JP2015529685A - 筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年9月17日に出願された米国仮特許出願第61/702,030号に基づいて、米国特許法第119条(e)に規定される優先権の利益を主張し、その開示は、引用により明示的に本明細書に包含される。
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)から、助成金番号NRSAF31NS058224号、同ROl NS644912−1A1号および同RC2 NS69476−01号により助成を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を保有する。
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。特に、本発明は、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(cytoplasmic toxic granule)の発現を低減させること、または患者の運動ニューロン(MN)におけるMHCクラスIの発現を増加させることによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。
筋萎縮性側索硬化症は、俗に、ルー・ゲーリッグ病と言われ、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの選択的な早期の変性および細胞死により特徴付けられる。運動ニューロンの喪失は、呼吸器不全から最終的に死に至る進行性の筋肉の麻痺の原因となる。全ての筋萎縮性側索硬化症のおよそ90%は、家族性疾患ではない散発性筋萎縮性側索硬化症であり、残り約10%は、家族性筋萎縮性側索硬化症である。危険因子および潜在的感受性遺伝子を同定するための多大な努力にも関わらず、散発性筋萎縮性側索硬化症の病因は、ほとんど未知のままである。
1.患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
2.細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、項目1に記載の方法。
3.パーフォリンがパーフォリン1である、項目2に記載の方法。
4.細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、項目1に記載の方法。
5.グランザイムがグランザイムBである、項目4に記載の方法。
7.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目1から6のいずれかに記載の方法。
8.化合物が核酸である、項目7に記載の方法。
9.核酸がRNA干渉により機能するか、またはアンチセンスRNA分子である、項目8に記載の方法。
10.核酸が、siRNA、miRNA、およびshRNAから成る群より選択される、項目8に記載の方法。
11.核酸がshRNAである、項目10に記載の方法。
13.核酸が配列番号1の配列を有する、項目8に記載の方法。
14.核酸が配列番号2の配列を有する、項目8に記載の方法。
15.筋萎縮性側索硬化症が、散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目1から14のいずれかに記載の方法。
16.筋萎縮性側索硬化症が、家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目1から14のいずれかに記載の方法。
17.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約1mgの範囲である、項目1から16のいずれかに記載の方法。
19.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約100ngの範囲である、項目1から17のいずれかに記載の方法。
20.組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目1から19のいずれかに記載の方法。
21.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目20に記載の方法。
22.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目21に記載の方法。
23.組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目1から22のいずれかに記載の方法。
25.MHCクラスIの増加した発現が、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目24に記載の方法。
26.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目24または25に記載の方法。
27.化合物が核酸である、項目26に記載の方法。
28.核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目27に記載の方法。
29.ベクターがウイルスベクターである、項目28に記載の方法。
30.ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、項目29に記載の方法。
32.核酸が組織適合遺伝子複合体H2Kをコードしている、項目31に記載の方法。
33.筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目24から32のいずれかに記載の方法。
34.筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目24から32のいずれかに記載の方法。
35.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約1mgの範囲である、項目24から34のいずれかに記載の方法。
36.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約500ngの範囲である、項目24から35のいずれかに記載の方法。
37.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約100ngの範囲である、項目24から36のいずれかに記載の方法。
38.組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目24から37のいずれかに記載の方法。
39.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目38に記載の方法。
41.組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目24から40のいずれかに記載の方法。
42.筋萎縮性側索硬化症を有する患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
43.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目42に記載の組成物。
44.化合物が核酸である、項目43に記載の組成物。
45.核酸が、siRNA、miRNA、およびshRNAから成る群より選択される、項目44に記載の組成物。
46.化合物がアンチセンスRNA分子である、項目44に記載の組成物。
47.核酸がshRNAである、項目45に記載の組成物。
48.核酸が配列番号1の配列を有する、項目44に記載の組成物。
49.核酸が配列番号2の配列を有する、項目44に記載の組成物。
50.組成物が、1つまたはそれ以上の担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目42から49のいずれかに記載の組成物。
52.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目51に記載の組成物。
53.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目42から52のいずれかに記載の組成物。
54.組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目42から53のいずれかに記載の組成物。
55.再構成可能な凍結乾燥形態である、項目42から50および53から54のいずれかに記載の組成物。
56.筋萎縮性側索硬化症を有する患者の運動ニューロンにおけるMHCクラスIの発現を増加させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
57.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目56に記載の組成物。
58.化合物が核酸である、項目56に記載の組成物。
60.組成物が、1つまたはそれ以上の担体、希釈剤、もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目56から59のいずれかに記載の組成物。
61.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目60に記載の組成物。
62.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目61に記載の組成物。
63.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目56から62のいずれかに記載の組成物。
64.組成物がアンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目56から63のいずれかに記載の組成物。
65.再構成可能な凍結乾燥形態である、項目56から60および63から64のいずれかに記載の組成物。
66.組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目1から65のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
67.非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目66に記載の方法または医薬組成物。
68.凍結乾燥形態である、項目55または65に記載の組成物。
69.固体形態である、項目42から50、53から60および63から65のいずれかに記載の組成物。
71.化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、項目70に記載のキット。
72.化合物の用量が、患者の体重1kg当たり、1から5μgの範囲である、項目70または71に記載のキット。
73.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目70から72のいずれかに記載のキット。
74.化合物または組成物が非経腸投与量形態である、項目70から73のいずれかに記載のキット。
75.非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目74に記載のキット。
76.組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、項目70から75のいずれかに記載のキット。
77.薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、項目76に記載のキット。
79.筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための、項目42から69のいずれかに記載の医薬組成物。
80.細胞質中毒性顆粒がSOD1ではない、項目1から23のいずれかに記載の方法。
81.細胞質中毒性顆粒が、抗酸化性細胞質中毒性顆粒ではない、項目1から23のいずれかに記載の方法。
82.細胞質中毒性顆粒がSOD1ではない、項目42から55のいずれかに記載の組成物。
83.細胞質中毒性顆粒が、抗酸化性細胞質中毒性顆粒ではない、項目42から55のいずれかに記載の組成物。
本発明のいくつかの態様は、以下の列挙される項目によって記載され、本明細書の詳細な説明部分に記載される各態様は、以下の各態様に適用される。
1.患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
2.細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、項目1に記載の方法。
3.パーフォリンがパーフォリン1である、項目2に記載の方法。
4.細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、項目1に記載の方法。
5.グランザイムがグランザイムBである、項目4に記載の方法。
7.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目1から6のいずれかに記載の方法。
8.化合物が核酸である、項目7に記載の方法。
9.核酸がRNA干渉により機能するか、またはアンチセンスRNA分子である、項目8に記載の方法。
10.核酸が、siRNA、miRNA、およびshRNAから成る群より選択される、項目8に記載の方法。
11.核酸がshRNAである、項目10に記載の方法。
13.核酸が配列番号1の配列を有する、項目8に記載の方法。
14.核酸が配列番号2の配列を有する、項目8に記載の方法。
15.筋萎縮性側索硬化症が、散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目1から14のいずれかに記載の方法。
16.筋萎縮性側索硬化症が、家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目1から14のいずれかに記載の方法。
17.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約1mgの範囲である、項目1から16のいずれかに記載の方法。
19.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約100ngの範囲である、項目1から17のいずれかに記載の方法。
20.組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目1から19のいずれかに記載の方法。
21.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目20に記載の方法。
22.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目21に記載の方法。
23.組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目1から22のいずれかに記載の方法。
25.MHCクラスIの増加した発現が、化合物の投与後に、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの作用効果をもたらす、項目24に記載の方法。
26.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目24または25に記載の方法。
27.化合物が核酸である、項目26に記載の方法。
28.核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、項目27に記載の方法。
29.ベクターがウイルスベクターである、項目28に記載の方法。
30.ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、項目29に記載の方法。
32.核酸が組織適合遺伝子複合体H2Kをコードしている、項目31に記載の方法。
33.筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、項目24から32のいずれかに記載の方法。
34.筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目24から32のいずれかに記載の方法。
35.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約1mgの範囲である、項目24から34のいずれかに記載の方法。
36.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約500ngの範囲である、項目24から35のいずれかに記載の方法。
37.化合物の量が、患者の体重1kg当たり、約1ngから約100ngの範囲である、項目24から36のいずれかに記載の方法。
38.組成物が、担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目24から37のいずれかに記載の方法。
39.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目38に記載の方法。
41.組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目24から40のいずれかに記載の方法。
42.筋萎縮性側索硬化症を有する患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒(toxic granule)の発現を低減させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
43.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目42に記載の組成物。
44.化合物が核酸である、項目43に記載の組成物。
45.核酸が、siRNA、miRNA、およびshRNAから成る群より選択される、項目44に記載の組成物。
46.化合物がアンチセンスRNA分子である、項目44に記載の組成物。
47.核酸がshRNAである、項目45に記載の組成物。
48.核酸が配列番号1の配列を有する、項目44に記載の組成物。
49.核酸が配列番号2の配列を有する、項目44に記載の組成物。
50.組成物が、1つまたはそれ以上の担体、添加剤、もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目42から49のいずれかに記載の組成物。
52.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目51に記載の組成物。
53.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目42から52のいずれかに記載の組成物。
54.組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目42から53のいずれかに記載の組成物。
55.再構成可能な凍結乾燥形態である、項目42から50および53から54のいずれかに記載の組成物。
56.筋萎縮性側索硬化症を有する患者の運動ニューロンにおけるMHCクラスIの発現を増加させるのに有効な、化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
57.化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目56に記載の組成物。
58.化合物が核酸である、項目56に記載の組成物。
60.組成物が、1つまたはそれ以上の担体、希釈剤、もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目56から59のいずれかに記載の組成物。
61.組成物が、液体担体である薬学的に許容される担体を含む、項目60に記載の組成物。
62.液体担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目61に記載の組成物。
63.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目56から62のいずれかに記載の組成物。
64.組成物がアンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目56から63のいずれかに記載の組成物。
65.再構成可能な凍結乾燥形態である、項目56から60および63から64のいずれかに記載の組成物。
66.組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目1から65のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
67.非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目66に記載の方法または医薬組成物。
68.凍結乾燥形態である、項目55または65に記載の組成物。
69.固体形態である、項目42から50、53から60および63から65のいずれかに記載の組成物。
71.化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、項目70に記載のキット。
72.化合物の用量が、患者の体重1kg当たり、1から5μgの範囲である、項目70または71に記載のキット。
73.化合物の純度が、重量%に基づき少なくとも98%である、項目70から72のいずれかに記載のキット。
74.化合物または組成物が非経腸投与量形態である、項目70から73のいずれかに記載のキット。
75.非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目74に記載のキット。
76.組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、項目70から75のいずれかに記載のキット。
77.薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、項目76に記載のキット。
79.筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための、項目42から69のいずれかに記載の医薬組成物。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が1から5μg/kgである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が1から3μg/kgである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
実施例1.ALSアストロサイトは、細胞質中毒性顆粒であるパーフォリンおよびグランザイムを発現し、その増加した共局在を示す。
顆粒エキソサイトーシス経路の細胞質の中毒性顆粒は、細胞毒性活性を有する構造的に関係のあるセリンプロテアーゼファミリーである、膜破壊タンパク質であるパーフォリン(例えば、PRF1)、およびグランザイムを含み、グランザイムB(GZMB)は、その一例であり、強力なアポトーシス促進因子として同定されている。本実施例は、顆粒細胞死経路の細胞傷害性化合物が脊髄の細胞で発現されるかどうかを分析した。図1Aに示す通り、PRF1およびGZMBタンパク質は両方とも、野生型およびSOD1 G93Aマウス(筋萎縮性側索硬化症(ALS)の許容された動物モデル)の脊髄においてウェスタンブロット分析により容易に検出され、転写物の存在がRT−PCRにより確認された。PRF1またはGZMBの全般的発現レベルは、SOD1G93A マウスの疾患の進度に伴って変化しなかった(図1A)。
本実施例は、SOD1 G93A アストロサイトが、PRF1およびGZMBをMN中に放出する能力を有するかどうかを、インビトロ培養システムを用いてアストロサイトの共培養したMNに対する毒性を調べることにより調査した。MNは、MNおよびアストロサイトの共培養における視覚的な差異を可能にする、運動ニューロン特異的なHB9プロモーターの制御下にGFPを発現するmES細胞に由来した。SOD1 G93A マウスから単離されたアストロサイトの融合層上に培養したMNにおいて、細胞質型および膜結合型PRF1およびGZMBタンパク質は、プレーティング後24時間より早く可視化されるが、一方、野生型アストロサイトと共培養したMNは、この時点で如何なるシグナルも示さなかった。この差異は、共培養の時間経過に亘って維持されて、培養の120時間後、SOD1 G93A アストロサイト上で培養したMNにおけるPRF1およびGZMBタンパク質の実質的な蓄積をもたらすが、一方、両タンパク質は、野生型アストロサイト上で培養したMNには本質的に存在しないままであった(図2A参照)。PRF1(図2G)およびGZMB(図2H)のレベルを、図2Aに示す通り、野生型またはSOD1 G93A アストロサイトと共培養されたMNにおいて異なる時間点で分析した。
マウスモデルにおける結果と一致して、PRF1およびGZMBの実質的な量は、FALS及びSALS患者の脊髄のMNにおいて検出されたが、罹患していない対照では検出されなかった(図3A参照)。ヒト脊髄におけるPRF1またはGZMBについて陽性のMN数の定量分析は、FALSおよびSALSの両方におけるMNの高陽性率を示し、いくつかのサンプルにおいて最大100%の細胞が両タンパク質を含んだ(図3Bおよび3C参照)。ALSアストロサイトとMNのインビトロにおける共培養システムならびにマウスおよびヒトの両方のALS脊髄から得られたこれらの観察は、ALSアストロサイトが積極的にPRF1およびGZMBを脱顆粒し、次いで、これらの細胞のパーフォリンにより仲介されるMNへの取り込みを示唆する。
本実施例において、ALSアストロサイト仲介性MN毒性におけるPRF1/GZMB経路の機能的重要性を決定した。まず、アストロサイトにおけるPRF1およびGZMBの発現を効率的に排除することが可能なshRNAを同定した。SOD1G93A アストロサイトにおけるPRF1およびGZMB発現の排除は、共培養中のMNのほぼ完全な保護をもたらした(図4AおよびB参照)。この保護作用は、より多くの生存MN数(図4B参照)、細胞体萎縮(soma atrophy)の減少(図4C参照)、および伸張した神経長(図4D参照)により明らかである。この保護作用の特異性は、スクランブルshRNA対照で処理したSOD1G93A アストロサイトの不変のMN数に対する毒性により確認され、共培養の20時間以内にMNの80%の細胞死がもたらされた。
PRF1/GZMB細胞死経路の積極的使用により、ALSアストロサイトはNK細胞の機能的特性を採用している。細胞表現型におけるこの明らかな変化の程度を特徴付けるために、本実施例は、ALSアストロサイトにおけるNK細胞関連マーカーの大規模シリーズの発現レベルを評価した。SOD1G93A アストロサイトは、2つのプロトタイプのNKマーカーである、CD56およびCD57をロバストレベルで発現し、それらは、野生型アストロサイトでは最小限に発現されている(図5A参照)。さらに、NK活性化に関与することが知られている受容体、リガンド、および仲介シグナル伝達タンパク質を含む大規模な遺伝子セットの定量的RT−PCR分析は、SOD1G93A アストロサイトにおけるこれらの遺伝子の大部分の上方制御を明らかにしたが、野生型対照では上方制御されなかった(図5B参照)。
ALSアストロサイトの表面上に発現するMHCクラスI阻害受容体は、NK細胞様の標的細胞との相互作用を、MN誘発性ALSアストロサイト毒性によるMHCクラスIの低減した提示と共に仲介し得る。まず、MHCクラスI受容体のMN表面上のレベルを、アストロサイトと共培養することにより測定した。野生型アストロサイト上に培養したMNは、120時間以上、ロバストなMHCクラスI発現を維持したが、SOD1G93A アストロサイトと共培養したMNは、MHCクラスI抗原の迅速かつ顕著な減少を示した(図6A参照)。この減少は、共培養24時間の時点で有意であり、より長時間の共培養でより顕著となり、共培養の120時間の時点で最低のMHCクラスI発現であった (図6A参照)。SOD1G93A アストロサイトと共培養したMN上のMHCクラスI発現の減少は、MN内のPRF1/GZMBレベルの観察された増加に逆相関した(図2A参照)。
Kp7−6を、それがMNに対するアストロサイト毒性を阻止するかどうかを決定するために分析した。Kp7−6は、Fas/FasL−により仲介されるアポトーシスを特異的に阻害する。Kp7−6を、MNの共培養の24時間前にSOD1G93A アストロサイトに添加し、共培養の全ての時点で維持した。細胞傷害性リンパ球においてFas/FasL 活性の阻害に有効であることが知られているKp7−6濃度では、MNに対するSOD1G93A アストロサイト由来の毒性は変化しなかった (図7参照) p<0.001。
変異 SOD1を発現したトランスジェニックマウス(B6SJL−Tg SOD1G93A)は、ジャクソン研究所(Bar Harbor、ME)から入手した。動物を、明/暗(12:12時間)サイクル下、餌および水の自由摂取下で飼育した。各世代において、SOD1 導入遺伝子コピー数およびSOD1 タンパク質発現レベルを、それぞれPCRおよびウェスタンブロット分析により確認した。全ての手順は、NIHガイドラインに従って実施され、全国小児病院施設内動物管理使用委員会により承認を受けた。
アストロサイトを、110から130日齢のSOD1G93A および野生型B6SJL マウスから単離した。アストロサイト培養物を、上記の通りに微細な改変をして行った。簡単には、脊髄を、酵素パパイン (2.5 U/ml;Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)、ディスパーゼグレード II (1 U/ml;Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)およびDnアーゼ I (250 U/ml;Worthington Biochemical)の混合物で約20分間処理して単一細胞に分離させた。70μMのナイロンメッシュを用いて濾過後、細胞をペレット状にし、10%胎仔ウシ血清(FBS、Invitrogen) および0.2%N2サプリメント (Invitrogen)を添加したDMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中に再懸濁し、75cm組織培養フラスコ状に播種した。細胞は、2〜3週間以内にコンフルエント状態になり、この時点で、潜在ミクログリア細胞を除去するために、プレートを一晩振盪した。接着状態のコンフルエントなアストロサイトを、シトシンアラビノース (20μM、Sigma− Aldrich, St。Louis、MO)で48時間処理して、分割中の細胞を迅速に死滅させた。分析前に、アストロサイト調製物を、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)およびナチュラルキラー(NK)細胞の存在について試験し、これらの細胞型を欠くことが見出された。
ミクログリアを、110から130日齢のSOD1G93A および野生型B6SJL マウスから、上記のプロトコルに従い単離した。簡単には、全脊髄をハンクス平衡塩溶液(HBSS)、pH 7.4中でホモジナイズした。得られたホモジネートを70μmのナイロン製セルストレーナーに通して濾過し、 400gで6分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを70%の等張パーコール液 (GE Healthcare, Waukesha, WI)中に室温で再懸濁した。不連続パーコール密度勾配を、70%、50%、35%、および0%の等張パーコール液のように設定した。勾配液を、2000gで20分間遠心し、ミクログリアを70%と50%のパーコール層の間の層から集めた。細胞を洗浄し、次いで、HBSS中に懸濁し、RNAまたはタンパク質の単離に用いた。分析前に、ミクログリア調製物を、CTLおよびNK細胞の存在について試験し、これらの細胞型を欠くことが見出された。
NPCを、SOD1G93A および野生型B6SJL マウスの脊髄から、上記の方法に従い単離した。簡単には、脊髄を、酵素パパイン(2.5 U/ml;Worthington Biochemical)、ディスパーゼグレード II (1 U/ml;Boehringer Mannheim Corporation)および Dnアーゼ I (250 U/ml;Worthington Biochemical)の混合物で約20から30分間処理して単一細胞に分離させた。70μMのナイロンメッシュを用いて濾過後、細胞をペレット状にし、10%FBSを添加したDMEM(Invitrogen)中に再懸濁した。細胞懸濁液を、等量の等張パーコール液(GE Healthcare)と混合し、20,000gで30分間、室温にて遠心した。低浮遊画分(赤血球層上の5−10ml)から細胞を集め、D− PBS/PSF (Invitrogen) で完全に洗浄し、60mmの コーティングされていないプレートに播種した。細胞を、1% N2 サプリメント (Invitrogen)、20ng/mlの線維芽細胞増殖因子−2 (FGF−2、Peprotech、Rocky Hill、NJ)および20ng/mlの内皮増殖因子(EGF、Peprotech)を添加した増殖培地 (DMEM/F12、Invitrogen)中で増殖させた。プレートに付着した細胞の増殖性クラスターは、約10から15日目に出現し始めた。70〜80%コンフルエントにて、細胞を、ポリオルニチン−ラミニン (P/L)でコーティングしたプレート上に播種した。これらの増殖条件では、マウスNPC培養は、アストロサイト、ミクログリア、CTLおよびNK細胞の混入がないことを確認した。培養を確立した後は、野生型およびSOD1G93A マウス由来のNPCを、明細書に記載の実験のためのアストロサイトを区別するために用いた。NPC由来のアストロサイトを、増殖因子を除き、10%FBS (Invitrogen)を添加した培地を添加して得た。培地を3日毎に交換した。アストロサイトは、実験に用いる前に10%FBS中で7日間成熟させた。高度に濃縮されたアストロサイトを、この方法に従い、ミクログリア、CTLまたはNK細胞の混入が検出されないレベルで得た。
この実験に用いるヒトNPC由来のアストロサイトは、上記の通りである。ヒト組織の受取は、全国小児病院施設内倫理委員会(IRB08−00402、筋萎縮性側索硬化症におけるグリアの役割を調査)により承認を受け、全てのヒトサンプルの使用は、その承認されたプロトコルに従った。死後の脊髄または脳を、死後24時間から72時間以内に処理し、NPCの単離のために用いた。NPCを滅菌条件下で維持し、組織をダイスカットして、単一細胞懸濁液を、37℃にて30から40分間、2.5 U/mlのパパイン (Worthington Biochemical)、250 U/ml のDNase I (Worthington Biochemical) および 1 U/ml の中性プロテアーゼ (Roche)を用いて組織を酵素的に解離することにより得た。解離後、細胞ペレットを10% FBS (Invitrogen)を添加したDMEM/F12 (Invitrogen)に再懸濁し、70μMフィルターに通して遠心した。細胞ペレットを10% FBS (Invitrogen)を添加したDMEM/F12 (Invitrogen)に再懸濁し、パーコール (GE Healthcare)と1:1で混合した。細胞/パーコール混合物を、20℃にて、20,000 gで30分間遠心し、赤血球細胞層上の低浮力画分(10ml)を集めた。細胞を洗浄し、10% FBS (Invitrogen) 、10% BIT9500(Stem Cell Technologies)、1% N2 サプリメント (Invitrogen)、20ng/mlのFGF−2 (Peprotech)、20ng/mlのEGF (Peprotech)および20ng/mlのPDGF−AB (Peprotech)を添加したDMEM/F12 (Invitrogen)を含むNPC培地に再懸濁した。NPCを、フィブロネクチン (Chemicon)でコーティングしたプレート上で培養し、24時間後、培地を血清不含有NPC培地に置き換えた。その後、培地の半量を2日毎に交換した。約3から4週間後に60−70%のコンフルエンスに達したとき、NPCを継代した。増殖条件において、本発明者らは、ヒトNPC培養は、アストロサイト、ミクログリア、CTLおよびNK細胞の混入がないことを確認した。NPC培養が確立された後、アストロサイトの分化を、増殖因子を除去し、かつ10% FBS (Invitrogen)を含む培地を添加することにより誘導した。これらの条件において、アストロサイトは容易に作製され、20回以上の継代で維持され得た。培養物が80%コンフルエンスに達したときにアストロサイトをアストロサイトを3日ごとに継代し、ラミニンでコーティングしたプレート上で維持した。NPC由来のアストロサイトに関するデモグラフィック情報のまとめを、表4に示す。
Hb9 プロモーター により駆動される緑色蛍光タンパク質 (GFP)を発現するマウス胚性幹細胞(mES 細胞) (HBG3 細胞)を用いた。ES細胞を、不活性化されたマウス線維芽細胞 (Millipore, Billerica, MA)の上で培養した。MNの分化を、2μMのレチノイン酸 (Sigma− Aldrich)および2μMのプルモルファミン (Calbiochem, Billerica, MA)の存在下で、10cmディッシュ当たり1〜2×106 のmES細胞を播種することにより誘導した。分化の5日後に、胚体を分離し、FACSVantage/DiVa ソーター (BD Biosciences, Rockville, MD)を用いて、GFPのレベルに基づいて選別した。
マウスのNPCを、0.1% FBS (Invitrogen)、レチノイン酸(1μΜ、Sigma− Aldrich)、およびフォルスコリン(5μΜ、Sigma− Aldrich)を含む増殖培地を補充することにより、GABA作動性ニューロンに分化するように誘導した。培地を毎日交換した。培養物を実験に使用する前に7日間分化させた。
マウスアストロサイトおよびMNの共培養実験について、アストロサイトを、ラミニンでコーティングした96ウェルプレートに、1ウェル当たり40,000個の細胞密度で播種した。48時間後、FACS 選別したGFP+ MNを、1ウェル当たり2,000個の細胞密度でアストロサイト単層の上に播種した。共培養を、5%ウマ血清 (Equitech Bio、Kerrville、TX)、2% N2 サプリメント (Invitrogen)、2% B27 サプリメント (Invitrogen)、10ng/mlのGDNF (Invitrogen)、10ng/ml BDNF (Invitrogen)、10ng/ml CNTF (Invitrogen)を添加したDMEM/F12 (Invitrogen)を含むMN培地中で行った。培地の半量を毎日交換して、新鮮な増殖因子を添加した。ヒト アストロサイトおよびMNの共培養について、アストロサイトを、ラミニンでコーティングした96ウェルプレートに1ウェル当たり10,000個の細胞密度で播種した。48時間後、GFP+ MNを、1ウェル当たり10,000個の細胞密度でアストロサイトの上に播種した。MN播種の24時間後、シトシンアラビノース(1μM、Sigma− Aldrich)を、残りの分化中のアストロサイトまたは未分化の胚性肝細胞を排除するために48時間の間、添加した。培地を毎日交換し、増殖因子を添加した。
RNAを、RT2 q−PCR−gradeRNA アイソレーションキット (Qiagen, Frederick, MD)を用いて採取し、全RNAを、RT2 ファーストストランドキット(Qiagen) を製造業者の指示書に従って用いて逆転写した。半定量的RT−PCRのために、転写物を、以下の遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。PRF1−F:5'−GTCACGTCGAAGTACTTGGTG−3' ;PRF1−R:5 ' − ATGGCTGATAGCCTGTCTCAG−3' ;gzmb−F:5'−CCTGCCCAGGCGCAATGTCA−3' ;gzmb−R:5'−TGGTCTTTGGGTCCCCCGCA−3' ;Ly49c−F:5'− TCCCACGATGAGTGAGCCA−3';Ly49c−R:5' −TACCTTTAACTCTAGTTGGAA AA−3' ;Ly49i−F:5'− GATGAATGAGCCGGAGGTC−3' ;Ly49i−R:5'− TTTCACTGTTCCATCTGTCCT−3' ;actb−F:5'−GTGGGCCGCCCTAGGCACCA−3' ;actb−R:5' −CTCTTTGATGTCACGC ACGATTTC− 3'。ヒトのキラー細胞免疫グロブリン様受容体転写物 (KIR)の検出を、上記のプライマーセットを用いて定量的RT−PCRにより決定した (Thompson et al., Immuno genetics, Nov 2006, 58, 865)。ナチュラルキラー細胞マーカーを、SOD1G93A および野生型由来のアストロサイトにおいて、マウス ナチュラルキラー細胞96 StellARay (Lonza, Hopkinton, MA)を利用して定量的RT−PCRによりアッセイした。この StellARayは、細胞表面受容体、リガンド、シグナル伝達分子、接着分子、細胞毒性の媒介物質、サイトカインおよびサイトカイン受容体を含む、NK細胞生物学の多くの面に関連する遺伝子の発現を測定する。定量的RT−PCR反応は、ABI プリズム 7000 (Applied biosystems, Carlsband, CA)を付したRT2 リアルタイム SYBR Green/Rox PCR マスターミックス (Qiagen)を用いてデュプリケートで行った。
細胞、マウス脊髄またはパラフィン包埋されたヒト脊髄サンプルにおいて種々の抗原を可視化するために使用される免疫蛍光染色は、表2に記載の抗体およびそれぞれの希釈率で行われた。ほとんどの抗原に関して、サンプルを、0.1% トライトン−X および 10% ロバ血清を含むTBS中、最初に室温で1時間インキュベートし、次いで4℃にて48〜72時間、一次抗体と共にインキュベートした。種々の蛍光色素に結合した二次抗体での標識化を、室温で2時間行った。パラフィン包埋されたヒト組織におけるPRF1とGZMBの検出は、ABCおよびVectorRedキットプロトコル(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて、ビオチニル化二次抗体を用いて達成された。組織を、簡単に、ヘマトキシリンQS溶液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて対比染色した。MHCクラスI染色を、上記のプロトコルに従って、軽微な変更を加えて行った。簡単には、細胞透過は、マウス脊髄サンプルについて0.05%のトリトンX、およびヒト脊髄サンプルについて0.1%のサポニンを用いて達成された。一次および二次抗体とのインキュベーションを、任意の界面活性剤を用いることなく、10%のロバ血清中で行った。インビトロでの表面標識のために、カバースリップ上に細胞を固定し、最初に透過処理せずに、ブロッキングし、室温で1時間、一次抗体と共にインキュベートした。膜の完全性を検証するために、各サンプルを、細胞内タンパク質TUJ1について染色した。TUJ1染色の欠失は、無傷の膜を確認し、陽性のTUJ1染色を有するMNを、分析から除外した。免疫染色に用いたヒト脊髄組織に関連するデモグラフィック情報のまとめを表3に示す。
全ての画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY)を用いて得て、3次元再構成は、LSM 510 ソフトウェア(Carl Zeiss)を用いて得た。
アストロサイトとMNの共培養における種々の時点にて、MNの細胞生存性、神経突起長および細胞体サイズを、完全自動化 IN CELL 6000 セルイメージャー(GE Healthcare)を用いて記録した。画像を、開発および分析ソフトウェアパッケージ (GE Healthcare)を用いて処理した。
アストロサイトにおけるPRF1およびGZMBレベルをノックダウンするために、RNAiのコンソーシアムレンチウイルスのshRNAライブラリーからの配列をスクリーニングし、関連するプラスミドをOpen Biosystems社から購入した。クローンTRCN0000077206(CCACTCCAAGGTAGCCAATTT)およびTRCN0000032742(CCTATGGATATAAGGATGGTT)をそれぞれ、マウスのアストロサイトにおいてPRF1およびGZMBを標的とするために用いた。
クローン TRCN0000007942(ACCTGAATCATGGCCACCTAA) およびTRCN0000006448(CATTGTCTCCTATGGACGAAA)をそれぞれ、ヒトのアストロサイトにおいてPRF1およびGZMBをノックダウンするために用いた。スクランブル shRNAを、PRF1(GGCACTACCCGATCTATTACA)およびGZMB(GACCGATACTCGCGATATATT)についてのコントロールとして用いた。これらの配列は、文献に記載の通り、超遠心分離により上清から収集した293細胞およびウイルスのCaCl2媒介性の一過性トランスフェクションにより製造されたレンチウイルス粒子により送達された(Tiscornia et al., Nat Protoc, 2006, 1, 241)。簡単には、ウイルス粒子は、ヘルパープラスミド、VSV−G、MDLおよびREVの存在下での293細胞の一過性トランスフェクションにより製造された。トランスフェクションは、10分間のCaCl2沈殿、その後のさらに20時間の培地インキュベーションにより得られた。ウイルス上清を、その後96時間の間、24時間毎に集め、ウイルス粒子を、50,000gで2時間の超遠心分離によりペレットとして得た。ウイルス粒子を等分し、使用するまで−80℃で凍結保存した。アストロサイトに添加する前に、ウイルス力価を、Quick−titer レンチウイルス定量キットを製造業者の指示に従って用いて得た(CellBiolabs Inc、San Diego、CA、USA)。
アストロサイトにおけるPRF1およびGZMB発現をノックダウンするために、RNAiのコンソーシアムレンチウイルスのshRNA ライブラリーからの配列 (TRC−Mm1.0 および TRC−Hs1.0) をスクリーニングし、Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)から購入した。以下の配列をスクリーニングした。
マウス:TRCN0000077203 (CTATGCATAGAGAGGCCACTA);TRCN0000077204 (GCCCATTTGGTGGTAAGC AAT) ;TRCN0000077205(CGGTGTCGTGTGGAAC AATAA) ;TRCN0000077206(CCACTCCAAGGTAGCCAATTT);TRCN0000077207 (AGGGTGAAATTCTCCTACCAT)。
ヒト:TRCN0000007938 (CCAACACAATTCTTCTTCCAA) ;TRCN0000007939 (GCCTATGTGAAGCTCTTCTTT) ;TRCN0000007940(CCTCAGGCTTATCTCCAACTA) ;TRCN0000007941 (TGCCGCTTCTACAGTTTCCAT) ;TRCN0000007942 (ACCTGAATCATGGCCACCTAA)。
マウス:TRCN0000032739 (CGAGAATGTTATCTAATGCTA) ;TRCN0000032740 (CGAGTTTCTTATCCTGGATAA) ;TRCN0000032741(GCCTTACTTTCGATCAAGGAT) ;TRCN0000032742 (CCTATGGATATAAGGATGGTT);TRCN0000032743 (CAGACTATAATCCTAAGACAT)。
ヒト:TRCN0000006445 (CGAATCTGACTTACGCCATTA);TRCN0000006446 (GCTTATCTTATGATCTGGGAT) ;TRCN0000006447( AATGGTACTGTCGTAATAATG) ;TRCN0000006448(CATTGTCTCCTATGGACGAAA);TRCN0000006449 (GCTTCCTGATACAAGACGACT)。
MNにおいてMHCクラスIを発現するために、野生型アストロサイトを、ラミニンでコーティングしたトランスウェル(Corning, Lowell, MA)上にMN培地を用いて播種した。24時間後、分別されたGFP+の MNを、別々のラミニンでコーティングした96ウェルプレートに野生型アストロサイトで馴化した培地中に播種した。4時間後、野生型アストロサイトを含むトランスウェルを、全てのMNが完全に付着し、神経突起伸張を示し始めたことが確認された後、MNプレートに移した。1日後、野生型アストロサイトのトランスウェルを除去し、MNに、H2K cDNA発現構築物をコード化するレンチウイルス(MN当たり40ウイルス粒子)を感染させた。感染の12時間後、トランスウェルによる野生型アストロサイトとの共培養を再開した。72時間後、トランスウェルを除去し、共培養実験を開始した。
粗タンパク質細胞溶解物を、製造者の推奨に従って組織タンパク質抽出試薬 (Pierce, Rockford, IL)を用いて得た。レーン当たり、20μgのタンパク質を、NuPAGE 4〜12%のBis−Tris ゲル(Invitrogen)上にローディングした。タンパク質を、150Vで1時間、電気泳動により分離し、その後、Invitrolon PVDF膜(Invitrogen)に移した。該膜をTBS中5%脱脂乳、0.1% トゥイーン−20で1時間ブロッキングし、次いで、一次抗体と共に一晩インキュベートした。結合した一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、次いで、ECLTMウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)を用いる化学発光により検出した。
動物。変異SOD1G93A導入遺伝子を高レベルで発現したトランスジェニックのオスおよびメス同腹仔マウスを、グループ間で均等に分けた。SOD1遺伝子コピー数およびSOD1タンパク質発現を、PCRおよびウェスタンブロット分析により確認した。動物を、明暗(12:12時間)サイクル下で、餌および水を自由に摂取できる状況下で飼育した。全ての方法は、全国小児病院施設内動物管理使用委員会により承認を受けたプロトコルを用いて行った。
AGTGTCGCCGCGGACGCTGGATATAAAGTCCACGCAGCCCGCAGAACTCAGAAGTCGCGAATCGCCGACAGGTGCGATGGTACCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGACCCGCGCGGGCCCACACTCGCTGAGGTATTTCGTCACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCTCGGGGAGCCCCGGTACATGGAAGTCGGCTACGTGGACGACACGGAGTTCGTGCGCTTCGACAGCGACGCGGAGAATCCGAGATATGAGCCGCGGGCGCGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAAAGCCAAGGGCAATGAGCAGAGTTTCCGAGTGGACCTGAGGACCCTGCTCGGCTACTACAACCAGAGCAAGGGCGGCTCTCACACTATTCAGGTGATCTCTGGCTGTGAAGTGGGGTCCGACGGGCGACTCCTCCGCGGGTACCAGCAGTACGCCTACGACGGCTGCGATTACATCGCCCTGAACGAAGACCTGAAAACGTGGACGGCGGCGGACATGGCGGCGCTGATCACCAAACACAAGTGGGAGCAGGCTGGTGAAGCAGAGAGACTCAGGGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGAAGAACGGGAACGCGACGCTGCTGCGCACAGATTCCCCAAAGGCCCATGTGACCCATCACAGCAGACCTGAAGATAAAGTCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCTGACATCACCCTGACCTGGCAGTTGAATGGGGAGGAGCTGATCCAGGACATGGAGCTTGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCATCTGTGGTGGTGCCTCTTGGGAAGGAGCAGTATTACACATGCCATGTGTACCATCAGGGGCTGCCTGAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCTCCTCCATCCACTGTCTCCAACATGGCGACCGTTGCTGTTCTGGTTGTCCTTGGAGCTGCAATAGTCACTGGAGCTGTGGTGGCTTTTGTGATGAAGATGAGAAGGAGAAACACAGGTGGAAAAGGAGGGGACTATGCTCTGGCTCCAGGCTCCCAGACCTCTGATCTGTCTCTCCCAGATTGTAAAGTGATGGTTCATGACCCTCATTCTCTAGCGTGAAGACAGCTGCCTGGAGTGGACTTGGTGACAGACAATGTCTTCTCATATCTCCTGTGACATCCAGAGCCCTCAGTTCTCTTTAGTCAAGTGTCTGATGTTCCCTGTGAGCCTATGGACTCAATGTGAAGAACTGTGGAGCCCAGTCCACCCCTCTACACCAGGACCCTGTCCCTGCACTGCTCTGTCTTCCCTTCCACAGCCAACCTTGCTGGTTCAGCCAAACACTGAGGGACATCTGTAGCCTGTCAGCTCCATGCTACCCTGACCTGCAACTCCTCACTTCCACACTGAGAATAATAATTTGAATGTAACCTTGATTGTTATCATCTTGACCTAGGGCTGATTTCTTGTTAATTTCATGGATTGAGAATGCTTAGAGGTTTTGTTTGTTTGTTTGATTGATTTGTTTTTTTGAAGAAATAAATGATAGATGAATAAACTTCCAGAATCTGGGTCACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
全ての統計的試験は、群間の平均誤差のBonferroniの事後解析に続く分散多方向分析により行った(GraphPad Prism, San Diego, CA)。各実験は、3または4回繰り返し、各々トリプリケートを使用した。
Claims (20)
- 患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させることにより、筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための方法であって、患者のアストロサイトにおける細胞質内毒性顆粒の発現を低減させる化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
- 細胞質内毒性顆粒がパーフォリンである、請求項1に記載の方法。
- パーフォリンがパーフォリン1である、請求項2に記載の方法。
- 細胞質内毒性顆粒がグランザイムである、請求項1に記載の方法。
- グランザイムがグランザイムBである、請求項4に記載の方法。
- 細胞質内毒性顆粒の減少した発現が、結果として、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの効果をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 化合物が核酸である、請求項7に記載の方法。
- 核酸が配列番号1の配列を有する、請求項8に記載の方法。
- 核酸が配列番号2の配列を有する、請求項8に記載の方法。
- 患者の運動ニューロンにおいて発現されるMHCクラスIを増加させることによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、該患者の運動ニューロンにおけるMHCクラスIの発現を増加する化合物の有効量を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
- MHCクラスIの増加した発現が、結果として、化合物の投与後の運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮の抑制、および神経突起長の伸張からなる群より選択される患者の運動ニューロンへの効果をもたらす、請求項11に記載の方法。
- 化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 化合物が核酸である、請求項11に記載の方法。
- 核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを介して患者に送達される、請求項14に記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターである、請求項15に記載の方法。
- ベクターが、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 核酸が配列番号3の配列を有する、請求項14に記載の方法。
- 核酸が組織適合遺伝子複合体H2Kをコードしている、請求項14に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症が散発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項1に記載の方法。
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