PT1159453E - Processo para sequenciação directa de ácidos nucleicos - Google Patents

Description

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Descrição "Processo para sequenciação directa de ácidos nucleicos"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a processos para a sequenciação de amostras de ácidos nucleicos. Mais especificamente a presente invenção diz respeito a processos de sequenciação sem a necessidade de amplificação; conhecimento anterior de algumas sequências nucleótidicas para gerar os iniciadores de sequenciação; e às técnicas de electroforese de trabalho intensivo.

Antecedentes da Invenção A sequenciação de amostras de ácidos nucleicos é uma técnica analítica importante na biologia molecular moderna. 0 desenvolvimento de processos fidedignos para a sequenciação de ADN tem sido crucial para a compreensão da função e controlo dos genes e para aplicar muitas das técnicas básicas da biologia molecular. Estes métodos tornaram-se cada vez mais importantes como instrumentos na análise genómica e em muitas aplicações fora da área da investigação, tal como a identificação genética, análise forênsica, aconselhamento genético, diagnósticos médicos e muitos outros. Nestas últimas aplicações, foram utilizadas ambas as técnicas que fornecem informação parcial da sequência, tal como de impressão digital e comparações de sequências e técnicas que fornecem a determinação da sequência completa. Ver, por ex. Gibbs et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 86: 1919-1923 (1989); Gylensten et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7652-7656 (1988); Carrano et al., Genomics 4: 129-136 (1989); Caetano-Annoles et al·., 2

Mol. Gen. Genet. 235: 157-165 (1992); Brenner e Livak, Proc. Natl. Acad. Sei USA 86: 8902-8906 (1989); Green et al., PCR Methods and Applications 1: 77-90 (1991); e Versalovic et al-, Nucleic Acid Res. 19:6823-6831 (1991). A maior parte dos métodos de sequenciação de ADN actualmente disponíveis necessitam da criação de um conjunto de fragmentos de ADN que são ordenados por comprimento de acordo com a composição nucleótidica. A criação deste conjunto de fragmentos ordenados ocorre através de uma de duas vias: (1) degradação química para nucleótidos específicos utilizando o método de Maxam-Gilbert ou (2) incorporação de didesóxi nucleótido utilizando o método Sanger. Ver Maxam e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 560-564 (1977); Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977). O tipo e o número de passos necessários limita inerentemente tanto o número de segmentos de ADN que podem ser sequenciados em paralelo, e a quantidade de sequência que pode ser determinada a partir de um determinado local. Além disso, ambos os métodos são propensos a erros devido à migração anómala de fragmentos de ADN em geles desnaturant.es. Limitações de espaço e tempo inerentes a estes métodos baseados em geles. têm impulsionado a investigação de métodos alternativos.

Num esforço para satisfazer as solicitações de sequenciação em larga escala foram efectuadas melhorias no método de Sanger. Por exemplo, a utilização de terminadores de cadeia fluorescentes simplifica a detecção dos nucleótidos. A síntese de fragmentos de ADN mais longos e melhoria na resolução dos fragmentos produz mais informação sobre a sequência a partir de cada experiência. A análise automatizada dos fragmentos em geles ou capilares reduziu significativamente o trabalho envolvido em recolher e processar a informação da sequência. Ver, por ex., Prober et al., Science 238:336-341 (1987); Smith et al.,. Nature 3 321:674-679 (1'986) ; Luckey et al., Nucleic Acids Res 18:4417-4421 (1990); Dovichi, Electrophoresis 18: 2393-2399 (1997) .

Contudo, as tecnologias actuais de sequenciação de ADN sofrem de três grandes limitações. Primeiro, necessitam de uma grande quantidade de moléculas dè ADN que são geralmente obtidas ou por clonagem molecular ou por amplificação de sequências de ADN por reacção em cadeia da polimerase. Os métodos actuais de detecção não são .sensiveis e requerem assim um número critico mínimo de oligonucleótidos marcados. Também são necessárias muitas cópias idênticas de oligonucleótidos para gerar uma cadeia da sequência. Urna segunda limitação consiste no facto de que as técnicas de sequenciação actuais dependem da iniciação a partir de olígodesóxinucleótidos específicos da sequência que necessitam de ser sintetizados antes de iniciar o procedimento de sequenciação. Sanger e Coulson, J. Mol. Biol. 94:441-448 (1975). A necessidade de moldes idênticos múltiplos requer a iniciação sincronizada de cada cópia do mesmo local pré-determinado. Em terceiro lugar, as técnicas de sequenciação actuais dependem de técnicas demoradas, trabalho intensivas de electroforese que se encontram limitadas pela velocidade a que os fragmentos podem ser separados e estão também limitadas pelo número de bases que podem ser sequenciadas numa dada experiência pela resolução possível de obter num gel.

Num esforço para dispensar a necessidade de técnicas por electroforese, foi desenvolvido um processo de sequenciação que utiliza terminadores de cadeia que podem .ser desbloqueados, ou desprotegidos para a continuação da extensão. Ver patente de invenção US N° 5,302,509; Metzker et al., Nucleic Acids Res. 22: 4259-4267 (1994). Este método envolve ciclos repetitivos de incorporação de base, detecção da incorporação e reactivação do terminador da 4 cadeia para permitir um próximo ciclo de sintese de ADN. Assim, detectando cada base adicionada a cadeia de. ADN vai crescendo, a necessidade de fraccionamento por tamanho é eliminada. Este método é no entanto ainda muito dependente de grandes quantidades de ácido nucleico a ser sequenciado e à utilização de sequências conhecidas para iniciar o crescimento da cadeia. Além disso, esta técnica é afligida por quaisquer ineficiências de incorporação e desprotecção. Devido ao facto da incorporação e regeneração de 3'-OH não serem completamente eficientes, um conjunto de cadeias a serem prolongadas inicialmente idênticas podem tornar-se rapidamente assíncronas e as sequências não podem ser resolvidas para além de algumas adições iniciais limitadas. A WO 99/05315A2 (Medicai Biosystems Ltd., et al. revela um método que compreende fazer reagir um polinucleótido alvo com uma enzima polimerase imobilizada num suporte sólido, e os diferentes nucleótidos em condições suficientes para a reacção da polimerase, e detecção de um efeito consequente na incorporação de um nucleótido específico complementar a.o polinucleótido alvo.

De acordo com a WO 90/13666A1 (Arnersham International PLC, et al.) um complexo imobilizado de um molde a ser sequenciado e um iniciador é exposto a um fluxo contendo apenas um dNTP de .· cada vez. Cada acontecimento de polimerização é detectado, preferencialmente directamente e por meios espectroscópicos. A WO 93/21340A1 (Medicai Research Council, et al.) revela um método para determinar a sequência de um ácido nucleico compreendendo a formação de um molde de cadeia simples compreendendo o ácido nucleico a ser sequenciado, hibridizando um iniciador com um molde para formar um complexo molde/iniciador, prolongando o iniciador por adição de um único nucleótido marcado determinando o tipo do nucleótido marcado adicionado ao iniciador, removendo, 5 ou neutralizando a marcação e depois repetindo tais passos sequencialmente e registando a ordem da incorporação de nucleótidos marcados.

Os quatro diferentes tipos de nucleótidos são adicionados sequencialmente. A WO 00/36152A1 (Li-Cor, Inc. et al.) revela processos de sequenciação e genotipagem de ácidos nucleicos numa única configuração da molécula por detecção de molécula única de resíduos de PPi ' marcados com fluorescência libertados de NTPs à medida que o produto de extensão da polimerase é criado.

Assim, permanece ainda a necessidade no estado da técnica de um processo eficaz sob o ponto de vista de custo e de débito elevado para sequenciar amostras de ácidos nucleicos desconhecidas que eliminam a necessidade de amplificação; conhecimento anterior de algumas sequências nucleótidicas para gerar os iniciadores de sequenciação; e às técnicas .de electroforese de trabalho intensivo.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção é por isso disponibilizado um processo para sequenciação de bases nucleótidicas compreendendo os passos sequenciais: (a) numa câmara reaccional contendo uma polimerase imobilizada num suporte sólido é introduzida uma amostra de ácido nucleico, uma pluralidade de diferentes iniciadores oligonucleótidicos e uma solução tamponizada contendo todos os quatro diferentes nucleótidos, estando cada nucleótido marcado de forma diferente com um grupo marcador destacável e bloqueado na posição 3' com um grupo bloqueador destacável, em que a dita amostra de ácido nucleico se hibridiza com um iniciador, e a dita polimerase prolonga o 6 dito iniciador incorporando um nucleótido marcado de forma diferente que é complementar ao ácido nucleico da amostra; (b) remoção dos nucleótidos que não foram incorporados no iniciador; (c ) determinação da identidade do nucleótido incorporado no iniciador em elongaçâo, através da detecção do seu grupo marcador, identificando deste modo o complemento do nucleótido marcado, bloqueado na posição 3'; (d) separação do grupo de bloqueio 3' e do grupo marcador do nucleótido incorporado; (e) remoção do grupo de bloqueio 3' separado e do grupo marcador separado do passo (d); (f) confirmação da separação e remoção do grupo de bloqueio 3' do nucleótido incorporado no iniciador através da monitorização da presença de nucleótidos marcados na câmara reaccional através de um segundo passo de detecção, em que a presença de nucleótido marcado na . câmara reaccional indica que o grupo de bloqueio 3' ainda não foi removido; (g) introdução na câmara reaccional de solução tamponizada fresca contendo todos os ditos. quatro nucleótidos diferentes para reiniciar a síntese; e (h) repetir os passos de (b) a (g) até que nenhum novo nucleótido seja incorporado no passo (g), ou que o grupo de bloqueio 3' persista em não ser- separado e removidos nos passos (d) e (e) ; 7 em que a ordem em que os nucleótidos marcados nos passos (b) são detectados corresponde ao complemento da sequência de pelo menos uma porção da dita amostra de ácido nucleico. A presente invenção disponibilíza deste modo processos de sequenciação de amostras desconhecidas de ácidos nucleicos eficazes sob o ponto de vista de custos, de débito elevado que eliminam a necessidade de amplificação; do conhecimento anterior de algumas sequências nucleótidicas para criar iniciadores de sequenciação; e técnicas de electroforese de trabalho intensivo. Os métodos da presente invenção permitem a sequenciação directa de ácidos nucleicos (DNAS- do inglês direct nucleic acid sequencing) de moléculas isoladas de ácidos nucleicos.

De acordo com os métodos da presente invenção, uma pluralidade de moléculas de polimerase podem ser imobilizadas num suporte sólido através de uma interacção covalente, ou não covalente. Uma amostra de ácido nucleico e de iniciadores oligonucleótidicos são introduzidos na câmara reaccional numa solução tamponizada contendo todos os quatro terminadores nucleósidos trifosfatos bloqueados marcados. 0 alongamento conduzido por um molde de um. ácido nucleico é mediado pelas polimerases ligadas utilizando os terminadores nucleósidos trifosfatos bloqueados marcados. Os centros reaccionais podem ser monitorizados por um sistema microscópico até que a maioria dos locais contenham a polimerase imobilizada ligada a um molde de ácido nucleico com um único terminador nucleótido trifosfato bloqueado marcado. A câmara reaccional pode então ser lavada com tampão de lavagem. Pode então ser determinada a incorporação especifica de nucleótidos para cada centro reaccional activo. A seguir à detecção, a câmara reaccional pode ser irradiada para desbloquear o nucleótido incorporado e lavada mais uma vez com tampão de lavagem. A presença de. nucleótidos marcados bloqueados é mais uma vez s monitorizada antes de reagentes frescos serem adicionados para reiniciar ., a síntese, para verificar que os centros reaccionais são libertados com êxito. Uma' falha persistente da libertação, ou incorporação indica contudo, a falha de um centro reaccional. Uma falha persistente da libertação, ou incorporação consiste em 2-20 ciclos, preferencialmente 3-10 ciclos, mais preferencialmente 3-5 ciclos, em que a presença de um nucleótido marcado aprisionado é detectada durante o segundo passo de detecção, indicando que o centro reaccional não foi desbloqueado com êxito. 0 ciclo de sequenciação descrito acima é repetido até uma grande proporção dos centros reaccionais falharem.

Os nucleótidos marcados de forma diferente utilizados nos processos de sequenciação da presente invenção possuem um grupo marcador destacável é são bloqueados na posição 3' com um grupo de bloqueio destacável. Numa concretização preferida o grupo de marcação encontra-se directamente ligado ao grupo de bloqueio 3' destacável. A libertação dos nucleótidos pode ser realizada enzimaticamente, quimicamente, ou preferencialmente fotoquimicamente, dependendo do agente de ligação utilizado para ligar o grupo marcador e o grupo de bloqueio 3' ao nucleótido.

Numa'outra concretização preferida, o grupo marcador é ligado à base de cada nucleótido com um agente de ligação destacável e não ao grupo de bloqueio 3' destacável. O grupo de marcação e o grupo de bloqueio 3' podem ser removidos enzimaticamente, quimicamente ou fotoliticamente. Alternativamente, o grupo marcador pode ser removido, através de um método diferente do método do grupo de bloqueio 3'. Por exemplo, o grupo marcador pode ser removido enzimaticamente, enquanto que o grupo de bloqueio 3' é removido quimicamente, ou por activação fotoquímica.

Muitas reacções independentes ocorrem simultaneamente na câmara reaccional, gerando cada centro reaccional 9 individual algumas centenas, ou milhares de pares de bases. Este aparelho possui a capacidade de sequenciar em paralelo milhares e possivelmente milhões de moldes separados a partir de pontos especificados ou aleatórios da sequência. A sequência combinada de cada corrida é da ordem de vários milhões de pares de bases da sequência e não necessita de amplificação, conhecimento anterior de uma porção da sequência alvo, ou resolução dos fragmentos em geles, ou capilares. Simples preparações de ADN de qualquer origem podem ser sequenciadas com o, equipamento e processos da presente invenção. '

Breve Descrição das Figuras

Fig. 1 (painéis A-C) é uma representação esquemática de nucleótidos de terminação marcados bloqueados para utilização na sequehciação directa de ácidos nucleicos. 0 painel A apresenta um trifosfato de desoxiadenosina modificado através da ligação de um conjugado agente de ligação-fluorocromo fotolábil a um carbono 3f da ribose. 0 painel B representa uma configuração alternativa, em que o fluorocromo se encontra ligado à base. do nucleótido, através de um agente de ligação fotolábil. 0 painel C representa os quatros diferentes nucleótidos cada um marcado com um fluorocromo com diferentes propriedades espectrais, que permitem que os quatro nucleótidos sejam distinguidos durante a fase de detecção de um ciclo reaccional de sequenciação directa de ácidos nucleicos.

Fig. 2 é uma representação- esquemática dos passos de um ciclo de sequenciação directa de ácidos nucleicos em que o passo 1 ilustra a incorporação de um nucleótido bloqueado marcado, o passo 2 ilustra a detecção do marcador e o passo 3 ilustra a libertação do grupo de bloqueio 3'-OH. 10 A Fig. 3 é uma representação esquemática de um centro reaccional que representa uma polimerase imobilizada e uma amostra de ácido nucleico a ser sequenciada. A Fig. 4 é uma representação esquemática da câmara reaccional que alberga uma matriz de centros reaccionais de DNAS e medeia a troca de reagentes e tampão. A Fig. 5 é uma representação esquemática de uma matriz de centros reaccionais. O painel do lado esquerdo (Campo do Microscópio) apresenta uma vista da matriz completa tal como foi registada para os quatro acontecimentos sucessivos de detecção (um para cada um dos fluorocromos separados). O painel central representa uma vista ampliada de uma parte do campo mostrando o espaçamento entre os centros reaccionais individuais. O painel da extrema direita apresenta a vista da câmara de um único centro reaccional. A Fig. 6 é uma representação esquemática do principio da onda evanescente. A Fig. 7 é uma representação esquemática de uma montagem de uma sequenciação directa de ácidos nucleicos utilizando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. A Fig. 8 é uma representação esquemática de um exemplo de um algoritmo de aquisição de dados obtido a partir de uma matriz 3x3.

Descrição Detalhada da Invenção O método da presente invenção aqui referido como Sequenciação Directa de Ácidos Nucleicos (DNAS -do inglês Direct Nucleic Acid Sequencing) oferece um processo rápido, 11 eficaz do ponto de vista de custos, de débito elevado a partir do qual moléculas de ácidos nucleicos de qualquer tipo podem ser facilmente sequenciadas sem a necessidade de amplificação prévia. A DNAS pode ser utilizada para determinar a sequência nucleótidica de numerosas moléculas de ácido nucleico isoladas em paralelo.

1. Matriz de Centros reaccionais de DNAS

As' polimerases encontram-se ligadas a um suporte sólido, espaçadas a intervalos regulares, numa matriz de centros reaccionais presentes com uma periodicidade maior do que o poder de resolução óptica do sistema . do microscópio. Preferencialmente, apenas uma molécula de polimerase encontra-se presente em cada centro reaccional, e cada centro reaccional encontra-se localizado a uma distância opticamente resolúvel dos outros centros reaccionais. As reacções de sequenciação ocorrem preferencialmente numa fina câmara reaccional aquosa compreendendo uma cobertura de uma. tampa selada e um suporte sólido opticamente transparente. A imobilização de moléculas de polimerase para utilização na sequenciação de ácidos nucleicos foi revelada por Densham no pedido de patente de invenção PCT WO 99/05315. Densham descreve a ligação de grupos amino seleccionados da polimerase a uma superfície activada de dextrano, ou éster de N-hidróxisuccinimida. WO 99/05315; EP-A-0589867; LÕfas et al. , Biosens. Bioelectron 10: 813-822 (1995). Estas técnicas podem ser modificadas na presente invenção para assegurar que a área activada é demasiado pequena de modo a que- os impedimentos estereoquímicos impessam a ligação de mais . do que uma polimerase a qualquer local na matriz. 12 A matriz de centros reaccionais contendo uma única molécula de polimerase é construída utilizando técnicas litográficas utilizadas habitualmente na construção de circuitos electrónicos integrados. Esta metodologia tem sido utilizada no estado da técnica para construir matrizes microscópicas de oligodesoxinucl-eótidos e matrizes de motores de proteínas únicas. Ver por ex. Chee et al., Science 274:610-614 (1996); Fodor et al ., Nature 364: 555-556 (1993); Fodor et al., Science 251: 767-773 (1991); Gushin, et al., Anal. Biochem. 250: 203-211 (1997); Kinosita et al., Cell 93: 21-24 (1998); Kato-Yamada et al.·, J. Biol. Chem. 273: 19375-19377 (1998); e Yasuda et al., Cell 93: 1117-1124 (1998). Utilizando técnicas tais como a fotolitografia e/ óu litografia de feixe electrónico [Rai-Choud-hury, Handbook of Microlithography, Micromachining, and 'Microfabrication, Volume I: Microlithography, Volume PM39, SPIE Press (1997); Service Science 283: 21-28 (1999)], p. substracto é sensibilizado com um grupo de ligação que permite a ligação de uma única molécula modificada. Alternativamente, pode ser gerada uma matriz de locais sensibilizados utilizando tecnologia de camada fina, tal como de Langmuir-Blodgett- Ver por ex., Zasadzinski et al., Science 263: 1726-1733 (1994). 0 espaçamento regular de proteínas é conseguido através da ligação da proteína a estes locais sensibilizados no substracto. As polimerases contendo a marcação são incubadas com o substracto sensibilizado de modo a que uma molécula de polimerase única se ligue a cada local sensibilizado. A ligação da. polimerase pode ser conseguida através de uma ligação covalente, ou não covalente. Exemplos de tais ligações comuns no estado da técnica incluem Ni2+/hexahistidina, estreptavidina/biotina, avidina/biotina, glutationa S-transferase (GST)/glutationa, 13 anticorpo monoclonal/ antigénio, e ligação à maltose proteina/maltose.

Uma representação esquemática de um centro reaccional é apresentada na Fig. 3. A polimerase de ADN (por ex. de Thermus aquaticus) é ligada a uma lamela de vidro de microscópio. A ligação é mediada por uma etiqueta de hexahistidina na polimerase, ligada por interacções não covalentes fortes a um átomo de Ni2+, que por sua vez se liga ao vidro através de um ácido nitrilotriacético e uma molécula de agente de ligação. 0 ácido nitrilotriacético está ligado covalentemente ao vidro por um agente de ligação ligado por química do silício. A química do silício está limitada a locais de pequeno diâmetro gravados a água forte a intervalos regulares sobre o vidro por litografia de feixe electrónico ou fotolitografia. Para além da polimerase. ligada, o centro reaccional inclui o molde da molécula de ADN e um iniciador de oligonucleótido ambos ligados à polimerase. A lamela de vidro constitui a lamela inferior da câmara reaccional de DNAS. A montagem da câmara reaccional de DNAS alberga a matriz, de centros reaccionais e medeia a troca de reagentes e tampão. Um exemplo de uma 'câmara reaccional de DNAS é ilustrada na Fig. 4. A câmara reaccional é um compartimento selado com lamelas transparentes superiores e inferiores. As lamelas são mantidas- na sua posição através de um invólucro metálico, ou plástico que pode ser montado e desmontado para permitir a substituição das lamelas. Existem duas aberturas que permitem o acesso à câmara. Úma abertura permite a entrada do tampão (e dos reagentes) e a outra abertura permite que o tampão (e produtos de reacção) sejam retirados da câmara. A lamela inferior suporta a matriz de centros reaccionais. Além disso, é ligado um prisma à lamela inferior para dirigir o feixe laser para a lamela inferior com um ângulo tal de modo a produzir a 14 reflexão interna total da luz laser dentro da lamela inferior. Esta disposição permite que uma onda evanesçente seja gerada sobre a matriz dos centros reaçcionais. Uma lente objectiva com uma abertura numérica elevada é utilizada para focar a imagem da matriz de centros reaccionais no sistema de máquina fotográfica digital. 0 invólucro da câmara reaccional pode ser equipado com elementos de aquecimento e de arrefecimento, tais como um aparelho de Peltier, para regular a temperatura das reacções.

Fixando o local da incorporação nucleótida dentro do sistema óptico pode ser obtida informação sobre a sequência a partir de muitas moléculas de ácido nucleico distintas simultaneamente. É apresentado um diagrama da matriz de centros reaccionais na Fig. 5. Como descrito acima, cada centro reaccional·' encontra-se ligado à lamela inferior da câmara reaccional. Representado no painel do lado esquerdo '{Campo Microscópico) encontra-se a . vista de uma matriz completa registada através de quatro acontecimentos sucessivos de detecção (um por cada um dos fluorocromos separados). O painel central representa uma vista ampliada de. parte de um campo que mostra o espaçamento de centros reaccionais individuais. Finalmente, o painel do extremo direito representa a vista da câmara de um único centro reaccional. A cada centro reaccional é atribuído 100 pixels para assegurar que se encontra verdadeiramente isolado. É mostrada a área da imagem de um único pixel relativa à área de 1 μιη x μιη atribuída a cada centro reaccional. A densidade dos centros reaccionais está limitada pela resolução óptica do sistema do microscópio. Praticamente isto significa gue os centros reaccionais têm que estar separados em pelo menos 0,2 μπι a serem detectados como. locais diferentes. 15 2. Selecção das Enzimas

Era geral, qualquer macrornol.écuia como a polimerase que catalise a formação de uma sequência de polinucleótidos pode ser utilizada. Nalgumas concretizações a polimerase pode ser um complexo enzimático que: 1) promove a associação (por ex. através de ligações de hidrogénio, ou emparelhamento. de bases) de um marcador (por ex. de um nucleótido normal, ou modificado, ou qualquer composto capaz de se associar especificamente com nucleótidos complementares moldes) com o nucleótido molde complementar no centro activo; 2) catalisa a formação de uma .ligação covalente entre o marcador e a cadeia sintética ou iniciador; e 3) traduza o centro activo para o· próximo nucleótido molde. .... Enquanto que as polimerases serão tipicamente enzimas proteináceas, será óbvio para um perito de capacidades médias do estado da técnica que a actividade da polimerase não' precisa de estar associada com uma enzima proteinácea. Por exemplo, a polimerase pode ser ela própria um ácido nucleico, como é o caso das ribozimas, ou enzimas baseados em ADN. Uma grande selecção de enzimas proteináceas encontra-se disponível para utilização na presente invenção. Por exemplo, a polimerase pode ser uma enzima, tal como uma ADN polimerase dirigida para o ADN, uma ADN polimerase, dirigida para o ARN, uma ARN polimerase dirigida para ADN ou feita de uma enzima nuclear e factores associados que aumentam a actividade do núcleo (por ex. aumentam a processabilidade ou a fidelidade da sub-unidade nuclear). A enzima tem de ser modificada de modo a ligar-se ao suporte. A enzima pode ser clonada por técnicas bem conhecidas no estado da técnica para produzir uma proteína recombinante com um marcador de ligação adequado. Numa concretização adequada, esta ligação é um marcador de 16 hexahistidina, que permite uma ligação forte aos iões niquel no suporte sólido. As enzimas preferidas são altamente processáveis, i.e. elas permanecem associadas à sequência nucleotidica molde durante uma sucessão de adições de nucleótidos, e são capazes de manter um complexo de polimerase-polinucleótido, mesmo quando não sintetizando activamente. Além disso, as polimerases preferidas são capazes de incorporar nucleótidos modificados em 3' . São obtidas quantidades suficientes de enzima utilizando técnicas recombinantes padrão conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Dabrowski e Kur, Protein Expr. Purif. 14: 131-138 (1998). 2.1 ADN Polimerase

Numa concretização preferida, a sequenciação é efectuada com uma ADN polimerase dependente de ADN. A ADN polimerase dependente de ADN catalisa a polimerização dos desoxinucleótidos para formar a cadeia complementar de um molde de. ADN iniciador. Exemplos de ADN polimerases dependentes de ADN incluem, mas não estão limitados a ADN polimerase ' de Bacillus stearothermophilus (Bst), o fragmento de Klenow da ADN polimerase I de E. coli, holoenzima de ADN polimerase III de E. colir o bacteriófago T4 e as ADN polimerases T7 e as de Thermus aquaticus (Taq}, Pyrococcus furiosis (Pfu), e Thermococcus litoralis (Vent). A polimerase do gene 5 T7 pode. também ser utilizada quando complexada com a tioredoxina. Tabor et al., J. Biol.· Chem., 262: 1612-1623 (1987). A ADN polimerase de Bst é preferida porque foi demonstrado que incorpora de forma eficiente 3'-0-(-2-Nitrobenzil)-dATP numa cadeia de ADN em crescimento, é altamente processável, muito estável, e falta-lhe actividade da 3'-5' exonuclease. A sequência de codificação 17 desta enzima tem sido determinada. Ver patente U.S. N°s 5,830,714 e 5,814,506.

Numa concretização preferida alternativa em que o ARN é utilizado como molde, a ADN polimerase dependente de ADN seleccionada funciona como uma ADN polimerase dependente de ARN, ou transcriptase reversa. Por exemplo, a .ADN polimerase de Thermus thermophilus (Tth) foi reportada como funcionando com uma ADN polimerase ARN dependente, ou transcriptase reversa em determinadas condições. Ver, Meyers e Gelfand, Biochem 30:7661-7666 (1991). Assim, a ADN polimerase Tth está ligada ao substracto e a reacção de sequenciação é conduzida sob condições em que este enzima vai sequenciar um molde de ARN, produzindo deste modo uma cadeia de ADN complementar.

Nalgumas concretizações uma sub-unidade de polimerase ou fragmento encontra-se ligado ao suporte e outras sub-unidades necessárias, ou fragmentos. são adicionadas como partes de um complexo com a amostra a ser sequenciada. Esta estratégia é útil para sistemas de polimerase que envolvem vários factores de replicação diferentes. Por exemplo, a utilização do sistema de replicação do bacteriófago T4 para a sequenciação DNAS, a polimerase gp34 pode ser ligada ao suporte. Outros factores de replicação, tal como o "clamp loader" (gp44/62) e "sliding clamp" (gp45) podem ser adicionados com o molde de ácido nucleico para aumentar a processabilidade do sistema de replicação. Uma estratégia semelhante pode ser utilizada com o sistema polimerase III de E. colif em que o núcleo de polimerase se encontra imobilizado na matriz e a sub-unidade do dímero β ("sliding clamp") e o subconjunto τ e γ (clamp loader) são adicionados à amostra de ácido nucleico antes da sequenciação por DNAS. Além disso, a estratégia pode ser utilizada com polimerases de ADN eucarióticas (por ex.a ou δ) e o PCNA correspondente (anti-génio nuclear da célula em 18 proliferação - do inglês proliferating cell nuclear antigénio). Nalgumas concretizações "sliding clamp" é o factor de replicação que está ligado na matriz e o resíduo de polimerase é adicionado em conjunto cora a amostra de ácido, nucleico. 2.2 Transcriptase reversa

Uma transcriptase reversa é uma ADN polimerase dependente de ARN - uma enzima que produz uma cadeia de ADN complementar em relação a um molde de ARN. Numa concretização preferida alternativa, uma enzima transcriptase reversa encontra-se ligada ao suporte para ser utilizada na sequenciação de moléculas -de. ARN. Isto permite a sequenciação de ARNs retirados directamente de tecidos sem transcrição reversa anterior. Exemplos de transcriptases reversas incluem, mas não se encontram limitados a transcriptase reversa do vírus Avian Myeloblastosis (AMV), .vírus da leucemia de murino de Moloney e vírus 1 da imunodeficiência humana (HIV.-l) , A transcriptase reversa de HIV-1 é particularmente preferida, porque se encontra bem caracterizada, tanto do ponto de vista estrutural como bioquímico. Ver por ex. Huang et al., Science 282: 1669-1675 (1998).

Numa concretização alternativa preferida a transcriptase reversa imobilizada funciona como uma ADN polimerase dependente de ADN, produzindo deste modo uma cadeia cópia de ADN da amostra, ou molde do ADN alvo. 2.3 ARN polimera.se

Ainda numa outra concretização alternativa preferida uma ARN polimerase dependente de ADN encontra-se ligada ao suporte, e utiliza ribonucleótidos marcados bloqueados para 19

gerar uma cópia de ARN -da amostra ou do ADN alvo a ser sequenciado. Exemplos preferidos destes enzimas incluem, mas não se encontram limitados a ARN polimerase de E. coli [Yin, et al., Science 270:1653-1657 (1995)] e ARN polimerases de bacterióf agos T7, T3, e SP6. Numa concretização alternativa preferida, uma ARN polimerase T7 modificada funciona como uma ADN polimerase dependente de ADN. Esta polimerase de ARN encontra-se ligada ao suporte e utiliza desoxiribonucleótidos bloqueados marcados para gerar uma cópia de. ADN de um ADN molde. Ver por ex. Izawa, et al., J. Biol. Chem. 273: 14242-14246 (1998).

2.4 ARN polymerase dependente de ARN

Muitos vírus utilizam ARN polimerases dependentes de ARN nos seus ciclos de vida. Numa concretização preferida uma ARN polimerase ARN dependente encontra-se ligada ao suporte e usa ribonucleótidos bloqueados marcados para gerar uma cópia de ARN de uma cadeia de ARN a ser sequenciada. Exemplos preferidos destas enzimas, incluem, mas não . se encontram limitados a ARN polimerases dependentes de ARN das famílias virais dos bromovírus, tobamovírus, tombusvírus, levivírus vírus semelhantes aos da hepatite C, e picornavírus. Ver por ex. Huang et al., Science 282: 1668-1675 (1998); Lohmann et al., J. Virol. 71:8416-8428 (1997); Lohmann et al., Virology 249: 108-118 (1998), e 0'Reilly e Kao, Virology 252: 287-303 (1998). 3. Preparação da Amostra 0 ácido nucleico a ser sequenciado pode ser obtido de qualquer origem. Exemplos de amostras de ácidos nucleicos a serem sequenciadas incluem ADN de dupla cadeia, ADN de cadeia simples, ADN de plasmídeo, primeira cadeia de cADN, 20 ADN genómico total, ARN, ADN modificado de corte/terminal (por ex. com promotor de ARN polimerase) , transposão in vitror marcado (por ex. inserção aleatória do promotor de ARN polimerase) . O ácido nucleico alvo, ou amostra a ser sequenciada é preferencialmente aparada (ou cortada) até a um determinado tamanho e emparelhada com iniciadores de oligodesoxinucleótidos utilizando técnicas bem conhecidas do estado da técnica. Preferencialmente, a amostra de ácido nucleico é desnaturada, neutralizada e precipitada e depois diluída até a uma concentração adequada, misturada com iniciadores de oligodesoxinucleótidos, aquecida a 65°C e depois arrefecida à temperatura ambiente num tampão adequado. O ácido nucleico é então adicionado à câmara reaccional após, a' polimerase ter sido imobilizada sobre o suporte, ou alternativamente é combinada com a polimerase -antes do passo de imobilização.

3.1 Marcação in vitro do transposão do molde de ADN

Numa concretização preferida alternativa transposases purificadas e elementos marcadores transponíveis serão utilizados para inserir aleatoriamente sequências especificas em moldes de ADN de cadeia dupla. Numa configuração o elemento transponível contém o promotor para ARN polimerase especifica. . Alternativamente, as repetições invertidas dos elementos transponíveis podem ser hibridizáveis com iniciadores de oligodesoxinucleótidos complementares para DNAS com ADN polimerases. Exemplos preferidos para estas transposases e elementos transponíveis incluem, mas não estão limitados a TC1 e TC3A de C. elegans e do sistema de teleósteo submetido a engenharia Sleeping Beauty. Ver por ex., Ivics et al., Cell 91:501-510 (1997); Plasterk, Curr. Top. Microbiol, Immunol. 21 204:125-143 (1996); van Luenen et al., EMBO J. 12: 2513- 2520 (1993), e Vos et al. , Genes Dev. 10: 755-761 (1996). 3.2 Molde de ADN de cadeia dupla

Ainda numa outra caracterização,· o ADN de cadeia dupla é sequenciado por Bst ADN polimerase sem a necessidade de emparelhamento de iniciadores. Ver por ex. Lu et al., Chin. J. Biotecnol. 8:2932 (1992). 3.3 Iniciadores São conhecidos vários iniciadores e promotores no estado da técnica e podem ser adequados para o prolongamento da sequência em DNAS. Os exemplos incluem iniciadores aleatórios, bibliotecas de pontos de ancoragem de iniciadores, mascar.amento de proteínas de ligação de cadeia simples/ biblioteca de iniciador, e primase.

Numa concretização preferida são utilizados iniciadores ancorados em vez de iniciadores aleatórios. Iniciadores ancorados são iniciadores oligonucleótidos de. sequências previamente identificadas. Os iniciadores ancorados, podem ser utilizados para uma determinação rápida de sequências específicas de ADN genómico completo de cADNs ou ARNs. Isto será em particular, para utilização numa genotipagem rápida e/ o.u para rastreio clínico , para' detectar polimorfismos, ou mutações em genes relacionados com doenças previamente identificados ou noutros genes de interesse. Uma vez que projectos genómicos e outros estudos identificaram sequências de interesse particular, então oligonucleótidos correspondentes a várias localizações dentro e à volta daquela sequência podem ser desenhados para serem utilizados na DNAS. Isto vai maximizar a quantidade de dados úteis que podem ser obtidos a partir de uma única corrida, de sequenciação, particularmente útil, 22 quando são utilizadas amostras de ADN complexas. Para identificação de genes de doenças modificados, ou polimorfos esta técnica vai obviar a necessidade de realizar genotipagem por quaisquer outros meios actualmente utilizados, incluindo a utilização de polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) [Orita et al, Genomics 5:874-879 (1989)], sequenciação por PCR ou tecnologia de hibridização de matriz de ADN [Hacia, Nat. Genet. 21: 42-47 (1999)]. A sequenciação directa do gene da doença é superior a SSCP e tecnologias de hibridização, porque elas são relativamente insensíveis e podem frequentemente identificar mutações positivamente, ou negativamente. Muitos oligonucleótidos âncora podem ser misturados de modo que centenas,; ou milhares de genes ou sequências possam ser identificadas simultaneamente. Em essência, qualquer gene conhecido, ou potencialmente relacionado com a doença pode ser sequenciado simultaneamente a partir de uma dada amostra. 4. Nucleótidos de terminação marcados bloqueados

Para serem úteis como um substracto terminador de cadeia pará os métodos da presente invenção, um nucleótido tem que conter um marcador detectável que o distinga de outros três nucleótidos.. Além disso, os nucleótidos terminadores de cadeia têm que permitir a incorporação de base, têm que terminar a elongação por incorporação e têm que ser capazes de serem desbloqueados para permitir o prolongamento sucessivo da cadeia, permitindo.deste modo os ciclos repetitivos de incorporação, monitorização para identificar bases incorporadas e desbloqueamento para permitir o próximo ciclo de prolongamento da cadeia. 0 desbloqueamento dos nucleótidos pode ser conseguido 23 enzimaticamente, quimicamente, ou preferencialmente fotoliticamente. A molécula base é uma NTP com modificação . em 3'- OH (R) , em 2' -OH (R' ) , ou a base (R' ' } . Num didesoxi padrão NTP, R=H, R'=H, e R"=H. R~H, R'=OH, e R,,P=H é um terminador de cadeia para ARN polimerases.

Um conjunto de nucleótidos úteis na terminação de cadeias para· os ' processos da presente invenção é R=bloqueío/marcação, R'=(H ou OH), e R''=H. Numa concretização preferida o nucleótido modificado é um marcador (por ex. um fluoroforo) ligado ao resíduo de açúcar através de um grupo 3'-0-(-2-nitrobenzil). O 3'-0-(-2-nitrobenzilo)-dNTP modificado é incorporado na cadeia em crescimento de ADN pela Bst ADN polimerase . ligada a um suporte. Para terminar o prolongamento da cadeia o nucleótido é desbloqueado por remoção do grupo 2- nitrobenzilo (com o seu marcador detectável correspondente) por exposição à luz com a frequência adequada. 0 nucleótido modificado 3'-0-(2-nitrobenzil)-dATP foi previamente utilizado num ciclo único de incorporação nucleótidíca e desbloqueamento. Metzker et· al., Nucleic Acids Res. ' 22: 4259-4267 (1994) . Ver também Cheesman, patente de invenção U.S. N° 5,302,509.

Um conjunto alternativo de nucleótidos úteis na terminação de. cadeias possui a configuração R=bloqueio, R' = (H ou OH), e R''-bloqueio/marcação. Numa concretização preferida o grupo marcado destacável é um marcador (por ex. um fluoroforo) ligado à base do nucleótido por um grupo 2-nitrobenzilo e um grupo destacável, é um grupo 3'-0-(-2-nitrobenzilo). 0 nucleótido modificado é incorporado na cadeia crescente de ADN pela Bst ADN polimerase ligada a um suporte. De modo a terminar o prolongamento da cadeia o nucleótido é desbloqueado por remoção tanto do grupo 24 marcado como do grupo de bloqueio por exposição à luz da frequência adequada.

Em qualquer uma ' destas configurações pode ser vantajoso colocar dois marcadores , (por ex. dois fluorocromos) em cada local bloqueado, como foi descrito em WO 98/33939.

Para a sequenciação quando a cadeia sintética é ARN ribonucleótidos marcados-bloqueados {i.e., R'=OH) são sintetizados como nucleótidos modificados desenhados para incorporação de ARN polimerase ligada ao suporte. 4.1 Marcadores fluorescentes A utilização de marcadores fluorescentes para identificar nucleótidos na sequenciação de ácidos nucleicos é bem conhecida do estado da técnica. Ver, por ex. patentes de invenção US N°s 1 4,811,218; 5,405,747; 5,547,839 e 5,821,058.' Metzker e Gíbbs revelaram recentemente uma família de nucleótidos marcados com fluorescência baseados nos Cy fluoroforos com características espectrais melhoradas. Patente de invenção US N° 5,728,529. Conjuntos alternativos de fluoroforos incluem: os fluoroforos baseados em rodamina, TARAM, ROX, JOE, e FAM; os fluoroforos BigDye® (Applied' Biosystems, Inc.}; e os fluoroforos BODIPY® (patente de invenção US N° 5, 728,529).·

Numa concretização preferida da presente invenção um marcador fluorescente encontra-se ligado ao grupo de bloqueio fotolábil 3' (i.e. local de bloqueio)-. Exemplos de nucleótidos modificados para DNAS são ilustrados esquematicamente na Fig. 1 (painéis A-C). O painel A representa uma desoxiadenosina trifosfato modificada por ligação a um conjugado de agente de ligação-fluorocromo fotolábil com o carbono 3' da ribose. Fotólise do agente de ligação para luz < 360 mti faz com que o fluorocromo se 25 dissocie, deixando o grupo 3'-OH do nucleótido intacto. O painel B representa uma configuração, alternativa em que o fluorocromo se encontra ligado à base do nucleótido através de um agente de ligação fotolábil. 0 3'-OH é bloqueado por um grupo fotolábil separado. Nucleótidos modificados tais como os representados nos painéis A e B são exemplos de desoxiribonucleótidos marcados-bloqueados para utilização na DNAS. Uma variedade de. fluorocromos e grupos fotolábeis pode ser utilizada na síntese de desoxiribonucleótidos marcados-bloqueados. Além disso, os ribonucleótidos podem também ser ' sintetizados para serem utilizados com polimerases de ARN. Quatro fluorocromos com propriedades espectrais distintas permitem que os quatro nucleótidos sejam distinguidos durante a fase de detecção do ciclo reaccional de DNAS. Fig. .1 (Painel C) disponibiliza uma representação .esquemática de quatro . nucleótidos de terminação marcados-bloqueados diferentes para utilização na sequenciação directa de ácidos nucleicos.

Após a incorporação dos nucleótidos terminador.es marcados-bloqueados pelas moléculas de polimerasé imobilizadas os fluoroforos são iluminados para excitar a fluorescência em cada uma das quatro. espécies de fluoroforos. A emissão em cada ponto da matriz é detectada opticamente e registada. Assim que a informação da sequência éobtida os agentes de espaçamento fotolábeis são removidos por iluminação com luz no comprimento de onda de desbloqueamento (<360 nm) . É apresentado na Fig·. 2 uma volta única do ciclo reaccional, i.e. (1) a incorporação de um nucleótido marcado-bloqueado; (2). a detecção do nucleótido marcado; e (3) o desbloqueamento do nucleótido. É através de voltas sucessivas do ciclo da reacção de DNAS que a informação da sequência primária é deduzida. No primeiro painel (passo 1) está um exemplo de um molde de cadeia simples de ADN (3'-AGCAGTCAG-5') do lado esquerdo 26 encontra-se uma sequência iniciadora curta (5'-C-3') e um dGTP marcado-bloqueado a sofrer incorporação. No painel central (Passo 2) . o fluorocromo BODIPY564/57° é excitado por iluminação a laser YAG a 532 nm. 0 fluorocromo emite luz centrada a um comprimento de onda de 570 nm que é detectado pelo sistema do microscópio. Finalmente, no Passo 3,· a fotólíse do agente de ligação por iluminação· com luz <360 nm dissocia simultaneamente um marcador fluorocromo e liberta o bloqueador 3' . Como resultado o iniciador é· prolongado com mais uma base (5'-TCG-3') ' e o 3' -OH é restabelecido do modo a que outro nucleótido possa ser incorporado no próximo ciclo. 4.2 Níveis de pontos quânticos

Numa concretização alternativa preferida da presente invenção cada um dos terminadores bloqueados encontra-se marcado cora um tipo diferente de' pontos quânticos. Recentementé pontos quânticos (QDs- do inglês quantum dots) semi-condutores altamente .luminescentes foram acopladas covalentemente a biomolêculas. Chan e Nie, Science 281: 2016-2018 (199.8) . Estes marcadores luminescentes apresentam características espectrais melhoradas em relação a corantes orgânicos tradicionais e mostrou-se permitirem uma detecção sensível com um microscópio de fluorescência confocal ao nível de partícula única. Nesta caracterização, terminadores de pontos quânticos bloqueados são incorporados detectados e desbloqueados de uma maneira semelhante à descrita acima para os terminadores de fluorescência bloqueados. 4.3 Partículas de ressonância de plasmâo 27

Numa concretização preferida, cada um dos terminadores bloqueados é marcado, com uma partícula de ressonância de plasmão de prata coloidal (PRP -do inglês plasmon ressonant particle). Schultz et al., J. Clin. Ligand Assay 22:214-216 (1999) ; Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 996-1001 (2000) . As PRPs são nanopartículas metálicas tipicamente de 40-100 nm de diâmetro que podem ser submetidas a engenharia para dispersar de forma eficiente a luz, em qualquer lado na gama visível do espectro. Estas partículas são suficientemente brilhantes para serem utilizadas na detecção de molécula única. Foi mostrado que as PRPs produzem um fluxo dispersante equivalente ao de 5 milhões de moléculas de fluorosceína e maior do que 105 vezes do que os pontos quânticos típicos. Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97:996-1001 (2000). Além disso, quando se faz uma imagem por CCD padrão o pico espacial pode ser localizado com uma precisão de 10 Ã, uma precisão semelhante à observada na imageologia de fluoroforos únicos em nanopartículas de ouro. Denk e Webb, Appl. Opt. 29: 2382-2391 (1990). Para facilitar a detecção, em determinadas concretizações cada diferente tipo de nucleótido é modificado com uma PRP de uma cor diferente. Para resolver o sinal de duas PRPs incorporadas numa amostra única em centros reaccionais vizinhos, os centros reaccionais têm que estar pelo menos separados por um comprimento coerente (aproximadamente o comprimento de onda da luz de iluminação). Além disso, difraeção por Rarnan pode ser utilizada para detectar PRPs. Nie e Emory, Science 275: 1102-1106 (1997). 5. Detecção de nucleótidos incorporados

Avanços nas técnicas microscópicas permitiram a detecção espectroscópica de moléculas isoladas. Ver, Nie e 28

Zare, Annu. Ver, Biophys. Biomol. Struct. 26: 567-596 (1997), e Keller et al., Appl. Spectrosc. 50: Ϊ2Α-32Α (1996). Por exemplo, moléculas únicas fluorescentes em solução aquosa podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-do inglês total internai reflection fluorescence microscopy), microscopia confocal, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET -do inglês fluorescence resonance energy transfer)', espectroscopia de ressonância de plasmão de superfície (SPR). Ver Dickson ét al., Nature 388:355-358 (1997); Dickson et al., Science 274: 966-969 (1996); Ishijima et al., Cell 92: 161-171 ' (1988); Iwane et al., FEBS Lett. 407:235-238 (1997); Nie et al-, Science 266:1018-1021 (1994); Pierce et al., Nature 388:338 (1997); Ha et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: .6264-6268 (1996), e Gordon et al., Biophys. J. 74:2702-2713 (1988). Yokota et al., Phys. Rev. Letts. 80:4606-4609 (1998). Uma vez que moléculas. isoladas podem ser detectadas espectroscopicamente, amostras de ácidos nucleicos clonados deixam de ser necessárias para a sequenciação. Uma cópia única do molde, contida num centro reaccional é um tamanho de amostra suficiente. Os aparelhos e métodos da presente invenção permitem a resolução de sinais a partir de marcadores isolados de moléculas num plano óptico. e a sua conversão subsequente em informação digital. Os fotões são recolhidos a partir de um plano fino grosseiramente equivalente ao volume dentro do qual a enzima e base recentemente sintetizada residem. ·.

5.1 TIRFM

Quando a luz é dirigida a um ângulo muito particular num meio de refraeção. com uma dada espessura, tal como uma lamela de vidro, vai.resultar uma reflexão total interna 29 (TIR) . Acima do plano do meio de refracção, ocorre um fenómeno electromagnético conhecido como onda evanescente. 0 principio da onda evanescente é representado na Fig. 6. A onda evanescente estende-se da superfície até a uma distância da ordem do comprimento de onda da luz· É um facto importante que uma onda evanescente possa ser utilizada para excitar fluorocromos a esta distância. Quando este fenómeno é utilizado para microscopia é chamada microscopia de fluorèscência de reflexão interna total (TIRFM). A disposição das lamelas do microscópio, prisma e feixe de laser representados nesta figura vai conduzir a TIR dentro da lamela, inferior e assim é gerada uma onda evanescente a 150 nm da superfície superior da lamela inferior. Moléculas de fluorõcromo, tais como as. dos centros reaccionais de DNAS serão excitadas e podem ser detectadas opticamente utilizando a. lente objectiva, microscópio e sistema da máquina fotográfica. É conseguida uma razão elevada sinal-ruído.utilizando uma excitação de onda evanescente, porque apenas aquelas moléculas de fluorocromos dentro da onda evanescente são estimuladas.

Numa concretização preferida TIRFM é utilizada para detecção. Encontra-se representado na Fig. 7 a disposição do equipamento necessário para efectuar a DNAS utilizando TIRFM. Um . laboratório microscópico padrão encerra o conjunto da câmara reaccional, lente objectiva, roda do filtro, íntensificador de prato de microcana.is, e câmara arrefecida CCD. A luz laser ' e dirigida para o prisma através de espelhos dicroicos e portas controladas por computador. É utilizada a excitação por onda evanescente para estimular a amostra. A excitação por onda evanescente é conseguida por reflexão interna total na interface vidro-líquido. Nesta interface, o campo electromagnético óptico não cai abruptamente para zero, mas decai exponencialmente para a fase líquida. O campo em decaimento rápido (onda 30 evanescente) pode ser utilizado para excitar moléculas fluorecentes numa camada fina de aproximadamente 150 nm imediatamente a seguir a esta interface. Ver, pedido de patente de invenção PCT WO 98/33939. A sensibilidade que permite a detecção de moléculas isoladas surge do pequeno volume da amostra analisado. Uma vantagem de TIRFM é que a matriz completa do centro reaccional pode ser sujeita a imageologia simultaneamente. Imagens da matriz de centros reaccionais encontram-se focalizadas na face do intensificador de prato de mfcrocanais, através da barreira de filtros transportados pela roda de filtros. O intensificador de pratos de microcanais amplia a imagem e transfere-a para a face da máquina fotográfica com CCD arrefecido. Os dados da imagem são lidos a partir do circuito integrado do CCD e processados num microcomputador. Um laser de estimulação, ou um conjunto de lasers de estimulação é dirigido para o espécimen através de uma mesa óptica. Outro laser desbloqueia o grupo protector 3'-OH: Podem ser necessários lasers adicionais para uma estimulação óptima do fluorocromo. Uma roda de filtros está também incluída na invenção para alterar as barreiras de filtros de modo que os quatro fluorocromos diferentes (cada um correspondente a um diferente tipo de nucleótido marcado bloqueado) são distinguidos de uma forma que não é ambígua.

Como indicado na Fig. 7 é construído um prisma sobre a lâmina do microscópio para dirigir o laser para a lâmina fora do microscópio. Ishijima et al., Cell 92: 161-171 (1998). Alternativamente, a objectiva tipo TIRFM pode ser utilizada para detecção por fluorescência. A luz laser é dirigida, através de uma lente objectiva fora do centro de modo a que seja conseguido um ângulo crítico utilizando a própria lente objectiva. Ver, Tokunaga et al., Biochem. Biophys. Res. Coram. 235:47-53 (1997). 31 5.2 Microscopia confocal

Numa concretização preferida alternativa é utilizada microscopia confocal para a detecção. Na microscopia confocal um feixe de luz é levado para o seu foco limitado por difracção dentro de uma amostra utilizando uma imersão em óleo, uma lente objectiva de elevada abertura numérica (NA) . Foram deteçtadas moléculas isoladas em solução por fluorescência confocal de fotão múltiplo. Mertz, et al., Opt. Lett. 20:2532-2534. (1995). Numa concretização desta invenção os marcadores nucleótidos são detectados por microscopia confocal de fotão múltiplo de varrimento. Nie et al. Science,266: 1018-1021 (1994). 5.3 Energia de transferência de ressonância de fluorescência (FRET)

Numa concretização preferida alternativa, a tecnologia FRET é utilizada para detecção. Ά energia de transferência de ressonância de fluorescência é uma interacção dependente da distância entre os estados electrónicos excitados de duas moléculas, de corantes em que a excitação é transferida de uma molécula doadora para uma molécula aceitadora sem a emissão de um fotão. FRET está dependente do inverso da sexta potência da separação intermolecular tornando-a útil ao longo de distâncias comparáveis com as dimensões de macromoléculas biológicas. Assim, FRET . é uma técnica importante para investigar uma . variedade de fenómenos biológicos que produzem alterações na proximidade molecular.

Esta técnica faz uso de algumas propriedades não usuais de moléculas corantes. Em experiências que utilizam corantes fluorescentes, a molécula de corante encontra-se tipicamente excitada a um comprimento de onda de luz e os 32 dados são recolhidos a um comprimento de onda mais longo. Contudo, quando duas moléculas de corantes diferentes são colocadas muito próximas uma da outra, a luz pode ser adsorvida por uma molécula (o doador) e a sua emissão pode ser imediatamente capturada pela molécula adjacente (o aceitador) . Luz a um comprimento de onda mais longo pode então ser emitida a partir do aceitador. Na maior parte das aplicações os corantes doadores e aceitadores são diferentes, neste caso FRET pode ser detectado pelo aparecimento de fluorescência sensível do aceitador, ou por paragem da fluorescência do doador. Quando õ doador e o aceitador são os mesmos, FRET pode ser detectado pela despolarização da fuorescência resultante.

As.moléculas de doadores e aceitadores têm que estar em grande proximidade (tipicamente 10-100 Ã). O espectro de absorção do aceitador tem que se sobrepor ao espectro de emissão de fluorescência do doador, e as orientações do dipolo de transição do doador e do aceitador têm que -ser aproximadamente paralelas. O FRET pode ser utilizado para aumentar a razão sinal ruído. Adicionalmente, FRET'pode ser utilizado em DNAS para evitar a necessidade de um agente de espaçamento fotolábil nos fluorocromos. FRET é utilizado habitualmente para medir a distância entre moléculas, ou parte delas, ou para detectar interacções moleculares transientes. Na prática, moléculas candidatas, ou partes diferentes da mesma molécula são modificadas por dois grupos fluorescentes diferentes. A solução é então excitada pela luz correspondendo a um comprimento de onda de excitação mais curto dos dois fluorocromos. Quando o segundo fluorocromo se encontra muito próximo do primeiro será excitado pela emissão de energia do primeiro e vai emitir, ao seu próprio comprimento de onda característico. A eficiência (rendimento quântico) da conversão encontra-se directamente 33 relacionado com a distância fisica entre os dois fluorocromos. Para aplicação especifica na DNAS, moléculas de polimerases são marcadas com um fluorocromo que se comporta como um doador de fotões para os nucleótidos modificados. Isto iria limitar a sua excitação para o local activo da polimerase, ou para qualquer outro local-apropriado da polimerase. Um tal arranjo iria aumentar significativamente a razão sinal ruido da detecção nucleótidica. Além disso, devido ao facto de apenas nucleótidos na polimerase serem excitados por FRET, quando aplicados à DNAS tornaria desnecessária a remoção de resíduos fluorescentes previamente incorporados. FRET foi efectuado ao nível da molécula isolada como necessário para DNAS [Ha et al., Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 93:6264-6268 (1996)], e foi òptimizado para quantificação por microscopia de fluorescência. Gordon et al., Biophys. J. 74:2701-2713 (1998). De forma óptima a polimerase seria sintetizada como uma proteína fluorescente verde recombinante (GFP -do inglês green fluorescent protein) proteína de fusão uma vez .que isto iria eliminar a necessidade de derivâtizar a polimerase e ao contrário da maior parte dos fluorocromos mais habitualmente utilizados GFP é substancialmente resistente a fotobranqueamento. Contudo, pode-se verificar que a disposição óptima é uma polimerase quimicamente modificada à qual um fluorocromo sintético, ou um ponto quântico foram ligados. 5.4 Ressonância de plasmão de superfície

Numa concretização ressonância de plasmão de superfície (SPR -do inglês surface plasmon resonance) é utilizada para detectar a incorporação de marcador na amostra de ácido nucleico. A SPR é utilizada para medir as propriedades de uma solução detectândo as diferenças no 34' índice de refracção entre a fase no seu todo da solução e a região de onda evanescente. SPR foi recentemente utilizada para imageologia de molécula única de.· proteínas marcadas com fluorescência em metal através de plasmões de superfície em solução aquosa. Yokota et al., Phys. Rev. Letts. 80:4606-4609 (1998). Esta técnica envolve o revestimento da superfície da câmara reaccional com uma camada fina de metal para aumentar o sinal de nucleótidos marcados com fluorescência.·

5.5 O detector de DNAS O detector é uma máquina fotográfica com CCD arrefecido equipada com um intensificador de placa de microcanais. Um diagrama de blocos da constituição do instrumento é apresentado .na Fig. 7. Máquinas fotográficas CCD intensificadas-arrefecidas disponíveis recentemente possuem resoluções de pelo menos 1000x1000 pixeis. Numa concretização preferida desta invenção, uma matriz consiste em 100x100 centros reaccionais. Assim, quando se faz uma imagem da matriz sobre a face da máquina fotográfia, a cada centro reaccional é alocado aproximadamente 10x10 pixeis. A DNAS utiliza uma lente 63x1.4 NA para fazer a imagem de uma matriz (grelha de 100x100 pm) de centros reaccionais espaçados regularmente apresentados na Fig. 5. A informação pode ser gravada simultaneamente a partir de 10000 centros reaccionais. Esta resolução esperada é comparável com a conseguida num relatório recente, em que TIRFM foi utilizado para fazer uma imagem de uma amostra de fluoroforos vermelhos do Nilo e produz imagens de um grande número de moléculas isoladas. Foi feita uma imagem de uma única molécula de vermelho do Nilo de forma não ambígua num quadrado de 8x8 pixeis. Dickson et al., Nature 388:355-358 (1997) . 35 6. Ciclo de sequenciação

Encerrando a matriz de DNAS de centros reaccionais e mediando a troca de reagentes e tampão trata-se do conjunto da câmara reaccional. A câmara reaccional é um compartimento selado com lamelas transparentes superiores e inferiores. As lamelas são mantidas no lugar por um invólucro de metal, ou de plástico que pode ser montado, ou desmontado para permitir a substituição das lamelas. Existem duas aberturas que permitem o acesso à câmara. Uma abertura permite a entrada de tampão (e reagentes) e a outra abertura permite que o tampão (e produtos de reacção) sejam retirados da câmara. A lâmina inferior transporta a matriz do centro reaccional. Além disso um prisma encontra-se ligado à lamela inferior para dirigir o feixe laser para a lamela inferior a um tal ângulo de modo a produzir reflexão interna total da· luz laser na lamela inferior. Esta disposição permite que uma onda evanescente seja gerada sobre a matriz de centros reaccionais. Uma lente objectiva de elevada abertura numérica' é utilizada para focar a imagem da matriz dos centros reaccionais para o sistema da. máquina fotográfica digital. O invólucro da câmara reaccional pode ser ajustado com elementos de aquecimento e de arrefecimento, tal como um aparelho de Peltier para regular a temperatura das reacções. Uma, amostra de ácido nucleico é \ introduzida na câmara reaccional em solução tamponizada contendo todos os quatro terminadores nucleosidos trifosfatos marcados.

Uma representação esquemática da montagem da câmara reaccional é apresentada na Fig. 4. Os centros reaccionais são monotorizados pelo sistema do microscópio até uma maioria de centros reaccionais contenham polimerase imobilizada ligado a um molde, com um único nucleótido terminador· incorporado marcado-bloqueado. A câmara 36 reaccional é então lavada com tampão de lavagem. É então determinada para cada centro reaccional a incorporação específica de nucleótidos. A seguir à detecção, a câmara reaccional é irradiada para desbloquear o nucleótido incorporado e lavado mais uma vez com tampão de lavagem. A presença de nucleótidos marcados é mais uma vez monitorizada antes de reagentes frescos serem adicionados para reiniciar a síntese. Esta segunda detecção verifica que um centro reaccional é desbloqueado com êxito. A presença de um nucleótido marcado na câmara reaccional durante este passo indica que o centro reaccional não foi desbloqueado.· Deste modo, a leitura seguinte deste centro reaccional durante o próximo passo de detecção do ciclo será ignorada. Assim, ignorando os sinais de centros reaccionais que não foram desbloqueados com êxito, os processos da presente invenção evitam os problemas causados pelo desbloqueamento incompleto em métodos de sequenciação do estado da técnica. 0 ciclo de sequenciação descrito acima é repetido até uma grande proporção dos centros reaccionais falhem persistentemente a incorporar ou desbloquear nucleótidos adicionais. Métodos para regular a alimentação (e. 'remoção) de reagentes dos centros reaccionais, assim como do meio da câmara reaccional (por ex. a temperatura, e ambiente oxidativo) são incorporados na câmara reaccional utilizando técnicas comuns no estado da técnica. Exemplos desta tecnologia são descritos em: Kricka, Clinicai Chem. 44:2008-2014 (1998); ver também a patente de invenção US n° 5,846,727. 7. Software de aquisição da sequência O software de aquisição da sequência adquire' e analisa os dados da imagem durante o ciclo de sequenciação. No 37 inicio de uma experiência de sequenciação é determinado um bin de pixels contendo cada centro reaccional. Durante cada ciclo de sequenciação são produzidas quatro imagens da matriz completa e cada imagem corresponde à excitação de uma das quatro bases de nucleótidos marcadas - com fluorescência A, C, G, ou T (U) . Para cada bin de centro reaccional, todas as quatro imagens são analisadas para determinar quais espécies nucleótidas foram incorporadas naquele centro reaccional durante aquele ciclo. Como descrito acima, o bin do centro reaccional correspondente a um determinado centro reaccional contém uma matriz de 10x10 pixeis. O número total de fotões produzidos, pelo único fluoroforo naquele centro reaccional é. determinado pela soma do valor de cada pixel na matriz. Tipicamente são emitidos 500-1500 fotões de um único fluoroforo, quando excitado durante 100 milisegundos com um laser- que produz uma intensidade de 5kW/cm2 à superfície da lamela, do microscópio. Dickson et al. Science 274: 966-969 (1996). As somas dos bin de centros reaccionais de cada uma das quatro imagens são comparados e a imagem que produz uma soma significativa- corresponde à base incorporada recentemente naquele centro, reaccional. As imagens são processadas para cada um dos centros reaccionais e uma matriz de nucleótidos incorporados é registada. Um exemplo de um algoritmo de aquisição de dados é fornecido na Figura 8. Tal processamento é'efectuado em tempo real a baixo custo com os computadores modernos de processamento de imagem.

Leituras múltiplas da matriz do centro reaccional podem ser necessárias durante o passo de detecção para assegurar que os quatro nucleótidos sejam adequadamente distinguidos. Tempos de exposição podem ser tão baixos com 100 ms, e o tempo de leitura do circuito integrado do CCD pode ser tão longo como 250 ms. Assim, o tempo máximo necessário para quatro leituras completas da matriz é 1,5 38 segundos. 0 tempo total para um dado ciclo incluindo adição de reagente, remoção e lavagens é certamente menor do que 10 segundos. Neste contexto, um aparelho de sequenciação consiste numa matriz de 10,000 centros reaccionais que é capaz de detectar pelo menos 360 bases por local por hora, ou· 3,6 megabases por hora de sequência total, como uma estimativa conservadora. Esta velocidade é significativamente mais rápida do que as das metodologias tradicionais de sequenciação.

Para além dos curtos tempos de sequenciação, os métodos da presente invenção não necessitam de processos com um elevado consumo de tempo de amplificação de amostra (clonagem, ou PCR), e electroforese em gel. A falta de consumíveis necessários para amplificação da amostra e electroforese acoplada com pequenos volumes de reagentes {o volume da câmara reaccional é da ordem de.10 microlitros) e as necessidades reduzidas· de trabalho manual, reduzem drasticamente o custo por nucleótido sequenciado-em relação a técnicas de sequenciação tradicionais. 8. Software de análise sequencial É apresentada na Fig. 8 um exemplo de aquisição de dados de DNAS utilizando uma matriz 3x3 de centros reaccionais. Contudo, numa configuração típica DNAS irá utilizar uma matriz de 100x100 centros reaccionais. Neste exemplo são apresentados 4 ciclos de DNAS. Para cada ciclo são produzidas quatro imagens da matriz. Cada imagem corresponde a um comprimento de onda' de excitação especifico e combinação de barreira : de filtros correspondendo assim à incorporação de um nucleótido modificado específico. Considerar a matriz acima à esquerda (Ciclo 1, A) . Neste caso quando se utiliza o .conjunto de nucleótidos modificados BODIPY Άf é 3'-O-(DM-NPE- 39 (BODIPY493/5o3) ) “2' -desoxy ATP. Assim, o centro reaccional é iluminado com luz de 488 nm do laser .Ar e a imagem focalizada num filtro. barreira a 503 nm. Cada um dos nove elementos na matriz 3x3 corresponde a uma área de pixeis de 10x10 da resposta da máquina fotográfica CCD. Para cada uma das quatro imagens cada pixel do centro reaccional é analisado para determinar se um dado nucleótido foi incorporado. Assim, vemos no exemplo, que no Ciclo 1, A, ATPs desoxi modificados foram incorporados em centros reaccionais XI e Zl. Assim, na tabela os primeiros nucleótidos registados para os centros reaccionais X 1 e Zl são Ά' s. Se considerarmos um dado centro reaccional, por ex., o centro reaccional XI ao longo dos quatro ciclos de DNAS vemos que no primeiro ciclo o centro reaccional incorporou um Ά'; no segundo ciclo um 'C', no terceiro ciclo um 'C' e no quarto ciclo um 'Τ'. Assim, o fragmento da sequência do molde de ADN ligado ao centro reaccional Y3 é o complemento inverso de 5'-ACCT-3', que é.5'-TGGA-3'. A sequência primária existe como uma matriz de' sequências, cada uma derivada de um único centro reaccional. O comprimento da sequência de cada centro reaccional irá depender do número de ciclos que um dado centro permanece activo numa experiência. Com base na processabilidade de polimerases.de clones reportadas no estado da técnica são de esperar comprimentos de sequências da ordem de várias centenas a vários milhares de bases.

Numa concretização da presente invenção, uma amostra de ácido nucleico é aparada antes da. inclusão num centro reaccional. Uma vez que estes fragmentos tenham sido sequenciados é utilizado o software de análise de sequências para montar as suas sequências em extensões contíguas. Existem muitos algoritmos no estado da técnica que podem comparar sequências e deduzir a sua sobreposição correcta. Foram desenhados novos algoritmos para processar 40 grandes quantidades de dados sequenciais de estratégias de sequenciação "tipo caçadeira -do inglês shotgun" (aleatórias).

Numa concretização preferida, um algoritmo reduz inicialmente a quantidade de dados a serem processados utilizando apenas duas sequências mais pequenas derivadas de qualquer terminal da sequência deduzida a partir de um centro reaccional único numa determinada experiência. Esta estratégia tem sido proposta para ser utilizada numa sequenciação de "caçadeira" do genoma humano. Rawlinson, et al.f J. Virol. 70:8833-8849 (1996); Venter et al., Science 280: 1540-1542 (1998). Utiliza algoritmos desenvolvidos no

Institute for Genome Research (TXGR). Sutton, et al., Genome Sei. Technol. 1: 9 (1995).

Numa concretização alternative preferida os dados primários são comprimidos numa impressão digital de pequenas palavras (por ex. locais de enzimas de restrição de hexanucleótidos) e estas impressões digitais podem ser comparadas e reunidas em maiores blocos contínuos de sequências (coxitigs). Esta técnica é semelhante à utilizada para deduzir sequências em sobreposição após hibridização com oligonucleótidos. Idury e Waterman, J. Comput. Biol. 2:291-306 (1995). Uma outra concretização utiliza ainda dados de sequenciação existentes de mapas genéticos, ou de ligações físicas, para auxiliar na montagem de novos dados de sequências de genomas completos, ou de grandes peças genómicas.

9. Utilidade da DNAS (a) Aplicações clinicas A importância dos diagnósticos genéticos em medicina não pode ser subestimada. A mais óbvia é a utilização de 41 técnicas que podem identificar transportadores de traços genéticos nocivos para diagnóstico pré-natal e neo-natal. Actualmente, testes bioquímicos e análises de cariotipos são as técnicas habitualmente mais utilizadas, mas estas possuem limitações claras. Os testes bioquímicos são apenas úteis, quando existe uma alteração na actividade, ou níveis de uma enzima, ou proteína que foi associada com um estado de doença e para o qual foi determinado um teste especifico. Mesmo quando foi atribuída uma proteína a um estado de doença, o desenvolvimento de tais reagentes pode ser difícil, caro e moroso. As análises de cariotipos são apenas úteis para identificar grandes desordens genéticas, tais como translocações ploidia e grandes supressões. Ape sar de ser teoricamente possível determinar se os indivíduos possuem alelos defeituosos de um determinado gene, através de tecnologias, actuais de ADN, programas de rastreio eficaz são apenas actualmente praticáveis em casos em que uma mutação comum se encontra associada com a doença e a sua presença pode ser determinada, através de técnicas que não são de sequenciação.

Os métodos da presente invenção permitem que grandes quantidades de dados da sequência de ADN sejam determinados a partir de um doente individual com pouco esforço técnico e sem; a necessidade de clonar ADN do doente, ou amplificar sequências específicas por PCR. As. moléculas isoladas podem ser sequenciadas directamente a partir de uma simples preparação de ADN a partir do sangue do doente, amostras de tecidof ou do fluido amniótico. Deste modo a DNAS pode ser utilizada para o diagnóstico clínico de desordens genéticas, traços, ou outras. características possíveis de prever a partir da informação primária da sequência de ADN, tal como diagnósticos pré-natais, neonatais e pós-natais, ou detecção de desordens congénitas; análise patológica de doenças somáticas provocadas pela recombinação genética e/ 42 ou mutação; identificação, ou perda de heterozigosidade, mutações pontuais, ou outras alterações genéticas associadas com o cancro, ou presentes em estados pré-cancerosos.

Os métodos da presente invenção podem também ser utilizados para identificar patogéneos que provocam doenças (por ex. virais,' bacterianos, fúngicos) por sequenciação directa de tecidos afectados. (b) Identificação do gene funcional

Rastreios ' genéticos de larga escala de genes envolvidos em determinados processos, por exemplo durante ó desenvolvimento sao agora comuns e são aplicados a vertebrados com grandes genomas· como o peixe zebra (Danio rerio) e o anfíbio (Xenopus tzopicalis}. Tentativas para clonar genes mutantes em ratinhos e mutantes foram longas e difíceis e mesmo em organismos geneticamente mais tratáveis como o peixe zebra é ainda moroso e difícil.

Uma vez que os métodos da presente invenção permitem a sequenciação de um genoma completo do tamanho de um mamífero num curto período de tempo, a identificação de genes mutantes pode'ser conseguida por rastreio em volume, da sequência', i.e. sequenciação dos genomas completos ou de grandes segmentos genómícos de um veículo e comparação cora a sequência dos genomas completos, ou de grandes segmentos genómicos de diferentes membros de uma dada espécie.

De forma semelhante, os métodos da presente invenção permitem uma sequenciação fácil dos genomas bacterianos completos. A informação da sequência gerada desta maneira pode ser utilizada para uma identificação rápida de genes que codificam para novas enzimas a partir de uma larga variedade de organismos, incluindo bactérias extremofílicas. 43

Além disso, os métodos da presente invenção podem também ser utilizados para avaliação de taxas de mutação em resposta a mutagéneos e radiação em qualquer tecido, ou tipo de célula. Esta técnica é útil para optimização de protocolos para futura pesquisa de mutações. (c ) Análise de alterações genéticas em tumores

Muitos cancros, possivelmente todos os cancros iniciam-se com alterações específicas no genoma de uma célula, ou de algumas células que crescem depois não verificadas pelos controlos do crescimento normal. A maior parte do tratamento de cancros está dependente da resposta fisiológica específica destas células anormais a agentes particulares. 0 método da presente invenção vai permitir a geração rápida de um perfil genético dè' tumores individuais permitindo aos investigadores seguirem . precisamente que alterações genéticas acompanham várias fases da progressão de um tumor. Esta informação vai também permitir o desenho de agentes específicos para tomarem como alvos células cancerígenas para assaltos feitos por medida a tumores individuais. (d.) Análise da variação genética

Muitos traços fisiológicos importantes, tal como o controlo da pressão sanguínea são controlados por uma multiplicidade de locais genéticos. Actualmente estas características são analisadas por análise quantitativa de ligação característica (QTL -do inglês quantitativa trait linkage). Geralmente na análise QTL é utilizado um grupo de marcadores de ligações genéticas polimorficas· num grupo de sujeitos com uma característica particular, tal como 44 elevada pressão arterial familiar crónica. Através de uma análise da ligação dos marcadores com a caracteristica é desenhada uma correlação entre um conjunto de locais particulares e a caracteristica. Geralmente um punhado de locais contribui para a maior parte da caracteristica e um grupo maior vai ter efeitos menores na caracteristica.

Os métodos da presente invenção permitem uma sequenciaçâo rápida do genoma completo. Assim, utilizando o método da presente invenção é efectuada a análise QTL a uma escala muito fina com um grande grupo de sujeitos e são facilmente identificados todos os locais principais que contribuem para uma determinada caracteristica e a maior parte dos locais menores.

Além disso, o método da presente invenção pode ser utilizado na construção de árvores filogenéticas e/ ou relações de parentalidade, através da estimativa de recombinações genómicas anteriores (por- ex. inversão, transloc.ação, supressão, mutação pontual), ou através de acontecimentos recombinantes meióticos anteriores que afectam a distribuição de marcadores polimórficos. 0 método da presente invenção pode ser utilizado para identificar mutações ou polimorfismos com o objectivo de associar o genótipo com o fenótipo. O método da presente invenção pode também ser utilizado para identificar a sequência daqueles mutantes, ou genes polimórficos resultando num. fenótipo especifico, ou contribuindo para uma caracteristica poligénica. (e) Aplicações na agricultura A eficiência na agricultura e produtividade é aumentada, através da geração de plantas de reprodução e animais com características genéticas óptimas. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, 45 para revelar variação genética subjacente tanto a caracteristicas desejáveis e indesejáveis em plantas e animais importantes sob o ponto de vista da agricultura. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para identificar patogéneos de plantas e animais, e para desenhar métodos para os combater. (f) Aplicações forênsicas

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados em investigações criminais e forênsicas, ou.para determinar a paternidade/ maternidade identificando geneticamente amostras de sangue, cabelo, pele e outros tecidos para estabelecer, de. forma não ambígua uma ligação entre um indivíduo suspeito e amostras relevantes do ponto de vista forênsico. Os . resultados obtidos serão análogos aos resultados obtidos com as técnicas actuais de impressão digital, mas vão fornecer informação bastante mais detalhada e será menos provável a identificação de falsos positivos. Além disso, pode ser determinada a identidade de indivíduos de uma amostra misturada. ' (g) Aplicações em investigação

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para diferentes aplicações na investigação, tais como a sequenciação de construções de ADN artificiais para confirmar/deduzir a sua sequência primária, e/ ou para isolar clones de mutantes específicos a partir de pesquisas por mutagénese aleatória; a sequenciação de cADN a partir de células isoladas, tecidos completos, ou organismos a partir de qualquer fase em desenvolvimento, ou circunstância ambiental para determinar o perfil genético a partir daquele espécimen; a sequenciação de produtos PCR e/ 46 ou fragmentos· de ADN clonados de qualquer tamanho isolados a partir de qualquer origem.

Os métodos da presente invenção podem' ser também utilizados para a sequenciação de fragmentos de ADN gerados por técnicas analíticas que sondam a estrutura de ordem superior do ADN através da sua diferente sensibilidade aos enzimas, radiação, ou tratamento químico (por ex., tratamento da cromatina com DNase parcial), ou para a determinação do estado de metilação do ADN por' comparação das sequências geradas a partir de um determinado tecido com ou sem tratamento prévio com produtos químicos que convertem à metil-cítosina em timina (ou outros nucleótidos) como a base eficaz reconhecida pela polimerase. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para ensaiar alterações na fisiologia celular que ocorrem durante o desenvolvimento, ou senescência. ao nível da sequência primária..

Os métodos da presente invenção podem também ser utilizados para a sequenciação de genomas completos, ou de grandes segmentos genómicos de células transformadas para seleccionar indivíduos com o estado de integração desejado. Por exemplo, pode ser utilizado DNAS para o rastreio de linhas ' celulares de células estaminais . embrionárias transfectadas para a integração correcta de construções específicas, ou para o· rastreio de organismos, tais como Drosophila, peixe zebra, ratinho, ou tecidos humanos para acontecimentos específicos de integração.

Além disso, o método da presente invenção pode ser utilizado para identificar novos genes, através da identificação de blocos conservados da sequência ou motivos de organismos .divergentes evolucionários. 0 método da presente invenção pode também ser utilizado para identificação de outros elementos genéticos (por ex. sequências reguladoras e locais de ligação à proteína), 47 através de conservação da sequência e localização genética relativa.

Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção foram apresentadas na descrição que as acompanha acima. Apesar de quaisquer métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes aqueles aqui descritos . poderem ter sido utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos preferidos e materiais são agora descritos. Outras caracteristicas, objectos e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição e a partir das reivindicações. Na' memória descritiva e nas reivindicações em anexo as formas singulares incluem referentes plurais a não ser que o contexto mencione claramènte o contrário. A não ser que definido de. outro modo, todos os termos científicos e técnicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um vulgar perito no estado da técnica à qual esta invenção pertence.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar de forma mais completa as. concretizações preferidas da invenção. Estes exemplos deverão de modo algum ser construídos como limitando o âmbito da invenção como definido nas reivindicações em anexo.

Exemplo 1 Preparação do substracto da câmara reaccional conjugado de níquel/quelante. A unidade fundamental da metodologia DNAS é o centro reaccional (Fig. 3) . 0 centro reaccional compreende uma molécula de polimerase ligada a uma molécula de ácido nucleico molde e presa a uma localização fixa num substracto transparente através de interacções de elevada afinidade entre grupos ligados à polimerase e substracto respectivamente. Numa configuração, as reacções DNAS ocorrem numa câmara reaccional, cuja base, o substracto é 48 feito de vidro (SÍO2.) modificado de modo que moléculas de polimerase possam ser ligadas numa matriz regular. Utilizando uma litografia de feixe electrónico uma matriz quadrada de dimensões 100 μιη x 100 μπι é gerada. Rai-Choudhury, Handbook of Microlithography, Micromachining, e Microfabrication, Volume I: Microlitografia, Volume PM39, SPIE Press (1997). Uma pequena mancha, < 50 nm de diâmetro é gravada a água forte a cada intervalo de 1 μιη em material resist cobrindo a lâmina de vidro. Esta gravação a água forte expõe o vidro para posterior derivatização em que o grupo ácido nitrilotriacético encontra-se covaientemente ligado através da química do silício.. Schmid, et al., Anal Chem 69: 1979-1985 (1997). Cada grupo de ácido nitrilotriacético serve como um quelante. para o ião Ni2+. 0 ião Ni2+ coordenado pode então ser ligado por resíduos de hexahistidina sujeitos a engenharia a umà variedade de moléculas de polimerase. Assim, é gerada uma matriz de 10,000 moléculas de polimerase numa matriz. ÍOO μιη x 100 μη que será observada num sistema de microscópio óptico. Numa configuração alternativa a biotina encontra-se covalentemente ligada a cada mancha através da química do silício.. A biotina é então ligada por resíduos de estreptavidina ligados covalentemente a, ou submetidos a engenharia de moléculas de polimerase.

Exemplo 2: Câmara reaccional microf luidica permite uma troca rápida de reagentes, tampão e produtos. A câmara reaccional é um dispositivo que encerra uma matriz de centros reaccionais e regula o meio ambiente. Como descrito no Exemplo 1, o substracto é uma lamela de microscópio preparada com uma matriz microscópica regular de resíduos covalentes. É ligado um prisma à lamela à superfície oposta à matriz. O prisma dirige a luz laser 49 para a lamela a um tal ângulo que a reflexão interna total do feixe de laser é conseguida dentro da lamela. Nesta condição é gerada uma onda. . evanescente sobre a matriz durante o ciclo de reacção de sequenciação. A lamela e o prisma são fixados numa montagem que. vai gerar uma câmara selada com um volume de 1-10 μΐ (Fig. 4) . Reagentes e tampão são bombeados para dentro e para fora da câmara, através de aberturas microfluidicas.de cada lado da câmara. Trocas completas de volume ocorrem durante 1 segundo e são mediadas por válvulas e bornbas controladas electronicamente.

Exemplo 3: Preparação de nucleótidos de terminação de cadeia marcados-bloqueados

Preparação de conjugado de agente de ligação fotolábil-fluorocromo

Derivados de 2-nitrobenzilo ligados a um fluorocromo são primeiro gerados como descrito por Anasawa, et al., WO 98/33939. Alternativamente, um agente de ligação fotolábil sensibilizado (por ex. utilizando o kit de bloqueamento DMNPE, Número de catálogo D-2516, Sondas Moleculares, Inc.) pode ser primeiro ligado ao grupo 3' da dNTP como detalhado abaixo e depois ligado a um fluorocromo utilizando a quimica da succinimida ou de outra forma. Pode ser demonstrado ser óptima a utilização de um agente de ligação de comprimento variável entre o fluorocromo e o grupo de bloqueio para reduzir a possibilidade de impedimento estereoquimico causado por grupos químicos volumosos. Brandis, et al., Biochemistry 35: 2189-2200 (1996).

Preparação de análogos de 3'-O-modifiçados-2'- desoxinucleótidos 50 3'-O-modificados-2'-desoxinucleótidos. são sintetizados por esterificação do grupo 3' -OH de dATP·, dCTP, dGTP e dTTP. Isto é conseguido através de. vários métodos gerais. Metzker, et al., Nucleic Acids Res 22: 4259-4267 (1994). Método 1:

Primeiro é feito reagir 2f -desoxi-5'-hidróxi-dNTPs com terc-butildifenilsilil (TBDPS) na presença de imidazole e dimetilformamida (DMF) produzindo desoxinucleótidos 5'-protegidos. Depois o 2'-desoxi-5'-tec-butildifenilsilil-dNTP resultante é dissolvido em benzeno e misturado com o derivado de halogeneto do conjugado agente ligante fotolábil- fluorocromo na presença de hidróxido de tetrabutilamónio (TBAH) (e adicionalmente NaOH em alguns casos) e agitado a 25ÕC durante 16 horas. A camada orgânica é extraída com acetato de etilo e lavada com água desionizada, NaCl saturado, e seca sobre Na2S04 e purificada por cromatografia flash utilizando um gradiente em passos (10% metanol/acetato de etilo até 5% de metanol/ acetato de etilo em intervalos de 2%).. Método 2: , 2'-desoxi-5'-terc-butildifenilsilil dNTPs preparados como descrito detalhadamente ·acima são feitos reagir directamente. com o anidrido do ácido do conjugado agente de ligação fotolábil-fluorocromo em piridina seca na presença de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) a 25°C durante 6 horas. A piridina é depois removida sob vácuo, o resíduo é dissolvido em água desionizada, extraído em clorofórmio, lavado com água desionizada, com HCl a 10%, NaHCCb saturado, NaCl saturado, seco sobre Na2S04, e' purificado pgr cromatografia flash. 51 Método 3 2'-desoxi-5'-terc-butildifenilsilil dNTPs são secos por co-evaporação repetida com piridina, dissolvida em DMF quente e arrefecida a 0°C num banho frio. NaOH é dissolvido em DMF após lavagem com benzeno seco, depois é adicionado ao 2'-•desoxi-5'-terc-butildifenilsilil dissolvido e agitado durante 45 minutos. Um derivado halogenado de um conjugado agente de ligação fotolábil-fluorocromo em DMF· é adicionado e a reacção é agitada durante algumas horas. A reacção é depois parada com água desionizada fria e agitada de um dia para o outro. O sólido obtido é . filtrado, seco, e recristalizado em etanol. Método 4:

Os NTPs bloqueados 3' podem ser preparados directamente a partir do trifosfato de acordo com Hiratsuka et al., Biochim Biophys Acta 742:496-508 (1983).

No caso dos métodos 1-3, os compostos resultantes são posteriormente. dessílilados por adição de 1,0 equivalentes de fluoreto de tetrabutilamónio (BU4NF) . As reacçóes são monitorizadas por cromatografia em camada fina e após conversão total (cerca de 15 minutos) as reacções são paradas com 1- equivalente de ácido acético . glacial • 0 solvente é removido, e os resíduos purificados por cromatografia em coluna de sílica. Os derivados trifosfato-5' dos compostos gerados pelos métodos 1-3 são sintetizados pelo protocolo seguinte. 0 nucleósido modificado 3' (1,0 equivalentes) é dissolvido em trimetilfosfato sob uma atmosfera de azoto. Oxicloreto de fósforo (POCI3) (3,0 equivalentes) é adicionado e a reacção é agitada a -10°C durante 4 horas. A reacção é parada com uma solução de fosfato de tributilamónio (5,0 equivalentes) em DMF e 52 tributilamina. Após agitação vigorosa durante 10 minutos, a reacção é parada com TEAB pH 7,5. A solução é concentrada, e o derivado trifosfato isolado, através de um gradiente linear (TEAB 0,01 M a 0,5 M) utilizando uma coluna de celulose DEAE (forma- HCO3) coluna.

Os produtos finais sintéticos são purificados por HPLC e podem ser purificados por limpeza enzimática se necessário [Metzker, et al., Biotechniques 25:814-817 (1998)], uma técnica que utiliza a preferência extrema enzimática de muitas polimerases para desoxinucleótidos em função das suas partes correspondentes 3'-bloqueadas. Isto resulta provavelmente a partir da baixa eficiência da formação catalítica da ligação fosfodiéster, quando os nucleótidos 3'-modificados se encontram presentes no centro actívo da enzima de· modo que a enzima tende a esgotar rapidamente primeiro os desoxinucleótidos contaminantes normais. Brandis, et al., Biochemistry 35: 2189-2200 (1996).

Numa alteração alternativa um grupo fotolábil é ligado ao 3'-OH utilizando succinimida ou outra . química e um conjugado de agente de ligação fotolábil-fluorocromo é ligado directamente à base do nucleótido como descrito por Anasawa et al., W098/33939. O grupo fotolábil ligado em 3' vai servir como um terminador de cadeia reversível [Metzker, et al·., Nucleic Acids Res 22:4259-4267 (1994)] e o agente de ligação fotolábil-fluorocromo ligado à base vai servir como um marcador possível de remover. Nesta configuração em cada ciclo ambos os grupos fotolábeis serão removidos por fotólise antes de uma nova incorporação ser permitida. Uma tal configuração poderá ser preferida se se verificar que os impedimentos estereoquímicos de grandes grupos fluorocromos ligados ao grupo 3'-OH do nucleótido evitam que o nucleótido entre na polimerase. 53

Exemplo 4: DNAS utilizando uma ADN polimerase marcada com hexahistidina clonada, molde de ADN de cadeia simples iniciada aleatoriamente e microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Existem duas fases do processo.

Fase 1: A primeira fase é a fase da montagem. ADN polimerase de hexahistidina marcada é levada para a câmara reaccional e permitida ligar-se à matriz de Ni2+ -nitrilotriacético. A título de exemplo, pode ser utilizada a ADN polimerase marcada com hexahistidina de Thermus aquaticus. Dabrowski, et al., Acta Biochim Pol 45: 661-667 (1998). 0 molde de ADN é preparado aparando ou por digestão por restrição seguida por desnaturação a 95°C e emparelhãmento com uma mistura de iniciadores de oligodesoxinuçleótidos aleatórios. 0 molde de ADN de cadeia simples iniciado é então bombeado para a câmara reaccional.

Fase 2: A segunda fase do processo é o ciclo· de sequenciação principal. 0 ciclo é como se segue: 1. Tampão da reacção contendo desoxinucleótidos trifosfatos terminadores de cadeia marcados-bloqueados (dNTP*s) é bombeado para a câmara reaccional. 0 tampão da reacção é constituído por: Tris HC1 10 mM, pH 8,3; KC1 50 mM; e MgCl2 2,5 mM. Os dNTP*s estão cada um a uma concentração de 0,02-0,2 mM. 54 2. A câmara reaccional é lavada com tampão de reacção sem dNTP*. 3. Para cada um dos 10000 centros reaccionais é determinada a identidade do nucleótido incorporado de novo por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). Registos múltiplos da matriz de centros reaccionais são feitos de modo a que cada um dos quatró nucleótidos seja distinguido. Os fluorocromos utilizados possuem elevados coeficientes de extinção, e/ ou elevados rendimentos quânticos para fluorescência. Além disso, os fluorocromos possuem uma excitação bem resolvida e/ou emissão máxima. Existem várias famílias de fluorocromos que serão utilizadas, por exemplo a família . de fluorocromos BODIPY (Molecular Prohes, Inc.). Utilizando os fluorocromos BODIPY e os agentes de ligação fótolábeis 1-(4,5-dimetóxi-2-nitrofenil) etil (DMNPE) pode ser utilizado o conjunto seguinte de análogosde.nucleótidos para a DNAS:

3,-O-(DMNPE-{BODÍPY493/503))-2/ desóxi ATP 3' -0- (DMNPE- (BODIPYS30/55o) ) -2' desóxi CTP 3'-0-(DMNPE-(BODIPYS64/57o) )-21 desóxi GTP 3' -0- (DMNPE- (BODIPY581/593) ) -2' desóxi TTP

Os 'A's incorporados desta forma são detectados com iluminação laser a 488 nm de ião Árgon e um filtro barreira centrado a 503 nm. Incorporados e 'C's, 'G's e 'T's são detectados a 532 nm com iluminação de laser YAG e filtros: barreira centrados a 550 nm, 570 nm, e 591 nm respectivamente.

Para cada um dos acontecimentos de iluminação é gerada uma onda evanescente na matriz da câmara reaccional e a imagem da matriz é focada, através do sistema do microscópio sobre a face de uma placa de microcanais 55 intensificado de uma. máquina fotográfica com CCD arrefecido. 4. Nucleótidos recentemente incorporados são desbloqueados opticamente iluminando com luz < 360 nm de um outro laser YAG. Isto provoca a dissociação do DMNPE-BODIPY da cadeia nascente de ácido nucleico deixando-a intacta e preparada para incorporar o próximo nucleótido. 5. A remoção do resíduo fluorescente foi verificado por TIRFM e o ciclo reaccional é repetido até os nucleótidos deixarem de ser incorporados.

Tipicaménte o tempo de exposição pára cada fluorocromo é de 100 ms. O tempo de leitura do circuito integrado CCD é de 0,2 5 s. Assim, o passo de detecção para cada ciclo demora < 1,5 s. 0 volume total da câmara reaccional é de Ι-ΙΟ μΐ. Leva menos do que um segundo .para lavar completamente a câmara reaccional.· Assim, o' tempo total para um. dado ciclo é menos do que 10 s. Por isso, a 10 s/ciclo cada um dos 10000 centros reaccionais da máquina de DNAS é capaz de deduzir pelo menos 360 bases da sequência por hora, correspondendo a 3,6 M bases/hora da sequência deduzida pela máquina de DNAS como um todo.

Portas controlando' a iluminação laser, rodas de filtros que transportam os filtros da barreira e a câmara CCD são bem controladas por um microcomputador. A recolha de imagem e a análise de dados são todas bem executadas pelo mesmo microcomputador. Dados da sequência extraída e imagens da matriz são armazenadas permanentemente num CD ROM, à medida que vão sendo' colhidas.

Apesar de terem sido aqui reveladas em detalhe concretizações particulares, isto foi feito, a título de exemplo com o objectivo apenas de ilustração e não se 56 pretende que seja limitante em relação ao âmbito das reivindicações em anexo seguintes. A escolha da polimerase em particular, a ligação particular da polimerase. ao suporte sólido, ou os terminadores nucleótidicos particulares, por exemplo são considerados ser uma questão de rotina para um perito vulgar no estado da técnica e com o conhecimento das concretizações aqui descritas.

Lisboa, 20 de Agosto de 2008

Claims (20)

1 Reivindicações 1. Processo para sequenciação de bases nucleótidicas compreendendo os passos sequenciais: (a) numa câmara reaccional contendo uma polimerase imobilizada num suporte sólido introduz-se uma amostra de ácido nucleico, uma pluralidade de diferentes iniciadores oligonucleótidicos e uma solução tamponizada contendo todos os quatro diferentes nucleótidos, estando cada nucleótido marcado de forma diferente com um grupo de marcação destacável e bloqueado na posição 3' com um grupo de bloqueio destacável, em. que a dita ' amostra de. ácido nucleico se hibridiza com um iniciador, e a dita polimerase prolonga o dito iniciador incorporando um nucleótido marcado de forma diferente que é ' complementar ao ácido nucleico da amostra; (b) remoção .dos nucleótidos que não foram incorporados no iniciador; (c ) determinação da identidade do nucleótido incorporado no iniciador em elongação, através da detecção do seu grupo marcador, identificando deste modo o complemento do nucleótido marcado, bloqueado na posição 3'; (d) separação do' grupo de bloqueio 3' e do grupo marcador do nucleótido incorporado; (e) remoção do grupo 3' de bloqueio, separado e do grupo marcador separado do passo (d); (f) confirmação da separação e remoção do grupo de bloqueio 3' do nucleótido incorporado no iniciador através da 2 monitorização da presença de nucleótidos marcados na câmara reaccional através de um segundo passo de detecção, em que a presença de nucleótido marcado na câmara reaccional indica que o grupo de bloqueio 3' ainda não foi removido; (g) .introdução na câmara reaccional de solução tamponizada fresca contendo todos os ditos quatro nucleótidos diferentes para· reiniciar a sintese; e (h) . repetir os passos de (b) a (g.) até que nenhum, · novo .nucleótido seja'incorporado no passo (g), ou que o grupo.de bloqueio 3' ' persista em não ser separado e removido nos passos, (d) e (e) ; em que a ordem em que os nucleótidos marcados nos passos (c) são detectados corresponde'ao complemento da sequência de pelo menos uma porção da dita amostra de ácido nucleico.

2. Processo de acordo.com a reivindicação 1, em, que o grupo-de bloqueio 3' e o grupo marcador são separados no passo (d) do nucleótido incorporado por activação fotoquímica.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo de bloqueio 3' e o grupo marcador são separados no passo (d) do nucleótido incorporado por activação química, ou enzimática.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito grupo marcador marcado de forma diferente é um marcador fluorescente, uma partícula de ressonância de plasmão-, ou um ponto quântico.' 3

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito grupo marcador encontra-se ligado directamente ao grupo bloqueador 3' destacável.

6. Processo de acordo' com a reivindicação 5, em que o dito grupo· de bloqueio .destacável em 3' é um grupo 2-nitrobenzilo.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito grupo marcador se encontra ligado à base de cada nucleótido com um agente de ligação destacável.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, .em que o dito agente de ligação destacável é um grupo 2-nitrobenzilo.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita polimerase é escolhida entre uma ADN polimerase, uma ÂRN polimerase e uma transcriptase reversa.

Í0. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a dita ADN polimerase é. escolhida entre a ADN polimerase de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerase de Thermus acquaticus, ADN polimerase de Pyrococcus furíosís, a ADN polimerase- de Thermococcus litoralís, .a ADN polimerase de Thermus thermophilus, a ADN polimerase do bacteriófago T4, a ADN polimerase do bacteriófago T7, o fragmento de Klenow da ADN polimerase I de E. coli, è a ADN polimerase III de E. coli.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a dita ARN polimerase é escolhida entre a ARN polimerase de E. coli, ARN polimerase do bacteriófago: T3, a ARN polimerase do bacteriófago T7, a ARN polimerase do bacteriófago SP6 e as ARN polimerases das famílias virais de bromovírus, 4 tobamovírus, tombusvirus, levivírus, vírus do tipo da hepatite C e picornavírus.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9 em que a dita transcriptase reversa é escolhida entre a transcriptase reversa do virus da mieloblastose aviária, a transcriptase reversa do virus da leucemia de murino de Moloney, a transcriptase reversa do virus-X da imunodeficiência humana e a polimerase de T7 modificada-

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito nucleótido marcado é detectado por microscopia de fluorescência de reflexão interna, total, microscopia confocal fotónica, ressonância de plasmão de superfície ou por transferência de energia. de ressonância de fluorescência (FRET).

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito suporte sólido compreende uma matriz . de centros reaccionais, compreendendo cada centro reaccional uma molécula de polimerase única imobilizada sobre, o dito suporte sólido, e onde os ditos centros reaccionais são controlados.por um sistema de microscópio e apresentam-se com uma periodicidade superior à potência de resolução do dito sistema do microscópio.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a dita separação física dos ditos centros reaccionais é pelo menos de 0,2 μια.

16. Processo de acordo çom a reivindicação 14 em que a.dita separação física dos centros reaccionais é pelo menos de 1 μια. 5

17. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a dita separação física dos ditos centros reaccionais é pelo menos de 2 μχη.

18. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a dita separação física dos ditos centros reaccionais é pelo menos de 10 μχη.

19. Processo de acordo com. a reivindicação 14, em que após a introdução dos ditos nucleótidos marcados de forma diferente, os ditos centros reaccionais são controlados utilizando o dito sistema de microscópio até que uma maioria dos centros contenha uma polimerase imobilizada ligada a um ácido nucleico molde com um único nucleótido incorporado marcado de maneira diferente.

20. Processo de acordo com a reivindicação- 19, em que os ditos locais reaccionais .são controlados em relação à incapacidade de incorporação de um nucleótido ou de libertação de um grupo.de bloqueio em 3' ao longo de 2-20 ciclos. Lisboa, 20 de Agosto de 2008