PT1100868E - Processo pra preparar culturas de arranque de bactérias lácticas - Google Patents

Description

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"PROCESSO PARA PREPARAR CULTURAS DE ARRANQUE DE BACTÉRIAS LÁCTICAS" A invenção presente diz respeito a um processo novo para se prepararem culturas bacterianas de arranque, de bactérias lácticas, as quais exibem propriedades de conservação e de acidificação que são superiores às das culturas de arranque habitualmente utilizadas. A preparação de produtos fermentados inicia-se com a inoculação de uma cultura de arranque constituída por uma ou mais estirpes bacterianas que tenham as características pretendidas para originar o produto final, sobre uma substância alimentar.

As culturas de arranque prontas a utilizar são comercializadas sob a forma de preparações bacterianas que estão em geral congeladas ou foram liofilizadas. Para assegurar que a fermentação se inicia bem, as bactérias de que é constituída a cultura de arranque devem em primeiro lugar ser cultivadas, colhidas, embaladas e armazenadas em condições que sejam as óptimas para o seu crescimento e também para a sua sobrevivência. Para além disso, para se conseguir um produto final de qualidade constante, as condições de preparação da cultura de arranque devem ser reprodutíveis.

No entanto, das condições de stress diferentes que podem ocorrer durante os diferentes passos da preparação de culturas de arranque podem resultar alterações no crescimento e/ou na sobrevivência das bactérias.

Em primeiro lugar, quando se cultivam bactérias lácticas, o meio vai ficando acidificado como consequência natural do crescimento bacteriano. Esta acidificaçâo consegue parar a divisão celular quando o pH do meio atinge um valor de cerca de 4,5, e também decresce a viabilidade das células.

Para além disto, além do ácido láctico, as bactérias lácticas também produzem diversas outras substâncias anti bacterianas durante o seu crescimento, tais como a nisina, as bacteriocinas, diversos ácidos orgânicos e diacetilo. Uma vez que estas substâncias são mais activas sobre determinadas bactérias contaminantes que podem estar presentes na cultura, do que sobre as próprias bactérias lácticas, a sua produção no meio favorece inicialmente o crescimento destas últimas. No entanto, a acumulação destas substâncias durante a cultura também pode tornar-se prejudicial para a sobrevivência das bactérias lácticas. 3 KANEKO et al., [Appl. Environ. Microbiol., 56:(9), 2644-2649 (1990)], descreveram o cultivo de uma estirpe de bactérias lácticas que possui uma elevada actividade de NADH oxidase e uma elevada actividade de diacetilo sintase (estirpe 3022 de L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis) , em condições aeróbicas e na presença de hemina e/ou de Cuz+. Os autores observaram um aumento substancial da produção de diacetilo e de acetoína. Ao longo do processo de cultura, os autores também observaram um aumento do pH, após uma descida inicial, sendo o resultado global o de uma diminuição da acidificação do meio de cultura, e um aumento do crescimento bacteríano, e portanto uma massa bacteriana muito mais substancial (medida por trubidimetria). Eles mostraram que estes efeitos são devidos sobretudo a activação da diacetilo sintase pela hemina e/ou pelo Cu2+, e de um aumento da actividade da NADH oxidase. Estas condições promovem a transformação do piruvato (que provém da glicólise) a diacetilo, em vez de se transformar em lactato; Para além dito, quando se esgota a glucose do meio de cultura, as bactérias metabolizam o ácido láctico que se encontra presente no meio, levando a um aumento do pH. O Pedido de Patente Japonês JP 04-36180 e a Patente EP 430.406, ambos solicitados em nome de MEIJI MILK PRODUCTS CO. LTD., propõem utilizar estas condições de cultura para melhorar o rendimento da produção de diacetilo e de acetoína por parte da estirpe 3022 de L. lactis. O pedido JP 04-36180 também descreve um aumento da produção 4 de nisina pela estirpe K-i de L. lactis K-l, outra estirpe com elevada produção de diacetilo.

Os estudos acima foram todos levados a cabo usando estirpes produtoras de diacetilo, e quando existem melhorias nas propriedades de crescimento elas estão estreitamente associadas a aumentos da produção de diacetilo. Urna vez que tanto o diacetilo como a nisina, que são os produtos que evidenciam elevados rendimentos nestes estudos, são ambos tóxicos para as bactérias, não se pode prever o estado nem a actividade metabólica das células bacterianas no final do crescimento. Os documentos acima não tratam portanto o problema da sobrevivência das culturas na presença de elevadas concentrações de diacetilo (ou de nisina), nem a capacidade das culturas como iniciadoras de novas culturas por fermentação clássica.

Para além das condições de stress que suportam durante o crescimento, as bactérias também são submetidas a stress quando são separadas, embaladas e armazenadas. Ocorrem nessa altura, em especial, stresses de tipc oxidativo, osmótico ou térmico.

Estes factores diversos alteram a sobrevivência das bactérias que constituem a cultura de arranque, e podem portanto afectar a sua capacidade para voltar a iniciar uma cultura quando sejam utilizadas em fermentações. É de facto notável que as diferenças entre diferences fabricos de culturas de arranque possam ser substanciais e possam levar 5 a produtos com qualidade variável.

Para se resolverem os problemas associados com a diminuição do pH, os métodos correntes de produção de culturas de arranque de bactérias lácticas utilizam meios de cultura que são tamponizados a valores próximos de pH 6, com catiões que estão associados a carbonatos, a hidróxidos, a fosfatos ou a óxidos. No entanto, estas adições ao meio de cultura podem provocar problemas para os produtos que delas se irão subsequentemente produzir. Por exemplo, a adição de iões cálcio durante a neutralização pode promover o desenvolvimento de fagos, e a utilização de culturas de arranque contendo iões fosfato ou citrato pode levara um menor rendimento em produtos de queijaria, uma vez que estas moléculas aumentam a solubilidade das caseínas.

Nos documentos acima citados não existe qualquer informação acerca dos possíveis efeitos destas condições de cultura relativamente à viabilidade das bactérias e à sua capacidade para voltar a iniciar crescimentos quando forem de novo colocadas nas condições de fermentação convencionais. A invenção presente resolve estes problemas por intermédio de um novo processo para preparar culturas de arranque constituídas por bactérias lácticas, com um rendimento melhorado, e com um aumento da sobrevivência das bactérias referidas, e uma melhoria das propriedades 6 acidifícantes das culturas de arranque referidas.

Desta fc-rma, os inventores observaram que a adição de um composto de porfirina ao meio de cultura de bactérias lácticas que sejam cultivadas sob arejamento, não só aumenta o rendimento das culturas, mas também a viabilidade das bactérias e a sua resistência à diversas condições de stress que podem ocorrer durante o processo de produção da cultura e durante as fases de embalagem e armazenagem das culturas de arranque. A invenção presente diz respeito à utilização de um composto de porfirina em associação com uma cultura aeróbíca para aumentar a taxa de sobrevivência das bactérias lácticas no final da cultura referida. A invenção presente diz respeito, em particular, a um processo para se preparar uma cultura de arranque de bactérias lácticas, efeito para o qual o processo inclui: - proceder-se à cultura de pelo menos uma estirpe de bactéria láctica sob arejamento e num meio nutriente adequado, no qual esteja presente, ou ao qual seja adicionado, pelo menos um composto de porfirina; - recolherem-se as bactérias no final da cultura referida. "Bactérias lácticas" refere um coniunto de π bactérias que pertencem a diversos géneros e que são utilizadas nos processos para se fermentarem os produtos alimentares. Este conjunto é constituído sobretudo por bactérias cujo produto principal de metabolismo de hidratos de carbono é o ácido láctico. No entanto, as bactérias que produzem pequenas quantidades de ácido láctico (Leuconostoc e as bactérias de ácido propiónico) estão incluídas neste conjunto devido ao facto de que são utilizadas nos processos de fermentação. Em geral, as bactérias lácticas envolvidas sâo as que pertencem aos géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Propionibacterium, e Bífidobacterium, ou Streptococcus salivarius. "Cultura de arranque de bactérias lácticas" significa qualquer preparação cuja utilização prevista é a de inocular um meio que tem que ser fermentado, e que inclua uma estirpe bacteriana ou uma mistura de estirpes, que pertençam a um dos géneros mencionados acima; uma tal cultura de arranque também pode incluir, ou ser constituída por, estirpes de bactérias mutantes e/ou estirpes de bactérias recombinantes, que sejam derivadas de bactérias que pertençam aos géneros que se mencionaram acima. É possível, para efeito da implementação da invenção presente, utilizar qualquer meio nutriente que seja adequado para o crescimento da(s) estirpe(s) de bactérias lácticas utilizadas. Estes meios, que são conhecidos por si próprios, contêm em geral uma fonte de carbono, que em geral assume a natureza de um açúcar ou de 8 açúcares que seja(m) assimilável (is), uma fonte de azoto, que em general assume a forma de uma mistura de aminoácídos, bem como sais minerais e vitaminas. "Composto de porfirina" refere os derivados de tetrapirrole cíclicos cujas esuruturas são derivadas da estrutura da porfirina, por substituição com diversos grupos funcionais dos átomos de carbono localizados nos ápices do núcleo pirrólico. Também refere os complexos dos derivados referidos com um átomo metálico que forme ligações coordenadas com dois dos quatro átomos de azoto do anel de porfirina.

Esta definição inclui, sem que se limite a: - uroporfirinas, coproporfirinas, protoporfirinas e hematoporfirinas, bem como os seus sais e ésteres e os seus complexos com um átomo metálico, de preferência um átomo de ferro; o dicloridrato de coproporfirina I, o éster tetraetílico de coproporfirina III, o sal dissódico de protoporfirina IX, o dicloridrato da hematcporfirina IX, o éster tetraisopropílico ou o éster tetrametílico da coproporfirina, o éster tetraisopropílico ou o éster tetrametílico da coproporfirina III, a hematoporfirina IX, a hemoglobina, a protoporfirina IX, o éster dimetílico da protoporfirina IX, a protoporfirina IX zinco, a hematina e a citohemina; 9 - as diversas clorofilas, em especial a clorofila a e a clorofila b, os seus derivados tais como as clorofilinas, e também os seus sais e ésteres, e os complexos de todos estes com um átomo metílico, de preferência um áromo de ferro. São compostos de porfirina especialmente preferidos a protoporfirina IX e os seus complexos com um átomo de ferro, em especial o heme e a hemina, bem como os derivados da clorofila, tais como as clorofilinas.

Os inventores observaram que se obtinham resultados positivos no que diz respeito á sobrevivência bacteriana, não apenas quando o composto de profirina adicionado ao meio continha ferro (por exemplo o heme), mas também quando se adicionavam compostos de profirina, tais como a protoporfirina, que não contém nenhum ferro. Eles observaram que, neste último caso, a espécie porfirínica forma um complexo com o ferro, quer o proveniente do meio, quer por reacção enzimática no interior das células, e que o complexo de se forma por esse processo, pede ser incorporado nos citocromas bacterianos.

De acordo com uma caracterização preferida da invenção, adiciona-se o composto de profirina referido numa concentração de entre aproximadamente 2,5 e aproximadamente 100, de preferência a uma concentração de entre aproximadamente 5 e aproximadamente 40, micromoles por 10 litro, de meio de cultura.

De acordo com outra concretização preferida da invenção presente, areja-se a cultura de forma a manter, durante toda a duração do processo de cultura, um conteúdo em oxigénio que seja igual a pelo menos 5 milimoles por litro de meio de cultura, de preferência entre 8 e 45 milimoles por litro de meio de cultura. Pode-se conseguir o arejamento por um qualquer dos processos conhecidos de um especialista da técnica, por exemplo por agitar ou chocalhar o meio de cultura, ou borbulhando através do meio de cultura uma corrente gasosa contendo oxigénio, tal como ar.

Quando a invenção presente é implementada, obtém-se uma massa bacteriana que é maís substancial do que a que se obtém quando se preparam culturas de arranque pelos métodos convencionais. Para além disso, existe uma maior percentagem de bactérias que são viáveis e estão metabolicamente activas, na população bacteriana.

Apesar deste crescimento bacteriano substancial, verifica-se que o meio apenas se encontra ligeiramente acidificado; o pH decresce menos rapidamente do que no caso de uma cultura que não seja arejada e na qual não exista um composto de profirina, e este PH estabiliza em geral a um valor de entre cerca de 5 e cerca de 7. Quando se implementa a invenção presen te, o decréscimo de pH é regular; não se observa que o PH diminua e depo is volte a 11 subir, ao contrário do que KANEKO et al. observaram para o caso da estirpe 3022 de L. lactis.

No processo da invenção, a quantidade de glucose que é transformada em ácido láctico no meio de cultura, é inferior a cerca de 40 %, em peso, da quantidade total de glucose inicialmente presente. Esta quantidade varia habitualmente entre cerca de 5 % e cerca de 30 % da quantidade total de glucose inicialmente presente.

Recolhem-se as bactérias quando se considera que a população bacteriana atingiu um nível suficientemente elevado. Nos métodos da técnica anterior, é difícil controlar o instante da colheita, com precisão; assim, enquanto é necessário ter conseguido uma população bacteriana suficientemente elevada, também é necessário que essa população ainda contenha um número máximo de bactérias viáveis. Por outro lado, a utilização do processo de acordo com a invenção torna possível, em simultâneo, aumentar o crescimento da população bacteriana e a sua viabilidade, proporcionando deste modo uma maior liberdade de escolher o instante de se levar a cabo a separação.

Por exemplo, é possível colherem-se as bactérias a entre 5 e 24 horas, com vantagem a entre 7 e 13 horas, após o início da cultura. A recolha das células bacterianas que vão ser utilizadas como culturas de arranque pode ser levada a cabo por um qualquer procedimento que seja do conhecimento de um especialista da técnica; Por exemplo, pode-se dividir a cultura em alíquotas, em contentores adequados, e armazenar-se sob esta forma até á utilização; no entanto e de preferência, separam-se as bactérias do meio de cultura, e concentram-se por centrifugação ou por filtração. Podem então embalar-se as bactérias que se separaram, para utilização subsequente ou para armazenagem.

Podem utilizar-se imediatamente as culturas de arranque que desta forma se obtiveram; no entanto elas serão mais frequentemente armazenadas antes da sua utilização. 0 processo da invenção tem aspectos que beneficiam a viabilidade bacteriana e a acrividade metabólica, em especial tal como observada em relação às propriedades das culturas de arranque apó s períodos de armazenagem.

Podem armazenar-se durante algum tempo as culturas de arranque obtidas de acordo com a invenção, à temperatura utilizada para se fazer crescer a cultura bacteriana (isto é, de entre cerca de 20°C e cerca de 50°C, de acordo com a temperatura óptima de crescimento das bactérias lácticas em questão); nestas condições, as bactérias ainda exibem uma taxa de sobrevivência substancial 2 a 4 dias depois de se dar como terminada a fase de crescimento da cultura; aos 7 dias após se dar como terminada a fase de crescimento, as bactérias exibem uma taxa de sobrevivência que é muito superior, em comparação 13 com culturas tratadas da mesma forma, excepto por o seu crescimento ter sido levado a cabo sem arejamento e na ausência de quais quer compostos de porfirina.

Para as culturas bacterianas que sejam obtidas de acordo com o processo da invenção, e em seguida sejam armazenadas a uma temperatura de cerca de 4°C, a taxa de sobrevivência é em geral de pelo menos 80 %, preferivelmente de entre 90 e 100%, durante pelo menos 7 dias depois de se haver completado a fase de crescimento; ainda é possível observar uma taxa de sobrevivência de entre 0,1 e 10 % ao fim de 2 meses de terminada a fase de crescimento.

Para se obter um período de armazenagem ainda mais longo, bem como para tornar mais fácil o transporte e a armazenagem, é possível congelar ou liofilizar as culturas de arranque, ou então pulverizar ou atomizar essas cultura em vazio. Estes tratamentos diferentes, bem como a armazenagem de determinadas culturas de arranque depois de serem tratadas por estes processos, são levados a cabo utilizando metodologias conhecidas pelos especialistas da técnica.

No caso da congelação, pode ser vantajoso utilizar-se um críoprorector, seleccionado de entre os seguintes compostos: glucose, lactose, rafinose,

SctCârOS6 , trehalose; 14 adonitol, glicerol, manitol, metanol, polietilenoglicol, propilenoglicol, ribitol; alginato, albumina de soro bovino, carnitina, citrato, caseina, dextrana, sulfóxido de dimetilo, glutamato de sódio, betaina da glicina, glicogénio, hipotaurina, leite desnatado, peptona, polivinilpirrolidona e taurina. 0 crioprotector empregue será vantajosamente alginato, glicerol, betaina da glicina, leite desnatado, trehaiose ou sacarose. A invenção presente também inclui as culturas de arranque de bactérias lácticas que se podem obter de acordo com o processo da invenção. Estas culturas de arranque incluem uma ou mais espécies de bactérias lácticas e/ou uma ou mais estirpes de uma só espécie, tendo todas ou algumas das estirpes referidas ou das espécies referidas, sido produzidas de acordo com a invenção. Poderão fazer culturas de diversas espécies, ou de diversas estirpes, em simultâneo (quando forem compatíveis as suas condições de crescimento óptimas), ou então elas poderão ser objecto de culturas em separado, sendo misturadas depois de colhidas.

Podem utilizar-se as culturas de arranque de ioactérias lácticas que se hajam obtido de acordo com a invenção, para se inocular um meio que se pretende fermentar, em especial no contexto de se transformarem matérias-primas cruas, de proveniência animal vegetal, para 15 se produzirem por exemplo produtos alimentares, tais como lacticínios fermentados, ou para se produzirem moléculas de interesse, num fermentador.

Após inoculação de uma cultura de arranque, e utilizando uma série de estirpes e sub espécies de lactococos, pode observar-se que a cultura começa a crescer, e acidifica rapidamente, mesmo depois de a cultura de arranque ter sido submetida a um período de armazenagem longo, o que demonstra que uma proporção substancial das bactérias da cultura de arranque eram viáveis e estavam metabolicamente activas, e para além disso que estas bactérias, que são provenientes de culturas levadas a cabo sob condições de arejamento e na presença de compostos de porfirina, são capazes de se voltarem a adaptar rapidamente às condições habituais da fermentação láctica. A invenção será ilustrada em mais pormenor na descrição que se segue e que se refere a exemplos não limitativos da implementação do processo da invenção. I) Legendas das Figuras

Figura 1: Crescimento e sobrevivência de Lactccoccus lactís, que é cultivado e armazenado a 3 0 0 C.

Nesta figura compara-se as curvas de crescimento e de sobrevivência de bactérias lácticas (e neste - 16 - caso de Lactococcus lactis), em cultura a 30°C, na presença e na ausência de hemina e com ou sem arejamento de acordo com o processo da invenção. Exprime-se o número de células viáveis em função do tempo (número de dias após a inoculação, que ocorre no instante zero), sendo de 30°C a temperatura de armazenagem das bactérias. A curva obtida das observações a que correspondem círculos (·) corresponde a bactérias cultivadas pela metodologia conhecida obtida anteriormente (sem hemina), enquanto que a das observações correspondentes aos quadrados () corresponde às condições de cultura que se descreveram nesta invenção, na presença de hemina e com arejamento do meio.

Figura 2: Crescimento e sobrevivência de lactococcus lactis em cultura a 30°C durante 24 h, e depois armazenado a 4°C.

Nesta figura compara-se as curvas de crescimento e de sobrevivência de bactérias lácticas (e neste caso de Lactococcus lactis), em cultura a 30°C, e depois transferidas para 4°C, 24 horas após a inoculação. A fase de cultura a 30°C é levada a cabo num meio na ausência de hemina e sem arejamento de acordo com o processo da invenção (·) , ou então sob arejamento e na presença de hemina (!) ou de protoporfirina IX (♦). Exprime- se o número de células viáveis em função do tempo (número de dias após a inoculação, que ocorre no instante zero), sendo de 30°C a temperatura de armazenagem das bactérias. - Figura 3 (a-f): Propriedades de acidificação de uma cultura de arranque de bactérias lácticas, preparada quer de acordo com a invenção, quer tradicionalmente sob condições não aeróbicas. A estirpe utilizada, CHCC373, é uma estirpe de culturas de arranque de Lactococcus lactís.

Nestas figuras representa-se a variação do pH em função do tempo, durante a fermentação de um substrato lácteo por parte de uma cultura de arranque que foi preparada de acordo com a invenção (hemina+arejamento), ou por uma cultura de arranque que foi preparada sob condições não aeróbicas (anaeróbicas), quer imediatamente após a cultura (a), quer passados 5 dias (b) , 8 dias (c) , 13 dias (d) , 21 dias (e) e 30 dias (f) , de armazenagem a 4°C. II) Exemplos 0 Lactococccus lactís é uma bactéria que, quando é cultivada num meio rico, em leite ou de acordo com a técnica anterior á invenção presente, exibe as seguintes caracterí st icas: 18 produção de ácido láctico como principal produto do metabolismo dos açúcares (por exemplo glucose ou lactose), acidificação do meio até um valor de pH de cerca de 4,5, num meio contendo 1% de glucose.

No entanto, quando as bactérias são submetidas a uma cultura nas condições descritas na invenção presente, pode observar-se que estas características são modificadas.

As experiências seguintes demonstram isto.

EXEMPLO 1: PROPRIEDADES DE CULTURAS BACTERIANAS QUE CRESCERAM NA PRESENÇA DE OXIGÉNIO E DE DM DERIVADO DE PORFIRINA; EFEITOS SOBRE 0 RENDIMENTO EM BACTÉRIAS E A ACIDIFICAÇÃO DO MEIO 1) Cultivo na presença de hemina

Inocula-se um meio laboratorial (M17 suplementado com glucose, nas quantidades que são indicadas na Tabela I, sendo também possível utilizar-se lactose), com Lactococcus lactis subsp. cremoris, estirpe MG1363, sob a forma de uma diluição de uma cultura saturada (preparada a 30°c sem agitação) a 1/10G ou a 1/1000. Prepara-se o meio inoculado, que contém ou não hemina a uma concentração final de 10 pg/mL (prepara-se uma solução de reserva a 0,5 mg/mL, no laboratório, dissolvendo 100 mg de hemina em 2 mL de NaOH 5 19 N, adicionando-se então 198 mL de água; autoclava-se a solução a 120°C durante 20 minutos) . Para as bactérias que se fizeram crescer em meio contendo hemina, mantiveram-se as culturas a 30°C sob agitação (250 rotações por minuto) para se assegurar a oxigenação. As culturas de controlo, sem adição de hemina e sem agitação, foram cultivadas a 30°C em paralelo com aquelas. Passadas 24 h de crescimento, foram retiradas alíquotas para se medir a densidade óptica a 600 nm (DOeoo ™) , o número de bactérias viáveis, o valor final do pH, e a concentração de ácido láctico no meio. Estes resultados encontram-se tabelados na Tabela I.

Tabela I A: Culturas sem hemína nem agitação Concentração de glucose (g/L) 5 6 7 8 9 10 Factor de diluição 100 1000 ! 100 i 1000 100 1000 100 1000 100 I 1000 100 1000 DOfiOO nm 2,8 2,4 2,22 2,37 2,4 2,78 2,82 2,8 3,05 2,95 3,1 2,8 Contagem de bactérias viáveis (xlQs) 3,25 3,44 3,43 3,6 3,2 3,2 3,5 3,5 3,5 3,7 3,9 2,4 pH 5,77 5,74 5,51 5,52 5,13 5,19 4,96 4,92 4,71 4,65 4,56 4,55 Concentração de ácido láctico (g/L) não medida 3,3 não medida 4,8 não medida 4,9 não medida 6,5 não medida 5,9 não medida 8 B:Culturas com hemina e arejamento Concentração de glucose (g/L) 5 6 7 8 9 10 Factor de diluição 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 100 1000 DQêOO m 4,6 4,5 5,1 5,5 5,5 5,7 5,9 5,4 5,9 5,8 6,1 6,2 Contagem de bactérias viáveis (xlO9) 5,7 5,7 6 7,6 9,1 8,6 8,9 9,3 9,2 9,4 10,1 9,6 pH 6,2 6,19 6,25 6,13 6,09 6,07 6,04 6,03 6,02 6,01 6,01 5 . Concentração de ácido láctico (g/L) não medida 0,12 não medida 0,14 não medida 0,19 não 0,35 medida não medida 0,52 não medida 0,98 20 21

Estes resultados mostram que se obtém uma maior biomassa quando se cultivam as bactérias na presença de hemina e de oxigénio. Este aumento é demonstrado pelo aumento dos valores de densidade óptica. Para além disto, também se observa um número mais elevado de células viáveis quando as células são cultivadas na presença de hemina e de oxigénio. Também se pode anotar que, quando se cultivara as células na presença de hemina e de oxigénio, o valor de pH não varia muito e permanece estável em torno de um valor de cerca de 6,1, qualquer que seja a concentração de glucose. Por outro lado, e de forma contrastante, no caso das células cultivadas sob condições convencionais, o pH é marcadamente inferior quando a concentração de glucose é de 1 % (pH 4,5), do que quando a concentração de glucose é de 0,5 % (pH 5,7). Também se observa que a produção de ácido láctico pelas células cultivadas na presença de hemina e de oxigénio é pequena, e que é sempre inferior a 10 % da quantidade de açúcar que se adiciona, enquanto que, no caso das culturas de controlo, cerca de 80 % da glucose adicionada vem transformada em ácido láctico.

2) Cultura na presença de protoporfirina IX

Inocula-se um meio laboratorial (M17 suplementado com 1 % de glucose) com a estirpe MG 1363 de Lactococcus lactis subsp. cremoris sob a forma de uma diluição a 1/1000 de uma cultura saturada (preparada a 30°C sem agitação). O meio inoculado continha ou não protoporfirina IX, a uma 22 solução de reserva a 0,5 mg/mL adicionando 100 mg de protoporfirina IX a 2 mL de NaOH 5 N, adicionando-se-lhe então mais 198 mL de água; a solução é depois autoclavada a 120°C durante 20 minutos). Para bactérias que se fizeram crescer em meio contendo protoporfirina IX, as culturas foram mantidas a 30°C com agitação (a 250 rotações por minuto) para se assegurar a oxigenação, ou foram mantidas sem agitação, como controlo. Duas outras culturas de controlo, sem protoporfirina IX e sem agitação, forma feitas crescer a 30°C, em paralelo. Passadas 24 h de crescimento, removeram-se aliquotas para se medir a densidade óptica a 600 nm (DO 60o nm) , a número de bactérias viáveis, o valor final de pH e a concentração de lactato no meio. Compílam-se os resultados na Tabela II.

Tabela II

Condições de cultura -P+02a 1 O ΙΌ D* + P-02C + P+02d DO600 nm 2 2,5 2,5 4,6 4Número de células viáveis (xlO9) 2, 8 2, 9 2,7 6, 9 pH final 4,52 4,61 5,53 5,49 Concentração em ácido láctico (g/L) 8,9 8,2 8,2 1,9 d: sem protoporfirina IX nem arejamento β: sem protoporfirina IX mas com arejamento c: com protoporfirina IX mas sem arejamento d: com protoporfirina IX e com arejamento - 23 -

Os valores de DOgonm mostram que se consegue uma bíomassa superior quando as células são cultivadas na presença de protoporf irina IX e de oxigénio. Para além disse, o número de células viáveis é superior. Pode também anotar-se que quando as células são cultivadas na presença de protoporfirina OX e de oxigénio, o pH não varia grandemente e permanece estável a um valor de cerca 5,5. Em contraste, o pH desce notavelmente (pH final de 4,5) no caso das culturas de controlo. Também se observou que a produção de ácido láctico pelas células cuja cultura decorreu na presença de protoporfirina IX e de oxigénio, é pequena e sempre menos do que 40 % da quantidade de açúcar adicionado, enquanto que, no caso das culturas de controlo, 80 % do açúcar é transformado em ácido láctico.

As experiências descritas em 1) e 2) acima demonstram que, em culturas levadas a cabo de acordo com a invenção, a massa bacteriana (medida por turbidimetria) é aproximadamente duas vezes mais elevada do que no caso de uma cultura levada a cabo sem arejamento e na ausência de um composto de porfirina. 3) Culturas na presença de clorofilina

Inocula-se um meio laboratorial (M17 suplementado com 1 % de glucose) com a estirpe MG 1363 de Lactococcus lactis subsp. cremoris sob a forma de uma diluição a 1/1000 de uma cultura saturada (preparada a 30°C sem agitação). 0 meio inoculado continha ou não clorofilina (um produto de - 24 - degradação de ciorcfíla), a uma concentração final de 10 μς/ιτΛ. Para ela estar activa, a clorofilina havia sido previamente num meio ácido e na presença de vestígios de ferro, para substituir o átomo de Cu da clorofilina por um átomo de Fe. Isto pode ser feito, por exemplo, do seguinte modo: a) inoculando uma solução concentrada de clorofilina durante 24 h num meio de laboratório (M17 suplementado com 1 % de glucose), com 106 lactococos por mí, mantendo-se a 30°C durante 24 h. Filtra-se o sobrenadante contendo a clorofilina a uma concentração de 100 μg/mL e depois adiciona-se ao meio da cultura de modo a se obter uma concentração final de 10 μρ/πιΐ. b) incubando-se uma solução concentrada de clorofilina durante 24 h em M17, a um pH de entre 3 e 5 (acidificando com HCl) e a uma temperatura de 4°C, 30°C ou 60°C. Volta-se então a ajustar o pH a 7. Filtra-se em seguida a solução de clorofilina, a uma concentração de 100 pg/mL, e adiciona—se ao meio oe cultura para se obter uma concentração final de 10 μς/πιΐ. c) incubando-se uma sol ução concentrada de clorofilina durante 24 h em M17, a um pH de entre 3 e 5 (acidificando pela adição de lact ato e a uma temperatura de 4°C, 300C ou 60°C. Volta-se ei itãc a ajustar o pH a 7. Filtra-se em seguida a solução de clorofilina, a uma concentração de 100 μρ/ιηΐ, e adiei ona- -se ao meio de cultura - 25 - para se obrer uma concentração final de 10 μg/mL.

Para bactérias que cresceram num meio contendo ciorofilina, colocam-se as culturas a 3Q°C, com agitação para se oxigenarem as culturas (250 rotações por minuto). As culturas de controlo, ás quais se não adicionou qualquer ciorofilina, e que não são agitadas, crescem em paralelo. Passadas 24 de crescimento, removem-se alíquotas para se medir a densidade óptica a 600 nm (DOôoonm)/ e o valor do pH final.

Em todas as culturas levadas a cabo utilizando as preparações a), b) ou c) , ou sob arejamento, observa-se um DOgoo nm que é mais elevado do que o das culturas de controlo em 0,3 a 0,8 unidades, e um pH que é mais elevado do que o das culturas de controlo em 0,3 a 0,8 unidades, consoante as amostras a que se referem as diferenças. Não se observa uma variação significativa face ao controlo quando não se agitam as culturas feitas na presença de ciorofilina.

EXEMPLO 2: EFEITO DE SE CULTIVAR NA PRESENÇA DE OXIGÉNIO E DE UM DERIVADO DE PORFIRINA, SOBRE A SOBREVIVÊNCIA DAS BACTÉRIAS LÁCTICAS DURANTE A ARMAZENAGEM A 30°C

Inocula-se um meio laboratorial (M17 suplementado com 1 % de glucose) com a estirpe MG 1363 de Lactococcus lactis subsp. cremoris sob a forma de uma diluição a 1/1000 de uma cultura sarurada. Divíde-se então a cultura em duas 26 - partes iguais, e adiciona-se hemina a uma destas duas culturas, de modo a se obter uma concentração final de 10 gg/inL. Incuba-se a cultura de controlo, que não contém nenhuma hemina, a 30°C sem agitação, enquanto aquela que contém hemina é incubada a 30°C com agitação (250 rotações per minuto) para que seja oxigenada. Removem-se regularmenue alíquotas das duas culturas durante a fase exponencial de crescimento, para se monitorizar a viabilidade, a taxa de crescimento e o pH. Passadas 24 h de crescimento, colocam-se (armazenam-se) as culturas numa incubadora, a 30°C sem agitação, e removem-se alíquotas a cada 24 h para se monitorizar a viabilidade das células. Listam-se os resultados na Tabela III e na Figura 1.

Tabela III Número de dlâS apOS â inoculação 0 1 2 3 5 6 Ml 7 1 % cie glucose 9,5xlQ5 2,45xl09 4,5x10b Ί GD O \-i X co cn 2,2xl04 2,2xl02 Ml7 + 1% de glucose! lxlO8 1, 76xl010 1,71x 5, 32x 4,3xl08 8,5xl07 hemina e arejamento l·-1 O o 109

As células cultivadas na presença de hemina e de oxigénio apresentam uma taxa de sobrevivência muito superior à das células cujas culturas são conduzidas nas condições convencionais. Esta melhoria da sobrevivência é evidente ao fim de um dia de armazenagem (isto é, 2 dias depois da inoculação); as células cujas culturas são feitas na presença de hemina e de oxigénio não perdem nenhuma 27 viabilidade. Em contraste, o número de células viáveis nas culturas de controlo já diminuiu notavelmente. Esta diferença aumenta durante a armazenagem: passados 5 dias de armazenagem a 30cC, a taxa de sobrevivência é de cerca de 10“' no caso das culturas de controlo, enquanto que ela é de cerca de 1G'2 no caso das culturas que cresceram com arejamento e na presença de hemina.

EXEMPLO 3: EFEITO DE CONDUÇÃO DAS CULTURAS NA PRESENÇA DE OXIGÉNIO E DE UM DERIVADO DE UMA PORFIRINA, SOBRE A TAXA DE SOBREVIVÊNCIA DE BACTÉRIAS LÁCTICAS, DURANTE A ARMAZENAGEM A 4°C

Fez-se uma cultura da estirpe MG 1363 de Lactococcus lactis subsp. cremoris, tal como se descreveu para o Exemplo 2, mas a armazenagem, que se inicia 24 h depois da inoculação, foi conduzida a 4°C em vez de o ser a 30 °C. Os resultados estão listados na Tabela IV e ilustrados na Figura 2.

Estes resultados demonstram que as células cuja cultura ocorre na presença de hemina ou de protoporfirina IX, e de oxigénio, têm uma raxa de sobrevivência significativamente superior durante a armazenagem a frio (4°C) do que as células cuja cultura foi levada a cabo nas condições habituais. Passados 2 meses a 4°C, as bactérias cujas culturas ocorreram na presença de hemina e sob arejamento, exibem uma taxa de sobrevivência da ordem aos 5 %, e as bactérias cujas culturas foram levadas a cabo na 28 - presença de protoporfirina IX e sob arejamento, exibem taxa de sobrevivência da ordem de I %. Em contraste, a de sobrevivência das células de controlo é inferior a 1 28 - uma taxa o-9.

Tabela IV Número de células por mL Número de dias depois da cultura 0 1 2 3 7 8 9 10 M17 cl 1 % de glucose + hemina e arejamento 4,3x10® 4,2x10® 3,3x10® 3,3x10* 4,2x10® 2,8x10® 2,2x10® 9,6x10* M17 cl 1 % de glucose + protoporfirina IX e arejamento 5,4x10® 6,2x10* 5,6x10* 5,4x10* 4,0x10* 3,8xl09 1,9x10® 3,9x10* M17 cl 1 \ de glucose 1,8x10® 1,3x10* 5,3x10* 3,5x10* 2,0x10* 2,0x10' 2,1x10* 1,9x10® Número de células por mL Número de dias depois da cultura 13 15 22 28 36 43 50 57 M17 c/ 1 1 de glucose + hemina e arejamento 5,0x10* 3,2x10* 3,0x10* 3,0x10* 2,0x10* 2,2x10* 1,8x10* 2,0xl08 M17 c/ 1 % de glucose + protoporfirina IX e arejamento 1,7x10* 6,0x10® 5,8x1o7 5,4xl07 5,4xl07 5,3x10' 4,8xl07 5,3x10® M17 c/ 1 1 de glucose 4,0xlQ2 <2x10° <2x10* <2x10* <2x10° <2x10* <2x10* <2x10° 29 30 -

EXEMPLO 4: EFEITOS DO PROCESSO DE CULTURA DA INVENÇÃO SOBRE O RENDIMENTO, E SOBRE AS PROPRIEDADES DE ACIDIFICAÇÃO DO MEIO, UTILIZANDO DIFERENTES ESTIRPES DE BACTÉRIAS LÁCTICAS

Fazem-se culturas de bactérias [MG 1363 e 7 estirpes (IL1403, IL582, TL801, IL896, ΖΊ 05, Z106, Z191) representativas de sub grupos de L. lactis [TAILLEZ e tal., System. Appl. Micr obiol. 21 r 530-538, ( 1998)]] com uma cultura de arranque em M17 que crescera previamente a 30°C durante 24 h. Adiciona-se hemina a uma concentração final de 10 pg/mL ao meio inoculado, antes de se arejarem as culturas por agitação (a um mínimo de 220 rpm). Em paralelo fazem-se crescer culturas de controlo sem hemina no meio, e sem agitação. Passadas 24 h, obtêm-se alíquotas e medem-se a DOeoo nm e o pH final. Listam-se os dados na Tabela V adiante.

Cultura sem hemina e sem agitação MG 1363 IL1403 IL562 IL801 IL896 Z105 Z106 Z191 do600 nitl 2,4 1,7 2,1 2,1 2,5 2 2 2,3 2,3 pH 4,59 4,57 4,57 4,53 4,55 4,55 4,56 4,59 Cultura com hemina e com agitação MG 1363 IL1403 IL582 ILS01 IL8 96 2105 Z106 Z191 DO500 nm 5 5, 3 5,1 4,3 4,5 4,5 3,8 pH 5, 96 5,41 5,73 5,44 5,24 5, 67 5,74 5,53 1363 também, é obtido

Estes dados mostram que o efeito observado com MG com Lactococcs dos diversos sub 31 grupos. Note-se que todas as bactérias cultivadas de acordo com a invenção acidificam menos (o valor final do pH é sempre superior a 5,2 , em comparação com um valor final de pH de 4,5 para as culturas de controlo), e que a biomassa obtida é sempre superior nas culturas que se obtêm de acordo com a invenção (DO superior a 4,3 em comparação com um DO inferior a 2,5 para as culturas de controlo).

EXEMPLO 5: PROPRIEDADES DE UMA CULTURA DE ARRANQUE QUE FOI PREPARADA DE ACORDO COM A INVENÇÃO

Faz-se uma cultura de uma estirpe industrial de L. lactis subsp. lactís (estirpe CHCC373, disponível junto da CHR HANSEN ou na Deutsche Sammlung vcn Microorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124, BRAUNSCHWEIG, depositada em Fevereiro de 1998, sob o número de acessão DSM12015), a 30°C num fermentador de 350 litros, quer a) em condições anaeróbicas sob atmosfera de azoto, quer b) na presença de 20 ppm de hemina e com um caudal de ar. Quando termina o crescimento, centrifugam-se as culturas e as pastilhas são congeladas em azoto líquido e depois são armazenadas a -80°C.

Medem-se as propriedades de acidifícação das culturas de arranque preparadas do modo convencional a), ou pelo processo da invenção b), no dia 0 e passados 5, 8, 13, 21 e 30 dias a -80°C. Inocula-se o meio de crescimento, leite desnatado reconstituído a 9,5 %, com 0,01 % (peso/voJ ume) das culturas de arranque 'a)' ou * b) ' , tal 32 como acima, e leva-se a cabo a fermentação a 30°C sem agitação; mede-se o pH em contínuo.

Os resultados obtidos são ilustrados na Figura 3(a-f). Estes resultados demonstram que; - nenhuma das 2 culturas de arranque perde as suas propriedades durante a armazenagem a -80°C; - desde o momento da sua preparação, e durante a totalidade do período de armazenagem, a cultura d arranque b), de acordo com a invenção, exibe propriedades significativamente superiores às da cultura de arranque a), que foi obtida de acordo com a metodologia convencional. Em particular, a cultura de arranque b) atinge um valor de pH previamente determinado 30 a 40 minutos antes da cultura de arranque a), evidenciando a mesma cinética de acidificação.

Parece portanto que a adição de hemina em combinação com o prosseguimento da cultura em condições aeróbicas, melhora significativamente a produção de uma cultura de arranque de bactérias lácticas, e em especial melhora o desempenho em acidificação da cultura de arranque referida.

Lisboa, I de Março de 2007

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para se preparar uma cultura de arranque de bactérias lácticas, o qual inclua: "fazer-se uma cultura de pelo menos uma estirpe de bactérias lácticas sob arejamento e num meio nutriente adequado, no qual esteja presente, ou seja adicionado, pelo menos um composto de porfirina; -colherem-se as bactérias no final da cultura referida.

2. Processo de acordo com a Reivindicação 1, no qual as bactérias lácticas sejam seleccionadas de entre Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Propíonibacterium, Bifidobacterium, e Streptococcus salivarius.

3. Processo de acordo quer com a Reivindicação 1 quer com a 2, caracterizado por o composto de porfirina referido ser seleccionado de entre uroporfirinas, coproporfirinas, protoporfirinas, hematoporfirinas, clorofilas e clorofilina, os seus sais e ésteres, e os seus complexos com um átomo de ferro.

4. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, no qual o composto referido seja 2 adicionado a uma concentração de entre cerca de 2,5 e cerca de 100 micromoles por litro de meio de cultura.

5. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, no qual a cultura seja arejada de modo a manter, durante toda a duração da cultura, um conteúdo cm oxigénio que seja igual a, pelo menos, 5 milimoles por litro de meie de cultura.

6. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5, caracterizado por as bactérias serem colhidas a entre cerca de 5 e cerca de 24 horas após o inicio da cultura.

7. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, caracterizado por também incluir a embalagem das bactérias lácticas colhidas.

8. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 7, caracterizado por também incluir a armazenagem das bactérias lácticas colhidas.

9. Processo de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por se armazenarem as bactérias lácticas referidas a cerca de 4°C.

10. Processo de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por as bactérias lácticas referidas serem armazenadas sob uma forma congelada ou liofilizada. 3

11. Uma cultura de arranque de bactérias lácticas que possa ser obtida por um processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10.

12. Processo para se preparar um produto fermentado, caracterizado por ele incluir a inoculação de um meio que vai ser fermentado, com uma cultura de arranque de bactérias lácticas, de acordo com a reivindicação 11.

13. Utilização de um composto de porfirina, em combinação com um processo de cultura sob condições aeróbicas, para aumentar a sobrevivência de bactérias lácticas no final da cultura referida.

14. Utilização de uma cultura de arranque de bactérias lácticas, de acordo com a Reivindicação 11, para preparar um produto fermentado. Lisboa, 1 de Março de 2007