PT107276B - Método para produção de colagenase recombinante para digestão de colagénios - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO AO MÉTODO PARA PRODUZIR COLAGENASE RECOMBINANTE ATIVA, PROVENIENTE DE AEROMONAS HYDROPHILA, PARA APLICAÇÃO EM PROCESSOS ONDE A DIGESTÃO DE COLAGÉNIOS É NECESSÁRIA, NOMEADAMENTE PARA APLICAÇÃO MÉDICA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS QUE ENVOLVEM DEPOSIÇÃO EXCESSIVA DE COLAGÉNIOS E PATOLOGIAS MEDIADAS POR COLAGÉNIO. PARA ALÉM DA APLICAÇÃO NA CLÍNICA E NA INVESTIGAÇÃO, AS COLAGENASES MICROBIANAS TÊM UM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO ELEVADO AO NÍVEL DA INDÚSTRIA, NOMEADAMENTE NA INDÚSTRIA ALIMENTAR NA TENDERIZAÇÃO DE CARNES OU NA INDÚSTRIA DOS CURTUMES ONDE PARTICIPAM NO PROCESSO DE TINGIMENTO DOS COUROS. DESTE MODO, A PRESENTE INVENÇÃO PRETENDE FORNECER UM MÉTODO PARA OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DE COLAGENASE RECOMBINANTE ATIVA DE AEROMONAS HYDROPHILA EM QUE O COLAGÉNIO É DIGERIDO PELA COLAGENASE COM CONCENTRAÇÕES DE COLAGENASE INFERIORES À CONCENTRAÇÃO TÓXICA DA COLAGENASE PARA AS CÉLULAS.

Description

COIAGENASE RECOMBINANTE PARA DIGESTÃO DE COLAGÉNIOS, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO E SEUS USOS

Domínio técnico da invenção [00013 A presente invenção diz respeito ao método para produzir oolagenase recombinante ativar proveniente de Aeromoças hydrochiía, para, aplicação em processos onde a digestão de colagéníos ê necessária, nomeadamente para aplicação médica no tratamento de doenças que envolvem deposição excessiva de colagénios.

Antecedentes da Invenção {0C02] O colagénio é o constituinte maiorítário dos tecidos dos organismos pertencentes ao sub-reino Eumecazoa, estando presente de uma. forma geral nos Metasoários (Reino Metazoa ou Anima li ai , desde organismos ma is simples como espongiários até a organismos estruturalmente mais complexos como os mamíferos. Os colagénios constituem umaextensa família de proteínas caracterizada por uma variedade de propriedades químicas e estruturais. São moléculas semi-cristalinas, cuja principal função é suportar as células. Para além da sua função estrutural, através da formação de fibras insolúveis; na matriz extracelular, â qual confere força tensora e elasticidade, o colagénio: tem funções relacionadas com a atividade e desenvolvimento celulares; tem particular importância cm processos associados á .remodelação da matriz extracelular, quer em processos fisiológicos quer em processos patológicos,

Γ00Ό3Ί Em numanos, ο colagénio tem um papel fundamental em processos de cicatrizaçâo. Diversos traumatismos da pele, como queimaduras, atos cirúrgicos ou infeções, sâo frequentemente caracterIrados por acumulação excessiva de tecido fibroso rico em vários tipos de coiagénios. Várias outras patologias estão associadas a excessiva deposição de coiagénios e, por esta razão sâo frequentemente designadas como patologias: mediadas por colagérío.. As colagenases, como enzimas· capazes de digerir coiagénios de forma, específica, têm sido utilizadas para tratar diversas patologias mediadas por colagénio. Têm sido aplicadas colagenases de diferentes origens {i.e.: mamíferos, crustáceos, fungos, bactérias) para uso terapêutico, Um exemplo ma is frequente de aplicação terapêutica ê a utilização de colagenases microbianas no desbridamento enzimatico de feridas, para degradação dos tecidos necrosados, tornando maís fácil o processo de cicatrizaçâo de queimaduras, Recentemente, a utilização da colagenase produzida por bactérias da espécie Ctostridium histolyticum foi licenciada como método não invasivo e aplicada com sucesso no tratamento da doença de Dupuytren, evitando <3 necessidade de intervenções cirúrgicas recorrentes.

[0004] Muito frequente também ê a utilização das colagenases microbianas no estabelecimeirto e manutenção de culturas de células e tecidos. Tem sido citada a sua aplicação em métodos para o isolamento de células neurenais e células hepáticas, estudos em células estamí na is e célulaS: epiteliais. Para além da aplicação na clínica e na investigação, as colagenases microbianas têm um potencial híotecnologlco elevado ao nível da indústria, nomeadamente: na indústria alimentar na tenderízação de carnes ou na indústria dos curtumes onde participam no processo de fingimento dos couros .

[0005.] Xndepenâenfcemente da aplicação das col acenas es microbianas, estas enzínias são normal monte obtidas por processos fe.rmentat.ivos dos microrganismos produtores (como descrito no documento US 2010/0330065) © que requerem o seu isolamento posterior. Esta estratégia de obtenção de encima apresenta como principais desvantagens a uti.liração de metodologias que envolvem varias etapas eromatográfiças para ã. sua purificação, com. a consequente perda de prov.ei.na e de atividade,. Outra desvantagem associada a estas colagenases microb iana s se1vagens estabilidade ao armazenamento que baixa maior e a sua constitui o constrangimento para a efíçãçía da sua aplicação.

0006;

O documento Clonagem e: expressão de uma tese de potencial colagenase de Meromenas hydrophiia mestrado de Sliana Cavaleiro> Universidade de ãveiro (E t_.2 0 08} , di vu I ga recombinante. Este a expressão de uma. proteína trabalho consiste numa construção genética que não inclui nenhum tipo de fusão ou marçaçãò; a proteína recombinante obtida, não possui qualquer atividade, consequentemente resultando na perda de potencial biotecnológico. A presente invenção apresenta novas abordagens em termos de manipulação genética., nnmeadamènte pela construção de um gene híbrido que incluí um marcador (cauda de poli-histidínas) e condições de sobrexpressão de proteína recombinante, permitindo a obtenção de colagenase ativa em larga escala e com estabilidade ao armazenamento.

[0007.]; 0 documento “í⁵urif ication and çharacterízation of a reeombinant his tidine-tagged microbial. collagenase, apresentado no II Workshop de Biotecnologia. *5 anos de Biotecnologia na. UM, Aveiro, 2011 , não revela dados sobre a construção genética para expressão da colagenase recombinante v$tiva,· nem fas referência as etapas da sua resultados sobre purificação., mostrando apenas resultados Sobre a termoesíuibi 1 idade associada ao armas enaraente da enzima recombinante oura.

[0008] 0 documento A novel collagenase from Aeromonas sp, apresentado no congresso nacional Mi.crobi.otec' 11, Braga, 201.1, r epo r ta r es u 11 a do s compara t i vo s da caracterização da. atividade, colagenolítica associada à est i rpe AS-3 (Aeromonas pi sei cola ) e o seu mutante nulo para o gene da coiagenase, Não é referida qualquer informação relativamente ao nome ou. numero de acesso da suã sequência,· nem são referenciadas quaisquer particularidades inerentes à. clonagem e expressão do gene, [0009] O documento * Pathogeni.ç pótential of a çollagemase gene from Aeromoços veronil, descrito por Han e colaboradores {HA....2QQ8}, refere-se & uma peptidase da família IJ32 com ~68fcDa. 0 gene que codifica para esta enzima, é homólogo ao gene AHA....1043 anotado: no genoma de Aeromoças hydi'opdil& ATCG 7966*, Nô entanto, na presente invenção, a construção .basei.a-se na sequência da GRF (open reading írame) AHA....0517 (genoma A, xÇpdropbiia: ATCC 7966), que codifica para uma potencial coiagenase da família M9 (Pfami: PF01752) ·, produto distinto da coiagenase descrita por Kan e c o -autores (K A....2 0 08).

[0010] 0 documento US3677900 (1972;, METROD QF PRODUC1NG COLLAGENASE W1TK A SPFCXEF QF VISRXO, refere-se a ima método de produção de colagenases bacterianas produzidas por bactérias dos géneros Vibrio e Aeromoças. Contudo, a espécie citada -- Aerepomas proteoiyfcica ~ foi posteriormence teci as si ficada como Ai brio proteoíytious (BA_1980) e o nome da bactéria foi aprovado em 1985 (MO„1985)não se tratando, portanto, de uma patente para produção de colagenases de Aeromoças.

[Ο 01 1] Ο do oamen t Ο D S 2 0112439 2 0 * Compos i t i οη s and methods for treafing collagen-medíated diseases íundameritâ--se no desenvolvimento de um produto e formulações. farmacêuticas e consiste na combinação de colagenase I e colagenase II fauma proporção de 1:1} de Ciostridium hlarolyticum para tratamento de doenças que envolvam a deposição de colagénio.

[00123 A presente invenção descreve uma colagenase de origem distinta (Aeromonas hydropáila) das acima citadas, que é produzida de forma pura, ativa e estável, através de um protocolo que envolve um único passo de purificação por cromatografia de afinidade.

Descrição geral da invenção [0013] A presente invenção refere-se a um método para obtenção de uma colagenase, capaz de digerir colagénio, em concentrações inferiores à concentração tóxica para as células, em particular células tipo fibrobiasto, ou inferior à concentração usada com outras colagenase. A colagenase descrita na presente invenção, pode ser proveniente de bactérias do género Aeromonas, entre outras.

(0014] A colagenase microbiana é produzida de forma recombinante (Fig. 1} e sobr©expressa em bactérias, Dadas as çaraçterístiças do produto obtido, nomeadaménte a capacidade de digestão de colagénios In vitro, a atividade, em çoricentrações sub-tóxicas, na expressão de colagénio da matriz; exfraceiular de osteoblastos em cultura e a sua elevada estabilidade ao armazenamento, è possível a sua aplicação em processos onde a digestão de colagénios é pretendida< Ξ aqui reivindicada a sua utilização, assim como de qualquer forma modificada derivada, que mantenha as mesmas própriedàâes biológicas, quer em âmbito clínico e veterinário, pare 0 tratamento de patologias era que sêja pretendida a digestão dê eolagéníos, quer para fins biotecnOlogiCbs, para produção de compostos farmacêuticos, na indústria alimentar, ou cosmética.

[0015] Descreve-se ura método para obtenção e purificação de colagenase recorabinante ativa de Aercsonas compreendendo os seguintes passos * isolar o DNA genómíco de uma cultura de Aeromoças;

• amplificar	uma	sequência cora	ura grau de horaoiogia
pélo menos	95 %	cora â 3KQ. Tb	, iv 1 ;
* integrar,	num	vector de	expressão induzivei,

sequência codificante para uma proteína de fusão, em que a referida sequência codificante codifica para um conjunto^ de histídinas consecutivas ;

• produzir e seleoionar o plasmídeo teeomtoinante desejado;

» selecionar e cultivai' as referidas células recombinantes e induzir a expressão de colagenase recorabinante cora indutor apropriado;

• recolher e purificâr a oolâgenese recombinante ativa.

[0016] Descreve-se ainda ura método para obtenção e purificação de colagenase recorabinante, cora ainda melhores resultados, que compreende:

* o isolamento do DNA genóraíco de uma cultura de

Aoremovas;

• a araplificaçao do gene da putativa colagenase da referida cultura cora uma secruência cora ura grau de homologia de pelo menos 5 5 % com a SEQ. í:d No. 1 ~ ΑΗΆ....0517, de preferência, cora ura grau de homologia de peio menos 56 %, 97 %, 98 %, ou igual utilizando iniciadores que inolue-rò o local de. reconhecimento das enzimas de restrição iccni e HindiΐI ;

• a digestão de um vetor de clorlagem» o qual possui um gene marcador de resistência a canamicína, dom as enzimas íicol e Hindi! I,_: um gene de resistência à canamícina;

• e que apresente uma sequência de DKA que codifica para um conjunto de histidinas consecutivas (cauda de histidinas)?

• olonagem do genê amplificado e digerido com as enzimas de restrição SspBi: e Hindiii no vetor de clonagem selecionado e previamente digerido com as enzimas de: restrição dcol e Bíndlll;

• a utilização de células hospedeiras, de preferência cole, nomeadamente £< coli

TOP10F' para transformar e selecionar vetores rec omb í nantes;

• utilização de células de expressão, de preferência coli, nomeadamente B, c&lí BL21 (DE3) para sobreexpressar a proteína pretendida;

« purificação da proteína com atividade.

[Q017Í Â colagenase reeombinsnte obtenível pelo método descrito nesta invenção íe não selvagem), possui ura pèptido sinal que promove a sua transiocaçao para o meio extracelular (o que facilita o processo de puríficação) e uma cauda de histidinas que permite a purificação através de uma cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado.

[GG18] Á colagenase recomhihahte para a digestão: de ço.iagénio obtenível pelo método descrito: nesta invenção, digere o colagénío coia concentrações de colagenase inferiores à concentração não tóxica para as células, noraeadamente até 25 μΜ de colagenase, em particular para 100: nM, ISO nM ou 3 00 nM de oelageuase, [0019] Foi ainda demonstrada a sua interação física com colagénio (substrato) , que garante uma permanência alargada no local (tecido) onde se pretende ser exercida a sua atividade, [00201 Gontrariamente à colagenase de Cl astridium sp> comerciai, esta colagenase produz um padrão hidroiitico mâis próximo do padrão produzido por colagenases de humanos o que sugere uma maior potencialidade para a sua utilização médica..

[0021] Numa outra realização o método para obtenção e purificação de colagenase compreende os seguintes passos:

a) isolar o DMA gendmíco de uma cultura de Aeromcaas de preferência Aeromoças hgdrophiia ATCC 7966·;

fo) amplificar o gene da putativa colagenase da referida cultura com uma sequência cora um grau de homologia de polo menos 95 % comi a SEQ_:. XD- No, 1 ahã_G51'7, de preferência com um grau de homologia dé pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou igual, utilizando iniciadores que incluem o local de reconheci mento das enzimas de; restrição AspHX e HindiXX, de preferência com AHCF_.SapHI (SSQ, 1D, No. 2) e AHGR„H.indiXI (SEQ. XD. No, 3). e terem como base a sequência de nucleó tidos codificar-te SEQ- XD. No. 1 do pollpeptíd-eo pre-ColAh, incluindo o péptido-sinal;

c) digerir o referido vetor de clonagem, de preferência que compreende o local para as enzimas Neol e Sindill , um gene de resistência à cansmícina e que apresente nmá sequência, de SNA que codifica para um conjunto de hístidinas consecutivas (cauda de poli-hist idinas)?

d) clonar o referido gene da colagenase no referido vetor de clonagem;

e) produzir o plasmideo recombinante desejado;

f) inserir o referido plasmideo reçomfoinante em células hospedeiras adequadas de E. coii, de preferência. X. coii TOPlQFd

g) transformar o referido plasmideo recombinante em células de expressa© recombinânte, de preferencia utilizando células hospedeiras compatíveis com o vetor utilizado, como demostrado com £. c&ií BL21 (DE3; para sobreexpressar a proteína pretendida, e ainda pFT2Sb(+};

h) semear, selecionar e cultivar as referidas células recom.binant.es ;

í) recolher e purificar a colagenase recombinante activa.

[0022] Uma outra realização refere-se aos iniciadores, que incluem o local de reconhecimento das enzimas de restrição Fépííl e Hindi XX, que compreendem as seguintes sequências horno1ogas • SSQ. ID No. 2: GGGAT.AATC ATG AAC AATCTGGGTACC AG - 3 ’ ;

• SSQ. XD No. 3: TTAAGCTTGTGGGAGGAGTCGTTGGC -3‘.

[002 3 j Numa outra realização do referido método a amplificação pode ocorrer por reações em cadeia pela polimerase realizadas em volumes de 50 μΐ contendo 3 mN de NgClr, 250 uN dNWs, 0,5 μΜ de cada iniciador (AHGF_BspHl e

AíICR_NíndIll) , 5% pMSG (v/v) , .1,5 U Tag 'DMA ppl.iiterase em tampão apropriado e 50-100 ng de DNA.

[0024] Numa outra realização do referido método a referida amplif .1 cação pode ser realizada num termociclador,

compreendendo	a desnaturação inicial do	DNA genómico de
Aerornou a s s pp,	. à temperatura 94 - 96 °C	durante 2 - 5min,·
seguido de 40	ciclos de 30 s a 94 - 96 '	CC, 3Os a 58 GC e:
3min a ~0 - 7	5 °C de preferência 68 SC;	extensão final de
2Q~3Qmin a 68	-7 5 °C, de preferência 72	eC; a temperatura

ótima de atividade da Tag polimerase usada, quê contudo poderá variar com o fabricante.

[0025] Numa outra realização do referido método pode utilizar-se um vetor de clonagem que permita a aplííioação de uma sequência líder (péptido sinal) e uma cauda <fe histídínas, compatíveis com os terminais do fragmento (gene) a ligar, como demonstrado para o vetor de clonagem ser pST26b(+), [0026.] Numa outra forma de realização do referido método a seleeção de um clone contende o plasmideo recombinante pode ser feita através de cultura em meio seletivo, como demonstrado para o plasmideo pET26b(+)_; em que os clones positivos são selecionados em meio suplementado com canamícina.

[0027] Numa outra realização do referido método as células hospedeiras de expressão podem ser transformadas e cultivadas a 26 ®C e 130 rpm durante 18h, [0028] Numa outra forma de realização do referido método as condições de centrifugação: (para obtenção do extrato) poden; ser as seguintes: velocidade de llOOOxg, 4 ^S;C; durante 25 rainutos.

[0029] NtiSiá outra realização do referido método a recolha da eolagenase reco.m.bina.nr.e pode: ser efetuada por centrifugação ref ri gerada ou por outro processo de concentração celular, Seguida de uma diálise (4 ^SC) contra tampão de ligação é filtrado com filtro de seringa (0,2 pm).

[0032] Numa outra forma de realização do referido método a purificação da colageiiase recombinante pode ser efetuada por çromatografia de afinidade, de preferência cromaf ograf ia. de afinidade^ com ião metálico imobilizado ou por outros processos similares. A çromatograf ia de afinidade poderá ser realizada de preferência numa coluna acoplada a um sistema de média pressão, [0031.3 Descreve-ss ainda uma eolagenase. isolada, obtenível a partir do processo descrito no método anterior, que inclui na sua construção genética um domínio de proteína recombinante soforeexpresso com um marcador de cauda de histidínas, Assim, a eolagenase isolada obtenível a partir do processo descrito na presente invenção é capaz de digerir o colagénio em concentrações não tóxicas, muito inferiores as çoncentraçôes eficazes com outras co1açenases, [0032] Numa outra realização, g referida côlagenase isolada inclui na sua construção genética um domínio de proteína recombinante sobre-expresso e um marcador, cauda de histidínas.

(0033] Numa outra de realização isolada obtenível a partir do processo descrito na prer^ente invenção, capaz de digerir o colagénio em concentrações de colagenase inferiores à toxica, [0034] Numa outra realização tem a caracteristica da colagenase isolada apresentar capacidade de digestão de colagénio do tipo I, tipo II e tipo III (digestão ia vítro, analisada por eleotroíorese) <

(00353 Numa outra realização a colagenase isolada poderá ser usada como medicamento ou em medicina, de preferência no tratamento cie tecidos traumatizados, nomeadamente no tratamento de feridas traumáticas, úlceras varicosas e queimaduras e também no tratamento da doença de Dupuytren, uma fibrodisplasia prolíferativa da aponevrose palmar; em terapia genica ou eletro-génica; e ainda no tratamento de ciática, nomeadamenfe em discos íntervertebrais he.rniad.os, (0036] É ainda descrita uma composição caraoterísada por compreender ou consistir na colagenase descrita anteriormente. A referida colagenase pode ser aplicada em solução, na sua forma liofilizada, ou numa composição compreendida/constituída pela referida colagenase e um biomaterial, nomeadâmente o guitosano, {0037j Numa outra realização a referida composição poderá ser uma formulação tópica, uma formulação para administraçáo oral, ou parental ou uma formulação injetáve'1, [003 8 j A presente invenção descreve ainda o uso da referida colagenase obtenível pelo método descrito anteriormente, em técnicas para cultura de células e tecidos animais, tais como isolamento cie células endotelíais, células neuronais, çsrdiomiócifos, hepatoeitos e células estaminais; ha industria alimentar, nomeadamente no processamento de carnes: para melhoramento das suas propriedades e texturas; e na indústria dos curtumes, nomeadamente .para auxiliar no processo de tingimentô de couros ·.

[0039] A presente invenção diz respeito ao processo de clonagem, expressão e purificação de uma colagenase de Aeromonan para digestão de coiagéníos , [0040] Um dos objetivos da presente invenção é a produção de colagenase de Aeromoços, seguindo uma metodologia baseada na r©combinação genética. Numa realização preferencial., após identificação do gene, foram desenhados iniciadores visando a clonagem dirigida do gene completo que codifica para a colagenase em Ânmr.u npdrophiia. O gene isolado pode ser clonado num vetor de clonagem contendo uma sequência de UNA que codifica para um conjunto de cinco histidinas consecutivas (cauda de histidinas].,. que foi posteriormente utilizado para transformar células competentes, de forma a produzir células recombinanf.es, capazes de expressar a colagenase bacferiana. Apôs identificação e seleção dos clones positivos, as células recombinantes expressão de colagenase reeombinante.

são induzidas para O meio extracelular das culturas centrifugação, crorna tografia purificação de pode ser separado das células por dialisado e aplicado numa coluna de com afinidade para histidinas, para colagenase reeombinante ativa.

[0041] A presente invenção é útil para aplicação em processos onde se pretende digerir coiagéníos intersticiais, especificâmente para o tratamento de patologias que envolvam, a deposição excessiva de matriz extracelular, por exemplo como a Doença de Bapuytren. & colagenase recombinante descrita tem ainda aplicação no estabelecimento de culturas celulares primarias, para as quais é essencial o destacamento dos tecidos de origem e dissociação celular prévia, è cultura in vítro.

Descrição das Figuras t0042] Para uma ma is fácil compreensão da invenção juntam-se em anexo as figuras,: as quais representam realirações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem limitar o objecto da presente invenção.

Figura 1: Representação esquemática do processo de clonagem e obtenção do plasmideo recombinante ípCUA). Vetor de clonagem digerido com as encimas //.iodiir/Vcoí (a) e produto de reação em cadeia pela polimerase íPCR) digerido com as encimas de restrição RindIIl/físpHl (fc) > gerando terminais complementares para proporcionar a ligação do gene ao vetor (c), em que:

IA - representa o piasmideo digerido;

1B - representa o produto de RGB digerido;

1C - representa a reação de ligação.

Figura 2: Diagrama método1dgico da expressão e puríficação da colagenase recombinante.

Figura :3t Expressão da colagenase: recombinante em B. colí. Sobreexpressão ÍSDS --PAGE) e atividade proteol.it ica (zimografia de gelatina} da colagenase nas células recombinantes ÍR) vs células não transformadas (G) . A migração da proteína recombinante corresponde ao peso molecular esperado ¢-.100 kDa) e esta assinalada cora uma seca.

Figura 4: Pur i ficação dá ColAh recom.binante por' cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado.

Figura 5: Digestão de coiagénio do tipo 1 humano com a coiagenase recorabinante (ColAh:) ,

Figura 6: Deteção da interação física entre enzima; substrato (colagenase recorabinante:colagénios do tipo X) por imunodeteção...

Figura 7: r e c orab i na n t e (-80 »C; -20

Estabilidade da atividade da colagenase (ColAh) ao armacenaraento a várias temperaturas *C; 4 ^?C e 37 ^VC) .

Figura 8: Determinação da viabilidade osteoblastos em cultura expostos ao tratamento celular de com ColAh.

Figura 9: Tmunodeteção de coiagénio do tipo T nas frações celulares e meio extráeéluiar de osteoblastos sujeitos ao tratamento com ColAh durante um ensaio do tipo doserestosta.

Figura 10: Distribuição infra e extracelular de coiagénio do tipo I em osteoblastos MC3T3 (15 dias após confluência):, analisada por microscopia confocal,

Descrição detalhada da invenção {0043] Como ê pretendido: nesta secção será feita uma_: exposição detalhada da invenção. Os métodos revelados são meramente explicativos e: .não devem, por isso, ser interpretados como uma restrição cia invenção,, mas sim como suporte das reivindicações. Á invenção será descrita com ref erência às f iguras 1 a 1.9, [0044] A estratégia básica para aumentar: a expressão da proteína ativa passa peia clonagem do gene que codifica, para a coiagenase num vetor de expressão e consequente transformação no hospedeiro para expressão hetergIoga, [0045] O vetor de expressão é um. vetor de clonagem, const.ru ido de forma. que o gene ai inserido seja transcrito/traduzido e?pós a sua introdução nas células hospedeiras.

[90461 Neste trabalho foi utilizado d sistema pET para expressão da coiagenase anotada na ORE ARA_0517 de Aeromonas úydíOph/Je ATCC 966⁷, [0047] a presente, invenção refere-se ao método para obtenção de coiagenase recombinante que compreende as Seguintes etapas: (a) isolamento de DNA genómico de Aeromonas hydrophila ΛΤ-CC 7966¾ (b) amplificação do gene ela putativa coiagenase por PCR. para gerar múltiplas cópias do gene da coiagenase (ORE: AHA_0S17) (c) clonagem do gene da coiagenase de Áeromonas no vetor de clonagem pET26toÇi-}; (d) transformação do vetor recombinaifte, pcUA. era células competentes (E, coli TOP10E') para produzir um cl, One de partida.; (e) identificação e seleção do cloro de partida transformado positivamerite,- ffí seguenciação do insere o para confirmação da correta fase de leitura do gene no vetor; (g) purificação do plasmideo recomirinance e transf ormação em células de expressão E. coli BI..-21 í DK3} ; (h) identificação e seleção das células recombinartes transformadas; (i) indução das células recombira.nte.s para expressão da colagenase recombinante; (j) recolha do meio ex t r a c e 1 υ 3. a r cultura purificação: da colagenase:

recombinante por cromatografia de afinidade; (k) diáiise contra tampão colagenolítica.

isotóníco;

(lí ensaio de atividade [0048] Assim, numa primeira fase do processo,· o DNA total da estirpe Aeranonas iydfopdia ATCC 79 6 6' foi isolado a partir de culturas líquidas em meio iuria-Bertani (LB) suplementado cota o antibiótico ampícilína (50 pgAml}, utilizando o sistema comercial Genomle MA Purificatíon Kit, seguindo as instruções do fabricante. Posteriormente, o gene: que codifica para a putativa colagenase em Aaromcoas foi amplificado pela PCB utilizando o seguinte par de iniciadores (sublinhada a sequência de reconhecimento das enzimas de restrição} ::

- SEQ. 1D NO, 2: GGGATAÃTGArGAACAATCIGGGTACCAG-3'

- SEÇp 1D No. iWAAGGT^GTGGGAGGÃGTCGWGGG -3' [0049] Estes iniciadores foram desenhados com base na sequência de nucleótidos codifícante. (AHA__05.17) í£SQ. 1D. Kc. 1} do polipeptídeo pre~ColAh de forra a incluir o péptido-sinal.. As reações de PCB foram efectuadas em volumes de 50 pl contendo 3 mli de MgGla, 250 pM dNTPs, 0,5 pN de cada iniciador (AhCF...EspHl e AHCR„KÍndxri) , 5%

DMSO (v/ví, 1,5 U Τα o DNA poi imerase em tampão apropriado e 50-100 ng de DNA, As reações decorreram num t ermoci dador iCycled Thermai Cyder nas seguintes condições de amplificação:: desnaturação inicial a 94 ⁰C durante Smin; 40 ciclos de 30s a 94 ^âC, 3 0s a 5® ^QG e 3 min a 72 d? extensão final de 30 min a 72 ^:::C.

[005(3] como referido anteriormente, ao sequências dos iniciadores incluem o local cie reeonheclmento das ensinas de restrição, SspHI e HindXII, (sublinhados na sequência dos iniciadores}, indispensáveis para gerar os terminais aqnados para posterior ligação ao vetor (Fig. 1) . Neste trabalho foram utilizadas as enzimas de restrição BspHl e hindu I para digerir o produto: de RCR e a dcol e á fíiadili para digerir o vetor, seguindo as instruções do fabricante (tabela 1}.

Tabela 1: Digestão com uma enzima de fesirição

Reação de digestão:

• t/w do volume final ide tampão de reação {10X) » 50-180ng de DMA • 1 U de endfonuclease de restnçâo • Agua destilada até perfazer o volume fina! 1Dpi

Incubar 2-3 horas: temperatura ôttma da atividade enzimàtioa Parar reação a -20*C [0051j conter seleção

O: plasmíde© pET26fe( + ) foi o vetor escolhido, por um gene de resistência à canamiciua que permite a posterior dos transformantes.

[0052] Após diges tão, (tabela 2} das r eações de (produto de PCR), de modo foi efetuada uma d í g e s t ã o d o veto r a eliminar os sais precipitaça o e do inserto das soluções, que poderiam inibir a reação de ligação.

Tabela 2; Predpitsçao das reações de ífoestao * Adicionar a cada ruaçao 30 μ; da ágbá: desíonteada .e^ênl e WU pi .de isopropanui * incuba?'a~ SCFC; 1 hora· * Oeatníaga? 5 mindiós a 14 000 ?p?a 'è descartar o soferensdanía * Deixa? secar a temperatura ambiente * Ressospertífer ó: DNA em 20 pi de águá desiótMáadá estéril [0053] A reação de ligação do fragmenta ao vetor foi estabelecida numa razão molar inserto:vetor correspondeute a 3 ri [tabela 3), aplicando a seguinte formula de calculo:

Xng de vetor x tamanho do inserto (kb) x inserto/vetor ~ ng de vetor tamanho do vetor (kb)

Tabela 3: Reaçàa de bgaçâo ♦ tOO og DNA Çustod * 180 ug: da Inserto t pi tampao: de isgase· d Oh * t U 14. DMA hgase

- Água eoténi pa?a gerbes? ou voiame íínaí 10 pi

Incubar a reacaãu a M^SG durante 14-i Oheras; a reaoaàc pode ser imedi stamente utdzads ou armazenada a ÁdC fOOoâj Tendo em conta as sues caracteristícas, nomeadamente, por serem. rsoA- e e.hi , possuírem uma elevada, eficiência de transformação e boa px:oduçao de piasmideo, as células TOPIOF' foram selecionadas como estirpe hospedeira para gerar um clone de partida (para manter o piasmideo recombínante) , O vetor recombínante obtido, o guai designamos por pCOA, foi utíiisãdc numa fase: inicial para transformar a estirpe E, coli TOPIOF', segundo o estabelecido na tabela i,

Tafoeís 4; Transformação do células competentes de £ <xto • Descongelar em goto uma aiiquota {50-200 μ!} das células químlo-competentos - £ cof/TGPWF' ou 8L2KDE3) » Adicionar 2-t 0 μΙ da reaoào de ligação as células competentes, misturando suavemente. Manter em gelo durante 30 minutos, • Submeter as células a um cheque íérroscc: 30 segundes a 42^ÇC; 2 minutos em golo.

• Adicionar 250 pl de meio SOC. Incubar durante fhora a 3?^SC e a 250 rpm.

• Semear 2.0-100 pl da transformação em placas de meio LA suplementado com o SQpg/mi de canamlcina.

• incubar as placas a 37-C; 16- f Shcras.

ÍQÕ55] A seleção dos transformantes (çiones positivos) foi. efetuada por PGR usando os iniciadores universais para o vetor pET (T7 Pr orno ter Priraer #6.9348-3, SSQ. ID, 6 ~ 5'-AATACGACTCAGTATAGGG-3 ·' e T7 Termina tor Primei; #69337-3 SEQ-. ID. 7 -5-GCTAGTTATTGGTCAGCGG-3') de acordo com as indicações do fabricante, A avaliação em gel de aqarose permitiu a seleção de um clone positivo (contendo o pCÉA) * Os ciones transformados foram criopreservados a -80 ^SC, em 1.5 % gliceroi (v/v) , [0056I A inserção correta do fragmento cionado no pCUA foi confirmada por sequeneiação do DMA plasmídi co, Para isso, a extracçâo dos plasmídeos recombinantes foi efetuada utilizando d sistema UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep Kit,, para posterior sequenciaçáo com os iniciadores T?, A sequência nucleotidica obtida (SEQ, 1D. No, 4) foi confrontada com sequências depositadas na base de dados do NCBI. Os resultados de sequenciaçáo permitiram aluda confirmar a pauta de leitura da sequência que codifica a cauda de bístidinas , presente no vetor pET26hít. uma vez confirmada a construção pretendida para, o vetor pCUA, procedeu-se à. transformação no hospedeiro de expressão 20 eçli BL2Í (DE3 ) - e â seleççáô de transformantes pdxí PCB, segundo a metodologia descrita anteriormente para seleção do elone de partida {em Fl ooli tópiQF ' ) .

(0057} Para expressar a coiagenase recorabinante foi seguida a estratégia representada na Fig. 2. Foram utilizados pré-inôculos de um transformante da estirpe F. coli BD21 (DE 3) inoculado em meio BB contendo 50 pg/ml canamicina, Uma cultura (50 ml) foi incubada a 37 -C e 150 rpm até atingir 0,5 unidades de densidade óptica (D.O.) a 600 nm; as células foram induzidas com adição de 0,5 mM isopropil-beta-D-tiogalsdtopitanosídeo (IPTG). As condições de cultura após indução foram ajustadas para 26 ^SC e 130 rpm durante 18 h, no sentido de uma maior expressão de enzima ativa. A. sobreexpressâo da coiagenase recombinante ColAh em F, coli foi avaliada por GQS-RAGB e atividade proteolitica por zimografía de gelatina (Fig. 3).

Γ0058.] O meio extracelular foi recolhido após centrifugação a llOQOxg, 4 -C, durante 25 minutos e diâlísado (4® C, 1 h) contra tampão de ligação. e filtrado com filtro de seringa (0,2: gm) , antes do passo de purificação por cromatografía de afinidade. A cromatografia foi realizada numa coluna de afinidade com ião metálico imobilizado em particular HisTrap”⁵ FF, acoplada a um sistema de média pressão em particular AKTA Basic. Assim, após equilíbrio com 10 volumes de coluna em tampão de ligação (20 mM fosfato de sódio, 0,5 M NaCl, 5 míi ímidazol, pH 7,4), a amostra (10 ml) foi aplicada a coluna e ela ida em 10: % (v/vj de tampão: de eluíção (20 rafó fosfato de sódio, 0,5 M FfaCl, 500 mP imídazol, pH 7,4), que corresponde a 50 mH âe: ímidazol (Fig. 4) . A fração recolhida foi analisada em zimografía de gelatina (0, 1 %) e por SDS-PAGE, para confirmar a sua atividade e o seu estado de pureza. A colágénááé recombinante foi ainda. restada em relação à sua capacidade para digerir ceia génio do tipo X ;Fíg. 5) , de acordo com o protocolo descrito por Duarte e colaboradores (1)1)....2005} e a sua interação .física com este substrato (Fig. 6), Foi também confirmada a estabilidade ao armazenamento da sua atividade por incubação da ColAh em diferentes temperaturas ·;··«0 ^SC, -20 ^SC, 1 ^aC e 37 ^sCj e tempos de armazenamento (Fig. 7).

FORMAS DE REALIZAÇÃO [0C59 j O procedimento para obtenção da solução de eolagenase recombinante para digestão de coi.agénios será mais facilmente compreendido em contexto dos exemplos seguintes. São possíveis realizações da invenção e, por isso, não deverão ser interpretados como limitações da invenção.

[00603 foma forma de_: realização compreende a utilização de doses sub-tóxícas de eolagenase recombinante para redução de colagénios em osteoblastos em cultura.

[0061]

Aoromenas Assim, após tiydropih i 1 a AHC.F__BspHI. permitirem,: introduz ír, sequências restrição. reconhecí das

HindiXI (tabela 1} para isolamento AICC 7966b

A obtenção de eolagenase compreendo as etapas descritas de DMA genbmioo são utilizados e AKCR__ Hindi II, específicamente simultaneamente, selecionar a em cada uma das extremidades de reconhecimento das respetivas Estas sequências são e clivadas pelas enzimas de restrição recombinante de anteriormente. de Aeromonas os iniciador e s concebidos para ORF AHÃ_05í7 © do gene, as enzimas de especrticamente BspHX e gerar terminais coesivos compatíveis com os terminais do vetor pET26b(+) digerido pelas enzimas fícbl e HindIIT, como representado na Fig. 1 e seguindo as indicações para a reação de ligação (tabela 3). Após ligação do inserto ao vetor, o plasmideo reeombinante é utilizado para transformar células competentes (F, coli TQPÍW' j e produzir um cione de partida, seguindo o protocoib: descrito na tabela 4. úma vez selecionado como cione positivo em placas de. meio lb contendo 50 ug/mi canamicína (antibiótico que permite selecionar as células transformadas: pelo plasmideo), procede-se à purificação do plasmideo e a sequência do inserto é determinada por sequenciação automática de modo a confirmar se o gene foi clonado na fase de leitura correta, o que permite a expressão da proteína reeombinante ativa contemplando a cauda de histidinas (SEQ, ID, NO. 5} para posterior purificação por cromatogfafía de afinidade. Após confirmação, o plasmideo reeombinante é então usado para transformar células de expressão B< coil BL21(DE3) (tabela. 4) , À semelhança, do que foi descrito anteriormence, os clones positivos são selecionados em placas contendo canamicína e a presença do inserto é confirmada por PCB. utilizando os iniciadores específicos para o vetor e posterior determinação da sequência peio: método de Sanger (SA__1977) , Uma vez confirmado, o cione positivo é inoculado em meio LB (suplementado com 50 pg/ml canamícina) para produzir um pré-inóculo que é usado para estabelecimento da cultura para sobreexpressao de colagenase reeombinante, Como representado no esquema da Fig, 2, 1 ml de pré-inóculo é utilizado para inocular 50 ml de meio contendo canamícina, que é incubado a 37 ^&C, sob agitação (150 rpm), Quando atinge a densidade ótica 0,6, medida a 600 nm, a cultura é induzida com 500 mM de IPTG e incubada durante 18 h, a 2 6 -C e sob agitação controlada (13 0 rpm) , O meio extracelular da. cultura é recolhido, após sedimentação das células por centrifugação (llQOOxg, 25 minutos:, 4 ^SC)_:, posfceriormenfce dialísado (1 ^Í!C) contra tampão de ligação (20 mM fosfato de sódio, 0,5 M NaCl, 5 mH imidazol, pH 7,4) sob ligeira agitaçãoA amostra é filtrada com filtro de seringa {0,2 çm) e aplicada a uma coluna cie afinidade com ião metálico imobilizado (HisTrap™ FF) , acoplada a um sistema de média pressão, de preferência AKIA Basic. .Assim, após equilíbrio com 10 volumes de coluna em tampão de ligação, a amostra (10 ml) é aplicada e a corrida é estabelecida a um fluxo constante (1 mi/mín). A oolagenase recombinâute é elurda dâ coluna ém 10% de tampão de eluiçãó ( 20: mM fosfato de sódio, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazol, pH 7,4), que corresponde a 50 mM de imidazol (Fig. 4). A fração recolhida é analisada em zimografía de gelatina (0,1 %) e por SDS-PAGE, para confirmar a sua atividade e o seu estado de pureza.

[0062] A amostra ê quantificada utilizando o kit de quantificação de proteínas Micro BCA, segundo as indicações do fabricante.

[0063] O objetivo desta aplicação é demonstrar o efeito da colagenase recombinante de Aerc/scnas na proliferação e diferenciação de células de mamíferos em cultura. Para isso é utilizada a linha celular EC3T3-E1 (ATCC), uma linha celular de osteoblastos de ratinho, Estas células encontram-se na superfície óssea e são diretamente responsáveis pela formação dos ossos. Foram particularmente selecionadas, porque durante o processo de diferenciação as células precursoras dos osteoblastos alteram a sua morfologia e a expressão de marcadores funcionais, começando por segregar proteínas da matriz óssea, como colagénio do tipo 1, que representa cerca de 90 % da matriz orgânica e providência a mineralização do osso.

[0664] Assim, a cultura estabelecida de acorde Resnitidamente, as células em atmosfera húmida, 5 % estrutura para a posterior da linha celular MC3T3--E.1 foi des cri to (P I_2 010) . foram, mantidas a 37 ^SC meio .mínimo essencial equilibrada sup1ementado com % (v/v) de uma es tr ep t omi ç í na sub -conf1uen tes 1: 5 c om 0,25 % com

CQ:;, era contendo. 2 mlã glntamina numa solução salina EBES |Eagle's Balanced Balt Bolution), % (v/v) soro bovino fetal (FSS), 1 solução com penicilina (160 D/ral) e (100 mg/ml) e 3,7 g/l de Na ECO;.. Culturas (80 - 90 % de confluência] são divididas: solução de trinsina/EDTA a 5 GO/, 37 -C .

[00651 Para determinação da viabilidade celular dependente da dose e avaliação do efeito da ColAh na proliferação,- 1x10^:; células são: semeadas em poços de 35 mm, em placas de cultura de 6 poços (numa densidade de 1x10’ células /cm-^;) e cultivadas nas condições anteriormente referidas. O meio é renovado: a cada 2 dias de cultura. Após 18 dias em cultura, que corresponde ao 15 dia após confluência, o meio de cultura é substituído por meio suplementado com 1.00, 150 e 306 nM de colagenase pura, e as células são incubadas^ durante 16 horas:. Depois deste período de exposição, o meio é removido por aspiração e substituído por meio fresco contendo 10 % de uma solução de resasnrina 0,1 mg/ ml para determinação da viabilidade celular. Após 4 h de incubação a 37 ^aC, em atmosfera húmida com 5 % CO:?, 1 ml de melo é recolhido e a densidade ótica (DO) a 570 e 600nm é medida para todas as amostras, A DO final (DO-?) resulta subtração entre a razão DQrô/DGetm de cada amosbra e a razão DOs-m/DOscm cio controlo negativo (meio contendo 10 % de uma solução 0,_f 1 mg/ml resazurína) , Como controlo positivo, a DCn das. células incubadas em 0 nM de colagenase reeombinante é considerada ÍÔQ % e a viabilidade celular é calculada como percentagem relativa deste valor controlo. Coro esta representado no gráfico da Fig. 8, as concentrações de GolAh reeombinante testadas e obtidas pelo método da presente invenção não afetam a viabilidade das células MC3T3 [00663 Nb sentido de determinar o efeito da GolAh na proliferação celular dos osteoblastos em cultura, é avaliado o perfil de expressão e segregação de colagénio do tipo I, utilizando metodologias baseadas em imunodeteção.

[0067] Assim, após ensaio de exposição a GolAh, o meio de cultura {1 mi) de cada condição é recolhido para micro tubos contendo 10 % dodecílsnlfato de sódio: (SDS) . As respetivas células são cuidadosamente lavadas com tampão fosfato salino (P8SG e recolhidas com uma solução 1% SDS (m/v)... As amostras são fervidas durante 10 minutos em banho-maria (100 ^{3 * S}C) e é determinada a concentração de proteína total (BCA Protein Ássay lleageut, Pierce)< Seguidamente, a mesma quantidade de proteima total (60 pg) , para ambos os tipos de frações celulares obtidos (células e meio de cultura) , foi resolvida em. gel 6,5 % SDS--FAGE em tampão triscglicina. As proteínas separadas por eletroforese foram eletrotransferidas para urna membrana de nitrocelulose para posterior ímunodetêçáp com anticorpo primário anti-colagénio tipo .1, após bloqueamento da membrana com solução 5 % (m/vi leite magro em TfôS-T (10 i«N Tris--HC.1, pK 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 % Ween) (DU....2005) , A deteção da ligação proteína-anticorpo é efetuada através de guimíolumíhescêocía, com anticorpo secundário anti~XgGs de ³ DBS ( ix) ; Dissolver 8g NaCl, 0,2g PCI, 1, «g :Ot>l'?O_4z 0,24« ef KftPO._; èfft 800 ml de água destilada; ajustar o pa a 4; perfater 1 t e esterilizar em autoclave (latsi, 121 *0, 20tninS .

coelho, conjugado com. peroxidase de rábano e recorrendo ao Kit ECL, de acordo com as instruções do fabricante e reveladas em câmara escura., em chapas auto-radiográficas.

[0068] Os resultados mostram, claramente, a redução de colagénio em ambas as frações, células e meio extracelular, demostrando o efeito da colagenase na expressão da matriz extracelular por parte dos osteobla.st.os (Fig. 9) , o mesmo efeito é observado em concentrações de colagenase não tóxicas.

colagenase purificada [0069] A distribuição celular do colagénio foi analisada por .imunocitoguímica de acordo com PI_2010. A semelhança da descrição anterior as culturas foram estabelecidas em placas de 35 mm de diâmetro contendo lamelas e foram tratadas segundo as mesmas condições de exposição à No fim do teste, as lamelas foram % (v/v) de formaldeído em PBS e permeabilizadas com metanol. Os locais não específicos foram bloqueados por incubação (1 h) com 3 % (m/v) albumina do soro bovina (BSA) em PBS e a imunocitoguímica foi realizada com anticorpo antí-colagénio do tipo I diluído em 3 % BSA-PBS. Depois de .3 lavagens em PBS, as células com uma solução de anticorpo fluorocromo fluoresceína ísotiocianato (FICT). As lamelas foram montada® em lâminas de microscopia em meio de montagem dí-hidrocloreto de é’,6d.iamíd.ino-2 '-fenilindoi (DAPI) com reagente de vectashíeld

Lxaoas em fixadas foram incubadas secundário ligado ao (para reduzir o fotodeca.imen.to da fluorescência) .

At? A-\ hs imagens foram adquiridas num microscópio confocai LÍ3M S10 META com um laser Argon (488nm) de forma a excitar o conjugado EITC e um laser Diode 4 05-43 0 para avaliar aí fluorescência DAPI.

[0070] As imagens adquiridas mostram que: o tratamento das células secretoras de colagénio com a colagenase recombinante promove uma resposta dependente da dose, refletindo-se numa maior proliferação de asteóplastòs para a maior concentração de coíagenâse utilizada no ensaio {Fig. 10) , É também evidente a redução da deposição de: colagénio do tipo X na matriz extraoelu.lar das células em cultura, [0071] Os resultados obtidos comprovam que a ColAh reeemfe i n ant e induz propr i edade s f í s i o .1. og x camente r e levantes nos osteoblastos, mesmo em concentrações sub-tóxicas para as células. De facto,, a primeira fase da formação óssea é caracterizada por segregação massiva de coiagénios, sendo o colagénio do tipo I a proteína, maís abundante do osso.

[0072] Em conclusão, as propriedades biológicas associadas à colagenase obtida pelo método descrito sugerem que esta nova colagenase bacterlana tem potencial biotecnoiógíco, nomeadamente para aplicação médica no tratamento de doenças que envolvem deposição excessiva, de coiagénios.

[Q073] Suma outra forma de realização possível da presente invenção a colagenase recombinante, ColAh, à semelhança do que se conhece para outras colagenases microbianas, pode ter aplicações: diversas, com a vantagem de possuir uma elevada estabilidade ao armazenamento, p.ex., a sua potencial aplicação a dosbridação enzimãtica de tecidos, pela sua capacidade degradativa de coiagénios, facilitando a regeneração e cicatrizaçâo, nomeadamente no tratamento de feridas traumáticas, úlceras varicosas e queimaduras.

[ 0074 ] A doença de Dupuytren é uma fíbrodisplasía prolíferativa da aponevrose palmar, caracterisada por deposição excessiva de colagénío na matriz extracelular, uma patologia prevai ente em populações como a Britânica, a Norte-Americana, e a Australiana (SY_..2O12) , Para tratamento recorre-se frequentemente a faseiectoraia cirúrgica que não limita a recorrência da patologia e que, por ser ura método invasivo, conduz ao aumento da raorbilidade dos doentes. Uma nova estratégia terapêutica não invasiva. foi recen.temente implementada e baseia-se na utilização de Colagenase de Ciostridíam disroiyeicum^: (GCH) xiaflex® (com ratio X iil constante para as colagenases ColG e ColH, respetivamente).

100751 A publicação recente: dos resultados sobre o efeito da CCB xiaflex® a nível molecular e celular (S¥__2012) fundamenta e reforça a potencial aplicação da colagenase recombinante CoiAh no tratamento da doença de Dupuytren, numa das formas preferidas de realização da presente invenção.

[OGitj Numa outra forma de realização possível da presente invenção é aplicada a utilização dei colagenase recombinante em metodologias: de transformaçáoZtransfecção de células tumorais em processos relacionados com a terapia genica ou eletro-génica.

[0077] Numa outra forma de realização: possível da presente invenção é aplicada a utilização da CoiAh recombinante para o tratamento de ciática, noraeadamence era discos intervertebrais herniados.

[0078] Numa outra forma de realização: possível da presente invenção é aplicada a utilização da colagenase reGombinante GolAh era técnicas que envolvem culturas de células e tecidos animais (isolamento de células cndoteliais, células ueuronaís, cardaomiócítos, hepatóci tos, células estaminais, entre outras), [0079] Numa outra forma de realização possível da presente invenção é aplicada a utilização da: colagenase recombinante ColAh na indústria alimentar, nomeadamente no processamento de carnes para Incremento das suas propriedades e texturas, [0080] Numa outra forma de realização possível da presente invenção é aplicada a utilização da colaòéna.se recombinante ColAh na indústria associada aos curtumes, nomeadamente para auxiliar no processo de tingímento de couros.

[0081] Numa outra forma de realização possível da presente invenção é aplicada a utilização da colagenase recombinante ColAh para a extração e purificação de colagéníos.

[00821 Lista de sequências de nucleótidos (SSQ. nx No. 1 - 4). As sequências de nucleótidos encontram-se descritas através do código de uma letra de nucleótidos» A legenda dos nucleótidos é a que se segue (código de uma letra): A adenína, T - timína, G - guanidína, Ç - oitosina.

SEQ. ID, No. 1 - ãeguência núcleotidica do gehè da colagenase (.ΑΗΆ....0517) de Aeromoças hpdrophíia ATCC 7966'·

ArGAAGAATCTGGGTACGAGGTTGGTGGTGCTGGCAGCAGCGGGCCTGTTTGCGACTTC

GGCGCTGGCCAACTACTGCeCCTCCGACTGGCAACAGTATCAACTCAAAGGTGAATCCA

GCCGTCAGCTGGGAGATGGTeTCACCGAAGTGACCTACGAGCTGAGCGCCCGCAGCGGe

GGCGCCCCCTATe&GCAGCTGAGGGTGTATCGGCGeTTCGÁCTGGAGCGATGCGA.ACGT

GGCTGeGCTGGCAGAACAGCAGTGCGGCG.AGCCGCÃGCTCAAGATCGAGCTGGGGTGGC

AGATCCGCTAGGTCAGeTGTGAAGAGGTGGTGGCGGCTGGGAAGGCCGTTCGGGGCAGe agctatgactatggctacggcatgaagcagggccgçtgggagccactggcaggcaccgg

GACCGCGCGGGGTGAGGATGGTCTGGGGGTGGGGGAGCGGGTGATGGTGGGTCAGAGGG

AGGAGGAAGTGGATGGGTGGGAGCTGAAGGGCGAAGGCGGCTGCGGGGAGGAGGGATGG gagtagcaggcggaaaagtggcagcagttgaaggtggtggaagagaggggcaatgaagg ggatggcggcgtggaggagatgttgttccgcctgcagccgatcgtggggagcgaggcgg

GGAAGeAGGTGAGGGAGCTGGACGTCTGGGGCCAGTACACCTGGTTGCTGGAAeAAGGe

AAGAGGGAGCAAGAGTGGGATGAAGGCCAGAGGCGTGAGGAAGGGGACAAGACGATGAG

CTACGGGGTGTGGGGGC^AGACCGTGGCGGGCGGGAGCGAAGTGGAGGTGGTGTTGAAGG

ACACCGGCTATCAATACCCGGTGGGGGGGAGGGAATGGGAGAGCGTGCGGGxAAAGAAGC

GAGTGGCAGGAGAGGGGGGTGCTCAACCACGCCATCGTGCTGGCCAGCAAGGAAGAGCA

GGTGGACTGTGGGCGTGCCGAGGGGCGCGGCTGTTGCGAGGGAGATGTGCGGGGCACGG

AGGTGCTGGAGGCGGAAGGGGGCAAGATAGTGCAGGATGGGAGTGGCCAGGGTGGGCCG

GTCTGGCAGGAGAACTATGGTCACGATGACAGGAAGCTGCTGGCCGTGTCGGGGGGGAT

GGAGAGGGTGCTGGGGGCGÂATCAGCGGGGGGATGCAGGGATGAAGGTGGTGeTGGAAT

AGGTGGGTGCCCAGAAGTAGGAGAACTAGGGCAAGGACAÃGGAAGAGGGGGGGGGGGGG

GGCGAGGGGCTGGGGGAGGGGTTGAGGGGGCTGGGGGCGGATGCGCTGCTCTTCGCGGA

GCAGGGCAGCGACGAGGTTGGTGCAGTGATGGGTGGGTGGAGCATeGCCGTGCACGGTC

ÁGTTGAAGAGGGCAGCAGTGCAGAGCCGCTTTGGCAGGeTGCTGGGCGAGTTCAACCAG

ATGCTGGeCTACAGCACCCGGCATGCCAGCGAGATCAACGGTGAGCAGGGCTGGGGAAG

CGGCCTGTTGGATCTGGTCAAGTTGGTGGACTTCGGCAGCGAGTACAGCGAGeCGTTGG

CCAACGAÇTTCCGCCAAGAGGACGGTGAGCTGCGGAAGCAGGTGeACGCCGTCGGCATG

AtGCGAACTCGCGTTGTGGAAGGGAGGGGATGGGGGGGATGTGTTeCTGeTGAAGAACGT gçtggatgggtaçaggggcctctagggggtggggcggtataçcggccgggaggagctgg

ACGGCTATGGÇ^AAAGTGTTGGATGAGTeCGTGATCGGACTGGírTGGCGACCAGAAGGTG:

atgcgcggtgggcagcagagtcaggatctggtggaagagatgtcagtgãgcgtgtgcãc

GTACTACGTGACGTACxAÇGGAGÚGCAGCAGGGAGGÇGTGCATCAGGGGTGÂCTTGGGCG

GGGTGTGGACGCCTGTeGGGGTGGAGGAeGTGCTGqGGTTGGÃGGAGÃCGTGGTeGGCG agcgtgcgggtgggggçgcaggaggtgaggatggatgaggccgãagggatgtggggtga agtgggtgccgaagagcaggagttggatcaagagatggagagcgggtgggãggçggtgg gggacgatcagaacgaggcgctggaactggtggtgttgaagtgctgcgcggactggaaa cgctatggcagtgctctgttcggcggcgtgtggagggagaagggcgggatgtagctgga

AGGGGATGCGGGTCGGeGCGGGAAÇGAGGGGGGGTTGTTCGGGTAGGAGGCGGAGTGGA agcggggagcgttccaggtgtggaacgtgggggaggagtatgtgcactãgctggagggg

GGGTTGAACCAGTACGGCAGCTTGGGGCAGTACGGGGTGAACCGGACeAGCTGGTGGTG ggaaggggtgggggagttcatggçggaggggcagtggttggggcggqgtctggâgaagg

TGGGGGGCCGTCGXOCCAGTGATGGmGGGGGGTTGGGeGACATCCTGCACCTGGATTAG

GAGAAGGGTGGCGAGATGGTGTAGTGCTGGTCGTACAGGGTGGAGCGCTTCGTGAAGGA

AACGGGTCGGGGGGCGAGGTGGGTGGGCADGGCCGAGGCGCTGGGCAAGCeGGATCAGC

AGCAGGGCATGAGCACGTTCGAAGCCGAGGTGGACCãGGTGATTGCCA&TGACAGCGAG

GCGTACCAGCAGTGGCTCGGCGGCGAGCTGCTGGCGTGGTGGGAAGCCAAGAAGGACTC cgacgagtggaaggccaaggactcctcccactga

SKQ, XD. No. 2 - Sequência: nueleotídica do iniciador

AHCF...ScpHI 5'- GGGATAATCATGAACAATGTGGGTACGAG-l ’

SEQ. XD. No. 3 ~ Sequência núcleotidica do iniciador

AHCR HindiII 5'-TTAAGGTTGTGGGAGGAGDGGTTGGG -3'

SEQ. ID. No. 4 - Sequência nucl eotidíca obtida por sequenciação com os iniciadores universais T7 promotor prímer e T7 termineter primer

TAATAGGAGTCACTAXAGGGGAATTGTGAGGGGATAACÃATTCGGCTeTAGAAATAATT

TTGTTTAAGTTiÂAGAAGGAGATATAGATATGAAATAeGTGCTGGGGAGCGGTGCTGGT

GGTCTGCXGCTCCTGGCTGCGGAGGCGGGGATGGCGADGAACAATCTGGGTACGAGGTT

GGTGGTGCTGGCAGCACCGSGCCTGTTTGCÇAGTTCGGCGGTGGGCAAGTAGGGCGGGT

CCGACTGGGAACAGTAÍC^AAGTCAAAGGTGAATCGAGGCGTGAGCTGGGAGADGGTGTC

AGGGAAGTGAGGTAGGAGGTGAGCGGCCGGAGGGGGGGGGGCGGCTATGAGCAGGTGAG ggtgtatcgcggçttcgactggagcgatgcgaacctggctgcgçtggcagaacagcacít qgggcqagccgcaggtcaagatcgagctgggctggcagatgggctaçctgagçtGtgaa gaggtggtggcgggtgggaagggcgttggggcgagcagçtatgagtatgggtacggcat

GAÃGCAGGGCCGGTGGGAGGCAGTGGCAGGCAGGCGGACGGGGCGGCGTGAGGATeGmG tggcgctggcggagggggtgatggdgggtcacagcgaggaggaactggatcgctgcgag

GTCAAGGGCGAAGGGGGCTGGGGGGAGCAGGCA-PGGGAGTAGGAGGGGGAAAACTGGGA

GGAGTTGAAGGTGCTGGAAGAGAGGGGGAATGAAGGGGATGGGGGGGTGGAGGAGATCT

TGTTGGGGCTGGAGGGGATGGXOGGGAGCCAGGGGGCGAAGCAGGTGAGGGAGGXGGAC

GTGTGGCGGeAGTAGACGTGGTTGCIGGAAGAAGCGAAGAGCCAGGAAGAGTGGGATGA agggcagacgggtcaggaaggggacaagacgatgaggtagggggtgtgcggcgagaccc

TGGGCGGCGGCAGCGAAGTGCAGGTGGTGTTGAAGGAeAGCGGGrATGAATAGGCGGTG

GGGGGGAGCGAATGGGAGACGCTGCCGGAAACAACCGAGTGGGAGGAGAGGGGGGTGGm

GAAGCACCGGATCGTGGTGGGGAGCAAGGAAGAGGAGGTCGAGTGTCGCGGTGCCGACG

GCGGGGGGTGTTCeGAGGeAGATCTGCGGGGCACGGAGGTGCTGGAGGCCGAAGCGGGC

AAGATAGTGCAGGATGCCAGTGGCCAGCCTGCGCCGGTCTGGCAGGAGAMCTATGGTCA

CGATGACAÇCÁÁGeTGCTGfâCGGTG^CGCGCGGCATCCAGAGCCTGCTGGCGGCCAATC agccggccgatccagccatgaaggtgctgctggaatacgtgcgtgggcacaagtacgac

AACTÃCGGCAAGCAGAAGGAAGAeGGCGCGGCCGCCGCCGAGGCGCTGGCCGAGGCGTT

GAGGGCGGTGGGGGGCCAlGCGGTGCTGT^CCeGGAGCAGGCCAGCGACGAGGTTGGTG

CÃGTCATGGGTGCCTGGAGCATCGCCGTGGACGGGGAGírTCAAGAGCCGAGCAGTGCAG

AGGCGGTTGGGGAÇeGTGCTGGGCGAGTTCAAGCAGATGGTGGCGTACAGCAGGCGCGA

TGCCAGGGAGAXCAAeGGT/GAGGAeGCCTGGGCAA.CCGGGG.TGTTGGATGTGCTCAACT tgctcgacttggcçagcgactagagçgaggggttcgcgaacgacttcggggaagaggag

GGTGAGeTGGGGAAGGAGÇTGCACGCGÇTeGGÇATGAGGGAAGTGGCGTTGTGGAAGGG

AGGGGAIGGGGÇCGAXGTGTTGGTGGXGAAGAAGGTGGTGGATGCeTACAGCGGCCTGT

AGCGGGT.GGGCCGGTATACCGGCGGGGACGAGGTGGAGGGCTA^CGCAAAGTGTTGGAT

GAGTGCGTGAXGGCAGTGGTTCGGGACGACAãGGTGATGGGGGGTGGCGAGGAGAGTGA

GGATCTGGTGGAAGACAT@rGAGTGACGGTCTGCAGGTACTAGCTGACÇTAGAGGGAGe

GGACGAGCGAGGGGXGGAreAGGGGTGACTTGGGeGGGGTGTGCAGCGCTGTGeGGGTG

GAGGAGGXGG^GCGGTTGGAGCAGAGCTGGTGGGGGÁGGCTGGGCGTGCGGGGCGAGGã

GGTGAGGAXGGAXGAGGCGGAAGGGAXCXGGGGTGAACXGGGTGCCGAAGAGCAGeAGT

GÇGATÇAACAGAGGGAGACGGGCGGGGAGGCGGTGGGGGAGGATÇAC:AAGGAGGCGGTG

GAACTGGGGG:TGTTGAACTGGTGGGCÇGAGTGGAAAÇGÇTATGGGAGTGCTGTÇ4Tsr‘CGG

GGGCGTGTCCAGCGAGAACGGGGGCATCTAGGTGGAAGGGGATGGGGCTGGGGGGGGGA

AGGAGGGGGGGTTGTTGGÇGTaAGGAGGGGGAGTGGAAGÇGGCGAGÇGTTCGAGGTGTGG aaggtgggccaggagtatgtggagtaggtggacggggggttgaagcagtagggc:aggtt

GGGGCAÇGAÇGGGGTCAAGGGGAGGAaCGTGGXGGTGGGAAGGGGTGGCGGAGTTGAIGG

CGGACGGCGAGTGGTTGGGGCGGGGTCTGGAGAÂGGTGGGGGGGCGTGGTGGGAGTGAT

GGTGGGGCGTTGGCGGAGATGGÍGGACGTGGATTAGGAGAAGGGTGGGGAGATGGTCTA

GTGCTGGGGGXAGAGGGIGGAGGGGTTGGTGAAeGAAAGGGGTGGCGGGGCGAGCTGGG

TGGGGATGGGGCAGGGCCTGCGGAAGGGGGATGAGGAGGAGGCGATGAGGAGGTTGGAA

GGGGÁGGTGGACGAGGTGATTGGGAAXGAGAGCGAGGGGTACGAGGAGTGGCTGGGGCG eGAGÇTGGTGGGGTGGGíGGGAAGGGAACAAGGAGiTGCGAeGAGTGGAAGGCeAACGACT cctcccacaaggttgggggggçaçtggmgçaccacgaccaccacctgagatggggctgC

TAÃCAAAGCGGGAAAGGAAGGTGAGTTGGeTGGTGCÇACCGGTGAGCAATAACTAGG

Τ7 Promoter Prírfter #69348-3

SEQ. ID. No, 6 ~ 5' - A.ATACGACTCACTATAGGG-3 ' ;

T7 Terminator Prirner «69337-3

SEQ. ID. No. 7 - 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'.

T7 direto: SEQ _x T7 Reverso : SEQ.

:d. No. 8- 5'

ID. No. 7 TAATACGACTCACTATAGGG - GGTAGTTATTGCTCAGGGG

Sequência líder: sublinhado; Região codificarte: negrito [0083] Sequência da proteína_: recombinante ativa da colagenase (colAhl de Açromonaa Ágdrophíia ATCC 7966'·' (SEG. ID. No. 5) soforeexpressa e purificada nesta invenção. A sequência de proteína recombinante ativa encontra-- se descrita através do código de uma letra de amínoácidos. A legenda dos aminoacidos é a que se segue (código de uma letra) : Histidina - H, Arginína - R, Lisina - K, isoleucina - L Fenilaianina - F, Leucina - L, Triptofano M..

Pi

P, 7a li na

W, Alanina - A, Metiopina Cisterna -· C, Asparagina - N, Giicína - G. Serina. - S, Glutamisa - Q, Tirosina - Treonína - T, Ácido aspártico - D, Acido glutâmico - E.

O ima

V,

SEQ. ID. NÓ, 5 ΜΙ4ΝΕ0ΤΡ.ΕΕΕΕΑΑΡ&ΕΕΑΤΕΑΕΑΝΥΕΡ3ΝΝβθΥ0ΕΚ0Ξ38Ε9Ι,ΟΟΚΙ.ΤΕ7ΤΥΕΙ,ΕΑΙ<ΕΤτ

GAPYQQLRWRREDWSDANLAALíAEQQCGEPQDKIELGWQIEYDSGEEíWPAGKAVPAG δΎΡΥΟΥύΜΝΟαΕνίΕΡΕΑΟΤΡΤΑΡΕΟΕΕΕΡΕΑΕΕνίΕάΗΕΕάΕΕηΕΟΕΕΝΑΕβΕσΑΕδΑΚ

QyQPQWQQLKVLEETPNEmiGRLEQIEFRDQPiWSQAAKQVSELHVWRQYTIftJLDEQA

KTQQECDEPQTRQEGDKTISYRVCRQTLPA.GSEVQYVDKDTGYQYPVGGSÊWQTLPETT

ΕΧ7αΕΕΚνΕΝΗΡΐνΕΑΕ:ΚΕΕ.ζ5_:ΕΠ€ΕΝΑΟ6ΝΑ€:.9ΕΝϋΕΡ^ΤΕΙ..Ι.Ι}ΑΒΑΑΚΤν0ϋΑΕΟ0ΡΑΡ

WQSNYGHDDTKLLAVSSGIQSLLAANQPAHPAMELLLEYVRANNYHNYGíqíKEDGPAA

ΑΕΑΕΑΕΑΕΤΑΕβΑΗΡΝΕΕΡΕ£Α3ΕΕνθΑ^0ΑΝ8ΙΑΕΗΟ’ζ5ΒΚΕΡΑνθδΕΡ0ΤΙίΤ,ιΟΕΕΝζ) .KÍLAYSTRHASEINGQHAWATGLFnLLNFLDFASDYSDPFANDFR^QD^SIJS.KOPHALÇlí

ΕΕΕΑΚ4ΚσΡηθΑΕΕΕΕΕΡΝνΕΠΑΥΤΝΕΥΗνΑΕΥΤΚΡΡΕΕΠ6ΥΕΚΙ,ΝΏηΕνΐΑΙΑ^ΗΗΝ.Τ..' iPGGQQ.SQDLLEDMEt.TLSTYYLTYTDWEAGrSGDFAGLCTpVRVEDVLPFÈHTQSP

ΤίΗΕΗΑΟϋΝΤΝΡΟΑΕβίΕΕΕΕαΑΕΕΟαΕΗΟάΜΕΤ^ΝαΡνΑΒηΕΝΕΑΕΕΙ,ννΕΝΕΕΑβΐ^Κ

RYGSALFGGVSTDNGG1¥LEGDPARPGNQARESAYEAEWKRPAFQWNLRHEYVHYLDG RFNQyGSFGMY^ElJRTTWSEGLASFIAHGGCEARGhDWAGEPASDHPALAUXLHLDY DKGGEI^SWSYTWmFIMETGRGAS^m^íAQALíWFÍJQQQAMSTFEAELDQLXAISDâE ΑΥΟΟΝΕβΕΕΕΕΡνν^ΑΧϊΕΕΕΏΕ.ϋΕΑΙ'ίΕΒΕΗΚΕΑίΑΑΕΕΕΗΗΗΒ

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(0084) As realizações preferenciais acima descritas são combináveis entre si, As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

(Í)Q8S) A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrita as realizações descritas neste documento a uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma e de substituições de caracteristicas técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, tal como definido nas reivindicações anexas.

Claims (2)

1. Colagenase isolada caracterizada peia sequência SEQ, ID. 5,

   Método para recomb inante obtenção e purificação ativa. de Ae romena s, de colagenase descrita na reivindicação 1., compreendendo os seguintes passos:

   isolar

   DNA genómico de uma cultura de

   Aerómonasf amplificar uma sequência coro um grau de homologia. de pelo menos 95 % coro a SEQ, ID. N.^s 1? integrar, num vetor de expressão induzível a sequência codifícante para uma proteína de fusão, em que a referida sequência codifícante codifica para uro conjunto de histidinas consecutivas; produzir e selecionar o plasmídeo recombinante desejado selecionar cu .11 i va.' as referidas célula;

   recombinantes e induzir a expressão de çolagenase:

   recombinante com indutor apropriado;

   recolher e purificar a coiagenese recombinante.
2. 3. Método para recombinante obtenção e purificação de colagenase descr i ta ativa de Aeromonar, reivindicação 1, de acordo com a reivindicação compreendendo os seguintes passos;

   DNA genómico de proa cultura na

   a) isolar o Aeromoços;

   b) amplificar o gene da putativa oe colagenase da referida cultura com uma sequência com uro grau de homologia de pelo menos 95 % com a SEQ, ID. t.^;? 1 - AHA...0517 utilizando iniciadores quê incluem o local de reconhecimento das enzimas de restrição BopH.I e Aíndllx;

   c) digerir um vetor de c:lonãgem que compreende o locai para as enzimas Νησί e Hlndlll;

   d) clonar o referido gene da çolagenase no referido vetor de clonagem;

   e) produzir e selecionar: o plasmideo reeombinante desejado;

   fi inserir o referido plasmideo reeombinante em células hospedeiras adequadas, de preferência E> coli, nomeadamente: M. colí TuPlOF' para, transformar e selecionar vetores reeorobinânfes,·

   g) transformar o referido: plasmideo recombinante em células de expressão reeombinante:, de preferência E, ccli, nomeadamente E, coli BL21 (DE3);

   h) selecionar e cultivar as referidas células de expressão recombinanres e induzir a expressão da colagenase reeombinante;

   i) recolher e purificar a colagenase: reeombinante.

   Método para obtenção e purificação de colagenase reeombinante ativa de Aeromonas, descrita na reivindicação 1, dê acordo com as reivindicações 2-3, em que as referidas: Aercmónas são microrganismos da espécie ãerojaonas hydrapa .i ia ATCC V966^r.

   Método para obtenção e purificação de colagenase reçombinante ativa de Aeromonas, descrita na: reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-4, era que os referidos iniciadores compreendem o local de reconhecimento das: enzimas de restrição SEQ, ΪΡ No, 2 ou SEQ. 1D No. 3 e terem ainda como base a sequêncíci de nucleótidos codíficante SEQ. ID No. 1 do polipepfideo pre-ColÂh, incluindo o pèptido-sinal,

   Método para obtenção e purificação de eolagenase recombinante ativa de Aeromonas, descrita na reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-5, am que os referidos iniciadores compreendem as seguintes sequências homologas;

   SEQ. ID No. 2, SEQ. T.D No. 3 .

   Método para r ec ombinante obtenção e ativa de purificação de eolagenase A e r om o na: s , descrita na reivindiçação 1, de acordo com as reivindicações 2-6, em que a referida amplífi..cação: ocorre por reações em cadeia pela polimerase.

   δ.

   Método para obteiíçãd e purificação de eolagenase recombinante ativa de Aertwonas, descrita na reivindicação 1, de acordo com: a reivindicação anterior, e.m que as referidas reações em cadeia pela polimerase são realizadas em volumes de 50 pl contendo 3 mM de MgClz, 250 pM dNIPs, 0,5 μΜ dos referidos iniciadores - SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3 -5% DMSO (v/v) > .1,5 D lag Í3NA polimerase em tampão apropriado e 50-100 ng de SNA.

   Método: para obtenção e purificação de cobngenase recombinante ativa de Aeromonás, descrita na: reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-8, em que a referida amplifi cação è realizada num termociclador. compreendendo a desnaturação inicial do dna genómied de Aeromenas ερρ· a temperatura 91 - 96 ^ôC durante 2 - 5 min; seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 - 96 b, 30 s a 58 °C e 3 min a 70 - 75 °C de preferência 72 ^ÕC; extensão final de 20-30 min a 68-75 °C, de preferência 72 °C.

   10. Método para obtenção e purificação de colagenase recombinante ativa de ãeromenas, descrita na reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-9, em que o vetor de çlonagem é pET26b(i).

   1.1, Método para obtenção e purificação de colagenase recombinante ativa de ãeromonan, descrita na reivindicação 1, dê acordo com as reivindicações 2-10, em que a,s células hospedeiras para amplificação do vetor recomninante são células de £, rois de preferência coli TOPIOF·'

   12. Método para obtenção e purificação de colagenase ãeromonu c, descrita reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2 -1,1, em que as células hospedeiras para a sobreexpressâo da recombinante ativa ae na proteína recombinante são células de ã. preferência, ooli BL21 (DE3).

   de

   13. Método: para obtenção e: purificação de colagenase recombinante at rva de r©romenas, descrita na reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-12, em que ae referidas células hospedeiras são cultivadas a 2 5 °C - 37 '--c, e 100-150 rpm âurantè J. 6-13 h, de preferência 26 ~C, 130 rpm.

   14. Método para obtenção e purificação de colagenase recombinante ativa de .ãeremonas, descrita na reivindicação 1, de acordo Com: as reivindicações 2-13, em que a seleção de um cione do passo d) é feita através de cultura em meio seletivo, em que os elones positivos são selecionados em meio suplementado com canamicina.

   15. Método para obtenção e purificação de colagenase racomhín&nte ativa da Aeromoças, descrita na reivindicação 1, de acordo: com as reivindicações 2-14, era que a recolha da colagenase recombinante é por

   centrifugação sobrenadante post er i or £ i1í refrigerada, seguida de diálise do de ligação e a 1 ^GC rração. contra tampão Método para. obtenção e purificação de colagenase r e c omb i na nte ativa de Λ e r cm ona s, descrita na

   reivindicação 1, de acordo com as reivindicações 2-13, ara que a referida purificação da colagenase recombinante é por eromatografia de afinidade, de preferência com ião metálico imobilizado.

   17. Colagenase isolada descrita na reivindicação I para uso como medicamento ©u em medicina.

   18. Colagenase isolada descrita na reivindicação 1 para_: o uso no tratamento de tecidos traumatizados, de acordo com a reivindicação 17, nomeadamente no tratamento de feridas traumáticas, úlceras varicosas e queimaduras ou também no tratamento outras patologias associadas à

   excessiva deposição doença de Dupuytren. de colagénios como por exemplo a 19 . Colagenase descríta na reivindicação 1 para o uso em terapia genica ou reivindicação 17, eletro-génica, de acordo com a 2 Q. Colagenase descrita na reivindicação 1. para uso Π©:

   tratamento de ciática, de acordo com a reivindicação 17, nomeadamente em discos Íntervertebrais herniados.

   21. Composição caracterizada por compreendei a colagenase descrita na reivindicação 1.

   22. Composição de acordo coai, a reivindicação anterior em que a colagenase é líofilizada.

   23. Composição de acordo com as reivindicações 21-22 compreendéndõ ainda um bíomaterial, em particular qui tosano.

   24. Composição de acordo com as reivindicações 21-23 em que a composição é uma formulação tópica, usa formulação por administração oral ou parental ou uma formulação injetâvel,

   25. Uso da colagenase recombínante descrita na reivindicação 1 em técnicas para cultura de células e tecidos^ animais tais como isolamento de células endoteliais, células neuronais, cardiomiócitos, hepatoei tos e células estãmínais,

   26. Uso da colagenase recombínante descrita na reivindicação I na indústria alimentar, uomeadamente no processamento de carnes para melhoramento das suas propriedades e texturas.

   27. Uso da colagenase recombínante descrita na reivindicação 1 na indústria dos curtumes, nomeadamente para auxiliar no processo de tíngimento de couros.