PT105981A

PT105981A - Processo de produção de vinhos sem adição de anidrido sulfuroso por utilização de filmes com base em quitosana

Info

Publication number: PT105981A
Application number: PT105981A
Authority: PT
Inventors: Manuel Antonio Coimbra Rodrigues Da Silva; Claudia Sofia Cordeiro Nunes; Elia Sofia Oliveira Maricato; Angela Maria Martins Vieira Da Cunha; Sonia Alexandra Leite Velho Mendo Barroso; Jose Antonio Lopes Da Silva
Original assignee: Univ Aveiro; Dao Sul Sociedade Vitivinicola S A
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-05-02
Also published as: BR112014010394A2; WO2013066200A3; CA2854282A1; US20140328974A1; WO2013066200A2

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE VINHO UTILIZANDO O PROCESSO DE VINIFICAÇÃO TRADICIONAL COM A EXCEPÇÃO DE, APÓS A FERMENTAÇÃO, O VINHO SER COLOCADO EM CONTACTO COM UM FILME À BASE DE QUITOSANA E SEM ADIÇÃO DE ANIDRIDO SULFUROSO AO VINHO. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AINDA A UM PROCESSO DE PREPARAÇÃO DO FILME À BASE DE QUITOSANA POR MODIFICAÇÃO DA QUITOSANA COM COMPOSTOS NATURAIS QUE PERMITEM PRODUZIR FILMES DE QUITOSANA ESTÁVEIS EM MEIO ÁCIDO, COM ELEVADA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE E MANTENDO A ACTIVIDADE ANTIMICROBIANA. NUMA FORMA DE REALIZAÇÃO, OS FILMES SÃO PREPARADOS POR LIGAÇÃO COVALENTE À QUITOSANA DE MOLÉCULAS QUE PERMITEM AUMENTAR A SUA INSOLUBILIDADE EM MEIO ÁCIDO, COMO POR EXEMPLO A GENIPINA, E DE MOLÉCULAS COM ELEVADA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE, COMO POR EXEMPLO O ÁCIDO CAFEICO OU EXTRACTOS DE UVA OU VINHO RICOS EM COMPOSTOS COM ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE.

Description

naturais, como por exemplo o ácido cafeico ou extratos de uva ou vinho ricos em compostos antioxidantes.

Mais concretamente, o processo de obtenção de quitosana modificada com ligação de moléculas naturais consiste na adição à quitosana, que está em solução aquosa, num meio ácido, de um reagente oxidante, o hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN), em simultâneo com as moléculas que se pretendem ligar, como por exemplo o ácido cafeico ou os extratos de uvas ou vinhos. À quitosana modificada é adicionada acetona, que leva à sua precipitação, ficando o excesso de reagente oxidante em solução. 0 processo de produção dos filmes consiste em preparar uma solução de quitosana, por dissolução numa solução de ácido acético (por exemplo, 5%) e a essa solução é adicionado um plastificante, como por exemplo o glicerol. 0 genipin é adicionado após a adição do plastificante e este é deixado a reagir com a quitosana durante pelo menos 6 horas. A solução, depois de filtrada e desgaseifiçada, é colocada em placas (por exemplo, 0,2 g de solução por cm2) . O filme é obtido por evaporação do solvente a 35 °C. A presente invenção permite obter filmes que, devido às suas propriedades antimicrobianas e antioxidantes, podem ter aplicação em diversas áreas para além da enológica. Além destas propriedades, os filmes são ainda insolúveis em meios com uma alargada gama de pH, desde ácido a básico, permitindo aumentar as suas potencialidades de aplicação. 2 A uva contém uma elevada quantidade de compostos fenólicos na película, na polpa e nas grainhas, e estes são parcialmente transferidos para o vinho durante o processo de vinificação. Assim, as uvas, o vinho e os subprodutos da vinificação são uma boa fonte de compostos fenólicos. Os principais compostos fenólicos presentes são os flavonóides (antocianinas, flavan-3-óis e flavonóis), os estilbenos (resveratrol), os ácidos fenólicos (derivados dos ácidos cinâmicos e benzóicos) e os taninos.

Os subprodutos da vinificação têm vindo a ser utilizados como fonte de compostos bioactivos, principalmente devido à presença de compostos fenólicos, para incorporação em produtos cosméticos, farmacêuticos e alimentares (Pedido de Patente US 2006078568 AI; Pedido de Patente US 2003108493 AI;) . O pedido de patente Europeia EP 0448674 AI divulga um processo de vinificação sem adição do anidrido sulfuroso que consiste na adição dos subprodutos da vinificação, que contêm estes compostos fenólicos, antes, durante e após a fermentação. A quitosana é um polissacárido constituído por resíduos de D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina, em que os resíduos de D-glucosamina são maioritários, ou seja, em que o grau de acetilação é inferior a 50%. Este polissacárido é, em ambientes industriais e comerciais, designado por "quitosano". A designação quitosana é, no entanto, a recomendada pela Nomenclatura de Hidratos de Carbono e, por esse motivo, será utilizada ao longo do texto. A solubilização da quitosana em meios aquosos deve-se à protonação do grupo -NH2 do C2 dos resíduos de D-glucosamina, que ocorre em soluções ácidas diluídas (pH abaixo de 6,0, quando o 3 grupo -NH2 é maioritariamente protonado e convertido a -NH3+, dado que o pKa do grupo amina da glucosamina é de 6,3).

Como consequência, esta protonação irá influenciar as propriedades anti-microbianas da quitosana que dependem essencialmente da razão do número de grupos -NH3+ em relação aos grupos -NH2 existentes nas cadeias de quitosana. 0 tamanho das moléculas é também um factor importante para as suas propriedades anti-microbianas.

Tal como para a actividade anti-microbiana, a actividade anti-oxidante da quitosana está relacionada com o seu tamanho e grau de acetilação. Uma quitosana com um grau de acetilação inferior tem maior actividade anti-oxidante pois permite uma maior complexação com os iões metálicos como o Fe2+ ou o Cu+ (participantes na reacção de Fenton). A presença do grupo amina confere à quitosana as propriedades biológicas já descritas mas também a possibilidade de ocorrência de diversas reacções químicas, tais como acetilação, quaternização, reacções com aldeídos e cetonas (que originam bases de Schiff), alquilação ou quelação de metais, permitindo a obtenção de uma grande variedade de quitosanas modificadas, aumentando as suas potencialidades de aplicação. A ligação química de moléculas (grafting) e a reticulação polimérica (crosslinking) são os métodos mais utilizados para a modificação química da quitosana com o intuito de alterar as suas propriedades físicas, químicas e mecânicas. A ligação covalente de moléculas à cadeia principal de quitosana permite obter materiais com propriedades melhoradas, 4 nomeadamente por ligação de anti-oxidantes, antifúngicos, anti-bacterianos e outros nutrientes com diferentes propriedades biológicas.

Uma das caracteristicas que tem sido melhorada nas matrizes com base de quitosana é a sua capacidade anti-oxidante por incorporação de anti-oxidantes naturais, tais como os compostos fenólicos (Pedido de Patente US 2011059162 Al). A ligação covalente de moléculas à cadeia da quitosana já foi realizada com recurso a diferentes métodos, tais como, por mecanismo radicalar recorrendo a um agente oxidante, uso de radiação γ (Pedido de Patente US 2005272876 Al) ou uso de enzimas. De entre os agentes oxidantes mais usados, encontram-se o perssulfato de potássio (KPS) e o hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN). Estes reagentes utilizam-se principalmente para ligar moléculas que possuam ligações vinilicas. A reticulação do polímero por uma molécula (agente de reticulação) , em que esta serve de ponte na ligação de duas ou mais moléculas de quitosana, leva à formação de uma rede covalente tridimensional. A formação de ligações intermoleculares fortes e permanentes permite melhorar as propriedades do polímero, nomeadamente a resistência mecânica, a estabilidade química, a capacidade de absorção de água e a solubilidade, mas mantendo as propriedades biológicas.

Recentemente, a genipina tem vindo a ser utilizada com muito sucesso como agente de reticulação para a quitosana devido às suas caracteristicas. Este composto é a aglicona do genipósido presente no fruto de Gardenia (originária da China). A genipina reage rapidamente com os grupos amina, originando 5 pigmentos azuis que são utilizados como corante natural alimentar. Muitos estudos têm surgido sobre a utilização da genipina como agente de reticulação para a quitosana, por esta ser menos citotóxica, por exemplo, cerca de 5000 a 10000 vezes menos do que o glutaraldeido. Os filmes preparados com adição de genipina possuem melhores propriedades mecânicas, nomeadamente, maior resistência às tensões, são mais estáveis em água e a actividade anti-microbiana é igual à do filme apenas com quitosana. O pedido de patente Norte-americano US 20070299034 AI divulga o processo de obtenção de polímeros de quitina, quitosana ou do complexo quitina-glucana a partir da biomassa de fungos e leveduras e refere ainda possíveis aplicações destes polímeros em várias áreas, incluindo em bebidas fermentadas como clarificantes.

Embora este pedido demonstre que a quitosana e os complexos quitina-glucana podem ser utilizados para o tratamento de mostos e vinhos como clarificantes em substituição de outros adjuvantes enológicos, não é referido que estes compostos possam substituir a adição de anidrido sulfuroso ao vinho, actuando somente como substitutos de agentes clarificantes e estabilizantes da cor por co-precipitação de compostos. Em enologia, o anidrido sulfuroso nunca é utilizado como agente clarificante nem estabiliza a cor dos vinhos por remoção de compostos que são importantes para a manutenção das características organolépticas dos vinhos. O documento Spagna et al., Fining treatments of white wines by means of polymeric adjuvants for their stabilization against browning, J. Agric. Food Chem., Vol. 48, pp. 4619-4627, divulga tratamentos de vinhos brancos por meio de adjuvantes 6 poliméricos, como a quitosana, referindo a capacidade deste polímero na remoção de polifenóis, estabilizando os vinhos contra o escurecimento. No entanto não é referida nem sugerida a utilização na substituição do anidrido sulfuroso na conservação dos vinhos.

De acordo com o exposto existe a necessidade de um processo de produção de vinho que permita a conservação das propriedades organolépticas eliminando a adição de anidrido sulfuroso.

Surpreendentemente, verificou-se que o processo da presente invenção com um filme à base de quitosana que combina as propriedades anti-microbianas e anti-oxidantes em simultâneo com uma baixa solubilidade em meio ácido, permite uma conservação estável do vinho, a longo prazo, mantendo inalteradas as suas propriedades organolépticas e eliminando a adição de anidrido sulfuroso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinhos compreendendo a produção de vinho pelo método tradicional sem adição de anidrido sulfuroso, caracterizado por compreender ainda: a) preparar um filme de quitosana adicionando um agente de reticulação à quitosana; ou b) preparar um filme de quitosana modificada compreendendo: 7 • modificar a quitosana por ligaçao covalente a compostos fenólicos anti-oxidantes, • formar um filme por reacção da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação e, • neutralizar o filme anterior; c) fazer contactar o filme de quitosana obtido em qualquer um dos passos anteriores com vinho após a fermentação.

Numa forma de realização da invenção, no passo c) faz-se contactar 100 cm2 de filme à base de quitosana com 750 mL de vinho.

Numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a modificação da quitosana compreende as etapas de: dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V); adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.

Ainda numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a formação do filme de quitosana modificada compreende as etapas de: 8 dissolver a quitosana modificada em meio ácido; adicionar um plastificante à solução anterior e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos; após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos; filtrar e secar a solução anterior para obter um filme à base de quitosana modificada; e lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente.

Numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a neutralização do filme à base de quitosana compreende as etapas de: neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com água até obter pH 6; e secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas.

Numa forma de realização da invenção, o composto fenólico anti-oxidante é seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho. 9

Numa forma preferida de realização da invenção, o ácido cafeico é utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana.

Numa outra forma de realização preferida, os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho são seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.

Ainda noutra forma de realização preferida da invenção, os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho são utilizados numa razão de 0,7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.

Numa outra forma de realização da invenção, o oxidante é seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).

Numa forma de realização preferida da invenção, o oxidante é hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.

Ainda numa outra forma de realização preferida, o plastif icante é glicerol numa razão de 1% m/m por massa de solução.

Numa outra forma de realização preferida, o agente de reticulação é a genipina numa razão de 0,05% em relação ao f ilme. A presente invenção refere-se ainda ao processo de produção de filme à base de quitosana para aplicação no processo de produção de vinhos. 10

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

De seguida procede-se à descrição detalhada da invenção fazendo referência aos desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 representa graficamente uma análise sensorial dos vinhos brancos, ao fim de 9 meses, produzidos com adição de anidrido sulfuroso, segundo a vinificação tradicional (anidrido sulfuroso - "Sulfuroso") e vinhos sem adição de anidrido sulfuroso, submetidos ao contacto com o filme à base de quitosana (Filme de quitosana). A Figura 2 representa graficamente a solubilidade (% perda de massa) do filme à base de quitosana modificada por ligação com genipina e ácido cafeico e do filme de quitosana não modificada numa solução aquosa com pH 3,5 durante 7 dias à temperatura ambiente, com agitação constante (Exemplo 4). A Figura 3 representa graficamente a actividade anti-oxidante (% de inibição) do filme à base de quitosana modificada por ligação com genipina e ácido cafeico e do filme de quitosana não modificada (Exemplo 4). A Figura 4 representa graficamente a solubilidade (% perda de massa) e actividade anti-oxidante (% de inibição) do filme à base de quitosana modificada por ligação de compostos fenólicos extraídos do vinho e reticulada com genipina e do filme de quitosana não modificada (Exemplo 5). 11

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinho utilizando o método de vinificação tradicional, com a adição de um filme à base de quitosana em contacto com o vinho após a fermentação, em alternativa à adição de anidrido sulfuroso comum aos processos de produção de vinho de técnica anterior para conservação de vinhos. A presente invenção refere-se ainda ao processo de produção de um filme à base de quitosana, reticulado com genipina e quimicamente modificado por meio de ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes, para adição ao processo de produção de vinho da presente invenção.

Verificou-se que este filme apresenta, para além das propriedades anti-microbianas da quitosana, um aumento das propriedades anti-oxidantes comparativamente à quitosana e, simultaneamente, uma baixa solubilidade em meio ácido resultando num filme que, quando em contacto com os vinhos, prolonga o seu tempo e qualidade de conservação, mantendo inalteradas as suas propriedades organolépticas.

Descreve-se de seguida o processo de produção do filme à base de quitosana modificada por ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes e reticulada com genipina, de acordo com a presente invenção. 12

Produção de quitosana modificada 0 processo de produção de quitosana modificada com ligação de moléculas naturais consiste na adição à solução de quitosana, em meio ácido, de um reagente oxidante e, simultaneamente, das moléculas que se pretendem ligar. 0 primeiro passo consiste em dissolver a quitosana de massa molecular média numa solução aquosa ácida com agitação, durante pelo menos 16 horas, de um modo preferido à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresente concentração de, aproximadamente 1,5% (m/V). Em seguida, adiciona-se à solução de quitosana um oxidante seleccionado de entre perssulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN), de um modo preferido, hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) a 60 mM. Esta adição faz-se numa razão de 1 mL de oxidante por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adiciona-se um composto fenólico anti-oxidante, seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos ant i-oxidantes extraídos da uva ou do vinho. No caso do ácido cafeico são adicionados 3 mg (a solução é preparada em etanol) por grama de solução de quitosana, enquanto para os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho é adicionado um volume que corresponde a 0,7 mg de compostos fenólicos por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os reagentes, manteve-se a mistura em atmosfera inerte, fazendo borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante pelo menos 3 horas, com agitação constante. Após a reacção, adiciona-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado é obtido por centrifugação (por exemplo, 15000 rpm durante 20 min 13 a 4 °C) e é lavado com metanol durante, pelo menos, 1 hora para retirar o excesso de compostos iniciais que não reagiram.

Processo de produção do filme à base de quitosana modificada

Em seguida, prepara-se o filme à base de quitosana modificada dissolvendo a quitosana anteriormente obtida numa solução de ácido acético a 5% V/V e a essa solução é adicionado um plastificante, como por exemplo o glicerol numa concentração de 1% em relação à massa de solução e a mistura é homogeneizada a uma temperatura entre 40 e 60 °C, de um modo preferido a 50 °C, num banho de água, durante 10 minutos. Esta mistura é deixada arrefecer até à temperatura ambiente, mantendo uma agitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta solução adiciona-se um agente de reticulação, a genipina, numa razão de 0,05%, em relação à massa de filme e depois de filtrada e desgaseifiçada é colocada em placas (0,2 g de solução por cm2). A genipina reage com a quitosana durante, pelo menos, 6 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a placa é colocada numa estufa a 35 °C para formação do filme por evaporação do solvente (cerca de 16 horas). O filme obtido é lavado para remover todos os compostos que não estão covalentemente ligados às moléculas de quitosana, de um modo preferido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora) . Em alternativa pode ser utilizado etanol como solvente para a lavagem do filme. Após a lavagem, o filme é deixado a secar à temperatura ambiente. 14

Neutralização do filme à base de quitosana modificada

Por último, de modo a promover a actividade anti-oxidante do filme, é necessário um tratamento de neutralização por contacto com uma solução de hidróxido de sódio. De um modo preferido, o filme é colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lava-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e seca-se à temperatura ambiente durante, pelo menos, 18 horas. 0 pH final do filme deve ser, aproximadamente, 6. A utilização do filme obtido no processo de produção de vinho decorre após a fermentação, de um modo preferido no passo do engarrafamento do vinho, em que se coloca o filme à base de quitosana numa garrafa para estabilização do vinho. A área do filme a aplicar depende das propriedades do filme e do tipo de vinho. Num vinho branco é suficiente adicionar numa garrafa um filme à base de quitosana reticulada com genipina de 100 cm2. Após a colocação do filme, a garrafa de vinho pode ser armazenada e manipulada seguindo a prática da vinificação tradicional.

Deste modo, é possível obter um vinho seguro do ponto de vista da sua utilização alimentar, possuindo propriedades organolépticas e um tempo de conservação igual ou superior aos verificados com a adição de anidrido sulfuroso do método de vinificação tradicional (ver exemplo 3).

De um modo inesperado, o processo de acordo com a presente invenção permite não só preservar a actividade anti-microbiana característica da quitosana, mas também conferir uma actividade anti-oxidante surpreendentemente aumentada em relação à da 15 quitosana e, também, uma solubilidade em meio ácido muito reduzida, quer em relação à quitosana, quer em relação à quitosana modificada utilizando apenas a genipina como agente de reticulação (ver exemplos 4 e 5).

Exemplos:

Para uma melhor compreensão da presente invenção descrevem-se, em seguida, alguns exemplos de formas de realização preferidas da invenção, as quais não pretendem limitar o objecto da presente invenção. A solubilidade dos filmes é determinada por percentagem de perda de massa dos filmes após estarem mergulhados 7 dias numa solução aquosa a pH 3,5, numa proporção de uma área de 4 cm2 de filme em 30 mL de solução, com agitação orbital, à temperatura ambiente. A actividade anti-oxidante dos filmes é determinada pelo método do ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico), ABTS. A solução de ABTS+" é preparada por dissolução do ABTS, numa concentração de 7 mM, em perssulfato de potássio 2,45 mM, sendo a solução deixada a reagir no escuro durante 12-16 horas. Adicionam-se a 1 mL desta solução 80 mL de etanol. Os filmes são mergulhados na solução de ABTS+', numa proporção de 1 cm2 de filme para 1,5 mL de solução. Ao fim de 72 horas de reacção no escuro, mede-se a absorvância a 734 nm da solução de ABTS+'. A actividade anti-oxidante dos filmes corresponde à percentagem de inibição do ABTS+', calculada da seguinte forma: % Inibição =100 x (Ab-Aa)/Ab, 16 em que:

Ab é o valor da absorvância do ABTS+‘ sem filme, e Aa é o valor da absorvância do ABTS + ‘ na presença do filme (ambos ao fim de 72 horas de reacção). A actividade anti-microbiana é determinada numa cultura de leveduras (Sacharomyces cerevisae). As leveduras são inoculadas num meio liquido, YEPD (constituído por 0,5% de extracto de levedura, 1% de bactopeptona de carne e 1% de glucose) de modo a existirem aproximadamente 100 células por mL. Os filmes são colocados nesta suspensão, numa proporção de 4 cm2 de filme por 10 mL, que é incubada a 25 °C e com uma agitação orbital de 160 rpm. A viabilidade celular é determinada ao fim de 48 horas por inoculação em placas contendo YEPDA. As unidades formadoras de colónias (UFC) são determinadas após 36 horas a 25 °C.

Exemplo 1 - Preparação do filme à base de guitosana modificada com ácido cafeico 1.1. Produção de quitosana modificada

Dissolveu-se quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% V/V, com agitação, durante 16 horas, à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresentasse uma concentração de, aproximadamente, 1,5% (m/V). Em seguida, adicionou-se à solução de quitosana hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM, numa razão de 1 mL por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adicionaram-se 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os 17 reagentes, fez-se borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante 3 horas com agitação constante. Após a reacção, adicionou-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado foi obtido por centrifugação (15000 rpm durante 20 minutos a 4 °C) e lavou-se com metanol durante 1 hora. 1.2. Processo de produção do filme à base de quitosana modificada

Dissolveu-se a quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% (V/V) durante 4 horas, com agitação, e à temperatura ambiente. Após a completa dissolução, adicionou-se glicerol 1% m/m e homogeneizou-se a mistura a 50 °C, num banho de água, durante 10 minutos. Deixou-se arrefecer a mistura até à temperatura ambiente, mantendo uma agitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta mistura adicionou-se uma solução de genipina 10% (m/V) em etanol, de modo que a concentração de genipina no filme fosse 0,05%. A mistura foi homogeneizada, durante 30 minutos com agitação constante. Filtrou-se a solução sob vácuo com um funil de placa porosa (tamanho G2) e desgaseificou-se com vácuo. Transferiu-se a solução para uma placa (0,2 g/cm2) e 6 horas após a adição da genipina colocou-se a placa numa estufa a 35 °C, durante cerca de 16 horas para formar o filme por evaporação do solvente.

Lavou-se o filme obtido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora). Após a lavagem, deixou-se o filme secar à temperatura ambiente. 18 1.3. Neutralização do filme à base de quitosana modificada 0 filme foi colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lavou-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e secou-se à temperatura ambiente durante 18 horas. 0 pH final do filme obtido foi, aproximadamente, 6.

Exemplo 2 - Preparação do filme à base de quitosana modificada com compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho 2.1. Produção de quitosana modificada

Dissolveu-se quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% V/V, com agitação, durante 16 horas, à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresentasse uma concentração de, aproximadamente, 1,5% (m/V). Em seguida, adicionou-se à solução de quitosana 1 mL de hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 6 0 mM, numa razão de 1 mL de oxidante por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adicionaram-se 0,7 mg de extractos de vinho por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os reagentes, fez-se borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante 3 horas com agitação constante. Após a reacção, adicionou-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado foi obtido por centrifugação (15000 rpm durante 20 minutos a 4 °C) e lavou-se com metanol durante 1 hora. 19 2.2. Processo de produção do filme à base de quitosana modificada

Dissolveu-se a quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% (V/V) durante 4 horas, com aqitação, e à temperatura ambiente. Após a completa dissolução, adicionou-se qlicerol 1% m/m e homogeneizou-se a mistura a 50 °C, num banho de áqua, durante 10 minutos. Deixou-se arrefecer a mistura até à temperatura ambiente, mantendo uma aqitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta mistura adicionou-se uma solução de genipina 10% (m/V) em etanol, de modo que a concentração de genipina no filme fosse 0,05%. A mistura foi homogeneizada, durante 30 minutos com agitação constante. Filtrou-se a solução sob vácuo com um funil de placa porosa (tamanho G2) e desgaseificou-se com vácuo. Transferiu-se a solução para uma placa (0,2 g/cm2) e 6 horas após a adição da genipina colocou-se a placa numa estufa a 35 °C para formar o filme por evaporação do solvente (cerca de 16 horas) .

Lavou-se o filme obtido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora). Após a lavagem, deixou-se o filme secar à temperatura ambiente. 2.3. Neutralizaçao do filme à base de quitosana modificada O filme foi colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lavou-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e secou-se à temperatura ambiente durante 18 horas. O pH final do filme obtido foi, aproximadamente, 6. 20

Exemplo 3 Produção de vinho em contacto com um filme à base de guitosana.

Um vinho branco foi produzido segundo o método de vinificação tradicional, com a excepção de não ter sido adicionado anidrido sulfuroso, mas tendo sido colocado em contacto com um filme à base de quitosana (quitosana reticulada com genipina). Ao fim de 9 meses de armazenamento o vinho estava estável a nível microbiológico, pois não apresentou nenhuma unidade formadora de colónias de leveduras e bactérias. As análises físico-químicas demonstraram que, em comparação com o vinho contendo SO2, o vinho em contacto com o filme tinha a mesma actividade anti-oxidante e composição em compostos fenólicos. No entanto, a cor dos vinhos era diferente, apresentando o vinho branco que estava em contacto com a quitosana uma menor intensidade da cor. Segundo os parâmetros CIELAB, este vinho apresentava também uma tonalidade de cor mais verde e menos amarela do que o vinho sem anidrido sulfuroso mas que não estava em contacto com o filme à base de quitosana. A análise sensorial dos vinhos realizada por um painel de provadores treinado revelou que o vinho branco em contacto com o filme à base de quitosana possuía a nível global uma melhor cor, sabor e aroma em relação ao vinho produzido sem adição de SO2 e de filme à base de quitosana. A comparação com o vinho produzido pela vinificação normal, com adição de SO2, mostrou que o vinho branco produzido segundo o processo descrito nesta invenção foi considerado pelo painel como o melhor vinho das provas (Figura 1). 21

Exemplo 4 Solubilidade e actividade anti-oxidante de filmes de quitosana sem modificação química, quitosana reticulada com genipina e quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácido cafeico

Seguindo os procedimentos incluídos na descrição detalhada, preparou-se um filme à base de quitosana de acordo com o exemplo 1 e um outro de quitosana reticulada com genipina. Na figura 2 é apresentada a solubilidade destes filmes e, como comparação, a de um filme à base de quitosana não modificada, preparado segundo o mesmo procedimento. Os filmes à base de quitosana produzidos com ácido cafeico e genipina ou apenas com genipina apresentam uma solubilidade, em meio ácido, cerca de 45% inferior em relação aos filmes produzidos com quitosana sem modificação química. A neutralização dos filmes (tratamento com NaOH) diminui a solubilidade dos filmes à base de quitosana, tendo o filme modificado com ligação covalente de ácido cafeico e genipina uma solubilidade de aproximadamente 10% (Figura 2), o que representa uma diminuição de 36% em relação ao filme sem tratamento. A actividade anti-oxidante dos filmes à base de quitosana com ácido cafeico e/ou genipina, assim como o de quitosana não modificada, com e sem neutralização com NaOH, é apresentada na Figura 3.

Os resultados para a actividade anti-oxidante dos filmes demonstram que a neutralização (tratamento com NaOH) aumenta a actividade anti-oxidante dos filmes de quitosana, principalmente dos da quitosana modificada com ácido cafeico e genipina. Este filme obtido após a neutralização apresenta uma capacidade anti- 22 oxidante cerca de 45% superior à dos filmes neutralizados de quitosana com genipina e quitosana não modificada (Figura 3). A actividade anti-microbiana foi determinada para os três filmes numa cultura de leveduras (Sacharomyces cerevisae). As suspensões de células contendo os filmes, filme preparado com quitosana modificada com ácido cafeico e/ou genipina e filme preparado com quitosana, não modificada, não apresentaram nenhuma UFC ao fim de 48 horas de incubação, enquanto o controlo (suspensão de células inoculadas nas mesmas condições mas sem adição de filme) apresentou 8xl07 UFC/mL. 0 filme reticulado com genipina e com moléculas de ácido cafeico ligadas à quitosana apresenta baixa solubilidade em meio ácido e elevada actividade anti-oxidante em comparação com um filme à base de quitosana não modificada. 0 filme com a quitosana modificada manteve a actividade anti-microbiana.

Exemplo 5 - Solubilidade e actividade anti-oxidante de filmes à base de quitosana reticulada com genipina e quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho

Os extractos de vinho foram obtidos por extracção em fase sólida (SPE) com um polímero Cis (octadecilo) . A coluna foi activada com metanol e lavada com água destilada antes da sua utilização. 0 vinho tinto foi destilado à pressão atmosférica para retirar o etanol. 0 resíduo desalcoolizado resultante foi passado pela coluna de Cis ao pH do vinho (cerca de 3,5) . A fracção não retida foi eluída com água destilada e, em seguida, foram eluídos os compostos fenólicos com metanol contendo 0,1% 23 de HC1 (metanol acidico). 0 pH desta fracçao foi elevado a 7 por adição de NaOH 1 M e foi diluída 2 vezes com tampão fosfato 0,1 M a pH 7. A coluna co t—1 o foi lavada com uma solução tampão fosfato 0,1 M a pH 7. A fracção eluida com metanol acidico contida na solução a pH 7 foi novamente aplicada na coluna Cia e a fracção não retida, eluida com o tampão a pH 7, foi recolhida. Esta fracção, rica em ácidos fenólicos numa concentração de 2,4 g/L (em equivalentes de ácido gálico), era constituída principalmente pelos ácidos caftárico, gálico e cumárico, entre outros.

Após a eluição com o tampão a pH 7, foi efectuada uma eluição com acetato de etilo e, por fim, com metanol acidico (metanol com HC1 0,1%). A fracção eluida com metanol acidico era maioritariamente constituída por antocianinas, sendo a malvidina-3-glucósido a antocianina mais abundante (representando cerca de 60%). Esta fracção que foi utilizada para adicionar aos filmes à base de quitosana continha uma concentração de compostos fenólicos de 2,2 g/L (em equivalentes de ácido gálico).

Foi preparado um filme à base de quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácidos fenólicos ou de antocianinas provenientes de um extracto de vinho, de acordo com o exemplo 2. Um filme à base de quitosana não modificada foi preparado seguindo o mesmo procedimento para ser usado como comparação. Os filmes foram tratados com NaOH.

Na figura 4 é apresentada a solubilidade em meio ácido ao fim de 7 dias e a actividade anti-oxidante do filme obtido por reticulação com genipina e adição dos compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos do vinho e a do filme à base de quitosana não modificada preparado usando o mesmo procedimento. A solubilidade e a actividade anti-oxidante dos filmes foram determinadas tal como anteriormente descrito, com excepção do tempo de reacção dos filmes com a solução de ABTS + ', para a determinação da actividade anti-oxidante, que foi apenas de 48 horas. 0 filme à base de quitosana modificada apresenta uma solubilidade de aproximadamente 12%, sendo 58% inferior em relação à solubilidade do filme à base de quitosana não modificada. A actividade anti-oxidante do filme com a quitosana reticulada com genipina e com adição de compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos do vinho é superior (cerca de 100%) à do filme à base de quitosana. O filme produzido com quitosana reticulada com genipina e com adição de antocianinas extraídas do vinho apresentou actividade anti-oxidante idêntica (percentagem de inibição de 83% ao fim de 48 horas de reacção com a solução de ABTS+") à do filme preparado com quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácidos fenólicos provenientes do mesmo extracto de vinho.

Em comparação com a actividade anti-oxidante do filme à base de quitosana com ácido cafeico e genipina, descrito no exemplo 4, o filme preparado com a quitosana reticulada com genipina e com adição do extracto de vinho tem uma actividade anti-oxidante bastante superior, uma vez que ao fim de 48 horas já apresentava uma percentagem de inibição superior (87%) à que o outro filme possuía após 72 horas, cerca de 75% (Figura 3) . A solubilidade em meio ácido (após 7 dias) dos dois filmes foi idêntica, aproximadamente 10% (Figuras 2 e 4).

Lisboa, 2 de Novembro de 2012 25

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de vinhos, compreendendo a produção de vinho pelo método tradicional sem adição de anidrido sulfuroso caracterizado por compreender ainda: a) preparar um filme de quitosana adicionando um agente de reticulação à quitosana; ou b) preparar um filme de quitosana modificada compreendendo: • modificar a quitosana por ligação covalente a compostos fenólicos anti-oxidantes, • formar um filme por reacção da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação e, • neutralizar o filme anterior; c) fazer contactar o filme de quitosana obtido em qualquer um dos passos anteriores com vinho após a fermentação.
2. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no passo c) se fazer contactar 100 cm2 de filme à base de quitosana com 750 mL de vinho.
3. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a modificação da quitosana compreender as etapas de: 1 dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V); adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.
4. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a formação do filme de quitosana modificada compreender as etapas de: dissolver a quitosana modificada em meio ácido; adicionar um plastificante à solução anterior e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos; após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos; filtrar e secar a solução anterior para obter um filme à base de quitosana modificada; e lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente. 2 Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a neutralização do filme à base de quitosana compreender as etapas de: neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com áqua até obter pH 6; e secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o meio ácido ser uma solução de ácido acético. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o composto fenólico anti-oxidante ser seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o ácido cafeico ser utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os compostos fenólicos 3 anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho serem seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.
10. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes serem utilizados numa razão de 0, 7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.
11. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o oxidante ser seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).
12. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o oxidante ser hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.
13. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o plastificante ser glicerol numa razão de 1% m/m por massa de solução.
14. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente de reticulação ser genipina numa razão de 0,05% em relação ao filme.
15. Processo de produção de filme à base de quitosana para aplicação no processo de produção de vinhos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, compreendendo modificar a quitosana por ligação covalente a compostos fenólicos anti-oxidantes, 4 caracterizado por compreender ainda: i) formar um filme por reacçao da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação; e ii) neutralizar o filme obtido no passo i).
16. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a modificação de quitosana compreender as etapas de: dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V); adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.
17. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o passo i) compreender as etapas de: dissolver a quitosana modificada em meio ácido; adicionar um plastificante e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos; 5 após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos; filtrar e secar a solução obtida para obter um filme à base de quitosana modificada; e lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente.
18. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o passo ii) compreender as etapas de: neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com água até obter pH 6; e secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas.
19. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o meio ácido ser uma solução de ácido acético.
20. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o composto fenólico anti-oxidante ser seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho. 6
21. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o ácido cafeico ser utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana.
22. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho serem seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.
23. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes serem utilizados numa razão de 0,7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.
24. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o oxidante ser seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).
25. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o oxidante ser hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.
26. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o plastificante ser glicerol numa razão de 1% m/m por massa de solução.
27. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o agente de 7 reticulaçao ser genipina numa razao de 0,05% em relaçao ao filme. Lisboa, 2 de Novembro de 2012 8