PT103752A - Processo de biocatálise fúngica num meio de cultura contendo líquidos iónicos solúveis em água - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM PROCESSO DE BIOCATÁLISE FÚNGICA, ONDE A CAPACIDADE PRODUTIVA DO FUNGO FILAMENTOSO É AUMENTADA SUPLEMENTANDO O MEIO DE CULTURA DO ORGANISMO COM LÍQUIDOS IÓNICOS SOLÚVEIS EM ÁGUA, ESPECIFICAMENTE FUNCIONALIZADOS DE MODO A ALTERARAM A BIOCATÁLISE FÚNGICA. DESTA FORMA, O PRESENTE INVENTO É ÚTIL PARA AUMENTAR A CAPACIDADE DE SÍNTESE NÃO POLUENTE DE NOVOS PRODUTOS NATURAIS COM ACTIVIDADE BIOLÓGICA E PARA APLICAÇÃO A PROCESSOS ONDE SE PRETENDA A DIGESTÃO FÚNGICA DE UM COMPÓSITO INSOLÚVEL EM ÁGUA (OU POUCO SOLÚVEL), QUE UMA VEZ SOLUBILIZADO NO LÍQUIDO IÓNICO PODE SER DEGRADADO PELO FUNGO FILAMENTOSO, SENDO ESPECIALMENTE INTERESSANTE A APLICAÇÃO DESTA INVENÇÃO EM BIOREMEDIAÇÃO FÚNGICA DE COMPOSTOS TÓXICOS RECALCITRANTES. ASSIM, A PRESENTE INVENÇÃO PODE SER APLICADA NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA, NA INDÚSTRIA DE GESTÃO E ELIMINAÇÃO DE RESÍDUOS SÓLIDOS (TÓXICOS OU NÃO) E NA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE VALOR ACRESCENTADO OBTIDOS POR DIGESTÃO EFICIENTE DE EXCEDENTES DA INDÚSTRIA ALIMENTAR (COMO POR EXEMPLO, ENRIQUECIDOS EM LENHINA, CUTINA E SUBERINA).

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO DE BIOCATÁLISE FÚNGICA NUM MEIO DE CULTURA CONTENDO LÍQUIDOS IÓNICOS SOLÚVEIS EM ÁGUA"

Dominio técnico da invenção A presente invenção relaciona-se com um processo de biocatálise original, que explora a capacidade de alguns microrganismos, inclusive fungos filamentosos crescerem num meio de cultura suplementado com líquidos iónicos solúveis em água, especificamente funcionalizados, o que resulta na produção de novas moléculas (metabolitos). A função orgânica introduzida no líquido iónico determina a diversidade dos metabolitos sintetizados pelo fungo.

Desta forma, a presente invenção insere-se no domínio da bioquímica, com aplicação à indústria farmacêutica, de tratamento de resíduos e em processos que impliquem a digestão eficiente de excedentes da indústria alimentar.

Antecedentes da invenção

Os fungos são um vasto grupo de organismos classificados como um Reino pertencente ao Domínio Eucariota. Estão incluídos neste grupo organismos de dimensões consideráveis, como os cogumelos, mas também muitas formas microscópicas, como fungos filamentosos e leveduras. Os fungos possuem um corpo vegetativo chamado talo ou soma que é composto de finos filamentos unicelulares chamados hifas. Estas hifas geralmente formam uma rede microscópica junto ao substrato (fonte de alimento), chamada micélio, por onde o alimento é absorvido. Usualmente, a parte mais conspícua de um fungo são corpos frutificantes ou esporângios (as estruturas reprodutivas que produzem os esporos). 2

Os metabolitos secundários são geralmente produzidos após a fase activa de crescimento e muitos possuem uma estrutura química complexa e pouco comum. Alguns metabolitos são comuns a fungos de taxa próxima, mas outros são apenas encontrados em poucas espécies. Esta distribuição restrita implica que a ausência de um função geral para os metabolitos secundários nos fungos. Os metabolitos secundários de fungos são submetidos a sintese química combinatória e dependem directamente do substrato utilizado pelo fungo durante o crescimento.

Actualmente as estratégias de biocatálise, utilizando organismos vivos, baseia-se em líquidos iónicos imiscíveis em água, pelo que a fase do solvente iónico não está em contacto directo com o microrganismo e é utilizada para remover por partição da fase aquosa (onde está o meio de cultura e o organismos vivo) uma substância inibitória para o microrganismo, como por ex. o fenol ou o etanol, como se pode constatar pelo divulgado nos documentos Baumann, MD, Daugulis, AJ, and Jessop, PG. Phosphonium ionic liquids for degradation of phenol in a two-phase partitioning bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005; 67(1): 131-137; Pfruender, H, Jones, R, and Weus t er-Bot z, D. Water immiscible ionic liquids as solvents for whole cell biocatalysis. J. Biotechnol. 2006; 124(1): 182-190.

Contudo, na presente invenção o microrganismo desenvolve-se um meio de cultura contendo um líquido iónico solúvel em água o que se traduz numa influência directa do líquido iónico no metabolismo do fungo durante o crescimento, influenciando uma nova catálise fúngica o que resulta num novo perfil de metabolitos fúngicos. 3

Nos documentos Swatloski, R. P.; Rogers, R. D.; Holbrey, J. D. "Dissolution and processing of cellulose using ionic liquids," U.S.10/256,521; PCT/US02/31404; WO03/029329, divulga-se a utilização de um liquido iónico especifico de modo a solubilizar a celulose (biocompósito insolúvel em áqua) mas não utiliza, ou explora, a capacidade dos fungos crescerem nesta matriz mista que contém o biocompósito (substrato) e o liquido iónico, o que concomitantemente dissolve o substrato e controla a diversidade de metabolitos fúngicos sintetizados. Na presente invenção a capacidade solvência dos líquidos iónicos é explorada de modo a aumento a eficiência da biodegradação do compósito parcialmente solubilizado pelo fungo, facto determinado pela maior acessibilidade do fungo ao substrato (biodisponibilidade), e que resulta na capacidade de explorar com a presente invenção a síntese de metabolitos específicos produzidos após digestão de substratos pouco solúveis em água e extremamente recalcitrantes.

Desta forma, a presente invenção proporciona um novo processo de biocatálise fúngica que se distingue dos demais processos conhecidos no estado da técnica por utilizar líquidos iónicos que transportam diferentes funcionalidades orgânicas nos iões que constituem o sal, determinando assim que os componentes de uma mistura reactiva reajam diferentemente em diferentes solventes iónicos, i.e., a funcionalidade do líquido iónico determina o curso da reacção química, originando produtos distintos, permitindo a indução, com ubiquidade, da síntese de novos metabolitos fúngicos.

Uma vez que os líquidos iónicos apresentam excelentes capacidades de solvência, a sua utilização na biocatálise 4 4 alargado plantas quimi cas ntese de fúngica permite ainda que se explore um espectro de substratos, por exemplo os biocompósitos de insolúveis em água que apresentam estruturas complexas e podem ser explorados como para a si novas moléculas.

Descrição geral da invenção A presente invenção relaciona-se com um novo processo de biocatálise utilizando organismos vivos, nomeadamente algumas espécies de fungos filamentosos, que crescem num meio de cultura suplementado com líquidos iónicos.

Pretende-se com a presente invenção, aumentar a capacidade produtiva do fungo filamentoso pela suplementação do meio de cultura do organismo, com líquidos iónicos solúveis em água especificamente funcionalizados de modo a alteraram a biocatálise fúngica o que consequentemente leva à produção de novas moléculas. determina a fungo, que fúngica em A função orgânica introduzida no líquido iónico diversidade dos metabolitos sintetizados pelo são característica exclusiva de cada espécie cada substrato.

Embora a presente invenção possa ser utilizada de modo a explorar fungos de diferentes taxa, é preferencialmente aplicável a fungos gue se reproduzem assexuadamente, não apenas pela facilidade de preparação de um inoculo de esporos, mas também por serem capazes de se desenvolver em cultura submersa. 5

Na presente invenção os fungos filamentosos foram preferencialmente explorados pela razões acima apontadas, mas também pela sua diversidade, capacidade biodegradativa e multiplicidade de metabolitos que podem sintetizar.

Foi preferencialmente explorada a capacidade de alguns isolados fúngicos (previamente isolados da comunidade fúngica que coloniza as pranchas de cortiça [1-4]) degradarem eficientemente os constituintes maioritários das paredes das células de cortiça lenhina e suberina. Essa comunidade fúngica inclui algumas das seguintes espécies: Penícíllíum adametzii, Penicillium brevicompactum, Penícíllium brevicompactum, Penicillium corylophílum, Penicillium diversumr Penicillium decumbens, Penícíllíum fenneliae, Penícíllíum glabrum, Penícíllíum glabrum, Penicillium glandicola, Penicillium glandicola, Penícíllíum hiraymae r Penicillium janczewskiir Penicillium varíabile, Penicillium olsoníí, Penicillium restríctum, Trichoderma longibrachiatumr Mucor plumbeus, Chrysonilia sitophíla e Cladosporium herbarum. A presente invenção pode utilizar todos os tipos de fermentações fúngicas (continua, descontinua, semi-contínua), explorando uma gama vasta de substratos e de condições ambientais.

Como estratégia inicial foi explorada a produção de metabolitos endógenos sintetizados durante o crescimento do fungo em meio pobre, suplementado com 1% glucose (minimal media, pH 6) contendo por litro de meio 0,3 g NaN04; 0,05 g de KC1; 0,05 g de MgS04.7H20; 0,001 g de FeS04.7H20; 0,01 g de ZnS04.5H20; 0,0005 g de CuS04.5H20, 1 g de K2HP04. 6 O meio é inoculado com 105 esporos/mL e o desenvolvimento do micélio fúngico (na presença de NaCl ou do liquido iónico) é monitorizada por mediação da densidade óptica da cultura a 600 nm. O extracto de cultura é recolhido quando a cultura fúngica atinge a fase estacionária. O extracto é clarificado por centrifugação (remoção do micélio) e filtrado (0.22 μιτι) antes da análise. Os perfis de MS (preferencialmente ESI (Electron-Spray Ionisation Mass Spectrometry) permitem pesquisar a totalidade de massas (m/Z) existentes na amostra (50 a 750 Da).

Comparando o perfil de metabolitos do meio contendo 0,05 M NaCl com aquele contendo 0,05 M de um liquido iónico, é possível identificar novas espécies de massas. A tabela seguinte lista alguns dos líquidos iónicos possíveis de utilizar na presente invenção.

Tabela 1 - Líquidos iónicos aplicáveis na presente invenção

Nome Nome Abreviado Ri Ri Rj Rt Rs GATIÕES COMUNS Piridínio í?-,. /\ 51, [CnPyr n-alquil H H H - [Cn-3-MePyf n-alquil H ch3 H - [Cn-4-MePy]+ n-alquil Π Π ch3 - Bipiridínio =,...... 'P_V/ [RR-BPyf Ri r2 2,2-Bipiridínio rf^Çj Hm.pl—s, O [Cn2,2-BPy]" n-alquil 7

Piridazínio Ο 1, [Ri-Pydzf Ri Pirimidinio íA" AtA M Ri [Ri-Pymf Ri Pirazinio 0 N 1, [Ri-Pyz]+ Ri Colinio +---\ R1 — N \/ W OH — — — — [AcCh]1" CH2COO -- - - - [ChOMe]+ och3 -- - - - Imidazólio % /R« Κι Y Ri Rj [mim]+ H H ch3 H H [Cnmim]+ ch3 H n-alquil H H [i-Cnmim]+ ch3 H i-alquil H H [C„im]+ H H n-alquil n>2 H H [i-Cnim]+ H H i-alquil H H [C^Cmim]" ni-alquil ni>2 H n2-alquil n2 > 2 H H P- MeCn2Cniim]+ nralquil ni >2 ch3 n2-alquil n2>2 H H [2-Memim]+ H ch3 ch3 H H [2-MeCnim]+ H ch3 n-alquil n>2 H H [M5If ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 [R3,Riim]+ Ri H r3 H H :i/ ~'ir. li·.. ^ , - ** >Ch* ?· Dr/- C'J [&((7Ο)3(η0- c6n5cn2- mim)]+ [PEGnCnim]" R = n-alquil n > 2 PEG - polietilenoglicol [PEGnmim]+ r = ch3 PEG - polietilenoglicol

Imidazólio tipo Ciclofano <?1 Rz [Ch2im]+ H H - — — [Ch3im]+ ch3 H Pirrolidinio ÍC K I_ [Pm^r rq-alquil n2-alquil - - - Ρΐ,ηΓ ch3 n-alquil - — — Piperidínio ,νΓ 0 [Pri,„]+ ch3 n-alquil 1,4-Dimetilpiperazinio / \^V" h2q,-j|\ "ta-í>CHsF [(Me)2-Pizf Pirazólio \*)/ Í^H / \ [R3,R2Pylf H r2 r3 H H [2-MePyl]+ H ch3 H H H Triazólio a, R-s» 1¾1 'Ví^N' [R^taZif ch3 H H R. - [l-Ri-2- R2-3-R3-Taz]+ Ri r2 r3 H ” [3-R3-TaZlf ch3 H r3 H - [l-Ri-3- R3-Tazl+ Ri H r3 H Benzotriazólio Ri u ; ; n A, [QABTazf n-alquil - ch3 - - [Rj-QBtaz]" ch3 — r3 — — Oxazólio XnHo W' R;. R, [R3Ox]+ H H r3

Tetrazólio t Rk -N- --R< Í4 Rj [l,5-2-NH2- Ttraz1]+ nh2 H H ch3 nh2 [1-Rí-2-R2-4- R4-Ttrazi]+ Ri r2 H R. ch3 9

Oxazolidínio --0 C-> [OxdiJ+ ch3 n-alquil [R2-0xdi]+ ch3 R2 — " " Morfolinio 99 [ΜριιΠ]+ ch3 n-alquil - - - [R2-Mpi]+ ch3 r2 — — — Tiazólio r, JL Vv^ S^\ FÇ R. [R3th]" Π Π r3 Π Pirrolinio Ra .-ίχ R$ R2 [R3-Pyrf H H r3 H H [2-Me-CnPyr]+ H ch3 n-alquil H H Amónio Rj Η^ΗΝ-,,slRs R? [Nnl ,iã ,n3 .rf] ni-alquil n2-alquil n3-alquil Oi-alquil - [Nnl ,n2 ,n3 ,h] ni-alquil n2-alquil n3-alquil Π " Fosfónio R4 [Pnl ,n2 ,n3 ,n4 ] ni-alquil n2-alquil n3-alquil Oi-alquil Sulfonio Ri ? f R- [Snl ,n2 ,n3 ,n4] ni-alquil n2-alquil n3-alquil n4-alquil Guanidinio Xí" RV XX Rí xR2 [Gnl ill2] ni-alquil n2-alquil \ x-Rjr I [GnGf n2-alquil Imidazolina cíclica de guanidinio Rx vr \ / [Cncigif ch3 n-alquil - - - [Cncig]+ Π n-alquil Hexahidro-pirimidina cíclica de guanidinio Ri-. + .-1¾ p [Cnchgi]+ cn3 n-alquil [Cnchg]+ Π n-alquil - - - 10

Tetrahidro-1,3,5-oxadiazina cíclica de guanidínio Y"'* [C3ctgif Triazolina cíclica de guanidínio N N N N““" [Cnctragi]+ n-alquil Y ^ N *HY [Cnctragh]+ N-alquil-isoquinolínio > ί[ 1 ♦ ^ /'"k-.JI ^ ^ R [CnIsoq]+ n-alquil GATIOES QUIRAIS Imidazólio Quiral SR, ^=4' CH2OH \/ [Ch2C2im]+ cn3 - - - - [Ch3C2im]+ i-C2H5 - - - - [Ch4C2im]+ i-C4H9 - - - - Cu^GEt X C [Chl-mim]+ D-l-etil-2-(R-feniletil)-imidazólio Η,ΟγΡϋ ^Nv/ [Ch5C2im]+ Imidazólio tipo Ciclofano R. i/'"· [Ch4imf ch3 O Oxazolínio Quiral r2 + /7\ k; N 0 \_j [2-Et-l-CjOx]+ C3Hu C2n5 - - - [2-Et-l-Qoxf ch3 C2n5 11 rS ?? W^rRi Λ Rí [Mym- Νηΐ,ηί,ιΰ] n-alquil n-alquil n-alquil -x f 1 [Chc4f -/ —OH / s / r [chc5]+ COOR-1+ ' J R [ABCC..J" n-alquil H [ABC], onde A, B e C são as três letras representantes de aminoácidos. Phx>CH3 0 “[Ch5-Py]+ fL [Chc8]+ D1CATIGES a, ω-diimidazólio alquileno if . Ψ <t> Λ,μ V.r/ !_// [Cra(Cnim)2]+ n-alquil n-alquil 1,l-Metileno-4,4-dialquilbis(1,2,4-triazólio) [Cm(CnTaz)2]^ n-alquil n-alquil IL EWITTIEIÒIS '•-v bb % [Zlim]\ m=3 c2h5 H sor - \72vmX, m=3 Etileno H so3- - - [Z3im]+, m=2 c2n5 Π S02-1T- ch2cf3 — — [Z4imf, m=3 c2h5 H so2-ir- ch2cf3 " " [Z5im]+, m=2 ch3 ch3 so2-rt- ch2cf3 — — R - grupos funcionais como amidas, aminas, éteres, álcoois, grupos carboxílicos, ureia, e tiouréia, fosfinas, grupos funcionais nitrilo, N-butironitrilo, cadeias fluoradas, tiól e alquileno. 12

Aniões Estrutura Química [αιυ4Γ Υ = Cl, Br, I Haleto de alumínio γ 1 e Y—AI—Y 1 [AuC14] ” Tetracloroaurato Ci 1 θ Cl—AU—01 Ci [FeCl4] “ Tetracloroferrato Cl 1 Θ Cl—Fe—Cl Cl [PdCl4] ” Tetracloropaladato Cl 1 Θ Cl—Pd—α Cl [C104] " Perclorato 0 li O—Q—0 1 0 0 [HBr2] ' Dibromohidrogenato(I) H—Br—Br° [LA]' Lactato ">X [N03] ‘ Nitrato 0 Q**' ^0 [N02] ‘ Nitrito e _ N , 0^ ^'0 [DCA]“ Di ci anamida Θ íX %N [SCN]“ Tioci anato N=C—Se [ C ( CN ) 3] ^ Tri ci anometanida CN Λθ CN CN [NfO] " Nonaflato 0 p X? CF3CF2CF2CF2 0 [CiS04] " Metilsulfato Q p X9 13

[ C2S04 ] Etilsulfato OAAD ^ o>c [1-C4SO4] ' Isobutilsul fato i P . X V 0—S—0 \ [ Cg S O3 ] Octilsulfato Q p Ve 11—Cgríij Vo [AcO] ' Acetato 9 ίθ CHf1 V) [ HSO4 ] Hidrogenosulfato Xe HC^ Vd [TA] -= [TFA] “ Trifluoroacetato 0 JL® CF3 'Ao [Tf2N] “ Bis((trifluorometil) sulfonil)imida A //\\ 0 0 ó 0 [BETI]“ imida CF;CFrx,x ^CT-CFi //A /V Q O <f O [Me] _ Tris(trifluorometilsulfonil) metanida 0 f3c—s=o F3C^S/Cx-S^CF3 0//X\ A, 0 0 0 0 [ΗΒΓ Heptafluorobutanoato 0 li Θ C._ CF3CF2CF2 Ά [ CB11H12 ] Carborano \Q 1° «Ve V 14 [1-R-CBiiHn] ' R = Ci a C4 1-Alquil-carborano R { Ίι -VI XXdi ......Cf; ·>ν· Á"'d ίί-Ογ. iA Ato' n [TfO] “ Tri fluorometanosulfonato, Tri flato O ®/° V O [MeS04] ” Mesilato / θ ΗίΓ_"° [Sac]“ Sacarinato ο$· [Ace]~ Acesulfato 0 J-L © % [Tos]' Tosilato 0 //% [TTA]" 2,2,2-trifluoro-N-(tri fluorometi1 sulfonil)-acetamida Θ ΟΡ,ν mCF; /\ \ 00 0 [MeOEtSO4] “ Metoxi eti1sulfato P l; Θ • ,.-v ví’!^S_q ^ \ [ EtOEt SO4 ] ' Etoxi eti1sulfato /„ \ [ACESO]' 2-[ (Ιο cetamido)amino]etanosulfato 9 H vh/VVN)-s^ [ACES]' 2-[(2-acetamido)amino] etanosulfonato O H Ιι 1 4o A N /xd -H,N S^O w 0 15 [BESO]“ 2-[Bi s(2-hidroxi eti1)amino] etanosulfato \ [BBS]" 2-[Bi s(2-hidroxi eti1)amino] etanosulfonato HC> O Nx/\ // -x—-7 ST^° HO \X0 [TAPSO]" 3-{[Tris(hidroximeti1)meti1] amino}-1-propanosulfato °K-ch: k [TAPS]“ 3-{[Tris(hidroximeti1)meti1] amino}-1-propanosultonato ηοΆ I1 /° HO F XX0 [CHES]" 2-(Ciclohexilamino) etanosulfonato ^NH(CH2)AG30 [MOPSO]“ 2-Hidroxi-4- morfolinopropanosulfonato i—V , v_y [MES]“ 4-Morfoi inoetanosulfonato [MOPS]“ 4-Morfoi inopropanosulfonato c/ ^NH(CH2)3S03e [CAPS]“ 3-(Ciclohexilamino) -1 -propanosulfonato ^ ^Η(ΟΗ2^θ3Θ [PFS] " Hexafluorofos fato Fe Fx4.·'...... ρ'ΊΝ F [As F 6 ] Hexafluoroars enato F© Pvis-‘,,,F I^F F [NbF6] “ Hexafluoroniobato Fe fa<f 16

[TaF6] - Hexafluorotantalato ..........tU''F 1 '""'F F [BF4] " Tetrafluoroborato 1 0 .B ... F - V"F [BPh4] ' Tetrafenilborato Ph i® Phx VPh Kn Ph [Barf]“ Tetrakis[p-dimetil(1H,1H,2H,2 H- perfluorooctil)sililfenil]-borato : jj1 1 [Y]" Aniões de halogénio y=CI® Br®, I© [DOC]" Docusato / 1 “==· i? ib 3, 3 J; \ iT ' i [dtc]“ Di etilditiocarbamato £: N—of 0 / Xv, E: â [dtmn] 2~ Ditiomaleonitrilo <τ X S X -X -X X ψ A Ψ H [K-salt] 2~ Nitroditioacetato O H .3' A X Θ OjN S [Ν(Ν02)2Γ Dinitramida Θ cyw \% [ CuPc ( SO3 ) 4 ] 4~ Ftalocianinotetrasulfonato de cobre X\ OoJ ; X a 'A»-X / 4·“x a X XJÍ aaS \ Ιον: 4' »3 [ Trl]~ 3,5-Dinitro-l,2,4-triazolato A3„ tY N-;-N 17 17 [ Dni ] 4,5-Dinitroimidazolato e-K, -N, " 'Efh V__j/ [Ntl]- 5-Nitrotetrazolato •Yf'A; A β N—N Q ΐί (¾ (ί „ y [DBS]" Dodecilbenzeno-sulfonato c \ 9 Θ. [WOF5] " Oxipentafluorotungstato nfe., ; t'lXs.r p | f A escolha dos solventes iónicos foi criteriosamente elaborada de modo a privilegiar formulações com iões não tóxicos e permitir que a integração dos dados permita análise causa-efeito separadamente do catião ou do anião, o que significa por ex. que líquidos iónicos contendo o mesmo catião e aniões diferentes são testados. A tabela seguinte apresenta os catiões e aniões inicialmente pesquisados, mas a presente invenção pode ser utilizada com qualquer líquido iónico miscível em água (mesmo que muito pouco solúvel). A concentração do líquido iónico no meio de crescimento do fungo varia de diluição infinita a 10 M, sendo a concentração máxima de líquido determinada pela tolerância a concentração de sal existente no meio de cultura. Algumas espécies de fungos foram isoladas em ambientes com concentrações de sal extremamente elevadas, por ex. Eurotium herbaríorum, que foi isolada do Mar Morto onde a concentração de sal é de 340 g/L (~ 6 M) [5]. sao

As espécies fúngicas existentes em ambientes extremos, com elevada concentração salina e baixa actividade da água, 18 espécies adaptadas e não espécies verdadeiramente halofilicas ou halotolerantes de fungos [5, 6], o que significa que fungos existentes em meios comuns podem ser gradualmente adaptados a condições extremas explorando ciclos múltiplos de germinação/esporulação em concentrações crescentes de líquidos iónicos.

Resultados prévios indicam que numa concentração final de 0,05 M, cerca de 10% dos líquidos iónicos testados impedem a germinação dos esporos. Contudo, cada isolado fúngico testado possui um padrão de crescimento específico no meio suplementado com líquido iónico, não sendo por essa razão, possível estabelecer nenhuma correlação entre a espécie ou o género fúngico e o perfil de crescimento num líquido iónico específico.

Nos casos em que a germinação é possível e há desenvolvimento de micélio, o aumento da concentração do líquido no meio de cultura diminui a taxa de crescimento do fungo, sem comprometer a produção de metabolitos.

Nos casos onde há crescimento fúngico o aumento do carácter hidrofóbico do solvente iónico aumenta a diversidade de novos metabolitos.

Assim, são utilizados líquidos iónicos funcionalizados e solúveis em água como suplemento ao meio de crescimento de microrganismos, sendo a sua concentração, no meio de cultura, tal que permita o desenvolvimento do microrganismo seleccionado.

Os líquidos iónicos são inteiramente constituídos por iões, sendo a formulação mais comum destes solventes constituída 19 19 por um catião orgânico e dependendo o seu efeito, do anião utilizados na toxicidade do solvente funcionalidade do ião. um anião orgânico ou inorgânico, na cultura de fungos, do catião e sua formulação (o que infere na para os organismos vivos) e da

Os líquidos iónicos (por definição sais líquidos à temperatura ambiente, ou perto) transportam diferentes funcionalidades orgânicas nos iões que constituem o sal. Esta característica determina que os componentes de uma mistura reactiva reajam diferentemente em diferentes solventes iónicos, i.e., a funcionalidade do líquido iónico determina o curso da reacção química, originando produtos distintos. O ácido e a base utilizados na síntese do líquido iónico são geralmente inibitórios do crescimento do microrganismo e nos casos em que se observa crescimento não se detectam novos metabolitos. A presença do solvente ión produtos sintetizados durante do efeito provocado na mesma concentração (e força iónica) maior quanto mais hidrofóbica correlação género, e a iónico. A capacidade do liquido metabolitos sintetizados essencialmente de: i) determina o curso da ico altera o espectro dos o crescimento, e é distinta cultura na presença da mesma de um sal comum e é tanto for o ião, não existindo uma mesmo o liquido aparente entre a especie do fungo, ou concentração mínima inibitória (MIC) do iónico de alterar o espectro de durante o crescimento resulta a funcionalidade do solvente reacção bioquímica, originando 20 20 r e s e s a r produtos distintos (esta reacção bioquímica pode se mediada por enzimas extracelulares ou ligadas à pared celular, ou nos casos em que há absorção do solvente pela células, por enzimas intracelulares); ii) os iões qu constituem o líquido iónico são utilizados como precursore na síntese de novos metabolitos naturais, sendo diferenciação entre os dois processos conseguida po análise da biodegradabilidade do líquido. A capacidade produtiva da biocatálise fúngica depende também da biodisponibilidade do substrato, sendo a solubilidade do substrato no solvente da catálise um factor determinante. Os líquidos iónicos apresentam excelentes capacidades de solvência permitindo que a invenção explore um espectro alargado de substratos, por exemplo os biocompósitos de plantas insolúveis em água (enriquecidos em lenhina, cutina e suberina) que apresentam estruturas químicas complexas e podem ser explorados para a síntese de novas moléculas. Desta forma, esta invenção explora esta capacidade na biocatálise fúngica e serve para induzir com ubiquidade a síntese de novos metabolitos fúngicos.

Em todos os casos testados de micélio fúngico ocorreu com maior significância no onde se observou desenvolvimento a síntese de novos metabolitos, caso dos líquidos hidrofóbicos. A diversidade de produtos naturais esconde um sem número de propriedades farmacológicas, pelo que, a biocatálise na presença de líquidos iónicos constitui um avanço significativo na capacidade de síntese não poluente de novos produtos naturais com actividade biológica. Para além disso, este processo também pode ser aplicado a qualquer processo onde se pretenda a digestão fúngica de um 21 compósito insolúvel em água (ou pouco solúvel), que uma vez solubilizado no liquido iónico pode ser degradado pelo fungo filamentoso, sendo especialmente interessante a aplicação desta invenção em bio-remediação fúngica de compostos tóxicos recalcitrantes.

Uma vez que são constituídos só por iões, estes líquidos não apresentam pressão de vapor mensurável e podem portanto ser considerados solventes verdes. Assim, podem ser aplicados não apenas na indústria farmacêutica, na síntese de novos fármacos, mas também como processo alternativo para a produção de fármacos já existentes por uma tecnologia não poluente.

Podem igualmente ser aplicados na indústria de gestão e eliminação de resíduos sólidos (tóxicos ou não), explorando concomitantemente a capacidade de biodegradação dos fungos filamentosos (mesmo de poluentes orgânicos persistentes) com a elevada capacidade de solvência dos líquidos iónicos.

Para além das mencionadas aplicações, a presente invenção pode ainda ser usada na produção de produtos de valor acrescentado obtidos por digestão eficiente de excedentes da indústria alimentar (enriquecidos em lenhina, cutina e suberina). A grande vantagem de se utilizar organismos vivos, em vez de se restringir a biocatálise a apenas enzimas e/ou misturas de enzimas, depreende-se no aumento exponencial de diversidade de metabolitos que o fungo pode sintetizar e nas múltiplas combinações possíveis entre espécie fúngica versus solvente iónico (e/ou substrato). 22

Descrição detalhada da invenção 1. Meios de cultura

Para a concretização da presente invenção utiliza-se como meio de cultura um meio pobre semi-sintético (meio mínimo, pH 6) contendo por litro de meio 0,3 g NaN04; 0,05 g de KC1; 0,05 g de MgS04.7H20; 0,001 g de FeS04.7H20; 0,01 g de ZnS04.5H20; 0, 0005 g de CuS04.5H20, 1 g de K2HP04 suplementado com 1% de glucose (ou outra fonte de carbono, como por exemplo pó de cortiça, que é extremamente rico em lenhina e suberina, podendo no entanto a sua formulação ser variável, desde que possibilite o crescimento do fungo em questão. 0 líquido iónico é adicionado ao meio na concentração desejada. Por fim, a mistura é esterilizada por filtração. 2. Líquidos iónicos

Os líquidos iónicos podem ser produzidos a partir dos iões listados na Tabela 1, embora não exclusivamente, com uma concentração molar variável entre 0 e 10 M. 3. Estabelecimento da cultura de fungos 0 meio de cultura contendo o solvente iónico é inoculado com uma suspensão de esporos ou material de multiplicação do fungo seleccionado. monolaurato de

Os esporos são recolhidos de uma cultura com 3 semanas de idade, crescidas em meio sólido (meio mínimo pH 6 gelificado com agar 15 g/L) . Os esporos são libertados do micélio embebendo a cultura com uma solução de soro fisiológico (0,85% de NaCl) contendo 0,1% polixilenosorbitano (v/v). 23 A suspensão de esporos é clarificada por filtração através de lã de vidro. Os esporos são recuperados por centrifugação (centrífuga Sigma 4K15 com um rotor 12166-H, 13500 rpm durante 20 minutos a 4 °C) e lavados com soro fisiológico (0,85% de NaCl) contendo 10% glicerol(v/v ) · A densidade em esporos na suspensão é quantificada por contagem directa em hemacitómetro (BH2-RFCA, Olympus).

Utilizam-se culturas de cerca 250 μ]1 em microplacas de 96 poços para pesquisa inicial da tolerância do fungo a cada um dos solventes iónico em teste. Assim, o efeito do aumento da concentração do solvente iónico na taxa de crescimento do fungo é monitorizado a 600 nm utilizando um leitor espectrofotométrico para microplacas. O desenvolvimento da cultura (germinação dos esporos e desenvolvimento de micélio fúngico) é monitorizado indirectamente pelo aumento da absorvância do meio de cultura, e/ou directamente por observação directa auxiliado ou não pela ampliação da imagem sob um lupa ou microscópio.

Quando a cultura inicia novo ciclo de esporulação, o extracto de crescimento é recolhido e o micélio removido para análise. A água no extracto pode ser eliminada por liofilização. 4. Análise dos metabolitos produzidos

Os metabolitos fúngicos produzidos podem ser removidos do liquido iónico utilizando um solvente orgânico que seja imiscível nesse líquido, como por exemplo hexano, etilacetato ou metanol. A diversidade de metabolitos fúngicos é analisada e comparada com a composição de extractos de cultura do fungo crescido no mesmo meio de cultura sem liquido iónico, contendo ou não cloreto de sódio na mesma concentração do liquido iónico.

Esta análise pode ser efectuada por qualquer método analítico que permita boa resolução da mistura, por exemplo cromatografia de camada liquida com detector de UV (ultravioleta) ou por espectrometria de massa.

Nos casos em se detecta o aparecimento de novas moléculas (ou novas massas) estas são isoladas e identificadas através de métodos de análises comuns.

Exemplos

Exemplo 1

Um isolado fúngico, Penicillíum olsoníí, foi utilizado como organismo vivo para monitorizar o efeito de diferentes líquidos iónicos no espectro de metabolitos sintetizados pelo fungo durante o crescimento.

Utilizou-se como meio de cultura um meio pobre semi-sintético suplementado com 1% de glucose (minimal media, pH 6) contendo por litro de meio 0,3 g NaNCú; 0,05 g de KC1; 0,05 g de MgS04.7H20; 0,001 g de FeSC>4.7H20; 0,01 g de

ZnS04.5H20; 0, 0005 g de CUSO4.5H2O, 1 g de K2HPO4 (a formulação do meio de cultura pode ser variável). O meio de cultura foi suplementado com 0,05 M de cada um dos líquidos em teste (a concentração máxima inibitória 25 pode ser determinada previamente). A mistura é esterilizada por filtração. A titulo de exemplo foram utilizados os seguintes líquidos: Cloreto de Etil-Metilimidazólio (C2mimCl), Cloreto de Butil-Metilimidazólio (C^imCl), Cloreto de Colínio (ChCl), Cloreto de Metil-Butilpirrolínio (MBPyrrolCl), Cloreto de Butilpiridínio (CíPyCl), Tiocianato de Etil-Metilimidazólio (C2mimSCN); Etil sulfato de Etil-Metilimidazólio (C2mimC2H5S04) 0,05 M de solvente ionico foi de esporos de P. olsonii (105 o método de pesquisa rápida em O meio de cultura contendo inoculado com a suspensão esporos por mL) utilizando microplacas de 96 poços. 0 desenvolvimento da cultura (germinação dos esporos e desenvolvimento de micélio fúngico) foi monitorizado indirectamente pelo aumento da absorvância do meio de cultura (600 nm), auxiliada directamente por observação directa sob uma lupa.

As condições de incubação mantiveram-se constante até a cultura atingir a fase estacionário (~2 semanas após inoculação). As condições de incubação devem ser próximas da condições óptimas de crescimento, o que para estes fungos foi de 27°C, às escuras e sob agitação orbital (90 rpm) . A constituição do extracto de cultura filtrado, i.e. a diversidade de metabolitos fúngicos, foi analisada (ESI-MS) e comparada com a composição de extractos de cultura do fungo crescido no mesmo meio de cultura sem liquido iónico 26 contendo ou não cloreto de sódio na mesma concentração do liquido iónico. 0 efeito da adição de cada base e de cada ácido utilizado na síntese dos diferentes solventes também foram pesquisados.

Quando a cultura atinge a fase estacionária, o extracto de cultura é recolhido. 0 micélio e os esporos são eliminados por centrifugação e os restos celulares eliminados por filtração através de filtros de nylon de 0.22 μπι. O extracto pode ser analisado directamente por cromatografia líquida ou espectroscopia de massa, ou pode ser previamente concentrado por eliminação da água por liofilização e posteriormente analisado, antes ou depois de eliminação do líquido iónico por extracção dos metabolitos com um solvente iónico imiscível no solvente iónico (neste caso específico utilizou-se etilacetato).

Na tabela seguinte estão indicadas todas as novas espécies de massas que possuem origem fúngica (detectadas em modo negativo ESI-MS) relativamente ao mesmo perfil obtido quando a cultura é crescida em meio contendo 0.05 M de NaCl. Neste exemplo os extractos utilizados foram após clarificação submetidos a liofilização para eliminar água. As espécies de massas detectadas nos controlos, i.e. no extracto de cultura do fungo crescido na ausência do solvente iónico e na presença de 0,05 M de NaCl ou nos líquidos iónicos não são consideradas. P. olsonii Novas espécies de massas C2mimCl 179. 216. 666, 736 C2mimC2H5S04 210. 273 C2mimSCN Inibição do crescimento MBPyrrolCl 137, 179, 210, 238, 257, 296, 358 27 C4PyCl 125, 161, 210, 311, 325, 430, 480, 530, 607, 631 ChCl 179, 216. 456

Neste caso especifico dos 6 líquidos testados, a adição ao meio de crescimento do fungo do solvente C2mimSCN impediu o desenvolvimento do micélio. Nos restantes líquidos, a presença do solvente iónico induziu, relativamente ao controlo crescido na presença de NaCl, e com ubiquidade, o aparecimento de novos metabolitos, o que se demonstra no perfil das espécies de massas detectadas por espectroscopia de massa (ESI). Aparentemente, a diversidade de novos metabolitos foi tanto maior quanto mais hidrofóbico o solvente iónico, i.e. na presença dos solventes iónicos hidrofílicos (bastante solúveis em água) C2mimCl, C2mimC2H5S04 e o ChCl o número de novos metabolitos é menor do que no caso dos solventes mais hidrofóbicos: C4PyCl e do MBPyrrolCl. Neste exemplo algumas das massas detectadas não são específicas, i.e. a mesma espécie de massa é produzida pela cultura em diferentes líquidos iónicos (ver massas sublinhadas).

Exemplo 2

Um isolado fúngico, Tríchoderma longíbrachíatum, foi utilizado como organismo vivo para monitorizar o efeito de diferentes líquidos iónicos no espectro de metabolitos sintetizados pelo fungo durante o crescimento.

Utilizou-se o mesmo meio de cultura do exemplo 1 que foi suplementado com 0,05 M de cada um dos líquidos em teste. A título de exemplo foram utilizados os seguintes líquidos: Cloreto de Etil-Metilimidazólio (C2mimCl), Cloreto de Butil-Metilimidazólio (C4mimCl), Cloreto de Colínio (ChCl), Cloreto de Metil-Butilpirrolínio (MBPyrrolCl), Cloreto de 28

Butilpiridínio (CíPyCl), Tiocianato de Etil-Metilimidazólio (C2mimSCN); Etil sulfato de Etil-Metilimidazólio (C2mimC2H5SC>4) 0 meio de cultura contendo 0,05 M de solvente iónico foi inoculado com a suspensão de esporos de T. longibrachíatum (105 esporos por mL) utilizando o método de pesquisa rápida em microplacas de 96 poços como mencionado no exemplo 1. As condições de incubação (idênticas à do ex. 1) mantiveram-se constante até a cultura atingir a fase estacionário (~2 semanas após inoculação). A constituição do extracto de cultura filtrado, i.e. a diversidade de metabolitos fúngicos, foi analisada (ESI-MS) e comparada com a composição de extractos de cultura do fungo crescido no mesmo meio de cultura sem liquido iónico contendo 0,05 M de cloreto de sódio. O efeito da adição de cada base e de cada ácido utilizado na sintese dos diferentes solvente também foram pesquisados.

Quando a cultura atinge a fase estacionária, o extracto de cultura foi recolhido, clarificado e concentrado como descrito no exemplo 1. As espécies de massas detectadas nos controlos, i.e., no extracto de cultura do fungo crescido na ausência do solvente iónico e na presença de 0,05 M de NaCl ou nos liquidos iónicos não são consideradas.

Na tabela seguinte estão indicadas todas as novas espécies de massas que possuem origem fúngica (detectadas em modo negativo ESI-MS) relativamente ao mesmo perfil obtido quando a cultura foi crescida em meio contendo 0.05 M de

NaCl. 29 T. longibrachiatum Novas espécies de massas C2mimCl Inibição do crescimento C2mimC2H5S04 Inibição do crescimento C2mimSCN Inibição do crescimento MBPyrrolCl 137, 165, 198, 210, 238, 284, 300, 358, 372, 456, 478 C4PyCl Inibição do crescimento ChCl 120, 155, 228

Neste caso especifico dos 6 líquidos testados, a adição ao meio de crescimento do fungo dos 3 solventes contendo o catião C2mim, portanto C2mimSCN, C2mimC2H5S04j C2mimSCN, impediu o desenvolvimento do micélio. O solvente C4PyCl também impediu na concentração testada o desenvolvimento do micélio. Nos restantes líquidos, a presença do solvente iónico induziu, relativamente ao controlo crescido na presença de NaCl, e com ubiquidade, o aparecimento de novos metabolitos, o que se demonstra no perfil das espécies de massas detectadas por espectroscopia de massa (ESI). Aparentemente, a diversidade de novos metabolitos nas culturas onde houve crescimento foi mais uma vez tanto maior quanto mais hidrofóbico o solvente iónico, por exemplo, no caso do líquido ChCl o número de novos metabolitos é menor do que no caso do MBPyrrolCl. Neste exemplo todas as massas detectadas são específicas para a combinação fungo versus solvente iónico.

Referências bibliográficas 1. Oliveira, A, Peres, G, Correia Pires, J, Silva Pereira, C, Vitorino, S, Figueiredo Marques, J, Barreto Crespo, M, and San Romao, M. Cork stoppers industry: defining appropriate mould colonization. Microbiol Res 2003; 158(2): 117-24. 30 2. Silva Pereira, C, Pires, A, Valle, M, Vilas-Boas, L, Figueiredo Marques, J, and San Romão, M. Role of Chrysonílía sítophíla on the quality for cork stoppers for sealing wine bottle. J Ind Microbiol Biotech 2000; (24): 256-261. 3. Silva Pereira, C, Soares, G, Oliveira, A, Rosa, M, Pereira, H, Moreno, N, and Romao, M. Effect of fungai colonization on mechanical performance of cork. Int Biodeter Biodegr 2006; 57(4): 244-250. 4. Basilio, MG, Gaspar, R, Silva Pereira, G, and San Romão, MV. Penícíllíum glabrum cork colonising isolates - preliminary analysis of their genomic similarity. Rev Iberoam Micol 2006; 23(3): 151-154. 5. Kis-Papo, T, Oren, A, Wasser, SP, and Nevo, E.

Survival of Filamentous Fungi in Hypersaline Dead Sea Water. Microb. Ecol. 2003; 45: 183-190. 6. Kis-Papo, T, Kirzhner, V, Wasser, SP, and Nevo, E. Evolution of genomic diversity and sex at extreme environments: Fungai life under hypersaline Dead Sea stress. PNAS 2003; 100(25): 14970-14975.

Lisboa, 25 de Maio de 2007

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de biocatálise fúngica caracterizado por se fazer crescer a estirpe do fungo seleccionado num meio de cultura suplementado com líquidos iónicos solúveis em água, compreendendo os seguintes passos: a) adição de um líquido iónico a um meio de cultura especifico para a indução do crescimento de fungos; b) inoculação do meio de cultura suplementado com um líquido iónico com material de multiplicação do fungo seleccionado, como por exemplo esporos; c) recolha dos metabolitos produzidos pela cultura de fungos; d) análise dos metabolitos recolhidos.

2. Processo de biocatálise fúngica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de cultura usado para o crescimento do fungo ser preferencialmente um meio pobre semi-sintético suplementado com cerca de 1% de uma fonte de carbono.

3. Processo de biocatálise fúngica, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o meio de cultura usado para o crescimento do fungo conter uma fonte de lenhina e/ou suberina e/ou cutina, como por exemplo, pó de cortiça.

Processo de reivindicação solubilizado anião e um acordo com a líquido iónico composto por um funcionalidades biocatálise fúngica, de 1, caracterizado por o no meio de cultura ser catião que transportam 4 .

5. 2 orgânicas especificas, tais como as que conferem hidrofobicidade /hidrofilicidade e/ou lipofobicidade/lipofilicidade aos iões.

Processo de reivindicação concentração infinita e 10 biocatálise fúngica, de acordo com a anterior, caracterizado por a molar do líquido variar entre diluição M. Processo de reivindicaçõe do fungo sele semi-contínua 6. biocatálise fúngica, de acordo com as s anteriores, caracterizado por a cultura ccionado poder decorrer de forma contínua, ou descontínua.

7. Processo de biocatálise fúngica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a recolha dos metabolitos produzidos pela cultura do fungo seleccionado em meio suplementado com líquidos iónicos, se realizar através da utilização de um solvente orgânico imiscível no liquido iónico, como por exemplo o etilacetato. biocatálise fúngica, de anteriores, caracterizado síntese de metabolitos em

8. Utilização do processo de acordo com as reivindicações por ser aplicado à indução da cultura de fungos.

9. Utilização do processo de acordo com as reivindicações por ser aplicado à indução de de metabolitos fúngicos. biocatálise fúngica, de anteriores, caracterizado novas vias biossintéticas Lisboa, 25 de Maio de 2007