PT101152A - Composicoes detergentes enzimaticas inibidoras da transferencia de corantes - Google Patents

Description

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COMPOSlçOES DETERGENTES -ENZIMATICAS INIBIDORAS DA TRANSFERÊNCIA DE CORANTES

Campo da Invenção A presente invenção refere-se.a uma composição enzimática-para inibição ria transferencia de corantes de um tecido tinto para outro tecido, durante a lavagem,.

Antecedentes da Invenção Um dos problemas mais persistentes e mais complicados que se levantam durante as operações de lavagem dos tecidos modernos, é a tendência que alguns tecidos tintos tSm libertar o corante nas 'soluções de lavagem. D corante é assim transferido para outros tecidos que estejam a ser simultaneamente lavados»

Urna formai de ultrapassar este problema seria retirarem por meio de branqueamento, os corantes saídos dos tecidos tintos, antes de eles terem a oportunidade de se fixarem aos outros artigos presentes na lavagem»

Os corantes suspensos ou solubilizados podem sofrer um certo grau de oxidação na solução por meio do emprego de agentes branqueadores conhecidos» A patente ΘΒ E 101 167 descreve uma composição branqueadora líquida estável que contem.um percursor de peróxido de hidrogénio que é activado para libertar peróxido de hidrogénio na N - diluição» é no entanto importante que, ao mesmo tempo, não se branqueiem os corantes existentes realmente nos tecidos, isto é, que? não se danifiquem as cSres. A Patente Norte-americana A«077.768 descreve um processo para a inibição da transferencia de corantes palmeio da utilização de um agente branqueador oxidante, juntamente com compostos catalíticos tais como porfinas de p

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 fervo r. 0 Pedido de Patente Norte-americano 421.414 descreve peroxidases e oxidases utilizadas para a oxidação de substâncias orgânicas ou inorgânicas, incluindo substâncias tingidas. Uma composição inibidora da transferência de corantes constituída por sistema enzimâtico capaz de gerar peroxidase.de hidrogénio e catalizadores de ferro, foi descrita no Pedido de Patente Europeia copendente 91202655.6 depositado em 9 dè OUtubro de 1991. A patente EP 424 398-A descreve um aditivo detergente capaz de exercer um efeito de branqueamento que compreende uma peroxidase. O aditivo compreende ainda um ou mais enzimas, particularmente uma lipase, protease, amilase ou uma celulase» A patente EP-A-350 098 descreve um método C14CMC que define critérios de selecção de celulase que são relevantes para aplicação em detergentes. Verificau~se que um mínimo de 10% de remoção de carboximetilcelulose imobilizada radioactivamente marcada de acordo com o método CMC a 25x:L0'6K em peso de proteína da celulase na solução de ensaio, proporciona uma elevada celulase activa. Um grupo de celulase preferido, que cabe na definição de elevada actividade,· de acordo com a presente invenção, foi descrito no Pedido copendente de Patente Dinamarquesa N2 1159/90 depositado em 5 de Maio de 1990. Descreve-se 'aí uma . preparação de celulase essencialmente constituída por uma componente de endoglucanase homogénea, que é imunoreactivo com um anticorpo monoclonal criado contra uma celulase de 43 kD parcialmente purificada, derivada do Humicola insolens DMÍ800. Verificou-se agora, surpreendentemente, que a eficiência da peroxidase, em termos de inibição da transferência de corantes, é consideravelmente ampliada por 35 1 *5 10 15

Mod. 71 - 20.000 «. - 90/08 20 / meio da utilização da referida celulase de alta actividade e mais pariicularmente a preparação de celulase específica descrita no Pedido copendente de Patente Dinamarquesa N9 1159/90. Constitui portanto um objecto da presente invenção, proporcionar composições inibidoras da transfertncia de corantes que apresentem um índice óptimo de transfertncia de corantes nos líquidos de lavagem, por meio da utilização das referidas celulase e peroxidase de altas actividades de celulase e peroziçjase. De ãcarda com uma forma de realização desta invenção, proporciona-se uma composição inibidora da transferência de corantes que compreende uma preparação de celulase que é economicamente eficaz, por exemplo com a utilização de, por exemplo, técnicas de ADN recombinan te De acordo com outra forma de realização desta invenção, proporciona-se igualmente um processo para operações de lavagem que envolvam tecidos tintos. Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma composição inibidora da transferência de corantes constituída por um enzima que apresenta actividade de peroxidase, um peróxido de hidrogénio ou um percursos de peróxido de hidrogénio ou um sistema enzimático capaz de gerar peróxido de hidrogénio, um substrato oxidável adicional e uma celulase, caracterizado por a celulase proporcionar pelo menos 10¾ de remoção de carboximetil celulose imobilizada radioacti.vam.ente marcada de acordo com o método C14CMC a 25xl0“65í em peso da solução de ensaio de lavagem.

De acorda com & presente invenção, uma celulase 4· T 1 65552

preferida é constituída essencialmente por - um componente homogénio tie endoglucanase que é imunoreactivo com um anticorpo monoclonal criado contra uma celulase de A3kD parcialmente purificada, derivada de Humicola insolens DM1800. 10 15

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Descrição pormenorizada da Invenção CELULASE A actividade dos enzimas e particularmente a actividade do enzima da celulase, foi definida para várias aplicações por diferentes' métodos analíticos,, Esses métodos tentam todos proporcionar uma avaliação realística do desempenho esperado em utilização, ou pelo' menos uma medição que se relacione com o desempenho em utilização. Conforme foi descrito pormenorisadamente no Pedido de Patente Europeia EP--A--35009S, muitos dos métodos, particularmente os frequentemente usados . pelos fabricantes de celulase, não se encontram suficientemente relacionados com o desempenho em utilização da celulase em composições detergentes para lavandaria. Isto deve-se às outras condições de utilização para as quais esses métodos de medição da actividade foram desenvolvidos. D método descrito no EP--A-350098, foi desenvolvido para ser e para ter uma correlação preditiva para a hierarquia da actividade de celulase nas composições detergentes para lavandaria» A presente invenção utiliza, por isso, o método descrito no EP-A-350098, para investigar as celulases a fim de distinguir as celulases que são Citeis na presente invenção daquelas que não proporcionarão os objectivos da presente invenção. 0 método de detenção, daqui em diante referido como Método C1A-CMC, que foi adaptado do-método descrito no EP-A-350098, pode ser descrito como segues 35 1 1 1 1 5 10

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Principio s · 0 princípio'do Método C14CMC para investigar é medir, a uma concentração de celulase definida numa solução de lavagem, a remoção da carboximetil celulose imobilizada (CMC) de um substrato de tecido» A remoção da CMC é medida por meio de marcação radioactiva de alguma da CMC* por meio da utilização de carbono C14 radioactivo „A simples contagem da quantidade de C14 radioactivo existente no substrato de tecido, antes e depois do, tratamento com celulase» permite a avaliação da actividade da celulose»

Preparação das amostrast

Preparação da CMC: A solução base da CMC radioactiva é preparada de acordo com o Quadro I» A CMC radioactiva pode ser obtida pelos métodos referidos no EP-A-35Q09S»

Substratos de tecidos Os substratos de tecido são constituídos por mechas de algodão egípcio com um tamanho de 5cm x Sem» São inoculados, no seu centro, com 0,35 ml da slução de base com CMC marcada radioactivamente» As mechas de algodão egípcio são então secas ao ar,

Imobilização da CMC! Para imobilizar a CMC radioactivamente marcada nas mechas de algodão egípcio, ê usado equipamento lavandométrico "Linitest Original -Haunau", fabricada por Original Haunau, Alemanha. Um frasco da metal do lavandómetro ê cheio com 400 ml de água dura (4 mmol/litro de ices de Ca*+) » Pode ser utilizado um número máximo de 13 mechas por jarro. 0 jarro ê a seguir incubada num ciclo de aquecimento progressivo de H0°C a &0°C, durante 40 minutos, -num equipamento lavandométrico„ Após a incubação, as mechas são en«aguadas com água corrente de cidade durante 1 minuto. São espremidas s deixadas secar ao ar durante pelo menos 30 minutos» De acordo com as amostras EP—A—350Q98 das mechas com 6 35 τ 5 10 16

65555 a CMC radioactiva imobilizada podem ser também medidas como "amostras em branco", sem lavagem»

Mod. 71 - 20.000 ex. - 70/08 20 25 30 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS; Solução de ensaio de lavagems A solução de ensaio de lavagem é preparada de acordo com a composição do Quadro II. έ equilibrada até um pH de 7,5. A solução de ensaio de lavagem é a base a que adiciona uma amostra para o ensaio dá celulase. Dever-se-â ter o cuidado de não diluir a solução de ensaio de lavagem por meio da adição de água até 100H de equilíbrio, antes de se ter determinado qual a quantidade de celulase a ser adicionada. A quantidade de celulase que é utilizada nesta? ensaio de detecção, deverá ser adicionada de forma a fornecer Ξ5 x IO-6 em peso por cento de proteína de celulase, na solução de ensaio tíe lavagem (equivalente a 0,25 miligramas/litro a Processo de lavagem: As mechas assim inoculadas com CMC radioactivamente marcada, são então tratadas num processo de simulação de lavagem» 0 processo de lavagem é simulado no equipamento tipo lavandómetro, "Linritest, Original Haunau" fabricado pela Original Haunau, Haunau, Alemanha» Uma mecha individual é colocada num tubo de vidro de 20cm3« 0' tubo é cheio com 10 ml de solução de ensaio'de lavandaria e depois selado de maneira estanque aos líquidos» Em cada frasco lavandométrico são colocados até 5 frascos» 0 frasco é cheio com água, como meio de transf erSnc ia do calor para a simulação da lavagem» A simulação da lavagem é efectuada sob a forma de um ciclo de aquecimento progressivo desde 20°Ό a 60,:>C, ao longo de 40 minutos. Após o processamento das amostras, os frascos são submersos em água fria e pósteriòrmente cada uma das mechas ê extraída do. seu frasco, enxaguada numa proveta com água 7 35 T 5 10 15

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65555 macia corrente, espremida e deixada secar ao ar durante pelo menos 30 minutos„ iv!sd leão !! Para se medir a remoção .da CMC marcada radioactivamente, é usado um contador de cintilação, por exemplo um LKB 1Ξ10 U1 trabéta Seiritillation Counter. A "fim de se obterem resultados mais precisos, dever-se-á seguir o manual de contador con tador instruções para o funcionamento óptimo daquele particular de cintilações. Por exemplo, para o

de cintilações Ultrabeta LKB 1 21 0,0 deve ser seguida a seguinte procedimento. A mecha a ser medida ê colocada num ' frasco de plástico cheio com 12 ml de liquido cintilador <por exemplo, cintilador 299 da Packard). A amostra é então deixada estabilizar durante pelo menos 30 minutos. 0 frasco é então colocado dentro do LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter e obt'§m-se as .respectivas contagens de radioactivaidade para a mecha. Para se. medir a quantidade da remoção da CMC devida apenas à celulase, é necessária uma medição de uma mecha que tenha sido inoculada ao mesmo tempo, mas que tenha sido tratada na solução de ensaio de lavagem sem celulase. A actividade da celulase é então expressa como percentagem da remoção da CMC radioactivamente marcada.Esta percentagem é calculada por meio da seguinte fórmulas % de remoção da CMC radioac ti va. = XO -· XC x 100 X0 onde XO é a contagem da radioactividáde por cintilação de uma mecha tratada com a solução de ensaio de lavagem sem celulase XC éa contagem de cintilação radioactiva de uma mecha tratada com a solução de ensaio de lavagem que contem a celulase a ser avaliada. β 35

Gonslderasges^stajy^tic^^ A fim de se proporcionarem resultados estatisticamente seguros,, dever-se-á empregar uma análise tu estatís tica. padrao „ Para o exemplo dado., com a utilização do Ultrabeta Scintillation Counter (Contador de Cintilação IJltrabeta) LKB 1210, verificou-se que se pode utilizar um tamanho de amostra de 3 mechas para cada contagem da radioactividade por cintilação» A fim de se confirmar o processo por meio de uma contra-prova interna, recomenda-se a medição e cálculo da "amostra em branco" de acordo com a EP-A—350098Isso permitirá detectar e eliminar erros»

Interpretação de resultados; 0 ensaio de detecção descrito proporciona um método rápido , único e seguro para identificar celulases que satisfazem os critérios de actividade da presente invenção, contra as celulases que não fazem parte da presente invenção»

Verificou-se que uma remoção de 10% ou mais da CMC radioactivamente marcada imobilizada de acordo com o método Ci^iCMC acima indicado, indica que a celulase respectiva satisfaz as exigtncias da invenção»

Será óbvio para os técnicos do ramo que as percentagens de remoção situadas acima de 10%, indicam uma actividade mais elevada para a respectiva celulase» É por isso considerado que a celulase que proporcione mais de S5% ou preferivelmente mais de 50% de remoção da CMC radioactivamente marcada, na concentração de proteínas na solução de ensaio de lavagem de acordo com o método Clá-CMC, tu fornecerá indicaçao de um desempenho da celulase ainda melhor na utilização em detergentes para lavandaria»

Foi igualmente considerado que a utilização de 9 T τ T τ 1 10

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 65555 concentrações mais elevadas de celulase para o método C14CMC, forneceria percentagens de remoção mais elevadas» Não obstante,, não existe nenhuma relação linear provada entre a concentração da celulase e a percentagem de remoção obtida por intermédio dela»

Foi igualmente considerado que a utilização de concentrações mais elevadas de celulase para o método C14CMCS forneceria percentagens mais elevadas de remoção»

Quadro I s Solução base de CMC marcada com Clít radioactivo (Todas as percentagens em peso da solução total)

1 CMC# Total (a CMC deverá I sor de grau detergente» com um grau de substituição de entre cerca de 0/+7 e cerca de 0,7) 99 j,S >! 10-aK ' Etanol .17+985,,12 m 10-3½ 1 Aaua desionizada 84915.68 >í 10-3¾ ' I Tq te 11........ 1 ÔO% S >ί; A CMC total contém CMC radioactiva e não-radioactiva,, para proporcionar uma radioactividade que permita leituras suficientemente claras . no contador de cintilação utilizado,, Por exemplo,, a CMC radioactiva pode ter uma actividade de 0?7 milicuries/g e estar misturada com CMC não radioactiva numa proporção de 1 a 6 p7 ,, 10 35

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 T .1 65555 1 Quadro 11 s Solução de ensaio de lavandaria (todas as percentagens em peso da solução total) 6 Acido Cla alquil benseno sul fónico O 1-* Ι—5· O Alquil sulfato de coco (sal TEA) 0 ,040¾ Etoxilato de alcoól Cia_is (E0?) 0,100% Acido gordo de coco 0,100% 10 Acido oleíco 0,050% Acido cítrico 0,010% Tr ie tanolamina 0 ,040% Etanol 0,000% 16 Propanedioi 0,015% Hidróxido de sódio 0 ,030% Formato de sódio 0,010% Protease 0,,006% 20 Agua (2,5 mmol/litro ca") ,agente de ajustamento do pH (soluções de HCL ou NaOH> e celulase Restante para 100% 25 De acordo com a presente invenção, as celulases preferidas são as semelhantes «is descritas no Pedido de Patente Dinamarqts 1159/90. Por exemplo,, uma preparação de 30 celulase útil nas composições da invenção, pode ser essencialmente constituida por um componente homogéneo de endoglucanase, que é iraunoreactivo com um anticorpo criado contra uma celulase de 43kD altamente purificada, derivada do 35 Humicola insolens, DSM 1800, ou que seja homóloga à referida 11

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 endoglucanase de 43kD. . Deverá salientar-se que todos os enzimas·, de celulase de. acordo com a presente invenção., t'ê'm de preencher os critérios do ensaio, de detecção acima referido» No entanto,t no Pedida de Patente Dinamarquês 1159/90, são estabelecidos critérios adicionais que, em combinação com o presente ensaio de detecção, permitem identificar enzimas de celulase preferidos» Preparações de celulase particularmente úteis nas composições da presente invenção, são aquelas em que, além do ensaio de detecção, o componente de endoolucanase apresenta uma actividade de endoase CMC de, pelo menos, cerca de 50, prefer ivelmente pelo menos cerca de 60, especialmente cerca de 90 unidades de endoase CMC por mg da proteína, total» Um componente de endoglucanase preferido apresenta, particularmente, uma actividade de endoase CMC de, pelo menos, 100 unidades de endoase CMC por miligrama de proteína total» No presente contento, o termo "actividade de endoase CMC.Ícevu) refere-se à actividade de endog lucanase do componente de endoglucanase, em termos da sua capacidade para degradar a celulose em glucose, celobiose e triose, conforme determinado pela diminuição da viscosidade de uma solução de carboximetil celulose <CMC), após incubação com a preparação de celulase da invenção, conforme descrito pormenorizadamente abaixo» . A actividade de endoase CMC íendoglucanase) pode ser determinada a partir da diminuição da viscosidade da CMC, conforme segues Prepara-se uma solução de substrato contendo /•*£3? g/1 de (I :MC <He.r -cules 7 LFD) em 0,1 M de tampão t? - is a pH 9,0» A amostra do enzima a ser analisada é d.is soIvlds nesse mesmo tampão. 10 ml de solução de substrato e 0,5 ml de soluç ão de enzima são

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Mod. 71 - 20.000 ex. · 90(08 20 25 30 misturados e transferidos para um viscosímetro (por exemplo, um Haake VT 181, com sensor IMV, a 181 rpm), termostatados para 4Q°C. As leituras de viscosidade são obtidas logo que possivel após a mistura e de novo 30 minutos mais tarde» A quantidade de enzima que reduz a viscosidade a metade, nestas condições é definida como 1 unidade de actividade de endoase CMC» A electroforese em geleia de poliacrilamida de SDS ÍSDS~PABE> e a focagem isoeléctrica com proteínas alvo de uma maneira conhecida dos técnicos do ramo, foram utilizadas para determinar o peso molecular e o ponto isoeléctrico <pl>, respectivamente, do componente de endoglucanase na preparação de celuiase útil no presente contexto» Desta forma, o peso molecular de um componente específico de endoglucanase foi determinado como sendo de 43kD» D ponto isoeléctrico desta endoglucanase foi determinado como sendo de cerca de 5,1» A actividade de celo-bio-hidrolase pode ser definida como sendo a activ-idade que tende para a p— nitrofenil celobiose. A actividade é determinada como pmole de nitrofenil libertada por minuto a 37*C e pH 7,0. Verificau-se que o presente componente de endoglucanase nlo tinha praticamente. nenhuma actividade de celo-bio-hidrolase. O componente de endoglucanase na presente preparação de celuiase, foi inicialmente isolado por meio de processos extensivos de purificação, envolvendo, por exemplo, purificação por CLAP (Cromatografia Liquida de Alta Pressão) de fase invertida de uma mistura em bruto de celuiase de H»insolens de acordo com a patente Norte-americana 4»435„307. Este processo resultou, surpreendentemente, no isolamento de uma endoglucanase de 43kD, como único componente com propriedades inesperadamente 13 35 1 i 5 10 16

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favoráveis» devido a uma actividade de endoglucanase su.rpreendentemente elevada. Da mesma forma , além do ensaia de detecção, os enzimas de celulase úteis nas presentes composições podem ainda ser definidos como enzimas que apresentam actividade da endoglucanase <no seguimento, referidos como "enzimas de endoglucanase">, enzimas esses que têm a sequência de aminoácidos' representada na Lista de Sequências ID#2 anexa, ou um seu homólogo que apresente actividade de endoglucanase» No presente contexto, o termo "homólogo" pretende indicar um polipéptido codificado pelo ADN que hibrída è. mesma sonda como a codificação do ADN para o enzima de endoglucanase com esta sequência, sob certas condições especificadas <ta.is como o embebimentõ prévio com SxSSC e pré-hibridação durante 1 h a 40C'C, numa solução de £0% de formamida, 5x de solução de Denhardt, 50 mH de fosfato de sódio, pH 6,8 e 50 pg de ADN de timo de vitela soniçado e desnaturada, seguido de hibridação na mesma solução, suplementada com 100 μΙΊ de ATP durante 18 h a 40°C)» 0 termo pretende incluir derivados da sequência anter ior mente mencionada, obtida por adição de um ou mais resíduos de aminoácido» a um oú a ambos os C- e N- terminais da sequência nativa, substituição de um ou - mais resíduos de aminoácidos em qualquer uma ou em ambos os locais da sequência de aminoácidos nativa deleçao de pm ou mais resíduos de aminoácidosem qualquer uma ou ambas as extremidades da sequência de aminoácidos ou num ou mais locais dentro da sequência nativa, ou inserção de um ou mais residuos de aminoácidos numa ou mais localizações na sequência nativa. 0 presente enzima de endoglucanase pode ser um enzima produzivel por espécies Humicola tais como o Humicola 14- 35 1 5 10 15

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insolens» por exemplo a estirpe DSM 1800, depositada em 1 de Outubro de 1981 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-33Q0 Braunschweig, (RFA) Alemanha, de acordo com o determinado no Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Processamento de Patentes (o Tratado de Budapeste) CBudapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patente Procedure (the Budapest Treaty)"]. Ainda num outro aspecto, os enzimas de celulase aqui utilizáveis podem ser definidos, para além do ensaio de detecção, como enzimas de endoglucanase que possuem a sequência de aminoácidos representada na Listagem de Sequências ID#4 anexa, ou um seu homólogo (conforme definido acima) que apresente uma actividade de endoglucanase. 0 referido enzima de endoglucanase pode ser um que seja produzível por - uma espécie de Fusarium, tal como o Fusarium oxvsporum. por exemplo a estirpe DSM Bó?2, depositado . em 6 de Junho de 1983 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 18, D-3300 Braunschweig , (RFA) Alemanha, de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste» Além disso, considera-se que podem derivar-se endoglucanases homólogas de outros microrganismos que produzem enzimas celulóticos, por exemplo espécies de Tr ichoderma . Mvce 1 lophthoraPhanerochaeteSchizophvl Ium Penic 111ium . Aspergi 1 lus, e Beotr icum Para a preparação industrial da presente preparação de celulase é, no entanto, preferido empregarem-se técnicas de ADIM recombinante ou outras técnicas que envolvem ajustamentos de fermentações ou mutação dos microrganismos envolvidos, para assegurar a sobreprodução das actividades enzimáticas desejadas. Tais métodos e técnicas são conhecidos 15 35 1 5 10 15

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na industria e podem facilmente ser executados pelos técnicos do ramo . 0 componente de endoçjlucanase pode assim ser um que se possa produzir por um método constituído pelo cultivo de uma célula hospedeira transformada por um vector ADN recombinante portador de uma sequência ADN que codifica o referido componente dê endoglucanase, ou um percursor do referido componente de endog lucanase., bem como sequências de ADN que codificam funções, que permitem a expressão da sequência de ADN que codifica o componente de endoglucanase ou um seu percursor , num meio de cultura e sob condições que permitam a expressão do componente de endoglucanase ou do seu percursor e a recuperação do componente de endoglucanase de d en tr o d a c u 1 tur a » Construções de ADN que compreendem uma sequência de ADN codificadora de um enzima de endoglucanase conforme descrito acima, ou uma forma percursora do enzima, incluem as construções de ADN que têm a sequência de ADN conforme se encontra representada na Listagens de Sequências ID#1 e JD#3 anexa, ou uma sua modificação. Exemplos de modificações adequadas da sequência de ADN são as substituições nucleótidas .que não dão origem a ou tra sequência de amxnoãcido de endoglucanase, mas que correspondem à utilização como codão do organismo hospedeiro em que ct construção de ADN é introduzida ou a substituições nucleótidas que originam uma sequência de aminoácidos diferente e por isso, possivelmente, uma estrutura diferente de proteína que poderá, dar origem a uma endoglucanase mutante com propriedades diferentes do enzima nativo. Outros exemplos de modificações possíveis são a inserção de um ou mais nucleótidas em cada uma das extremidades da sequência, ou a deleção de um ou rnaís nucleótidas em qualquer uma das extremidades ou no interior ló 35 1 5 10 65555

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 da sequ'§nc ia» As construções d.e ADN que codificam os enzimas de endoglucanase utilizáveis .aqui, podem ser preparadas sinteticamente por meio de métodos normalizados estabelecidos, por exemplo* o método da fosfoamidite descrito por 5.L» Beaucage e Μ«H.Caruthers, Tetrahedron Letters gg„ 1981, pp.1859-1869, ou o método descrito por Matthes e outros, EiiBO Journa 1 3. 1984, pp. S01-S05, De acordo com o método da fosfoamidite, os oligonucleótidos são sintetizados, por exemplo num sintétizador automático de ADN, purificados, extintos, ligados e clonados em vectores adequados. Uma construção de ADN que codifica o enzima de endoglucanase ou um seu percursor pode, por exemplo, ser isolado por meio do estabelecimento de uma bibliotéca de ADNc ou genómica de um microrganismo produtor de ce 3. ui ase, tal como o Humico la inso lens. DSM 1800 e detecção de clones. positivos por meio de procesos convencionais, tal como por hibridação por meio da utilização de sondas oligonucleótidas sintetizadas na base de uma sequfncia completa ou parcial de aminoácido da endog .'Lucanase, de acordo com técnicas normalizadas (cf«Sambrook e outros, Molecular Cloning s A__Laboratorv Manua 1. Sâ Ed. Cold Spring Harbor, 1989), ou por meio de selecção de clones que expressem a actividade enzimática apropriada (isto é, actividade de endoase de CMC conforme definido acima) ou por meio de selecção dos clones produtores da proteína que reage com um anticorpo contra uma celulase nativa (endoglucanase). Finalmente, a construção de ADN pode ser de origem mista sintética e genómica, mista sintética e de ADNc preparada por meio da ligação dos fragmentos de origem sintética, genómica e de ADNc (conforme fôr apropriado), correspondendo osfragmentos às várias partes 35 17 -1

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Mod. 71 · 20.000 et. - 90/08 20 25 30 de toda a construção do ADN de acorda com técnicas normalizadas. A construção de ADN pode também ser preparada por meio de reacção da cadeia de polímeras© utilizando-se iniciadores específicos,, por exemplo . conforme descrito na Patente Norte—americana 4.683.202 ou R.K.Saiki e outros», Science 539·,, 1988, pp. 487-491. Os vectores de expressão, recombinantes em que as construçSes de ADN acima são inseridas, incluem qualquer vector que possa convenientemente ser sujeito a processos recombinantes de ADN e a escolha do vector dependerá muitas vezes da célula hospedeira em que é para ser introduzido. Assim, o vector pode ser um vector autónomamente replicante, isto ê, um vector que exista como uma entidade extra-cromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómicà, por exemplo um plasmídio. Alternativamente, o vector pode ser um que, quando, introduzido numa célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o(s) cromossoma(s) em que tenha sido integrado. No vector, a sequência do ADN que codifica a endoglucanase deverá estar operacionalmente ligada a uma sequência promotora e terminadora adequada» A sequência promotora pode ser qualquer sequência de ADN que apresente uma actividade. transcritiva na célula hospedeira escolhida e pode ser derivada de genes codificadores de proteínas, tanto homólogos como heterólogos da célula hospedeira. Os processos usados para ligar, respecti-vamente, as sequências de ADN que codificam a endo-g lucanase, a sequência promotora e a terminadora e para as inserir em vectores adequados, são bem conhecidos dos técnicos do ramo (cf, por exemplo, Sambrook e outros, obra citada)» As células hospedeiras que são transformadas com 18 35

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1 5 10 15 20 25 30 as construções de ADIM ou os vectores de expressão acima indicados,, podem pertencer, por exemplo, a uma espécie de Aspergi 1lus. ma is preferivelmente Asperáillvs prvzae ou Asoergi1lus nioer. As células de fungos podem ser transformadas por meio de um processo quê envolve a formação e a transformação protoplâstica dos protoplastoe, seguidas pela regeneração da parede da célula de uma maneira em si jâ conhecida. 0 uso do Asperg.il lus como um microrganismo hospedeiro encontra-se descrito na EP 238 023 (da Novo Industri A/S), cujo conteúdo é aqui incorporado como referência. A célula hospedeira pode também ser uma célula de levedura, por exemplo, de uma estirpe de Saccharomvces cerevisae. AIternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma bactéria, em particular estirpes de S-treotomvces e Bac11lus e E.co1i. A transformação das células bacterianas pode ser executada de acordo, com métodos convencionais, por exemplo, conforme descrito em Sambrook e outros», Molecular Cloninqs A Laboratorv Manual·,. Co 1 d Spring Harbor, 1989» ' 0 rastreio das sequências de ADN apropriadas e a construção dos vectores podem também ser efectuados por meio de processos norma 1izados, cf» Sambrook e outros, obra citada. 0 meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional adequado ao desenvolvimento das células hospedeiras em questão. A endoglucanase expressa pode ser convenientemente segregada no meio de cultura e pode ser recuperada dò mesmo Por„ meio de procedimentos bem conhecidos, que incluem a separação das células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteinicos do meio por intermédio de um sâl, tal como o sulfato de 19 35 1 -1

amónio, seguido de processos crornatográficos tais como cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade ou seme1han tes» 6 *F'or meio de técnicas de ADN recombinante, conforme acima indiçadasg técnicas de purificação de proteínas, técnicas de fermentação e mutação e outras técnicas que são bem conhecidas no ramo, é possivel proporcionarem-se endoglucanases de elevada pureza» 10 0 nivel de celulase da presente composição descrita acima deverá ser tal que a quantidade da proteína de enzima a ser libertada na solução de lavagem seja de entre 0,005 e 40 mg/litro de solução de lavagem preferivelmente 0,01 a 10 mg/litro de solução de lavagem» 16

Mod. 71 - 20.000 ac. - 90/08

FEROXIPASES 25

As peroxidases que podem ser empregues com a presente finalidade, podem ser isoladas de e ser produzidas por plantas (por exemplo, -peróxidase de rábano silvestre) ou de microrganismos tais como fungos ou bactérias» Alguns fungos preferidos incluem estirpes pertencentes à subdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, por exemplo, Fusarium, Humico la, Tricoderna, Myrothecium, Verticillum, Anthromyces, Caldaryomices, U loc ladiumEmbellisia, Cladosporium ou Dreschlera, em particular Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucana <IF0 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Uloc ladium chartarum, EmbelTisia all-ior Dreschlera ha Iodes»

Outros fungos preferidos incluem estirpes pertencentes à subdivisão Basidiomycotina, classe Basidiomycetes, por exemplo Coprinus, Phanerochaete, Coriolus ou Trametes, em particular Coprinus cinereus 20 35 1 6 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90(08 20 25 30 65555

f.microsparus (IFO 8371), Coprinus macrarhizus, Phanerochaete chrysosporium (por exemplo, NA-12.) "ou Coriolus versicolor (por exemplo, PR4 28-A). Outros fungos. preferidos incluem estirpes pertencentes à subdivisão Zigomycotina, classe Mycoracsae, por exemplo Rhizopus ou Mucor, em particular Mucor hiemalis. Algumas bactérias preferidas incluem estirpes da ordem Actinomycetales, por exemplo Streptomyces spheroides (ATTC 23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12332) ou Streptovertici 11 um verticilUum ssp. verticillium. Outras bactérias preferidas incluem Bacillus pumillus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophi lus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudonomas purrocinia (ATCC 15958) ou Pseudomonas fluorescsns (NRRL B--11). Outras fontes potenciais de peroxidases úteis estão listadas em Et.C.Saunders e outros, obra citada.pa· 41—43„ Métodos para produzir enzimas a serem usados de acordo com a invenção encontram-se descritos na técnica, conf.por exemplo FEBS Letters 1625. 173(1). Applied and Environmenta 1 liicrobio.Loav. Fev.,1985, pp. 273-278, Applied Mic:robio 1. B io tec hno 1.26. 1987, pp „ 158-163, Biotechnoloav Letters 9 (5), 1987, pp» 357-360, Nature 326. 2 de Abril de 1987, FEBS Letters 4270. 209 (2), p.321, EP 179 486, EP 200 565, 8B 2 167 421, EP 171 074 e Agr ic .Βίο! .Chem50 (1>, 1986, p »247. Peroxidases particularmente preferidas são aquelas que são activas aos pH típicos dos licores de lavagem, isto ê, a um pH de 6,5-10,5, preferivelmente 6,5-9,5 e ma is preferivelmente 7,5-9,5. Tais enzimas podem ser isolados por meio de rastreio para detecção da produção de enzima relevante, por meio de micorganismos alcalófilos, por 21 35 1

1 5 10

Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 20 25 30 exemplo utilizando-se um ensaio ABTS descrito em R»E„Ch.ilds e W „8 .BardsleyBiochem.J. :1.45. 1975,, pp. 93-102» Outras peroxidases preferidas são as que apresentam uma boa termostabilidade, bem como uma boa estabilidade em relação aos- componentes detergentes vulgarmente utilizadas, tais como 'tensio-activos não iónicos, catiónicos cu aniónicos, intensificadores de detergtncia, fosfata etc. ni Outro grupo de peroxidases úteis sao as pelas haloperoxidases, tais como peroxidases decloro e bromo . O enzima-peroxidase". pode ainda ser um conjunto que possa ser produzido por um método constituído pela cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector recoiTibínante de ADN, portador de uma sequência codificadora de ADIM do referido enzima, bem; como sequências de ADN codificadoras de funções que . permitem a expressão da sequência do ADN que codifica o" enzima, num meio de. cultura, sob condições que permitem a expressão do enzima e a recuperação do enzima da cultura» Urn fragmento de ADN codificador do enzima pode, por exemplo, ser isolado por meio do estabelecimento de uma biblioteca de ADNc ou genómica de um microrganismo produtor do enzima que interessa, como seja um dos organismos acima mencionados e rastreio para detecção de clones positivos por meio de processos convencionais tais como seja por -hibridação com sondas oligonu-cleótidas sintetizadas na base da sequtncia total ou parcial de aminoácidos do enzima, ou por selecçlo de clones que expressem a actividade enzimática apropriada, ou por meio da selecção de clones produtores de uma proteína que seja reactivá com um anticorpo contra o enzima nativo. Uma vez seleccionada, a sequência de ADN pode ser 22 35

1 5 10 16

Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 20 25 inserida num vector de expressão repiicável adequado, compreendendo sequências promotora,, - operadora e terminal adequadas, que permitem que o enzima seja expresso num organismo hospedeiro particular, bem como uma origem de replicação , impossibilitando ao vector que se replique no organismo hospedeiro em questão» 0 vector de expressão resultante pode então ser transformado numa célula hospedeira adequada, como seja uma célula de um fungo, de que exemplos preferidos são uma espécie do Aspergillus, muito preferivelmente Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. As células de fungos podem ser transf ormadas por meio de um proceso que envolve a formação e transformação protoplástica dos protoplastos, seguida pela regeneração da parede da célula de uma maneira conhecida de per si» 0 uso do Aspergillus como micorganismo hospedeiro encontra—se descrito na EP 238,023 <da Novo Industri A/3), cujo conteúdo é aqui incorporado como referência» Alternativamente, os organismos hospedeiros podem ser uma bactéria, em particular estirpes de Streptomyces e Bacillus, ou E» coli» A transformação das células bacter lanas pode ser efectuada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, conforme descrito em T.Man iatis e outros, Molecular Clonings A -Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, 1982,. A detecção das sequências de ADN adequadas e a construção dos vectores, podem ser efectuadas por processos normalizados, cf.Maniatis e'outros, obra citada. 0 meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolver as células hospedeiras em questão» 0 enzima expresso pode ser convenientemente segregado para no meio de cultura e pode ser recuperado dele por processos bem 30 * i 65555 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 e*. · 90/08 20 25 30 conhecidos,-, incluindo a separação das células do meio por (neio de centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteínicos do meio por intermédio de um sal tal como sulfato de amónio, seguidos por processos cromatográficos tais como cromatografia de troca de iões, cromatografia de afinidade ou semelhantes, A detecção das sequências de ADN apropriadas e a construção dos vectores podem também ser executadas por meio de processos normalizados, cf „ T.Maniatis e outros, obra citada„ 0 meio usado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolver as células hospedeiras .em questão, 0 enaima expresso pode ser convenientemente segregada no meio de cultura e pode ser dele recuperado por processos bem conhecidos que incluem a separaçao das células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteicos do meio por intermédio de um sal tal como o sulfato de amónio, seguidos por processos cromatográficos tais como cromatografia de troca de iões, cromatografia de afinidade ou semelhantes. Mo inicio ou durante o processo, pode ser adicionado He0a, numa quantidade de por exemplo 0,001-5 mM, particularmente 0,01-1 mM. Quando se utiliza peroxidass de Coprinus, são preferidos 0,01-0,£5 mM de He0e ® com peroxidase de B.pumillus 0,1-1 mM HB0e. 0 peróxido de hidrogénio pode ser acrescentado sob a forma de peróxido de hidrogénio ou de um seu percursor, preferivelmente um perborato ou um per carbonato,, 0 nivel de percursor de peróxido de hidrogénio que pode ser usado é dependente das propriedades especificas da peroxidase escolhida, por exemplo, a peroxidase de Coprinus deverá ser aplicada numa composição detergente que contenha menos do que £4 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 «. - 70/03 20 25 30 65555

5% de perborato» No processo da presente invenção pode ser desejável utilizar-se um processo enzimático para a formação do peróxido de hidrogénio» Portanto o processo de acordo com a invenção pode também compreender a adição de um sistema enzimático (isto é, um enzima e o respectivo substrato) que seja capaz de gerar peróxido de hidrogénio no inicio „ ou durante o processo de lavagem e/ou de en xaguamen to» Uma tal categoria de sistemas geradores de peróxido de hidrogénio compreende enzimas que conseguem converter oxigénio molecular e um substrato orgânico ou inorgânico,, respec:tivamente em peróxido de hidrogénio e no substrato oxidado» Estes enzimas produzem apenas baixos niveis de peróxido de hidrogénio, mas podem ser empregues mais vantajosamente no processo da invenção, uma vez que a presença de peroxidase assegura uma utilização eficiente do peróxido de hidrogénio produzido» Enzimas geradores de peróxido de hidrogénio preferidos,, são aqueles que actuam sobre substratos baratos e fáceis de obter que podem ser convenientemente incluídos em composições detergentes. Um exemplo de um tal substrato é a glucose, que pode ser utilizada para a produção do peróxido de hidrogénio por meio de uma oxidase da glucose» As oxidases adequadas incluem aquelas que actuam sobre os compostos aromáticos tais como os fenóis e substâncias afins, por exemplo oxidases de catecol, lacase» Outras oxidases adequadas são oxidase de urato, oxidase de galactose, oxidases de álcool, oxidases de amina, oxidases de aminoácidos, amiloglucosidase e oxidase de colesterol» Os sistemas enzimáticos preferidos são as oxidases de álcool e de aldeído. 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 «.-90/08 20 25 Ó5555

Os sistemas mais preferidos para a aplicação em detergentes granulares terão alcoóis sólidos., por exemplo glucose cuja oxidação seja catalisada por oxidase de glucose para ácido* g lucorónico, com a formação de peróxido de hidrogénio. Os sistemas mais preferidos para a aplicação em <u detergentes líquidos envolverão alcoóis líquidos que poderão também actuar como, por exemplo, solventes., Um exemplo disso ê a oxidase de etanol/etanol. A quantidade de oxidase a ser empregue nas composições de acordo com a invenção deverá ser pelo menos suficiente para proporcionar uma geração constante de 0,01 a 10 ppm Avo por minuto, no banho de lavagem. Com a oxidase de glucose isso pode consegui)—se, por exemplo, à temperatura ambiente e a um pH de 6 a 11, preferencialmente 7 a 9, com ‘50-5000 U/l de oxidase de glucose, 0,005 a 0,5¾ de glucose, sob arejamento constante» A adição de outro substrato oxidâvel para a peroxidase, no início ou durante o processo de lavagem e/ou enxaguamento pode melhorar o efeito inibitório da transferencia de corantes da peroxidase empregue. Pensa—se que isso poderá ser atribuído à formação de radicais de vida curta ou outros estados oxidados deste substrato que participam no branqueamento ou outra modificação da substância colorida» Exemplos de tais substratos oxidáveis são os iões de metais, por exemplo Mn*+ iões de haletos, por exemplo iões de cloreto ou de brometo, ou compostos orgânicos tais como fenóis, por exemplo ácido p-hidro-xicinãmico ou Ε,Α-diclorofenol. Outros exemplos de compostos fenólicos que podem ser usados com o objectivo presente, são os fornecidos em M.Kato e S»Shimizu, Plant Ce 11 Physiol. E6<7>, 1985, pp» 1E91-1301 .(particularmente cf .Quadro 1) ou B.C.Saunders e outros, obra citada» p,.141 ff» A quantidade 30 1 \ 65555 5 10 15

Mod. 71 · 20.000 «.-90/08 20 25 30 de substrato oxidável a ser adicionada é, adequadamente, entre cerca de 1 μΙΊ e 1 mM„ No processo de acordo com a invenção, a peroxidase será tipicamente acrescentada como componente de uma composição detergente e pode ser adicionada numa quantidade de 0,01 - 100 mg de enzima por litro de líquido de lavagem. Como tal, pode ser incluida na composição detergente sob a forma de um granulado não pulverizável, um líquido, especialmente um liquido estabilizado, ou um enzima protegido. Os granulados não pulverizáveis podem ser produzidos, por exemplo conforme descrito nas patentes Norte-americanas 4.106.991 e 4.661„45£ (ambas concedidas a Movo Industri A/S) e podem ser facultativamente revestidos por meio de métodos conhecidos da técnica. As preparações de enzima líquido podem, por exemplo, ser estabilizadas por meio da adição de um paliai tal como o propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórica, de acordo com métodos estabelecidos. São bem conhecidos da técnica outros estabilizadores enzimáticos. Ds enzimas protegidos podem ser preparados de acordo com o método descrito na EP £38.216« A composição detergente pode também ser constituída por um mais substratos para a peroxidase. Beralmente, o pH de uma solução da composição detergente de acordo com a invenção será, de preferência de 7-iH, especial mente de 7,5 a 9,5. 0 pH do banho de lavagem está dependente da peroxidase escolhida, por exemplo a peroxidase de Coprinus deverá ser aplicada a um pH do banho inferior a 9,5« Auxiliares de deterggncia A composição de acordo com a presente invenção pode contér os componentes usuais de tais composições £7 35 0" X 1 δ 10 16 mmv

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90(08 20 25 30 detergentes,, nas quantidades usuais» Assim, podem encontrar-se presentes agentes tensio-activos orgânicos aniónicos, não iónicos, anfoliticos ou zwiteriónicos ou, mais raramente, catiónicos e suar» misturas» Agentes tensio-activos adequados sSo bem conhecidos da técnica e uma lista extensiva de tais compostos έ apresentada na Patente Norte-americana n9 3.717.630 e no pedido de patente Norte-americano com o N9 de Série 58?«116» Composições detergentes úteis na presente invenção contêm entre 1 e 95%, preferivelmente entre 5 e 40% de um agente tensio-activo não iónico, aniónico, zwiteriónico ou suas misturas» Intensificadores de detergência, sejam inorgânicos ou orgânicos, fosfáticos ou não, solúveis na água ou insolúveis e outros sais solúveis na água, podem estar presentes e sais desse tipo podem ser empregues, estejam ou não presentes detergentes orgânicos. Uma descrição de intensificadores adequados é apresentada na Patente Norte—americana nS 3.936.,537 e no pedido de patente Norte~americano com o n9 de série 589.116. Os in tensif icadores de detergência encontram-se presentes de 0 a 50%, preferivelmente da 5 a 40%. Outros componentes usadas em composições detergentes podem ser empregues, tais como agentes intensificadores de espuma ou agentes depressores de espuma, enzimas e estabilizadores ou activadores, agentes suspensores da sujidade, agentes libertadores da sujidade, abrilhantadores ópticos, abrasivos, bactericidas , inibidores de nódoas, agentes corantes e perfumes. Estes componentes, particularmente os enzimas, abrilhantadores ópticos, agentes corantes e perfumes, deverão preferivelmente ser escolhidos de tal forma que sejam compatíveis com o componente branqueador da composição. 88 35 1 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. 20 25 30

As composições detergentes de acordo com a invenção podem ter formas líquidas, em pasta ou granulares, 0 enzima pode ser formulado de qualquer forma conveniente, par exemplo- sob a forma de um pó ou de um líquido . 0 enzima pode ser estabilizado num líquido por inclusão de estabilizadores de enzima. Os detergentes líquidos podem incluir ainda percursores estabilizados de peróxido de hidrogénio.. As composições granulares de acordo com a presente invenção podem também ser em "forma compacta", isto é, podem ter uma densidade relativamente mais elevada do que os detergentes granulares convencionais, isto é, entre 550 e 950 g/1? em tal caso, as composições detergentes granulares de acordo com a presente invenção conterão uma quantidade inferior de "sal inorgânico de enchimento", em comparação com detergentes granulares convencionais5 sais de enchimento típicos são os sais de metais alcalino-terrosos de sulfatos e cloretos, tipicamente sulfato de sódio; os detergentes "compactos" não compreendem tipicamente mais do que 10% de sal de enchimento. A presente invenção refere-se igualmente a um processo para a inibição da transferência de corantes de um tecido para outro, dos corantes solufaiiizados e suspensos encontrados durante as operações de lavandaria que envolvem tec idos tin tos» «v Q processo compreende a colocaçao dos tecidos em contacta com uma solução de lavagem conforme anteriormente descr ito. 0 processo de acordo com a invenção é convenientemente executada no decorrer do processo de lavagem. 0 processo de lavagem é executado, de preferência, de 5°C a 75° C, especialmente de 20,:,C a ó0 -C,, 0 pH da solução de tratamento é „ de preferência, de 7 e 12, 29 35 1 1 10 15

Mod. 71 -20.000 e*.- 90/08 20 25 30 especialmente de 7 a 9,5. 0 processo e as composições de acordo com a invenção podem também ser usados como aditivos durante operações de lavandaria»

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção e os inesperados benefícios superiores de tratamento das cores obtidos com ela»

EXEMPLO I

Importância do parâmetro de desempenho da celulase da reivind icacão 1

Foi efectuado o seguinte ensaios Condições do ensaio:

Temperatura de lavagems 60° C (ciclo de aquecimento progressivo)

Tempo de lavagem s A-O minutos ph 7,5

Dureza da águas 4 mmol/L Concentração do detergentes 1%

Composição do detergentes cf» EPA 350 098 ex.l

Celulasess 1) Celluzyme* produzido por Novo Mordisk = referência

S) endoglucanase de 43kD = celulase de acordo com. a invenção Resultados do ensaio: _% de Remoção de C14-CMC pela Celulase

Detergente sem celulase(-referência) 0

Detergente + Celluzyme" 1.5 mg proteína/L (150x10"* 50 12,7 3,0 mg proteína/L (300x10“· 50 17,7 4.5 mg proteína/L (450x10“* %) 21,5 30 35

Detergente + endoglucanase com 43kD 0,3 mg proteína/L (30x 10-6 %) 20,3

Mod. 71 - 20.000 e*. - 90/08 5 Discussão dos resultados: Os dados apresentados acima demonstram'claramente a importância do parâmetro reivindicado para as ceiulases de acordo com a invenção, sobre o Celluzyme existente no mercado»10 EXEMPLO II São preparados dois conjuntos de cada um de quatro tipos de composições detergentes, todos baseadas num compacto granular. 15 Tipicamente uma composição detergente granular compacta contem os seguintes ingredientes? 20 25 30

Sul tona to de alqu.il benzeno linear (SAL) Sulfato de alquilo Não iónico Ci tra to tr xssód io Zeo1ite ácido cítrico Po 1 ,imero Quelan te Su1f a to de sód io Silicato de sódio 11% cr V \fj S'f ó% 15% 3E% ά% 4% 0 ,E% 5% 2%

Perbarato 0 ,5 Sulfanato de fenol 0,1 A composição detergente acima foi suplementada conforme indicado abaixos

35 / CCTCCT òDjju

A5 sem endoglucanase com 43kD nem peroxidase =* referência B) com endog lucanase de 43kDC) com peróxido D) com endoglucanase de 43kD e peroxidase

CONJUNTO 2s Com CelluzymeR A) sem celluzymeR nem peroxidase B) com ce!luzymeR C) com peroxidase D) com celluzyme* e peroxidase 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90(08 20 25 0 primeiro tipo de cada conjunto de composições detergentes não contém qualquer celulase ou peroxidase (composição de referências A). No primeiro conjunto de composições detergentes a endoglucanasei de 43kD ê adicionada a um nivel de 2 mg de proteína do enzima/litro de solução de lavagem <55 cevu/litro). Mo segundo conjunto de composiçoes detergentes, o celluzyme* é adicionado a um nível de 76 mg de proteína de IV enzima/litro da solução de lavagem (55 cevu/iitro).

Condições do ensaio s ” Ensaio em máquina de lavar Miele ~ Programa para algodão, baixo nivel de água (181), ciclo curto. - 4 ciclos

· Temperatura 40° C ” Composição da caroa de lavaoem 35 1) 1 Kg de carga limpa s 32 I: 1 I: 1 5 10 - 150 g de - 150 g de ·· £00 g de - 300 g de

Mod. 71 -20.000 ex. - 90108 20 25 30 algodão (veludo em bruto) malha de algodão (roupa interior) tecido de algodão po 1 ie t i 1 eno /a 1 godão - £00 g de polieti leno E) Para a graduação da brancuras 3 artigos brancos., sujos (4 repetições de cada um), 3) 10 por 5 cm de corante vermelho ácido 151 em "nylon" s Para criar um nivel baixo de transferencia de corante. 4) Nódoas preparadas para proporcionarem uma fonte de sujidade típica de lavandaria. - água dura (15 grs/3,78 litros), - Concentração de detergente = O,όΚ.

Processo do ensaio : A intensão deste ensaio é a de comparar a brancura dos artigos têxteis, lavados cumulativamente por 4 vezes, entre as composiçSes a serem ensaiadas e a composição de reíeri?ncia. Para este ensaio são utilizados tr’§'s artigos sujos. Para cada tratamento de um artigo são utilizadas quatro repetições. Os artigos a serem examinados são expostos numa superfície de graduação, plana e de cor neutra, colocada paralelarnente à fonte de iluminação. Como fonte luminosa è usada uma luz fluorescente s Philips £7 "fria" de côr TL 40/57 que produz 1080 WATTS de luz, concebida para corresponder à luz do dia normal (Dé>5)„ A cor T° é de 7400°K, a ref lectSncia. da luz ê excelente (74) e a emissão luminosa é de 46 LH/W. 33 35 5 1 5 1 10

Mod. 71 - 20.000 ex. · 90/08 20

As diferenças são indicadas em unidades de painel de contagem (upc), sendo positivamente melhores quanto ao desempenho do que as do tratamento de referencia*

Escala de graduação (graduação UPC5 0 = Igual 1 = Penso que esta é melhor 2 = Sei que esta ê um pouco melhor 3 = Esta é rnuito melhor 4 = Esta é muitíssimo melhor

Os dados da graduação UPC são estatisticamente recontados, obtem-se uma média das 4 repetições, a DMS (diferençai menos significativa) está mencionada nos quadros 1 e 11 * QUADRO I s

Resultados do ensaio s peroxidase / celluzymeR B vs.fi C vs.A D vs. A DM5 Média -cic los E 0 , ES í ,67 s 1 ,80 s 0,61 Média - O V.J 0, ES E, OE s> E ,86 s 0,50 ciclos liéd ia - 4 0,68 E, 48 s S ,66 s 0,76 c iclos 34 35

65555 QUADRO II 8

Resultados do ensaio : peroxidase /-endoglucanase de 4-3kD ____________________________B vs . A____C vs. A___D vs . A DM5 Média - S -0,10 1.,39 s 1,97 s 0,40 ciclos Média - 3 ciclos r*t cr _ d |ido s E, 0,46 Méd ,i.a - 4 - 0,07 2,44 s 2,97 s 0,29 ciclos

Conclusão íí combinação um me1hor a .soma das

Os resultados acima mostram claramente que a peroKidase/43kD da presente invenção, fornece desempenha estatisticamente significativo do que acções individuais de ambos os ingredientes» EXEMPLOS III a VIII Fasem-se as seguintes composições, a) Detergente granular compacto : exemplos II a IV»

EXEMPLOS III IV

Sultonato linear de alquil benseno 11 ,4 10,70 Sulfato de sebo alquilo 1 ,80 2,40 Sulfato Cue alquilo 3,00 3,10 Álcool Cw etoxilado 7 vezes 4 ,00 4 ,00 Álcool seboso etoxilado 11 vezes 1 ,80 1 ,90 Dispersante 0,07 0,1 Silicone líquido O GO O 0,80 19! t/v v—

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 C i tr a to tr is só d ic o 14,,00 15,00 Acido cítrico 3,00 2,50 Zeo1 Ate OO Er UC η w 32,10 6 Copolímero de ácido maleíco ácido acrílico 5,00 5,00 DETMPA 1 ,00 0,20 Celulase de- endoglucanase de 43kD 0,,03 0,02 A Icalase 0,60 0,60 10 Lipase 0.,36 0 ,40 Amilase 0,30 0,30 Si 1icato de sódio a, oo a, 50 Su 1 f a to cl e só d io 3,50 5, ao PVP 0,30 0,50 15 Perborato 0,5 1 Fenol sulfonato 0,1 0,2 Peraxidase 0,1 0,1 Componentes menores até 100 20 b) Detergente granular convencional 5 exemplos V e VI EXEMPLO V IV Sulfonato de sódio Cta alquil benseno linear Ò 1| 8,0 25 Sulfato de sódio 15,0 1S, 0 Zeolite A E6 ,0 22,0 Nitriloacetato de sódio 5 ,0 5,0 Ce lulalase de endoglucanase de 43 kD 0,02 0 ,03 30 PVP0, 5 0,7 TAED 3,0 3,0 Acido bórico 4,0 - Perbarato 0,5 1 Su1fonato de feno 1 0,1 0,2 35 Paroxidase 0,1 0,2 36

Jr e

Componentes menores até 100

Mcd. 71 · 20.000 ex. - 90/08 c) Detergente líquido s exemplos VII e VIII 5 EXEMPLOS VII VIII ácido C18_1<k alcenil succínico 3 ,0 8,0 Monohiclrato de ácido cítrico 10 s 0 L5,0 Sulfato de sódio ClB_ia alquilo 8,0 8,0 10 Sulfato de sódio de álcool Clg_ls etoxilado 2 vezes - 3,0 Álcool Cte_l5 etoxilado 7 vezes S ,0 Álcool Clg_ie etoxilado 5 vezes 8,0 - Penta dietileno triamina (ácido 15 meti leno fosfónico) ο,ε - Ácido oleico 1 ,8 - Etanol ,;·Ι· π 0 4 ,0 Propanediol Ξ , 0 2,0 Pro tease 0 ,2 0 ,2 20 Celulase de endoqlucanase de 43kD 0,,2 0,05 PVP .1. f. 0 E ,0 Supressor de espumas 0,15 0,15 NaOH a té pl-1 7,5 Perborato 0 ,,5 1 25 S u 1 f on a to d e f e η o 1 0,1 0,2 Pero;·; id ase 0 , 4· 0 ,, 1 Água e componentes menores até 100 par tes 30 INF0RMAÇA0 PARA A SEQ.ID N° 1 . (i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento s lOóO pares de <B) Tipos ácido nucleico (C) Tipo de cordãos simples base 35 (D) Topolog ia s 1inear 37

1 t κγκγεγιsí· QUvJiJD 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. · 70/08 (ii) TIPO DE MOLÉCULA a ADNc (iii) HIPOTÉTICA a IMS O <iv) FONTE ORIGINAL (A) Organismo 5 Humicola insolens ÍB) Estirpe a DSM 1800 Cix) CARACTER1STICA (A) Nome/Chave s péptido mat. (B) Loca 1izaçSo : 73.»927 < i x) CARACTERiSTICA (A) Nome/Chave s péptido sig. ÍB) Localização : 10»=72 (i x) CARACTERiSTICA (A) Nome/Chave s CDS ÍB) Locali2açSo s 10.=957 DESCRlpSO DA SEQUÊNCIAs SEG.ID.NS ls GGATCCAAG ATO CGT TCC TCC CCC CTC CTC CCG TCC GCC GTT GTG GCC Hei Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala -EI -ao -15 -10

GCC CTG CCG GTG TTG GCC CTT GCC GCT GAT GGC AGG TCC ACC CGC TAC 96 A la Leu Pro Vai Leu Ala Leu •Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr -5 1 5 TGG GAC TBC TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCT CCC GTC 144 Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Vai 10 15 EO AAC CAG CCT GTC TTT TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT ATC ACG GAC 192 Asn Gin Pro Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg lie Thr Asp S5 30 35 AO 38 35

TTC GAC GCC AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Uai Ala Tyr Ser Cys 50 55 45 GCC GAC CAG ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG CTC GGT TTT Ala Asp Bln Thr Pro Trp A la Uai Asn Asp Asp The ala Leu Gly Phe éO 65 70 GCT GCC ACC TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC Ala Ala Thr Ser lie Ala Gly Ser Asn Glu. Ala Gly Trp Cys Cys Ala 75 80 85

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90|Q8 20 25 30 TGC TAC GAG CTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG Cys* Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro. Vai Ala Gly Lys Lys Het 90 95 100 GTC GTC CAG. TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC ÂAC CAC TTC Vai Vai Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe 105 · UO. US 120 GAT CTC AAC ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC. TTC GAC- GGA TGC ACT Asp teu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Vai Gly lie Phe Asp Gly Cys Thr 125 130 _ 135 CCC CAG TTC GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser 140 145 150 CGC AAC GAG TGC GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GGC TGC TAC Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr 155 160 165 TGG CGC TTC GAC. TGG; TTC AAG AAC GCC GAC AAT' CCG AGC TTC: AGC TTC Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe 170' 175 180 CGT CAG GTC CAG TGC: CCA GCC GAC CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC Arg Gin Vai Gin Cys Pro Ala Glu Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg 185 190 195 200 CGC AAC GAC GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala Vai Gin Ile Pro Ser Ser Ser 205 210 215 ACC AGC TCT CCG GTC AAC CAG CCT ACC AGC ACC AGC ACC ACG TCC ACC Thr Ser Ser Pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr 220 225 230 TCC ACC ACC TCG AGC CCG CCA GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys 235 240 245 ACT GCT GAG AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys 250 255 260

39 35 65553 ACC ACC TBC GTC OCT GGC AGC ACT TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC 912 Thr Thr Cys Vai Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr 2ÓS 270 275 280 DAT CAG TGC CTG TAGACGCAGG GCAGCTTGAG GBCCTTACTG GTGGCCGCAA Mis Gin Cys Lsu 9é4 10 15

Mod. 71 - 20.000 cx. 20 25 30 35 285 CQAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024 GATTGTCACA TAAATGCAAT 6AGGAACAAT GAGTAC 1060 INFORMApXQ PARA A SEQ.ID.W8 2s (1) CARACTERiSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Ccíffipriaiento s 305 amirioácidos (£0 Tipo i âfflinaácido (D) Topologia : linear Ui.) ΠΡΟ DE MOLÉCULA 5 proteína DESCRlpXO DA SEQUENCIAs SEQ.ID.NS 2: Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai A la Ala Leu Pro -Hl -20 -15 -10 Vai Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys “5 1 5 10 {><= Lys Pro Ser Cys Gly Trp A la Lys Lys Ala Pro Vai Asn Gin Pro 15 20 25 Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg Ile Thr· Asp Phe Asp Ala 30 35 40 Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Vai Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gin 4» 50

j£j. Q * l 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex.-90/OS 20 25 30

Thr Pro Tro Ala Vai Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly p|-,e Ala Ala Thr ÓO 65 70 ?5 Ser Ile Ala Gly Ser Asn Blu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu 80 85 90 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Vai Ala Gly Lys Lys Het Vai Vai Gin 95 100 105 Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn 110 115 180 He Pro Gly Gly Gly Vai Gly He Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe 125 130 135 Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly He Ser Ser Arg Asn Glu 140 145 150 155 Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe 160 165 170 Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gin Vai 175 180 185 Gin Cys Pro Ala Glu Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 190 195 200 Asp Gly Asn Phr Pro Ala Vai Gin He Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser 805 23.0 2.15 pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr £20 225 230 235 4:1. 35 á * 1

Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr Thr 240

Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu 245 250 15

Mod. 71 20.000 ex. - 90/09 20 25

Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys 255 ..,-260 265

Va'.l. Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys 270 275 230

Leu INFORRAÇKO PARA A SEG.ID N9 3 ti) CARACTERiSTICAS DA SEBUtNCIA (A) COMPRIMENTOS 1473 pares de base (B) TIPO s ácido nucleíco (C) ΠΡΟ DE CDRDXO s simples (D) TOPOLOGIA s linear <li) TIPO DE MOLÉCULA s ADNc (iíi) HIPOTÉTICA s NXG (iv) SENTIDO INVERSO s NÍÍO (vi) FONTE ORIGINAL (A) ORGANISMOs fusarium oxysporum (B) ESTIRPE s DSM 2672 (i'<) CARACTERíSTICA (A) NOME/CHAVE * CDS (B) LOCALIZAÇÃO s 97.«1224 30 DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ.ID.NS 3:

GAATTCGCGG CCGCTCATTC ACTTCATTCA TTCTTTAGAA TTACATACAC TCTGTTTCAA

AACAGTCACT CTTTAAACAA AACAACTTTT GCAACA ATG CGA TCT TAC.ACT CTT ilet Arg Ser Tyr Thr Leu 1 5 114 35

Mod. 71 · 20.000 ex. -

CTC GCC CTG ί·\ /Ί p 1? lí GGC CCT CTC GCC GTG L.eu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Vai 10 15 CAC TCT ACT CG A TAC TGG GAT TGC TGC His Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys 25 30 GGA AAG GCT GCT GTC AAC GCC CCT GCT 8 ly Lys ala Ala Vai Asn Ala Pro ala 40 45 AAC CCC ATT TCC AAC ACC AAT GCT GTC Asn Pro lie Ser Asn Thr Asn A la Vai 55 6Q AGT GCT GCT TCT GGA AGC GGT 162 Ser Ala A la Ser Gly Ser Gly ao AAG CCT TCT TGC TCT TGG AGC 8.10 Lys Pro Ser Cys 35 .ser Trp Ser TTA ACT TBT GAT AAG AAC GAC 858 Leu Thr Cys Asp Lys Asn Asp 50 AAC GGT TGT GAG GGT GGT GGT 306 Asn Gly Cys Glu Gly Gly Gly 65 70 TCT GCT TAT GCT TGC ACC AAC TAC TCT CCC TGG GCT GTC AAC GAT GAG 354 Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro Trp A .La Vai Asn Asp Glu 75 80 85 CTT GCC TAC GGT TTC GCT GCT ACC AAG ATC TCC GGT GGC TCC GAG GCC 402 Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile Ser Gly Gly Ser Glu Ala 90 95 100 AGC TGG TGC TGT GCT TGC TAT GCT TTG ACC TTC ACC ACT GGC CCC GTC 450 Ser Trp Cys Cys A la Cys Tyr A la Leu Thr Phe Thr Thr Gly Pro Vai 105 110 1.15 AAG GGC AAG AAG ATG ATC GTC CAG TCC ACC AAC ACT GGA GGT GAT CTC 49S Lys Gly Lys Lys Het 1 le Vai Gin Ser Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu 120 125 130 4. *»»· 35 1 i 5 10 15

Mod. 71 -20.000 ex.· 92/12 20 25 30 54.555

i GGC GAC AAC CÀC TTC. GAT CTC ATG ATG CCC GGC GGT GGT GTC GGT ATC Gly Asp Asn His Phe Asp leu Het Het: Pro Gly Gly Gly Vai Gly Ile 135 140 145 * 150 TTC GAC GGC TGC. ACC TCT GAG TTC GGC AAC GCT CTC GGC GGT GCC CAG Phe Asp; Gly Cys Thr Ser Glu Phe. Gly Lys Ala leu Gly Gly Ala Gin 155 150. 165 TAC GGC GGT ATC TCC TCC CGA AGC GAA TGT GAT AGC TAC CCC GAG CTT Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Glu Cys Aso Ser Tyr Pro Glu leu 170 175 180 CTC AAG GAC GGT TGC CAC. TGG CGA TTC 6ACTGG. TTC GAG AAC GCC- GAC Leu Lys- Asp Gly Cys His Trp Arg Phe Asp. Trp Phe Glu Asn Ala Asp. 185 190 195 I AAC CCT GAC TTC ACC TTT GAG CAG GTT CAG TGC CCC AAG: GCT. CTC CTC I Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gin Vai Gin Cys Pro lys Ala Leu Leu ZOO 205 210 GAC ATC AGT GGA TGC AAG CGT GAT GAC GAC TCC AGC TTC CCT GCC TTC , Asp Ile Ser Gly Cys lys Arg Asp Asp Asp Ser Ser Phe Pro Ala Phe 215 220 225 230 AAG GTT GAT ACC TCC GCC AGC AAG' CCC CAG CCC: TCC. AGC' TCC GCT AAG lys Vai Asp Thr Ser Ala Ser lys Pro Gin Pro Ser Ser Ser Ala Lys 235 240 245 AAC ACC ACC TCC. GCT GCT GCT GCC GCT CAG CCC CAG AAG ACC AAG GAT Ivs Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gin Pro Gin Lys. Thr Lys Asp 250 255 260 TCC GCT CCT GTT GTC CAG AAG TCC TCC ACC AAG CCT GCC GCT CAG CCC Ser Ala Pro Vai Vai Gin lys Ser Ser Thr lys Pro Ala Ala Gin Pro 255 270 275 . c GAG CCT ACT AAG CCC GCC GAC AAG CCC CAG ACC GAC AAG CCT GTC GCC Glu Pro Thr lys Pro Ala.Asp Lys Pro Gin Tljr Asp Lys Pro Vai Ala 280. 285 290 ACC AAG CCT GCT GCT ACC AAG CCC GTC CAA CCT GTC AAC AAG CCC AAG Thrlys Pro Ala Ala Thr lys Pro Vai Gin Pro Vai Asn lys Pro Lys 295- 300 305- 310 ACA- ACC CAC AAC GÍC CGT GGA ACC AAA- ACC CGA GGA AGC TGC CCG GCC Thr Thr Gin. lys Vai Arg Gly Thr lys Thr Arg Gly Ser Cys. Pro Ala 315 320 , 325 546 594 . i 642 ; 690 738 786 834 882 930 97ÍT1 1026 1074. AAC ACT GAC GCT ACC GCC AAG GCC TCC GTT GTC CCT GCT TAT TAC CAG 1122 Lys· Thr Asp: Ala Thr Ala lys Ala Ser Vai Vai Pro Ala Tyr Tyr Gin 330 335 340 TGT GGT GGT TCC AAG' TCC GCT TAT CCC. AAC. GGC AAC CTC GCT TGC GCT' 1170 Cys Gly Gly Ser Lys. Ser Ala Tyr Pro Asn Gly Asn Leu Ala Cys Ala 345 350 355 ACT GGA AGC AAC TGT GTC AAG CAG AAC. GAG TAC TAC TCC CAG TGT GTC 12181 Thr Gly Ser lys Cys Vai Lys Gin Asn Glu Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai j 360 365_ ________370 _ ! 44 35

1 óCC AíC TAAA úâTAG ATCCATCGGT TGT6SAADAG ACTATGCGTC TCAGAAGGGA 1274 -vo Asr> S75 5 TCCTC < CftTS AvCAQGCTTG ΤΟΑΪ'ϊΌΤΑΪΑ GCATG6CATC CTGGACCAAG TB7TCGACCC 1334 T7Q7T8TACA TAGTATATCT TCATTSTATA TATTTABACA CATAQATASC CTCTTGTCAG 1394

CijACAAfjves C « ACAAAA8A CTTGGCAQGC 7T8TTCAATA TTGACACAGT TTCCTCCATA 1454

AhAAAAAftrtfi AAÃriAAAAA Í47S 10 INFORMAÇÃO PARA A SEQ.ID NO 4

<U CA:?ACT£R1STICAS DA SEQUÊNCIA tA> CDi·--psíIHENTO s 376 a»inoécidos 15

Mod. /1 · 20.000 ex. 20 25 ÍB) Tir'0 ” ôíftinoácidos <C) r0.':OLOGIA s linear

Cii> 7' 1 70 )>£ MOLeSCULA s proteína DE3CRICSO DA SEQUêNCIAs SEP.IP.Mg 4a__ SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ 10 N0:4:

Met Arg Ser Tyr Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Vai Ser 15 10 15

Ala Ala Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys 20 25 30

Pro Ser Cys Ser Trp Ser Gly Lys Ala Ala Vai Asn Ala Pro Ala Leu 35 40 45

Thr Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro lie Ser Asn Thr Asn Ala Vai Asn SO 55 60

Gly Cys Glu Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro 65 70 75 80

Trp Ala Vai Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile 85 90 95

Ser Gly Gly Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr 100 10S 110

Phe Thr Thr Gly Pro Vai Lys Gly Lys Lys Het lie Vai Gin Ser Thr 115 120 125

Asn Thr Gly. Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp leu Het Het Pro 130 135 140

Gly Gly Gly Vai Gly lie Phe Asp Gly Cys Thr Ser Glu Phe Gly Lys 145 ISO 1S5 160 <15 35

* ' \ JyJUxJ 10 16

Ala Leu Gly Gly Ala Gin Tyr Gly Bly lie Ser Ser Arg Ser Glu Cye IÓS 170 175 Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Leu Lys Asp Bly Cys His Trp Arg Phe Asp Í8Ô 185 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gin Vai Gin 195 200 SOS Cys Pro Lys Ala Leu Leu Asp Ile Ser Bly Cys Lys Arg Asp Asp Asp £10 215 220

Ser Ser Phe Pro Ala Phe Lys Vai Asp Thr Ser Ala Ser Lys Pro Bln S25 230 235 240

Mo d. 71 - 20.000 ex. - 20/08 20 25 30

Pro Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gin 245 250 255

Pro Gin Lys Thr Lys Asp Ser Ala Pro Vai Vai Gin Lys Ser Ser Thr 2<S0 265 270

Lys Pro Ala Ala Gin Pro Glu Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gin 275 280 285 Thr Asp Lys Pro Vai Ala Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Vai Gin 290 295 300

Pro Vai Asn Lys Pro Lys Thr Thr Gin Lys Vai Arg Gly Thr Lys Thr 305 310 315 320

Arg Gly Ser Cys Pro Ala Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Vai 325 330 335 35 *'11 %

Mal Pr d Ala Tyr Tyr Gin Cys Gly Gly Ser Lvs Ser Ala Tyr Pr o Asn *'11 % 34Í) 345 350

Gly Asn Leu Ala Cys Ala Thr Gly Ser Lys Cys Vai Lvs Gin Asn Glu 355 360 3é5

Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai Pro Asn 370 * 375 10 15

Lisboa 51G.Wffi.1993

Por THE PROCTER & GAMBLE C0MPANV

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

VASCO MARQUES UifKt Agiote Oficial de Propf.Hjade InduMrisl «erlório-Aíce ao Conceição, 3, 1.·-110β UtfMH

Claims (1)

1. 1 5 10 15 DESCRIÇÃO 90/04 - *» 000'02 - U 'P°W REIVINDICAÇÕES . -lã» - Composição inibidora da transferência de corante constituída por - um enzima que apresenta uma actividade de peroxidase, - um peróxido de hidrogénio ou um percursor de peróxido de hidrogénio., ou um sistema enzimâtico capaz de gerar peróxido de hidrogénio, ~ um substrato oxidável adicional, e - uma celulase, caracterizado por essa celulase fornecer pelo menos 10% de remoção da carboximetil celulose imobilizada, radioactivamente marcada de acordo com o método C14CMC a 85 x Í0~ em ptso da proteína da celulose na solução de ensaio» 21»- Composição inibidora da transferência de corante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a celulase ser essencialmente constituída por um componente homogéneo de endoglucanase, que é imunoreacfcivo com um anticorpo criado contra uma celulase cerca de 43 kD, altamente purificada, derivada do Humlcola_____insolens,, D SM 1800, ou que é homólogo dessa endoglucanase 43kD„ 3ã„- Composição inibidora da transferência de corante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o componente endoglucanase da referida celulase ter um ponto iso-eléctrico ds cerca de 5,1» 4ã«- Composição detergente de acordo com as reivindicações E ou 3, caracterizada por o referido componente endoglucanase ser produzido por um método que compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada, 1 35 • 1 • 1 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   65555 com um vector de ftDIM recombinante que transporta uma sequência de ADN que codifica o referida componente de endoglucansse ou um percursor do referido componente de endog lucanase, bem como sequências de ADM que codificam funções, que permitem que a exprssão da sequ'§'ncia de ADN codifique o componente de endoglucanase, ou um seu percursor, " num meio de cultura e sob condiçSes que permitem a expressão do componente de endoglucanase ou do seu percursor e a recuperação do componente de endoglucanase da cultura»' 5ã,.- Composição inibidora da transferencia de corante· de acordo com a reivindicação i, caracterizada por a ceiulase ter a sequência de aminoácidos representada na listagem de sequências junta ID#fí, ou ser homóloga a ela, apresentando actividade de endoglucanase. è<ã«- Composição inibidora da transf erfnc ia de corante de acordo com a reivindicação 3, caracterisada por a referida ceiulase poder ser produzida por uma espécie do género Humicola» por exemplo, Humicola insolens- 7« Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o composto de ceiulase ser um enzima de endoglucanase, que tem a sequência de aminoácidos representada na listagem de sequências junta ID#A, ou é um seu homólogo que apresenta activ,idade de endoglucanase. Sã.,- Composição, detergente de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido enzima de qlucanase ser produzido por uma espécie de Fusarium, por exemplo, Fusar ium Qxysporum»

   9â„- Composição detergente de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada por o referido enzima ser produzido por uma construção de ADN constituindo uma sequência de ADN que codifica o enzima. Composição detergente de acordo com a reivindicação 9,, carac ter ízado por a sequência de ADN ser conforme representado nas listagens de sequências anexas ID#1 ou ID#2. lliu- Composição detergente de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizada por a referida célula hospedeira ser uma estirpe de um fungo tal como Tricloderuca ou Aspergillus. prefrivelmente Asoer α i 1 lus oryzae ou As per q i. 1 lus__niger, ou uma célula da levedura pertencente a uma estirpe de Hansenula ou Saccharonivcespor exemplo, uma estirpe de Sacchachomvces cerevisae„ 12â.” Composição detergente de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizada por a referida cá?lula hospedeira ser uma estirpe de uma bactéria, por exemplo, Bac i 1 lus Streptomvces ou E .coli. 13ã«- Composição inibidora da transferência de corante, de acordo com as reivindicações 1 a IS, caracterizada por o referido enzima que apresenta actividade de peroxidase, ser derivado de uma estirpe de Coorinus ou B„pur1lus . 14ã.~ Composição inibidora da transferência de caracterizada um perborato corante cie acordo com as reivindicações 1 a 13, por o percursor de peroxidase de hidrogénio ser O w

   65555 ou um percar bana to .. 15ã.- Composição inibidora da transferencia de corante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o nivsl do referido perhorato ser a partir de 1 μ!νΙ a 1 0mlvl da solução de . lavagem» 16§.'“ Composição inibidora da transferência de corante de.acordo com as reivindicações 1 a 15, caracte-rizada por o referido substrato oxitíével adicional ser seleccionado de entre um ião de metal,, um ião de haleto ou um composto orgânico tal como um feno 1, por exemplo ácido p—hidra—xicinSmico ou S,4-diclorofenol ou um sulfonato de fenoL 17®.- Composição inibidora da transferência de corante de acordo com qualquer uma das reivindicações .1. a 16, caracterizada por o referido sistema enzimâtlco capaz de gerar peroxidase cie hidrogénio, ser uma oxidase seleccionada do grupo constituído por oxidase de glucose, oxidase de urato, oxidase de galactose, oxidases alcoólicas, oxidases de amina, oxidase de aminoácidos e oxidase de colesterol» 18®»- Composição inibidora da transferência de corante de acordo com qualquer uma das reivindicações santeriores, caracterizada por ser um detergente, aditivo sob a forma de um granulato não-pulverulento, de um liquido,, em particular 'um liquido estabilizado, ou de um sistema enzimático protegido» 19®»- Composição detergente caracterizado por incluir uni detergente aditivo de acordo com qualquer uma das 4 65555 reivindicações í a 1.8, S0ã„- Composição detergente de acordo com a reivndicação 19, caracteriEado por representar em forma granular, em forma granular compacta, ou em forma liquida» 2iâ..~ Processo para a inibição da transferencia de um corante têxtil de um tecido tingido para outro tecido, quando os referidos tecidos são lavados e/ou enxaguados juntamente numa resolução de lavagem, na qual os referidos tecidos ficam em contacto com uma composição de acordo com as reivindicações 1 a S0, caracterizado por a peroxidase ser utilizada a niveis entre 0,01 e 100 mg/Por litro da solução de lavagem, o nivel de peroxido de hidrogénio ser entre 0,001 e 5 míi da solução de lavagem o nivel absoluto de substrato oxidável adicional ser entre 1 μΜ a ImM e sendo a celulãse ser adicionada'a niveis situados entre 0,005 e 40 mg de proteína do enzima/Por litro da solução de lavagem» Lisboa, 10.MAKL1993 Por THE PROCTER & GAMBLE C0MPANY

   5 VASCO MARQOE* M Ãgénle Oficiei dt Propriedade Industriei Gtrtêtlo-Asiê *ê ConcelÇâe, 3, LMlfi· UKttMI