PT100486B

PT100486B - Aminoglucosidos lipossomais com altas eficacia de encapsulacao e actividade terapeutica, nomeadamente a netilmicina, e processo para a sua preparcao

Info

Publication number: PT100486B
Application number: PT100486A
Authority: PT
Inventors: Maria Eugenia Meirinhos D Cruz; Isabel M Costa Mimo Carvalhosa; Ana Paula Gameiro Francisco
Original assignee: Ineti Inst Nac Engenh E Tecnol
Priority date: 1992-05-14
Filing date: 1992-05-14
Publication date: 1999-07-30
Also published as: WO1993023015A1; PT100486A

Description

Esta invenção relaciona-se com a preparação de lipossomas de misturas de glicerofosfolípidos (e.g. PC, DMPC, DPPC) com colesterol e moléculas carregadas, lipidicas ou não (e.g. SA, PI, DcP), nas proporções 50 a 807o, 10 a 307o e 10 a 507 respectivamente, todas para encapsulação de netilmicina. O tratamento final dos lipossomas é aquele que se obtém depois da

preparação lipossomal ser filtrada por membranas de policarbonato, com poro final sucessivamente decrescente desde 3 pm a 0,01 pm.

Os aminoglucósidos, incluindo a netilmicina, são antibióticos bactericidas usados em clinica no combate de infecções graves causadas por bactérias gram-negativas, incluindo tuberculose, brucelose, septicémia, peritonite, pneumonia, infecções de tracto urinário e outras, que não respondam normalmente a outras classes de antibióticos (1, 2, 3, 4, 5). No entanto, a administração de aminoglucósidos, e da netilmicina em particular, apresenta efeitos

laterais graves sendo o principal a nefro e ototoxicidade. Dos efeitos nefrotóxicos salienta-se a alteração da capacidade de reabsorção tubular e alterações da morfologia renal. Em relação aos efeitos ototóxicos salienta-se a toxicidade vestibular e coclear, possuindo tendência para lesarem o 8° par de nervos craneanos (1, 5).

Os lipossomas foram usados em modelos animais como veículos de transporte de aminoglucósidos nomeadamente a gentamicina, tendo mostrado evidência de serem protectores contra os referidos efeitos de toxicidade (6, 7, 8). No entanto as formulações desenvolvidas são obtidas a partir de razões elevadas de fármaco / lipido, apresentando eficácias de encapsulação baixas.

Com o presente processo pretende-se obter formulações lipossomais de netilmicina com elevada eficácia de encapsulação, baixa toxicidade e elevada actividade terapêutica.

A presente invenção compreende um processo de desidratação-reidratação, seguida por uma extrusão através de filtros de policarbonato. Este processo nunca foi até agora usado para a netilmicina. Do processo destacam-se os principais passos que são: a) o uso de lipossomas multilamelares (MLV) contendo fármaco intra e extra-lipossomal; b) o uso de dextrose na fase de hidratação; c) a abolição dos passos de congelamento-descongelamento antes da liofilização; d) o elevado volume de diluição dos lipossomas antes da extrusão; e) uso dos lipossomas para extrusão sem serem previamente separados da fármaco extra-lipossomal.

Assim, de acordo com a presente invenção uma solução de lipido (10 mg/ml - 100 mg/ml) em clorofórmio é sujeita a um fluxo de N2 até formação de um filme lipidico seco. Adiciona-se então uma solução aquosa de fármaco (0,05 mg/ml - 2,4 mg/ml) que é vigorosamente agitada com vortex até hidratação completa da película de lipido. A preparação de lipossomas multilamelares assim obtida é congelada em azoto líquido e liofilizada. 0 pó branco seco resultante é então hidratado em dois passos sucessivos consistindo em (i) adição de solução de dextrose 57», 1/10 do volume de solução de fármaco usada, agitação vigorosa com vortex e 30 minutos de repouso e (ii) adição de soro fisiológico, 9/10 do volume de solução de fármaco usada. A preparação reidratada é diluída com 5 a 10 volumes de soro fisiológico e sujeita a um processo de filtração sob pressão através de membranas de policarbonato de poro sucessivamente decrescente, e.g. entre 3 pm e 0,01 pm. Finalmente a solução de lipossomas é concentrada por ultracentrifugação a 250 000 x g durante 30 minutos e o sedimento ressuspenso em soro fisiológico.

presente processo é mais simples que o usado por outros autores para encapsulação de aminoglucósidos (8), pois parte de lipossomas multilamelares contendo fármaco, em vez de preparar lipossomas vazios aos quais é adicionado o fármaco posteriormente; não usa passos de congelamento e descongelamento antes de liofilização como fazem outros autores (8); prepara lipossomas isosmolares com o plasma humano utilizando dextrose; aumenta a eficácia de encapsulação utilizando, antes da extrusão, lipossomas sem serem previamente separados do fármaco extralipossomal.

As formulações assim obtidas apresentam eficácias de encapsulação superior a 607» sem alteração da aetividade biológica in vitro.

Quando injectadas em murganhos formulações de netilmicina preparadas pelo presente processo mostraram tempos de semi-vida no plasma 12 a 18 vezes superiores aos do fármaco livre.

Estudos de toxicidade aguda in vivo demonstraram que a dose letal 50 para as formulações lipossomais de netilmicina é muito superior (> 50 mg/Kg) à dose letal 50 para a netilmicina livre (20-24 mg/Kg).

Num modelo de peritonite in vivo, usando uma suspensão bacteriana de E.Coli sensível à netilmicina, as preparações obtidas pelo presente processo mostraram uma actividade terapêutica muito superior à da netilmicina livre.

Os resultados são notoriamente superiores aos publicados para outras formulações lipossomais de aminoglucósidos, dado que com a formulação preparada pelo presente processo se obtêm eficácias de encapsulação elevadas com baixas razões de Fármaeo / lípido (0,47 - 5,6 mg / 100 mg lípido). Ainda, os resultados obtidos indicam que as formulações lipossomais de netilmicina aqui descritas são um agente altamente eficaz no tratamento profilático ou terapêutico de infecções graves provocadas por bactérias gram-negativas. A acção prolongada da netilmicina lipossomal permite uma administração e monitorização menos frequente do fármaeo.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Soares, M.A., Farmácia Portuguesa, 1985, 34, 23-41.

2. Wright, J.J., J. Chem. Soe. Chem. Commun., 1976, 6, 206.

3. Miller, G.H., Arcieri, G., Weinstein, M.J., Waitz, J.A.,

Antimicrob. Agent. Chemother., 1976, 10, 827-836.

4. Sande, M.A., Mandell, G.L. in As Bases Farmacológicas da Terapêutica, Vol. II, p. 1018-1034; ed. by Guanabara Koogan

S.A.,1983.

5. Luft, F.C., J.Int. Med. Res., 1978, _6, 286-299.

6. Swenson, C.E., Stewart, K.A., Hammett, J.L., Fitzsimmons, W.E., Ginsberg, R.S., Antimicrob. Agent. Chemother., 1990, 34, 235-240.

7. Fierer, J. , Hatlen, L. , Lin, J.P., Estrella, D., Mihalko, P. ,

Yau-Young, A. , Antimicrob. Agent. Chemother., 1990, 34,

343-348.

8. Bally, M.B., Bolcsak, L.E. , Cullis, P.R., Janoff, A.S., Mayer, L.D., PCT/US87/00077, 1987.

Para completa elucidação da formulação lipossomal preparada pelo presente processo, descrevem-se de seguida alguns estudos realizados de acordo com a presente invenção.

ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS:

CARACTERIZAÇÃO DA FORMULAÇÃO LIPOSSOMAL

Para caracterizar a formulação lipossomal de um antibiótico,

apresentam-se de seguida os parâmetros de encapsulação caracteristicos da presente invenção (Tabela 1).

TABELA 1 - Parâmetros de Encapsulação

FORMULAÇÃO LIPOSSOMAL (Diâmetro, gm)	RAZÃO FINAL ANTIBIÓTICO/LÍPIDO (mg/mg lípido)	EFICÁCIA ENCAPSULAÇÃO (7o)	RENDIMENTO (7o)
0,81 - 1,00	0,58 - 0,61	65 - 71	47 - 53
0,19 - 0,21	4,79 - 5,38	82 - 88	61 - 65

A eficácia de encapsulação é calculada pela razão entre o quociente antibiótico/lipido final e o quociente antibiótico/lípido inicial. 0 rendimento é calculado pela razão entre a concentração de antibiótico final e a concentração de antibiótico inicial.

Pelos resultados obtidos conclui-se que com a formulação lipossomal preparada pelo presente processo se obtêm rendimentos e eficácias de encapsulação elevados, partindo de baixas razões de fármaco/lipido.

TOXICIDADE AGUDA IN VIVO

Para avaliar a toxicidade aguda in vivo da netilmicina livre e encapsulada em lipossomas realizou-se um estudo em que grupos de 10 murganhos Swiss (Charles River) foram injectados via intravenosa com doses de 10 a 50 mg/Kg de fármaco livre e lipossomal. Determinou-se o número de sobreviventes em cada dose e calculou-se a dose que matou 50% dos animais (DLso) (Tabela 2).

TABELA 2 - Toxicidade Aguda

FORMULAÇÃO	DLso (mg/Kg)
Netilmicina livre	20 - 28
Netilmicina lipossomal	> 50

Os resultados obtidos permitem concluir que a formulação lipossomal de netilmicina obtida pelo presente processo reduz

eficazmente a toxicidade aguda já que para a dose máxima injectada a sobrevivência foi de 100% sem se observar qualquer sinal de choque anafilático.

ESTUDO FARMACOCINÈTICO

Os estudos de farmacocinética foram realizados com netilmicina livre e lipossomal em murganhos Swiss (Charles River) normais e imunodeprimidos (granulocitopénicos). A imunossupressão foi induzida, administrando intraperitonealmente uma solução de ciclofosfamida. Os animais foram injectados via intravenosa, com doses de 4 mg/Kg, recolhendo-se o sangue aos tempos previamente seleccionados (Tabela 3).

TABELA 3 - Parâmetros Farmacocinéticos

ANIMAIS	FORMULAÇÃO	TEMPO SEMI-VIDA (min)	VOL. DIST. (SS) (ml)	TEMPO MÉDIO RESIDÊNCIA (min)
Normais	Netilmicina livre	12	15,69	21
	Netilmicina lipossomal	138	2,89	204

	Netilmicina livre	11	15,89	19
Granuloci-
topénicos	Netilmicina lipossomal	219	2,90	330

Vol. Dist. (SS) - Volume de Distribuição estado estacionário

Os resultados mostram o aumento significativo do tempo de circulação das formulações lipossomais preparadas de acordo com a presente invenção quando comparadas com o fármaco na forma livre.

facto deste aumento ser ainda mais relevante para os animais imunodeprimidos deveu-se à diminuição da capacidade fagocitica, uma vez que as defesas destes animais estavam diminuídas.

ACTIVIDADE FARMACOLÓGICA

Para testar a eficácia das formulações lipossomais preparadas pelo presente processo realizou-se um estudo in vivo de actividade terapêutica utilizando um modelo de peritonite em murganhos Swiss (Charles River). A infecção foi provocada com uma suspensão bacteriana de E. Coli sensível à netilmicina. Utilizando grupos de murganhos estudaram-se dois tipos de tratamento: num os animais foram tratados profilaticamente 24 h antes da infecção e no outro o tratamento foi efectuado imediatamente após a infecção. 0 grupo controlo foi injectado com

NaCl 154mM. A dose de tratamento foi 10 vezes inferior à dose de mg/Kg utilizada profilacticamente. A percentagem de sobrevivência foi determinada ao fim de 24 dias (Tabela 4).

TABELA 4 - Actividade Farmacológica num Modelo de Peritonite

% SOBREVIVÊNCIA

FORMULAÇÃO	PROFILÁCTICO (-24h)	TRATAMENTO (0H)
NaCl 154mM	0	0
Net. Livre	33	17
Net. Lip. (0,81-1,00 gm)	17	50
Net. Lip. (0,19-0,21 gm)	83	33

Net. - Netilmicina

Lip. - Lipossomas

Dos resultados apresentados conclui-se que a actividade farmacológica foi bastante potenciada pelas formulações lipossomais produzidas de acordo com a presente invenção, o que sugere a sua utilização em clínica.

RESUMO

AMINOGLUCÓSIDOS LIPOSSOMAIS COM ALTAS EFICÁCIA DE ENCAPSULAÇÃO E

ACTIVIDADE TERAPÊUTICA, NOMEADAMENTE A NETILMICINA, E PROCESSO

PARA A SUA PREPARAÇÃO

A presente invenção refere-se a formulações lipossomais

contendo	um antibiótico,	caracterizadas	por	terem razões
fármaco /	lipido até 10 mg	/ 100 mg lipido,	em que	o tamanho	dos
lipossomas	varia entre	I gm e 0,01 gm	e as	eficácias	de

encapsulação são superiores a 60%.

Os antibióticos lipossomais quando administrados ao animal resultam num aumento do tempo de semi-vida no plasma, reduzem substancialmente a toxicidade aguda e aumentam a actividade antimicrobiana relativamente ás formas livres dos fármacos.

processo para a preparação das formulações lipossomais é caracterizado pela formação de lipossomas multilamelares contendo o antibiótico e sujeitando os lipossomas a liofilização, reidratação e extrusão sob pressão.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação lipossomal contendo um antibiótico caracterizada por ter uma razão fármaco / lipido que vai até 10 mg / 100 mg lípido em que o tamanho dos lipossomas varia entre 1 μτη e 0,01 μτη.
2. Formulação lipossomal de acordo com a reivindicação caracterizada por o antibiótico se encontrar na fase aquosa.
3. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 e caracterizada por o antibiótico ou um seu derivado hidrófobo se encontrar na fase lipídica.
4. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 a 3 caracterizada por o antibiótico ou um seu derivado hidrófobo se encontrar na fase aquosa e na fase lipídica.
5. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações caracterizada pelo facto de ser conservada a sua actividade biológica.
6. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 a 5 caracterizada por os antibióticos usados serem os aminoglucósidos.
7. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 a 6 caraterizada por o aminoglucósido ser a Netilmicina.
8. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 a 7 caracterizada pelo facto de aumentar o tempo de semi-vida no plasma e reduzir a toxicidade aguda, relativamente à netilmicina livre.
9. Formulação lipossomal de acordo com as reivindicações 1 a 8 caracterizada pelo facto de quando utilizada no tratamento de peritonite potenciar a actividade farmacológica, avaliada pelo aumento de sobrevivência relativamente à netilmicina livre.
10. Processo para a preparação de formulações lipossomais de acordo com a reivindicação 1 que é caracterizado pela formação de lipossomas multilamelares, contendo o antibiótico, e sujeitando os lipossomas a liofilização, reidratação e extrusão sob pressão.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por os lipossomas multilamelares serem formados por hidratação de um filme lipidico na presença de um solução aquosa de antibiótico.
12. Processo de acordo com as reivindicações 10 e 11 caracterizado por o antibiótico não incorporado nos lipossomas ser removido antes ou depois da fase de extrusão.
13. Processo para a preparação de formulações lipossomais de netilmiclna caracterizado pela formação de lipossomas multilamelares a partir de uma solução aquosa de netilmicina e lipido, liofilização dos lipossomas resultantes, reidratação dos lipossomas liofilizados compreendendo a adição de um volume pequeno de uma solução não salina seguida, após uma fase de repouso, pela adição de uma solução salina, diluindo a suspensão resultante e extrudando-a sob pressão sem separação prévia do fármaco não Incorporado.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo facto de se obterem formulações lipossomais de netilmicina que quando administradas reduzem a toxicidade aguda pelo menos duas vezes relativamente à netilmicina livre.
15. Processo de acordo com as reivindicações 13 e 14 caracterizado pelo facto de se obterem formulações lipossomais de netilmicina com eficácia de encapsulação superior a 60%.
16. Processo de acordo com as reivindicações 13 a 15 caracterizado pelo facto de se obterem formulações lipossomais de netilmicina que quando utilizadas no tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas potenciam a actividade farmacológica, avaliada pelo aumento de sobrevivência relativamente à netilmicina livre.
17. Formulações lipossomais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizadas por serem preparadas pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
18. Formulações lipossomais e processos para a sua preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizados pelo uso dos seguintes lípidos, hidrogenados ou não, individualmente ou em misturas, numa razão molar entre 0,01 e 10: colesterol (Col), fosfatidilcolina (PC), diestearilfosfatidilcolina (DSPC), esfingomielina (SM), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), fosfatidilglicerol (PG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), gangliósidos, ceramidas, fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatidico (PA), dicetilfosfato (DcP), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), estearilamina (SA), dipalmltoilfosfatidilglicerol (DPPG) e outros lípidos sintéticos.