PT100424A - Processo e sistema de ensaio para a actividade da neurotrofina - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se a composições farmacêuticas e processos para o tratamento de mamíferos portadores de células tumorais que expressam factores neurotróficos e que utilizam um mecanismo de ansa autócrina para sobrevivência. Mais especificamente, este invento refere-se a processos de interrupção da via de transdução do sinal do factor neurotrófico derivado de cérebro ("BDNP") e ocasionando a morte celular em células que expressam BDNF.

Historial do Invento A. Tumores Derivados da Cristã Neural 0 termo neuroblastoma é usado para designar o espectro de neoplasmas neurogénicos derivados de neuroblastos do simpático embrionário, células da cristã neural e da camada manto do tubo neural. Tumores neuroblastoma, os neoplasmas mais comummente diagnosticados em crianças com menos de 1 ano de idade, ocorrem com uma frequência de 1 em cada 10 000 nascimentos.

Neuroblastoma é considerada a terceira malignidade mais comum na infância, contabilizando para aproximadamente 10% de todas as neoplasias pediátricas, e pelo menos 15% de todas as mortes relacionadas com o cancro em crianças.

Bioquimicamente, os neuroblastomas contêm frequentemente elementos de ambas as vias de neurotransmissores adrenérgicos e colinérgicos. Eles expressam enolase específica de neurónio e proteínas neurofilamentosas e exibem crescimento celular, em cultura, aderente ao substrato, com formação de neurite. Talvez o facto mais saliente do neuroblastoma humano seja a amplificação do oncogene N-myc, que tem sido identificado em 19 de 22 linhas de células de neuroblastoma e em aproximadamente 31% dos tecidos tumorais de pacientes com etapa III e etapa IV de neuroblastoma [Kohl et al.. Science. 226: 1335 (1984)]. A linha de células de neuroblastoma humano SK-N-SH e a sua derivada SH-SY5Y são de origem toráxica e não da cristã neural e não expressam N-myc amplificado, mas expressam N-ras. 73 889 6526-089-118 -3-

Outra classe de tumores, o carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC) partilha uma linhagem de desenvolvimento comum com os neuroblastomas, sendo ambas aparentemente derivadas de células progenitoras neurais com origem na cristã neural [ Carney, Câncer Res.. 45.:2913 (1985); Gazdar et al.. Câncer Res.. 45.: 2924 (1985)]. 0 carcinoma do pulmão de célula pequena representa aproximadamente um terço de todos os cancros do pulmão. Embora em vários neuroblastomas seja conhecida a expressão de níveis amplificados de N-mvc. os SCLC são geralmente caracterizados por níveis activados de N-myc ou de L-mvc. Os carcinomas de célula pequena representam aproximadamente 20-25% de todas as malignidades pulmonares, produzindo uma incidência de aproximadamente 25 000-30 000 casos por ano nos Estados Unidos, e são, de longe, as malignidades pulmonares mais agressivas. 0 SCLC é frequentemente (70%-90%) de apresentação metastática. Carcinomas de célula pequena são de origem neuroectodérmica. Estes tumores possuem propriedades de absorção e incorporação e descarboxilação do precursor de amina (APUD), e outras características neuronais, tais como a produção de péptidos neuroactivos. Os síndromes paraneoplásticos, tais como neuropatia sensorial subaguda, ocorrem com maior frequência entre vítimas de célula pequena do que outros cancros pulmonares. B. Neurotrofinas e Seus Recentores 0 desenvolvimento e função do sistema nervoso depende de proteínas, denominadas factores neurotróficos, originalmente definidas pela sua capacidade de apoiar a sobrevivência de células neuronais. Para além de promover a sobrevivência neuronal, estes factores podem influenciar processos de proliferação e diferenciação no sistema nervoso e podem também ter acções fora do sistema nervoso. Muito tem sido aprendido sobre a molécula de sobrevivência prototípica neuronal, factor de crescimento do nervo (NGF) e, mais recentemente, os seus dois parentes estruturais, factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3). Estas três proteínas, juntamente 73 889 6526-089-118 -4—

com a recentemente identificada neurotrofina-4 [Hollbook et al.. Neuron, 6.:845-58 (1991)], compreendem uma família (designada "neurotrofinas"), da qual cada membro partilha com os outros cerca de 55% a 60% de identidade da sequência de aminoácidos. A compreensão dos papéis biológicos destes factores neurotroficos requer a caracterização das vias de transdução de sinal e do receptor que eles usam para exercer os seus efeitos. A família trk de receptores da proteína tirosina-quinase tem sido identificada como receptores biologicamente funcionais para as neurotrof inas. O BDNF é uma molécula de sobrevivência neuronal que é capaz de se ligar ao receptor trk da superfície celular conhecida como trkB, que possui uma actividade intrínseca de proteína quinase e é principalmente expressa no sistema nervoso [Kaplan et al.. Nature. 350:158 (1991); Klein et al. . Cell. 65.:189 (1991), Hempstead et al♦ . Nature. 350: 678 (1991)]. 0 gene trkB codifica uma proteína que liga e medeia respostas funcionais tanto para BDNF como NT-3 [Pedido de Patent Internacional PCT W091/03568; Squinto et al. . Cell. 65:885 (1991); Glass et al.. Cell. 66^:405-413 (1991); Soppet et al.. Cell. 65:895 (1991)]. A recente introdução de receptores trk em fibroblastos permitiu a criação de células que apresentam respostas biológicas para factores neurotróficos que mimetizam as acções de factores de crescimento tradicionais. A introdução do receptor trkB nas células NIH 3T3 que necessitam de certos factores de crescimento (FGF ou PDGF) para proliferação e sobrevivência, resultaram em células capazes de sobreviverem em níveis exógenos, fisiologicamente apropriados, de BDNF ou NT-3. Tais modelos proporcionam um poderoso sistema de ensaio que pode ser usado para detectar e/ou medir a actividade da neurotrofina, para identificar agentes que exibem uma actividade semelhante à da neurotrofina e para identificar antagonistas que bloqueiam a ligação de ligandos aos receptores da neurotrofina [Glass et al.. supra1. A utilização de receptores de tirosina quinases pela 73 889 6526-089-118 5

família de factores neurotróficos relacionados com NGF, sugere que os mecanismos de transdução de sinal utilizados pelos neurónios se assemelham fundamentalmente aos utilizados por outros tipos de células em resposta a factores mitogénicos. Esta verificação é consistente com dados recentes em que factores neurotróficos podem actuar como mitogénios em certos contextos [Cattaneo e McKay, Nature. 347:762 (1991); Glass et al., supra). BDNF e NT-3 podem servir como factores de sobrevivência e/ou mitogénicos para precursores neuronais que ainda não tenham atingido um fenótipo pós-mitótico.

Juntamente com a família trk das proteínas tirosina-quinase que tem sido identificada como receptores biologicamente funcionais para as neurotrofinas, as quinases ERK representam uma família recentemente identificada e molecularmente clonada de proteínas quinase extracelulares reguladas por sinal [Boulton et al. . Cell. 65.:663-75 (1991)]. A actividade da ERK é rapidamente activada em resposta à estimulação de células pelo factor de crescimento (i.e., insulina e NGF) e representa uma classe de quinases Ser/Thr intracelulares que são elas próprias fosforiladas na tirosina [Boulton et al.. supra]. Tem sido demonstrado in vitro que a fosforilação da tirosina das ERK aumenta grandemente a sua actividade de quinase. C. Tecnologia Anti-sentido A compreensão dos acontecimentos moleculares que orientam a regulação da proliferação, diferenciação e sobrevivência das células devem, no final, conduzir à concepção racional de drogas especificamente direccionadas para o tratamento de várias doenças incluindo cancro, imunodeficiência e neurodegenerescência. Recentemente surgiu uma poderosa ferramenta experimental que permite, por meios selectivos e eficazes, a inibição da expressão de produtos chave do gene que se sabe estarem envolvidos no controlo de proliferação, diferenciação e sobrevivência de células eucariotas. A técnica envolve o uso de moléculas de ADN ou ARN anti-sentido concebidas para proporcionar o bloqueio da tradução destas proteínas chave da regulação celular. Esta tecnologia permitiu a contribuição -6

-6 C. X 73 889 6526-089-118 directa da função do produto de um gene único durante importantes períodos de transição celular, pela criação de um mutante nulo para um produto genético específico.

Correntemente, existem duas abordagens principais para atingir o bloqueio da tradução dirigida anti-sentido da síntese proteica. 0 primeiro processo faz uso de construções genéticas transfectadas estavelmente e dirigidas ao promotor, concebidas para sintetizar constitutivamente sequências complementares de ARNm anti-sentido. Esta tecnologia resulta geralmente no bloqueio por hibridação, da tradução da proteína para um dado produto de um gene. Foi recentemente sugerido que a ARNase pode desempenhar um papel neste mecanismo pela clivagem dos dúplexes de ARN/ADN formados entre ARNm anti-sentido e ADN. Outros mecanismos possíveis incluem processamento nuclear diminuído ou a incapacidade do dúplex de ARN/ADN ser traduzido eficazmente. Uma abordagem alternativa para bloqueio da tradução anti-sentido conduzido por vector envolve a síntese de pequenos oligodesoxirribonucleótidos sintéticos anti-sentido 5' ou 3' (ADN anti-sentido). Vários trabalhos têm demonstrado recentemente a capacidade do ADN anti-sentido para bloquear a tradução de ARN seleccionados quando adicionados a células eucariotas in. vitro (revisão em Van der Krol et al. . Biotechnicrues. 6.: 958-973 (1988)). Várias abordagens têm sido tomadas para usar oligonucleótidos que são complementares para sequências alvo seleccionadas de ácido nucleíco celular ou virai, para modular a expressão da sequência alvo de ácido nucleico. Têm havido vários trabalhos sobre o uso de sequências específicas de ácido nucleico para inibir a replicação virai [ver por exemplo Goodchild et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:5507-5511 (1988); Wickstrom et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 1028-1032 (1988); e Kawasaki, Nucl. Acids Res. . 13.:4491 (1985)]. Vários laboratórios tentaram desenvolver oligonucleótidos modificados que são relativamente permeáveis na membrana e resistentes a nucleases. Uma abordagem envolve o desenvolvimento

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de análogos ollgonucleotídlcos não iónlcos. Exemplos de tais análogos incluem metilfosfonatos [Smith et elf Proc. Natl.

Acad. Sei. USA. 83;2787-2791 (1986); Agris et al.. Biochemistrv. 25: 6268-6275 (1986); Jayaraman et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78.:1537-1541 (1981)]; fosforotioatos [Agarwal et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83.:4143-4146 (1988); Matsukura et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84.:7706-7710 (1987); Marcus-Sekura et al.. Nucl. Acids Res. 15: 5749-5763 (1987)]; e fosforamidatos [Agarwal et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:4143-4146 (1988)].

Tem-se especulado que os fosforotioatos podem, para além de se ligarem a sequências alvo complementares de ácidos nucleicos, dirigir também a inibição da ligação do iniciador à transcriptase reversa de HIV [Matsakura et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84.:7706—7710 (1987)]. A inibição antimolde tem também sido descrita usando polinucleótidos, incluindo ácido policitidílico parcialmente tiolado [revisão em Stein e Cohen, Câncer Res.. 48:2659-2668 (1988)].

Outra abordagem tem envolvido a conjugação do oligonucleótido a uma molécula que irá aumentar a eficiência da absorção e incorporação do oligonucleótido pela célula. Exemplos destes conjugados incluem oligonucleótidos conjugados a colesterilo [Letsinger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86.:6533-6556 (1989)] e um conjugado de poli-L-lisina [Lemaitre et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84:648-652 (1987)]. Outro exemplo inclui um oligonucleótido ligado através de um braço de ligação a um grupo que diminui o carácter anfofílico do produto final, de modo a aumentar a eficácia do transporte de membrana [Publicação PCT N9 W0 88/09810, publicada em 15 de Dezembro de 1988].

Outra abordagem que foi seguida envolve o uso de oligonucleótidos reactivos, i.e. oligonucleótidos anti-sentido ligados a agentes reactivos que são capazes de modificar o ácido nucleico alvo. Um destes grupos de agentes reactivos são agentes intercalantes que se podem ligar ao dúplex por inserção interna

entre pares de bases adjacentes, ou ligar a nucleósidos externos ou elementos fosfato, respectivamente. Exemplos de intercalantes que têm sido ligados a oligonucleótidos e a análogos de oligonucleótidos incluem acridina, antrídio, e psoralene fotossensibilizante [revisão em Zon, Pharm. Res.. 5.:539-549 (1989)]. Outro destes grupos de grupos reactivos acoplados a oligómeros inclui complexos de metais tais como EDTA-Fe(II), o-fenantrolina-Cu(I), ou porfirina-Fe(II) [revisão em Krol et al.. Biotechniques. 6.:958-976 (1988)]. Estes compostos podem gerar radicais hidroxilo na presença de oxigénio molecular e um agente redutor. Os radicais resultantes podem clivar a cadeia complementar no seguimento do ataque à estrutura do ácido nucleico alvo.

Existem muitas publicações recentes que tratam da inibição por oligonucleótidos anti-sentido. Por exemplo, a proliferação de melanomas humanos malignos tem sido inibida in vitro por oligonucleótidos anti-sentido dirigidos contra factores de crescimento de fibroblastos básicos [Becker et al.. EMBO J. 8.: 3685 (1989)]. Foi observado que a formação de ARN anti-sentido para parte do gene humano N-mvc por via de um vector de expressão de replicação epissomal, bloqueava a transdiferenciação de linhas de células de tumores neuroectodérmicos [Whitesell et al. . Mol. Cell. Biol. . 11(3):1360-1371 (1991)]. Oligonucleótidos anti-sentido para o gene da proteína tau associada ao microtúbulo neuronal, quando adicionados aos meios de cultura, inibiram a polaridade da neurite em neurónios primários do cerebelo [Caceres e Kosik, Nature. 343:461 (1990)]. Um oligonucleótido anti-sentido para o factor de crescimento beta 3 transformante inibiu a transformação do epitélio-mesênquima de células endoteliais cardíacas embrionárias em culturas de explantes [Potts et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:1516-1520 (1991)]. D. Ansas Autócrinas 0 envolvimento do mecanismo de crescimento autócrino em neoplasia foi primeiramente identificado em 1980 [Sporn e Todaro, N. Encl. J. Med.. 308:878-80 (1980)]. As ansas

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autócrinas têm sido observadas para várias moléculas de factor de crescimento e linhas de células tumorais. Certas células tumorais são conhecidas por sintetizar e dar resposta a factores de crescimento que são necessários para um crescimento e divisão celulares normais. Por via de sinalização autócrina, as células respondem a substâncias que elas próprias produzem. As ansas autócrinas podem servir para acelerar ou amplificar uma resposta celular em células tumorais porque essa célula está menos dependente do seu meio ambiente para a sua existência.

Em alguns casos, as ansas autócrinas têm sido definidas experimentalmente pelo uso de abordagens anti-sentido para a ruptura da ansa autócrina. Por outras palavras, a mera capacidade de um oligonucleótido, que seja anti-sentido para um factor em particular, para afectar adversamente o crescimento celular é indicador de que essa célula está a sintetizar esse factor e o factor é necessário para o crescimento ou sobrevivência da célula. Em tais situações, a existência de receptores celulares para o factor ou até a libertação do factor de crescimento para o meio ambiente pode não ser detectável.

Os oligonucleótidos anti-sentido têm sido utilizados para demonstrar que o factor de crescimento beta transformante serve como factor autócrino de diferenciação celular responsável pela transformação de células epiteliais em células do mesênquima [Potts et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:1516 (1991)]. Têm sido utilizadas abordagens anti-sentido para demonstrar que o factor de crescimento de fibroblasto básico parece ser necessário para a proliferação por estimulação autócrina de ambos os melanomas humanos [Becker et al. . EMBQ J. , 8.:3685 (1989)] e de astrócitos humanos transformados [Morrison et al. . J. Biol. Chem., 266:728 (1991)]. Oligonucleótidos anti-sentido contra a hormona do crescimento inibem a proliferação de linfócitos [Weigent et al.. Endocrinoloav. 128:2053 (1991)]. E. Inibidores de Proteína-Ouinase Têm sido utilizados inibidores específicos de fosforilação proteica para estudar o efeito de várias quinases e as suas

73 889 6526-089-118 -10- acções na fosforilação de proteínas celulares chave para a actividade biológica do factor de crescimento do nervo nas suas células alvo. O inibidor de guinase K252a, isolado a partir de um caldo de cultura de Nocardiosis sp. e seus derivados, estão descritos nas Patentes dos E.U.A. Nfi 4 555 402; 4 877 776; e 4 923 986, documentos estes que são aqui incorporados por referência, o K252a e a estauroesporina foram inicialmente caracterizados como potentes inibidores in vitro de proteína-quinases c (PKC) e de quinase cíclica dependente de nucleótidos [Kase et al.. Biochem. Biophys. Res. Comnt. 142:436-440 (1987)], mas sabe-se agora que possuem acções mais vastas que incluem a inibição de proteína--quinases específicas de tirosina [Fujita-Yamaguchi e Kathuria, Biochem. Biophvs. Res. Comm. 157:955-962 (1988); 0'Brian e Ward, J. Natl. Canc. Instit. 82.:1734-1734 (1990)]. Verificou-se que concentrações nanomolares de K252a e seus derivados inibem in vitro, de um modo algo selectivo, a proteína*guinase C, proteína--quinases dependentes de AMP cíclico e de GMP cíclico, quinase da cadeia leve da miosina, e fosfodiesterase dependente de calmodulina [Kase et al.. Biochem. Biophvs. Res. Commun. 142:43640 (1987); Nakanishi, J. Biol. Chem., 263:6215-19 (1988); Kase et al. . J. Antibiotic. 39.:1059-60 (1986)]. o mecanismo da inibição selectiva da quinase aparece relacionado com uma competição para o local de ligação da adenosina-5,-trifosfato (ATP), na enzima.

Embora o K252a e a eatauroesporina não pareçam diminuir as respostas a FGF ou EGF em células PC12, eles são capazes de bloquear os processos de sinalização induzidos por NGF mais precocemente detectáveis, incluindo a fosforilação da tirosina induzida por NGF. Também se mostrou que o K252a inibe excrescências, induzidas por NGF, de neurites de culturas primárias de explantes de gânglios embrionários de raiz dorsal, bem como bloqueia completamente a actividade de sobrevivência de NGF em culturas primárias de neurónios do simpático de embrião de pinto [Matsuda e Fukuda, Neurosei. Lett.. 87:11-17 (1988); Borasio, Neurosci. Lett.. 108:207-12 (1990)].

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Outra classe de inibidores da proteína-quinase da tirosina, a classe de inibidores tiazolidinadiona, demonstrou autofosforilação de receptor específica, induzida pelo factor de crescimento epidérmico (EGF) e tem mostrado ser inibidora de células dependentes de EGF [Geissler et al. . "Thiazolidine-Diones," J. Biol. Chem.. 265:22255-22261 (1990)]. Estes inibidores são análogos ao K252a no seu mecanismo específico de interrupção das alterações celulares mediadas pelo factor de crescimento.

Existe, na arte, tuna necessidade de processos e composições farmacêuticas capazes de reduzir o crescimento in vivo de células tumorais que expressem BDNF, tais como neuroblastomas, e de inibição da progressão do tumor. Em particular, existe uma necessidade de meios de interrupção da ansa autócrina de sobrevivência de BDNF de células tumorais que expressam BDNF.

Sumário do Invento O presente invento é dirigido a um processo de tratamento de mamíferos portadores de uma célula tumoral de um tipo caracterizado pela expressão de um BDNF. Em particular, o presente invento refere-se à identificação de uma ansa autócrina de sobrevivência em células tumorais que expressam BDNF e meios para a interrupção da ansa autócrina de modo a provocar a morte da célula. O presente invento é, para além disso, dirigido a células recombinantes que servem como um sistema modelo para células, incluindo células tumorais, que estão dependentes de uma ansa autócrina para sobreviver. Tais células recombinantes proporcionam um meio para a pesquisa de compostos para eficácia terapêutica no tratamento de tumores que utilizam ansas autócrinas de sobrevivência.

Num aspecto do invento, células recombinantes que expressam tanto BDNF como o receptor de trkB, e assim dependem de uma ansa autócrina de BDNF para sobrevivência, são utilizadas para identificar agentes que interrompem a ansa autócrina de BDNF e 73 889 6526-089-118

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que podem ser utilizadas para tratar células tumorais que dependam, de forma semelhante, dessas ansas autócrinas para sobrevivência e/ou proliferação.

Num aspecto, o invento é dirigido a ácidos nucleicos de pelo menos seis nucleótidos que são anti-sentido para um gene ou ADNc que codifica para BDNF ou uma porção deste. "Anti-sentido", como é aqui usado, refere-se a um ácido nucleico capaz de hibridar com uma porção de ARN de BDNF (preferencialmente ARNm) em virtude de alguma complementaridade da sequência.

Os ácidos nucleicos anti-sentido do invento, que são utilizados para interromper uma ansa autócrina de sobrevivência de BDNF, podem ser oligonucleótidos que são de cadeia dupla ou cadeia simples, ADN ou ARN ou uma modificação ou derivado destes, os quais podem ser directamente administrados a uma célula, ou podem ser produzidos intracelularmente por transcrição de sequências exógenas introduzidas.

Noutro aspecto, este invento é dirigido ao uso de estauroesporina, K252a e seus derivados, ou outros inibidores de proteína-quinases, para interromper a ansa autócrina de sobrevivência de BDNF.

Os ácidos nucleicos anti-sentido para BDNF e o K252a ou seus derivados proporcionados por este invento podem ser utilizados para o tratamento de tumores, cujas células do tipo de tumor demonstrem expressar BDNF.

Numa concretização, o invento é dirigido a processos para inibição da expressão de uma sequência de ácidos nucleicos de BDNF numa célula eucariota compreendendo proporcionar a célula com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um ácido nucleico anti-sentido para BDNF, do invento.

Noutra concretização deste invento, estauroesporina, K252a ou seus derivados ou outros inibidores de proteína quinase, podem ser usados para interromper a ansa autócrina de BDNF ao

73 889 6526-089-118 -13- -13- nlvel do receptor da superfície celular por inibição da fosforilação do receptor de BDNF.

Noutra concretização, a identificação de células que expressam BDNF funcional ou outros receptores de neurotrofina pode ser realizada pela observação da capacidade de uma neurotrofina para "salvar" tais células dos efeitos citotóxicos de um ácido nucleico anti-sentido para BDNF.

Outro aspecto do invento proporciona o diagnóstico de neuroblastoma humano ou carcinoma do pulmão de célula pequena através da detecção da expressão de BDNF em células obtidas a partir de pacientes.

Para além disso, o invento proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz dos ácidos nucleicos anti-sentido para BDNF, do invento, num portador farmaceuticamente aceitável. São também proporcionados processos para tratamento de várias doenças e desordens compreendendo a administração das composições farmacêuticas do invento.

Num outro aspecto, é também proporcionada uma composição farmacêutica que compreende, como seu ingrediente activo, K252a, estauroesporina ou um composto relacionado, num portador farmaceuticamente aceitável. Esta composição pode ser utilizada no tratamento de várias doenças e desordens relacionadas com células tumorais que expressam BDNF.

Um aspecto adicional deste invento consiste numa composição farmacêutica que compreende como um ingrediente activo, K252a, estauroesporina, ou um composto relacionado, e como segundo ingrediente activo os ácidos nucleicos anti-sentido para BDNF do invento. Alternativamente, a estauroesporina, K252a ou outro inibidor de proteína quinase podem ser combinados com outro agente farmacêutico convencional com utilidade no tratamento ou prevenção de desordens associadas com células tumorais que expressam BDNF.

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Ainda outro aspecto adicional deste invento consiste num processo para tratamento de pacientes que possuem um neuroblastoma ou carcinoma do pulmão de célula pequena pela administração de uma quantidade eficaz dos materiais e composições acima descritos.

Ainda, outro aspecto deste invento consiste num processo de estimulação de excrescência de neurite pela administração de doses particularmente baixas de um inibidor de proteína quinase tal como o K252a.

Outros aspectos ou vantagens do presente invento estão ainda apresentados na descrição detalhada, que se segue, das concretizações preferidas do presente invento.

Descrição das Figuras

Figura 1. Inibição da síntese de BDNF por oligonucleótidos anti-sentido num sistema de tradução in vitro de um lisado de semente de trigo. O ARNm de BDNF foi sintetizado in vitro utilizando o plasmídeo de expressão construído pC8hB, [ver Publicação PCT Na W0 91/03568 publicado em 21 de Março de 1991] que contém o promotor bacteriano T7 para transcrição eficaz in vitro pela ARN-polimerase de T7, conforme as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI). 0 ARNm de BDNF foi purificado e posteriormente colocado num sistema de tradução iii vitro de um lisado de semente de trigo (Promega) na ausência ou na presença de oligonucleótidos de BDNF. A síntese da proteína de BDNF foi seguida pela utilização, na reacção, de metionina marcada com 35S. Oligonucleótido de controlo refere-se ao uso de um mero 18 aleatório não relacionado com a sequência da BDNF humana.

Figura 2. Efeitos de 3/-AS-BDNF na viabilidade celular em cultura. A percentagem de viabilidade celular (eixo dos yy) é apresentada para diferentes concentrações de 3'-AS-BDNF (eixo dos xx, em micromolar) adicionado às células de neuroblastoma cultivadas. A: células LA-N-5; B: células LA-N-1; C: células SK-ES; D: células SH-SY5Y.

Figura 3. Efeito da adição conjunta de várias neurotrofinas com 3/-AS-BDNF em linhas de células de neuroblastoma. As linhas de células de neuroblastoma indicadas foram simultaneamente incubadas com 3'-AS-BDNF 50 μΜ e sem neurotrofina (quadrados em branco com ponto no centro), com BDNF (losangos a cheio), NT-3 (quadrados em branco), ou NGF (losangos em branco). Eixo dos yy: percentagem de viabilidade celular; eixo dos xx: horas em cultura. Figura 3A; células SH-SY5Y; Figura 3B: células LA-N-1; Figura 3C: células LA-N-5; Figura 3D: células CHP-134; Figura 3E: células CHP-404.

Figura 4. Análise por transferência de Northern de ARN celular total (10 μg por faixa) derivado de linhas de células de carcinoma do pulmão de célula pequena ou de cérebro de rato adulto (faixa 1). A transferência de Northern foi hibridada com uma sonda de BDNF humano. As linhas de células de carcinoma do pulmão de célula pequena foram as seguintes: H82 (faixa 2), H209 (faixa 3), H345 (faixa 4), H378 (faixa 5), H510 (faixa 6), e N417 (faixa 7).

Figura 5. Comparações de expressão de BDNF em ambas as linhas de células tumorais, de humano e roedor, por transferência de Northern (ARN). O ARN total (10 μg) de cada linha de células foi fraccionado, transferido para membranas e hibridado com BDNF marcado com 32P conforme previamente descrito [Maisonpierre, et al.. Science 247: 1446 (1990)]. As linhas de células de neuroblastoma nas Tabelas B e C estão representadas por LAN5, SY5Y e N18TG2.

Figura 6. Efeitos morfológicos de oligómeros de BDNF com sentido e anti-sentido em neuroblastoma LA-N-5. Fotomicrografias de luz de células de neuroblastoma LA-N-5 sem tratamento (Tabela A), tratadas com oligómero 3'-AS-BDNF 10 μΜ (Tabela B), com oligómero 3'-S-BDNF 10 μΜ (Tabela C) ou com ambos, de 3,-AS-BDNF 10 μΜ e 100 ng/ml de BDNF humano recombinante (Tabela D): foram obtidos com o outro oligómero de BDNF anti-sentido, PS-AS-BDNF, resultados semelhantes aos apresentados na Tabela B. Foram semeadas células de neuroblastoma LA-N-5 em placas Costar de 6

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poços, com uma densidade de 3 x 105 células por poço em RPMI 1640 (Irvine Scientific) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina, 2% de estreptomicina (P/S) e glutamina 2 mM. Dezoito horas após a sementeira, as células foram transferidas para um meio definido, isento de soro [Zhan et al.. Mol. Cell. Biol. 6.: 3541 (1986) e tratadas durante 72 horas com os reagentes acima descritos. O BDNF construído foi produzido em células CHO e purificado a partir de meio condicionado de células CHO até à homogeneidade como anteriormente descrito [Squinto et al.. Cell 65:885 (1991)].

Figura 7. Ensaio citométrico de fluxo de coloração dual para quantificar os conteúdos de ADN e de proteína de células de neuroblastoma LA-N-5. As células de neuroblastoma LA-N-5 foram semeadas em placas de 10 cm a uma densidade de 1 x 106 células por placa e foram cultivadas como descrito na Figura 6. As células não sofreram tratamento (Tabela A) ou foram tratadas apenas com 3'-AS-BDNF 10 μΜ durante 48 horas (Tabela B), com 3'-AS-BDNF com 100 ng/ml de BDNF (Tabela C), ou com elevadas concentrações (100 μΜ) de 3,-S-BDNF de controlo (Tabela D). A seguir a estes tratamentos as células foram recolhidas e ressuspensas em PBS-verseno (PBS com glucose e EDTA) para se obter suspensões com células únicas. As células foram coradas com 1 μg/ml de DAPI (para o conteúdo em ADN - lado esquerdo das Tabelas) e com 10 μg/ml de sulforodamina 101 (para o conteúdo proteico - lado direito das Tabelas) e analisadas por citometria de fluxo como descrito [Del Bino, et al. Exp. Cell Res. 193:27 (1991); Jakobisiak, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:3628 (1991)]. Foram contadas pelo menos 5 x 103 células para cada análise. A linha desenhada sobre os perfis de proteína salienta o decréscimo da fluorescência observado no Quadro 4 (lado direito) relativamente aos Quadros A-C (lado direito). A seta em B indica uma população de células apoptótica. Estão indicadas as fases do ciclo da célula. A percentagem de células na fase S foi como se segue: Quadro A - 25,5%; Quadro B - 16,2%; Quadro C -30,1%; Quadro D - 24,9%.

Figura 8. Curvas de morte em resposta à dose para oligómeros I 73 889 6526-089-118 -17-

de BDNF com sentido (S) e anti-sentido (AS) em neuroblastomas humanos e fibroblastos recombinantes autócrinos 3T3. As células de neuroblastoma humano (LA-N-5, Quadro A; SH-SY5Y, Quadro B) foram cultivadas como descrito para a Figura 6 ao passo que as células 3T3 autócrinas de BDNF (Quadro C) foram cultivadas em meios deficientes em factor de crescimento como descrito [Glass et al. . Cell 66.:405 (1991); Zhan et al. . Mol. Cell. Biol. r supra]. Todas as células foram plaqueadas com uma densidade de 2 x 104 células por poço, numa placa Costar de 24 poços. Foram adicionadas às culturas várias concentrações de 3#-AS-BDNF ou de oligómeros de controlo (0, 1, 5, 10, 50, 100 e 250 μΜ), durante 4 horas, na presença ou ausência de BDNF recombinante de humano (100 ng/ml) usando EMEM isento de soro (Quadros A e B) ou meios deficientes em factor de crescimento (Quadro C), para permitir a absorção e incorporação de oligonucleótido nas células. Foram então imediatamente adicionadas às culturas insulina, transferrina e selénio (ITS) e a viabilidade celular foi medida 72 horas mais tarde, por determinação da concentração de glucose que permaneceu nos meios de cultura. Quadrados a cheio - 3'AS; Quadrados em branco - 3'AS e BDNF; Círculos a cheio - 3'S; Círculos em branco - 3'S e BDNF.

Figura 9. Identificação de receptores de trk, autofosforilados de modo constitutivo em linhas de células de neuroblastoma. Quadro A, imunotransferência de anti-fosfotirosina de receptores de trkB autofosforilados que foram imunoprecipitados especificamente a partir de lisados de proteína total preparados a partir de aproximadamente 3 x 106 células NIH3T3 que expressam trkB [3T3(trkB)] e tratadas com BDNF, ou a partir de 2-5 x 106 células de neuroblastoma sem tratamento. No quadro B, as células de neuroblastoma N18TG2 não sofreram tratamento ou sofreram um pré-tratamento com K252a 200 nM antes da preparação dos lisados de células e da imunoprecipitação específica para trk. Quadro C, imunotransferência de antifosfotirosina de lisados de proteína total preparados a partir de células NIH3T3 (3T3), células 3T3(trkB) tratadas com BDNF ou células 3T3(autócrinas) sem tratamento. A posição do trkB está marcada com uma seta, ao

73 889 6526-089-118 -18- passo que os padrões de peso molecular (KD) estão Indicados no lado esquerdo da figura. Quadrados a cheio - 3'AS; Quadrados em branco - 3'AS e BDNF; Círculos a cheio - 3'S; Círculos em branco - 3'S e BDNF.

Figura 10. Identificação de receptores de trk autofosforilados de modo constitutivo, em linhas de células de neuroblastomas. Quadro A. Imunotransferência de anti-fosfotirosina de receptores de trkB autofosforilados que foram imunoprecipitados especificamente a partir de lisados de proteína total preparados a partir de aproximadamente 3 x 106 células NIH3T3 que expressam trkB e tratadas com BDNF ou a partir de 2-5 x 10^ células de neuroblastoma sem tratamento. No quadro B, as células de neuroblastoma N18TG2 não sofreram tratamento ou sofreram um pré-tratamento com K252a 200 nM antes da preparação dos lisados de células e da imunoprecipitação específica para trk. Quadro C, imunotransferência de antifosfotirosina de lisados de proteína total preparados a partir de células NIH3T3 (3T3), células NIH3T3(trkB) tratadas com BDNF ou células 3T3(autócrinas) sem tratamento. A posição do trkB está marcada com uma seta, ao passo que os padrões de peso molecular (KD) estão indicados no lado esquerdo da figura.

Figura 11. Efeito diferencial de K252a em neuroblastoma (Quadro A) e em linhas de células 3T3 (Quadro B) cuja sobrevivência depende, ou está relacionada com uma ansa autócrina de sobrevivência de BDNF. Células de neuroblastoma (Quadro A) e células 3T3 (Quadro B) foram semeadas em placas de 24 poços como descrito na Figura 7. Após a sementeira, todas as células foram transferidas para meios deficientes em factor de crescimento. As células 3T3 progenitoras foram mantidas em FGF 50 pM. As células foram tratadas durante 48 horas com várias concentrações de K252a (variando de 0 a 250 nM). A viabilidade celular para todas as linhas de células foi determinada por ensaio de utilização de glucose em amostras em duplicado. Quadro A; Quadrados em branco - SH-SY5Y (sem BDNF); Quadrados a cheio -LA-N-5 (com BDNF); Círculos a cheio - N18TG2 (com BDNF). Quadro B; Quadrados em branco - 3T3 (com FGF); Quadrados a cheio - 3T3

73 889 6526-089-118 -19 autócrino (com BDNF).

Figura 12. Efeito diferencial de K252a em carcinoma do pulmão de célula pequena (NCI-H69), adenocarcinoma pulmonar (Calu-3), 3T3(autócrino) e células de neuroblastoma (N18TG2). As células foram semeadas em placas de 24 poços como descrito na Figura 7. As células foram tratadas durante 48 horas com K252a 0, 50 e 100 nM. A viabilidade celular para todas as linhas de células foi determinada pelo ensaio de utilização de glucose em amostras em duplicado. Os histogramas (da esquerda para a direita) são apresentados como se segue: Histogramas a cheio; NCI-H69; Histograma com linhas diagonais a cheio; N18TG2; Histograma com ponteado; 3T3(autócrino); Histograma com linhas diagonais finas; Calu-3.

Descrição Detalhada do Invento O presente invento proporciona processos e composições farmacêuticas para o tratamento terapêutico de mamíferos portadores de células tumorais que expressam neurotrofinas para inibir ou interferir com o crescimento das células tumorais e a sua prógenia. As composições e processos do presente invento envolvem a administração, ao mamífero afectado, de uma quantidade eficaz de uma substância que interfere com a ansa autócrina de sobrevivência das células tumorais.

Mais especificamente, são proporcionados dois exemplos de mecanismos que podem ser usados para interferir com uma ansa autócrina de sobrevivência de BDNF e assim causar a morte celular em células tumorais que expressam BDNF.

Um mecanismo para a prática do presente invento envolve o uso de ácidos nucleicos de pelo menos seis nucleótidos que são anti-sentido para um gene ou para o ADNc que codifica BDNF ou uma porção deste. "Anti-sentido" como aqui é utilizado refere-se a um ácido nucleico capaz de hibridar com uma porção de ARN de BDNF (preferivelmente ARNm) em virtude de alguma complementaridade da sequência.

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Outro mecanismo envolve o uso do composto estauroesporina, K252a ou seus derivados, que estão descritos em Murakata et al. Patente dos Estados Unidos Ns 4 923 986 e Pedidos de Patente Europeia Nos 303 697, publicado em 22 de Fevereiro de 1989 e Na 323 171, publicado a 5 de Julho de 1989, ou outros inibidores de proteína*quinases.

Adicionalmente, o invento proporciona um modelo celular recombinante de ansa autócrina que concretiza muitas características de células tumorais (tais como neuroblastomas e SCLC) que utilizam ansas autócrinas de sobrevivência. Uma célula que utiliza uma ansa autócrina de sobrevivência, como aqui usado, refere-se a uma célula que expressa uma molécula que é necessária para a sua própria sobrevivência.

Interrupção de Ansa Autócrina A. Inibição da Expressão de BDNF

Os ácidos nucleicos anti-sentido do invento interrompem a ansa autócrina de BDNF a um nível intercelular, através da prevenção da síntese de BDNF pela célula a qual depende da expressão de BDNF para sobreviver. 0 mecanismo do K252a e compostos relacionados para interromper a ansa autócrina de BDNF ocorrem ao nível do receptor de BDNF, através da prevenção da activação e fosforilação do receptor de trk B. Outra classe de inibidores de proteína-quinases de tirosina, a classe de inibidores tiazolidinadiona [Geissler et al.., J. Biol. Chem.. 265i22255-22261 (1990)] pode actuar de modo semelhante ao K252a. Outros inibidores da proteína-quinase, como a calfostina C, estauroesporina, K252b, KT5720, KT5823 e KT5926 (Kamiya Biomedical Company, Thousand Oaks, Califórnia) podem também ser usados. Outros mecanismos de interrupção de ansa autócrina de BDNF são também abrangidos por este invento.

Os ácidos nucleicos anti-sentido deste invento podem ser oligonucleótidos que são de cadeia dupla ou cadeia simples, ARN ou ADN ou uma modificação ou derivados destes, que possam ser directamente administrados a uma célula, ou que possam ser produzidos intracelularmente por transcrição de sequências

exógenas introduzidas.

Os ácidos nucleicos anti-sentido de BDNF proporcionados pelo presente invento podem ser utilizados no tratamento de tumores, em que as células desse tipo de tumor possam demonstrar fin vitro ou in vivo) expressão do gene de BDNF. Tal demonstração pode ser feita pela detecção de ARN de BDNF ou de proteína BDNF. De acordo com o invento, os oligómeros anti-sentido de BDNF não só evitam o crescimento desses tumores, mas podem também resultar na morte de células tumorais por um mecanismo invulgar que envolve morte programada ou "apoptótica", que é caracterizada pela perda de ADN antes da perda de proteína celular. [Arends et al.. Am. J. Pathol. 136:593 (1990)]. O invento proporciona ainda, composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz dos ácidos nucleicos anti-sentido de BDNF do invento, num portador farmaceuticamente aceitável. São também proporcionados processos para tratamento de várias doenças e desordens que compreendem a administração de composições farmacêuticas do invento.

Noutra concretização, o invento é dirigido a processos para inibir a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos de BDNF numa célula eucariota, compreendendo proporcionar à célula uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um ácido nucleico anti-sentido de BDNF do invento.

Noutra concretização, a identificação de células que expressam BDNF funcional ou outros receptores de neurotrofina pode ser realizada pela observação da capacidade de uma neurotrofina de "salvar" essas células dos efeitos citotóxicos de um ácido nucleico anti-sentido de BDNF.

Outro aspecto do invento proporciona o diagnóstico de neuroblastoma humano ou carcinoma de pulmão de célula pequena, pela detecção de expressão de BDNF em células obtidas de pacientes. Tal detecção pode ser realizada pela detecção de ARN

de BDNF ou da expressão da proteína.

Os ácidos nucleicos anti-sentido do invento são de pelo menos seis nucleótidos e são preferencialmente oligonucleótidos (variando de 6 até cerca de 50 nucleótidos). Os oligonucleótidos podem ser de ADN ou ARN ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destes, de cadeia simples ou cadeia dupla. O oligonucleótido pode ser modificado na porção base, na porção do açúcar ou na estrutura fosfato. O oligonucleótido pode incluir outros grupos ligados, como péptidos ou agentes que facilitem o transporte através da membrana celular [ver e.g. Letsinger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84.:648-652 (1987)? Publicação PCT Na W088/09810, publicado em 15 de Dezembro de 1988] ou da barreira sangue-cérebro [ver e.g. Publicação PCT N2 W089/10134, publicada em 25 de Abril de 1988], agentes de clivagem despoletados por hibridação [ver por ex. Krol et al.. BioTechniaues. 6.:958-976 (1988)] ou agentes intercalantes [ver por ex. Zon, Pharm. Res. 5.:539-549 (1988)].

Num aspecto preferido do invento, é proporcionado um oligonucleótido anti-sentido de BDNF, preferivelmente de ADN de cadeia simples. Num aspecto mais preferido, tal oligonucleótido compreende uma sequência anti-sentido para os últimos 6 codões de BDNF humano. O oligonucleótido pode ser modificado em qualquer posição na sua estrutura com substituintes normalmente conhecidos na arte. O oligonucleótido anti-sentido de BDNF pode compreender pelo menos uma porção base modificada que é seleccionada do grupo que inclui, mas não está limitado a, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-cloro-uracilo, 5-iodo-uracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilamino-metil-2-tio-uridina, 5-carboximetilamino--metil-uracilo, di-hidro-uracilo, jS-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina,

5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminoetil-2-tio-uracilo, /3-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiura- cilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5--oxiacético (v), vibotoxosina, pseudo-uracilo, queosina, 2-tiocitosinaf 5-metil-2-tio-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio--uracilo, 5-metil-uracilo, metiléster de ácido uracil-5--oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tio--uracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina.

Noutra concretização, o oligonucleótido compreende pelo menos uma porção açúcar modificada, seleccionada do grupo que inclui, mas não é limitado a arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose.

Ainda noutra concretização, o oligonucleótido compreende pelo menos uma estrutura fosfato modificada seleccionada a partir do grupo que consiste num fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, um 15-fosforoamidato, um fosforodiamidato, um metilfosfonato, um fosfotriéster-alquilíco e um formacetal ou análogo deste.

Ainda noutra concretização, o oligonucleótido é um oligonucleótido α-anomérico. Um oligonucleótido a-anomérico forma híbridos específicos de cadeia dupla com AKN complementar no qual, contrariamente às unidades β usuais, as cadeias se encontram paralelas uma à outra [Gautier et al.. Nucl. Acids Res.. 15:6625-6641 (1987)]. O oligonucleótido pode ser conjugado com outra molécula, por ex., um agente de reticulação espoletado por hibridação com péptido, um agente de clivagem espoletado por hibridação com agente de transporte, etc.

Os oligonucleótidos do invento podem ser sintetizados por processos padrão conhecidos na arte, por ex. por utilização de um sintetizador automatizado de ADN (como os que estão comercialmente disponíveis em Biosearch, Applied Biosystems,

73 889 6526-089-118 etc.)· Como exemplos, os oligos de fosforotioato podem ser sintetizados pelo método de Stein et al.. Nucl. Acids Res.. 16; 3209 (1988), os oligos de metilfosfonato podem ser preparados por utilização de suportes poliméricos de vidro de poros controlados [Sarin et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:7448-7451 (1988)], etc.

Numa concretização específica, o oligonucleótido anti-sentido de BDNF compreende ARN catalítico, ou uma ribozima [ver, por ex., Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em 4 de Outubro de 1990? Sarver et al.. Science 247; 1222-1225 (1990)]. Noutra concretização, o oligonucleótido é um 2/-0-metilribonucleótido [Inoue et al. . Nucl. Acids Res.. 15: 6131-6148 (1987)], ou um análogo de ARN-ADN quimérico [inoue et al.. FEBS Lett.. 215:327-330 (1987)].

Numa concretização alternativa, o ácido nucleico anti-sentido de BDNF do invento é produzido intracelularmente por transcrição de uma sequência exógena. Por exemplo, pode ser introduzido um vector in vivo de modo a que este seja incorporado por uma célula, dentro da qual o vector, ou uma sua porção, é transcrito, produzindo um ácido nucleico (ARN) anti-sentido, do invento. Tal vector conteria uma sequência codificando o ácido nucleico anti-sentido de BDNF. Tal vector pode permanecer epissomal ou tornar-se integrado no cromossoma, desde que possa ser transcrito para produzir o ARN anti-sentido desejado. Tais vectores podem ser construídos por processos de tecnologia de ADN recombinante, comuns na arte. Os vectores podem ser plasmídicos, virais, ou outros conhecidos na arte, utilizados para replicação e expressão em células de mamíferos. A expressão da sequência que codifica o ARN anti-sentido de BDNF pode ser realizada por qualquer promotor conhecido na arte para actuar em células de mamíferos, preferencialmente humanas. Tais promotores podem ser indutíveis ou constitutivos. Tais promotores incluem, mas não estão limitados a: região promotora precoce de SV40 [Bernoist e Chambon, Nature. 290:304-310 (1991)], o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus de sarcoma de Rous [Yamamoto et al.. Cell. 22: 787-797 (1980)], o promotor

73 889 6526-089-118 -25 da timidina quinase do herpes [Wagner et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78:1441-1445 (1981)] r < as sequências regulatórias do gene da metalotioneína [Brinster et al». Nature. 296:39-42 (1982)]; etc.

Os ácidos nucleicos anti-sentido do invento compreendem complementaridade para pelo menos uma porção de um transcrito de ARN de um gene de BDNF, preferencialmente um gene humano de BDNF. Contudo, não é requerida complementaridade absoluta, embora seja preferida. Uma sequência "complementar para pelo menos uma porção de um ARN", como aqui referida, significa uma sequência possuindo complementaridade suficiente para ser capaz de hibridar com o ARN, formando um dúplex estável (ou triplex, no caso de ácidos nucleicos anti-sentido de BDNF de cadeia dupla). A capacidade para hibridar dependerá tanto do grau de complementaridade como também do comprimento do ácido nucleico anti-sentido. Geralmente, quanto maior for o ácido nucleico hibridante, tanto maior será o número de desemparelhamentos de bases que poderá conter com um ARN de BDNF e mesmo assim formar um dúplex estável (ou triplex, consoante o caso). Um perito na arte pode averiguar um grau tolerável de desemparelhamentos utilizando processos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridado. B. Interrupção da Fosforilacão do Recentor 0 composto conhecido como K252a está comercialmente disponível na Kamiya Biomedical Company em Thousand Oaks, Califórnia e está de outro modo descrito nas referências acima citadas. A substância K252a fisiologicamente activa é um derivado de uma substância K252 que foi produzida por cultura de um microrganismo do género Nocardiosis [Matsuda et al.. Patente dos E.U.A. Na 4 555 402]. Ο K252 está definido em Murakata et al.. Patente dos E.U.A. Na 4 877 776, como um composto representado pela fórmula: (segue fórmula)

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Η

na qual R1 e R2 são H ou OH; X é COOH, COOR ou CH2OH; Y é H,R ou COR? e Z é OH, OR ou SR, onde R é um alquilo inferior. O K252a mostrou inibir o crescimento de células HeLa do cancro do útero humano, células MCF7 do cancro da mama humano, células COLO320DM de adenocarcinoma do cólon humano e células PC10 de carcinoma do pulmão humano, por meio da actividade inibitória da proteína quinase.

São apresentados derivados de K252 em Murakata et al.. Patente dos Estados Unidos NB 4 923 986 como compostos de fórmula: onde W1, W2, R1, R2, R3 , R4 , X e Y representam vários substituintes.

Sem. estarem limitados por teoria ou mecanismos, os nossos resultados indicam que a estauroesporina e seus derivados e o K252a e seus derivados operam interferindo com a fosforilação do receptor de neurotrofina. Mais especificamente, a tirosina--quinase do receptor trk B é inactivada por interrupção da ansa autócrina de BDNF ao nível do receptor da superfície da célula. Crê-se que a supressão da fosforilação de proteínas celulares seja devida ao efeito directo da interferência específica do K252a ou da estauroesporina ou seus derivados com respostas celulares mediadas por BDNF. Outros inibidores de proteína quinase, tais como tiazolidinadionas, que inibem a fosforilação de receptores induzida por EGF, podem actuar de modo semelhante 73 889 6526-089-118 -27-

para interferir com respostas celulares mediadas por BDNF. Utilidade Terapêutica

Os materiais deste invento podem ser utilizados para tratar tumores de um tipo que se tenha mostrado expressar BDNF. Tais tumores incluem, mas não estão limitados a, neuroblastoma, carcinoma de pulmão de célula pequena e alguns tumores neuroepiteliais. Numa concretização, um oligonucleótido de ADN de cadeia simples anti-sentido para BDNF é usado no tratamento de neuroblastoma. Noutra concretização, estauroesporina ou K252a é utilizada no tratamento de neuroblastoma.

Outros tipos de tumores que expressam ARN de BDNF podem ser identificados por vários processos conhecidos na arte. Tais processos incluem, mas não estão limitados a, hibridação com ácido nucleico específico para BDNF, por ex. por hibridação de Northern, hibridação por transferência de pontos, por observação da capacidade do ARN ser traduzido in vitro em BDNF, etc. Num aspecto preferido, pode ser analisado um tecido tumoral primário de um paciente, quanto à expressão de BDNF, antes do tratamento.

Podem ser aministradas a um paciente, que possua um tumor que seja de um tipo que expressa ARN de BDNF, composições farmacêuticas do invento, compreendendo uma quantidade eficaz de uma substância que interfere com a ansa autócrina de sobrevivência de BDNF, num portador farmaceuticamente aceitável.

As composições terapêuticas e farmacêuticas do presente invento para inibir o crescimento de células tumorais que expressem BDNF, compreendem assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância capaz de interferir com a ansa autócrina de BDNF numa mistura com um portador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo actividade tumoricida podem ser utilizadas em formulações do tipo convencional tais como, por ex., soluções, xaropes, emulsões, injectáveis, comprimidos, cápsulas, ou supositórios.

Os portadores apropriados são bem conhecidos dos peritos na arte da farmacologia [ver por ex., Remingtons Practice of Pharmacy, 9a, 10a e 11a Edições] Exemplos de portadores incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrina, ágar, pectina, óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo, esgualeno e água. Adicionalmente, o portador ou diluente podem incluir um material retardador como monoestearato de glicerol ou diestearato de glicerol isolados ou com uma cera. Opcionalmente, podem ser utilizados estabilizadores químicos adequados, para melhorar a estabilidade da preparação farmacêutica. Os estabilizadores químicos adequados são bem conhecidos dos peritos na arte e incluem, por exemplo, ácido cítrico e outros agentes para ajustar o pH, agentes quelantes ou sequestrantes e antioxidantes.

As formulações da composição farmacêutica contendo K252a, estauroesporina, ou um seu derivado, ou qualquer outro inibidor de proteína-quinase, pode ser apresentado convenientemente sob a forma de uma unidade de dosagem e pode ser preparado por qualquer um dos processos convencionais. Alternativamente, a composição pode ser de uma forma adaptada para libertação lenta in vivo, como é conhecido na arte. Todos os processos incluem o passo de realizar a associação do ingrediente activo com o portador que pode ser constituído por um ou mais ingredientes acessórios. A quantidade da substância que será eficaz no tratamento de uma desordem ou condição particulares, dependerá da natureza da desordem ou da condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Numa concretização deste invento, seria desejável determinar a citotoxicidade anti-sentido do tipo de tumor a ser tratado in vitro. por ex., nos sistemas de ensaio descritos nos exemplos infra. e depois em sistemas de modelo animal úteis, antes do teste e uso em humanos.

Processos de introdução incluem, mas não são limitados a intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral e intranasal. Adicionalmente, pode ser

73 889 6526-089-118 desejável introduzir as composições farmacêuticas do invento no sistema nervoso central, por qualquer via adequada, incluindo injecção intraventricular e intratecal; a injecção intraventricular pode ser facilitada por um catéter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório, como um reservatório ommaya.

Para além disso, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas do invento localmente na área necessitada de tratamento; isto pode ser alcançado, por exemplo, e não ficando limitado a, por infusão local durante a cirurgia, por injecção, por meio de um catéter, ou por meio de um implante, sendo o dito implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como as membranas sialásticas, ou fibras. O invento também proporciona composições farmacêuticas que compreendem substâncias que interferem com uma ansa autócrina de BDNF administradas por via de lipossomas, micropartículas ou microcápsulas. Em várias concretizações do invento pode ser útil utilizar tais composições para conseguir a libertação sustida das substâncias. Numa concretização específica, pode ser desejável utilizar lipossomas dirigidos por via de anticorpos para antigénios tumorais específicos identificáveis (por ex., antigénios de superfície celular selectivos para neuroblastoma ou SCLC) [Leonetti et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 2448-2451 (1990); Renneisen et al. . J. Biol. Chem.. 265: 16337-16342 (1990)]. O K252a ou a estauroesporina ou seus derivados, bem como outros inibidores de proteína-quinase, podem também ser empregues de acordo com os processos e composições deste invento, isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico úteis no tratamento directo ou adjuntivo de certos cancros. Está contemplado que o K252a ou um seu derivado possa ser usado em combinação com os ácidos nucleicos anti-sentido de BDNF deste invento. Outros agentes, por ex., antimetabolitos, agentes alquilantes, alcaloides vinca,

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C~ - ‘ / õ' antibióticos antineoplásticos, derivados de platina, ureias substituídas, adrenocorticoesteróides, citoquinas, inter-leucinas, interferões ou anticorpos, podem ser também empregues em conjunção com esses inibidores de quinase para tratar uma variedade de cancros caracterizados por células que expressam BDNF e doenças relacionadas. 0 regime de dosagem envolvido na administração de uma quantidade eficaz de, por exemplo, K252a num processo para tratamento das condições abaixo descritas, será determinado pelo médico acompanhante, considerando vários factores que modificam a acção das drogas, por ex., a condição, o peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade do tumor, tempo de administração e outros factores clínicos. A dosagem das composições do invento utilizadas para tratar a condição específica da doença aqui descrita, pode variar dependendo da doença particular e da etapa da doença.

Está ainda contemplado que composições farmacêuticas contendo K252a ou um seu derivado, estauroesporina, ou outros inibidores de quinase também contenham outro agente terapêutico convencional, tal como. ciclofosfamida, citoquinas, interleucinas, interferões ou anticorpos, como acima mencionado. Está especialmente contemplado que os oligonucleótidos anti-sentido deste invento possam ser combinados com composições farmacêuticas contendo inibidores de proteína quinase. Quando estes agentes são combinados numa composição farmacêutica, está antecipado que cada ingrediente activo esteja presente na composição combinada na mesma concentração ou numa concentração ligeiramente inferior à que esse agente teria se fosse administrado isoladamente. 0 mecanismo terapêutico das composições e processos do presente invento difere, em princípio, do da larga maioria das drogas presentemente a uso para tratamento de tumores associados com a expressão de BDNF. Substâncias que interferem com a ansa autócrina de sobrevivência de BNDF, isoladas ou em combinação com outros agentes tumorocidas conhecidos, apresentam actividade

73 889 6526-089-118 -31 altamente específica de modo a que os pacientes não sofram as muitas desvantagens da terapia convencional para o cancro.

Os tumores que expressam BDNF susceptíveis de tratamento pelo presente processo e composições incluem, mas não estão limitados a, neuroblastoma, carcinoma de pulmão de célula pequena, e alguns tumores neuroepiteliais. Outros tipos de tumor que expressam BDNF podem ser identificados por vários processos conhecidos na arte. De acordo com o processo do presente invento pode ser analisado, tecido de tumor primário de um paciente quanto à expressão de BDNF antes do tratamento, caso seja desej ado. Àdicionalmente ao tratamento de desordens de mamíferos aqui apresentado, os processos e composições deste invento podem ser utilizados para fins veterinários no tratamento de tumores que expressam BDNF, que afligem cavalos, porcos, gado e aves de capoeira, por exemplo. Estas desordens podem ser tratadas utilizando quantidades do composto que podem ser usadas no tratamento das desordens de mamíferos acima apresentadas.

Utilidade do Diagnóstico A maioria das linhas de células de neuroblastoma humano expressam algum nível de ARNm de BDNF humano. A expressão de ARNm de BDNF parece ser única no neuroblastoma, com apenas algumas excepções (tais como o carcinoma de pulmão de célula pequena e algumas células de tumor neuroepitelial). Estes resultados sugerem que a expressão de ARNm de BDNF pode servir clinicamente como um marcador útil para o neuroblastoma humano, bem como para SCLC e para alguns tumores neuroepiteliais. Dado que o melhor marcador clínico para neuroblastoma, até à data, é a amplificação de N-myc e que N-mvc só é amplificado em aproximadamente 30% de todos os neuroblastomas em etapa tardia (Etapas III e IV), a expressão de ARNm de BDNF pode ser um marcador clínico mais útil e de mais largo espectro para ambos os neuroblastomas de etapa precoce e de etapa tardia.

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Identificacão de Células que Expressam BDNF Funcional ou Outros Receptores de Neurotrofina

Algumas linhas de células de neuroblastoma podem ser salvas eficazmente de efeitos citotóxicos de oligonucleótidos anti-sentido de BDNF pela adição quer de BDNF/ NGF ou NT-3 (ver Secção 6/ infra.)· Assim# pode prever-se que alguns neuroblastomas expressam receptores funcionais para BDNF, NGF ou NT-3 com base na capacidade destes ligandos individuais salvarem um destes tipos de células da citotoxicidade anti-sentido 5. Por exemplo# os nossos resultados (Exemplo 1.# Secção 1.1) sugerem que células de neuroblastoma LA-N-5 expressam receptores funcionais para NGF# BDNF e NT-3, enquanto que células LA-N-i expressam somente receptores funcionais para BDNF# e que células de neuroblastoma de CHP-134 e CHP-404 expressam tanto receptores de NGF como de BDNF# mas falham nos receptores de NT-3.

Engenharia Genética de um Sistema Celular Modelo que Imita Células Tumorais Dependentes de Ansa Autócrina.

Apesar da identificação de uma ansa autócrina de sobrevivência dependente de BNDF em neuroblastomas, as propriedades das células que reflectem uma tal ansa de sobrevivência, como níveis detectáveis de ARNm para trkB ou níveis detectáveis de um receptor de trk fosforilado constitutivamente, não foram detectados imediatamente. Estudos prévios de ansas autócrinas envolvendo factores mitogénicos convencionais demostraram que essas ansas podem funcionar na ausência de factor secretado detectável, com activação de receptor de ocorrência intracelular ocasional [Zhan e Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6.: 3541 (1986)]. Para além disso, a estimulação autócrina crónica pode resultar em regulação substancial na gama inferior da autofosforilação do receptor, bem como uma rápida reciclagem do receptor envolvido# podendo ambas dificultar ou impossibilitar a detecção de receptores fosforilados constitutivamente. De modo semelhante# a exposição contínua de células neuronais a NGF, enquanto requerido para a sobrevivência, resulta, eventualmente, em regulação substancial na gama inferior do receptor trkA activado [Kaplan et al. . Science 252:554 (1991)]. 73 889 6526-089-118 33-

Para superar estes problemas e para proporcionar um modelo celular que utilize uma ansa autócrina de BNDF, na qual a interrupção dessa ansa possa ser facilmente detectada in vitro. proporcionando assim, um sistema útil para pesquisar compostos com a capacidade de interromper uma tal ansa autócrina, foi criado um sistema celular recombinante. Este sistema utilizou uma ansa autócrina mediada por BDNF/trkB. Este sistema baseia-se numa variante da linha de células de fibroblastos NIH 3T3, cujo crescimento e sobrevivência em meios definidos necessita, de factor de crescimento de fibroblasto (FGF) ou de factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) [Lee e Donoghue, J. Cell Biol. 113!361 (1991)]; a morte destes fibroblastos devida à privação do factor, também é apoptótica [Ernfors et al.. Neuron 5.:511 (1990 )]. Quando estas células são transfectadas estavelmente com o receptor trkB, o BDNF pode substituir o FGF ou o PDGF [Glass et al.. Cell 66.:405 (1991)]. A co-transfecção destas células com ambos os trkB e BDNF leva a uma célula NIH3T3 [referida como 3T3(autócrina) ou MBx] que pode sobreviver em meios definidos sem a adição de factor de crescimento exógeno (i.e., elas tornam-se autócrinas para BDNF). Surpreendentemente, estas células NIH3T3 autócrinas são, em muitos aspectos, semelhantes a neuroblastomas dependentes de uma ansa autócrina de sobrevivência de BNDF. Por exemplo, elas apresentam uma susceptibilidade específica de sequência semelhante para oligómeros anti-sentido de BDNF, que pode ser superada por BDNF exógeno. Para além disso, estas células não secretam níveis detectáveis de BDNF para os meios nem apresentam níveis detectáveis de um receptor trkB fosforilado constitutivamente.

Adicionalmente, o K252a e a estauroesporina actuam em células NIH3T3 transfectadas com BDNF/trkB, crescidas em meios definidos, de um modo que é muito semelhante ao seu efeito em neuroblastomas, confirmando assim que tais células proporcionam um sistema de ensaio útil para a identificação de agentes que possam ser usados para destruir células tumorais dependentes de ansa autócrina, através da ruptura da ansa autócrina. Outros sistemas modelo de ansa autócrina, que são construídos para codificar e expressar um factor particular, bem como o receptor 73 889 6526-089-118 34-

para esse factor, podem também ser criados e utilizados, como é aqui contemplado, para identificar agentes que interrompem tais ansas autócrinas. Tais factores incluem, mas não estão limitados a, factor de crescimento do nervo, neurotrofina-3, neurotrofina-4, e factor neurotrofico ciliar.

De modo a que o invento aqui apresentado possa ser melhor compreendido na totalidade, são apresentados os exemplos seguintes. Deve ser entendido que estes exemplos são unicamente para fins ilustrativos e não devem ser encarados como limitantes deste invento de qualquer modo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Verificações Experimentais: Neuroblastoma

Como aqui descrito, mostrámos que oligonucleótidos anti-sentido dirigidos contra BDNF são citotóxicos in vitro para linhas de células de neuroblastoma, demonstrando assim que, células de neuroblastoma humano necessitam de BDNF como uma molécula de sobrevivência autócrina e que estas células de neuroblastoma podem ser salvas dos efeitos citotóxicos de BDNF anti-sentido através da administração de BDNF exógeno. Uma vez que a maior parte destas células de neuroblastoma não expressam níveis detectáveis de ARNm de trk B, os nossos dados implicam que possam existir receptores adicionais para BDNF. 1.1 Linhas de Células de Neuroblastoma de Humanos e Roedores, que Expressam ARNm de BDNF.

Pesquisámos um painel de linhas de células tumorais de humanos e roedores, por abordagens de transferências de Northern, quanto à expressão de ARNm de BDNF [Maisonpierre et al.. Science. 247:1446-1451 (1990)]. A Tabela I e a Figura 5 sumarizam estes resultados e indicam que a maioria das linhas de células de neuroblastoma (17 das 18 testadas) expressam ARNm de BDNF e que a expressão de ARNm de BDNF parece ser, de certo modo, única para o neuroblastoma. Por exemplo, só 3 de 12 neuroepiteliomas ou sarcomas de Ewing expressam ARNm de BDNF. Nenhum tumor não neural testado revelou expressar ARNm de BDNF.

As linhas de células de tumores não neuronais testadas incluíram retinoblastomas, melanomas, carcinomas (cervical e da mama) e leucemias. A única linha de células de neuroblastoma que não expressou ARNm de BDNF foi SH-SY5Y que é única, no sentido em que é toráxica, em oposição à origem derivada da cristã neural. 0 Dr. Mark Israel (UCSD) forneceu transferências de ARN de algumas destas linhas de células de neuroblastoma.

Tabela 1

Expressão de ARNm de BDNF em Linhas de Células Humanas* Linha de Células Expressão de BDNF

Neuroblastoma 382 + GICAN + NB-69 + CHP-404 + CHP-234 + CHP-134 + CHP-126 + NMB + KCNR + NGP + BE2 + KAN + GI + AS + LA-N-1 +/- LA-N-5 + IMR-32 + SH-SY5Y - I 73 889 6526-089-118 -36-

Tabela 1 (cont.)

Linha de Células Expressão de BDNF

Neuroepitelioma /Ewing SK-N-MC CHP-100 A4573 5838 EW-1 71 6647

N1050 32 DW + +

SK-N-LO LI

Linhas de Células Não Neuronais Y79 FOI BU2 Mol HL-60 COLO-320 HELA U937 K562 MCF7 *0s dados são um sumário de resultados de transferências de Northern de ARN de linhas de células humanas sondadas com BDNF humano. ( + ) indica expressão positiva de ARNm de hBDNF e (-) indica a ausência de ARNm de BDNF. (+/-) indica um nível de expressão muito baixo. (Dados Actuais de Transferência de Northern são apresentados na patente de BDNF). 73 889 6526-089-118 -37-

1.2 Oliqonucleótidos Antisentido Inibem a Tradução in vitro de ARNm de BDNF Foram sintetizados três oligonucleótidos anti-sentido complementares para várias regiões do gene de 5 BDNF humano [ver Publicação Internacional PCT Na W091/03568, publicado em 21 de Março de 1991], como se apresenta na Tabela II abaixo. Cada oligonucleótido ("oligo") foi construído como um mero 18 e os oligonucleótidos em sentido complementares serviram como controlos em todas as experiências. 0 oligo anti-sentido 5' (5'-AS-BDNF; SEQ ID NO:l) consistiu na sequência de ADN de BDNF humano, começando 3 nucleótidos a montante do presumível codão de iniciação ATG e extendendo-se a 4 codões a jusante desta metionina de iniciação. O segundo oligo anti-sentido correspondeu a uma sequência de ADN de BDNF em torno do local de processamento do resíduo dibásico (PS-AS-BDNF; SEQ ID NO:3) e o terceiro oligo anti-sentido (o S^AS-BDNF; SEQ ID N0:5) correspondeu aos 6 últimos codões de BDNF humano

Tabela II

Oliqonucleótidos de BDNF Anti-sentido SEQ. ID NO: 1 5'-AS-BDNF 5'-GAA AAG GAT GGT CAT CAC-3' 1 -129 a -124 5'-S-BDNF 5'-GTG ATG ACC ATC CTT TTC-3' 2 129 A -124 SEQ. ID NO: 3 PS-AS-BDNF 5'-GGC AGG GTC AGA GTG GCG-3' 3 1 a +5 PS-S-BDNF 5'-CGC CAG TCT GAC CCT GCC-3' 4 (Arg)(Lys) -1 a +5 SEQ. ID NO: 5 3’-AS-BDNF 5’-CTA TCC CCT TTT AAT GGT-3' 5 +113 a +119

3'-S-BDNF 5/-TTG ACC ATT AAA AGG GGA-3' 6 +113 a +119 AS - refere-se a sequência anti-sentido; s sequência com sentido; refere-se a

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PS - refere-se a local de processamento de aminoácido dibásico. O presumível codão de iniciação ATG é salientado na sequência 5'-S-BDNF. Os codões de resíduos dibásicos Arg-Lys estão indicados na sequência PS-S-BDNF. Todos os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador de ácidos nucleicos da Applied Biosystems.

Cada oligonucleótido de BDNF anti-sentido foi primeiro testado quanto à sua capacidade para inibir a síntese de BDNF, utilizando um sistema de tradução in vitro de lisado de semente de trigo (Figura 1). A síntese de BDNF (oligonucleótido +/-anti-sentido ou com sentido) foi seguida neste sistema de ensaio, por marcação metabólica com 35S-metionina, electroforese em gel de poliacrilamida, e fluorografia (Figura 1). Observou-se que um mero 18 aleatório (oligo de controlo) não teve efeito inibitório na síntese de BDNF in. vitro. em ambas as concentrações de 1 e 6 μΜ. 0 oligo 5'-AS-BDNF (SEQ ID N0:1) teve um leve efeito inibidor na síntese in. vitro de BDNF a uma concentração de 1 μΜ, e efeitos inibitórios profundos a 6 μΜ. Os 3'-AS-BDNF (SEQ ID NO:5) e o PS-AS-BDNF (SEQ ID N0:3), ambos inibiram eficazmente a síntese de BDNF em concentrações de 1 μΜ e 6 μΜ. Os oligos com sentido complementares tiveram pouco ou nenhum efeito sobre a síntese in vitro de BDNF a 1 μΜ, mas tiveram alguma actividade inibitória a concentrações muito elevadas (6 μΜ) (dados representativos apresentados para o oligo 57-S-BDNF (SEQ ID NO:2); Figura 1).

1.3 Oligonucleótidos Anti-sentido 3' para BDNF. mas não Antisentido 5’ ou com Sentido para BDNF. são Citotóxicos para Células de Neuroblastoma aue Expressem BDNF

Testámos os efeitos dos oligonucleótido de BDNF anti-sentido (5'-AS-BDNF, PS-AS-BDNF, e 3/-AS-BDNF) sobre a viabilidade celular quando adicionados directamente a culturas de células de neuroblastoma humano, in vitro.

As células de neuroblastoma humano foram cultivadas em meio essencial modificado de Eagle (EMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM e penicilina e estreptomicina, 1% 73 889

6526-089-118 de cada (meios completos). Para os ensaios anti-sentido, as células foram plaqueadas em placas Costar de 24 poços a uma densidade de sementeira de 2 x 104 células/poço. A absorção e incorporação de oligonucleótidos anti-sentido foi realizada pela adição dos oligos anti-sentido directamente nas células em EMEM sem soro. A concentração de oligonucleótidos com sentido ou anti-sentido adicionada aos meios de cultura das células, variou desde 0,1 até 50 μΜ (Figura 2). Após um período de incubação de 4 horas com o respectivo oligonucleótido, foi adicionado suplemento ITS (insulina, transferrina e selénio) aos poços de cultura de células e a viabilidade celular foi analisada 96 horas após a adição do oligo. Foram analisados e feita a média de poços em duplicado. A viabilidade celular foi analisada pela coloração de azul tripano. (Figura 2). os efeitos morfológicos de oligómeros de BDNF com sentido ou anti-sentido em células de neuroblastoma LAN-5 são apresentados nas fotomicrografias de luz na Figura 6. Como apresentado na Figura 2, a linha de células de neuroblastoma LA-N-5 foi a mais sensível aos efeitos citotóxicos do oligonucleótido 3'-AS-BDNF (SEQ ID NO:5). Mais do que 80% destas células foram mortas com 1 μΜ de 3'-AS-BDNF dentro de 96 horas. Células de neuroblastoma LA-N-1 foram um pouco menos sensíveis do que células LAN-5, uma vez que apenas 40% destas células foram mortas com 1 μΜ de 3'-AS-BDNF em 96 horas. Interessantemente, as células LA-N-1 expressam menos ARNm de BDNF do que as células LA-N-5. As células SK-ES e SH-SY5Y (que não expressam ARNm de BDNF) foram resistentes aos efeitos citotóxicos de 3'-AS-BDNF, mesmo a concentrações de 50 μΜ. Foi observada alguma perda de viabilidade celular a concentrações de 3'-AS-BDNF de 50 μΜ para estas linhas de células resistentes, mas a mesma perda de actividade celular foi observada quando estas células foram tratadas com 50 μΜ do oligonucleótido de controlo 3'-sentido-BDNF (3'-S-BDNF). De facto, não foi observada perda de células superior a 30% em nenhuma das quatro linhas de células quando tratadas durante 96 horas em meios isentos de soro com 3'-S-BDNF 50 μΜ. Finalmente, não foi observada nenhuma perda de viabilidade celular em nenhuma das linhas de células de neuroblastoma quando tratadas com o oligo 5'-AS-BDNF (SEQ ID N0:1) mas O PS-AS-BDNF (SEQ ID NO: 3) deu

resultados virtualmente idênticos com ο 37-AS-BDNF (SEQ ID NO:5).

Oligómeros anti-sentido de BDNF, mas não oligómeros de controlo, tiveram efeitos profundos na morfologia celular guando adicionados a culturas de neuroblastomas em baixas concentrações (Figura 6A-C). Como seria de esperar se estes efeitos fossem derivados da ruptura de uma ansa autócrina de BDNF, alterações na morfologia da célula mediadas por anti-sentidos poderiam ser evitadas pela adição de BDNF exógeno (Figura 6D). 1.4 Células de Neuroblastoma que Expressam BDNF Podem Ser Salvas Selectivamente dos Efeitos Citotóxicos do Oliaonucleótido 37-AS-BDNF pela Co-Adição de Neurotrofinas ao Sistema de Cultura de Células.

Figura 3 (A-E) apresenta os resultados de experiências de co-adição nas quais quer BDNF, N6F, ou neurotrofina 3 (NT-3) (100 ng/ml de cada factor recombinante purificado, obtido de células CHO transfectadas com o respectivo gene de neurotrof ina [ver Publicação Internacional PCT No W091/03568] foi adicionado simultaneamente com o oligonucleótido 3'-AS-BDNF (SEQ ID NO: 5) (50 μΜ) a várias células de neuroblastomas (i.e., SH-SY5Y (A), LA-N-1 (B), LA-N-5 (C), CHP-134 (D), CHP-404 (E)). A viabilidade celular foi determinada em poços em duplicado de uma placa de 24 poços, por coloração com azul tripano a intervalos de 24 horas após a adição de 3#-AS-BDNF +/- factor neurotrofico. O número de células foi também registado com um hemocitómetro. Como acima apresentado, a absorção e incorporação de oligonucleótidos foi realizada pela adição do oligo directamente ao sistema de cultura de células em condições de isenção de soro, durante 4 horas. Os resultados na Figura 3A demonstram que o 37-AS-BDNF não tem efeitos citotóxicos em células SH-SY5Y que são negativas para ARNm de BDNF. Tanto células CHP-134 como CHP-404 (Figuras 3D e E, respectivamente) são sensíveis aos efeitos citotóxicos do 37-AS-BDNF e cada uma destas linhas de células pode ser salva (70-90%) pela co-adição tanto de BDNF como NGF, mas não de NT-3. Células LA-N-l são apenas salvas da citotoxicidade de 37-AS-BDNF por BDNF (Figura 3B) enquanto que

células LA-N-5 são salvas por todas as três neurotrofinas (Figura 3C). Embora não esteja apresentado na Figura 3, foi observado que o oligonucleótido 3'-AS-BDNF era citostático bem como citotóxico em células LA-N-1, LA-N-5, CHP-134, e CHP-404, mas não em células SH-SY5Y. 1.5 Tratamento de Neuroblastomas com Oliaómeros Anti-sentido de BDNF Provoca Morte Apoptótica

Em contraste com os efeitos que resultam da ruptura de ansas autócrinas de factor de crescimento previamente descritas [Becker, et al.. EMBO J. £:3685 (1989); Morrison, J. Biol. Chem. 266:728 (1991); El-Badry, et al. J. Clin. Invest. 87:648 (1991); Selinfreund, et al.. J. Cell Biol. 111:2021 (1990)]f mesmo aqueles que se sabe serem operativos em neuroblastoma, os oligómeros de BDNF anti-sentido, não só evitaram o crescimento do neuroblastoma, mas também resultaram na morte das células tumorais de neuroblastoma (Figura 6B). Se o BDNF efectivamente funciona nestas células como uma molécula de sobrevivência neuronal, seria de esperar que pudesse ocorrer a morte devida à ruptura de uma ansa autócrina de BDNF, por mecanismos semelhantes aqueles previamente descritos para a morte celular neuronal a seguir à privação de factor neurotrofico [Martin, et al. J Cell Biol 106:829 (1988); Scott, et al. J. Neurobiol. 21: 630 (1990); Batistatou, et al. J. Cell Biol. 115: 461 (1991); Rukenstein, et al. J. Neurosci. 11.:2552 (1991)]. Embora os padrões morfológicos apresentados pelos neurónios que sofrem morte celular que ocorre naturalmente possam variar [Server, et al. em Apootosis. The Molecular Basis of Cell Death. pp. 263-279 (1991)], a morte neuronal pode geralmente ser marcada por algumas das mesmas alterações bioquímicas que caracterizam a morte celular programada noutros sistemas tais como o timo e a próstata (Batistatou, supra; Rukenstein, supra; Wylie et al. Int. Rev. Cytol.. 68:251 (1980)]. Em particular, a activação de endonucleases endógenas dependentes de cálcio que resultam na perda de ADN anterior à perda de proteína celular, pode ser um traço geral da morte programada ou "apoptótica" [Arends, et al.. Am. J. Pathol. 136:593 (1990)]. Tirámos vantagem de um ensaio de citometria de fluxo de coloração dupla (i.e., para ADN e

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proteína), para distinguir entre apoptose e necrose [Del Bino, et al. Exp. Cell Res. 193: 27 (1991); Jakobisiak, et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88.:3628 (1991)]. O perfil de ADN de células de neuroblastoma humano LA-N-5 é típico de muitas linhas de células de ciclo normal, com uma grande percentagem da população celular na fase G1 do ciclo celular, e o restante da população na fase S ou na fase G2+M (Figura 7A). O tratamento com oligómeros de BDNF anti-sentido resulta no aparecimento de uma população apoptótica de células LA-N-5, caracterizadas por um conteúdo de ADN significativamente reduzido na ausência de perda de proteína (Figura 7B); estas alterações são acompanhadas por um decréscimo na percentagem de células na fase S, como geralmente se observa em populações apoptóticas (Del Bino, supra). O salvamento, por BDNF, de células autócrinas tratadas anti-sentido, evita o surgimento da população apoptótica, como previamente observado na Figura 6D (Figura 7C). Apesar de as células de neuroblastoma não serem sensíveis a baixas concentrações de BDNF com sentido ou oligómeros de sequência aleatória, estes oligómeros resultaram, quando presentes em baixas concentrações (ver abaixo), em morte celular do neuroblastoma, bem como em morte das células não dependentes de ansas autócrinas de BNDF. Em contraste com o perfil apoptótico exibido pelas células de neuroblastoma tratadas com baixas concentrações de oligómeros anti-sentido de BDNF, elevadas concentrações de oligómeros com sentido resultaram em perfis de ADN e proteína consistentes com necrose - a perda de proteína celular é aparente sem efeito no conteúdo em ADN ou na percentagem de células na fase S (Figura 7D).

Para verificar que os oligómeros anti-sentido de BDNF operam de um modo dependente da sequência para matar especificamente células de neuroblastoma requerendo uma ansa autócrina de BDNF, comparámos a viabilidade de linhas de células de neuroblastoma quando expostas a concentrações variáveis de oligómeros quer com sentido quer anti-sentido. Estudos de resposta à dosagem revelaram que oligómeros de BDNF anti-sentido eram surpreendentemente mais potentes do que oligómeros de controlo na sua capacidade para matar um neuroblastoma que -43- 73 889 6526-089-118 expresse BDNF, LA-N-5 (Figura 8A). Contrariamente, oligómeros anti-sentido e de controlo eram igualmente ineficazes para matar o único neuroblastoma negativo para BDNF, SY5Y (Figura 8B). Embora a adição de BDNF exógeno não tivesse alterado os efeitos quer do oligómero com sentido quer do oligómero anti-sentido em células SY5Y (Figura 8B), o BDNF exógeno deslocou marcadamente a curva de morte de oligómeros anti-sentido em células LA-N-5 igualando a dos oligómeros com sentido de controlo (Figura 8A). Enquanto que a linha de células de sarcoma de Ewing negativa para BDNF, SK-ES, foi semelhante a SY5Y na sua insensibilidade para oligómeros de BDNF anti-sentido, o exame de 4 linhas de células adicionais positivas para BDNF (CHP-134, N18TG2, CHP-404 e LA-N-1) revelou uma susceptibilidade notável para oligómeros de BDNF anti-sentido, bem como uma capacidade para serem salvas por BDNF, que foi essencialmente indistinta da de células LA-N-5 (resultados não apresentados).

Assim, o oligómero de BDNF anti-sentido, actua de um modo específico para a sequência e apenas em neuroblastomas que expressem BDNF. Além disso, a toxicidade do oligómero anti-sentido é reduzida ao nível de oligómeros de controlo pela adição de BDNF exógeno. Juntamente com a nossa observação de que a morte do neuroblastoma provocada por oligómeros de BDNF anti-sentido ocorre por apoptóse, enquanto que a morte devida a concentrações superiores de oligómeros de controlo é necrótica, estes resultados demonstram inequivocamente que os oligómeros anti-sentido de BDNF activam selectivamente a morte celular apoptótica em neuroblastoma, pela ruptura da ansa autócrina de sobrevivência dependente da síntese continuada de BDNF. 1.6 Conclusão A maioria das linhas de células de neuroblastoma humano expressam um certo nível de ARNm de BDNF humano e a expressão de ARNm de BDNF parece ser única para o neuroblastoma com apenas algumas excepções (como carcinoma do pulmão de célula pequena e de alguns tumores neuroepiteliais). Estes resultados sugerem que a expressão de ARNm de BDNF possa servir como marcador clinicamente útil para o neuroblastoma humano. Dado que o melhor 73 889 6526-089-118 -44-

marcador clínico, até à data, para o neuroblastoma é a amplificação de N-myc e que N-myc só é amplificado em aproximadamente 30% de todos os neuroblastomas de etapa tardia (Etapas III e IV), a expressão de ARNm de BDNF pode ser um marcador clínico mais útil e de espectro mais vasto tanto para neuroblastomas de etapa precoce como de etapa tardia.

Os oligonucleótidos 37-AS-BDNF (SEQ ID NO: 5) e PS-AS-BDNF (SEQ ID NO: 3) são citostáticos e citotóxicos apenas naquelas células de neuroblastoma humano que expressam ARNm de BDNF. Estes resultados implicam que neuroblastomas positivos para ARNm de BDNF necessitem de uma ansa autócrina de BNDF para a sua própria proliferação e sobrevivência. Os nossos resultados sugerem que pelo menos alguns neuroblastomas podem ser mortos especificamente e eficazmente por tratamento com oligonucleótidos de BDNF anti-sentido.

Algumas linhas de células de neuroblastoma podem ser salvas eficazmente dos efeitos citotóxicos de oligonucleótidos de BDNF anti-sentido, pela adição quer de BDNF, NGF ou de NT-3.

Exemplo 2

Verificações experimentais: Carcinoma de Pulmão de Célula Pequena

2.1 Linhas de Células de Carcinoma de Pulmão de Célula Pequena expressam ARNm de BDNF

Com o objectivo de melhor compreender o potencial papel de BDNF como factor de sobrevivência autócrino para tumores de carcinoma de pulmão de célula pequena, utilizámos uma abordagem por transferência de Northern para examinar a expressão de ARNm de BDNF em várias linhas de células de carcinoma de pulmão de célula pequena.

Foram obtidas do laboratório do Dr. Jim Battey no NIH amostras de ARN total preparadas a partir de seis linhas de células diferentes de carcinoma de pulmão de célula pequena. As linhas de células apresentadas na Figura 4 são as seguintes: H82 -45-

73 889 6526-089-118 (faixa 2), H209 (faixa 3), H345 (faixa 4), H378 (faixa 5), H510 (faixa 6), e N417 (faixa 7). Foram utilizados 10 μg de ARN de cada linha de células para a transferência de Northern, e o nível de ARNm de BDNF foi comparado directamente com cérebro de rato adulto (faixa 1). Verificámos que todos os seis carcinomas de pulmão de célula pequena expressavam algum ARNm de BDNF. Foram detectados dois transcriptos, como demonstrado previamente para tecidos e linhas de células de neuroblastoma [Maisonpierre et al.. Science. 247: 1446-1451 (1990)]. A linha de células de carcinoma de pulmão de célula pequena H378 (faixa 5) expressou níveis particularmente elevados de ARNm de BDNF: aproximadamente 2 a 3 vezes os que foram expressos em cérebro de rato adulto (faixa 1).

2.2 Oliaonucleótidos Anti-sentido 3' para BDNF mas não Com Sentido ou Anti-sentido de 5' para BDNF. são Citotóxicos para Células de Carcinoma de Pulmão de Célula Pecmena que Expressam BDNF

Nucleótidos de BDNF anti-sentido preparados como apresentado no Exemplo 1.2, foram adicionados directamente a culturas de células de SCLC (H345 e H378) in vitro. Os ensaios foram conduzidos como apresentado no Exemplo 1.3. A concentração de oligonucleótido com sentido ou anti-sentido adicionado aos meios de cultura de células variou de 0,1 até 50 μΜ (Figura 8). Após um período de incubação de 4 horas com o respectivo oligonucleótido, foi adicionado suplemento ITS (insulina, transferrina e selénio) aos poços de cultura de células, e a viabilidade celular foi analisada 96 horas após a adição dos oligonucleótidos. Foram analisados poços em duplicado pela coloração de azul tripano. Como apresentado na Figura 9, tanto as células H345(8A) como H378(8B) foram extremamente sensíveis aos efeitos citotóxicos do oligonucleótido anti-sentido 3' para BDNF (SEQ ID NO: 5), mas não aos do oligonucleótido com sentido 5'. 2.3 Células de SCLC aue Expressam BDNF Podem Ser Salvas Selectivamente do Efeito Citotóxico do Oligonucleótido 3r-AS-BDNF pela Co-Adicão de BDNF ao Sistema de Cultura de

73 889 6526-089-118 -46-

Células A Figura 9 (A & B) apresenta o resultado das experiências de co-adição nas quais BDNF (100 ng/ml, obtido a partir de células CHO transfectadas com o respectivo gene da neurotrofina) foi adicionado simultaneamente com o oligonucleótido 3'-AS-BDNF (SEQ ID NO: 5) a culturas de células de SCLC H345 e H378. Como apresentado na Figura 9, ambas as linhas de células foram salvas pela co-adição de BDNF. 2.4 Conclusão

Adicionalmente aos neuroblastomas humanos, as linhas de células de SCLC expressam algum nível de ARNm de BDNF humano. Estes resultados sugerem que a expressão de ARNm de BDNF pode servir clinicamente como um marcador útil para SCLC.

Os oligonucleótidos 3'-AS-BDNF (SEQ ID NO: 5) e PS-AS-BDNF (SEQ ID NO: 3) são citostáticos e citotóxicos em ambas as linhas de células de SCLC testadas. Estes resultados implicam que linhas de SCLC positivas para ARNm de BDNF necessitam de uma ansa autócrina de BNDF para a sua própria proliferação e sobrevivência e que tais células podem ser mortas eficazmente por tratamento com oligonucleótidos de BDNF anti-sentido.

Exemplo 3 3.1 0 K252a Bloqueia a Via de Transducão de sinal de NGF, mas não a de FGF. em células PC12

De modo a estabelecer que o K252a possa actuar de modo a bloquear especificamente respostas celulares mediadas pela neurotrofina, examinámos o perfil de fosforilação da tirosina de lisados de proteína total preparados a partir de células PC-12 que tinham sido estimuladas com NGF ou FGF, na presença ou na ausência de três inibidores de proteína quinase estruturalmente relacionados: K252a (isolado da microbactéria Norcardiopsis sp.). estauroesporina (isolada de Streptomvces sp.) ou H-7(di-hidrocloreto de l-(5-isoquinolinassulfonil)-2-metilpipe-rizina).

Comparámos a fosforilação da tirosina em lisados totais

73 889 6526-089-118 preparados de células de PC-12 que foram pré-tratadas com inlbidores de quinase, K252a, estauroesporlna ou H-7 durante 15 minutos, e aos quais foram então administrados NGF ou FGF durante 5 minutos. As células PC-12 foram crescidas até aproximadamente 70% de confluência em placas de cultura de tecidos de 100 mm, com meio contendo soro (DME suplementado com 6% de soro equino, 6% de soro de vitela, 1% de glutamina, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina). Os factores e inibidores de crescimento foram diluídos no mesmo meio e administrados às células em alíquotas de 200 microlitros.

Após incubação, lavámos as células duas vezes a 4 °C com solução salina tamponada com fosfato, contendo ortovanadato de sódio 1 mM. A aspiração completa do tampão de lavagem foi seguida pela lise das células utilizando 500 microlitros de tampão RIPA suplementado (solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio, mas contendo 1% de NP40, 0,5% de DOC, 0,1% de SDS, ortovanadato de sódio 1 mM, PMSF 1 mM, 0,14 TlU/mg de aprotinina). Misturámos as placas utilizando um misturador Vari a 4 °C durante 15 minutos para lisar as células. O lisado das células foi transferido para um tubo Eppendorf de 2,2 ml e centrifugado durante 15 minutos a 4 °C. Removemos e deitámos o sedimento no gelo, usando um palito estéril. 0 sobrenadante representava o lisado total e foi preparado com corante de aplicação de proteína na proporção de lx para 5x, respectivamente. 0 lisado foi fervido a 95 eC durante 3 a 5 minutos, separado num gel de a 10% SDS-poliacrilamida, transferido para Immobilon (Millipore) e então confrontado com anticorpos anti-fosfotirosina (UBI) a 1:1000. Para detecção por autorradiografia foi usado um microlitro/ml de IgG anti-rato de cabra conjugado com 125I. (SA= 13 μΟ/ταΙ).

A análise da autorradiografia do gel de electroforese resultante mostrou que, em comparação com células PC-12 não tratadas, 0,01% ou 0,02% de DMSO não era tóxico para as células e não alterava o padrão de fosforilação. Adicionalmente, a electroforese foi corrida com amostras de cada uma das seguintes células que foram tratadas somente com inibidores [K252a 100 nM -48- 73 889 6526-089-118 e 200 nM, estauroesporina lOOnM e H-7 25 μΜ]; células que foram tratadas somente com factores [100 ng/ml de NGF; 10, 50, 100 e 200 ng/ml de FGF]; células que foram pré-tratadas com inibidores seguido pela administração de 100 ng/ml de NGF [K252a 100 nM e 200 nM, estauroesporina 100 nM, H-7 25 μΜ] e células que foram pré-tratadas com inibidores seguidos pela administração de 50 ng/ml de FGF [K252a 100 nM e 200 nM, estauroesporina 100 nM, H-7 25 nM]. Os inibidores foram ressuspensos pelo fabricante em DMSO e adicionados às células numa concentração final que não excedia os 0,02%.

Comparada com o controlo não tratado, a administração de NGF (100 ng/ml) às células PC-12 durante 5 minutos resultou na fosforilação rápida da tirosina de ERK1 (43 Kd) e de ERK2 (41 Kd) juntamente com uma proteína de elevado peso molecular (140 Kd) que se presumiu ser o receptor TrkA. A estimulação de células PC-12 com 10-100 ng/ml de FGF resultou apenas em fosforilação da tirosina detectável da ERK2 enquanto que com 200 ng/ml de FGF se inibiu este efeito. O tratamento apenas com os inibidores ou com DMSO (veículo de controlo) não afectou o perfil de fosforilação. O H-7 não bloqueou as vias de transdução de sinal nem de NGF nem de FGF. A estauroesporina e o K252a bloquearam significativamente a via do NGF como reflectido na perda de fosforilação da tirosina de TrkA, ERK1 e ERK2, mas não a via do FGF uma vez que a fosforilação do ERK2 permaneceu ao nível do controlo.

Em conclusão, observámos que o NGF e o FGF estimulam precocemente as respostas celulares nas células PC-12 através de vias de transdução de sinal independentes, diferenciadas pela especificidade das respostas mediadas por NGF a estauroesporina e ao K252a.

Exemplo 4 4.1 0 K252a Bloqueia a Estimulação pelo BDNF da Fosforilação da

Tirosina do trkB e da ERK 73 889 6526-089-118

-49-

Para determinar se a acção do K252a podia também bloquear a via de transdução de sinal do BDNF, construímos células 3T3 para expressar um receptor trkB funcional. Demonstrámos previamente que estas células 3T3 que expressam trkB estão dependentes do BDNF para a sua sobrevivência e proliferação em meios definidos [D. J. Glass et al.. Cell. 66.:405-413 (1991)]. 0 mesmo painel de inibidores usados nos ensaios com as células PC-12 foram administrados às células 3T3 que expressam trkB.

Comparámos a fosforilação da tirosina em lisados totais de células de neuroblastoma (N18TG2) e células 3T3 que expressam trkB que foram pré-tratadas com os inibidores utilizados no Exemplo 3, durante 15 minutos, mas em que depois foram administrados 100 ng/ml de BDNF durante 5 minutos. Processámos e imunotransferimos os lisados com anticorpos antifosfotirosina como descrito no Exemplo 3. Os lisados de células não tratadas e tratadas com BDNF foram comparados com células que foram pré-tratadas apenas com inibidores [H-7 25 μΜ, K252a 100 nM e estauroesporina lOOnM], e células que foram previamente tratadas com inibidores e a que foram então administradas 100 ng/ml de BDNF [H-7 25 μΜ, K252a 100 nM e estauroesporina 100 nM].

As imunotransferências de receptores trkB autofosforilados, imunoprecipitados a partir dos lisados da proteína total de células 3T3 (autócrino) tratadas com BDNF e células de neuroblastoma (N18TG2) tratadas e não tratadas, são apresentadas na Figura 10. Estes resultados indicaram que a administração de BDNF a estas células resultava na fosforilação rápida de trkB e ERK2 como comparado com o controlo não tratado. De acordo com os dados das células PC-12 apresentados no Exemplo 3, o padrão de fosforilação da tirosina revelou que o pré-tratamento de células com K252a e estauroesporina, mas não com H-7, aboliu a fosforilação da tirosina de trkB estimulada por BDNF. Os inibidores só por si não pareceram alterar o perfil de fosforilação da tirosina. A estauroesporina bloqueou completamente a fosforilação de EKK2, mas com K252a 100 nM, a fosforilação da tirosina de ERK2 era ainda imediatamente detectável. Uma vez que K252a 100 nM bloqueou aproximadamente

73 889 6526-089-118 -50-50% da fosforilação de ERK1 e ERK2 em células 20 PC-12, uma estimulação mínima do receptor trkB por BDNF (não detectável com este ensaio) pode ser suficiente para transmitir uma resposta intracelular.

Exemplo 5 5.1 0 K252a Interrompe a Transducão do Sinal de Trk e Causa a Morte em Linhas de Células Dependentes da Activacão do Receptor Trk para a sua Sobrevivência.

As nossas verificações com células 3T3 que expressam trkB, indicam que o K252a pode causar a ruptura de uma ansa autócrina de sobrevivência de BDNF inibindo a fosforilação e a activação do receptor trkB em resposta ao BDNF. Examinámos esta hipótese utilizando 4 linhas de células de neuroblastoma humano bem como o sistema de células modelo fibroblastos 3T3f uma linha de células de carcinoma de pulmão de célula pequena (NCI-H69-1-1) e uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão (Calu-3). A linha de células 3T3 escolhida para estes estudos está dependente do FGF para a sobrevivência em meios definidos isentos de soro. Demonstrámos previamente que células 3T3 que expressam trkA sobrevivem em meios definidos suplementados com NGF enquanto que, células 3T3 que expressam trkB sobrevivem em meios definidos suplementados com BDNF [Glass et al. . Cell 66.:405-413 (1991)]. As células 3T3 que expressam tanto trkB como BDNF, sobrevivem em apenas meios definidos e servem como um útil sistema modelo de células para a sobrevivência autócrina, assemelhando-se a linhas de células de tumores de neuroblastoma humanos. Das linhas de células de neuroblastoma, tanto as células LA-N-5 como as células SK-N-LO expressam o ARNm de BDNF, enquanto as células SH-SY5Y e SK-ES não expressam o ARNm de BDNF. Contudo, a expressão de trkB ao nível do ARNm foi apenas detectável na linha de células LA-N-5.

De modo a examinar os efeitos do inibidor da proteína quinase K252A na sobrevivência das células de neuroblastoma humano, nas células de carcinoma de pulmão de células pequenas e nas células 3T3 que expressam trkB, desenvolvemos um ensaio de -51- & & 73 889 6526-089-118 viabilidade celular com base na utilização da glucose. O princípio subjacente a este ensaio deriva do facto de que células viáveis irão metabolizar a glucose fornecida nos seus meios de crescimento enquanto as células mortas não. Assim, a concentração de glucose nos meios de crescimento está inversamente relacionada com o número de células viáveis na cultura. As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade aproximada de 2 x 10^ células por poço. Células de neuroblastoma humano, células SCLC e células de adenocarcinoma de pulmão foram cultivadas em RPMI 1640 com soro fetal bovino, enquanto as células 3T3 foram cultivadas em meios definidos isentos de soro com a neurotrofina apropriada (i.e., FGF, BDNF ou NGF a 500 pM) [Glass, et al.. Cell supra]. As células 3T3 autócrinas TrkB/BDNF (MBx) foram cultivadas em apenas meios definidos. Todos os meios de cultura de células continham 450 mg/dl de glucose na altura da sementeira celular. A 36 horas após a sementeira, foi adicionado K252a (solubilizado em DMSO -ver Exemplo 1) em concentrações de 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1000, e 2000 nM. Todos os ensaios foram efectuados em triplicado. A morfologia celular foi monitorizada visualmente e a viabilidade celular foi anlisada pelo ensaio de utilização de glucose depois de 6 dias em cultura. A concentração de glucose (mg/dl) foi determinada pela transferência de uma alíquota de 50 μΐ dos meios de crescimento para fitas de glucose do sangue e leitura destas fitas 2 minutos mais tarde num monitor de glucose do sangue.

Foi efectuada a média das leituras de glucose e depois representada versus a concentração de K252a para estimar a LD50 para cada droga em cada linha de células. A Tabela 3 apresenta os valores de LDgg para cada linha de células. Os nossos resultados (Figura 11) demonstram que a K252a é citocidal para células de neuroblastoma humano e que este inibidor do receptor da tirosina-quinase é eficaz para linhas de células de neuroblastoma que necessitam de uma ansa autócrina de BDNF para a sua sobrevivência em cultura (i.e., SK-N-LO e LA-N-5). Por exemplo, células LA-N-5 são aproximadamente 20 a 150 vezes mais sensíveis aos efeitos citocidais de K252a do que células SK-ES 73 889 6526-089-118

-52- ou SH-SY5Y, respectivamente. Células SK-N-LO também são mais sensíveis a K252a (2,5 a 19 vezes) do que células de SK-ES ou SH-SY5Y. Uma vez que células SK-N-LO aparentemente não expressam trkB, os nossos dados sugerem também que estas células podem expressar um único receptor de BDNF semelhante a trk e sensível a K252a ou, alternativamente, que o nível de expressão de trkB nestas células é inferior aos limites detectáveis. Além disso, os nossos dados demonstram que inibidores da proteína-quinase como K252a são citocidais para células de carcinoma de pulmão de célula pequena, mas não são citocidais para células de adenocarcinoma de pulmão. A comparação do efeito da K252a em 3T3 autócrinas, células de neuroblastoma (N18TG2), carcinoma de pulmão de célula pequena (NCI-H69) e células de adenocarcinoma de pulmão (Calu-3) é apresentada na Figura 12. TABELA 3

Tioo de célula Neuroblastoma SK-ES SH-SY5Y LA-N-5 SK-N-LO Células de Fibroblasto

Excrescência de neurite £^50 200 nm 1500 nm 10 nm 80 nm

(5 dias) NE NE <25 nm NE MBx 25 nm MG87 (+FGF) 175 nm MG87 trkA (+NGF) 30 nm MG87 trkB (+BDNF) 30 nm Células de Carcinoma de Pulmão de Célula Pequena NCI-H69 100 nm Células de Adenocarcinoma de Pulmão

CaLu-3 750 nm Células MG87 são células 3T3 que necessitam de fgf para sobrevivência em meio definido. Células MG87 trk-A necessitam de NGF. Células MG87 trk-B necessitam de BDNF. NE = Nenhum Efeito

73 889 6526-089-118

Também mostrámos que o K252a e a estauroesporina são mais eficazes (aproximadamente 6 vezes) para fibroblastos 3T3 que expressam quinases de receptor trk (MBx, MG87 trkA e MG87 trkB) que necessitam de neurotrofinas para sobrevivência em meios definidos, em relação às células progenitoras 3T3 (MG87) que sobrevivem em meios definidos suplementados com FGF. Estes dados com as células 3T3 transfectadas, proporcionam um argumento convincente em como os efeitos citocidais de K252a e de estauroesporina são mais pronunciados para a família de receptores trk relativamente à tirosina-quinase dos receptores de FGF. Cumulativamente, os nossos dados apoiam a hipótese de que o K252a interrompe selectivamente a via de transdução do sinal neurotrof ina/receptor trk e que o K252a e a estauroesporina são inibidores eficazes da ansa autócrina de sobrevivência de trkB/BDNF.

Finalmente, observámos que com concentrações de K252a de aproximadamente 25 nM ou menos, podia ser detectado um efeito antiproliferativo pronunciado, bem como uma excrescência de neurite significativa, em células de neuroblastoma LA-N-5 próximo dos 4 a 5 dias de cultura. Estas alterações morfológicas são reminiscentes da indução por NGF da diferenciação celular em LA-N-5. Estas observações em relação a baixas concentrações de K252a sugerem que esta droga pode funcionar como um agonista parcial da via de transdução de sinal do receptor trk.

Como aqui descrito, mostrámos que o K252a pode ser um antagonista selectivo importante da via de transdução do sinal neurotrof ina/receptor de trk e, por isso, pode ser potencialmente útil, terapeuticamente, para a morte de células tumorais derivadas, neuronalmente, dependentes de uma ansa autócrina de sobrevivência de BDNF. Esperamos que outras linhas de células de cancro que expressam BDNF possam ser afectadas por K252a de modo semelhante. Por exemplo, seria de esperar que alguns tumores neuroepiteliais fossem afectados adversamente por K252a e outros inibidores de proteína*quinase.

Embora certas concretizações do invento tenham sido

73 889 6526-089-118 -54- descritas em particular, será óbvio para os peritos na arte que podem ser realizadas muitas modificações e variações. Assim, o presente invento não deve ser encarado como limitado por nenhuma das concretizações particulares apresentadas, devendo em vez disso o seu âmbito ser definido apenas pelas reivindicações que se seguem.

DEPÓSITOS A seguinte linha de células foi depositada na Amerian Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.

DEPÓSITO

NÚMERO DE ACESSO MBx -55- 73 889 6526-089-118 (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:l:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc

(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:l: GAAAAGGATG GTCATCAC (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc

(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:2: GTGATGACCA TCCTTTTC (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:3:

GGCAGGGTCA GAGTGGCG 73 889 6526-089-118 C! // Μ, -56-

t (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:4:

CGCCAGTCTG ACCCTGCC (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc

(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:5: CTATCCCCTT TTAATGGT (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 18 pares de bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: simples (D) Topologia: desconhecida (ii) Tipo de molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO:6:

TTGACCATTA AAAGGGGA

Claims (44)

1. I 73 889 6526-089-118 -57-

   REIVINDICACÕES 1 - Oligonucleótido Isolado, caracterizado por consistir em pelo menos seis nucleótidos e compreender uma sequência complementar a pelo menos uma porção de um transcrito de ARN de um gene de factor neurotrófico derivado de cérebro, oligonucleótido que é hibridável com o transcrito de ARN.
2. 2 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o gene de factor neurotrófico derivado de cérebro ser um gene humano.
3. 3 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por consistir em pelo menos 18 nucleótidos.
4. 4 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser seleccionado do grupo consistindo em: 5'-GGC AGG GTC AGA GTG GCG-3' 5'-CTA TCC CCT TTT AAT GGT-3'.
5. 5 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter uma sequência complementar a uma porção do ARN de factor neurotrófico derivado de cérebro contendo os codões que codificam o sítio de processamento Arg-Lys.
6. 6 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter uma sequência complementar a uma porção do ARN de factor neurotrófico derivado de cérebro que se situa entre os últimos 6 codões do ARN.
7. 7 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter pelo menos um nucleótido modificado.
8. 8 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por conter pelo menos uma parte base modificada.
9. 9 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por conter pelo menos uma parte açúcar modificada.

   73 889 6526-089-118 -58
10. 10 - Oligonucleótido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por conter pelo menos um esqueleto de fosfato modificado.
11. 11 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 1; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
12. 12 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 2; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
13. 13 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 3; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
14. 14 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 4; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
15. 15 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 5; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
16. 16 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 6; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
17. 17 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 7; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
18. 18 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 8; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
19. 19 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 9; e um portador farmaceu-

    73 889 6526-089-118 -59-

    ticamente aceitável.
20. 20 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o oligonucleótido da reivindicação 10; e um portador farmaceu-ticamente aceitável.
21. 21 - Processo para inibir a expressão de uma sequência de ácido nucleico codificando factor neurotrófico derivado de cérebro ou uma sua porção numa célula, caracterizado por compreender proporcionar à célula uma quantidade eficaz do oligonucleótido da reivindicação 1.
22. 22 - Processo para inibir a expressão de uma sequência de ácido nucleico codificando factor neurotrófico derivado de cérebro ou uma sua porção numa célula, caracterizado por compreender proporcionar à célula uma quantidade eficaz do oligonucleótido da reivindicação 2.
23. 23 - Processo para o diagnóstico da presença de um tumor num paciente, de um tipo de tumor caracterizado pela expressão de um gene de factor neurotrófico derivado de cérebro, caracterizado por compreender detectar a expressão de um gene de factor neurotrófico derivado de cérebro em células do paciente que suspeita serem células de tumor, sendo a expressão detectada pela detecção da produção de ARN ou proteína de factor neurotrófico derivado de cérebro .
24. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado por o tumor ser um neuroblastoma.
25. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o tumor ser um carcinoma das células pequenas do pulmão.
26. 26 - Processo para identificar uma célula que expressa re-ceptores do factor neurotrófico derivado de cérebro, caracterizado por compreender: (a) expor a célula in vitro a (i) uma quantidade citotóxica do oligonucleótido da reivindicação 1, e (ii) uma quantidade apropriada de factor neurotrófico derivado de cérebro; e (b) detectar a sobrevivência da célula, indicando a sobrevivência da célula na presença do oligonucleótido e do factor neurotrófico derivado de cérebro a expressão de receptores do factor neurotrófico derivado de cérebro pela célula.
27. 27 - Processo para identificar uma célula que expressa receptores de neurotrofina-3, caracterizado por compreender: (a) expor a célula in vitro a (i) uma quantidade citotóxica do oligonucleótido da reivindicação 1, e (ii) uma quantidade apropriada de neurotrofina-3; e (b) detectar a sobrevivência da célula, indicando a sobrevivência da célula na presença do oligonucleótido e da neurotrofina-3 a expressão de receptores de neurotrofina-3 pela célula.
28. 28 - Processo para identificar uma célula que expressa receptores do factor de crescimento do nervo, caracterizado por compreender: (a) expor a célula in vitro a (i) uma quantidade citotóxica do oligonucleótido da reivindicação 1, e (ii) uma quantidade apropriada de factor de crescimento do nervo; e (b) detectar a sobrevivência da célula, indicando a sobrevivência da célula na presença do oligonucleótido e do factor de crescimento do nervo a expressão de receptores do factor de crescimento do nervo pela célula.
29. 29 - Composição farmaceuticamente aceitável, caracterizada por compreender, como ingrediente activo, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de K252a com pelo menos uma substância seleccionada do grupo consistindo em portadores, diluentes,

    73 889 6526-089-118 -61- excipientes e adjuvantes farmacêuticos, para o tratamento de tumores que expressam BDNF.
30. 30 - Composição de acordo com a reivindicação 29, caracte-rizada por compreender adicionalmente pelo menos um outro agente quimioterapêutico seleccionado do grupo consistindo em antimetabolitos, agentes alquilantes, alcaloides vinca, antibióticos antineoplásicos, derivados de platina, ureias substituídas, adrenocorticosteróides, citoquinas, interleucinas, interferões e anticorpos.
31. 31 - Processo para identificar um agente capaz de inibir o crescimento ou de provocar a morte de uma célula, caracterizado por compreender: (a) expor uma primeira e uma segunda células a um agente, expressando a referida primeira célula um receptor recombinante para um factor neurotrófico e dependendo a sobrevivência da primeira célula da presença do factor neurotrófico, e a segunda célula é do mesmo tipo do que a primeira célula e a referida segunda célula não expressa o receptor recombinante e não depende da presença do factor neurotrófico para a sobrevivência; e (b) detectar uma diminuição no crescimento ou sobrevivência da primeira célula na presença do agente e do factor neurotrófico, relativamente ao crescimento ou sobrevivência da segunda célula na presença do agente , pelo que a diminuição indica a capacidade do agente inibir ou provocar a morte da célula.
32. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracte-rizado por o referido factor neurotrófico ser BDNF.
33. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos primeiro e segundo tipos de células serem fibroblastos.
34. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por os referidos fibroblastos serem células NIH3T3.

    73 889 6526-089-118 -62-
35. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteri-zado por o referido factor neurotrófico estar presente por adição exógena.
36. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteri-zado por o referido factor neurotrófico estar presente por produção endógena pela célula.
37. 37 - Composição compreendendo o oligonucleótido da reivindicação 1 para uso num processo de redução do crescimento ou para provocar a morte de uma célula de tumor que expressa BDNF.
38. 38 - Uso de uma composição compreendendo K252a ou seus derivados, estauroesporina ou seus derivados, ou uma tiazolidinadiona ou seus derivados para a produção de um medicamento para redução do crescimento ou para provocar a morte de células de tumor que expressam receptor de BDNF.
39. 39 - Linha de células caracterizada por conter um ácido nu-cleico recombinante que codifica um factor neurotrófico e um ácido nucleico recombinante que codifica um receptor para essse factor, sendo a referida célula capaz de sobreviver em meio isento de soro.
40. 40 - Linha de células de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por o referido factor neurotrófico ser seleccionado de entre o grupo consistindo em BDNF, factor neurotrófico ciliar, factor de crescimento de nervo, neurotrofina-3 e neurotrofina-4.
41. 41 - Linha de células de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por o referido factor neurotrófico ser BDNF.
42. 42 - Linha de células de acordo com a reivindicação 41, caracterizada por o referido receptor ser trkB.
43. 43 - Linha de células, caracterizada por ser a linha de células MBx depositada no American Type Culture Collection com o -63- 73 889 6526-089-118 número de acesso....
44. 44 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido primeiro tipo de células ser MBx. Lisboa, 3; JBL 1992 Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. =0 AGENTE 0FICIAL=