Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego zwiazku 38 295 o charakterze antybio¬ tyku, nalezacego do grupy kwasowych eterów po- licyklicznych. Te klase zwiazków mozna scharak¬ teryzowac biologicznie ich wplywem na przenosze¬ nie kationów w mitochondriach. Ta rodzina anty¬ biotyków obejmuje monensyne, /J. Amer. Chem.Soc, 89:5737, 1967/, nigerycyne /Biochem. Biophys.Res. Comm., 33:20, 1908/, gryzoryksyne /J. Chem. iSoc. Chem. Commun., 1421 1970/, dianemycyne /J.Antibiotics, 22:161, 1969/, salinomycyne /J. Anti- biotics, 27:814, 1974/ X-537 A /J. Chem. Soc. Chem.Commun., 967, 19712/, X-206 /J. Chem. Soc. Chem.Commun., 927, 1971/ i A204 A /J. Amer. Chem.Soc, 95:3399, 1973/.Wymienione eterowe antybiotyki policykliczne wykazuja aktywnosc przeciwko bakteriom Gram- -dodatnim, grzybom i pierwotniakom. Wykazuja one potencjalna aktywnosc przeciwko kokcydiozie.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 839 557 opisano sposób lepszego wy¬ korzystania paszy przez zwierzeta przezuwajace i jednozoladkowe, które skarmiano wlóknista sub¬ stancja roslinna, podajac jednoczesnie monensyne, dianemycyne, nigerycyne lub inne eterowe anty¬ biotyki policykliczne.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zwiazku 38 295 o charakterze antybiotyku o wzorze przedstawionym na rysunku.Antybiotyk wytwarza sie przez hodowanie Strep- tomyces hygroscopicus ATCC 31 050 w wodnym srodowisku, zawierajacym pozywke, w warunkach aerobowych w zanurzeniu. Antybiotyk i jego ka¬ tionowe sole sa potencjalnymi srodkami niszcza¬ cymi drobnoustroje, a takze sa efektywnymi srod¬ kami przeciw kokcydiozie i srodkami promotuja- cymi wzrost zwierzat.Mikroorganizm, stosowany do wytwarzania an¬ tybiotyku sposobem wedlug wynalazku, wyizolo¬ wano z próbki gleby, pochodzacej z Japonii. Ho¬ dowano go w wielu róznych srodowiskach, sto¬ sowanych do identyfikacji tego gatunku i stwier¬ dzono, ze jest on zupelnie podobny do Streptomy- ces hygroscopicus.Kulture Pfizer F. D. 23 604 porównywano z wielu róznych wzgledów w róznych srodowiskach z kul¬ tura Streptomyces hygroscopicus 48 248, otrzyma¬ na z holenderskiego zbioru szczepów muzealnych, Central bureau voor Schimmelcultures /CBS/. Po¬ równanie i identyfikacje wykonano w oparciu o pojecie gatunku, zgodnie z opisem w Applied Microbiology, 4:243—'250, 1956. Porównanie dwóch wymienionych kultur bylo nastepujace: Morfologia lancucha zarodnikowego — lancuchy kultury Pfizer F. D. 23 604 w postaci spiral o 6—10 zwojach lub mniej w róznych srodowiskach przy¬ pominaly lancuchy Streptomyces hygroscopicus CBS. Zarodniki Pfizer F. D. 23 604 badane za po¬ moca wybiórczej elektroskopii elektronowej wy¬ gladaly dokladnie tak samo, jak zarodniki szczepu 97 34197 341 3 CBS S. hygroscopicus* przedstawione w Applied Microbiology, 18:659—896, 1969, gdzie zarodniki o- pisano jako posiadajace pofaldowana powierzchnie zlozona z licznych wglebien, oddzielonych grzbie¬ tami substancji, stanowiacej scianki zarodnika.Barwione wycinki zarodników obu kultur wygla¬ daly identycznie.Barwa kolonii — grzybnia powietrzna miala bar¬ we szara w wiekszosci srodowisk, jecz dokladny odcien byl nieco rózny dla obu kultur. Pfizer F. D. 23 604 na sacharozowym agarze Czapka tworzyl gruby, nieregularnie pofaldowany szarawo-bialy -nalot,—pedGzas* / byl -plaski, -cienki i szary. Pfizer F. D. 23604 na \ agarze z maczka zoledzi po 4 tygodniach inkuba- l cji wytworzyl zólty nalot na uprzednio szarej * ^y^3P|io^ie1;rznej. Na agarze z ekstraktem droz- : dzewym- i slodowym Pfizer F. D. 23 604 dawal zól¬ te plamy nalotu na szarej substancji grzybni.Tworzenie melaminy — zadna z kultur nie two¬ rzyla melaniny na agarze peptonowo-zelazowym.Wykorzystanie wegla — /metoda Pfidhama i Gotlieba J. Bact., 56:107—114/, szczep Pfizer F. D. 23 604 wykorzystuje glukoze, L-arabinoze, dekstry¬ ne, D-fruktoze D/+/galaktoze, gliceryne, inozytol, inuline, laktoze, maltoze, D-mannitol, salicyne, ra- finoze, ramnoze, octan sodu, D-sorbitol, sorboze, skrobie, sacharoze, trehaloze i D-ksyloze, przy czym dulcitol nie byl wykorzystywany. Wyniki te sa zgodne z wynikami* opisanymi dla szczepu S. hy- groscopius w Applied Microbiology, 15:637—639, 1967 i dla szczepu CBS S. hygroscopicus wedlug Industrial Microbiology, 10:183—221, 1969, z tym wyjatkiem, ze szczep CBS nie wykorzystywal ino¬ zytolu.Wytwarzanie H2S — dla obu kultur uzyskano pozytywne wyniki na skosach agarowych z agaru peptonowozelazowego z pasmami octanu olowiu.Mleko — podobne wyniki uzyskano dla obu kul¬ tur—brak koagulacji, hydroliza pelna lub prawie pelna w ciagu 12 dni, brazowy, rozpuszczalny pig¬ ment.Zelatyna — obie kultury byly podobne we wzros¬ cie, barwie i umiarkowanej szybkosci uplynniania.Charakterystyka specjalna — szczep CBS S. hy¬ groscopicus daje czarne, higroskopijne powierzch¬ nie w ciagu 3 tygodni na agarze glukozowo-aspa- raginowym, agarze z maczki z zoledzi i agarze z ekstraktów drozdzowo-slodowych, natomiast szczep Pfizer F. D. 23 604 wykazuje czarne plamy jedy¬ nie na agarze z ekstraktów slodowo-drozdzowych.Dalsza inkubacja przez tydzien i magazynowanie kultur na szalkach Petriego w temperaturze 4— —10°C przez czwarty tydzien powoduje wzrost zaczerwienienia szczepu Pfizer F. D. 23 604. Na aga¬ rze z maczki z zoledzi, Czapek'a agarze sacharozo¬ wym i na agarze z ekstraktów slodowo-drozdzo- wych szczep Pfizer F. D. 23 604 daje zapach po¬ dobny do zapachu dzikiej cebuli lub czosnku z nieco ziemista wonia dodatkowa* natomiast szczep CBS S. hygroscopicus daje jedynie zapach zie¬ misty, przy czym o gatunku tym nigdzie nie do¬ niesiono, aby posiadal zapach dzikiej cebuli. Szczep Pfizer F. D. 23 604 gatunku S.hygroscopicus daje zwiazek 38 295, nowy eterowy antybiotyk policyk- liczny, natomiast szczep CBS gatunku S.hygrosco¬ picus nie daje go, jak równiez nie doniesiono o wytwarzaniu tego antybiotyku przez inne szczepy S.hygroscopicus.Omawiana kultura F. D. 23 604 zostala zmagazy¬ nowana w The American Type Culture Collection, Rockville, Md., i oznaczona w tym zbiorze jako ATCC 31 050.Hodowla Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 050 najkorzystniej przebiega w srodowiskach wodnych, zawierajacych pozywke, w temperaturze 28—36°C, w zanurzeniu, w warunkach aerobowych z mieszaniem. Zawierajace pozywke srodowiska, uzyteczne do takich celów, obejmuja zródla przy¬ swajalnego wegla* takie jak cukry, skrobia i gli¬ ceryna, zródla organicznego azotu, takie jak ka¬ zeina, enzymatyczny wyciag kazeinowy, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, maczka z o- rzeszków ziemnych, gluten pszeniczny, maka so¬ jowa, maczka miesna i maczka rybna. Z powo¬ dzeniem mozna równiez wykorzystac zródla sub¬ stancji wzrostowych, takie jak ekstrakt z wyslod¬ ków i ekstrakt drozdzowy, jak równiez sole, ta¬ kie jak chlorek sodu i weglan wapnia oraz pier¬ wiastki sladowe, takie jak zelazo, magnez* cynk, kobalt i mangan. Jesli w czasie fermentacji poja¬ wia sie nadmiernie pienienie, wówczas w czasie fermentacji mozna do cieklego srodowiska dodac srodki przeciw pienieniu, takie jak oleje roslinne lub silikony. Szybkosc napowietrzania srodowiska w zbiorniku do hodowli w zanurzeniu wynosi ko¬ rzystnie 1/2—2 objetosci swiezego powietrza na objetosc bulionu na minute. Mieszanie mozna pro¬ wadzic za pomoca mieszadel typu, zwykle stoso¬ wanego w przemysle fermentacyjnym. W czasie przenoszenia organizmu i podczas jego wzrostu nalezy oczywiscie utrzymywac warunki aseptycz- ne.Szczepienie w celu wytworzenia antybiotyku mozna wykonac, stosujac nalot ze skosu kultury.Nalot ten mozna wykorzystac do zaszczepienia za¬ równo wstrzasanych kolb, jak i zbiorników szcze- piennych lub tez alternatywnie zbiorniki szcze- pienne mozna szczepic ze wstrzasanych kolb.Wzrost we wstrzasanych kolbach osiaga zwykle swe maksimum w ciagu 3 do 5 dni, podczas gdy zaszczepienie w zbiorniku szczepiennym w za¬ nurzeniu uzyskuje sie najkorzystniej w okresie 2 do 3 dni. Zasadnicza aktywnosc antybiotyczna u- zyskuje sie w koncowym etapie fermentacji w okresie 3 do 5 dni. Poziom antybiotyczny wynosi zwykle 50—500 mg/l.Proces wytwarzania antybiotyku dogodnie jest kontrolowac w czasie fermentacji za pomoca pró¬ by biologicznej bulionu przy zastosowaniu czulego szczepu Staphylococcus aureus lub Bacillus subtilis.Mozna tu stosowac standardowa metode próby na plytce, której strefa inhibicji wokól tarczy z pa¬ pieru filtracyjnego, nasyconego bulionem, stanowi miare mocy antybiotycznej. 60 Chromatografia cienkowarstwowa przy uzyciu zelu krzemionkowego jest uzyteczna metoda ana¬ lityczna do oznaczania antybiotyku, wytwarzanego w srodowisku fermentacyjnym i okreslenia skladu 65 surowych i oczyszczonych substancji, wyekstraho- 40 45 50 555 97 341 6 wanych z bulionów fermentacyjnych. Chromato- gramy cienkowarstwowe po rozwinieciu ich za pomoca octanu etylu spryskuje sie 3% roztworem waniliny w etanolowym roztworze kwasu siarko¬ wego /98,5—15% obj./obj./, a nastepnie ogrzewa do temperatury 60—80°C w ciagu kilku minut.Antybiotyk obserwuje sie wówczas jako jaskrawa, rózowo-czerwona plame na bialym tle.Antybiotyczny zwiazek 38 295 mozna wydzielic z wyklarowanego bulionu fermentacyjnego na dro¬ dze ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi, ta¬ kimi jak chloroform, octan etylu lub keton me- tylowoizobutylowy. Zasadnicza czesc antybiotyku zawarta jest w oddzielnej grzybni i mozna ja do¬ godnie ekstrahowac przez wytworzenie zawiesiny grzybni w rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczal¬ niku, takim jak metanol.Korzystna metoda wydzielania i wyodrebniania antybiotycznego zwiazku 38 295 jest nastepujaca procedura: Nieprzesaczony bulion fermentacyjny ekstrahuje sie dwukrotnie 1/5—1/2 objetosci metyloizobutylo- ketonu. Ekstrakt w rozpuszczalniku zate,za sie pod obnizonym cisnieniem do oleistej pozostalosci, z której nastepnie wytwarza sie zawiesine w mie¬ szaninie chloroformu i heksanu /l:.l/ i wprowadza do kolumny, wypelnionej zelem krzemionkowym /najkorzystniej zloze zelu krzemionkowego 60, w którego górnej czesci znajduje sie warstwa zelu krzemionkowego PF254, oba zele firmy E. Merck, Darmstad, RFN/. Kolumne z zelem krzemionko¬ wym wymywa sie kolejno heksanem, mieszanina chloroformu i heksanu /1:1/ i chloroformem. Glów¬ na frakcje antybiotyku wymywa sie octanem ety¬ lu. Odciek zateza sie. pod zmniejszonym cisnie¬ niem, przenosi sie do acetonu i miesza przez okres —60 minut z weglem aktywnym /Darco G 60/.Wegiel aktywny usuwa sie na drodze filtracji, roztwór zateza sie do malej objetosci pod obnizo¬ nym cisnieniem i dodaje sie nieco wody po czym pH doprowadza sie za pomoca wodorotlenku sodu do wartosci 8,0—8,5. Nastepnie krystaliczna sub¬ stancje, oddziela sie na drodze filtracji, przemy¬ wa woda i suszy.Wyodrebniony w tym etapie antybiotyk jest mie¬ szanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295, u- tworzonych z jonów sodu i potasu, wystepujacych w bulionie fermentacyjnym oraz pochodzacych z doda¬ nego wodorotlenku sodowego. Chromatogramy cien¬ kowarstwowe tej substancji moga wykazywac sla¬ dowe ilosci co najmniej dwóch innych bardziej polarnych antybiotyków, które podobnie jak zwia¬ zek 38 295 daja charakterystyczna rózowo-czerwo¬ na plame po spryskaniu wanilina w etanolowym roztworze kwasu siarkowego.Zwiazek 38 295 mozna otrzymac jako pojedyncze indywiduum metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej na zelu krzemionkowym PF254 przy uzy¬ ciu heksanu. Mieszanine soli sodowej i potasowej dodaje sie w postaci roztworu w chloroformie lub octanie etylu i kolumne pod cisnieniem 5,6 atm wymywa sie heksanem, zawierajacym wzrastaja¬ ca ilosc octanu etylu. Postep rozdzialu obserwuje sie metoda chromatografii cienkowarstwowej. Od¬ powiednie frakcje laczy sie, odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem i uzyskany antybiotyk krystalizuje z mieszaniny acetonu i wody.Zwiazek 38 295 w postaci wolnego kwasu moz¬ na otrzymac z mieszaniny soli sodowej i potaso- wej przez doprowadzenie pH w roztworze octanu etylu lub chloroformu do wartosci 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu fosforowego. Warstwe orga¬ niczna suszy sie bezwodnym siarczanem sodu, od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem, a pozosta¬ lo losc krystalizuje z mieszaniny chloroformu i hek¬ sanu.Sól sodowa zwiazku 38 295 mozna wytworzyc przez doprowadzenie pH roztworu wolnego kwasu w octanie etylu lub w chloroformie do wartosci 8,5 za pomoca roztworu wodorotlenku sodu /In/.Substancje krystalizuje sie z mieszaniny acetonu i wody. Krystaliczna sól potasowa otrzymuje sie analogicznie, stosujac wodorotlenek potasowy za¬ miast NaOH.Krystaliczna sól srebrowa mozna wytworzyc przez dodanie wodnego roztworu azotanu sodu do alkoholowego roztworu mieszaniny soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295. Innymi, dajacymi sie latwo wytworzyc zwiazkami sa sole miedzi* cynku, amonu, wapnia, magnezu i litu zwiazku 38 295.W przypadku zamierzonego stosowania otrzyma¬ nego produktu jako srodka zapobiegajacego i le¬ czacego kokcydioze u drobiu, caly bulion fermen¬ tacyjny, zawierajacy zwiazek 38 295, mozna wysu- szyc calkowicie /korzystnie metoda rozpylowego suszenia /i domieszac do pokarmu dla drobiu w ilosci, dajacej pozadany poziom mocy antybiotycznej Zwiazek 38 295 wykazuje dzialanie inhibitujace przeciwko wzrostowi licznych mikroorganizmów /tablica 1/. Testowe bakterie szczepi sie w szere¬ gu próbek, zawierajacych srodowisko z pozywka i rózne stezenia zwiazku 38 295 celem okreslenia minimalnego stezenia, wyrazonego w mikrogra- mach antybiotyku na mililitr, które inhibituje 40 wzrost organizmu w ciagu 24 godzin.Tablica 1 Organizm Staph. aureus 01A005 01A052 01A109 01A110 01A400 Strep. faecalis Strep. pyogenes Neisseria sicca Bacillus subtilis Lactobacillus casei var casei Lactobacillus catenaforme Clostridium innocuum Clostridium bifermentans Treponema hyodysenterif.e IZwiazek 138295 /mieszanina sól/ NaK ^78 0,78 0,78 0,39 0,39 0,20 <0,10 <0,10 <0,10 1,56 0*78 0,20 0,78 0,39 Zwiazek 33 295 /wolny kwas/ ^39 3,12 0,78 1,56 1,56 1,58 <0,10 <0,10 <0,10 —¦ —1 —{ — —97 341 Zwiazek 38 295 i jego sole wykazuja doskonala aktywnosc przeciwko zakazeniu kokcydioza u dro¬ biu. Przy zmieszaniu z pokarmem dla kurczat w ilosci 15—250 ppm zwiazki te sa efektywne w za¬ pobieganiu zakazeniu tymi organizmami.Dane, dotyczace efektywnosci zwiazku 38 295 i jego soli przeciwko zakazeniu kokcydioza u kur¬ czat, uzyskano w nastepujacy sposób. Grupy 3—5 sztuk 10 dniowych kogutków rasy bialej leghorn karmiono sruta, zawierajaca zwiazek 38 295 lub jedna z jego soli dokladnie wymieszanej z pokar¬ mem. Po 24 godzinach takiej diety kazde kurcze bylo szczepione doustnie za pomoca oocyst poszcze¬ gólnych gatunków badanych organizmów Einieria.Inne grupy kurczat karmionych pozbawiona anty¬ biotyków dieta srutowa byly zakazone w podobny sposób i sluzyly jako zakazone grupy kontrolne.Niezakazone i nieleczone kurczeta sluzyly jako nor- • walne grupy kontrolne. Wyniki leczenia oceniano po 5 dniach w przypadku E.acrevulina i po 6 dniach dla innych gatunków Eimeria.W tablicy 2 przedstawiono wyniki, uzyskane dla mieszaniny soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295.Tablica 2 Zakazenie gatunkiem Eimeria tonella Eimeria acervulina Eimeria necatrix Eimera | maxima Dawka /ppm/ ,250 J125 60 3,0 ;250 125 160 45 ¦ 250 J125 '60 ,250 1215 60 45 Sredni stopien * zakazenia 0,0 0,0 0,7 1.7 2,7 0,0 0,2 0,0 0,4 1,2 2,0 0,0 0,2 ^ 0,2 0,0 0,0 0,4 0,6 0,8 1,8 .Stosunek */ 0,0 0,0 0,211 0,54 0,86 0,0 0,1 0,0 0,2 0,6 1,6 0,0 0,13 0,13 0,0 0,0 i 0,25 0,33 0,44 0,68- */ Kryteria, stosowane do oceny aktywnosci prze¬ ciw kokcydiozie, polegaja na ocenie uszkodzen od 0 do 4 dla E.tenella /J. E. Lynch, Am. J.Vet. Res. 22:324—326, 1961/ i 0 do 3 dla innych gatunków /J. Johnson i W—H, Reid, Exp.Parasit./ 28:30—36, 1970/. W wyniku podzielenia oceny uszkodzen dla kazdej z leczonych grup przez ocene uszkodzen zakazonych zwierzat kon¬ trolnych uzyskuje sie staly stosunek.**/ Pierwsza liczba odnosi sie do uszkodzen jelit, a druga do uszkodzen katnicy. 40 45 50 55 Zakazenie gatunkiem Eimera brunetti Zakazenie mieszane /Coccivac D, Sterwine, Labora¬ tories, Opelika, Alabama./ Dawka /ppm/ 250 125 60 45 250 a'25 00 50 40 Sredni Stopien* zakazenia 0,4 0,4 0,8 1,2 1,6 1,6 0,0, 0,0 **/ 0,2, 0,4 0,2, 0,0 1,0, 0,6 1,2, 1,0 2,8, 2,0 Stosunek*/ o,o, 0,08, 0,08, 0,38, 0,48, 0,85, 0,22 0,44 0,22 0,53 0,88 0,88 0,0 0,18 0,0 0,21 0,35 0,71 Podobne wyniki uzyskac mozna z wolnym kwa¬ sem, sola sodowa, sola potasowa lub wysuszonym srodowiskiem fermentacyjnym, zawierajacym zwia¬ zek 38 295 w stosunku, dajacym pozadany poziom aktywnosci antybiotycznej.Promotowanie wzrostu przez zwiazek 38 295 wy¬ kazano w nastepujacych próbach z bydlem.Cieleta rasy Angus Heifer byly w sposób losowy umieszczane w przegrodach po 5 cielat w prze¬ grodzie i podawano im zwiazek 38 295 doustnie, przez wole, w wodzie pitnej itd. Zwiazek dawko¬ wano w oparciu o jego aktywnosc, podajac go w postaci kompozycji paszowej o duzej zawartosci substancji wlóknistych w ilosci 11—33 ppm. Zwia¬ zek 38 295 moze byc w róznych formach, takich jak wolny kwas, sól sodowa, sól potasowa, mie¬ szanina soli sodowej i potasowej lub suszony bulion fermentacyjny, wytworzony przez Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 050.Pasze bez leków -i pasze, zawierajaca zwiazek 38 295, podawano badanym zwierzetom do syta.Pasza zawierala 12,5% protein i miala stosunek skladników tresciwych do skladników objetoscio¬ wych 75:25, przy czym zawierala kukurydze, macz¬ ke sojowa, maczke z lucerny, fosforan wapnia, melase,, witaminy i mineraly sladowe. Zwiazek 38 295 zawarty byl w premiksie wraz z mielona kukurydza, mineralami i witaminami.Karma podstawowa /l2,5% protein — 75:25 skladników tresciwych do objetosciowych/ Skladnik Procent Kukurydza mielona 55,6 Maczka sojowa, 48% protein 6,3 Maczka z lucerny, 17*/o protein 25,0 Suszona melasa*/ 10,0 Olej sojowy . 2,0 Fosforan dwuwapniowy /24°/o Ca, 18,5%P/ 0,4097 341 Sól z mineralami sladowymi **/ Premiks witaminowo-mineralny ***/ 0,50 0,20 */ Melasa z trzciny cukrowej na nosniku z ka¬ czanów kukurydzy: nie mniej niz 3% surowych protein, nie wiecej niz 15°/o materialu wlók¬ nistego* nie mniej niz 42% obojetnego cukru i maksimum -S°/o wody.**/ Nadajac nastepujace stezenie mineralów sla¬ dowych /ppm/ mangan-10, zelazo-8,25, miedz- -1,25, jod-0,025, kobalt-0,86, cynk-45.***/ Nadajac nastepujaca zawartosc witamin na 1 kg karmy: witamina A-3327 jedn, witamina D-444 jedn, witamina E-58 jedn.Premiks Skladnik Ilosc /1,8 kg/ Koncentrat witaminy A /30 000 jedn/g/ 0,1 kg Koncentrat witaminy D3/200 000 jedn/g/ 2,00 g Koncentrat witaminy E /278 000 jedn/kg/ 018 kg Tlenek cynku /79,4 Weglan kobaltowy /45°/o Co/ -1,70 g Sruta sojowa lub drobno mielone kaczany kukurydzy 1,47 kg Zwiazek 38295 40,0 g Premiks w ilosci 0,45 kg na 1 t paszy daje osta¬ tecznie stezenie zwiazku 38 295 równe 11 ppm.W tablicy 3 przedstawiono wyniki 28-dniowego testu w odniesieniu do trzech takich samych za¬ gród, z których kazda zawierala 5 cielat. Przybli¬ zona poczatkowa waga kazdego cielecia wynosila 180 kg.Zasadniczo takie same wyniki mozna uzyskac przy zastosowaniu czystego kwasu, soli sodowej, Przyklad I. Przygotowano sterylne wodne srodowisko o nastepujacym skladzie: Gramy/litr Glukoza 10,0 Rozpuszczalna skrobia 20,0 Ekstrakt drozdzowy 5,0 Enzymatyczny wyciag z kazeiny 5,0 Maczka mie,sna 5,0 CaC03 1,0 pH=7,0 Komórki nalotu plesniowego Streptomyces hy- groscopicus ATCC 31 050 przeniesiono do szeregu kolb o pojemnosci 300 ml, z których kazda za¬ wierala 50 ml sterylnego srodowiska. Kolby te wstrzasano na obrotowej wytrzasarce w ciagu 3 dni w temperaturze 28—30°C. Porcje po 5 ml ho¬ dowanego w ten sposób szczepu przeniesiono w warunkach aseptycznych do 300 ml kolb, zawiera¬ jacych 100 ml opisanego wyzej sterylnego srodo¬ wiska. Po wytrzasaniu przez 3—4 dni w tempera¬ turze -28—30°C wzrastajacy szczep przeniesiono do tanków fermentacyjnych o pojemnosci 4 1» za¬ wierajacych 2 1 sterylnego srodowiska o nastepu¬ jacym skladzie: Gramy/litr Glukoza Skrobia kukurydziana Maczka sojowa Ekstrakt z wyslodków gorzelnianych NaCl CaCOg pH=6,6 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 1,0 Tablica 3 Mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 Dawka Kontrolna zwiazek 38 2:95 | /li ppm/ 1 Zwiazek 33 295 /zwiazek 33 ppm/ iSDPW */ kg ; wskaznik 1,03 1,09 100,0 110,6 118,9 SDDP **/ kg 8,39 '8,08 ,58 wskaznik ,0,0 95,1 87,3 Pasza/Przyrost ***/ stosunek 6,95 ,94 ,1.-1 wskaznik 100,0 117,0 1136,0 */ Sredni dzienny przyrost wagi.**/ Srednia dzienna dawka pokarmu.***/ Ilosc paszy /kg/ na 1 kg przyrostu wagi. soli potasowej lub wysuszonego bulionu fermen¬ tacyjnego, zawierajacego zwiazek 38 295.Porównywalne wyniki mozna uzyskac dla innych zwierzat przezuwajacych, takich jak owce, lub zwierzat jednozoladkowych, takich jak konie, swi¬ nie lub króliki.Zwiazek 38 295 mozna podawac w paszy w wo¬ dzie pitnej lub w postaci premiksu, stosowanego do mieszania z pasza lub woda pitna. Ciekly pre¬ miks, zawierajacy antybiotyk w postaci koncen¬ tratu, przeznaczonego do dodawania do wody pit¬ nej, zwieksza wydajnoc paszowa zwierzat. Pre¬ miks taki mozna przygotowac w odpowiednim ste¬ zeniu przez rozpuszczenie zwiazku 38 295 w odpo¬ wiednim rozpuszczalniku, takim jak etanol lub gli¬ kol propylenowy. 50 55 60 Fermentacje prowadzono przez 90—120 godz. w temperaturze 28—30°C, mieszajac z . szybkoscia 1700 obr./min. i napowietrzajac z szybkoscia jed¬ nej objetosci powietrza na objetosc bulionu na mi¬ nute. Duze tanki fermentacyjne, zawierajace 300— —38 000 1 srodowiska, mozna szczepic przy uzyciu okolo 2% tego nalotu. Fermentacje prowadzi sie az do uzyskania mocy antybiotycznej co najmniej 50 mg/l /90—120 godz./. 100 1 calego nieprzefiltrowanego bulionu fermen¬ tacyjnego ekstrahowano dwukrotnie 1/5 objetosci ketonu metylowoizobutylowego. Oddzielony ek¬ strakt rozpuszczalnikowy zatezano pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do oleistej pozostalosci /769 g/, która dyspergowano na zelu krzemionkowym przez dodanie pozostalosci rozpuszczonej w 2 1 chloro-97 341 li 12 formu na 1 kg zelu krzemionkowego PF254, a na¬ stepnie usunieto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana pozostalosc wymieszano z 2 1 mieszaniny chloroformu z heksanem /1:1/ i dodano do zloza 300 g zelu krzemionkowego 60, na wierzchu którego znajdowala sie warstwa 300 g zelu krzemionkowego PF254.Zel krzemionkowy przemywano nastepnie sukce¬ sywnie 75 1 heksanu, 7,5 1 mieszaniny chlorofor¬ my z heksanem /1:1/ i 7,5 1 chloroformu. Antybio¬ tyk eluowano nastepnie 3,8 1 octanu etylu. Octan etylu usunieto pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc /38 g/ rozpuszczono w 400 ml acetonu.Roztwór acetonowy energicznie mieszano w tem¬ peraturze pokojowej przez okolo 45 min z 40 g wegla aktywnego /Darco G 60/. Calosc przesaczo¬ no, a nastepnie zatezono do objetosci okolo 200 ml i rozcienczono 100 ml wody. Zwiazek 38 295 wy¬ dziela sie w postaci soli sodowej i potasowej po doprowadzeniu pH roztworu do wartosci 8,5 za pomoca 1,0 n NaOH. Krystaliczna substancje /.13,8 g/ rozpuszczono w octanie etylu i poddano chro¬ matografii na kolumnie z zelem krzemionkowym PF254 przy uzyciu heksanu. Chromatogram rozwi¬ jano pod cisnieniem 5,6 atm za pomoca heksanu, zawierajacego stopniowo wzrastajaca ilosc octanu elylu. Postep rozdzialu kontrolowano metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej. Odpowiednie frakcje polaczono, odparowano pod zmniejszonym cisnie¬ niem, a czysty zwiazek krystalizowano z miesza¬ niny acetonu z woda.Czysta, krystaliczna mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 ma temperature topnie¬ nia 200°C i aktywnosc optyczna [a]D25=+36° przy stezeniu 1% w metanolu. Analiza elementarna pro¬ duktu po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnie¬ niem w ciagu nocy w temperaturze 70°C piecio¬ tlenkiem fosforu wykazala srednia zawartosc wegla 60,58% i wodoru 8,56%.Zwiazek jest rozpuszczalny w metanolu* etanolu, acetonie, chloroformie, chlorku metylenu, eterze etylowym, octanie etylu i ketonie metylowo-izo- butylowym, a czesciowo rozpuszczalny w heksanie i nierozpuszczalny w wodzie.Mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 nie posiada charakterystycznego widma ab¬ orcyjnego w nadfioletowym zakresie promienie- wijpia. widmo w podczerwieni mieszaniny soli sodo¬ wej i potasowej zwiazku 38 295 przedstawiono na zalaczonym rysunku, fig. 1. Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc charakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczerwieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mikronach: 2,92; 3,40; 6,27; 6,85; 7,22; 8,40; 9,00; 9,15; 9,25; 9,48; 9,98; 10,45; 10,68 i 11,45.Przyklad II. Powtórzono operacje z przy¬ kladu I, stosujac klarowny bulion fermentacyjny, zamiast calkowicie nieprzesaczanego bulionu fer¬ mentacyjnego.Przyklad III. Grzybnie oddzielona ze skla¬ rowanego bulionu fermentacyjnego z przykladu II rozrabiano wielokrotnie w metanolu, a ekstrakt metanolowy zatezano pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc przerabiano zgodnie z przykladem I.Przyklad IV. Powtórzono proces fermenta¬ cyjny z przykladu I, stosujac srodowisko fermen¬ tacyjne o nastepujacym skladzie: Gramy/litr Glukoza 20,0 Skrobia kukurydziana 10,0 Maka sojowa 10,0 Ekstrakty z wyslodków gorzelnianych 5,0 Fe2/S04/3 0,2 MnCl2 0,2 CaC03 1.0 NaCl 5,0 Oleinian metylu 2,0 Olej sojowy 2,0 pH=6,6—6,7 Na koniec procesu fermentacyjnego caly, nie- przesaczony bulion fermentacyjny wysuszono me¬ toda rozpylowa.Przyklad V. Mieszanine soli sodowej i po- tasowej zwiazku 38 295 rozpuszczono w octanie etylu i pH roztworu doprowadzono do wartosci 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu fosforowego.Warstwe rozpuszczalnikowa wysuszono bezwodnym siarczanem sodu, odparowano do sucha, a pozo- stalosc krystalizowano z mieszaniny chloroformu z heksanem, otrzymujac krystaliczny kwas o tem¬ peraturze topnienia 135—1380C i aktywnosci otycz- nej [a]25D=+ 38° przy stezeniu l°/o w roztworze metanolowym. Po wysuszeniu w ciagu nocy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 70°C pie¬ ciotlenkiem fosforu analiza elementarna zwiazku wykazala zawartosc 61,65% wegla, 8,94% wodoru i 29,41% tlenu /z róznicy bilansowej/. Zwiazek 38 295 w postaci wolnego kwasu nie posiada cha- rakterystycznego widma absorpcyjnego w nadfio¬ lecie.Widmo w podczerwieni zwiazku 38 295 w posta¬ ci wolnego kwasu przedstawiono na rysunku, fig. 2.Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc cha- 40 rakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczer¬ wieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mi¬ kronach: 2,92; 3,43; 5,74; 6,85; 7,25; 8,28; 8,60; 8,80; 9,00; 9,18; 9,80; 10,10; 10,45; 10,68; 10,92; i 11,13.Rentgenowska analiza krystalicznej soli srebro- 45 wej zwiazku 38 295 pozwolila na ustalenie budowy zwiazku, która mozna przedstawic strukturalnym wzorem, przedstawionym na rysunku.Przyklad VI. Sól sodowa zwiazku 38 295 o- trzymano przez dodanie 1 n roztwór NaOH do 50 roztworu wolnego kwasu, otrzymanego w przykla¬ dzie V, w octanie etylu, az do osiagniecia war¬ tosci pH~8,5. Substancja wykrystalizowana z mie¬ szaniny acetonu z woda miala temperature top¬ nienia 197—198°C i aktywnosc optyczna [a]D25 = 55 = + 38° przy stezeniu 1,03% w roztworze metano¬ lowym. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnie¬ niem w ciagu nocy, w temperaturze 70°C, piecio¬ tlenkiem fosforu, sól sodowa zawierala 60,28% wegla i 8,76% wodoru.Widmo w podczerwieni soli sodowej zwiazku 38 295 przedstawiono na zalaczonym rysunku fig. 3.Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc cha¬ rakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczer- 65 wieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mi- 6013 97 341 14 kronach: 2,94; 3,42; 6,27; 6,84; 7,20; 8,75; 9,00; 9,14; 9,30; 9,45; 10,45; 10,92; 11,15; i 1.1,47.Przyklad VII. Sól potasowa zwiazku 38 295 wytworzono metoda, opisana w przykladzie VI, sto¬ sujac wodorotlenek potasu zamiast wodorotlenku sodu. Substancja wykrystalizowana z mieszaniny acetonu z woda miala temperature topnienia 196— —198°C i aktywnosc optyczna [a]D25=38° przy ste¬ zeniu 1,02% w roztworze metanolowym. Po wy¬ suszeniu pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu nocy, w temperaturze 70°C, pieciotlenkiem fosfo¬ ru, zwiazek zawieral 60,58% wegla i 8,0% wodoru.Widmo w podczerwieni soli potasowej zwiazku 33 295 przedstawiono- na zalaczonym rysunku, fig. 4. Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc charakterystycznych pasm absorpcyjnych w pod¬ czerwieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mikronach: 2,94; 3,42; 6,27; 6,84; 7,20; 8,75; 9,00; 9,14; 9,30; 9,45; 10,45; 10,92; lil,15; i 11,47.Przyklad VIII. Sól srebrowa zwiazku 38295 wytworzono przez dodanie wodnego roztworu azo¬ tanu srebra do etanolowego roztworu mieszaniny soli sodowej i potasowej, otrzymanych w przy¬ kladzie I. Wydzielone cialo stale krystalizowano z metanolu, otrzymujac produkt o temperaturze top¬ nienia 138—200°C i aktywnosci optycznej [a]D25= = +¦27°, przy stezeniu 0,982% w roztworze meta¬ nolowym. Sredni sklad próbki, wysuszonej w cia¬ gu nocy pod zmniejszonym cisnieniem, w tempe¬ raturze 70°C pieciotlenkiem^ fosforu, wynosil 55,95% wegla i 7,82—7,89% wodoru. Ciezar czasteczkowy krystalicznej soli srebrowej zwiazku 38 295, okres¬ lony z danych rentgenowskich wynosi 10'60±4. PL