PL245254B1 - Antiviral use of a preparation - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2 : 1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10 - 30% oraz polifenole 15 - 50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego, korzystnie przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.The subject of the invention is a preparation consisting of a 2:1 mixture of Sambucus nigra elderberry extract and Aronia melanocarpa chokeberry extract, containing anthocyanins 10 - 30% and polyphenols 15 - 50%, for use in antiviral treatment, preferably against human virus from the group coronaviruses.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest preparat zawierający ekstrakty z owoców aronii (Aronia melanocarpa) oraz czarnego bzu (Sambucus nigra) do leczenia przeciwwirusowego, w szczególności przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.The subject of the invention is a preparation containing extracts from chokeberry fruit (Aronia melanocarpa) and black elderberry (Sambucus nigra) for antiviral treatment, in particular against the human virus from the coronavirus group.

Sambucus nigra jest rośliną bogatą w składniki o dużej aktywności biologicznej, przede wszystkim zawiera polifenole, takie jak flawonole, kwasy fenolowe, proantocyjanidyny i antocyjany, których obecność w dużej mierze odpowiada za działanie przeciwwirusowe owoców jagodowych (Anton et al., 2013; Sekizawa et al., 2013). Dotychczasowe dane przedkliniczne wskazują na istotne działanie przeciwwirusowe ekstraktu z czarnego bzu (Sambucus nigra L.). Efekt ten wykazano względem różnych szczepów wirusa grypy typu A (H3N2, H1N1, H3N2, H1N1, H5N1) i wirusa grypy typu B (Krawitz et al., 2011; Roschek et al., 2009; Zakay-Rones et al., 1995). Zawarte w jagodach S. nigra L. flawonoidy wiążą się z wirionami H1N1 poprzez wiązanie się do hemaglutyniny i po związaniu blokują zdolność wirusów do infekowania komórek gospodarza. Zidentyfikowano dwa związki odpowiedzialne za ten efekt: 5,7,3',4'-tetra-O-metylokwercetynę i 5,7-dihydroksy-4-okso-2-(3,4,5-trihydroksyfenylo)chroman-3-yl-3,4,5-trihydroksycykloheksanokarboksylan (Roschek et al., 2009). Również lektyny z bzu czarnego wiążą się do kwasów sialowych występujących na błonie komórkowej gospodarza zapobiegając tym samym przyłączeniu się wirusa do komórki (Zakay-Rones et al., 1995). Jednak dokładny mechanizm przeciwwirusowego działania owoców czarnego bzu oraz jego wyekstrahowanych związków aktywnych jest nadal przedmiotem badań. Sugeruje się, że działanie to może wynikać także z neutralizującego efektu względem neuraminidazy (Macdonald 2004; Swaminathan et al., 2013), umożliwiającej nowo namnożonym wirusom uwolnienie z komórki. Inny proponowany mechanizm to stymulacja układu odpornościowego (Barak et al., 2001). Na uwagę zasługuje fakt, że w zależności od frakcji możemy spodziewać się różnych efektów działania. W badaniach na myszach stwierdzono, że największy efekt przeciwwirusowy daje frakcja wysokocząsteczkowa, w skład której wchodzą polisacharydy. Podanie tej frakcji myszom zainfekowanym wirusem H1N1 powodowało obniżenie wiremii oraz podwyższenie poziomu przeciwciał neutralizujących w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i płucnych (Kinoshita et al., 2012). Działanie przeciwwirusowe bzu czarnego nie ogranicza się tylko do wirusów powodujących infekcję górnych dróg oddechowych. Udowodniono również, że czarny bez wykazuje silną aktywność przeciwko kociemu wirusowi niedoboru odporności (FIV), ponieważ hamuje tworzenie syncytiów, a poziom zahamowania zależy od stężenia ekstraktu (Uncini Manganelli et al., 2005). Wykazano także, że ekstrakt z czarnego bzu hamuje całkowicie replikację czterech szczepów wirusa HSV-1, w tym szczepów opornych na acyklowir. Działanie to jest niezależne od tego czy ekstrakt podawany był przed, w trakcie czy po adsorpcji wirusa do komórek (Morag A et al., 1997). Dalej stwierdzono również efekt przeciwko ptasiemu koronawirusowi. Postuluje się, że mechanizm tego działania związany jest z wiązaniem się lektyn czarnego bzu bezpośrednio do wirusa (Chen et al., 2014).Sambucus nigra is a plant rich in ingredients with high biological activity, primarily it contains polyphenols, such as flavonols, phenolic acids, proanthocyanidins and anthocyanins, the presence of which is largely responsible for the antiviral effect of berries (Anton et al., 2013; Sekizawa et al. ., 2013). Preclinical data to date indicate significant antiviral activity of elderberry extract (Sambucus nigra L.). This effect has been demonstrated against various strains of influenza A virus (H3N2, H1N1, H3N2, H1N1, H5N1) and influenza B virus (Krawitz et al., 2011; Roschek et al., 2009; Zakay-Rones et al., 1995) . Flavonoids contained in S. nigra L. berries bind to H1N1 virions by binding to hemagglutinin and, once bound, block the viruses' ability to infect host cells. Two compounds responsible for this effect have been identified: 5,7,3',4'-tetra-O-methylquercetin and 5,7-dihydroxy-4-oxo-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl -3,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylate (Roschek et al., 2009). Elderberry lectins also bind to sialic acids present on the host cell membrane, thus preventing the virus from attaching to the cell (Zakay-Rones et al., 1995). However, the exact mechanism of the antiviral effect of elderberries and its extracted active compounds is still under research. It is suggested that this effect may also result from a neutralizing effect on neuraminidase (Macdonald 2004; Swaminathan et al., 2013), enabling newly multiplied viruses to be released from the cell. Another proposed mechanism is stimulation of the immune system (Barak et al., 2001). It is worth noting that depending on the faction, we can expect different effects. Studies on mice have shown that the highest antiviral effect is achieved by the high-molecular fraction containing polysaccharides. Administration of this fraction to mice infected with the H1N1 virus resulted in a decrease in viral load and an increase in the level of neutralizing antibodies in bronchoalveolar lavage and lung lavage (Kinoshita et al., 2012). The antiviral effect of elderberry is not limited only to viruses causing upper respiratory tract infections. Elderberry has also been proven to have strong activity against feline immunodeficiency virus (FIV) because it inhibits the formation of syncytia, and the level of inhibition depends on the concentration of the extract (Uncini Manganelli et al., 2005). It has also been shown that elderberry extract completely inhibits the replication of four strains of the HSV-1 virus, including acyclovir-resistant strains. This effect is independent of whether the extract was administered before, during or after virus adsorption to cells (Morag A et al., 1997). Further, an effect against avian coronavirus was also found. It is postulated that the mechanism of this action is related to the binding of elderberry lectins directly to the virus (Chen et al., 2014).

Badania kliniczne, również wykazały bezpieczny i terapeutyczny efekt ekstraktu z czarnego bzu w leczeniu grypy A i B, w porównaniu do grupy placebo (Zakay-Rones et al., 1995, 2004). Niezależne badania kliniczne potwierdziły pozytywny wpływ ekstraktu z czarnego bzu na przebieg infekcji wirusowej grypy typu A i B (Kong, 2009). W innym randomizowanym, podwójnie zaślepionym badaniu klinicznym ekstrakt z czarnego bzu znacząco zmniejszył objawy przeziębienia, czas trwania i nasilenie przeziębienia u osób podróżujących drogą powietrzną (Tiralongo et al., 2016). Wyniki tych badań zostały podsumowane w metaanalizie, gdzie stwierdzono, że standaryzowany ekstrakt z bzu czarnego skutecznie skraca całkowity czasu trwania i nasilenie objawów ze strony górnych dróg oddechowych w porównaniu z grupą placebo. Efekt suplementacji czarnego bzu jest większy w przypadku infekcji wirusem grypy niż zwykłego przeziębienia, ale suplementacja skutecznie zmniejsza objawy niezależnie od przyczyny (Hawkins, 2019).Clinical trials have also demonstrated the safe and therapeutic effect of elderberry extract in the treatment of influenza A and B, compared to a placebo group (Zakay-Rones et al., 1995, 2004). Independent clinical studies have confirmed the positive effect of elderberry extract on the course of influenza A and B viral infections (Kong, 2009). In another randomized, double-blind clinical trial, elderberry extract significantly reduced cold symptoms, duration, and severity of cold in air travelers (Tiralongo et al., 2016). The results of these studies were summarized in a meta-analysis, which found that standardized elderberry extract effectively reduced the total duration and severity of upper respiratory symptoms compared to the placebo group. The effect of elderberry supplementation is greater for influenza virus infection than for the common cold, but supplementation is effective in reducing symptoms regardless of the cause (Hawkins, 2019).

Efekt immunomodulującego działania czarnego bzu jest szeroko dyskutowany w piśmiennictwie. Badania wskazują działanie immunostymulujące, poprzez zwiększenie produkcji w monocytach ludzkich cytokin takich jak IL-1 β, TNF-α, IL-6 oraz IL-8 w porównaniu do komórek stymulowanych LPS (Barak et al., 2001). Zwiększone wydzielanie TNF-α, IL-6, IL-8 zaobserwowano również w komórkach linii A-549 (komórki nabłonka pęcherzykowego płuc) w porównaniu do komórek stymulowanych LPS. Efekt immunostymulujący był niezawiązany z obecnością cyjanidyno-3-glukozydu, związku z grupy antocyjanów który jest uważany za główny składnik aktywny bzu czarnego (Torabian et al., 2019). W kolejnych badaniach wykazano również, że ekstrakt z czarnego bzu łagodzi reakcję zapalną w makrofagach aktywowanych LPS (linia RAW 264.7) poprzez zmniejszenie ekspresji genów prozapalnych (TNF-α, IL-6,The immunomodulatory effect of elderberry is widely discussed in the literature. Studies indicate an immunostimulatory effect by increasing the production of cytokines such as IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-8 in human monocytes compared to LPS-stimulated cells (Barak et al., 2001). Increased secretion of TNF-α, IL-6, IL-8 was also observed in A-549 cells (alveolar lung epithelial cells) compared to LPS-stimulated cells. The immunostimulating effect was unrelated to the presence of cyanidin-3-glucoside, a compound from the anthocyanin group that is considered the main active ingredient of elderberry (Torabian et al., 2019). Subsequent studies also showed that elderberry extract alleviates the inflammatory reaction in LPS-activated macrophages (RAW 264.7 line) by reducing the expression of pro-inflammatory genes (TNF-α, IL-6,

COX-2, iNOS) i hamowanie wzmożonej produkcji mediatorów zapalnych (TNF-α, IL-6, PGE2, NO) (Zielinska-Wasielica et al., 2019). Ekstrakt z bzu czarnego wykazał także dobrą skuteczność w usuwaniu wolnych rodników i zmniejszał tworzenie reaktywnych form tlenu zależnie od dawki w keratynocytach linii HaCaT napromieniowanych UVB. Znacząco zmniejszał również wydzielanie cytokin zapalnych poprzez hamowanie kinaz białkowych aktywowanych mitogenami / białka aktywatora 1 (MAPK / AP-1) i szlaków sygnałowych czynnika jądrowego kB (NF-kB) (Lin et al., 2019).COX-2, iNOS) and inhibiting the increased production of inflammatory mediators (TNF-α, IL-6, PGE2, NO) (Zielinska-Wasielica et al., 2019). Elderberry extract also showed good free radical scavenging efficiency and reduced the formation of reactive oxygen species dose-dependently in UVB-irradiated HaCaT keratinocytes. It also significantly reduced the secretion of inflammatory cytokines by inhibiting mitogen-activated protein kinases/activator protein 1 (MAPK/AP-1) and nuclear factor-kB (NF-kB) signaling pathways (Lin et al., 2019).

W przypadku owoców aronii (Aronia melanocarpa) również istnieją doniesienia wskazujące na j ej działanie przeciwwirusowe. Dotychczas wykazano, że w modelach in vitro sok z aronii wykazuje działanie przeciw różnym szczepom wirusa grypy, w tym na szczepy oporne na oseltamiwir. Dawka 0,125 mg//ml hamowała rozwój badanych szczepów o >60%. Podanie ekstraktu z aronii, jak również wyekstrahowanego kwasu elagowego i mirecytyny, zainfekowanym rekombinowanym wirusem grypy myszom spowodowało znaczący spadek śmiertelności u tych zwierząt. Autorzy pracy sugerują, że efekt działania aronii częściowo można wyjaśnić inaktywującym działaniem względem hemaglutyniny (Park et al., 2013). Na działanie przeciwwirusowe może również wskazywać fakt, że produkt złożony Bioaron C zawierający aronię, również wykazywał działanie przeciwwirusowe w stosunku do szerokiego spektrum wirusów odpowiedzialnych za infekcje górnych dróg oddechowych (Glatthaar-Saalmuller et al., 2015).In the case of chokeberry fruit (Aronia melanocarpa), there are also reports indicating its antiviral effect. So far, it has been shown that chokeberry juice has activity against various strains of influenza virus in in vitro models, including strains resistant to oseltamivir. A dose of 0.125 mg//ml inhibited the development of the tested strains by >60%. Administration of chokeberry extract, as well as extracted ellagic acid and myrecitin, to mice infected with recombinant influenza virus resulted in a significant decrease in mortality in these animals. The authors of the study suggest that the effect of chokeberry can be partially explained by its inactivating effect on hemagglutinin (Park et al., 2013). The antiviral effect may also be indicated by the fact that the combined product Bioaron C containing chokeberry also showed antiviral activity against a wide spectrum of viruses responsible for upper respiratory tract infections (Glatthaar-Saalmuller et al., 2015).

Owoce aronii wykazują działanie prozdrowotne dzięki dużej zwartości polifenoli w tym antocyjanów i pochodnych kwasu kawowego. Podanie ekstraktu z aronii szczurom u których za pomocą LPS wyindukowano zapalenie naczyniówki oka powodowało obniżenie liczby komórek zapalnych i spadek poziomu NO, PGE2 i TNF-α w cieczy wodnistej oka. W badaniu tym wykazano również, że ekstrakt z aronii hamuje indukowaną LPS ekspresję iNOS i COX-2 w komórkach RAW 264.7 (Ohgami et al., 2005). Dalsze badania wskazują, że koncentrat z aronii hamuje produkcję TNF-α, IL-6 i IL-8 w ludzkich monocytach stymulowanych LPS. Wykazano również, że ekstrakt ten hamuje aktywację NF-kB w pobudzonych makrofagach linii RAW 264.7 (Apple et al., 2015). Dalej stwierdzono działanie hamujące aktywację drogi klasycznej układu dopełniacza, oraz obniżenie produkcji tlenku azotu w makrofagach RAW 264.7 indukowanych LPS (Ho et al., 2014). Badania przeciwzapalnego działania aronii z wykorzystaniem pierwotnych komórek mysich splenocytów wykazały także, że ekstrakt z aronii hamuje wydzielanie IL-6 z tych komórek po stymulacji LPS, oraz zwiększa wydzielanie IL-10 w komórkach niestymulowanych (Martin et al., 2014).Chokeberry berries have health-promoting properties due to their high content of polyphenols, including anthocyanins and caffeic acid derivatives. Administration of chokeberry extract to rats in which uveitis was induced with LPS resulted in a reduction in the number of inflammatory cells and a decrease in the levels of NO, PGE2 and TNF-α in the aqueous humor of the eye. This study also showed that chokeberry extract inhibited LPS-induced iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 cells (Ohgami et al., 2005). Further studies indicate that chokeberry concentrate inhibits the production of TNF-α, IL-6 and IL-8 in LPS-stimulated human monocytes. It has also been shown that this extract inhibits NF-kB activation in stimulated macrophages of the RAW 264.7 line (Apple et al., 2015). Further, it was found to inhibit the activation of the classical pathway of the complement system and to reduce the production of nitric oxide in LPS-induced RAW 264.7 macrophages (Ho et al., 2014). Studies on the anti-inflammatory effect of chokeberry using primary mouse splenocytes also showed that chokeberry extract inhibits the secretion of IL-6 from these cells after stimulation with LPS, and increases the secretion of IL-10 in unstimulated cells (Martin et al., 2014).

Preparaty zawierające S. nigra (czarny bez) mogą dawać efekty niepożądane, szczególnie związane z zawartością glikozydu cyjanogennego który może mieć potencjalnie toksyczne działanie. Dodatkowo preparaty te mogą powodować niepożądane objawy ze strony przewodu pokarmowego takie jak nudności, biegunki, ból brzucha (Ulbricht et al., 2014). W związku z tym konieczna jest wysoka standaryzacja ekstraktu z bzu czarnego oraz stosowanie możliwie najniższych dawek efektywnych. Pomoże to w uzyskaniu wyższej aktywności biologicznej i zminimalizuje działania niepożądane.Preparations containing S. nigra (black elderberry) may cause undesirable effects, especially those related to the content of cyanogenic glycoside, which may have a potentially toxic effect. Additionally, these preparations may cause undesirable symptoms from the gastrointestinal tract, such as nausea, diarrhea, and abdominal pain (Ulbricht et al., 2014). Therefore, high standardization of black elderberry extract and the use of the lowest possible effective doses are necessary. This will help achieve higher biological activity and minimize side effects.

Dotychczas na rynku nie występuje preparat złożony zawierający standaryzowane ekstrakty z bzu czarnego i aronii, o udowodnionym działaniu immunomodulującym i przeciwwirusowym. Dlatego też zasadne są działania zmierzające do otrzymania kombinacji ekstraktów z aronii i czarnego bzu w odpowiedniej standaryzacji. Działania te umożliwią zastosowanie mniejszej porcji do spożycia przy jednoczesnym utrzymaniu optymalnego stężenia pożądanych związków aktywnych zawartych w tych owocach, co przełoży się na lepszy efekt przeciwwirusowy.So far, there is no combined preparation on the market containing standardized extracts of elderberry and chokeberry with proven immunomodulatory and antiviral effects. Therefore, actions aimed at obtaining a combination of chokeberry and elderberry extracts in appropriate standardization are justified. These actions will enable the use of smaller portions for consumption while maintaining the optimal concentration of the desired active compounds contained in these fruits, which will translate into a better antiviral effect.

Z publikacji wynalazku WO2009059218 A1 znany jest sposób leczenia co najmniej jednego objawu zespołu metabolicznego (korzystnie cukrzyca) u osobnika oraz dedykowanej kompozycji zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość środka modyfikującego zespół metaboliczny pochodzącego z jagody zawierającej ekstrakt bogaty w antocyjany (korzystnie bez albo aronia albo porzeczka); i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.From the publication of the invention WO2009059218 A1 there is known a method of treating at least one symptom of the metabolic syndrome (preferably diabetes) in an individual and a dedicated composition containing a therapeutically effective amount of a metabolic syndrome modifying agent derived from a berry containing an anthocyanin-rich extract (preferably without either chokeberry or currant); and a pharmaceutically acceptable carrier.

Z innej publikacji WO2005110404 A2 znany jest sposób zwiększania aktywności cytotoksycznej środka chemioterapeutycznego przeciw zaburzeniu nieprawidłowej proliferacji komórek u pacjenta, obejmujący podawanie skutecznej ilości tego środka chemioterapeutycznego w połączeniu ze skuteczną zwiększającą cytotoksyczność ilością ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze, sposób zmniejszania toksyczności środka chemioterapeutycznego w normalnych komórkach pacjenta poddawanego chemioterapii, obejmujący podawanie ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze przed, z lub po środku chemioterapeutycznym, a także sposób zwiększania indeksu terapeutycznego środka chemioterapeutycznego podawanego do leczenia nieprawidłowo namnażających się komórek, obejmujący podawanie ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze przed, z lub po środkuAnother publication WO2005110404 A2 discloses a method of increasing the cytotoxic activity of a chemotherapeutic agent against an abnormal cell proliferation disorder in a patient, comprising administering an effective amount of the chemotherapeutic agent in combination with an effective cytotoxicity-enhancing amount of an antioxidant-rich berry extract, a method of reducing the toxicity of the chemotherapeutic agent in the patient's normal cells undergoing chemotherapy, comprising administering an antioxidant-rich berry extract before, with, or after a chemotherapy agent, and a method of increasing the therapeutic index of a chemotherapy agent administered to treat abnormally proliferating cells, comprising administering an antioxidant-rich berry extract before, with, or after the chemotherapy agent

PL 245254 Β1 chemioterapeutycznym. Korzystnie wspomnianą nieprawidłową proliferacją komórek jest rak jelita grubego a wspomnianym środkiem chemioterapeutycznym jest 5-fluorouracyl. Natomiast wspomniany ekstrakt z jagód jest wybrany spośród ekstraktu z aronii, maliny, borówki, jeżyny, żurawiny, borówki czarnej, czarnej porzeczki, wiśni, czarnego bzu, winogron, kiwi, truskawki lub dowolnej ich kombinacji.PL 245254 Β1 chemotherapy. Preferably said abnormal cell proliferation is colon cancer and said chemotherapeutic agent is 5-fluorouracil. Whereas said berry extract is selected from an extract of chokeberry, raspberry, blueberry, blackberry, cranberry, bilberry, blackcurrant, cherry, elderberry, grape, kiwi, strawberry or any combination thereof.

Zgłaszany preparat do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów oparty jest na mieszaninie ekstraktu z owocu bzu czarnego i ekstraktu z aronii, zawiera unikalne proporcje i standaryzacje, przez co wykazuje działanie przeciwwirusowe. Proporcje poszczególnych składników są dobrane w taki sposób, że powodują synergiczne działanie kompozycji w porównaniu do działania pojedynczych ekstraktów. Preparat według wynalazku, którego kompozycja oparta jest na mieszaninie ekstraktu z owocu bzu czarnego i ekstraktu z aronii wykazuje nowość i poziom wynalazczy w porównaniu do istniejącego stanu techniki.The preparation reported for use in antiviral treatment against a human virus from the coronavirus group is based on a mixture of elderberry extract and chokeberry extract, it contains unique proportions and standardization, therefore it has antiviral properties. The proportions of individual ingredients are selected in such a way that they cause a synergistic effect of the composition compared to the effect of individual extracts. The preparation according to the invention, the composition of which is based on a mixture of elderberry extract and chokeberry extract, shows novelty and an inventive level compared to the existing state of the art.

Znana jest publikacja ”Fenactive - w jaki sposób aronia i czarny bez wspierają naszą odporność?”.... (strona zarchiwizowana dnia 13.12.2020 r.) - jednak w publikacji tej nie ma szczegółowych danych i wyników badań dotyczących działania mieszaniny, w tym synergistycznego działania ekstraktów z aronii i czarnego bzu, które są przedmiotem niniejszego wynalazku. Brakuje również danych używanych stężeń oraz szczegółów dotyczących metodologii czy wyników. Natomiast zgłoszony do ochrony preparat wyróżnia się przede wszystkim nowymi proporcjami składników, gdzie stosunek ekstraktów z bzu czarnego i aronii wynosi 2:1. To specyficzne dostosowanie proporcji ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych efektów przeciwwirusowych. Dodatkowo, preparat zawiera standaryzowane ilości związków polifenolowych, szczególnie antocyjanów, co decyduje o jego nowości i potencjale terapeutycznym.There is a well-known publication "Fenactive - how do chokeberry and elderberry support our immunity?".... (page archived on December 13, 2020) - however, this publication does not contain detailed data and research results on the action of the mixture, including synergistic effect of chokeberry and elderberry extracts, which are the subject of this invention. There is also a lack of data on the concentrations used and details on the methodology or results. However, the preparation submitted for protection is distinguished primarily by new proportions of ingredients, where the ratio of elderberry and chokeberry extracts is 2:1. This specific adjustment of the ratio is crucial to achieving the desired antiviral effects. Additionally, the preparation contains standardized amounts of polyphenol compounds, especially anthocyanins, which determines its novelty and therapeutic potential.

Z abstraktu publikacji Badescu, O. Badulescu, L. Badescu, M. Ciocoiu „Effects of Sambucus nigra and Aronia melanocarpa extracts on immune system disorders within diabetes mellitus” (Pharma Biol. 2015 Apr; 53(4):533-9, abstract), znane są badania dotyczące właściwości biologicznych polifenoli ekstrahowanych z owoców aronii i bzu czarnego oraz ich wpływu na układ odpornościowy. Publikacja ta koncentrowała się na badaniu ekstraktów z bzu czarnego i aronii oddzielnie, a nie w ich połączeniu. To oznacza, że wyniki tych badań nie odzwierciedlają synergicznego działania mieszaniny ekstraktów, jak to ma miejsce w przypadku zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego. Ponadto, choć cukrzyca i choroby wirusowe mogą mieć pewne wspólne aspekty immunologiczne, ich patomechanizm i skutki są zazwyczaj różne, co oznacza, że wnioski dotyczące wpływu ekstraktów na układ odpornościowy w kontekście cukrzycy niekoniecznie można generalizować na leczenie chorób wirusowych. Zatem, mimo że publikacja ta jest cennym źródłem informacji na temat biologicznych właściwości ekstraktów z bzu czarnego i aronii, to jednak nie odzwierciedla ona synergicznego działania ich mieszaniny w kontekście przeciwwirusowego preparatu, jak również nie przekłada bezpośrednio się na specyficzne proporcje i standaryzację, które są kluczowe dla zgłoszonego wynalazku.From the abstract of the publication Badescu, O. Badulescu, L. Badescu, M. Ciocoiu "Effects of Sambucus nigra and Aronia melanocarpa extracts on immune system disorders within diabetes mellitus" (Pharma Biol. 2015 Apr; 53(4):533-9, abstract ), there are known studies on the biological properties of polyphenols extracted from chokeberry and elderberry fruits and their impact on the immune system. This publication focused on examining elderberry and chokeberry extracts separately, not in combination. This means that the results of these studies do not reflect the synergistic effect of the extract mixture, as is the case with the reported antiviral preparation. Furthermore, although diabetes and viral diseases may share some common immunological aspects, their pathomechanisms and effects are usually different, meaning that conclusions regarding the effects of extracts on the immune system in the context of diabetes may not necessarily generalize to the treatment of viral diseases. Therefore, although this publication is a valuable source of information on the biological properties of elderberry and chokeberry extracts, it does not reflect the synergistic effect of their mixture in the context of an antiviral preparation, and does not directly translate into specific proportions and standardization, which are crucial. for the claimed invention.

Z publikacji „Czarny bez-czy wzmocni odporność?” (https://pantabletka.pl/czarny-bez-odpornoscopinia/, 01.02.2020 r.), znane jest działanie przeciwwirusowe oraz immunostymulujące odporność bzu czarnego oraz aronii i ich ekstraktów. Publikacja ta rzeczywiście omawia korzyści zdrowotne czarnego bzu oraz przeprowadzone badania nad jego działaniem immunostymulacyjnym i przeciwwirusowym. W szczególności podkreśla ona aktywację zdrowego układu odpornościowego poprzez zwiększenie produkcji cytokin zapalnych, takich jak IL-6 i TNF-alfa, przez ekstrakty z czarnego bzu. Jednakże, choć te informacje są cenne i potwierdzają część efektów zdrowotnych zgłoszonego preparatu, to jednakże nie odzwierciedlają one całkowicie istoty i nowości samego wynalazku. Zgłoszony preparat, oparty na synergicznym połączeniu ekstraktów z bzu czarnego i aronii, jest bardziej skoncentrowany na wykorzystaniu specyficznych proporcji i synergii między składnikami w celu uzyskania skutecznej terapii przeciwwirusowej. Publikacja ta nie przekłada się bezpośrednio na unikalne proporcje i standaryzację, które są kluczowe dla zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego.From the publication "Black elderberry - will it strengthen immunity?" (https://pantabletka.pl/czarny-bez-odpornoscopinia/, February 1, 2020), the antiviral and immunostimulating effects of elderberry and chokeberry and their extracts are known. This publication actually discusses the health benefits of elderberry and the research conducted on its immunostimulating and antiviral effects. In particular, it highlights the activation of a healthy immune system by increasing the production of inflammatory cytokines, such as IL-6 and TNF-alpha, by elderberry extracts. However, although this information is valuable and confirms some of the health effects of the reported preparation, it does not fully reflect the essence and novelty of the invention itself. The reported preparation, based on a synergistic combination of elderberry and chokeberry extracts, is more focused on the use of specific proportions and synergy between the ingredients to obtain effective antiviral therapy. This publication does not directly translate into unique proportions and standardization, which are crucial for the reported antiviral preparation.

Z innej publikacji „Syropy na odporność dla dzieci - analiza i opinie” (http://pantabletka.pl/syropna-odpornosc-dziecko/. 21.02.2019 r.), znane są preparaty dla dzieci na bazie bzu czarnego. Publikacja ta dotyczy preparatów dla dzieci opartych na bzie czarnym. Mimo że może dostarczać informacji na temat popularności i szerokiego zastosowania bzu czarnego w suplementacji dla dzieci, to jednak nie analizuje specyficznych proporcji ekstraktów ani synergicznego działania z aronią, jak to ma miejsce w przypadku zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego.From another publication "Immunity syrups for children - analysis and opinions" (http://pantabletka.pl/syropna-odpornosc-dziecko/. 21/02/2019), preparations for children based on black elderberry are known. This publication concerns preparations for children based on black elderberry. Although it may provide information on the popularity and wide use of elderberry in supplementation for children, it does not analyze the specific proportions of extracts or the synergistic effect with chokeberry, as is the case with the reported antiviral preparation.

Celem wynalazku jest przeciwwirusowe zastosowanie preparatu, który zawiera ekstrakty z owoców aronii (Aronia melanocarpa) oraz czarnego bzu (Sambucus nigra).The purpose of the invention is the antiviral use of a preparation that contains extracts from chokeberry (Aronia melanocarpa) and black elderberry (Sambucus nigra).

Przedmiotem wynalazku jest preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2:1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.The subject of the invention is a preparation consisting of a 2:1 mixture of Sambucus nigra elderberry extract and Aronia melanocarpa chokeberry extract, containing anthocyanins 10-30% and polyphenols 15-50%, for use in antiviral treatment against a human virus from the coronavirus group.

Korzystnie reparat stosuje się doustnie.The preparation is preferably administered orally.

Korzystnie preparat stosuje się jako suplement diety.The preparation is preferably used as a dietary supplement.

Określenie stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, ma następujące znaczenie:The term used above and in the description and claims has the following meaning:

Ekstrakt - oznacza określenie tożsame/zamienne z wyrażeniem „wyciąg”.Extract - means a term identical/interchangeable with the expression "extract".

Kompozycja - oznacza określenie tożsame/zamiennie z wyrażeniem „preparat”.Composition - means a term identical/interchangeable with the expression "preparation".

Kompozycja według wynalazku - oznacza kompozycję/preparat o następującym składzie:Composition according to the invention - means a composition/preparation with the following composition:

- mieszaninę ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa,- a mixture of Sambucus nigra elderberry extract and Aronia melanocarpa chokeberry extract,

- gdzie mieszanina ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa zawiera antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%,- where the mixture of Sambucus nigra elderberry extract and Aronia melanocarpa chokeberry extract contains anthocyanins 10-30% and polyphenols 15-50%,

- stosunek ekstraktów z bzu i aronii w kompozycji wynosi 2:1.do 1:2.- the ratio of elderberry and chokeberry extracts in the composition is 2:1 to 1:2.

- kompozycja zawiera farmaceutyczną zaróbkę lub rozcieńczalnik lub nośnik.- the composition comprises a pharmaceutical excipient or diluent or carrier.

Opis rysunków:Description of drawings:

Fig. 1 - przedstawia wpływ ekstraktów z aronii (A), czarnego bzu (B), oraz kompozycji według wynalazku (C) na replikację wirusa HCoV-OC43 w dawce 100 TCID50 (mediana z trzech niezależnych doświadczeń z trzema powtórzeniami, przedział ufności 95%). Wyniki testu mikroskopowego pokrywają się z wynikami testu immunoperoksydazowego. Wyniki zostały zanalizowane testem t Welcha za pomocą GraphPad Prism 9.1.0.Fig. 1 - shows the effect of chokeberry extracts (A), elderberry (B), and the composition according to the invention (C) on the replication of the HCoV-OC43 virus at a dose of 100 TCID50 (median of three independent experiments with three repetitions, confidence interval 95% ). The results of the microscopic test coincide with the results of the immunoperoxidase test. The results were analyzed by Welch's t test using GraphPad Prism 9.1.0.

Fig. 2 - przedstawia wpływ kompozycji według wynalazku na wiązanie rekombinowanego białka hACE2 z domeną wiążącą receptor białka S wirusa SARS-CoV2 S (RBD) w kompetycyjnym teście ELISA.Fig. 2 - shows the effect of the composition according to the invention on the binding of the recombinant hACE2 protein to the receptor-binding domain of the S protein of the SARS-CoV2 S virus (RBD) in a competitive ELISA test.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia .The invention is illustrated by the following non-limiting embodiments.

Przykład 1:Example 1:

AKTYWNOŚĆ EKSTRAKTÓW Z OWOCÓW BZU CZARNEGO, ARONII ORAZ KOMPOZYCJI WEDŁUG WYNALAZKU WOBEC BETAKORONAWIRUSA HCoV-OC43ACTIVITY OF EXTRACTS FROM ELDERFRUITS, CHOKEBERRY AND COMPOSITIONS ACCORDING TO THE INVENTION AGAINST BETACORONAVIRUS HCoV-OC43

METODYKA BADAŃRESEARCH METHODOLOGY

Badane ekstraktyTested extracts

Standaryzowany wyciąg z owocu bzu czarnego (Sambucus nigra), standaryzowany wyciąg z aronii (Aronia melanocarpa) oraz kompozycja według wynalazku zawierająca standaryzowany wyciąg z aronii oraz standaryzowany wyciąg z owocu bzu czarnego. Wyjściowe stężenie ekstraktów, 10 mg/ml przygotowywano w 50% DMSO na świeżo przed każdym eksperymentem. Następnie, ekstrakty rozcieńczano w medium hodowlanym do odpowiednich stężeń. Końcowe stężenie DMSO w komórkach wynosiło < 5% (stężenie nietoksyczne dla komórek).Standardized extract of black elderberry (Sambucus nigra), standardized extract of chokeberry (Aronia melanocarpa) and the composition according to the invention containing standardized extract of chokeberry and standardized extract of black elderberry. The initial concentration of extracts, 10 mg/ml, was prepared in 50% DMSO fresh before each experiment. Then, the extracts were diluted in the culture medium to appropriate concentrations. The final concentration of DMSO in cells was <5% (non-toxic concentration to cells).

Linie komórkoweCell lines

Linia komórkowa raka okrężnicy HCT-8 [HRT-8] (ATCC® CCL-244™). Komórki hodowano w medium RPMI-1640 z dodatkiem 10% horse serum.HCT-8 [HRT-8] colon cancer cell line (ATCC® CCL-244™). Cells were cultured in RPMI-1640 medium with the addition of 10% horse serum.

Wirus testowyTest virus

Ludzki wirus HCoV-OC43 (ATCC® VR-1558™ - betacoronavirus 1).Human HCoV-OC43 virus (ATCC® VR-1558™ - betacoronavirus 1).

Ocena cytotoksyczności badanych preparatówAssessment of cytotoxicity of tested preparations

Cytotoksyczność badanych preparatów oceniano traktując 24 godzinne hodowle komórek linii HCT-8 wybranymi dawkami, rozpuszczonymi w płynie hodowlanym RPMI-1640 bez dodatku FBS (ekstrakt z aronii: 7,8-250 μg/ml, ekstrakt z czarnego bzu: 62,5-1000 μg/ml, kompozycja według wynalazku: 15,63-1000 μg/ml). Następnie hodowle inkubowano w inkubatorze 37°C, 5% CO2. Po 96 godzinach inkubacji wykonano kontrolne odczyty mikroskopowe zmian w morfologii komórek, wskazujących na cytotoksyczność (CTE, cytotoxic effect), w skali: 0 - brak cytotoksyczności; 1 - do 25%; 2 - 50%; 3 - 75%; 4 - 100% cytotoksyczność. Do badań wpływu preparatów na replikację wirusów wybrano 3 dawki dla każdego z preparatów, przy której żywotność komórek nie spada poniżej 75%.The cytotoxicity of the tested preparations was assessed by treating 24-hour cultures of HCT-8 line cells with selected doses dissolved in the culture fluid RPMI-1640 without the addition of FBS (chokeberry extract: 7.8-250 μg/ml, elderberry extract: 62.5-1000 μg/ml, composition according to the invention: 15.63-1000 μg/ml). Then the cultures were incubated in a 37°C, 5% CO2 incubator. After 96 hours of incubation, control microscopic readings were made of changes in cell morphology, indicating cytotoxic effect (CTE), on a scale: 0 - no cytotoxicity; 1 - up to 25%; 2 - 50%; 3 - 75%; 4 - 100% cytotoxicity. To study the effect of preparations on viral replication, three doses were selected for each preparation, at which cell viability does not fall below 75%.

Określenie wpływu preparatów na replikację betakoronavirusa 1Determining the effect of preparations on the replication of betacoronavirus 1

Wpływ preparatów na replikację wirusa oceniano w dawce 100 TCIDso/ml po wniknięciu wirusa do komórek (preinkubacja komórek z wirusami i późniejsza hodowla z badanym preparatem). 24-godzinną hodowlę komórek linii HCT-8 inkubowano z wirusem w płynie hodowlanym RPMI-1640, w inkubatorze 33°C, 5% CO2, przez 90 minut. Następnie dokładnie opłukano hodowlę z wirusów, po czym naniesiono wybrane dawki preparatów z zakresu:The effect of the preparations on virus replication was assessed at a dose of 100 TCIDso/ml after the virus entered the cells (pre-incubation of cells with viruses and subsequent culture with the tested preparation). A 24-hour culture of HCT-8 line cells was incubated with the virus in RPMI-1640 culture fluid in a 33°C, 5% CO2 incubator for 90 minutes. Then, the culture was thoroughly rinsed of viruses, and selected doses of preparations were applied:

• Ekstrakt z aronii: 7,8-31,25 μg/ml • Ekstrakt z bzu czarnego: 62,5-250 μg/ml • Kompozycja według wynalazku: 15,63-125 μg/ml przygotowanych w płynie hodowlanym RPMI bez dodatku FBS i inkubowano 96 godzin w inkubatorze 33°C 5% CO2. Po tym czasie odczytano miano wirusów pod mikroskopem.• Chokeberry extract: 7.8-31.25 μg/ml • Elderberry extract: 62.5-250 μg/ml • Composition according to the invention: 15.63-125 μg/ml prepared in RPMI culture fluid without the addition of FBS and incubated for 96 hours in a 33°C 5% CO2 incubator. After this time, the virus titer was read under a microscope.

Dodatkowo, wykonano również test immunoperoksydazowy w celu potwierdzenia odczytów mikroskopowych CPE wywołanych przez wirusa HCoV-OC43. Test ten pozwala wykryć nawet bardzo niskie miano wirusa HCoV-OC43, gdy nie jest widoczny typowy efekt cytopatyczny (CPE). Po 96 godz. inkubacji hodowli traktowanych preparatami i wirusem HCoV-OC43 wykonano barwienie z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciwko wirusowi HCoV-OC43 (mouse anti-coronavirus monoclonal antibodies) i przeciwciał drugorzędowych - goat anti-mouse IgG HRP. Następnie przeprowadzono reakcję barwną z użyciem DAB/H2O2 i obserwowano pod mikroskopem wybarwione na brązowo komórki zawierające wirusa HCoV-OC43.Additionally, an immunoperoxidase test was also performed to confirm the microscopic readings of CPE caused by the HCoV-OC43 virus. This test can detect even very low titers of the HCoV-OC43 virus when the typical cytopathic effect (CPE) is not visible. After 96 hours incubation of cultures treated with the preparations and the HCoV-OC43 virus was stained using primary antibodies directed against the HCoV-OC43 virus (mouse anti-coronavirus monoclonal antibodies) and secondary antibodies - goat anti-mouse IgG HRP. Then, a color reaction was performed using DAB/H2O2 and brown-stained cells containing the HCoV-OC43 virus were observed under a microscope.

Efekt wybarwienia przyporządkowano do skali 0-4, gdzie:The coloring effect was assigned to a scale of 0-4, where:

- brak wybarwienia- no discoloration

- poniżej 25% wybarwionych komórek- less than 25% of stained cells

- od 25 do 50% wybarwionych komórek- from 25 to 50% of stained cells

- powyżej 50 do 75% wybarwionych komórek- more than 50 to 75% of stained cells

- powyżej 75 do 100% wybarwionych komórek- more than 75 to 100% of cells stained

WYNIKIRESULTS

Wyznaczenie nietoksycznych stężeń ekstraktów z aronii, bzu czarnego oraz kompozycji według wynalazkuDetermination of non-toxic concentrations of chokeberry and elderberry extracts and the compositions according to the invention

Zarówno w przypadku ekstraktu z aronii, czarnego bzu, jak i kompozycji według wynalazku % żywych komórek HCT-8 zmniejszał się wraz ze wzrostem stężenia preparatów. Do badań wpływu preparatów na replikację wirusa HCoV-OC43 wybrano stężenia przy których ilość żywych komórek w hodowli wynosiła co najmniej 80%.Both in the case of chokeberry and elderberry extracts and the compositions according to the invention, the % of live HCT-8 cells decreased with the increase in the concentration of the preparations. For testing the effect of preparations on the replication of the HCoV-OC43 virus, concentrations were selected at which the number of live cells in the culture was at least 80%.

Wpływ badanych preparatów na replikację wirusa HCoV-OC43The impact of the tested preparations on the replication of the HCoV-OC43 virus

Zarówno ekstrakt z aronii jak i czarnego bzu w badanym zakresie stężeń nie wykazały działania przeciwwirusowego wobec wirusa HCoV-OC43. Z kolei kompozycja według wynalazku wykazała działanie przeciwwirusowe w stosunku do wirusa HCoV-OC43, hamując jego replikację po wniknięciu do komórek o ok. 50% (przy stężeniu 125 μg/ml) (Fig. 1).Both chokeberry and elderberry extracts in the tested concentration range did not show antiviral activity against the HCoV-OC43 virus. In turn, the composition according to the invention showed antiviral activity against the HCoV-OC43 virus, inhibiting its replication after entering cells by approximately 50% (at a concentration of 125 μg/ml) (Fig. 1).

Przykład 2:Example 2:

OCENA HAMUJĄCEGO DZIAŁANIA KOMPOZYCJI WEDŁUG WYNALAZKU NA WIĄZANIE ACE2 i SARS-CoV2 RBD in vitroEVALUATION OF THE INHIBITORY EFFECT OF THE COMPOSITIONS ACCORDING TO THE INVENTION ON THE BINDING OF ACE2 and SARS-CoV2 RBD in vitro

METODYKA BADAŃRESEARCH METHODOLOGY

Ocenę hamowania wiązania SARS-CoV2 RBD (domena wiążąca receptor) i hACE2 (ludzki enzym konwertujący angiotensynę 2) przeprowadzono przy użyciu zestawu COVID-19 Spike-ACE2 (CoVSACE2-1, RayBiotech Inc, https://www.raybiotech.com/covid-19-spike-ace2-wiążący-zestaw-testowy) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Kompozycja według wynalazku przygotowana była w trzech stężeniach (100, 1000, 2000 μg/ml), a potencjał inhibicyjny dla każdego stężenia oceniano w dwóch powtórzeniach. Analizowane ekstrakty zmieszano z rekombinowanym białkiem hACE2, dodano do płytki ELISA pokrytej rekombinowaną RBD białka S SARS-CoV2 i inkubowano przez noc w 4°C. Niezwiązane ACE2 usunięto przez płukanie, a wiązanie oceniano na podstawie reakcji przeciwciała anty-ACE2 sprzężonego z HRP (peroksydazą chrzanową) z 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyną (TMB). Absorbancję przy 450 nm mierzono czytnikiem PerkinElmer.Assessment of SARS-CoV2 RBD (receptor binding domain) and hACE2 (human angiotensin-converting enzyme 2) binding inhibition was performed using the COVID-19 Spike-ACE2 kit (CoVSACE2-1, RayBiotech Inc, https://www.raybiotech.com/covid -19-spike-ace2-binding-test-kit) according to the protocol provided by the manufacturer. The composition according to the invention was prepared in three concentrations (100, 1000, 2000 μg/ml), and the inhibitory potential for each concentration was assessed in duplicate. The analyzed extracts were mixed with recombinant hACE2 protein, added to an ELISA plate coated with the recombinant RBD of SARS-CoV2 S protein, and incubated overnight at 4°C. Unbound ACE2 was removed by washing, and binding was assessed by the reaction of an HRP (horseradish peroxidase)-conjugated anti-ACE2 antibody with 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB). Absorbance at 450 nm was measured with a PerkinElmer reader.

WYNIKIRESULTS

Analiza testu wiązania ACE2-SARS CoV2 RBD in vitro wykazała zależny od stężenia hamujący wpływ kompozycji według wynalazku (Fig. 2).Analysis of the ACE2-SARS CoV2 RBD binding assay in vitro showed a concentration-dependent inhibitory effect of the composition according to the invention (Fig. 2).

Literatura:Literature:

Aksoy, B.A., Aksoy, P., Wyatt, M., Paulos, C.M., & Hammerbacher, J. (2018). PBMC isolation from buffy coat or whole blood PBMC cryopreservation. Protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/proto- cols.io.qu2dwye.Aksoy, B. A., Aksoy, P., Wyatt, M., Paulos, C. M., & Hammerbacher, J. (2018). PBMC isolation from buffy coat or whole blood PBMC cryopreservation. Protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/proto-cols.io.qu2dwye.

Anton, A.M., Pintea, A.M., Rugina, D.O., Scon(a, Z.M., Hanganu, D., Vlase, L., & Benedec, D. (2013). Preliminary studies on the chemical characterization and antioxidant capacity of polyphenols from Sambucus SP. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 8(3): 973-980.Anton, A.M., Pintea, A.M., Rugina, D.O., Scon(a, Z.M., Hanganu, D., Vlase, L., & Benedec, D. (2013). Preliminary studies on the chemical characterization and antioxidant capacity of polyphenols from Sambucus SP. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 8(3): 973-980.

Appel, K., Meiser, P., Millan, E., Collado, J.A., Rose, T., Gras, C.C., Carle, R., Munoz, E. (2015). Chokeberry (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot) concentrate inhibits NF-kB and synergizes with selenium to inhibit the release of pro-inflammatory mediators in macrophages. Fitoterapia, 105: 73-82.Appel, K., Meiser, P., Millan, E., Collado, J. A., Rose, T., Gras, C. C., Carle, R., Munoz, E. (2015). Chokeberry (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot) concentrate inhibits NF-kB and synergizes with selenium to inhibit the release of pro-inflammatory mediators in macrophages. Phytoterapia, 105: 73-82.

Barak, V., Halperin, T., & Kalickman, I. (2001). The effect of Sambucol, a black elderberry-based natural product, on the production of human cytokines: I. Inflammatory cytokines. European Cytokine Network, 12(2): 290-296.Barak, V., Halperin, T., & Kalickman, I. (2001). The effect of Sambucol, a black elderberry-based natural product, on the production of human cytokines: I. Inflammatory cytokines. European Cytokine Network, 12(2): 290-296.

Bonarska-Kujawa, D., Pruchnik, H., Oszmiański, J., Sarapuk, J., & Kleszczyńska, H. (2011). Changes Caused by Fruit Extracts in the Lipid Phase of Biological and Model Membranes. Food Biophysics, 6(1): 58-67.Bonarska-Kujawa, D., Pruchnik, H., Oszmiański, J., Sarapuk, J., & Kleszczyńska, H. (2011). Changes Caused by Fruit Extracts in the Lipid Phase of Biological and Model Membranes. Food Biophysics, 6(1): 58-67.

Chen, C., Zuckerman, D.M., Brantley, S., Sharpe, M., Childress, K., Hoiczyk, E., & Pendleton, A. R. (2014). Sambucus nigra extracts inhibit infectious bronchitis virus at an early point during replication. BMC Veterinary Research, 10(24).Chen, C., Zuckerman, D. M., Brantley, S., Sharpe, M., Childress, K., Hoiczyk, E., & Pendleton, A. R. (2014). Sambucus nigra extracts inhibit infectious bronchitis virus at an early point during replication. BMC Veterinary Research, 10(24).

Glatthaar-Saalmuller, B., Fal, A.M., Schonknecht, K., Conrad, F., Sievers, H., & Saalmuller, A. (2015). Antiviral activity of an aqueous extract derived from Aloe arborescens Mill, against a broad panel of viruses causing infections of the upper respiratory tract. Phytomedicine, 22(10): 911-920.Glatthaar-Saalmuller, B., Fal, A. M., Schonknecht, K., Conrad, F., Sievers, H., & Saalmuller, A. (2015). Antiviral activity of an aqueous extract derived from Aloe arborescens Mill, against a broad panel of viruses causing infections of the upper respiratory tract. Phytomedicine, 22(10): 911-920.

Hawkins, J., Baker, C., Cherry, L., Dunne, E. (2019). Black elderberry (Sambucus nigra) supplementation effectively treats upper respiratory symptoms: A metaanalysis of randomized, controlled clinical trials. Complement Ther Med., 42: 361-365.Hawkins, J., Baker, C., Cherry, L., Dunne, E. (2019). Black elderberry (Sambucus nigra) supplementation effectively treats upper respiratory symptoms: A meta-analysis of randomized, controlled clinical trials. Complement Ther Med., 42: 361-365.

Ho, G.T.T., Braunlich, M., Austarheim, I., Wangensteen, H., Malterud, K.E., Slimestad, R., & Barsett, H. (2014). Immunomodulating activity of Aronia melanocarpa polyphenols. Int J Mol Sci., 15(7): 11626-11636.Ho, G. T. T., Braunlich, M., Austarheim, I., Wangensteen, H., Malterud, K. E., Slimestad, R., & Barsett, H. (2014). Immunomodulating activity of Aronia melanocarpa polyphenols. Int J Mol Sci., 15(7): 11626-11636.

Kinoshita, E., Hayashi, K., Katayama, H., Hayashi, T., Obata, A. (2012). Anti-influenza virus effects of elderberry juice and its fractions. Biosci Biotechnol Biochem, 76(9): 1633-8.Kinoshita, E., Hayashi, K., Katayama, H., Hayashi, T., Obata, A. (2012). Anti-influenza virus effects of elderberry juice and its fractions. Biosci Biotechnol Biochem, 76(9): 1633-8.

Kong, F. (2009). Pilot clinical study on a proprietary elderberry extract: efcacy in addressing infuenza symptoms. J Pharmacol Pharmacokinet., 5: 32-43.Kong, F. (2009). Pilot clinical study on a proprietary elderberry extract: efcacy in addressing infusion symptoms. J Pharmacol Pharmacokinet., 5: 32-43.

Krawitz, C., Mraheil, M.A., Stein, M., Imirzalioglu, C., Domann, E., Pleschka, S., & Hain, T. (2011). Inhibitory activity of a standardized elderberry liquid extract against clinically-relevant human respiratory bacterial pathogens and influenza A and B viruses. BMC Complement Altern Med., 11(1), 16.Krawitz, C., Mraheil, M. A., Stein, M., Imirzalioglu, C., Domann, E., Pleschka, S., & Hain, T. (2011). Inhibitory activity of a standardized elderberry liquid extract against clinically-relevant human respiratory bacterial pathogens and influenza A and B viruses. BMC Complement Altern Med., 11(1), 16.

doi.10.1186/1472-6882-11-16.doi.10.1186/1472-6882-11-16.

Lin, P., Hwang, E., Ngo, H.T.T., Seo, S.A., Yi, T.H. (2019). Sambucus nigra L. ameliorates UVBinduced photoaging and inflammatory response in human skin keratinocytes. Cytotechnology, 71(5): 1003-1017.Lin, P., Hwang, E., Ngo, H.T.T., Seo, S.A., Yi, T.H. (2019). Sambucus nigra L. ameliorates UVB induced photoaging and inflammatory response in human skin keratinocytes. Cytotechnology, 71(5): 1003-1017.

Macdonald, S.J., Watson, K.G., Cameron, R., Chalmers, D.K., Demaine, D.A., Fenton, R.J., Gower, D., Hamblin, J.N., Hamilton, S., Hart, G.J., Inglis, G.G., Jin, B., Jones, H.T., McConnell, D.B., Mason, A.M., Nguyen, V., Owens, I.J., Parry, N., Reece, P.A., Shanahan, S.E., Smith, D., Wu, W.Y., Tucker, S.P., (2004). Potent and long-acting dimeric inhibitors of influenza virus neuraminidase are effective at a onceweekly dosing regimen. Antimicrob. Agents Chemother., 48: 4542-4549.Macdonald, S.J., Watson, K.G., Cameron, R., Chalmers, D.K., Demaine, D.A., Fenton, R.J., Gower, D., Hamblin, J.N., Hamilton, S., Hart, G.J., Inglis, G.G., Jin, B ., Jones, H.T., McConnell, D.B., Mason, A.M., Nguyen, V., Owens, I.J., Parry, N., Reece, P.A., Shanahan, S.E., Smith, D., Wu, W.Y., Tucker, S.P., ( 2004). Potent and long-acting dimeric inhibitors of influenza virus neuraminidase are effective at a onceweekly dosing regimen. Antimicrobial. Agents Chemother., 48: 4542-4549.

Martin, D.A., Taheri, R., Brand, M.H., Draghi, A., Sylvester, F.A., Bolling, B.W. (2014). Anti-inflammatory activity of aronia berry extracts in murine splenocytes. J. Funct. Foods, 8: 68-75.Martin, D.A., Taheri, R., Brand, M.H., Draghi, A., Sylvester, F.A., Bolling, B.W. (2014). Anti-inflammatory activity of chokeberry berry extracts in murine splenocytes. J. Funct. Foods, 8: 68-75.

Morag, A., Mumeuoglu, M., Baybikov, T., Schelsinger, M., Zakay-Rones, Z. (1997) Inhibition of sensitive and acyclovir-resistant HSV-1 strains by an elderberry extract in vitro. J Z Phytother., 25: 97-98.Morag, A., Mumeuoglu, M., Baybikov, T., Schelsinger, M., Zakay-Rones, Z. (1997) Inhibition of sensitive and acyclovir-resistant HSV-1 strains by an elderberry extract in vitro. J Z Phytother., 25: 97-98.

Ohgami, K., Ilieva, I., Shiratori, K., Koyama, Y., Jin, XH., Yoshida, K., Kase, S., Kitaichi, N., Suzuki, Y., Tanaka, T., Ohno, S. (2005). Anti-inflammatory effects of aronia extract on rat endotoxin-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci., 46(1): 275-281.Ohgami, K., Ilieva, I., Shiratori, K., Koyama, Y., Jin, X.H., Yoshida, K., Kase, S., Kitaichi, N., Suzuki, Y., Tanaka, T., Ohno, S. (2005). Anti-inflammatory effects of chokeberry extract on rat endotoxin-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci., 46(1): 275-281.

Park, S., Kim, J. I., Lee, I., Lee, S., Hwang, M.W., Bae, J.Y., Heo, J., Kim, D., Han, S.Z., & Park, M.S. (2013). Aronia melanocarpa and its components demonstrate antiviral activity against influenza viruses. Biochem Biophys Res Commun., 440(1): 14-19.Park, S., Kim, J. I., Lee, I., Lee, S., Hwang, M. W., Bae, J. Y., Heo, J., Kim, D., Han, S. Z., & Park, M. S. (2013). Aronia melanocarpa and its components demonstrate antiviral activity against influenza viruses. Biochem Biophys Res Commun., 440(1): 14-19.

Roschek, B., Fink, R.C., McMichael, M.D., Li, D., & Alberte, R.S. (2009). Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro. Phytochemistry, 70(10): 1255-1261.Roschek, B., Fink, R.C., McMichael, M.D., Li, D., & Alberte, R.S. (2009). Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro. Phytochemistry, 70(10): 1255-1261.

Sekizawa, H., Ikuta, K., Mizuta, K., Takechi, S., & Suzutani, T. (2013). Relationship between polyphenol content and anti-influenza viral effects of berries. J Sci Food Agric., 93(9): 2239-2241.Sekizawa, H., Ikuta, K., Mizuta, K., Takechi, S., & Suzutani, T. (2013). Relationship between polyphenol content and anti-influenza viral effects of berries. J Sci Food Agric., 93(9): 2239-2241.

Swaminathan, K., Dyason, J.C., Maggioni, A., von Itzstein, M., Downard, K.M. (2013). Binding of a natural anthocyanin inhibitor to influenza neuraminidase by mass spectrometry. Anal Bioanal Chem., 405(20): 6563-6572.Swaminathan, K., Dyason, J.C., Maggioni, A., von Itzstein, M., Downard, K.M. (2013). Binding of a natural anthocyanin inhibitor to influenza neuraminidase by mass spectrometry. Anal Bioanal Chem., 405(20): 6563-6572.

Tiralongo, E., Wee, S.S., & Lea, R.A. (2016). Elderberry supplementation reduces cold duration and symptoms in air-travellers: A randomized, double-blind placebocontrolled clinical trial. Nutrients, 8(4), 182. doi.10.3390/nu8040182.Tiralongo, E., Wee, S.S., & Lea, R.A. (2016). Elderberry supplementation reduces cold duration and symptoms in air-travellers: A randomized, double-blind placebocontrolled clinical trial. Nutrients, 8(4), 182. doi.10.3390/nu8040182.

Torabian, G., Valtchev, P., Adil, Q., & Dehghani, F. (2019). Anti-influenza activity of elderberry (Sambucus nigra). Journal of Functional Foods, 54: 353-360.Torabian, G., Valtchev, P., Adil, Q., & Dehghani, F. (2019). Anti-influenza activity of elderberry (Sambucus nigra). Journal of Functional Foods, 54: 353-360.

Ulbricht, C., Basch, E., Cheung, L., Goldberg, H., Hammerness, P., Isaac, R., Khalsa, K.P.S., Romm, A., Rychlik, I., Varghese, M., Weissner, W., Windsor, R.C., & Wortley, J. (2014). An evidencebased systematic review of elderberry and elderflower (Sambucus nigra) by the natural standard research collaboration. J Diet Suppl., 11(1): 80-120.Ulbricht, C., Basch, E., Cheung, L., Goldberg, H., Hammerness, P., Isaac, R., Khalsa, K.P.S., Romm, A., Rychlik, I., Varghese, M., Weissner , W., Windsor, R. C., & Wortley, J. (2014). An evidencebased systematic review of elderberry and elderflower (Sambucus nigra) by the natural standard research collaboration. J Diet Suppl., 11(1): 80-120.

Uncini M., R.E., Zaccaro, L., & Tomei, P.E. (2005). Antiviral activity in vitro of Urtica dioica L., Parietaria diffusa M. et K. and Sambucus nigra L. J Ethnopharmacol., 98(3): 323-327.Uncini M., R.E., Zaccaro, L., & Tomei, P.E. (2005). Antiviral activity in vitro of Urtica dioica L., Parietaria diffusa M. et K. and Sambucus nigra L. J Ethnopharmacol., 98(3): 323-327.

Zakay-Rones Z., Varsano, N., Zlotnik. M., Manor, O., Regev, L., Schlesinger, M., & Mumcuoglu, M. (1995). Inhibition of Several Strains of Influenza Virus in Vitro and Reduction of Symptoms by an Elderberry Extract (Sambucus nigra L.) during an Outbreak of Influenza B Panama. J Altern Complement Med., (4): 361-369.Zakay-Rones Z., Varsano, N., Zlotnik. M., Manor, O., Regev, L., Schlesinger, M., & Mumcuoglu, M. (1995). Inhibition of Several Strains of Influenza Virus in Vitro and Reduction of Symptoms by an Elderberry Extract (Sambucus nigra L.) during an Outbreak of Influenza B Panama. J Altern Complement Med., (4): 361-369.

Claims (3)

1. Preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2:1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.1. A preparation consisting of a 2:1 mixture of Sambucus nigra elderberry extract and Aronia melanocarpa chokeberry extract, containing anthocyanins 10-30% and polyphenols 15-50%, for use in antiviral treatment against a human virus from the coronavirus group. 2. Preparat do zastosowania według zastrz. 1, znamiennym tym, że preparat stosuje się doustnie.2. Preparation for use according to claim 1. 1, characterized in that the preparation is administered orally. 3. Preparat do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jako suplement diety.3. Preparation for use according to claim. 1, characterized in that it is used as a dietary supplement.