PL243517B1

PL243517B1 - Pochodne (benzyloksy)benzenu nadające się do stosowania w immunoterapii nowotworów oraz zawierająca je kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL243517B1
Application number: PL434464A
Authority: PL
Inventors: Magdalena Konieczny; Jacek Plewka; Bogdan Musielak; Łukasz Skalniak; Tadeusz Holak
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2020-06-25
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2023-09-04
Also published as: PL434464A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek o wzorze ogólnym (I): gdzie X oznacza -Br lub fenyl, Y oznacza fenyl, 2,3-dihydrobenzo[b][1,4] dioksynę lub naftalen, R1 oznacza –Br, -OMe, -Me, -Cl lub –H, R2 oznacza -OH, -H lub pochodną pikolinonitrylu, a R3 oznacza podstawnik wybrany spośród grup określonych wzorem ogólnym (Ia) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. Zgłoszenie obejmuje także kompozycje farmaceutyczną, zawierającą efektywną terapeutycznie dawkę przedmiotowego związku.

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne (benzyloksy)benzenu stanowiące małocząsteczkowe inhibitory celujące w punkt kontroli odpowiedzi immunologicznej PD-1/PD-L1 mogące znaleźć zastosowanie w immunoterapii nowotworów oraz zawierająca je kompozycja farmaceutyczna.

Immunoterapia oparta na inhibitorach punktów kontroli jak np. PD-1, CTLA-4, etc. powoduje trwałe odpowiedzi terapeutyczne i lepsze przeżycie u pacjentów z różnymi rodzajami nowotworów^1-3. Liczne postępy w tej dziedzinie sprawiły, że czasopismo Science ogłosiło immunoterapię „Przełomem Roku” w 2013 roku, natomiast w 2018 James P. Allison z USA i Tasuku Honjo z Japonii otrzymali Nagrodę Nobla z medycyny i fizjologii za opracowanie metod odblokowania działania układu odporności.

Jednym ze sposobów, w jaki komórki nowotworowe unikają nadzoru immunologicznego umożliwiając rozrost guzów, są złożone mechanizmy immunosupresyjne, które zwykle odgrywają rolę w kontrolowaniu normalnych przeciwbakteryjnych i antywirusowych odpowiedzi immunologicznych i zapobiegają nadmiernie nadmiernej odpowiedzi immunologicznej i powiązanym immunopatologiom. Na przykład, silnie lub chronicznie aktywowane komórki T nadregulują ekspresję PD-1 w wyniku czego komórki będą wykazywać ekspresję PD-L1 po ekspozycji na IFNy pochodzący z limfocytów T. Tak więc w procesie znanym jako „adaptacyjna odporność immunologiczna” odpowiedź przeciwnowotworowa limfocytów T spowoduje supresję aktywowanych komórek T CD8 + za pośrednictwem PD-L1/PD-1.

PD-1, czyli receptor programowanej śmierci (eng. programmed death receptor 1, CD279), to glikoproteinowe białko o masie ok. 55 kDa składające się z 288 aminokwasów z rodziny białek B7-CD28. Składa się z zewnątrzkomórkowej domeny lgV podobnej, domeny transbłonowej oraz cytoplazmatycznej. PD-1 pełni funkcję negatywnego regulatora odpowiedzi immunologicznej. Jest kodowane przez gen pdcdl zlokalizowany na drugim chromosomie (2q37) i ulega ekspresji na powierzchni aktywowanych limfocytów T i B, odpowiadając za regulację tolerancji immunologicznej.

Ligand białka PD-1 (PD-L1, CD270 lub B7-H1) to glikoproteinowe białko o masie 33 kDa z genem zlokalizowanym na 9 chromosomie 9p24. To transmembranowe białko typu I składa się z 290 aminokwasów i posiada domeny lgV and IgC w części zewnątrzkomórkowej. Jego nadekspresja została zaobserwowana w wielu komórkach układu odpornościowego takich jak makrofagi, limfocyty B oraz wielu typach komórek niehematopoetycznych⁴. Oddziaływanie pomiędzy PD-1 i jego ligandem PD-L1 skutkuje supresją m.in. proliferacji limfocytów T, wydzielania cytokin oraz funkcji cytotoksycznych limfocytów. Szlak ten jest również często wykorzystywany przez komórki nowotworowe oraz wirusy czy bakterie do osłabienia naturalnej odpowiedzi immunologicznej organizmu i ułatwienia rozprzestrzeniania się w zaatakowanym organizmie⁵. Blokada tego szlaku np. poprzez specyficzne przeciwciała blokujące odziaływanie PD1-/PD-L1 przywraca funkcje cytotoksyczne limfocytom T normalizując odpowiedź immunologiczną organizmu i jest jednym z najważniejszych elementów immunoterapii nowotworowej.

Na chwilę obecną wszystkie zarejestrowane, bądź znajdujące się w fazie badań klinicznych związki bezpośrednio blokujące interakcje białka PD-1 z jego ligandem są oparte na przeciwciałach monoklonalnych, bądź ich kombinacjach między sobą lub z chemioterapią. Jedyny związek małocząsteczkowy znajdujący się aktualnie w I fazie badań klinicznych w Stanach Zjednoczonych, który miał bezpośrednio oddziaływać z białkami PD-1/PD-L1 (CA-170), został ostatnio scharakteryzowany jako oddziałujący na szlak PD-1/PD-L1⁶. Jednakże małocząsteczkowe inhibitory oddziaływania PD-1/PD-L1 są interesującą alternatywną dla terapii opartych na przeciwciałach ze względu na dużo niższe koszty produkcji, możliwość podawania doustnego zamiast dożylnego, lepszej farmakokinetyce i potencjalnie braku niepożądanych działań związanych z odpornością pacjenta tak charakterystycznych dla terapii opartych na przeciwciałach⁷.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków, które mogłyby być wykorzystywane jako inhibitor oddziaływania PD-1/PD-L1.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym (I):

O)

PL 243517 Β1 gdzie:

X oznacza -Br lub fenyl,

Y oznacza fenyl, 2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksynę lub naftalen,

Ri oznacza -Br, -OMe, -Me, -Cl lub -H,

R2 oznacza -OH, -H lub pochodną pikolinonitrylu a R3 oznacza podstawnik wybrany spośród:

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Korzystnie, związek według wynalazku został wybrany z grupy obejmującej: 3-bromo-4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd, kwas (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1-(4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1-(4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1-(4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy, 3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd, (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-kwas karboksylowy, 3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd, kwas (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy, 3-bromo-4-((2-bromo[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzoesan metylu, chlorowodorek 4-(3-(3-bromo-4-((2-bromo-[1,1’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzamido)propylo)morfolin-4-ium, 4-([1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzaldehyd, kwas (2S, 4S)-1-(4-([1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzylo)-4-hydroksy-pirolidyno-2-karboksylowy, 4-([1,T:2’, 1 ”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-5-chloro-2-hydroksybenzaldehyd oraz 4-((5-([1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-4-chloro-2-formylofenoksy)metylo)pikolinonitryl.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek określony powyżej do stosowania jako inhibitor szlaku białek PD-1/PD-L1, zwłaszcza w komórkach ssaka, korzystnie komórkach nowotworowych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek określony powyżej do stosowania w farmacji, zwłaszcza w leczeniu lub profilaktyce chorób nowotworowych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca efektywną terapeutycznie dawkę związku określonego powyżej.

W przykładowej realizacji opisano inhibitor oddziaływania PD-1/PD-L1 o wzorze ogólnym (I) (Schemat 1),

Schemat 1. Struktura inhibitorów (I) gdzie X oznacza -Br lub fenyl, Y to fenyl, 2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyna lub naftalen. Za R1 możemy natomiast przyjąć -Br, -OMe, -Me, -Cl lub -H, R2 to -OH, -H lub pochodna pikolinonitrylu, a R3 stanowią podstawniki, które możemy przedstawić za pomocą zamieszczonych poniżej struktur:

PL 243517 Β1

COOH

Θ

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól mogąca znaleźć zastosowanie jako lek w leczeniu chorób nowotworowych.

Inhibitory te powodują dimeryzację białka PD-L1 uniemożliwiającą jego interakcję z białkiem PD-1, co zostało potwierdzone metodą NMR. Aktywność związków w dysocjacji kompleksu PD-1/PD-L1 została potwierdzona badaniami metodą fluorescencji czasowo-rozdzielczej (eng. Homogenous Time Resolved Fluorescence - HTRF).

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku niniejszy opis został wzbogacony o szczegółowe przykłady jego realizacji, które zostały przedstawione poniżej.

Widma ¹H i ¹³C NMR zarejestrowano na spektrometrze Bruker Avance 600 MHz z wyrażeniem przesunięć chemicznych (5) w ppm i stałych sprzęgania (J) w Hz. TMS został zastosowano jako wzorzec i wewnętrzny standard. Ponadto analizowano przesunięcia chemiczne w odniesieniu do pików rozpuszczalnika (DMSO-d6, CDCh). Związki oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z zastosowaniem chromatografu typu flash Grace Reveleris X2. Progres reakcji monitorowano poprzez wizualizacje płytek TLC z żelem krzemionkowym typu TLC Merck 60 254 do 365 nm.

3-bromo-4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd (1)

(i)

2-bromo-3-(bromometylo)-1,T-bifenyl (220 mg, 0,68 mmol), 3-bromo-4-hydroksybenzaldehyd (136 mg, 0,68 mmol), węglan potasu (187 mg, 1,36 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 χ 30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) i otrzymano 1 (119 mg, 39%) w postaci białego osadu. ¹H NMR (600 MHz, CDCh) δ: 9,87 (s, 1H), 8,15 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,83 (dd, J = 8,4, 2,0 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,49-7,37 (m, 6H), 7,32 (dd, J = 7,5, 1,5 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,36 (s, 2H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCh) δ: 189,7, 159,5, 143,6, 141,1, 135,7, 134,8, 131,3, 131,3, 130,9, 129,6, 128,2, 127,9, 127,7, 127,2, 121,9, 113,4, 113,1, 71,1, UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,37 min, dla C2oHi₄Br₂02 [M+H]⁺ znaleziono: 447,07 m/z; obliczono: 446,94.

4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzaldehyd (2)

K₂CO₃

DMF

2-bromo-3-(bromometylo)-1,T-bifenyl (300 mg, 0,93 mmol), 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd (141 mg, 0,93 mmol), węglan potasu (255 mg, 1,85 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2x30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) i otrzymano 2 (192 mg, 52%) w postaci białego osadu. ¹H NMR (600 MHz, CDCh) δ: 9,87 (s, 1H), 7,53 (ddd, J = 10,8, 5,8, 5,0 Hz, 1H), 7,49-7,35 (m, 8H), 7,29 (dd, J = 7,5, 1,6 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,37 (s, 2H), 4,00 (s, 3H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCh) δ: 191,1, 153,4, 150,2, 143,6, 141,3, 136,2, 130,8, 130,7, 129,6, 128,2, 127,8, 127,6, 127,3, 126,8, 122,2, 112,6, 109,6, 71,0, 56,3. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 8,50 min, dla C2iHi7BrO3 [M+H]⁺ znaleziono: 397,22 m/z; obliczono: 397,04.

PL 243517 Β1

4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzaldehyd (3)

(3>

2-bromo-3-(bromometylo)-1 ,Τ-bifenyl (200 mg, 0,62 mmol), 4-hydroksy-3-metylobenzaldehyd (84 mg, 0,62 mmol), węglan potasu (170 mg, 1,23 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2x30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) i krystalizowano z cykloheksanu, otrzymując 3 (90 mg, 38%) w postaci białego osadu. ¹H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 9,88 (s, 1H), 7,76 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,73 (dd, J = 8,3, 2,0 Hz, 1H), 7,57-7,53 (m, 1H), 7,47-7,38 (m, 6H), 7,32 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,30 (s, 2H), 2,41 (s, 3H). ¹³CNMR(151 MHz, CDCI3)6: 191,3, 161,7, 143,7, 141,3, 136,6, 131,8, 130,8, 130,1, 129,6, 128,2, 128,1, 127,9, 127,5, 127,3, 122,5, 111,2, 70,4, 16,7. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,31 min, dla C₂iHi₇BrO₂[M+H]⁺ znaleziono: 381,20 m/z; obliczono: 381,05.

4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd (4)

2-bromo-3-(bromometylo)-1 ,Τ-bifenyl (200 mg, 0,62 mmol), 4-hydroksybenzaldehyd (75 mg, 0,62 mmol), węglan potasu (170 mg, 1,23 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) i krystalizowano z cykloheksanu, otrzymując 4 (97 mg, 43%) w postaci białego osadu. ¹H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 9,91 (s, 1H), 7,90-7,86 (m, 2H), 7,54-7,51 (m, 1H), 7,47-7,37 (m, 6H), 7,31 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,15-7,12 (m,2H), 5,30 (s, 2H). ¹³CNMR(151 MHz, CDCI₃)6: 190,8, 163,4, 143,7, 141,1, 136,1, 132,1, 130,9, 130,4, 129,4, 128,1, 127,8, 127,5, 127,4, 122,6, 115,2, 70,4. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 8,78 min, dla C₂oHi5Br0₂ [M+H]⁺ znaleziono: 367,18 m/z; obliczono: 367,03.

Kwas (S)-1 -(3-bromo-4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy (5)

COOH

1. AcOH, DMF

2. NaBHjCN

(119 mg, 0,27 mmol), kwas L-pipekolinowy (158 mg, 1,22 mmol) i AcOH (3 krople) mieszano w DMF (4 ml) w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBH₃CN (79 mg, 1,33 mmol) i tak powstały roztwór mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCI3), w wyniku czego jako produkt 5 otrzymano biały osad (77 mg, wydajność: 51%). Ή NMR (600 MHz, DMSO) δ: 7,67 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,52 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,50-7,35 (m, 6H), 7,32 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,26 (s, 2H), 3,84 (d, J = 13,3 Hz, 1H), 3,49-3,39 (m, 1H), 3,05 (s, 1H), 2,90-2,83 (m, 1H), 2,24-2,16 (m, 1H), 1,86-1,76 (m, 1H), 1,74-1,62 (m, 1H), 1,58-1,40 (m, 3H), 1,39-1,29 (m, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 153,4, 142,9, 140,7, 136,5, 133,7, 130,9, 129,8, 129,2, 128,3, 128,2, 127,7, 122,4, 113,6, 110,9, 70,6, 64,4, 57,8, 49,2, 28,7, 24,4, 22,0. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 6,51 min, dla C₂₆H₂₅Br₂NO₃[M+H]⁺ znaleziono: 558,20 m/z; obliczono: 558,02.

PL 243517 Β1

Kwas (S)-1 -(4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzylo)piperydyno-2-karboksylowy (6)

COOH

(100 mg, 0,25 mmola), kwas L-pipekolinowy (149 mg, 1,15 mmol) i AcOH (3 krople) mieszano w DMF (4 ml) w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (74 mg, 1,26 mmol) i otrzymany roztwór mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCL), w wyniku czego jako produkt 6 otrzymano biały osad (93 mg, wydajność: 72%). ¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ: 7,60 (dd, J = 7,6, 1,5 Hz, 1H), 7,52-7,33 (m, 7H), 7,09 (s, 1H), 7,05 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,08 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,15 (s, 1H), 3,04 (s, 1H), 1,96-1,87 (m, 1H), 1,72 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 1,61-1,53 (m, 3H), 1,41-1,33 (m, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 149,4, 147,9, 143,4, 141,3, 137,4, 131,4, 129,7, 129,3, 128,6, 128,2, 123,3, 123,1, 114,5, 113,7, 79,6, 71,0, 58,5, 56,1,49,7, 28,3, 23,6, 22,1. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 6,10 min, dla C₂7H₂8BrNO4 [M+H]⁺ znaleziono: 510,28 m/z; obliczono: 510,13.

Kwas (S)-1 -(4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzylo)piperydyno-2-karboksylowy (7)

COOH

1. AcOH, DMF

2. NaBHjCN

(90 mg, 0,24 mmola), kwas L-pipekolinowy (140 mg, 1,08 mmola) i AcOH (3 krople) mieszano w DMF (4 ml) w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (69 mg, 1,18 mmol) i otrzymany roztwór mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCI3), w wyniku czego otrzymano 7 jako żółty osad (65 mg, wydajność: 56%). Ή NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 7,50 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,44-7,21 (m, 9H), 6,83 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 5,06 (s, 2H), 4,39 (d, J = 55,8 Hz, 2H), 3,42 (d, J = 55,1 Hz, 2H), 2,62 (s, 1H), 2,28 (s, 3H), 1,96 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 1,85-1,69 (m, 2H), 1,37-1,20 (m, 2H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCI3) δ: 157,8, 143,5, 141,3, 137,0, 134,3, 130,9, 130,6, 129,6, 128,1, 127,9, 127,8, 127,3, 127,2, 122,4, 111,6, 70,1, 58,5, 50,9, 29,8, 28,2, 22,8, 22,1, 16,7. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 6,54 min, dla C₂7H₂sBrNO3 [M+H]⁺ znaleziono: 494,26 m/z; obliczono: 494,13.

Kwas (S)-1 -(4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy (8)

(90 mg, 0,25 mmol), kwas L-pipekolinowy (145 mg, 1,22 mmol) i AcOH (3 krople) mieszano w DMF (4 ml) w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (72 mg, 1,23 mmol) i otrzymany roztwór mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem.

PL 243517 Β1

Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 χ 30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCL), w wyniku czego otrzymano 8 jako biały osad (77 mg, wydajność: 65%). ¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ: 7,59 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,54-7,25 (m, 9H), 7,04 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 5,19 (s, 2H), 4,01 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,11 (s, 1H), 2,98 (s, 1H), 2,40 (s, 1H), 1,87 (s, 1H), 1,69 (s, 1H), 1,61-1,43 (m, 3H), 1,35 (s, 1H). ¹³C NMR(151 MHz, DMSO) δ: 158,4, 143,5, 141,3, 137,2, 131,8, 131,4, 129,7, 129,5, 128,6, 128,2, 123,4, 115,0, 79,6, 70,3, 58,3, 49,6, 28,5, 23,9, 22,2. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 6,18 min, dla C26H₂6BrNO₃ [M+H]⁺ znaleziono: 480,24 m/z; obliczono: 480,12.

3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd (9)

K₂CO₃

DMF

(9)

6-(2-bromo-3-(bromometylo)fenylo)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyna (250 mg, 0,65 mmol), 3-bromo-4-hydroksybenzaldehyd (130 mg, 0,65 mmol) i węglanu potasu (180 mg, 1,31 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (4 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) i otrzymano 9 (291 mg, wydajność: 88%) jako białe ciało stałe. Ή NMR (600 MHz, DMSO) δ: 9,88 (s, 1H), 8,15 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,97 (dd, J = 8,5, 2,0 Hz, 1H), 7,64 (dd, J = 7,6, 1,6 Hz, 1H), 7,52-7,44 (m, 2H), 7,35 (dd, J = 7,6, 1,7 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,84 (dd, J = 8,2, 2,1 Hz, 1H), 5,40 (s, 2H), 4,29 (s, J = 4,6 Hz, 4H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 190,7, 159,0, 143,2, 142,9, 142,5, 135,8, 134,1, 133,8, 131,3, 131,2, 131,0, 128,5, 127,8, 122,9, 122,3, 118,0, 116,8, 114,1, 111,9,71,2,64,2. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 8,89 min, dla C₂₂Hi6Br₂O4 [M+H]⁺ znaleziono: 503,04 m/z; obliczono: 502,95.

(S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-kwas karboksylowy (10)

cooh

1. AcOH, DMF

2. NaBH₃CN

(310 mg, 0,61 mmol) i kwas L-pipekolinowy (364 mg, 2,82 mmol) mieszano w DMF (4 ml) z dodatkiem katalitycznych ilości AcOH (3 krople) w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (181 mg, 3,07 mmol) i otrzymaną zawiesinę mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCI3), w wyniku czego wyizolowano 10 jako białe ciało stałe (164 mg, wydajność: 43%). ¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ: 7,66-7,59 (m, 2H), 7,48 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,35-7,29 (m, 2H), 7,18 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,83 (dd, J = 8,3, 2,1 Hz, 1H), 5,24 (s, 2H), 4,28 (s, 4H), 3,85 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 3,06 (dd, J = 8,2, 3,8 Hz, 1H), 2,93-2,81 (m, 1H), 2,30-2,17 (m, J = 16,9, 8,1 Hz, 1H), 1,86-1,77 (m, 1H), 1,74-1,61 (m, J = 12,6, 6,6 Hz, 1H), 1,57-1,41 (m, 3H), 1,38-1,28 (m,

1H), 1,23 (s, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 153,6, 143,1, 142,8, 142,4, 136,5, 133,8, 133,7,

131,0, 129,9, 128,2, 127,7, 122,7, 122,3, 118,0, 116,8, 113,7, 111,0,70,7,64,2,57,9,49,2,28,6,28,5, 24,1, 22,0. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 6,25 min, dla C28H27Br₂NO₅ [M+H]⁺ znaleziono: 616,23 m/z; obliczono: 616,03.

PL 243517 Β1

3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd (11)

(Π)

2-(2-bromo-3-(bromometylo)fenylo)naftalen (200 mg, 0,53 mmol), 3-bromo-4-hydroksybenzaldehyd (107 mg, 0,53 mmol), węglan potasu (146 mg, 1,06 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 χ 30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-100% AcOEt w heksanie) otrzymując 11 (107 mg, 41%) w postaci białego osadu. ¹H NMR (600 MHz, CDCL) δ: 9,88 (s, 1H), 8,16 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,93-7,87 (m, 3H), 7,86-7,84 (m, 1H), 7,83 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,73 (dd, J = 7,7, 0,9 Hz, 1H), 7,56-7,52 (m, 3H), 7,48 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,41 (dd, J = 7,5, 1,5 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,39 (s, 2H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCI3) δ: 189,5, 159,4, 143,5, 138,5, 135,7, 134,7, 133,1, 132,7, 131,2, 131,2, 131,0, 128,3, 128,2, 127,8, 127,6, 127,6, 127,5, 127,2, 126,4, 122,0, 113,3, 113,0, 71,0. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 10,02 min, dla C₂₄Hi₆Br₂O₂ [M+H]⁺ znaleziono: 494,93 m/z; obliczono: 494,95.

Kwas (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy (12)

(90 mg, 0,18 mmol) i kwas L-pipekolinowy (107 mg, 0,83 mmol) mieszano w DMF (3 ml) z dodatkiem katalitycznych ilości AcOH (3 krople) w 25 ⁰ C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (53 mg, 0,89 mmol) i otrzymaną zawiesinę mieszano dodatkowo przez 20 godzin. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w CHCE), w wyniku czego wyizolowano 12 jako białe ciało stałe (35 mg, wydajność: 32%). ¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ: 8,02-7,96 (m, 3H), 7,93 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,72 (dd, J = 7,7, 1,6 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,61-7,52 (m, 4H), 7,48 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,33 (dd, J = 8,4, 1,9 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,30 (s, 2H), 3,85 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 3,47 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 3,08 (dd, J = 8,2, 3,9 Hz, 1H), 2,90-2,83 (m, 1H), 2,23 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 1,86-1,78 (m, 1H), 1,73-1,64 (m, 1H), 1,56-1,43 (m, 3H), 1,38-1,31 (m, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 153,9, 143,4, 138,8, 137,0, 134,1, 133,2, 132,7, 131,6, 130,3, 129,0, 128,56, 128,5, 128,3, 128,0, 127,9, 127,9, 126,9, 126,9, 123,1, 114,1, 111,4, 71,0, 64,5, 58,2, 49,6, 29,1,24,7, 22,5. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 7,37 min, dla C3oH27Br₂N03 [M+H]⁺ znaleziono: 608,19 m/z; obliczono: 608,04.

3-bromo-4-((2-bromo[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzoesan metylu (13)

(13)

PL 243517 Β1

2-bromo-3-(bromometylo)-1 ,T-bifenyl (200 mg, 0,61 mmol), 3-bromo-4-hydroksybenzoesan metylu (142 mg, 0,61 mmol), węglan potasu (168 mg, 1,22 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 χ 30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt otrzymano strącając z octanu etylu otrzymując 13 (115 mg, wydajność: 39%) w postaci białego osadu. Ή NMR (600 MHz, CDCb) δ: 8,30 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,99 (dd, J = 8,6, 2,1 Hz, 1H), 7,72-7,67 (m, 1H), 7,48-7,37 (m, 6H), 7,30 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,32 (s, 2H), 3,90 (s, 3H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCb) δ: 165,7, 158,3, 143,4, 141,1, 135,9, 135,0, 130,8, 129,5, 128,0, 127,7, 127,5, 127,1, 124,3, 121,8, 112,5, 112,1, 70,8, 52,2. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,99 min, dla C2iHieBr2O3 [M+H]⁺ znaleziono: 475,12 m/z; obliczono: 474,95.

Chlorowodorek 4-(3-(3-bromo-4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzamido)propylo)morfolin-4-ium (14)

(100 mg, 0,21 mmol), 3-morfolinopropano-1 -aminę (1,50 ml, 10,26 mmol), oraz DBU (1,0 ml, 6,7 mmol) umieszczono w kolbie i mieszano 2 dni w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono wodą, a następnie ekstrahowano octanem etylu (3 χ 20 ml). Warstwy organiczne zebrano razem i osuszono bezwodnym siarczanem(VI) magnezu. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii typu FLASH w układzie chloroform/metanol. Następnie otrzymaną aminę przekształcono w chlorowodorek i rekrystalizowano z octanu etylu otrzymując 14 jako białe ciało stałe (60 mg, wydajność: 48%). ¹H NMR (600 MHz, CDCb) δ: 8,14 (s, 1H), 8,06 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,82 (dd, J = 8,6, 2,2 Hz, 1H), 7,73-7,68 (m, 1H), 7,48-7,37 (m, 6H), 7,30 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,31 (s, 2H), 3,78 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,57 (dd, J = 10,9, 5,8 Hz, 2H), 2,61-2,55 (m, 2H), 2,53 (s, 4H), 1,83-1,73 (m, 2H), ¹³C NMR (151 MHz, CDCb) δ: 165,6, 157,1, 143,5, 141,2, 136,2, 132,1, 130,7, 129,6, 129,0, 128,2, 128,2, 127,8, 127,6, 127,2, 121,9, 113,0, 112,3, 70,3, 67,1,59,2, 54,1,41,1,23,9. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R= 6,75 min, dla C27H2sBr2N2O3 [M+H]⁺ znaleziono: 587,12 m/z; obliczono: 587,05.

4-([1,1 ”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzaldehyd (15)

[1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometanol (300 mg, 1,15 mmol) rozpuszczono w bezwodnym DCM (4,5 ml) pod argonem. Ostrożnie dodano SOCI2 (1,4 ml) i otrzymany roztwór mieszano w 45°C. Po 3 godzinach reakcję zatrzymano i roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Utworzony chlorek, 3-bromo-4-hydroksybenzaldehyd (231 mg, 1,15 mmol) i K2CO3 (319 mg, 2,31 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (3,3 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, osuszono nad bezwodnym siarczanem(VI) magnezu i zatężono. Produkt poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-60% AcOEt w heksanie) otrzymując 15 jako białawy osad (308 mg, wydajność: 60%). Ή NMR (600 MHz, CDCb) δ: 9,8 (s, 1H), 8,1 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,7 (m, 1H), 7,7 (dd, J = 8,5, 2,0 Hz, 1H), 7,5 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,4 (dd, J = 7,7, 1,2 Hz, 1H), 7,2-7,0 (m, 10H),6,7(d, J = 8,5Hz, 1H), 5,0 (s, 2H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCb) δ: 189,7, 159,8, 142,0, 141,3, 139,8, 138,4, 134,7, 133,9, 131,1, 130,9, 130,4, 130,3, 129,9, 128,1, 128,0, 127,7, 127,3, 127,2, 126,5, 113,2, 112,9, 69,7. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,51 min, dla C26Hi₉BrO₂ [M+H]⁺ znaleziono: 445,34 m/z; obliczono: 445,06.

PL 243517 Β1

Kwas (2S, 4S)-1 -(4-([1, 1 ’: 2’ ,1 ”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzylo)-4-hydroksy-pirolidyno-2-karboksylowy (16)

Roztwór 15 (200 mg, 0,45 mmol), kwasu (2R, 4R)-4-hydroksypirolidyno-2-karboksylowego (272 mg, 2,07 mmol) w DMF (6,0 ml) mieszano z dodatkiem katalitycznych ilości AcOH (3 krople) w temperaturze 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano NaBHsCN (142 mg, 2,26 mmol) i mieszano przez noc. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2 x30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono. Produkt oczyszczono metodą chromatografii typu FLASH (żel krzemionkowy, 0-50% MeOH w AcOEt), otrzymując 16 jako białe ciało stałe (93 mg, wydajność: 37%). ¹H NMR (600 MHz, CDCI₃) δ: 7,7 (d, J = 7,2 HzJH), 7,6-7,5 (m, 2H), 7,4 (dd, J = 7,7, 1,1 Hz, 1H), 7,2-7,1 (m, 9H), 7,1-7,0 (m, 2H), 6,7 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,8 (s, 2H), 4,1 (s, 1H), 3,9 (d, J = 13,1 Hz, 1H), 3,5 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 3,1 (s, J = 19,4 Hz, 1H), 2,8 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 2,4 (s, 1H), 2,2 (s, 1H), 1,7 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 1,2 (s, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCI3) δ: 153,4, 141,3, 141,0, 139,8, 138,0, 134,6, 133,6, 130,1, 129,9, 129,7, 129,5, 129,0, 127,8, 127,7, 127,7, 127,7, 126,9, 126,4, 113,2, 110,7, 68,8, 68,6, 65,4, 60,7, 55,8, 48,6. UPLC-MS (DAD/ESI): Ir = 6,55 min, dla C3iH2sBrNO4 [M+H]⁺ znaleziono: 558,27 m/z; obliczono: 558,13.

4-((1,1 ’:2’,1 ”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-5-chloro-2-hydroksybenzaldehyd (17)

(17)

5-chloro-2,4-dihydroksybenzaldehyd (657 mg, 3,81 mmol), PPh₃ (11,07 g, 42,21 mmol) i [1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometanol (1000 mg, 3,84 mmol) rozpuszczono w bezwodnym THF (30 ml). Roztwór ochłodzono do 0°C i wkroplono Dl AD (0,83 ml, 4,23 mmol) w bezwodnym THF (30 ml). Roztwór pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 20 godzin, a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (0-60% AcOEt w heksanie) izolując 17 jako biały osad (313 mg, wydajność: 20%). ¹H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 11,36 (s, 1H), 9,66 (s,‘ 1H), 7,67 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,54-7,48 (m, 2H), 7,45 (dd, J = 7,7, 1,2 Hz, 1H), 7,24-7,06 (m, 10H),6,26 (s, 1H), 4,93 (s, 2H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCI₃)6: 193,7, 162,8, 160,8, 142,0, 141,1, 139,9, 138,2, 133,9, 133,4, 130,3, 130,2, 129,8, 128,0, 127,9, 127,6, 127,2, 127,1, 126,4, 114,9, 114,7, 101,5, 69,7. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,51 min, dla C26H19CIO3 [M+H]⁺znaleziono: 415,30 m/z; obliczono: 415,11.

4-((5-((1,1’:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-4-chloro-2-formylofenoksy)metylo)pikolinonitryl (18)

(18)

PL 243517 Β1 (278 mg, 0,67 mmola), 4-(bromometylo)pikolinonitryl (159 mg, 0,81 mmol) i K2CO3 (185 mg, 1,34 mmol) mieszano w bezwodnym DMF (4 ml) w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano AcOEt (2x30 ml). Warstwy organiczne połączono i zatężono. Produkt 18 otrzymano przez krystalizację z AcOEt jako białe ciało stałe (175 mg, wydajność: 90%). ¹H NMR (600 MHz, CDCb) δ: 10,27 (s, 1H), 8,73 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,66 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 7,63 (dd, J = 7,5, 1,3 Hz, 1H), 7,52-7,44 (m, 3H), 7,23-7,19 (m, 3H), 7,18-7,12 (m, 3H), 7,10-7,02 (m, 4H), 6,14 (s, 1H), 5,04 (s, 2H), 4,95 (s, 2H). ¹³CNMR(151 MHz, CDCb) δ: 186,3, 159,7, 159,6, 151,5, 146,4, 142,1, 140,9, 139,8, 138,3, 134,5, 133,2, 130,9, 130,6, 130,3, 129,8, 128,1, 128,0, 127,7, 127,4, 127,2, 126,6, 125,8, 124,2, 119,2, 117,3, 116,9, 98,3, 69,8, 68,1. UPLC-MS (DAD/ESI): t_R = 9,32 min, dla C33H23CIN2O3 [M+H]⁺ znaleziono: 531,35 m/z; obliczono: 531,15.

Aktywność biologiczna

Pomiary widm NMR

Widma NMR dla opisanych związków otrzymano na spektrometrze Bruker Avance 600 MHz w temperaturze 300 K. Po dodaniu do białka w końcowym stężeniu 0,2 mM wszystkie przetestowane związki dodane w stężeniu molowym 1:1 dimeryzowały ludzkie PD-L1 powodując zanik pików w alifatycznej części jednowymiarowego spectrum w porównaniu do spectrum samego białka. Przykład spektrów ludzkiego PD-L1 referencyjnego i zdimeryzowanego po dodaniu związków widoczny jest w Fig. 1, na której przedstawiono porównanie 1D spektrów NMR dla referencyjnego ludzkiego białka PD-L1 (niebieski), po dodaniu 1:5 związku: 1 (czerwony), 3 (zielony), 5 (purpurowy), 8 (pomarańczowy).

Wyznaczanie powinowactwa związków metodą HTRF

Aktywność biologiczna związków wyrażona w formie IC50 - (połowa maksymalnego stężenia hamującego) została wyznaczona metodą fluorescencji czasowo-rozdzielczej (eng. Homogenous Time Resolved Fluorescence - HTRF). Wyznaczenie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem kitu od firmy Cisbio w formacie 20 pL wykorzystując protokół od producenta. Związki w zakresie stężeń pozwalających na wyznaczenie aktywności biologicznej z krzywej przegięcia zostały dodane do kompleksu białek hPD-1 (50 nM) i hPD-L1 (5 nM) wraz z przeciwciałami oraz pozostawione na 2-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej przed pomiarem transferu Forster rezonansowej energii (TR-FRET) na aparacie Tecan Spark 20 M. Wyniki zostały znormalizowane na kontrole pozytywną (kompleks bez inhibitora) oraz negatywną (brak hPD-1), uśrednione z trzech niezależnych pomiarów i dopasowane krzywą Hilla. Wyniki przedstawione w Tabeli 1 w przedziałach IC50 > 50 pM (+), między 50 pM a 1 pM (++), pomiędzy 1 pM a 250 nM (+++) oraz poniżej 250 nM (++++).

związek	Aktywność biologiczna	Nazwa	Aktywność biologiczna
1	+	8	+++
2	+	9	++
3	+	10	+
4	+	13
5	++++	16	+
6	++++	15	++
7	++++	18

Wyniki i dyskusja

Modulacja odpowiedzi immunologicznej poprzez inhibicję receptorów punktów kontrolnych przeciwciałami jest skuteczną metodą walki z nowotworami znaną jako immunoonkologia. Zastosowanie małocząsteczkowych inhibitorów zamiast znanych białkowych stanowi korzystną zmianę w terapiach nowotworowych ze względu na częste i liczne niepożądane działania immunologiczne spowodowane stosowaniem przeciwciał.

W świetle wyników opisanych powyżej badań związki według wynalazku stanowią nową atrakcyjną grupę aktywnych inhibitorów wiążących się bezpośrednio do PD-L1, co zostało potwierdzone zaprezentowanymi badaniami NMR, w których związek dimeryzuje białko oraz wynikami wykonanych testów HTRF. Zaobserwowana zależność struktury od aktywności pozwala na dodatkową optymalizację wyłonionych struktur.

SKRÓTY

AcOEt, octan etylu;

AcOH, kwas octowy;

CHCI3, chloroform;

DAD, aparat z matrycą diodową;

DIAD, azodikarboksylan diizopropylu;

DCM, dichlorometan;

DMF, dimetyloformamid;

DMSO, dimetylosulfotlenek;

ESI, jonizacja typu elektrospray;

HTRF, fluorescencji czasowo-rozdzielczej (ang. Homogenous Time Resolved Fluorescence)

MeOH, metanol;

MeCN, acetonitryl;

MgSO4, siarczan(VI) magnezu;

NaBH3CN, cyjanoborowodorek sodu;

NMR, Spektroskopia Magnetycznego Rezonansu Jądrowego;

PD-1, ang. Programmed Death 1;

PD-L1, z ang. Programmed Death Ligand;

PPh3, trifenylofosfina;

THF, tetrahydrofuran;

TLC, chromatografia cienkowarstwowa;

TR-FRET, transfer Forster rezonansowej energii

TMS, tetrametylosilan;

UPLC, ang. ultra performance liquid chromatography

Literatura

1. Hellmann, M. D. et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 381,2020-2031 (2019).

2. Hellmann, M. D. et al. Nivolumab plus Ipilimumab in lung cancer with a high tumor mutational burden. N. Engl. J. Med. (2018) doi:10.1056/NEJMoa1801946.

3. Wolchok, J. D. et al. Nivolumab plus Ipilimumab in advanced melanoma. N. Engl. J. Med. (2013) doi: 10.1056/NEJMoa1302369.

4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer

12, 252-264 (2012).

5. Tumeh, P. C. et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.

Nature 515, 568-71 (2014).

6. Musielak, B. et al. CA-170 - A Potent Small-Molecule PD-L1 Inhibitor or Not? Molecules 24, 2804 (2019).

7. Adams, J. L., Smothers, J., Srinivasan, R. & Hoos, A. Big opportunities for small molecules in immuno-oncology. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 603-622 (2015).

8. Guzik, K. et al. Development of the Inhibitors That Target the PD-1/PD-L1 Interaction - A Brief Look at Progress on Small Molecules, Peptides and Macrocycles. Molecules 24, 2071 (2019).

Claims

1. Związek o wzorze ogólnym (I):

U) gdzie:

X oznacza -Br lub fenyl,

Y oznacza fenyl, 2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksynę lub naftalen,

Ri oznacza -Br, -OMe, -Me, -Cl lub -H,

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że został wybrany z grupy obejmującej: 3-bromo-4-((2-bromo-[1 ,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzaldehyd, 4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzaldehyd, kwas (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1-(4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metoksybenzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1 -(4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)-3-metylobenzylo)piperydyno-2-karboksylowy, kwas (S)-1-(4-((2-bromo-[1,T-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy, 3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd, (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioksyn-6-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-kwas karboksylowy, 3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzaldehyd, kwas (S)-1-(3-bromo-4-((2-bromo-3-(naftalen-2-ylo)benzylo)oksy)benzylo)piperydyno-2-karboksylowy,

3-bromo-4-((2-bromo[1,1’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzoesan metylu, chlorowodorek 4-(3-(3-bromo-4-((2-bromo-[1,1 ’-bifenylo]-3-ilo)metoksy)benzamido)propylo)morfolin-4-ium,

4-([1, Τ :2’, 1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzaldehyd, kwas (2S, 4S)-1-(4-([1,1’:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-3-bromobenzylo)-4-hydroksy-pirolidyno-2-karboksylowy, 4-([1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-5-chloro-2-hydroksybenzaldehyd oraz

4-((5-([1,T:2’,1”-terfenylo]-3’-ylometoksy)-4-chloro-2-formylofenoksy)metylo)pikolinonitryl.

3. Związek określony w zastrz. 1 lub 2 do stosowania jako inhibitor szlaku białek PD-1/PD-L1, zwłaszcza w komórkach ssaka, korzystnie komórkach nowotworowych.

4. Związek określony w zastrz. 1 lub 2 do stosowania w farmacji, zwłaszcza w leczeniu lub profilaktyce chorób nowotworowych.

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca efektywną terapeutycznie dawkę związku określonego w zastrz. 1 lub 2.