PL217128B1

PL217128B1 - Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne

Info

Publication number: PL217128B1
Application number: PL392037A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Szczepankowska; Jacek Bardowski; Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk; Kaja Kasarełło; Andrzej W. Lipkowski; Barbara Kwiatkowska-Patzer
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk; Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2014-06-30
Also published as: EP2436693B1; EP2436693A3; ES2561667T3; PL392037A1; EP2436693A2

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania niskocząsteczkowych peptydów, pochodnych białek mieliny rdzenia kręgowego, w bakteriach, zwłaszcza mlekowych, w celu otrzymania preparatów pojedynczych i skojarzonych peptydów mielinowych do stosowania w medycynie, zwłaszcza przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania syntetycznych genów kodujących niskocząsteczkowe peptydy mielinowe, pochodnych fragmentów białek rdzenia kręgowego ssaków, oraz sposób ich mikrobiologicznego wytwarzania w bakteriach mlekowych, preparaty pojedyncze i skojarzone tych peptydów oraz ich zastosowanie w medycynie do indukcji specyficznej tolerancji pokarmowej.

WPROWADZENIE

Stwardnienie rozsiane jest chorobą destrukcyjną centralnego układu nerwowego, która dotyka głównie ludzi młodych, między 20 a 40 rokiem życia. Dane dotyczące zachorowalności wskazują, że w Polsce choruje na nią ok. 60 000 osób. Jest to choroba o podłożu autoimmunologicznym, na którą, jak dotąd, nie ma skutecznego leku. Leki immunomodulujące, jak interferon i copaxon, jedynie zmieniają przebieg choroby, zmniejszając ilość rzutów, ale po 6 latach leczenia niepełnosprawność osób ze stwardnieniem rozsianym jest taka sama jak bez leczenia. Ponadto kuracja tego schorzenia jest dość kosztowna, a refundacja kosztów leczenia - sporadyczna. Stąd też potrzeba intensywnych badań nad nowymi skutecznymi i ekonomicznie opłacalnymi metodami leczenia tego przewlekłego schorzenia immunologicznego.

Choroby autoimmunologiczne polegają na patologicznym rozpoznawaniu przez układ odpornościowy białek własnych organizmu jako obcych antygenów, co w konsekwencji prowadzi do uruchamiania mechanizmów eliminacji tych antygenów. Fragmenty białek mieliny ośrodkowego układu nerwowego stanowią antygeny patologicznie rozpoznawane przez przeciwciała w stwardnieniu rozsianym.

Znany jest mechanizm tolerancji pokarmowej, w którym następuje specyficzne odczulanie układu odpornościowego na składniki pokarmowe. Zaproponowano wykorzystanie tego mechanizmu do wywoływania tolerancji na epitopy białek w chorobach autoimmunologicznych takich jak reumatyzm i stwardnienie rozsiane. W badaniach własnych Autorów wykazano, że hydrolizaty rdzenia kręgowego zwierząt hodowlanych, zawierające niskocząsteczkowe fragmenty peptydowe mieliny, wykazują działanie modulujące przebieg eksperymentalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), w modelu zwierzęcym stwardnienia rozsianego (SM) (1).

Podjęcie badań mających na celu opracowanie sposobu wytwarzania peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych wiązało się z kilkoma przesłankami: (i) ważna pozycja stwardnienia rozsianego pośród chorób występujących w Polsce; (ii) niska skuteczność i wysokie koszty leczenia tej choroby; (iii) wykazanie skuteczności peptydów w terapii tej jednostki chorobowej; (iv) udokumentowana rola jelita (przewodu pokarmowego) w systemie odporności organizmu; (v) dotychczasowe pozytywne wyniki stosowania bakterii mlekowych, jako producentów czynników immunomodulacyjnych (cytokin i antygenów), w tym także, jako szczepionek doustnych; (vi) dane wskazujące, że bakterie potęgują efekt tolerancji pokarmowej (2).

AKTUALNY STAN WIEDZY

Rozpoznanym celem ataku na układ odpornościowy w stwardnieniu rozsianym oraz w zwierzęcym modelu zapalenia mózgu i rdzenia EAE są białka składowe mieliny. Głównymi białkowymi składnikami mieliny są trzy białka:

(i) zasadowe białko mieliny, MBP (od ang. Myelin basie protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 13 (3) (ii) białko prolipidowe PLP (od ang. proteolipid protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 14 (4) (iii) Glikoproteina oligodendrocytów mieliny, MOG (od ang. myelin-oligodendrocyte glycoprotein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 15 (5).

Badania ostatniej dekady dostarczają dowodów, że fragmenty peptydowe, będące produktami częściowej hydrolizy białek pokarmowych, również mają zdolność przenikania przez barierę jelitową. Niektóre krótkie peptydy przenikają przez tę barierę łatwiej niż pojedyncze aminokwasy. Aby odróżnić pokarmowe peptydy przenikające do krwi z jelita, od białek inwazyjnych bakterii i wirusów, organizmy wytworzyły specyficzny system prezentacji antygenów pokarmowych. Rezultatem takiej prezentacji jest obniżenie specyficznej immunogenności na konkretne sekwencje peptydowe (jak również inne, niepeptydowe składniki pokarmowe). Zjawisko to nazwano „tolerancją pokarmową (ang. „oral tolerance).

Niniejszy wynalazek opiera się na wstępnych badaniach własnych. Zastosowanie preparatu otrzymanego w wyniku hydrolizy rdzenia kręgowego w arbitralnie dobranej dawce, u szczurów z EAE powodowało zmniejszenie objawów zapalnych zarówno przy podawaniu wyprzedzającym jak i po wywołaniu EAE (6).

PL 217 128 B1

Wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej, jako fabryk biologicznych produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych jest bardzo atrakcyjne naukowo i aplikacyjnie i prezentuje wiele korzystnych cech medyczno-farmakologicznych.

Bakterie fermentacji mlekowej, zwane inaczej bakteriami kwasu mlekowego lub bakteriami mlekowymi (ang. Lactic Acid Bacteria, LAB), stanowią dużą i bardzo zróżnicowaną taksonomicznie grupę bakterii gramdodatnich. Niewątpliwą zaletą tych bakterii jest nadany im status GRAS (ang. Generalny Regarded As Safe), tj. bakterii niechorobotwórczych i bezpiecznych dla człowieka i zwierząt. Bakterie mlekowe stanowią bardzo ważny przedmiot zastosowań biotechnologicznych i obiekt badań podstawowych i aplikacyjnych. Biotechnologia z udziałem bakterii mlekowych jest stosowana w różnych gałęziach przemysłu (7) - spożywczym (np. produkcja fermentowanych artykułów mleczarskich, żywności oraz pasz i dodatków do pasz), chemicznym (np. produkcja polimerów i enzymów) i farmaceutycznym (np. preparaty pro biotyczne typu Lakcid czy Lactovaginal). W ostatnich latach duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem tych bakterii do produkcji tzw. żywności funkcjonalnej, preparatów probiotycznych oraz leków o charakterze szczepionek doustnych (7, 8, 9). Wśród tych ostatnich duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania bakterii mlekowych jako wektorów szczepionkowych (10-12). Również podczas ostatnich kilku latach obserwuje się na świecie nasilenie badań nad wykorzystaniem bakterii mlekowych do produkcji różnych białek o znaczeniu terapeutycznym lub profilaktycznym. Bakterie fermentacji mlekowej próbuje się wykorzystać w profilaktyce i zwalczaniu zespołu chorobowego, zwanego IBD (ang. Inflammatory Bowel Disease - przewlekłym, nieswoistym zapaleniu jelita), który obejmuje także chorobę Leśniowskiego-Crohna (w skrócie zwaną chorobą Crohna) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (ang. ulcerative colitis).

Przedmiotem wynalazku jest opracowanie układu biologicznego, opartego o bakterie fermentacji mlekowej, wytwarzającego fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, do stworzenia preparatu przeznaczonego do wywoływania tolerancji pokarmowej.

Wyboru fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych do zastosowania w wynalazku dokonano na podstawie badań własnych, które wskazały, iż u chorych na stwardnienie rozsiane identyfikowany jest antygen HLA-DR2 rozpoznający fragment 84-103 białka MBP (13). Przeciwciała do innych fragmentów trzech zasadniczych białek są również identyfikowane (14, 15) a w miarę postępu choroby następuje zwiększanie się liczby rozpoznawanych antygenów pochodzących z trzech podstawowych białek mieliny. Powyższe obserwacje wiążą się prawdopodobnie z dostępnością zarówno tych białek jak i ich fragmentów u chorych. Immunogenność wybranych peptydowych fragmentów naturalnych białek mielinowych potwierdzona została również na zwierzęcych modelach EAE (16, 17, 18).

Nieoczekiwanie, okazało się, że w wyniku realizacji wynalazku, możliwe jest:

a) wytwarzanie syntetycznych genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych metodą PCR;

b) klonowanie, w komórkach wybranych szczepów gramdodatnich bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus otrzymanych genów rekombinowanych z odpowiednimi wektorami do klonowania;

c) ekspresja w wybranych rodzajach bakterii mlekowych (Lactococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus) genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych;

d) klonowanie genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych w komórkach bakterii gramujemnej (Escherichia coli);

e) optymalizacja biosyntezy peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych.

Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, według wynalazku, charakteryzują się tym, że zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP139-151, przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP178-191, przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a.

Sposób wytwarzania genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku polega na zsyntetyzowaniu metodą PCR syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego pep4

PL 217 128 B1 tydu 2 komplementarnych starterów („LONG) przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis. Dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów „FLONG (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP139-151 oraz PLP178-191 wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów „FLONG_peptyd zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencje 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji. Startery „LONG stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów („SHORT) homologicznych do 5' końców starterów „FLONG_peptyd i „RLONG_peptyd, przy czym końce 5' starterów „SHORT niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów „revSHORT_peptyd (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA) (Tabela 2).

Przedmiotem wynalazku są także, otrzymane w wyniku przeprowadzenia powyższej reakcji PCR, z zastosowaniem zaprojektowanych starterów „LONG i „SHORT, fragmenty DNA, o sekwencjach nukleotydowych, według wynalazku, w obrębie których zawarte są sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych (sekwencje podkreślone), według wynalazku, przedstawione wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem 10.

Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według wynalazku, polega na tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SaII, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus zwłaszcza z wektorem pIL253, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

W sposobie klonowania według wynalazku, korzystnie jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium.

Sposób wytwarzania wybranych peptydów w układzie bakteryjnym, korzystnie, według wynalazku, polega na ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce Μ17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDN (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C.

Sposób klonowania syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych w bakteriach gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, według wynalazku, polega na tym, że łączy się syntetyczny gen amplifikowany odpowiednimi starterami 'SHORT' (Tabela 2) z wektorem, preferencyjnie z komercyjnie dostępnym plazmidem pGEMT-Easy lub innym wektorem, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych. Zrekombinowane DNA wprowadzane jest znaną metodą, np. elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

PL 217 128 B1

W sposobie klonowania według wynalazku korzystnie jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, korzystnie szczep TG1.

Sposób optymalizacji ekspresji syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, korzystnie polega na zastąpieniu wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcB, zaangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, który jest regulowany poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza.

Sposób zoptymalizowanej produkcji peptydów w układzie bakteryjnym, według wynalazku, korzystnie polega na hodowli komórek niosących rekombinowany wektor plazmidowy (ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcB z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus) na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu > 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11, do stosowania w optymalizacji produkcji syntetycznych genów, kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku.

Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym replikującym się w komórkach L. lactis, przez region promotorowy genu ptcB z L. lactis, według wynalazku, polega na tym, że region promotorowy genu ptcB wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcBfor i ptcBrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu ptcB oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcBfor) oraz NciI (dla startera ptcBrev) (Tabela 3). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, według wynalazku, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcB (podkreślona).

Tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodującymi wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z których usunięto oryginalny region promotorowy (np. poprzez działanie tych samych restryktaz). Zrekombinowane DNA wprowadzane jest metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długością wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcB. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcB, według wynalazku, potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie bakterii produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej.

Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według wynalazku, do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej.

Oczekuje się, że bakterie produkujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, będą wywoływać efekt tolerancji pokarmowej podobny jak ten opisany w literaturze dotyczącej doustnego podania mieszaniny peptydów w postaci hydrolizatu rdzenia kręgowego pochodzenia zwierzęcego, opublikowany w wyniku badań własnych (1, 6).

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne, warunki hodowlane i stosowane plazmidy

Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w niniejszych badaniach przedstawiono w Tabeli 4. Szczepy Lactococcus lactis hodowano na podłożach M17 (Oxoid, Anglia) z dodatkiem 0.5% glukozy

PL 217 128 B1 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem glukozy lub cellobiozy (0.5%-1%), w temperaturze 20°C-30°C. Szczepy Escherichia coli hodowano na podłożu

Luria-Bertani (LB), w temperaturze 37°C. Gdy zachodziła potrzeba, w celach selekcyjnych, stosowano -1 -1 następujące antybiotyki: erytromycynę 5 μg ml^- dla L. lactis oraz ampicylinę 100 μg ml^- dla E. coli.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Syntetyczne geny zsyntetyzowano metodą PCR używając jako matrycy dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów (for/rev„LONG) oraz 2 krótkich starterów (for/rev„SHORT) homologicznych odpowiednio do skrajnych sekwencji starterów „LONG (Tabela 1). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkty o oczekiwanej długości, które następnie trawiono enzymem SaII oraz PstI i łączono z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus - pIL253, trawionym uprzednio również tymi samymi enzymami. Kolejno obydwa DNA zrekombionowano ze sobą i wprowadzano metodą elektroporacji do komórek wybranych szczepów Lactococcus lactis, które hodowano na -1 podłożu stałym M17 agar z dodatkiem 0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 ng ml^-, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

Otrzymane prawidłowe rekombinowane plazmidy wyizolowano znaną metodą z komórek bakterii Lactococcus i wprowadzano poprzez elektroporację do komórek innych rodzajów bakterii mlekowych, tj. Bifidobacterium i Lactobacillus.

Komórki szczepów L. lactis transformowano znaną techniką elektroporacji (19). Komórki Bifidobacterium i Lactobacillus transformowano znaną techniką elektroporacji według wcześniej ustalonych procedur (20, 21).

Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22).

T a b e l a 1

Sekwencje starterów („LONG”) użytych jako matryca do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów

Nazwa neuropeptydu	Nazwa startera	Sekwencje starterów (forward/reverse)
MBP21-40	FLONG MPB21	5' GAGTATTTCTATGGATCA- TGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAGATTCA 3'
RLONG MPB21	5' TGAATCTAAAATACCAGT- ATCACGATGACGTGGTAAAAAACCATGACGAGCATGATCCATAGAAATACTC 3'
MOG35-55	FLONG MOG35	5' GTATTTCTATGGAAGTTG- GATGGTATCGTTCACCATTTTCACGTGTTGTTCATTTATATCGTAATGG 3'
RLONG MOG35	5' CCATTACGATATAAATGA- ACAACACGTGAAAATGGTGAACGATACCATCCAACTTCCTAGAAATAC 3'
MBP85-97	FLONG MPB85	5' GTATTTCTATGCCAGGATCACGTCCACATTTAATTCGTTTATTTTCACGT 3'
RLONG MPB85	5' ACGTGAAAATAAACGAATTAAATGTGGACGTGATCCTGGCATAGAAATAC 3'
PLP139-151	FLONG PLP139	5' GTATTTCTATGCATTCATTAGGAAATGGTTAGGACATCCAGATAAATTT 3'
RLONG PLP139	5' AAATTTATCTGGATGTCCTAACCATTTTCCTAATGAATGCATAGAAATAC 3'

PL 217 128 B1 cd. tabeli 1

PLP178-191	FLONG PLP178	5' GTATTTCTATGAATACATGGACAACATGTCAATCAATTGCTTTTCCATC 3'
RLONG PLP178	5' GATGGAAAAGCAATTGATTGACATGTTGTCCATGTATTCATAGAAATAC 3'

P r z y k ł a d II

Produkcja wybranych peptydów w komórkach bakterii mlekowych polegała na ekspresji syntetycznych genów w komórkach bakteryjnych poprzez ich hodowlę na podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5%, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C, do osiągnięcia gęstości optycznej OD₆₀₀ >0.6.

P r z y k ł a d III

Badanie ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie transkrypcji przeprowadzano wykorzystując metodę RT-PCR. Z bakteryjnych szczepów niosących rekombinowane plazmidy izolowano całkowite RNA, które po odpowiedniej obróbce poddawano reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów reverse (revSHORT_peptyd) komplementarnych do końca 3' nici kodującej syntetyczny gen (Tabela 2). Otrzymane cDNA podawano następnie reakcji amplifikacji techniką klasycznego PCR, wykorzystując dwie pary starterów (forSHORTUniv i revSHORT_peptyd) (Tabela 2). W wyniku eksperymentu otrzymywano fragmenty DNA, o długości odpowiadającej długości każdego z genów.

T a b e l a 2

Sekwencje starterów „SHORT” użytych do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów

Nazwa neuropeptydu	Nazwa startera	Sekwencje starterów
Starter uniwersalny forward	ForSHORTUniv	5' ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATG 3'
MBP21-40	rev SHORT MBP21	5' AACTGCAGTTATTATGAATCTAAAATACCAG 3'
MOG35-55	rev SHORT MOG35	5' AACTGCAGTTATTATTTTCCATTACGATA 3'
MBP85-97	rev SHORT MBP85	5' AACTGCAGTTATTAACGTGAAAATAAACG 3'
PLP139-151	rev SHORT PLP139	5' AACTGCAGTTATTAAAATTTATCTGG 3'
PLP178-191	rev SHORT PLP178	5' AACTGCAGTTATTATTTTGATGGAAAAGC 3'

P r z y k ł a d IV

Badania ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie translacji przeprowadzano metodą immunoblottingu, wykorzystując ekstrakty białkowe, otrzymane znanymi metodami z hodowli komórek bakteryjnych zawierających rekombinowane plazmidy, zawieszone w buforze PBS, pH 7.4 oraz odpowiednie, specyficzne przeciwciała, dostępne komercyjnie.

P r z y k ł a d V

Region promotorowy genu ptcB zamplifikowano metodą PCR na matrycy genomowego DNA szczepu L. lactis IL1403 przy użyciu odpowiednich starterów (Tabela 3). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkt o oczekiwanej długości, który następnie trawiono enzymami NciI oraz VspI i łączono z plazmidem pIL253, zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami. Zrekombionowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu L. lactis, które hodowano na podłożu stałym M17 agar z dodatkiem

0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 μg m^- , a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające region promotorowy genu ptcB.

Komórki szczepów L. lactis transformowano techniką elektroporacji (19).

T a b e l a 3

Sekwencje starterów użyte do amplifikacji regionu promotorowego genu ptcB

Nazwa startera	sekwencja starterów
ptcBfor	5' GCGATTAATGTCGCCTAAAGGTTGC 3'
ptcBrev	5' AATCCCGGCGTTTTATAATTTAACGTTC 3'

PL 217 128 B1

P r z y k ł a d VI

Syntetyczne geny peptydów amplifikowano metodą PCR przy użyciu odpowiednich starterów 'SHORT' (Tabela 2) a następnie łączono z wektorem zdolnym do replikacji w komórkach bakterii Escherichia coli - pGEMT-Easy. Zrekombinowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu E. coli, które hodowano na podłożu LB agar z dodatkiem ampicyliny o końcowym stęże-1 niu 100 μg ml^- , a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

Komórki E. coli transformowano techniką elektroporacji (22).

P r z y k ł a d VII

Strukturę sekwencji nukleotydowej syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych oraz regionu promotorowego genu ptcB, według wynalazku, potwierdzano przez sekwencjonowanie fragmentów DNA przy zastosowaniu zestawu BigDye Terminator (Promega, USA) i sekwenatora ABI377 (Applied Biosystem, USA) oraz stosując rekombinowane plazmidy jako matrycę i startery o sekwencjach komplementarnych do skrajnych sekwencji dla każdej ze wstawek. Uzyskane sekwencje nukleotydowe analizowano przy pomocy programu BLAST (23).

T a b e l a 4 Szczepy i plazmidy

Szczep	genotyp	źródło
Lactococcus lactis
IL1403	laboratoryjny szczep, bezplazmidowy	(24)
IBB360	Szczep o potencjalnych właściwościach autolizujących	J. Bardowski - kolekcja własna IBB PAN
IBB477	Szczep o potencjalnych właściwościach adhezyjnych, Tc^r	J. Życka-Krzesińska - kolekcja własna IBB PAN
Bifidobacterium
Bifidobacterium pseudocatenulatum M115	Human intestinal isolate; plazmid free	IPLA Laboratory Collection
Lactobacillus
Lactobacillus plantarum	NCFB1193	NCFB Collection
Escherichia coli
TG1	supE Q(hsdm-mcrB)(rk-mk-McrB)thi Q(lac-oroAB)F'[traD36 lacIq lacZ QM15 proA+B+]	(25)
Plazmid
pIL253	Ery^r, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus	(26)
pIL253-_p[ptcB]	Ery^r, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus, z regulowanym regionem promotorowym genu ptcB	ta praca
pGEMT-Easy	Amp^R, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Escherichia coli	Promega

* Ery^r - oporność na erytromycynę Amp^r - oporność na erytromycynę

Claims

1. Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP139-151, przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP178-191, przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a.

2. Sposób wytwarzania genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe białek mielinowych przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, znamienny tym, że syntetyzuje się metodą PCR syntetyczne geny kodujące wybrane peptydy, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów („LONG) przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis, przy czym do sekwencji nukleotydowej starterów „FLONG (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP139-151 oraz PLP178-191 wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych, a jednocześnie końce 5' starterów „FLONG_peptyd zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencję 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji, przy czym startery „LONG stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów („SHORT) homologicznych do 5' końców starterów „FLONG_peptyd i „RLONG_peptyd, a końce 5' starterów „SHORT niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów „revSHORT_peptyd (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA), w celu otrzymania fragmentu DNA, w obrębie którego zawarta jest sekwencja syntetycznego genu o wzorze 1, wzorze 2, wzorze 3, wzorze 4 lub wzorze 5, kodującego wybrany fragment peptydowy naturalnego białka mielinowego.

3. Fragmenty DNA, zawierające sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mieliny (sekwencje podkreślone), przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, o sekwencjach nukleotydowych przedstawionych wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem 10.

4. Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SalI, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza z wektorem pIL253, trawionym uprzednio tymi

PL 217 128 B1 samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzyma nych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, np. Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus, poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce M17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C.

7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii z gatunku Escherichia coli, poprzez połączenie syntetycznego genu amplifikowanego odpowiednimi starterami 'SHORT' z wektorem, preferencyjnie ze zlinearyzowanym komercyjnym plazmidem pGENT-Easy lub innym, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, przy czym zrekombinowane DNA wprowadza się znaną metodą, korzystnie metodą elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, zwłaszcza szczep TG1.

9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do optymalizacji biosyntezy peptydów w bakteriach mlekowych stosuje się region promotorowy genu ptcB.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że zastępuje się wewnętrzny konstytutywny promotor na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcB, aangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, regulowanym poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza.

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hoduje się komórki niosące rekombinowany wektor plazmidowy ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcB z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus, na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, zwłaszcza na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu > 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C.

12. Sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11 przeznaczona do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1.

13. Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym,

PL 217 128 B1 replikującym się w komórkach L. lactis, znamienny tym, że region promotorowy genu ptcB wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcBfor i ptcBrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcBfor) oraz NciI (dla startera ptcBrev). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcB (podkreślona), a następnie tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI, a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodujące wybrane peptydy, z których usunięto oryginalny region promotorowy, korzystnie poprzez działanie tych samych restryktaz, a zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długości wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcB, następnie zgodność sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcB potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

14. Zastosowanie bakterii zawierających syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1, do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej.

15. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według zastrz. 12 do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1.