PL210859B1 - Odmiana subtylizyny zawierająca zmieniony epitop limfocytów T, kwas nukleinowy kodujący tę odmianę subtylizyny, wektor ekspresyjny i komórka gospodarza zawierająca kwas nukleinowy oraz kompozycje zawierające tę odmianę subtylizyny - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210859 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 364138 (22) Data zgłoszenia: 22.03.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

22.03.2002, PCT/US02/009205 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

03.10.2002, WO02/77187 (51) Int.Cl.

C07H 21/04 (2006.01) A61K 8/66 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) A61K 39/07 (2006.01) A61P 37/08 (2006.01)

Odmiana subtylizyny zawierająca zmieniony epitop limfocytów T, kwas nukleinowy (54) kodujący tę odmianę subtylizyny, wektor ekspresyjny i komórka gospodarza zawierająca kwas nukleinowy oraz kompozycje zawierające tę odmianę subtylizyny

	(73) Uprawniony z patentu:
	GENENCOR INTERNATIONAL, INC., Palo Alto, US
(30) Pierwszeństwo:	The Procter and Gamble Company, Cincinnati, US
23.03.2001, US, 60/278,459	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.12.2004 BUP 25/04	DAVID A. ESTELL, San Mateo, US GRANT C. GANSHAW, Tracy, US FIONA A. HARDING, Santa Clara, US EDMUND A. LARENAS, Moss Beach, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.03.2012 WUP 03/12	AYROOKARAN J. POULOSE, Belmont, US ELIZABETH ELLEN SIKORSKI, Fairfield, US RUSSELL PHILIP ELLIOTT, Egham Surrey, GB
	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Zbigniew Kamiński

PL 210 859 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest odmiana subtylizyny zawierająca zmieniony epitop limfocytów T, różny od epitopu znanej subtylizyny. Ponadto przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący odmianę subtylizyny według wynalazku, wektor ekspresyjny zawierający ten kwas nukleinowy oraz komórka gospodarza transformowana tym wektorem. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna albo kompozycja do pielęgnacji skóry, kompozycja do mycia, produkt do higieny osobistej, szampon, płyn do ciała, lub kompozycja do higieny jamy ustnej, zawierająca odmianę subtylizyny według wynalazku.

Coraz ważniejsze staje się zastosowanie białek w przemyśle, farmacji i inne zastosowania komercyjne. Osoby poddane działaniu białek mogą ulec uczuleniu, a w wyniku kolejnego kontaktu z tym białkiem mogą wystąpić reakcje alergiczne. Na przykład u niektórych osób proteazy mogą powodować reakcje alergiczne. Zatem, pomimo użyteczności proteaz w przemyśle np. w środkach piorących, kosmetykach, obróbce tkanin itp. i prowadzenia szeroko zakrojonych badań prowadzących do opracowania lepszych proteaz, które na przykład zapewniają bardziej skuteczne usuwanie plam przez środek piorący; zastosowanie proteaz w przemyśle wiązało się z poważnym problemami.

Dużo pracy wymagało rozwiązanie tych problemów. Strategie wykorzystywane do zmniejszenia immunogennego działania zastosowanej proteazy obejmowały ulepszone procesy produkcji, które ograniczają ewentualny kontakt przez kontrolę i minimalizowanie w miejscu działania stężeń pyłu lub aerozolu niosącego uwolnioną do atmosfery proteazę, procesy ulepszające granulację, które zmniejszają ilość pyłu lub aerozolu faktycznie wytwarzanego przez produkt zawierający proteazę, i ulepszone procesy odzyskiwania w celu obniżenia poziomu ewentualnie uczulających zanieczyszczeń w końcowym produkcie. Jednakże wysiłki prowadzące do obniżenia działania uczulającego samej proteazy były stosunkowo nieudane. Alternatywnie czyniono wysiłki maskowania epitopów proteazy, które są rozpoznawane przez immunoglobulinę E (IgE) u osobników nadwrażliwych (Publikacja PCT nr WO 92/10755), albo zwiększenia lub zmiany charakterystyki determinant antygenowych przez przyłączenie polimerów lub peptydów/białek do proteazy stanowiącej problem.

Wystąpienie nadmiernej lub nieodpowiedniej swoistej odpowiedzi odpornościowej wskazuje, że osoba doświadczająca tej odpowiedzi jest nadwrażliwa. Reakcje nadwrażliwości są wynikiem normalnie korzystnych odpowiedzi immunologicznych działających nieprawidłowo i czasami powodują reakcje zapalne i uszkodzenie tkanek. Wiele antygenów może wywoływać taką reakcję i różne mogą być przyczyny nadwrażliwości u różnych osób. Typowo objawy nadwrażliwości nie pojawiają się w wyniku pierwszego kontaktu z antygenem, lecz zwykle po kolejnym kontakcie. Jedna z postaci nadwrażliwości występuje gdy odpowiedź IgE jest skierowana przeciwko nieszkodliwym antygenom środowiskowym, takim jak pyłek, roztocza z kurzu lub łupież zwierzęcy. W wyniku wydzielania przez uczulone IgE komórki tuczne farmakologicznych czynników pośredniczących pojawia się ostra reakcja zapalna z objawami takimi jak astma lub zapalenie śluzówki nosa.

Jednakże strategia obejmująca modyfikowanie miejsc IgE nie będzie zasadniczo użyteczna przy zapobieganiu pierwotnej przyczynie reakcji alergicznej. Zgodnie z powyższym, takie strategie, które być może neutralizują i zmniejszają dotkliwość następujących reakcji nadwrażliwości, nie będą obniżać liczby ludzi którzy są faktycznie uczuleni. Na przykład, gdy dana osoba jest uczulona na określony antygen, podstawowy sposób postępowania w takich sytuacjach podlega na odizolowaniu osoby uczulonej od antygenu w takim stopniu jak to tylko możliwe. Faktycznie, każdy inny sposób postępowania mógłby być niebezpieczny dla zdrowia uczulonej osoby. Zatem, o ile w przypadku osoby uczulonej ważne jest zmniejszenie zagrożenia spowodowanego przez specyficzne białko, to w zastosowaniach przemysłowych znacznie bardziej pożądane byłoby obniżenie lub wyeliminowanie zdolności białka do zapoczątkowywania reakcji nadwrażliwości.

Limfocyty T odgrywają główną rolę w indukowaniu i regulacji odpowiedzi odpornościowych i immunologicznych funkcjach efektorowych. Jak wiadomo specyficzna odporność przeciwko czynnikom zakażającym i nowotworom jest zależna od tych komórek i uważa się, że biorą one udział w gojeniu się ran. Z drugiej strony, niepowodzenie w kontrolowaniu tych odpowiedzi może prowadzić do chorób autoagresyjnych. Ogólnie, antygen jest prezentowany limfocytom T w postaci komórek prezentujących antygen które, poprzez różne mechanizmy powierzchniowe komórek, wychwytują i przedstawiają antygen lub częściowy antygen w sposób odpowiedni dla rozpoznania antygenu przez limfocyt T. Po rozpoznaniu specyficznego epitopu przez receptory na powierzchni limfocytów T (receptory limfocytów T), limfocyty T rozpoczynają serię złożonych oddziaływań, obejmujących proliferację, która prowadzi do

PL 210 859 B1 produkcji przeciwciał przez limfocyty B. Podczas gdy limfocyty T i limfocyty B są oba aktywowane przez epitopy antygenowe w danym białku lub peptydzie, faktyczne epitopy rozpoznawane przez te jednojądrowe komórki zasadniczo nie są identyczne. W rzeczywistości, epitop, który aktywuje limfocyt T wywołując zmianę immunologiczną jest całkiem często innym epitopem, niż ten który jest później rozpoznawany przez limfocyty B podczas odpowiedzi immunologicznej. Zatem, rozpatrując nadwrażliwość podczas gdy specyficzne antygenowe oddziaływanie pomiędzy limfocytem T a antygenem jest krytyczne przy zapoczątkowaniu odpowiedzi immunologicznej na wystawienie na działanie antygenu, to swoistość oddziaływania, to jest rozpoznawany epitop, często nie jest w powiązaniu z następującemu po nim rozwinięciu pełnej reakcji alergicznej, w której pośredniczy przeciwciało IgE.

W publikacji PCT, WO 96/40791, ujawniono sposób wytwarzania koniugatów tlenek polialkilenu-proteaza o zmniejszonym działaniu uczulającym, w którym stosuje się tlenek polialkilenu jako materiał wyjściowy.

W publikacji PCT, WO 97/30148, ujawniono koniugat polipeptydowy o zmniejszonym dział aniu uczulającym, który obejmuje jedną polimeryczną cząsteczkę nośnika mającą dwie lub więcej związane kowalencyjnie ze sobą cząsteczki polipeptydowe.

W publikacji PCT, nr WO 96/17929, ujawniono proces wytwarzania polipeptydów o zmniejszonym działaniu uczulającym zawierający etap sprzęgania z wyjściowym polipeptydem od 1 do 30 policząsteczek.

W publikacji PCT, WO 92/10755, ujawniono sposób wytwarzania odmian białka wywoł ują cych zmniejszoną odpowiedź immunologiczną u zwierząt. W tym zgłoszeniu białka, serie proteaz i ich odmiany stosowano do immunizacji szczurów. Następnie pobrane od szczurów surowice stosowano do pomiaru reaktywności przeciwciał poliklonalnych wytworzonych wcześniej i obecnych w immunizowanej surowicy na te białka i jego odmiany. Na podstawie uzyskanych wyników, można było określić czy przeciwciała w preparacie stosunkowo bardziej czy mniej chętnie reagowały z białkiem i jego odmianami, co umożliwiło analizę które modyfikacje białka będą znosić lub obniżać zdolność do wiązania z Ig. Na podstawie tych bada ń na szczurach, stwierdzono, ż e zmiana dowolnej z 309 reszt subtilizyny odpowiadającej resztom 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 będzie prowadzić do zmiany zdolności do wywołania reakcji odpornościowej.

W publikacji PCT, WO 94/10191, ujawniono mało uczulające biał ka zawierające oligomeryczne formy wyjściowego monomerycznego białka, przy czym oligomer zasadniczo zachował swoją aktywność.

W publikacji PCT, WO 99/49056, ujawniono wiele odmian subtylizyny mających aminokwasowe podstawienia w zdefiniowanym regionie epitopu. Jednakże, ze względu na dużą ilość odmian ujawnionych, specjalista stanął przed problemem identyfikacji najlepszego produktu proteazowego do higieny osobistej lub innych zastosowań związanych z ludźmi, o obniżonym działaniu immunologicznym.

W publikacji PCT, WO 01/07578, ujawniono wiele odmian subtylizyny mających aminokwasowe podstawienia w zdefiniowanych regionach epitopu. Jednakże, ze względu na dużą ilość odmian ujawnionych, specjalista stanął przed problemem identyfikacji najlepszego produktu proteazowego do higieny osobistej lub innych zastosowań związanych z ludźmi, o obniżonym działaniu immunologicznym.

W publikacji PCT, WO 99/53038, ujawniono odmiany proteaz wywoł ują cych mniejszą odpowiedź immunologiczną u ludzi i sposoby ich konstrukcji, identyfikowania i produkcji takich odmian.

Pewne badania dostarczyły sposoby obniżania działania uczulającego niektórych białek i identyfikację epitopów, które powodują reakcje alergiczne, testy stosowane do identyfikacji tych epitopów ogólnie obejmują pomiar przeciwciał IgE i IgG w surowicy krwi, od osób wcześniej poddanych działaniu antygenu. Jednakże, zapoczątkowanie odpowiedzi Ig oznacza wytworzenie uwrażliwienia. Zgodnie z powyższym, istnieje potrzeba identyfikacji białek, które wytwarzają wzmocnioną odpowiedź immunologiczną i wytworzenia białek, które powodują zmniejszoną odpowiedź immunologiczną. Obecny wynalazek spełnia wszystkie powyżej wymienione i inne potrzeby.

Przedmiotem wynalazku jest odmiana subtylizyny zawierająca zmieniony epitop limfocytów T, różny od epitopu znanej subtylizyny, co prowadzi do różnej odpowiedzi immunologicznej u człowieka, charakteryzująca się tym, że epitop limfocytów T odmiany proteazy obejmuje podstawienia aminokwasowe odpowiadające pozycji I122A i jednej lub obu pozycjom N76D i I79A subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens, a odpowiedź immunologiczna wywoływana przez tę odmianę jest mniejsza niż odpowiedź immunologiczna wywoływana przez subtylizynę.

PL 210 859 B1

Korzystnie odpowiedź immunologiczna wywoływana przez tę odmianę charakteryzuje się mniejszą zdolnością do wywołania alergii in vivo albo in vitro.

Korzystnie odmiana subtylizyny według wynalazku ma podstawienie w pozycji I122A, w jednej lub obu pozycjach N76D i I79A, i przynajmniej w jednej z pozycji 3, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206 i 217.

W innym korzystnym rozwiązaniu odmiana subtylizyny zawiera połączone grupy podstawień wybrane spośród grupy obejmującej pozycje odpowiadające Y217L/I79A/I122A; Y217L/N76D/I122A i Y217L/N76D/I79A/I122A.

W kolejnym korzystnym rozwią zaniu odmiana subtylizyny zawiera połączone grupy podstawień wybrane z grupy obejmującej Y217L/N76D/I79A/I122A/N218S; Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L; Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S; Y217L/I79A/I122A/Q206L; Y217L/I79A/I122A/N218S; Y217L//I79A//I122A/P40Q; Y217L/I79A/I122A/D41A i Y217L/I79A/I122A/H238Y.

W innym korzystnym rozwiązaniu odmiana subtylizyny zawiera połączone grupy podstawień wybrane z grupy obejmującej Y217L/N76D/I122A/N218S; Y217L/N76D/1122A/Q206L; Y217L//N76D/I122A/Q206L/N218S; Y217L/N76D/I122A/P40Q; Y217L/N76D/I122A/D41A i Y217L/N76D//I122A/H238Y.

W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu odmiana subtylizyny zawiera również podstawienie w subtylizynie w przynajmniej jednej z pozycji równoważ nej do pozycji wybranej z grupy obejmują cej 216, 181, 101, 215, 216, 217, 247, 46, 154, 128, 182, 104, 107, 250, 254, 258, 50, 47, 48, 182, 183, 185, 248 i 262 subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens.

W dalszym korzystnym rozwiązaniu odmiana subtylizyny kolejne podstawienie w przynajmniej jednej z pozycji jest wybrane z grupy pozycji obejmującej A216H, D181G, S101V, G215A, A216E, Y217S, R247Y, R247S, R247Q, G46S, S101Q, S154G, G128S, S182T, S101R, Y104W, I107V, L250G, T254G, T254A, G258S, M50A, G47S, A48G, S182R, S183R, Q185A, S101R, S248G i Y262F.

Odmiana korzystnie zawiera ponadto podstawienie w subtylizynie w przynajmniej jednej z pozycji równoważnej do wybranej z grupy obejmującej 3, 76, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206 i 217 z subtylizyny Bacillus amyloliquefaciens.

Korzystniej, dalsze podstawienia są wybrane z grupy obejmującej S3T, N76D, 131L, P40Q, D41A, I111V, V147P, N218S, Q206L, i Y217M.

Przedmiotem wynalazku jest także kwas nukleinowy kodujący odmianę określoną powyżej oraz wektor ekspresyjny zawierający ten kwas nukleinowy. Ponadto przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna albo kompozycja do pielęgnacji skóry, kompozycja do mycia, produkt do higieny osobistej, szampon, płyn do ciała, lub kompozycja do higieny jamy ustnej, znamienna tym, że zawiera odmianę określoną powyżej.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo kosmetycznie dopuszczalny nośnik. Jako nośnik kompozycja zawiera hydrofilowy rozcieńczalnik wybrany z grupy obejmującej wodę, glikol propylenowy, etanol, propanol, glicerol, glikol butylenowy, glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej od około 200 do około 600, glikol polipropylenowy o masie czą steczkowej od okoł o 425 do okoł o 2025 i ich mieszaniny.

W korzystnym rozwiązaniu kompozycja do pielęgnacji skóry zawiera również aktywną substancję do pielęgnacji skóry, korzystnie aktywna substancja jest wybrana z grupy obejmującej składnik witaminy B3, pantenol, witaminę E, octan witaminy E, retinol, propionian retinolu, palmitynian retinolu, kwas retynowy (kwas retynolowy), witaminę C, teobrominę, kwas alfa-hydroksylowy, farnezol, fitrantriol, kwas salicylowy, palmitylo peptapeptyd-3 i ich mieszaniny. Korzystniej składnikiem witaminy B3 jest amid kwasu nikotynowego.

Kompozycja do pielęgnacji skóry według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo glicerynę.

W korzystnym rozwiązaniu kompozycja do pielęgnacji skóry zawiera:

a) od około 0,00001% do około 1% wagowych odmiany określonej w jednym z zastrz. 1-11;

b) od około 0,01% do około 20% wagowych środka pochłaniającego wilgoć;

c) od około 0,1% do około 20% wagowych aktywnej substancji do pielęgnacji skóry;

d) od około 0,05% do około 15% wagowych środka powierzchniowo czynnego oraz

e) od około 0,1% do około 20% wagowych silikonu.

Sposoby i kompozycje opisane tutaj są stosowane do wytwarzania kompozycji hipoalergicznych. Jak stosowano w opisie „hipoalergiczny oznacza kompozycję wytwarzającą mniejszą odpoPL 210 859 B1 wiedź immunologiczną niż ta sama kompozycja z prekursorami białek według wynalazku. Jak stosowano w obecnym opisie, „hipoalergiczny oznacza kompozycję wytwarzającą większą odpowiedź immunologiczną niź ta sama kompozycja z prekursorami białek według wynalazku.

Jako subtylizynę stosuje się dowolną subtylizyny. W korzystnej realizacji, subtylizyny i odmiana tej subtylizyny wykazuje przynajmniej częściową aktywność subtylizyny. Na przykład, jeśli stosuje się odmianę proteazy, to będzie ona wytwarzała ograniczoną odpowiedź immunologiczną, lecz zachowa wykrywalność, i korzystnie porównywalną aktywność i stabilność proteazy.

Na podstawie proteaz i ich odmian według wynalazku mogą być zidentyfikowane i dostarczone według wynalazku homologiczne sekwencje lub te sekwencje, które hybrydyzują z tymi proteazami i ich odmianami. Termin „homologiczne został zdefiniowany dalej i może odnosić się do podobieństw lub identyczności, przy czym korzystnie są identyczne. Korzystnie, homologiczne sekwencje są sekwencjami aminokwasowymi lub kodującymi nukleinowymi, które kodują peptydy o aktywności proteazy i odmian zgodnie z opisem.

Twórcy stwierdzili, że proteazy serynowe ogólnie znane jako subtylizyny, włącznie z subtylizyną BPN', mają wystawione regiony epitopowe w pozycjach aminokwasów 70-84, pierwszy region epitopowy, i 109-123, drugi region epitopowy, odpowiadające BPN'. Twórcy przekonstruowali genetycznie taką subtylizynę aby zmienić, np. złagodzić immunologiczne właściwości związane tymi regionami epitopowymi. W rezultacie uzyskali oni subtylizyny, które wywołują zmniejszoną odpowiedź immunologiczną, jednocześnie utrzymując ich skuteczną aktywność proteazy. Ponadto twórcy opracowali subtylizyny, które wywołują taką zmniejszoną odpowiedź immunologiczną i są stabilne, zarówno pod względem termicznym jak i wartości pH. Zgodnie z powyższym, proteazy według wynalazku są odpowiednie do stosowania w kilku typach kompozycji obejmujących, nie ograniczając zakresu: kompozycje farmaceutyczne, do prania, do mycia naczyń, do mycia twardych powierzchni, do pielęgnacji skóry, do pielęgnacji włosów, upiększające, do higieny jamy ustnej i szkieł kontaktowych.

W innym rozwiązaniu, twórcy opracowali sposób obniż ania odpowiedzi immunologicznej na proteazy obejmujący otrzymanie prekursora proteazy i otrzymanie odmiany z tego prekursora proteazy, odmiany mającej przynajmniej jeden epitop rozpoznawany przez limfocyt T prekursora proteazy w którym odmiana wykazuje zmienioną odpowiedź immunologiczną , która róż ni się od odpowiedzi immunologicznej na prekursora proteazy.

Inne aspekty wynalazku będą zrozumiałe dla osoby biegłej w dziedzinie dzięki poniższemu opisowi.

Krótki opis rysunku

Fig. 1 A, B1, B2 i B3 przedstawiają sekwencję DNA (SEKW. NR ID. 1) i aminokwasową (SEKW. NR ID. 2) subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens (BPN') i częściową mapę restrykcyjną tego genu.

Fig. 2 przedstawia konserwowane reszty aminokwasowe pomiędzy subtylizynami z Bacillus amyloliquefaciens (SEKW. NR ID. 3) i Bacillus lentus (typ dziki) (SEKW. NR ID. 4).

Fig. 3A i 3B przedstawiają zestawienie sekwencji aminokwasowej proteaz typu subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (SEKW. NR ID. 5) i Bacillus lentus. Symbol * oznacza brak specyficznych reszt aminokwasowych w porównaniu do subtylizyny BPN'.

Fig. 4a przedstawia sekwencję aminokwasową prekursora proteazy P1.

Fig. 4b przedstawia odpowiedź in vitro na białko subtylizyny odmiany P1 (BPN'-Y217L) w porównaniu z odmianami LAP2 (BPN'-Y217L/I79A/I122A), LAP3 (BPN'-Y217L/N76D/I122A) i LAP4 (BPN'-Y217L/N76D/I79A/I122A).

Fig. 4b przedstawia procent odpowiedzi na peptyd BPN' 70-84 i różne odmiany (n = 20).

Fig. 5 przedstawia indeks stymulacji (SI) odpowiedzi P1 (BPN'-Y217L) o resztach w miejscach 109-123.

Fig. 6 przedstawia 13 peptydowych sekwencji mających różne podstawienia alaniny w epitopie rozciągającym się od reszty 109 do 123, stosowane do wyznaczenia zmienionej odpowiedzi immunologicznej u osób poddanych działaniu tych peptydów.

Fig. 7 przedstawia indeks stymulacji (SI) pięciu osób po wystawieniu na działanie zsyntetyzowanych alaninowych peptydów z Fig. 6.

Fig. 7a przedstawia SI kilku osób po poddaniu działaniu peptydów o sekwencji z Fig. 6.

Fig 7b przedstawia odpowiedzi osobników żeńskich HLA-DR3/DQ2 P1 w ałunie.

Fig 7c przedstawia odpowiedzi osobników męskich HLA-DR3/DQ2 PI w ałunie.

PL 210 859 B1

Fig. 8 przedstawia hydrolizę substratu 5 mg/ml roztworu dimetylo kazeiny o pH 5,5 jak wykazano poprzez zmianę absorbancji substratu przy różnych stężeniach odmian subtylizyn (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 9 przedstawia hydrolizę roztworu substratu 5 mg/ml dimetylo kazeiny o pH 6,5 jak wykazano przez zmianę absorbancji substratu przy różnych stężeniach odmian subtylizyny (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 10 przedstawia hydrolizę roztworu substratu 5 mg/ml dimetylo kazeiny o pH 7,5 jak wykazano przez zmianę absorbancji substratu przy różnych stężeniach odmian subtylizyny (P1-0-; -□-LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 11 przedstawia hydrolizę roztworu substratu 5 mg/ml dimetylo kazeiny o pH 8,5 przez zmianę absorbancji substratu przy różnych stężeniach odmian subtylizyny (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 12 przedstawia hydrolizę roztworu substratu 5 mg/ml kolagenu bydlęcego w funkcji zmiany absorbancji substratu przy różnych pH (5,5-8,5) dla różnych odmian subtylizyny (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 13 przedstawia hydrolizę roztworu substratu 5 mg/ml elastyny bydlęcej w funkcji zmiany absorbancji substratu przy różnych wartościach pH (5,5-8,5) dla różnych odmian subtylizyny (P1-0-; -□-LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 14 przedstawia hydrolizę 5 mg/ml roztworu substratu keratyny bydlęcej w funkcji zmiany absorbancji substratu przy różnych wartościach pH (5,5-8,5) dla różnych odmian subtylizyny (P1-0-; -□-LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 15 przedstawia zmianę półokresu trwania enzymu w zakresie temperatur 42-56°C jako miary stabilności termicznej różnych odmian proteaz w 50 mM PIPES (pH 6,5) (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Fig. 16 przedstawia zmianę półokresu trwania enzymu w zakresie temperatur 42-56°C jako miary stabilności termicznej różnych odmian proteaz w 50 mM TES (pH 7,5) (P1-0-; -. -LAP2; -A-LAP3; i -x- LAP4).

Szczegółowy opis wynalazku

W jednym aspekcie odmiana proteazy ma zmienioną odpowiedź immunologiczną i moc uczulającą w porównaniu do prekursorowej proteazy, gdyż obniżanie tej mocy umożliwia bezpieczniejsze stosowanie enzymu. Podczas gdy obecny wynalazek jest użyteczny do uzyskania zmiany natężenia odpowiedzi immunologicznej, mutacje wyszczególnione w opisie mogą być wykorzystane w połączeniu z mutacjami znanymi w stanie techniki aby spowodować zmienioną stabilność termiczną i/lub zmienioną specyficzność substratową, zmodyfikowaną aktywność, zwiększoną aktywność specyficzną, zmienioną stabilność w warunkach alkalicznych lub zmieniony epitop rozpoznawany przez limfocyty B w porównaniu do prekursora.

Zgodnie z wynalazkiem, odmiana proteazy ma zmienioną odpowiedź immunologiczną, odmiana zawiera epitop rozpoznawany przez limfocyt T, gdzie odmiana subtylizyny według wynalazku różni się od prekursora subtylizyny posiadaniem zmienionego epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T, tak, że odmiana peptydu według wynalazku wytwarza różne odpowiedzi immunologiczne u człowieka. Ograniczona odpowiedź immunologiczna obejmuje zmniejszoną alergenność. Epitop rozpoznawany przez limfocyt T obejmuje podstawienia aminokwasu wybranego z tych reszt będących w zidentyfikowanym epitopie. Odmiany proteazy według wynalazku, obejmujących takie podstawienia prowadzące do obniżenia odpowiedzi immunologicznej mogą być charakteryzowane przez aktywność porównywalną do aktywności prekursora proteazy, odmiany z mutacją punktową, które nie wytwarzają odpowiedzi immunologicznej lub hybrydowe odmiany proteaz.

Wynalazek obejmuje również sposób zmiany, np., zwiększanie lub obniżanie odpowiedzi immunologicznej na proteazy zawierający: otrzymanie prekursora proteazy i modyfikowanie prekursora proteazy, aby otrzymać odmianę lub pochodną tego prekursora proteazy, odmianę mającą przynajmniej jeden zmieniony epitop prekursora proteazy rozpoznawany przez limfocyt T. Ponadto, odmiana charakteryzuje się wywoływaniem zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej, która różni się od odpowiedzi immunologicznej prekursora proteazy. Jak opisano w innym miejscu tego zgłoszenia, występują przynajmniej dwa epitopy rozpoznawane przez limfocyty T w proteazach subtylizyny, pierwszy odpowiadający resztom 70-84 z Bacillus amyloliquefaciens i drugi epitop odpowiadający resztom 109 do 123 z B. amyloliquefaciens. Sposób może również obejmować wyznaczanie reszt, które zwiększają lub obniżają taką odpowiedź immunologiczną. Reszty te mogą być określone przez badanie techniPL 210 859 B1 kami przeszukiwania peptydów opisane w innym miejscu tego zgłoszenia. W jednym rozwiązaniu, odmiany proteazy zawierają podstawienie aminokwasowe w grupie obejmującej pozycje odpowiadające resztom aminokwasowym w pozycjach 122 i jednym z 76 i 79 w subtylizynie z B. amyloliquefaciens. W wyniku tego podstawienia odmiana wykazuje zmienioną odpowiedź immunologiczną w porównaniu do odpowiedzi na prekursora subtylizyny.

Zrozumiałe jest, że określenia: białka, polipeptyd i peptyd są czasami stosowane w opisie wymiennie. Podczas gdy peptyd jest częścią białka, osoba biegła w dziedzinie może zrozumieć to poprzez kontekst w jakim określenie jest stosowane.

Komórka prezentująca antygen jak stosowano w opisie oznacza komórkę układu odpornościowego, która prezentuje antygen na swojej powierzchni, który jest rozpoznawalny przez receptory na powierzchni limfocytów T. Przykłady komórek prezentujących antygen obejmują komórki dendrytyczne, komórki grzebieniowe, aktywowane limfocyty B i makrofagi.

Proliferacja limfocytów T jak stosowano w opisie, oznacza liczbę limfocytów T wytwarzanych podczas inkubacji limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen, z lub bez antygenu.

Podstawowy poziom proliferacji limfocytów T jak stosowano w opisie oznacza proliferację limfocytów T, na poziomie który jest normalnie obserwowany u osobnika w odpowiedzi na poddanie działaniu komórek prezentujących antygen przy braku peptydu lub antygenu białka. W opisie, podstawowy poziom proliferacji limfocytów T został określony na zasadzie - w próbce pobranej od każdego osobnika jako proliferacja limfocytów T w odpowiedzi na komórki prezentujące antygen przy braku antygenu.

Epitop rozpoznawany przez limfocyty T oznacza cechę peptydu lub białka, która jest rozpoznawana przez receptor limfocytów T przy zapoczątkowaniu odpowiedzi immunologicznej na peptyd zawierający ten antygen. Rozpoznanie epitopu przez limfocyty T zachodzi, jak się ogólnie uważa, poprzez mechanizm, w którym limfocyty T rozpoznają peptydowe fragmenty antygenów, które są związane z klasą I lub klasą II cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (ang. major histocompatability molecules - MHC), których ekspresja zachodzi w komórkach prezentujących antygen (patrz np., Moeller, G. ed., „Antigenic Requirements for Activation of MHC Restricted Responses Immunological Review, tom 98, str. 187 (Copenhagen; Munksgaard) (1987).

Próbka jak stosowano w opisie zawiera jednojądrowe komórki, które nie miały do tej chwili kontaktu z bodźcem, to jest, nieuczulone na przedmiotowy antygen.

Homolog jak stosowano w opisie oznacza białko lub enzym, który ma podobne działanie katalityczne, strukturę i/lub zastosowanie jak białko według wynalazku. W wynalazku, homolog i białko według wynalazku nie muszą być spokrewnione ewolucyjnie np. funkcyjne białka od różnych gatunków. Pożądane jest znalezienie homologu, który ma trzeciorzędową i/lub pierwszorzędową strukturę podobną do białka według wynalazku gdyż zastąpienie epitopu w białku według wynalazku o analogicznym segmencie z homologiem zmniejszy destrukcyjność zmiany. Zatem, homologiczne w znacznym stopniu enzymy stanowią najbardziej pożądane źródło podstawień epitopu. W innym rozwiązaniu, jeśli jest to możliwe, korzystne jest sprawdzenie ludzkich analogów danych białek. Na przykład, podstawienie swoistego epitopu w bakteryjnej subtylizynie sekwencją z ludzkiego analogu subtylizyny (to jest, ludzkiej subtylizyny) powinno prowadzić do zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej na białko bakteryjne.

Analogiczna sekwencja może być określona przez upewnienie się, że zastąpienie aminokwasów wykazuje podobne funkcje, trzeciorzędową strukturę i/lub konserwowane reszty względem aminokwasów w białku według wynalazku w miejscu lub w pobliżu epitopu. Zatem, gdy region epitopu zawiera, na przykład, strukturę alfa-helisy lub beta-kartki, zastąpienie aminokwasów powinno utrzymać tą specyficzną strukturę.

Korzystnie, proteazy według wynalazku wyodrębniono lub oczyszczono. Przez oczyszczanie lub wyodrębnienie rozumie się, że proteaza została zmieniona względem jej naturalnego stanu w wyniku rozdzielenia proteazy od pewnych lub wszystkich naturalnie występujących składników, z którymi jest ona związana w przyrodzie. Można to osiągnąć stosując znane w stanie techniki sposoby rozdziału takie jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, rozdział hydrofobowy, dializa, działanie proteazą, strącanie siarczanem amonu lub strącanie białka inną solą, wirowanie, chromatografia z zastosowaniem sit molekularnych (size exclusion chromatography), filtracja, mikrofiltracja, elektroforeza w żelu lub rozdział w gradiencie, w celu usunięcia całych komórek, szczątków komórek, zanieczyszczeń, obcych białek lub niepożądanych enzymów w końcowej kompozycji. Jest również możliwe dodanie następnie składników do kompozycji zawierającej proteazę, co zapewni dodat8

PL 210 859 B1 kowe korzyści, na przykład, środki aktywujące, środki przeciwko hamowaniu, pożądane jony, związki do utrzymywania pH lub inne enzymy, takie jak celulaza.

Białka, np. proteazy, wykazują zwiększoną odpowiedź immunologiczną gdy odpowiedź limfocytu T, którą wywołują jest większa niż wywołana przez wyjściowe (prekursorowe) białka. Wynik netto tej większej odpowiedzi jest zwiększeniem w ilości przeciwciał skierowanych przeciwko tej odmianie białka. Białka wykazują zmniejszoną odpowiedź immunologiczną gdy odpowiedź limfocytu T, którą wywołują jest mniejsza niż wywołana przez białka wyjściowe. Wynik netto tej niższej odpowiedzi to brak przeciwciał skierowanych przeciwko tej odmianie białka.

Przykładowe testy użyteczne do stwierdzania obniżonej odpowiedzi immunologicznej na odmiany białka obejmują, między innymi testy in vivo (odpowiedzi mysich limfocytów T HLA-DR3/DQ2 i testy in vitro (ludzkie jednoją drowe komórki z krwi obwodowej (PBMC) odpowiadają ce na proteazę 1 (P1 jest proteazą BPN'-Y217L) i jego odmiany. Testy in vivo użyteczne do stwierdzania obniżonej odpowiedzi immunologicznej obejmują, między innymi zastosowanie transgenicznych zwierząt na przykład, myszy, szczurów (Taurog i wsp., Immunol. Rev., 169: 209-223 (1999)), królików lub świń. Korzystny transgeniczny mysi model do testowania in vivo zmodyfikowanego białka według wynalazku i jego odmian, obejmującego wyznaczenie zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej, jest mysim modelem HLA-DR3/DQ2. Ten mysi model prowadzi ekspresję haplotypu wspólnego dla całej ludzkiej populacji. W modelu tym zachodzi ekspresja HLA-DR3 na limfocytach B i makrofagach w drugorzędowych organach immunologicznych. Może to regulować zwiększając ekspresję HLA-DR w aktywowanych limfocytach T w sposób analogiczny jak w ludzkich limfocytach T. HLA-DQ2 ulega ekspresji na niższych poziomach niż HLA-DR, co, ponownie jest zgodne z układami ekspresji cząsteczek HLA u ludzi. Jak wykazano, epitopy proteazy wedł ug wynalazku wiążą się z HLA-DQ2 w analizach wią zania z powierzchnią komórek.

Twórcy są świadomi różnic pomiędzy tym mysim modelem a transgenicznymi mysimi modelami HLA opisanymi w literaturze. Myszy HLA stosowane przez obecnych twórców prowadzą ekspresję HLA-DR i -DQ w sposób analogiczny do tego obserwowanego u ludzi, to jest, ekspresja HLA-DQ jest całkiem niska, i nie może być regulowana, powodując jej zwiększenie, przez LPS który pośredniczy w aktywacji limfocytów B. Jest to w jawnym kontraście z obserwacjami u innych zwierząt transgenicznych, które wybrano do prowadzenia ekspresji na wysokich poziomach pojedynczego transgenicznego genu HLA. Ta mysz została skrzyżowana z myszą pozbawioną mysiego l-Ab, co powoduje eliminację ekspresji endogennego heterodimeru l-Aab, patrz Grusby i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci, 90: 3913-3917 (1993), który odpowiada ludzkiemu DQ. Te myszy nadal prowadzą ekspresję mysiego MHC klasy II I- łańcucha beta E. Cząsteczka ta może parować z łańcuchem alfa HLA-DR tworząc mieszany dimer który ma duże prawdopodobieństwo ekspresji przy wysokich poziomach na komórkach prezentujących antygen. Opisywano inne transgeniczne myszy HLA, które mogłyby być stosowane w podobny sposób w celu określenia potencjału odpowiedzi immunologicznych na haplotypy klasy II, na przykład patrz Herman i wsp., J. Immunol. 163: 6275-6282; Sonderstrup i wsp., Immunological Reviews 172: 335-343 (1999); Taneja i David, Immunological Reviews 169: 67-79 (1999).

Oprócz zmiany np., zwiększenia lub obniżenia odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia, takiego jak człowiek, naturalnie występujących sekwencji aminokwasowych, opisano tutaj również zmniejszanie odpowiedzi immunologicznej na zmutowane białko, np., białko lub proteazę, która została zmieniona, aby zmienić funkcyjną aktywność białka. W wielu przypadkach, mutacja białek w celu np. zwiększenia aktywności, stabilności termicznej, stabilności w warunkach alkalicznych i/lub stabilności w warunkach utleniających, prowadzi do wbudowania nowego epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T do zmutowanego białka. W wynalazku określono obecność nowych epitopów rozpoznawanych przez limfocyty T i podstawień aminokwasowych, które zmienią odpowiedź immunologiczną na zmutowane białko.

Proteazy są hydrolazami karbonylowymi, których zasada działania opiera się na cięciu wiązań peptydowych białek lub peptydów. Zgodnie z opisem, proteaza oznacza naturalnie występującą lub zrekombinowaną proteazę. Naturalnie występujące proteazy obejmują, na przykład, hydrolazę α-aminoacylopeptydu, hydrolazę peptydyloaminokwasową, acylaminową hydrolazę, serynową karboksypeptydazę, metalokarboksypeptydazę, tiolową proteinazę, karboksyloproteinazę i metaloproteinazę. Serynowe, metalo, tiolowe i kwaśne proteazy obejmują, zarówno endo jak i egzo-proteazy.

Subtylizyny są bakteryjnymi lub grzybowymi proteazami, które zasadniczo tną peptydowe wiązania białek lub peptydów. Jak stosowano w obecnym opisie, subtylizyna oznacza naturalnie występującą lub zrekombinowaną subtylizynę. Wiadomo, że naturalnie występujące subtylizyny są wytwaPL 210 859 B1 rzane i często wydzielane przez różne gatunki mikroorganizmów. Sekwencje aminokwasowe elementów tych subtylizyn nie są całkowicie homologiczne. Jednakże, subtylizyny wykazują taką samą lub podobnego typu aktywność proteolitycznezną. Ta klasa proteaz serynowych ma wspólną sekwencję aminokwasową definiującą katalityczną triadę, która jest cechą wyróżniającą ze związanych z chymotrypsyną klas proteaz seryny. Zarówno subtylizyny jak i związane z chymotrypsyną, proteazy serynowe zawierają a katalityczne triady obejmujące aspartan, histidynę i serynę. W proteazach związanych z subtylizyną kolejność tych aminokwasów, czytając od koń ca aminowego do karboksylowego, jest następująca aspartan-histidyna-seryna. Jednakże w proteazach związanych z chymotrypsyną, kolejność jest następująca: histidyna-aspartan-seryna. Zatem, subtylizyną według opisu odnosi się do proteazy serynowej mającej katalityczną triadę proteaz związanych z subtylizyną. Przykłady obejmują między innymi subtylizyny zidentyfikowane na Fig. 3. Ogólnie i według wynalazku, numery aminokwasów w proteazie z Bacillus amyloliquefaciens odpowiadają numerowi przypisanemu dojrzałej subtylizynie o sekwencji przedstawionej na Fig. 1.

„Rekombinant, „zrekombinowana subtylizyna lub „zrekombinowana proteaza odnosi się do subtylizyny lub proteazy, w których sekwencja DNA kodująca subtylizynę lub proteazę została zmodyfikowana, tak aby uzyskać odmianę (lub mutanta) sekwencji DNA, która koduje podstawienie, delecję lub insercję przynajmniej jednego aminokwasu w naturalnie występującej sekwencji aminokwasowej. Odpowiednie sposoby wytwarzania takiej modyfikacji, takie, które mogą być połączone z ujawnionymi w obecnym opisie, obejmują te z US Nr 4 760 025 (US RE 34 606), US Nr 5 204 015 i US Nr 5 185 258.

Nie pochodzące od ludzi subtylizyny i DNA kodujący je mogą być otrzymane z wielu prokariotycznych i eukariotycznych organizmów. Odpowiednie przykłady organizmów prokariotycznych obejmują bakterie Gram ujemne takie jak E. coli lub Pseudomonas i bakterie Gram dodatnie takie jak Micrococcus lub Bacillus. Przykłady eukariotycznych organizmów w których subtylizyna i ich geny mogą być otrzymane obejmują drożdże takie jak Saccharomyces cerevisiae, grzyby takie jak Aspergillus sp.

Ludzka subtylizyna oznacza białka pochodzące od ludzi, które wykazują katalityczną aktywność typu subtylizyny, np. rodzina keksyny ludzkich proteaz. Dodatkowo, pochodne lub homologi białek przedstawione w opisie, obejmują te niepochodzące od ludzi np. od myszy lub królika, które zachowują zasadniczą aktywność peptydu, to jest zdolność do hydrolizy wiązań peptydowych i powodujące zmienioną odpowiedź immunologiczną jak opisano w innym miejscu tego zgłoszenia, itp., i mają przynajmniej 50%, przynajmniej 65% i korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90%, i czasami aż 95, 97 lub nawet 99% homologii z przedmiotową proteazą . Zasadnicza aktywność homologu obejmuje zdolność do wytwarzania różnych odpowiedzi immunologicznych u człowieka. Proteaza według jednego rozwiązania została przedstawiona na Fig. 4a.

Numery pozycji reszt aminokwasowych stosowane w opisie odnoszą się do tych przypisanych sekwencji dojrzałej subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens przedstawionej na Fig. 1. Wynalazek, jednakże, nie jest ograniczony do mutacji tej szczególnej subtylizyny, lecz rozciąga się na prekursory subtylizyny zawierające reszty aminokwasowe w pozycjach które są równoważne ze szczegółowo zidentyfikowanymi resztami w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens. Na przykład, gdy prekursorem proteazy jest subtylizyna z Bacillus lentus, podstawienia, delecje i/lub insercje mogą być przeprowadzone w pozycjach równoważnych reszt aminokwasowych w B. lentus, odpowiadających resztom wymienionym powyżej.

Reszta (aminokwasowa) prekursora subtylizyny jest równoważna reszcie subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens jeśli jest ona bądź homologiczna (to jest, odpowiadająca w pozycji w pierwszorzędowej lub trzeciorzędowej strukturze) lub analogiczna do specyficznej reszty lub części tej reszty w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens (to jest, mająca te same lub podobne zdolności funkcjonalne do wiązania, reagowania, lub oddziaływania chemicznego). Odpowiadający jak stosowano w opisie ogólnie odnosi się do analogicznej pozycji w peptydzie.

W celu ustalenia homologii z pierwszorzę dową strukturą , sekwencja aminokwasowa prekursora subtylizyny jest bezpośrednio porównana z pierwszorzędową sekwencją subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens a szczególnie z układem reszt, o których wiadomo że są niezmienne w subtylizynach dla których sekwencja jest znana. Na przykład, Fig. 2 przedstawia konserwowane reszty pomiędzy subtylizyną z B. amyloliquefaciens a subtylizyną z B. lentus. Po zestawieniu konserwowanych reszt, z uwzględnieniem koniecznych insercji i delecji w celu utrzymania zestawienia (to jest, unika się usuwania konserwowanych reszt w wyniku delecji czy insercji), definiuje się reszty równoważne z po10

PL 210 859 B1 szczególnymi resztami aminokwasowymi w pierwszorzędowej sekwencji subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Zestawienie konserwowanych reszt korzystnie powinno zachowywać 100% takich reszt. Jednakże, zestawienie zachowujące ponad 75% lub tylko 50% konserwowanych reszt jest również właściwe w celu określenia równoważnych reszt. Należy zachować katalityczną triadę, Asp32//His64/Ser221.

Na przykład, sekwencje aminokwasowe subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) i Bacillus lentus mogą być zestawione razem aby dostarczyć maksymalną ilość homologii pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi. Porównanie tych sekwencji wykazało, że występuje pewna liczba konserwowanych reszt obecnych w każdej sekwencji. Konserwowane reszty pomiędzy BPN' a B. lentus zostały zidentyfikowane jak przedstawiono na Fig. 2.

Zatem zdefiniowane konserwowane reszty mogą być stosowane do zdefiniowania odpowiadającym im równoważnym resztom aminokwasowym subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens w innych subtylizynach takich jak subtylizyna z Bacillus lentus (Publikacja PCT nr W089/06279 opublikowana w lipcu 13, 1989), korzystny enzym prekursora proteazy w obecnym opisie, lub subtylizyna oznaczona jako PB92 (EP 0 328 299), która jest wysoce homologiczna z korzystną subtylizyną z Bacillus lentus. Sekwencje aminokwasowe niektórych z tych subtylizyn zestawiono na Fig. 3A i 38 razem z sekwencją substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens, aby uzyskać maksymalną homologię konserwowanych reszt. Jak widać, występuje pewna ilość delecji w sekwencji z Bacillus lentus w porównaniu do subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Zatem, na przykład, równoważny aminokwas dla Val165 w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens w innych subtylizynach jest to izoleucyna dla B. lentus i B. licheniformis.

Zatem, na przykład, aminokwas w pozycji +170 to lizyna (K) zarówno w subtylizynie z B. amyloliquefaciens jak i z B. licheniformis i arginina (R) w Sawinazie. W jednym rozwiązaniu odmiany proteaz, jednakże, aminokwas równoważny z +170 w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens jest podstawiony kwasem asparaginowym (D). Skróty i jednoliterowe oznaczenia wszystkich aminokwasów w opisie są zgodne z Patentln User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, str. 101.

Homologiczne sekwencje mogą również być określone przez stosowanie „algorytmu porównywania sekwencji. Optymalne zestawienie sekwencji do porównania może być przeprowadzone, np. stosując algorytm miejscowej homologii Smitha & Watermana, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algorytm zestawienia homologii Needlemana & Wunscha, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), przeszukiwanie podobieństwa w metodzie Pearsona & Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), komputerowe realizacje tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madizon, Wl), lub przez przeszukiwanie wizualne.

Przykładem algorytmu, który jest odpowiedni do wyznaczania podobieństwa sekwencji jest algorytm BLAST, który jest opisany w AItschul, i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Oprogramowanie do wykonania analizy BLAST jest dostępne na stronie National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nihi.gov/). Ten algorytm obejmuje pierwszą identyfikację par sekwencji o wysokiej liczbie punków (HSPs) przez identyfikację krótkich sł ów o dł ugoś ci W badanej sekwencji, które bądź pasują do siebie lub spełniają pewne oznaczone pozytywnie wartości progowe T gdy są zestawione razem ze słowem tej samej długości w bazie danych sekwencji. Te wstępne znalezione sąsiadujące słowa działają jako punkty startowe znalezienie dłuższych HSPs zawierających je. Trafienia słów są rozszerzane w obu kierunkach wzdłuż każdych z dwóch sekwencji i porównywane przez tak długi czas aż do powiększenia wyników zbiorczego zestawienia. Wydłużenie trafienia słów jest zatrzymywane gdy: zbiorczy wynik zestawienia będzie w zakresie X od maksymalnej uzyskanej wartości; zbiorczy wynik zbiega do zera lub poniżej; lub koniec każdej z sekwencji został osiągnięty. Parametry algorytmu BLAST W, T, i X wyznaczają czułość i szybkość przypisana. Program BLAST wykorzystuje jako typowe długości słów (W) równe 11, macierz wyników BLOSUM62 (patrz Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) zestawienia (B) wynosi 50, wartość oczekiwana (E) wynosi 10, M'5, N'-4 i porównanie obu nici.

Algorytm BLAST następnie przeprowadza analizę statystyczną podobieństwa pomiędzy dwoma sekwencjami (patrz np., Karlin & AItschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Jeden pomiar podobieństwa dostarczony przez algorytm BLAST jest najmniejszą sumą prawdopodobieństwa (P (N)), które dostarcza wskazanie prawdopodobieństwa przy którym dopasowanie pomiędzy dwoma sekwencjami nukleotydowymi lub aminokwasowymi mogłoby wystąpić przez przypadek. Na przykład, sekwencja aminokwasowa jest uważana za podobną z białkiem takim jak proteaza, jeśli najmniejsza

PL 210 859 B1 suma prawdopodobieństwa w porównaniu z testową sekwencją aminokwasową z białkiem takim jak sekwencja aminokwasowa proteazy jest mniejsza niż około 0,1, korzystniej mniejsza niż około 0,01, i korzystniej mniejsza niż około 0,001.

„Reszty równoważne mogą również być zdefiniowane przez wyznaczanie homologii na poziomie trzeciorzędowej struktury prekursora białka, którego trzeciorzędowa struktura została określona stosując krystalografię rentgenowską. Równoważne reszty są zdefiniowane jako te dla których koordynaty atomowe dwóch lub więcej atomów głównego łańcuch a poszczególnych reszt aminokwasowych prekursora białka takiego jak proteaza i subtylizyna z Bacillus amyloliquefaciens (N na N, CA na CA, C na C i O na O) są w zakresie 0,13 nm i korzystnie 0,1 nm po zestawieniu ze sobą. Zestawienie ze sobą uzyskuje się po zorientowaniu najlepszego modelu i takim ustawieniu aby uzyskać maksymalne nakładanie atomowych współrzędnych atomów białka, nie będących wodorami białka takiego jak badana proteaza względem subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Najlepszy model jest modelem krystalograficznym dającym najniższy czynnik R w danych doświadczalnych dyfraktometrycznych przy najwyższej dostępnej rozdzielczości.

Równoważne reszty, które są funkcjonalnie analogiczne ze specyficzną resztą substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens są zdefiniowane jako te reszty aminokwasowe białka prekursora takiego jak proteaza, które mogą przyjmować konformację tak, że zmieniają, modyfikują lub biorą udział w białkowej strukturze, wiązaniu substratu lub katalizie w sposób zdefiniowany i przypisany specyficznej reszcie subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Ponadto, są one tymi resztami prekursora białka, na przykład, proteazy (dla których trzeciorzędową strukturę otrzymano przez krystalografię rentgenowską), które zajmują analogiczną pozycję do tego stopnia, że pomimo, że atomy głównego łańcucha danej reszty mogą nie spełniać kryteriów równoważności na podstawie zajmowanej homologicznej pozycji, atomowe współrzędne przynajmniej dwóch z atomów bocznego łańcucha reszty leżą 0,13 nm od odpowiadających im atomów bocznego łańcucha substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Współrzędne trójwymiarowej struktury substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens przedstawiono w publikacji EPO Nr 0 251 446 (odpowiadającej US Nr 5,182,204) i mogą być stosowane jak opisano powyżej, do określania równoważnych reszt na poziomie struktury trzeciorzędowej.

Pochodna oznacza białko które pochodzi od białka prekursorowego (np., natywnego białka) przez addycję przynajmniej jednego aminokwasu do jednego z lub obu końców C- lub N-końca, podstawienie przynajmniej jednego aminokwasu w jednym lub pewnej ilości różnych miejsc w sekwencji aminokwasowej, delecję przynajmniej jednego aminokwasu do jednego z lub obu końców białka lub w przynajmniej jednym miejscu w sekwencji aminokwasowej, lub insercję przynajmniej jednego aminokwasu w przynajmniej jednym miejscu w sekwencji aminokwasowej. Wytwarzanie pochodnej proteazy jest korzystnie uzyskiwanie przez modyfikowanie sekwencji DNA która koduje natywne białko, transformację odpowiedniego gospodarza tą sekwencją DNA i ekspresję zmodyfikowanej sekwencji DNA aby utworzyć pochodną proteazy.

Pochodna według wynalazku obejmuje peptydy zawierające zmienione sekwencje aminokwasowe w porównaniu do sekwencji aminokwasowej prekursora (np., typ dziki lub natywne proteazy), które to peptydy zachowują charakterystykę proteazy, lecz które mają zmienione właściwości w pewnym specyficznym aspekcie. Na przykład, pochodna proteazy może mieć zwiększony optymalny zakres pH lub zwiększoną stabilność w zakresie temperatur lub warunkach utleniających lecz zachowuje swoją właściwość aktywności substratowej. Podobnie, pochodne według wynalazku obejmują domenę wiążącą wapń, która bądź została dodana, usunięta bądź zmodyfikowana w taki sposób, aby znacząco osłabiać lub wzmacniać jej zdolność do wiązania wapnia. Podobnie, katalityczna domena proteolityczna może być bądź dodana, usunięta lub zmodyfikowana, aby działać w połączeniu z proteazą. Rozważane są pochodne według wynalazku, które mogą pochodzić z fragmentu DNA kodującego pochodną proteazy, gdzie aktywność funkcjonalna ulegającej ekspresji pochodnej proteazy jest zachowana. Odpowiednie sposoby takich modyfikacji prekursorowej sekwencji DNA obejmują sposoby ujawnione w opisie, jak i sposoby znane biegłym (na przykład EP 0 328299, W089/06279 i patenty amerykańskie a także zastosowania przedstawione w opisie). Niektóre zidentyfikowane reszty subtylizyny przeznaczone do podstawienia, insercji lub delecji są konserwowanymi resztami podczas gdy inne nie.

Taka modyfikacja jest korzystnie modyfikacją prekursorowej sekwencji DNA, która koduje sekwencję aminokwasową prekursora enzymu, lecz mogą być zastosowane zmiany w prekursorze białka. Przykłady prekursorowej sekwencji DNA obejmują, między innymi BPN' i BPN'-Y217L. W przypadku reszt, które nie są konserwowane, zastąpienie przynajmniej jednego aminokwasu jest ograniczone

PL 210 859 B1 do podstawień, które wytwarzają odmianę o sekwencji aminokwasowej nieodpowiadającej tej występującej w przyrodzie. W przypadku konserwowanych reszt, takie zastąpienia nie powinny prowadzić do naturalnie występującej sekwencji. Pochodna ponadto obejmuje chemiczną modyfikację zmieniającą właściwości proteazy.

Zatem zwykle wyrażenie zasadniczo identyczne w kontekście dwóch kwasów nukleinowych lub polipeptydów oznacza, że polinukleotyd lub polipeptyd zawiera sekwencję, która wykazuje przynajmniej 60% identyczności, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90%, jeszcze korzystniej 95% i czasami aż 97%, względem sekwencji odniesienia, co można określić stosując oprogramowanie opisane powyżej (np., BLAST, ALIGN, CLUSTAL) i standardowe parametry. Jedną wskazówką, że dwa polipeptydy są zasadniczo identyczne, jest immunologiczne oddziaływanie krzyżowe jednego polipeptydu z drugim polipeptydem. Typowo, polipeptydy, które różnią się konserwatywnymi aminokwasowymi podstawieniami są immunologicznie reaktywne krzyżowo. Zatem, polipeptyd jest zasadniczo identyczny z drugim polipeptydem, na przykład, gdy dwa peptydy różnią się tylko konserwatywnym podstawieniem. Inną wskazówką, że dwie sekwencje kwasów nukleinowych są zasadniczo identyczne jest to, że dwie cząsteczki hybrydyzują ze sobą w ostrych warunkach (np., w zakresie średniej do wysokiej ostrości warunków).

Hybrydyzacja obejmuje dowolny proces w którym nić kwasu nukleinowego łączy się z komplementarną nicią kwasu nukleinowego w wyniku parowania zasad. Zatem mówiąc prościej, określenie odnosi się do dopasowania danej sekwencji aby związała się z sekwencją badaną lub vice-versa.

Warunki hybrydyzacji są typowo sklasyfikowane przez stopień ostrości warunków, w których hybrydyzacja jest mierzona. Stopień ostrości może być oparty, na przykład, na temperaturze topnienia (Tm) kwasu nukleinowego związanego z kompleksem lub sondą. Na przykład, maksymalna ostrość typowo występuje przy około Tm -5°C (5° poniżej Tm sondy); wysoka ostrość przy około 5-10° poniżej Tm; pośrednia ostrość przy około 10-20° poniżej Tm sondy; i łagodna przy około 20-25° poniżej Tm. W innym rozwiązaniu, lub dodatkowo, oznaczenie warunków hybrydyzacji może być oparte na warunkach stężenia lub mocy jonowej soli do hybrydyzacji i/lub przynajmniej jednej ostrości przemywania. Na przykład, 6xSSC = bardzo łagodne; 3xSSC = łagodne do średnie; 1xSSC = o średniej ostrości i 0,5xSSC = o wysokiej ostrości. Funkcjonalnie, warunki maksymalnej ostrości mogą być stosowane do zidentyfikowania sekwencji kwasu nukleinowego mającego bezpośrednią identyczność lub bliską bezpośrednią identyczność z sondą hybrydyzacyjną; podczas gdy warunki wysokiej ostrości stosowano do zidentyfikowania sekwencji kwasu nukleinowego mającej około 80% lub więcej identyczności z sondą.

Odmiana proteazy mająca zmieniony epitop może być stosowana do otrzymywania sekwencji oligonukleotydowych lub starterów o długości około 10-30 nukleotydów, które mogą być zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydowej, na przykład jak te ujawnione na Fig. 6, i stosowane w technologii PCR do wyizolowania naturalnie wystę pującej sekwencji lub odmian z sekwencji genomowych.

Inna ogólna strategia klonowania fragmentów genomowego DNA z B. subtilis do sekwencjonowania wykorzystuje odwrotną PCR. Znany region jest skanowany pod kątem zestawu odpowiednich miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych i odwrotna PCR jest wykonywana z zestawem starterów DNA określonych na podstawie zewnętrznej DNA. Fragmenty DNA z odwrotnej PCR są bezpośrednio stosowane jako matryca w reakcji sekwencjonowania. Nowo uzyskane sekwencje mogą być stosowane do projektowania nowych oligonukleotydów. Te nowe oligonukleotydy są stosowane do amplifikacji fragmentów DNA z genomowym DNA jako matrycą. Wyznaczenie sekwencji obu nici regionu DNA jest zakończone przez zastosowanie strategii kroczącego startera genomowych fragmentach PCR. Korzyść wielokrotnych punktów startowych kroczącego startera wynika z serii odwrotnych fragmentów PCR o różnych wielkościach nowo sklonowaych części DNA. Z najbardziej zewnętrznych sekwencji DNA, rozpoczyna się nowy cykl odwrotnej PCR. Gała strategia odwrotnej PCR jest oparta na kolejnym użyciu tradycyjnej polimerazy taq i zastosowanie odwrotnej PCR o długim zakresie w przypadkach, w których polimeraza taq nie może amplifikować fragmentów DNA. Sekwencjonowanie kwasu nukleinowego wykonuje się stosując standardową technologię. Jeden ze sposobów sekwencjonowania kwasu nukleinowego obejmuje zastosowanie sekwensera Perkin-Elmer Applied Biosystems 373 DNA (Perkin-Elmer, Foster City, California) zgodnie z instrukcją producenta.

Sekwencje kwasu nukleinowego pochodzące z genomowego DNA mogą zawierać oprócz regionów kodujących regiony regulatorowe. Bez względu na źródło, w celu powielania, wyizolowany gen MP powinien być wklonowany w odpowiedni wektor technikami molekularnymi.

PL 210 859 B1

W molekularnym klonowaniu genu z genomowego DNA, wytwarza się fragmenty DNA, z których niektóre z będą kodować żądany gen. DNA może być cięty w określonych miejscach stosując różne enzymy restrykcyjne. W innym rozwiązaniu, możliwe jest użycie DNAzy w obecności manganu, w celu fragmentacji DNA, lub DNA może być fizycznie rozdrabniany, na przykład, przez sonikację. Fragmenty liniowe DNA mogą następnie być rozdzielane według ich wielkości standardowymi technikami, obejmującymi, nie ograniczając zakresu, elektroforezę w żelu agarozowym i poliakrylamidowym, i chromatografię kolumnową.

Po uzyskaniu fragmentów DNA, identyfikuje się specyficzne fragmenty DNA zawierające zmienioną epitopową sekwencję, co można przeprowadzić na wiele sposobów. Na przykład, oligomer zmienionego epitopu kodowany przez gen B. subtilis według wynalazku lub specyficzne RNA, lub jego fragment, taki jak sonda lub starter, może być wyizolowany i znakowany, a następnie stosowany w testach hybrydyzacji do wykrywania epitopowej sekwencji wywołującej zmienioną odpowiedź immunologiczną. (Benton, W. i Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. i Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Fragmenty DNA mające zasadnicze podobieństwa sekwencji z sondą będą hybrydyzować w ostrych warunkach.

Opisano również sposób wykrywania zmienionych immunogennych polinukleotydowych homologów, który obejmuje hybrydyzację części lub całej sekwencji kwasu nukleinowego kodującego epitop z B. subtilis bą d ź pochodzą cych z genomowego lub cDNA.

Procesy amplifikacji przeprowadzi się stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), którą opisano w Dieffenbach, CW i GS Dveksler, (PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harber Press, Plainview, NY, 1995). Sekwencja kwasu nukleinowego o przynajmniej około 10 nukleotydach i aż około 60 nukleotydach z B. subtilis MP, korzystnie o około 12 do 30 nukleotydach, i korzystniej o około 20-25 nukleotydach mogą być stosowane jako sonda lub starter PCR.

W zastosowaniach wymagających dużej selektywności, typowo zastosuje się stosunkowo ostre warunki, aby utworzyć hybrydy, np., zostaną wybrane warunki stosunkowo niskiego poziomu soli i/lub wysokiej temperatury. Warunki hybrydyzacji, obejmujące pośrednią ostrość i wysoką ostrość, przedstawiono w Sambrook i wsp.

Wynalazek obejmuje proteazy mające zmienioną immunogenność, które są równoważne z tymi, które pochodzą ze wspomnianych mikrobiologicznych szczepów. Za równoważne, w tym kontekście, uważa się proteazy kodowane przez polinukleotyd zdolny do hybrydyzacji z polinukleotydem mającym sekwencję jak wskazano na dowolnej z Fig. 1A-1C w warunkach pośredniej do wysokiej ostrości i nadal zachowują ce zmienioną odpowiedź immunologiczną ludzkich limfocytów T. Bę d ą ce równoważne znaczy, że proteaza zawiera przynajmniej 55%, przynajmniej 65%, przynajmniej 70%, przynajmniej 75%, przynajmniej 80%, przynajmniej 85%, przynajmniej 90%, przynajmniej 95%, przynajmniej 97% lub przynajmniej 99% identyczności z sekwencją epitopową i odmianą proteazy mającą takie epitopy, np., mającą sekwencję aminokwasową ujawnioną na Fig. 4a zmodyfikowaną jak opisano w innym miejscu tego zgł oszenia.

„Proteazy hybrydowe lub „proteazy fuzyjne, stanowią białka zaprojektowane z przynajmniej dwóch różnych lub wyjściowych białek, które są korzystnie homologiczne ze sobą. Na przykład, korzystne hybrydowe proteazy lub fuzyjne białko może mieć N-koniec białka i C-koniec homologicznego białka. W korzystnym rozwiązaniu, dwa końce mogą być połączone tak aby odpowiadały aktywnemu białku o pełnej długości. W korzystnym rozwiązaniu, homologi mają takie same zasadnicze podobieństwa, ale nie mają identycznych epitopów rozpoznawanych przez limfocyty T. Dlatego, w jednym rozwiązaniu, na przykład, proteaza mająca przynajmniej jeden epitop rozpoznawany przez limfocyty T na końcu C może mieć koniec C zastąpiony homologicznym końcem C mającym epitop mniej skutecznie rozpoznawany przez limfocyt T z końca C, mniej epitopów rozpoznawanych przez limfocyty T lub brak epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T na końcu C. Zatem, osoba biegła w zrozumie, że dzięki temu, że jest w stanie zidentyfikować epitopy rozpoznawane przez limfocyty T pomiędzy homologami, można utworzyć wiele odmian wytwarzających różne odpowiedzi immunologiczne. Ponadto, zrozumiałe jest, że części wewnętrzne, i więcej niż jeden homolog może być stosowany do wytwarzania odmiany według wynalazku.

Przykładowa hybryda obejmuje hybrydę proteazy skonstruowaną znanymi technikami inżynierii białek. Hybrydę skonstruowano tak, aby wysoce uczulające sekwencje aminokwasowe białka były zastąpione odpowiadającą im sekwencją z mniej uczulających homologów. W tym celu, pierwsze 122 aminokwasy proteazy pochodziły z GG36 a pozostała sekwencja aminokwasowa pochodziła z BPN'.

PL 210 859 B1

Odmiany według wynalazku obejmują dojrzałe formy odmian białka, jak i formy pro- i preprotych odmian białka. Formy prepro- są korzystnymi konstrukcjami, gdyż to ułatwia ekspresję, wydzielanie i dojrzewanie odmian białka.

Prosekwencja oznacza sekwencję aminokwasową związaną z N-końcem dojrzałej formy białka. Usunięcie tej sekwencji prowadzi do wystąpienia „dojrzałej formy białek. Odkryto wiele proteolitycznych enzymów będących produktami translacyjnych proenzymów i, bez obróbki po-translacyjnej, ulegają one ekspresji w ten sposób. Korzystna prosekwencja do wytwarzania odmian białka takich jak odmiany proteaz jest prosekwencja subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens, jednak mogą być stosowane inne prosekwencje.

„Sekwencja sygnałowa lub „presekwencja oznacza dowolną sekwencję aminokwasową związaną z N-końcem białka lub z N-końcem probiałka, która może uczestniczyć w wydzielaniu dojrzałego białka lub form probiałek. Definicja dojrzałej sygnałowej sekwencji jest funkcjonalna, i obejmuje wszystkie te sekwencje aminokwasowe kodowane przez przez gen kodujący N-końcową część białka, które biorą udział w wydzielaniu białka w warunkach natywnych. Obecny wynalazek wykorzystuje takie sekwencje aby uzyskać wydzielanie odmian białka jak zdefiniowano w opisie. Jedna z możliwych sekwencji sygnałowych zawiera pierwsze siedem reszt aminokwasowych sekwencji sygnałowej subtylizyny z Bacillus subtilis połączonej z pozostałą sekwencją sygnałową subtylizyny z Bacillus lentus (ATCC 21536).

Postać prepro odmiany białka składa się z dojrzałej formy białka mającej prosekwencję funkcjonalnie związaną z końcem aminowym białka i pre lub „sygnałową sekwencję funkcjonalnie związaną z końcem aminowym prosekwencji.

Wektor ekspresyjny odnosi się do konstruktu DNA zawierającego sekwencję DNA, która jest funkcjonalnie związana z odpowiednią kontrolną sekwencją zdolną do przeprowadzenia ekspresji z tych DNA w odpowiednim gospodarzu. Takie kontrolne sekwencje obejmują promotor w celu uzyskania transkrypcji, ewentualnie operatorową sekwencję do kontroli tej transkrypcji, sekwencję kodującą odpowiednie rybosomowe miejsca wiązania mRNA i sekwencje, które kontrolują terminację transkrypcji i translację. Wektorem może być plazmid, cząsteczka faga, lub po prostu skuteczny genomowy insert. Po transformowaniu odpowiedniego gospodarza, wektor może się namnażać i funkcjonować niezależnie do genomu gospodarza, lub może, w pewnych przypadkach, ulec integracji z samym genomem. W opisie, plazmid i wektor są czasami stosowane wymiennie jako, że plazmid jest obecnie najczęściej stosowaną postacią wektora. Jednakże wynalazek ma obejmować także inne postacie wektorów ekspresyjnych o równoważnej funkcji, znane w stanie techniki.

Komórki gospodarza oznaczają według wynalazku prokariotyczne lub eukariotyczne organizmy, które korzystnie zostały poddane obróbce sposobami ujawnionymi w opisie patentowym US Nr 4, 760, 025 (RE 34,606), aby uczynić je niezdolnymi do wydzielania enzymatycznie aktywnej endoproteazy. Korzystna komórka gospodarza do prowadzenia ekspresji białka jest szczepem Bacillus BG2036 który jest pozbawiony enzymatycznie aktywnego obojętnego białka i proteazy alkalicznej (subtylizyna). Konstrukcja szczepu BG2036 została opisana w szczegółach) w opisie patentowym US Nr 5,264,366. Inne komórki gospodarza do prowadzenia ekspresji białka obejmują Bacillus subtilis 1168 (również opisane w opisie patentowym US Nr 4,760,025 (RE 34,606) i w US Nr 5,264,366), jak i dowolny odpowiedni szczep Bacillus taki jak B. licheniformis, B. lentus, itp.

Komórki gospodarza są transformowane lub transfekowane wektorami skonstruowanymi stosując techniki zrekombinowanego DNA. Techniki te mogą być znalezione w dowolnym podręczniku biologii molekularnej, na przykład, Sambrook i wsp. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (wyd. 2) tom 1-3, Cold Springs Harbor Publishing (1989) (Sambrook) i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp. (eds.), Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., (1997 Supplement) (Ausubel). Takie transformowane komórki gospodarza są zdolne zarówno do replikacji wektorów kodujących odmiany białka jak i prowadzenia ekspresji żądanej odmiany białka. W przypadku wektorów, które kodują formę pre- lub prepro- odmiany białka, formy te są typowo wydzielane z komórki gospodarza do pożywki komórki gospodarza.

Funkcjonalnie związane, opisując związek pomiędzy dwoma regionami DNA, po prostu oznacza że są one połączone funkcjonalnie ze sobą. Na przykład, presekwencja jest funkcjonalnie związana z peptydem, jeśli działa ona jako sygnałowa sekwencja, biorąc udział w wydzielaniu dojrzałej formy białka najprawdopodobniej obejmującej odcięcie sygnałowej sekwencji. Promotor jest funkcjonalnie związany z sekwencją kodującą jeśli kontroluje transkrypcję sekwencji; rybosomowe miejsce wiązaPL 210 859 B1 nia jest funkcjonalnie związane z sekwencją kodującą jeśli jest ona zlokalizowana tak, że umożliwia translację.

Geny kodujące naturalnie występujące prekursorowe białko mogą być otrzymane zgodnie z ogólnymi sposobami znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Sposoby ogólnie zawierają syntezę znakowanych sond mające próbne sekwencje kodujące regiony białka według wynalazku, przygotowując biblioteki genomowe od organizmów prowadzących ekspresję białka i badanie przesiewowe bibliotek genu według wynalazku przez hybrydyzację z sondami. Klony o pozytywnej hybrydyzacji są następnie mapowane i sekwencjonowane.

Gen kodujący białko jest zligowany z odpowiednim plazmidem ekspresyjnym. Sklonowany gen kodujący białko jest następnie stosowany do transformacji lub transfekcji komórki gospodarza w celu prowadzenia ekspresji gen kodujący białko. Plazmid ten może ulegać replikacji w gospodarzach w takim sensie, że zawiera on dobrze znane elementy konieczne do replikacji plazmidu lub plazmid może być zaprojektowany aby integrował się z chromosomami gospodarza. Konieczne elementy będą dostarczone do skutecznej ekspresji genu np., promotor funkcjonalnie związany z przedmiotowym genem (które mogą być dostarczone jako homologiczny promotor tego genu, jeśli jest on rozpoznawany, to jest, ulega transkrypcji, przez gospodarza), terminator transkrypcji (poliadenylacji region w eukariotycznych komórkach gospodarza) który jest egzogenny lub jest dostarczony przez endogenny terminatorowy region genu kodującego białko i, jeśli to jest pożądane, marker selekcyjny taki jak gen oporności na antybiotyki, która umożliwia stałe utrzymanie hodowli w zakażonych plazmidem komórkach gospodarza przez wzrost w pożywkach zawierających antybiotyki.

W jednym rozwią zaniu, gen moż e być naturalnym genem takim jak gen z B. lentus lub B. amyloliquefaciens. W innym rozwiązaniu, syntetyczny gen kodujący naturalnie występujące białko lub zmutowane prekursorowe białko mogą być wytwarzane. W takim podejściu, DNA i/lub sekwencja aminokwasowa białka prekursorowego jest określona. Wielokrotne, zachodzące na siebie syntetyczne jednoniciowe fragmenty DNA są poniżej zsyntetyzowane, które po hybrydyzacji i ligacji wytwarzają syntetyczny DNA kodujący prekursorowe białko. Przykład konstrukcji syntetycznego genu przedstawiono w przykładzie 3 opisu patentowego US Nr 5,204,015, ujawnienie którego jest włączone w opisie jako odnośnik.

Gdy naturalnie występujący lub syntetyczny gen kodujący prekursor białka zostanie sklonowany, pewna ilość modyfikacji jest zapewniona, aby wzmacniać zastosowanie genu poza syntezą naturalnie występującego prekursorowego białka. Takie modyfikacje obejmują produkcję zrekombinowanego białka jak ujawniono w opisie patentowym US Nr 4,760,025 (RE 34,606) i publikacji EPO Nr 0 251 446 i produkcję odmian białka opisanych w obecnym opisie.

Odmiany białka mogą być przeprowadzone z zastosowaniem wielu różnych technik mutagenezy dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie. Techniki te mogą być znalezione w dowolnym podręczniku do praktycznej biologii molekularnej, na przykład, Sambrook i wsp., Molecuar Cloning-A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor, lub Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp. Green Publishing Associates Inc. i John Wiley & Sons. Zestawy do mutagenezy są również dostępne z wielu komercyjnych źródeł biologii molekularnej. Sposoby są dostępne, aby wytworzyć specyficzne podstawienia przy zdefiniowanych aminokwasach (skierowanych punktowo), specyficzne lub losowe mutacje w zlokalizowanym regionie genu (regiono-specyficzne) lub losowe mutacje w całym genie (mutageneza nasycenia). Skierowana punktowo mutageneza jednoniciowego DNA lub dwuniciowego DNA stosując PCR, mutagenezę kasetową, syntezę genową, skłonny do błędów PCR, i chemiczną mutagenezę nasycenia są wszystkimi technikami, które osoba moż e użyć aby wytworzyć żądaną odmianę białka. Po wytworzeniu odmian, mogą one być przeszukiwane pod kątem żądanej właściwości (zmienionej, np., wysokiej lub zwiększonej; lub niskiej lub obniżonej odpowiedzi immunologicznej, zwiększonej termicznej stabilności lub stabilności w warunkach alkalicznych, itp.).

W jednym aspekcie wynalazku, przedmiotem jest zabezpieczenie odmiany biał ka mają cej potencjał zmienionej odpowiedzi immunologicznej w porównaniu do prekursorowego białka. Podczas gdy obecny wynalazek jest użyteczny do uzyskania niższej odpowiedzi immunologicznej, mutacje wyszczególnione w opisie mogą być wykorzystane w połączeniu z mutacjami znanymi w stanie techniki, aby otrzymać zmienioną stabilność termiczną i/lub zmienioną specyficzność substratową, zmodyfikowaną aktywność, ulepszoną specyficzną aktywność lub zmienioną stabilność w warunkach alkalicznych w porównaniu do prekursora.

Zgodnie z powyższym, obecny wynalazek obejmuje zmianę zdolności epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T, który obejmuje reszty w pozycjach 109-123 w B. amyloliquefaciens aby indukować

PL 210 859 B1 proliferację limfocytów T. Ponadto, obecny wynalazek obejmuje zmianę zdolności epitopu rozpoznawanego przez limfocyty T, które obejmuje reszty w pozycjach 70-84 w B. amyloliquefaciens, aby indukować proliferację limfocytów T. Inne korzystne rozwiązanie według wynalazku zawiera utworzenie modyfikacji i w jednej lub obu pozycjach 79 i 122. Inne rozwiązanie według wynalazku zawiera wytwarzanie modyfikacji w jednej lub obu pozycjach 76 i 122. Nadal inne rozwiązanie zawiera modyfikacje w pozycjach 76, 79 i 122. W połączeniu z obecnie ujawnioną mutacją (ami) w regionie odpowiadającym resztom aminokwasowym 109-123 i/lub 70-84, obecny wynalazek również rozważa mutację (np., podstawienie) w pozycji 76, opcjonalnie w połączeniu z przynajmniej jednym podstawieniem wybranym z grupy obejmującej pozycje odpowiadające resztom 3, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206, i/lub 217.

Rozwiązania według wynalazku rozważają specyficzne połączenia podstawionych reszt odpowiadających resztom w pozycjach 79-122-217, 76-122-217, i 76-79-122217, opcjonalnie w połączeniu z przynajmniej jednym podstawieniem w proteazie równoważ nej do tej wybranej z grupy obejmują cej pozycje odpowiadające resztom: 3, 76, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206, i/lub 217 subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Inne rozwiązania obejmują dalsze dodatkowe podstawienia w przynajmniej jednej pozycji w tej proteazie równoważnej do tej wybranej z grupy obejmującej 216, 181, 101, 215, 216, 217, 247, 46, 154, 128, 182, 101, 104, 107, 250, 254, 258, 50, 47, 48, 182, 183, 185, 248 i 262 z Bacillus amyloliquefaciens. Takie mutacje mogą być stosowane, oprócz obniż ania mocy uczulającej odmiany białka według wynalazku, modulują całkowitą stabilność i/lub proteolityczną aktywność enzymu.

Bardziej szczegółowo, specyficzne podstawienia obejmują N76D, 179T, I79A, I122A i konserwatywne jej podstawienia. Inne rozwiązania wynalazku rozważają specyficzne połączenia podstawionej reszty odpowiadającej resztom w pozycjach; I79A-I122A-Y217L, N76D-I122A-Y217L, i N76DI79A-I122A-Y217L, opcjonalnie wraz z przynajmniej jednym z poniższych podstawień: S3T; N76D; I31L; P40Q; D41A; I111V; V147P, I; N218S; Q206L; i/lub L217M. Opcjonalnie, dalsze podstawienie w przynajmniej jednej z pozycji odpowiadających resztom wybranym z grupy pozycji obejmują cej A216K, D181 G, S101V, G215A, A216E, Y217S, R247Y, R247S, R247Q, G46S, S101Q, S154G, G128S, S182T, S101R, Y104W, 1107V, L250G, T254G, T254A, G258S, M50A, G47S, A48G, S182R, S183R, Q185A, S101 R, S248G, i Y262F.

Zestawy połączeń rozważane przez twórców obejmują, między innymi BPN'-Y217L/79A; BPN'-Y21 7L/79A/I122A; BPN'-Y217UN76D/I122A; BPN'-Y217L/N76D/I79A/I122A i BPN'-Y217L/N76D. Dodatkowe zestawy połączeń rozważane przez twórców obejmują, między innymi N76D/I79A/I122A/N218S; N76D/I79A/I122A/Q206L; N76D/I79A/11 22A/Q206U N21 8S; I79A/11 22A/Q206L; I79A/I122A/N218S; I79A/I122A/P40Q; I79A/I122A/D41A i I79A/I122A/H238Y. W jednym rozwiązaniu te ostatnie zestawy połączeń przeprowadzono w proteazie BPN'-Y217L. W innym rozwiązaniu, dodatkowe zestawy połączeń

P1-N76D/I79A/I122A/A216K; P1-N76D/I79A/I122A/D181G; P1-N76D/I79A/I122A/S101V;

P1-N76D/I79A/I122A/G215A; P1-N76D/I79A/I122A/A216E; P1-N76D/I79A/I122A/L217S; P1-N76D/I79A/I122A/R247Y; P1-N76D/I79A/I122A/R247S; P1-N76D/I79A/I122A/R247Q; P1-N76D/I79A/I122A/G46S; P1-N76D/I79A/I122A/S101Q/S154G; P1-N76D/I79A/I122A/G128S; P1-N76D/I79A/I122A/S182T; P1-N76D/I79A/I122A/S101R; P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V; P1-N76D/I79A/I122A/L250G; P1-N76D/l79A/l122A/T254G; P1-N76D/l79A/l122A/T254A; P1-N76D/I79A/I122A/G258S; P1-N76D/I79A/I122A/M50A; P1-N76D/I79A/I122A/G47S; P1-N76D/I79A/I122A/A48G; P1-N76D/I79A/I122A/S182R; P1-N76D/I79A/I122A/S183R; P1-N76D/I79A/I122A/Q185A; P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V; P1-N76D/I79A/I122A/S248G i P1 N76D/I79A/I122A/YA262F skonstruowano, gdzie P1 jest BPN'-Y217L.

Najkorzystniejsze rozwiązania według wynalazku obejmują poniższe specyficzne połączenia podstawionej reszty odpowiadającej resztom w pozycjach N76D-I122A-Y217L substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Te podstawienia są korzystnie przeprowadzone w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens (zrekombinowana lub typu natywnego), pomimo, że podstawienia mogą być przeprowadzone w dowolnym białku z Bacillus.

W oparciu o wyniki przeszukiwania otrzymane przy odmianachi biał ek, mutacje wymienione powyżej w subtylizynie z Bacillus amyloliquefaciens są ważne dla proteolitycznej aktywności, wydajności i/lub stabilności tych enzymów i wydajności czyszczenia lub mycia jak i innych zastosowaniach takich odmian enzymów.

Oprócz punktowych mutacji opisanych powyżej, fuzja dwóch homologicznych białek może również eliminować epitopy rozpoznawane przez limfocyty T. Jak przykładowo opisano poniżej, region białka w którym epitop rozpoznawany przez limfocyty T występuje może być zastąpiony tym samym

PL 210 859 B1 regionem w homologicznym białku, które nie zawiera epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T. Jak przykładowo opisano poniżej, fuzyjne białko jest wytworzone z proteazą z Bacillus lentus i jego homologiem z B. amyloliquefaciens tak aby otrzymane białko nie miało epitopu rozpoznawanego przez limfocyt T obecny w wyjściowej proteazie z S. lentus. Dowolna długość może być poddana fuzji do wyjściowego białka, z jedynego epitopu do większości białka, tak długiego aby żądana aktywność była utrzymana. Jednakże, nie jest konieczne, aby wyjściowy poziom aktywności był utrzymany. Ponieważ obniżone działanie uczulające białka, może być możliwe do użycia bardziej hybrydowe białko niż białko wyjściowe, aby uzyskać ten sam poziom aktywności.

Aktywność odmiany proteazy może być określona i porównana z proteazą przez badanie oddziaływania proteazy z różnymi komercyjnymi substratami, obejmującymi, nie ograniczając zakresu kazeinę, keratynę, elastynę, kolagen. Aktywność proteazy może być określona analizami znanymi w stanie techniki. Przykładowe testy określające aktywność proteazy obejmują, między innymi, test sukcynilo-Ala-Ala-Pro-Phe-para nitroanilidu (SAAPFpNA) (Delmar, NP., i wsp., Anal. Biochem. 94 (1979) 316-320; Achtstetter, Arch. Biochem. Biophys 207: 445-54 (1981)) i test soli sodowej 2,4,6-trinitrobenzenu sulfonianu (TNBS). W teście SAAPFpNA, proteazy tną wiązanie pomiędzy peptydem a p-nitroaniliną uzyskując widoczny żółty kolor absorbujący promieniowanie przy 405 nm. W metodzie reakcji kolorowej TNBS, pomiary testowe enzymatycznej hydrolizy substratu w polipeptydy zawierające wolne grupy aminowe. Te grupy aminowe oddziałują z TNBS aby utworzyć kompleks zabarwiony na żółto. Zatem im bardziej kolorowa reakcja, tym wyższa aktywność jest mierzona. Żółty kolor może być określony przez różne urządzenia lub spektrofotometry znane w stanie techniki.

Inne charakterystyki odmian proteazy mogą być określone sposobami znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Przykładowe właściwości obejmują, między innymi stabilność termiczną, stabilność w warunkach alkalicznych i stabilność poszczególnych proteaz względem różnych substratów lub roztworów buforów lub preparatów produktów.

Po połączeniu z testem na stabilność enzymów ujawniono procedurę w obecnym opisie, w której mutanty otrzymane przez losową mutagenezę zidentyfikowano pod kątem wykazywania bądź zwiększonej bądź obniżonej stabilności w warunkach alkalicznych lub stabilności termicznej podczas gdy utrzymywana jest aktywność enzymatyczna.

Stabilność w warunkach alkalicznych jest mierzona bądź przez znane procedury bądź przez sposoby opisane w obecnym opisie. Zasadnicza zmiana stabilności w warunkach alkalicznych jest wykazywana przez przynajmniej około 5% lub wyższe zwiększenie lub obniżenie (korzystnie zwiększenie) czasu półtrwania aktywności enzymatycznej mutanta w porównaniu prekursorowej karbonylowej hydrolazy. W przypadku subtylizyny, stabilność w warunkach alkalicznych może być zmierzona jako funkcja aktywności enzymatycznej subtylizyny przy różnym pH.

Stabilność termiczna jest mierzona bądź przez znane procedury bądź przez sposoby opisane w obecnym opisie. Zasadnicza zmiana stabilności termicznej jest wykazywana przez przynajmniej około 5% lub wyższe zwiększenie lub obniżenie (korzystnie zwiększenie) czasu półtrwania aktywności katalitycznej mutanta gdy jest on wystawiony na stosunkowo wysoką temperaturę i obojętne pH w porównaniu do prekursorowej karbonylowej hydrolazy. W przypadku subtylizyn, stabilność termiczna jest mierzona przez autoproteolityczną degradację subtylizyny przy podwyższonych temperaturach i różnym pH. Patrz Fig. 14 i 15.

Wiele odmian białka według wynalazku jest użytecznych do wytwarzania różnych detergentowych kompozycje. Pewna ilość znanych związków jest odpowiednimi środkami powierzchniowo czynnymi użytecznymi w kompozycjach zawierających zmutowane białka według wynalazku. Te związki obejmują niejonowe, anionowe, kationowe, anionowe lub amfoteryczne detergenty, jak ujawniono w opisie US nr 4,404,128, Barry J. Anderson i US 4,261,868, Jiri Flora, i wsp. Odpowiedni preparat detergentowy jest opisany w Przykładzie 7 w opisie patentowym US Nr 5,204,015 (wcześniej włączony jako odnośnik). Stan techniki jest zapoznany z różnymi preparatami, które mogą być stosowane jako kompozycje do mycia. Oprócz typowych kompozycji do mycia, jest łatwo zrozumiałe, że odmiany białka według wynalazku mogą być stosowane w dowolnym celu, w jakim natywne lub białka typu dzikiego są stosowane. Zatem, odmiany te mogą być stosowane, na przykład, w zastosowaniach do mydeł w płynie i mydeł w kostkach, do preparatów do mycia naczyń, zastosowaniach do czyszczenia powierzchni, roztwory lub produkty do mycia szkieł kontaktowych, peptydowej hydrolizy, traktowania śmieci, zastosowaniach tekstylnych, jako enzymy tnące białka fuzyjne w produkcji białek, itp. Odmiany wynalazku mogą zawierać, oprócz obniżonego działania uczulającego, zwiększoną wydajność w kompozycji detergentowej (w porównaniu do prekursora). Jak stosowano w obecnym opisie, zwięk18

PL 210 859 B1 szenie wydajności w detergencie jest zdefiniowane jako ulepszone czyszczenie pewnych wrażliwych na enzymy plam takich jak z trawy lub krwi, jak określono typowym oznaczeniem po standardowym cyklu czyszczenia.

Białka, szczegółowo proteazy według wynalazku mogą być utworzone w postaci preparatu w znane proszkowe i płynne detergenty mają ce pH pomiędzy 6,5 a 12,0 na poziomach od około 0,01 do około 5% (korzystnie 0,1 % do 0,5%) wagowo. Te kompozycje detergentowe do mycia mogą również obejmować inne enzymy takie jak znane proteazy, amylazy, celulazy, lipazy lub endoglikozydazy, jak i środki wypełniające i środki stabilizujące.

Dodanie białek, szczegółowo proteaz według wynalazku do tradycyjnych kompozycji do mycia nie tworzy żadnych specjalnych ograniczeń użycia. Innymi słowy, dowolna temperatura i pH odpowiednia do detergentów jest również odpowiednia do obecnej kompozycji, jeśli pH jest w powyżej podanym zakresie i temperatura jest poniżej temperatury denaturacji opisanego białka. Ponadto, białka według wynalazku mogą być stosowane w kompozycjach do mycia bez detergentów, znowu zarówno same jak i w połączeniu ze środkami wypełniającymi i środkami stabilizującymi.

Jeden aspekt według wynalazku stanowi kompozycja do traktowania tkanin, która obejmuje odmianę białka według wynalazku. Kompozycja może być stosowana do działania na jedwab na przykład, lub wełnę jak opisano w publikacjach takich jak RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359 i EP 344,259.

Odmiany mogą być przeszukiwane pod kątem proteolitycznej aktywności według sposobów dobrze znanych w stanie techniki. Korzystne odmiany proteaz obejmują wielokrotne podstawienia w pozycjach odpowiadających resztom 76,79,122 subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens.

Proteaza według wynalazku wykazuje zmodyfikowaną immunogenność w porównaniu do ich prekursorowego białka. W korzystnym rozwiązaniu, białka wykazują obniżone działanie uczulające. Osoba biegła w dziedzinie z łatwością rozpozna, że zastosowania proteazy według wynalazku będą określone, w dużej mierze, na podstawie immunologicznych właściwości białek. Na przykład, proteazy które wykazują obniżone działanie uczulające mogą być stosowane w kompozycjach do mycia. Kompozycje do mycia stanowią kompozycje, które mogą być stosowane aby usunąć niepożądane związki z podłoża, takiego jak tkanina, naczyń , szkieł kontaktowych, innych stałych podłóż, włosów (szampony), skóry (mydła i kremy), zęby (do przemywania ust, pasty do zębów) itp. Skuteczne ilości przynajmniej jednej odmiany proteaz opisane w opisie mogą być obecne w kompozycjach użytecznych do czyszczenia wielu różnych powierzchni, gdy potrzebne jest usuwanie plam białkowych. Takie kompozycje do mycia obejmują detergentowe kompozycje do czyszczenia, do mycia twardych powierzchni, nieograniczone co do postaci (np., płynne i granulowane); detergentowe kompozycje do czyszczenia tkanin, nieograniczone co do postaci (np., granulowane, płynne i preparaty stałe); kompozycje do mycia naczyń (nieograniczone co do postaci); kompozycja do mycia jamy ustnej, nieograniczone co do postaci (np., środki do czyszczenia zębów, pasty do zębów i preparaty do płukania jamy ustnej) i kompozycje do mycia protez zę bowych, nieograniczone co do postaci (np., pł yny, tabletki). Jak stosowano w obecnym opisie, skuteczna ilość odnosi się do ilości odmiany proteaz koniecznej do osiągnięcia aktywności enzymatycznej koniecznej w specyficznej kompozycji do mycia. Takie skuteczne ilości mogą być z łatwością wyznaczone przez specjalistę o typowej wiedzy w dziedzinie i prowadzi się w oparciu o wiele czynników jak poszczególne stosowane odmiany enzymów, zastosowania do czyszczenia, specyficzne kompozycje kompozycji do mycia, ze względu na to czy płynne czy suche (np., granulowane, kostki) kompozycje są wymagane i tym podobne.

Skuteczna ilość przynajmniej jednej odmiany proteaz opisanych w opisie może również być obecna w kompozycjach, które były nanoszone na keratynowe tworzywa takie jak paznokcie i włosy, obejmujące nie ograniczając zakresu, te użyteczne jako aerozolowe kompozycje do włosów, mycie szamponem włosów i/lub kompozycje odżywcze, kompozycje naniesione w celu regulacji wzrostu włosów i kompozycje nanoszone na włosy i skórę włosów w celu traktowania łojotoku, zapalenia skóry, i/lub łupieżu.

Skuteczna ilość przynajmniej jednej odmiany proteaz opisanych w opisie może również być obecna w kompozycjach odpowiednich do zastosowania miejscowego na skórę lub włosy. Te kompozycje mogą być w postaci kremów, lotionów, żeli, i tym podobne, i mogą być utworzone w postaci preparatu jako wodne kompozycje lub mogą być utworzone w postaci preparatu jako emulsje przynajmniej jednej fazy olejowej w wodnej stałej fazie.

Na przykład, kompozycja do pielęgnacji skóry może obejmować odmiany proteazy jak opisano powyżej zawierające epitop rozpoznawany przez limfocyty T, w których ta odmiana różni się od tej

PL 210 859 B1 proteazy posiadającej zmieniony epitop rozpoznawany przez limfocyty T tak, że ta odmiana i ta proteaza wytwarzają różne odpowiedzi immunologiczne u człowieka. Odmiana proteazy może obejmować podstawienie aminokwasowe wybrane z grupy obejmującej reszty odpowiadające resztom 76, 79 i 122 substylizyny z Bacillus amyloliquefaciens; środki utrzymujące wilgoć; aktywne substancje do pielęgnacji skóry; środki powierzchniowo czynne; środki zmiękczające skórę; polimeryczne środki zagęszczające i silikon.

Aktywna substancja do pielęgnacji skóry

Kompozycje w opisie mogą zawierać aktywną substancję do pielęgnacji skóry na poziomie od około 0,1% do około 20%, korzystnie od około 1% do około 10%, korzystniej od około 2% do około 8%, wagowo. Nieograniczające przykłady odpowiedniej aktywnej substancji do pielęgnacji skóry do stosowania w opisie obejmują składnik witaminy B3, pantenol, witaminę E, octan witaminy E, retinol, propionian retinylu, palmitynian retinylu, kwas retinolowy, witaminę C, teobrominę, kwas α-hydroksylowy, farnezol, fitantriol, kwas salicylowy, palmitylo peptapeptyd-3 i ich mieszaniny.

Związek 83

Jak stosowano w obecnym opisie, związek witaminy B3 oznacza związek mający wzór:

w którym R oznacza -CONH2 (to jest, niacynamid), -COOH (to jest, kwas nicotynowy) lub -CH2OH (to jest, alkohol nikotynylowy); ich pochodne i sole każdego z powyższych. Przykładowe pochodne powyższego związku witaminy B3 obejmują estry kwasu nikotynowego, obejmujące nierozszerzające naczynia krwionośne estry kwasu nikotynowego, nikotynylowe aminokwasy, alkohole nikotynylowe estrów kwasów karboksylowych, N-tlenek kwasu nikotynowego i N-tlenek niacynamidu.

Odpowiednie estry kwasu nikotynowego obejmują estry kwasu nikotynowego C1-C22, korzystnie C1-C16, korzystniej C1-C6 alkoholi. Alkohole są odpowiednio o prostych łańcuchach lub o rozgałęzionych łańcuchach, cykliczne lub cykliczne, nasycone lub nienasycone (obejmujące aromatyczne) i podstawione lub niepodstawione. Estry są korzystnie nierozszerzające naczynia krwionośne. Jak stosowano w obecnym opisie, nierozszerzające naczynia krwionośne oznacza, że ester typowo nie prowadzi do widocznej odpowiedzi rumienienia się po nałożeni na skórę w przedmiotowych kompozycjach (większa część ogólnej populacji nie będzie doświadczać odpowiedzi widocznego rumienienia się, pomimo, że takie związki mogą powodować rozszerzanie naczyń krwionośnych nie widoczne dla nieuzbrojonego oka). Nie-rozszerzające naczynia krwionośne estry kwasu nikotynowego obejmują nikotionian tokoferolu i heksanikotionian inozytolu; nikotionian tokoferolu jest korzystny. Bardziej kompletny związków witaminy B3 przedstawiono w opisie WO 98/22085. Korzystne związki witaminy B3 związki są niacynamid i nikotionian tokoferolu.

Retinoidy

Inną odpowiednią aktywną substancją do pielęgnacji skóry jest retinoid. Jak stosowano w obecnym opisie, retinoid obejmuje wszystkie naturalne i/lub syntetyczne analogi witaminy A lub związki typu retinolu które mają biologiczną aktywność witaminy A w skórze jak i geometryczne izomery i stereoizomery tych związków. Gdy retinoid jest obecny w kompozycji w obecnym opisie, będzie on typowo zawierać od lub około 0,005% do lub około 2%, korzystniej 0,01% do około 2% retinoidu. Retinol jest korzystnie stosowany w ilości od lub około 0,01% do lub około 0,15%; estry retlnolu są korzystnie stosowane w ilości od około 0,01% do około 2% (np., około 1%).

Retinoidem jest korzystnie retinol, estry retinolu (np., C2-C22 alkilo estry retinolu, obejmujące palmitynian retinylu, octan retinylu, propionian retinylu), retinal, i/lub kwas retinolowy (obejmujące całytrans kwas retinolowy i/lub 13-cis-kwas retinolowy), korzystniej retinoidy inne niż kwas retinolowy. Te związki są dobrze znane w stanie techniki i są dostępne na rynku z kilku źródeł, np., Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), i Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Korzystnymi retinoidami są are retinol, palmitynian retinylu, octan retinylu, propionian retinylu, retinal, kwas retinolowy i ich połączenia. Korzystniejsze są retinol, propionian retinylu, kwas retinolowy i palmitynian retinylu. Retinoid może być włączony jako zasadniczo czysty materiał, lub jako ekstrakt otrzymany przez odpowiednie fizyczne i/lub chemiczne wyodrębnienie z naturalnych (np., roślina) źródeł.

PL 210 859 B1

Nośnik

Kompozycje w opisie mogą zawierać bezpieczną i skuteczną ilość dermatologicznie dopuszczalnego nośnika, odpowiedniego do zastosowania miejscowego na skórę lub włosy, w których zasadnicze materiały i opcjonalnie inne materiały są włączone aby umożliwić dostarczenie na skórę lub włosy zasadniczych materiałów i opcjonalnych składników w odpowiednim stężeniu. Nośnik może zatem działać jako rozcieńczalnik, środek dyspergujący, rozpuszczalnik, i tym podobnym dla zasadniczych składników, który zapewnia, że mogą one być naniesione i równo rozmieszczane na wybranej powierzchni w odpowiednim stężeniu.

Rodzaj nośnika wykorzystanego w obecnym wynalazku zależy od rodzaju postaci produktu żądanego dla kompozycji. Nośniki mogą być stałe, pół-stałe lub płynne. Odpowiednie nośniki są płynne lub pół-stałe, takich jak kremy, lotiony, żele, pałeczki, maści, pasty i pianki. Korzystnie nośnik jest w postaci lotionu, kremu lub ż elu, korzystniej takiej postaci która ma dostateczn ą gę stość lub granicę plastyczności, aby zapobiegać sedymentacji cząsteczek. Nośnik może sam być obojętny lub może mieć dermatologiczne korzyści. Nośnik może być naniesiony bezpośrednio na skórę i/lub włosy, lub może być naniesiony przez tkaną lub nietkaną ścierkę lub szmatkę. Może on również być w postaci łaty, maski, lub opaski. Może on również być w postaci aerozolowej lub w inny sposób natryskiwany na skórę i/lub włosy. Nośnik powinien również być fizycznie i chemicznie kompatybilny z zasadniczymi składnikami opisanymi w obecnym opisie, i nie powinien nadmiernie osłabiać stabilność, skuteczność lub inne wykorzystywane korzyści związane z kompozycją według wynalazku.

Korzystne nośniki zawierają dermatologicznie dopuszczalny, hydrofilowy rozcieńczalnik. Odpowiednie hydrofilowe rozcieńczalniki obejmują wodę, organiczne hydrofilowe rozcieńczalniki takie jak C-C4 jednowodorotlenowe alkohole i o niskiej masie cząsteczkowej glikole i poliole, obejmujące glikol propylenowy, glikol polietylenowy (np. o masie cząsteczkowej 200-600), glikol polipropylenowy (np. o masie cząsteczkowej 4252025), glicerol, glikol butylenowy, 1,2,4-butanetriol, estry sorbitolu, 1,2,6-heksametriol, etanol, izo-propanol, estry sorbitolu, etery etoksylowane, propoksylowane etery i ich połączenia. Rozcień czalnik jest korzystnie płyny. Woda jest korzystnym rozcieńczalnikiem. Kompozycja korzystnie zawiera przynajmniej około 20% hydrofilowego rozcieńczalnika.

Odpowiednie nośniki mogą również zawierać emulsje zawierające hydrofilową fazę, zwłaszcza wodną fazę i hydrofobową fazę np., lipid, olej lub materiał oleisty. Jak dobrze wiadomo osobie biegłej w dziedzinie, hydrofilowa faza zostanie zdyspergowana w hydrofobowej fazie, lub vice versa, aby utworzyć odpowiednio hydrofilową lub hydrofobową fazę rozproszoną i stałe fazy, zależnie od składników kompozycji. W technologii emulsyjnej, określenie faza zdyspergowana/rozproszona jest terminem dobrze znanym osobie biegłej w dziedzinie, co oznacza że faza występuje w postaci małych cząstek lub kropelek, które zawieszono w i są otoczone przez stałą fazę. Faza zdyspergowana jest również znana jako wewnętrzna lub nieciągła faza. Emulsja może być lub zawierać (np., w potrójnej lub innej wielofazowej emulsji) emulsję olej w wodzie lub emulsję woda-w-oleju taką jak emulsja woda-w-silikonie. Emulsje olej w wodzie typowo zawierają od około 1% do około 60% (korzystnie około 1 % do około 30%) zdyspergowanej hydrofobowej fazy i od około 1% do około 99% (korzystnie od około 40% do około 90%) stałej hydrofilowej fazy; emulsje woda-w-oleju typowo zawierają od około 1% do około 98% (korzystnie od około 40% do około 90%) zdyspergowanej hydrofilowej fazy i od około 1% do około 50% (korzystnie około 1% do około 30%) stałej hydrofobowej fazy.

Środki utrzymujące wilgoć

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać środki utrzymujące wilgoć które są korzystnie obecne na poziomie od około 0,01% do około 20%, korzystniej od około 0,1% do około 15% i zwłaszcza od około 0,5% do około 10%. Korzystne środki utrzymujące wilgoć obejmują, między innymi, związki wybrane z wielowodorotlenowych alkoholi, mocznika, D lub DL pantenolu, pantoteinianu wapnia, mleczka pszczelego, pantetiny, pantoteiny, pantenylo etylo eteru, kwasu pangamowego, pirydoksyny, kompleksu pantoilo laktoza witamina B, heksano-1,2,6,-trioli, guanidydyny lub jej pochodnych i ich mieszaniny.

Odpowiednie wielowodorotlenowe alkohole do stosowania w opisie obejmują polialkileno glikole i korzystniej alkileno poliole i ich pochodne, obejmują cych glikol propylenowy, diglikol propylenowy, glikol polipropylenowy, glikol polietylenowy i pochodne thereof, sorbitol, hydroksypropyl sorbitol, erythritol, treitol, pentaerytritol, ksylitol, glucitol, manitol, heksyleno glikol, glikol butylenowy (np., 1,3-butyleno glikol), heksano triol (np., 1,2,6-heksanotriol), trimetylolo propan, neopentylo glikol, glicerynę, etoksylowaną glicerynę, propano-1,3 diol, propoksylowaną glicerynę i ich mieszaniny. Alkoksylowane pochodne dowolnego z powyżej wymienionych wielowodorotlenowych alkoholi są również odPL 210 859 B1 powiednie do stosowania w obecnym opisie. Korzystne wielowodorotlenowe alkohole wynalazku są wybrane z grupy obejmującej glicerynę, glikol butylenowy, glikol propylenowy, diglikol propylenowy, glikol polietylenowy, heksano triol, etoksylowaną glicerynę i propoksylowaną glicerynę, i ich mieszaniny.

Odpowiednie środki utrzymujące wilgoć użyteczne w opisie stanowią 2-pirolidono-5-karboksylan sodu (NaPCA), guanidyna; kwas glikolowy i glikolanowe sole (np. amon i czwartorzędowe alkiloamon); kwas mlekowy i mlekowe sole (np. amon i czwartorzędowy alkilo amon); żywica aloesowa w dowolnej z jej wielu postaci (np., ż el z żywicy aloesowej); kwas hialuronowy i jego pochodne (np. pochodne sole takie jak hialuronian sodu); amid kwasu mlekowego monoetanolaminy; acetamid monoetanolaminy; mocznik; pantenol i ich pochodne i mieszaniny tych związków.

Przynajmniej część (do około 5% wagowo kompozycji) środka utrzymującego wilgoć może być włączone w postaci domieszki z w postaci lotnej cząstek stałych usieciowanego hydrofobowego akrylanu lub metakrylanu kopolimeru, samego korzystnie w ilości od około 0,1% do około 10%, która może być dodana do wodnej lub rozproszonej. Ten kopolimer jest szczególnie wartościowy do obniżania błyszczenia skóry i kontrolowania oleju jednocześnie pomagając w dostarczaniu skutecznej korzyści nawilżania i jest opisany bardziej szczegółowo w opisie WO 96/03964, włączonym w opisie jako odnośnik.

Środki zmiękczające skórę

Rozwiązania emulsji olej w wodzie według wynalazku mogą zawierać od około 1% do około 20%, korzystnie od około 1,5% do około 15%, korzystniej od około 0,1% do około 8%, korzystniej od około 0,5% do około 5% dermatologicznie dopuszczalnych środków zmiękczających skórę. Środki zmiękczające skórę mają tendencję na natłuszczania skóry, zwiększają gładkość i sprężystość skóry, zapobiegają lub łagodzą suchość skóry, i/lub chronią skórę. Środki zmiękczające skórę są typowo niemieszalne z wodą, oleiste lub woskowate materiały i środki zmiękczające skórę o wysokich masach cząsteczkowych mogą nadawać lepkie właściwości miejscowej kompozycji. Duży wybór odpowiednich środków zmiękczających skórę jest znany i może być stosowany w obecnym opisie. Sagarin, Cosmetics. Science and Technology. 2nd Edition, tom. 1, str. 32-43 (1972), zawiera wiele przykładów materiałów odpowiednich jako środki zmiękczające skórę. Wszystkie środki zmiękczające skórę dyskutowane w zgłoszeniu WO 00/24372 powinny być uważane za odpowiednie do stosowania w obecnym wynalazku pomimo, że korzystne przykłady są zarysowane bardziej szczegółowo poniżej:

i) węglowodory o prostych i o rozgałęzionych łańcuchach mające od około 7 do około 40 atomów węgla, takie jak dodekan, skwalen, cholesterol, hydrogenowany poliizobutylen, izoheksadekan, izoeikozan, izooktaheksakontan, izoheksapentakontahektan i C7-C40 Izoparafiny, które C7-C40 rozgałęzionymi węglowodorami. Odpowiednie węglowodory o rozgałęzionych łańcuchach do stosowania w opisie są wybrane z izopentakontaoktaktan, petrolatum, i ich mieszaniny. Odpowiednie do stosowania w opisie są alifatyczne węglowodory o rozgałęzionych łańcuchach sprzedawane pod nazwą handlową Permetylo (RTM) i dostępne na rynku z Presperse Inc., P. O. Box 735, South Plainfield, N. J. 07080, U.S.A.

ii) C1-C30 alkoholowe estry kwasów C1-C30 karboksylowych, C12-15 alkilo benzoesany, i C2-C30 dikarboksylowych kwasów, np. izononylo izononanonian, izostearylo neopentanonian, izodecylo oktanonian, izodecylo izononanonian, tridecylo izononanonian, mirystylo oktanonian, oktylo pelargonian, oktylo izononanonian, mirystylo mirystynian, mirystylo neopentanonian, mirystylo oktanonian, izopropylo mirystynian, mirystylo propionian, izopropylo stearynian, izopropylo izostearynian, metylo izostearynian, behenylo behenian, dioktylo maleinian, diizopropylo adypinian i diizopropylo dilinoleian i ich mieszaniny.

iii) C1-C30 mono- i poli-estry cukrów, i podobne materiały. Te estry pochodzą z cukrowej lub poliolowej część cząsteczki i przynajmniej jednej części cząsteczek kwasu karboksylowego. Zależnie od składowego kwasu i cukru, estry te mogą być bądź płynnej bądź w stałej postaci w temperaturze pokojowej. Przykłady obejmują: tetraoleian glukozy, tetraestry galaktozy kwasu oleinowego, tetraoleian sorbitolu, tetraoleian sacharozy, pentaoleian sacharozy, heksaoleian sacharozy, heptaoleian sacharozy, oktaoleian sacharozy, heksaester sorbitolu, w którym części cząsteczek kwasu karboksylowego w estrze stanowią palmitoleian i arachidanian w stosunku molowym 1: 2, i oktaester sacharozy, w którym esteryfikowane części cząsteczek kwasu karboksylowego są laurynian, linoleian i behenian w stosunku molowym 1: 3: 4. Inne materiał y obejmują estry kwasów tł uszczowych sacharozy z oleju z nasion baweł ny lub oleju z soi. Inne przykł ady takich materiał ów opisano w publikacji WO 96/16636, włączonej jako odnośnik w obecnym opisie. Szczególnie korzystny materiał jest znany pod nazwą INCI sacharoza polibawełnian (polycottonseedate).

PL 210 859 B1 iv) Oleje roślinne i hydrogenowane oleje roślinne. Przykłady olejów roślinnych i hydrogenowanych olejów roślinnych obejmują olej z szafranu barwierskiego, olej z orzecha kokosowego, olej z nasion baweł ny, olej ze ś ledzia (menhaden), olej z nasion palmy, olej palmowy, olej z orzeszków ziemnych, olej z soi, olej rzepakowy, olej z siemienia lnianego, olej z otrębów ryżowych, olej z pinii, olej sezamowy, olej słonecznikowy, częściowo i całkowicie hydrogenowane oleje z powyższych źródeł, i ich mieszaniny

v) Rozpuszczalne lub koloidalnie-rozpuszczalne środki nawilżające. Przykłady obejmują kwas hilaronowy i szczepione na skrobi poliakrylany sodu takie jak Sanwet (RTM) IM-1000, IM-1500 i IM2500 są dostępne z Celine Superabsorbent Materials, Portsmith, VA, USA i opisane w USA-A-4,076,663.

Korzystne środki zmiękczające skórę do stosowania w opisie obejmują izoheksadekan, izooktakontan, petrolatum, izononylo izononanonian, izodecylo oktanonian, izodecylo izononanonian, tridecylo izononanonian, mirystylo oktanonian, oktylo izononanonian, mirystylo mirystynian, metylo izostearynian, izopropyle izostearynian, C12-15 alkilo benzoesany i ich mieszaniny. Szczególnie korzystne środki zmiękczające skórę do stosowania w opisie stanowią izoheksadekan, izononylo izononanonian, metylo izostearynian, izopropylo izostearynian, petrolatum, lub mieszaniny tych związków.

Środki emulgujące/Środki powierzchniowo czynne

Kompozycje w opisie mogą zawierać środek emulgujący i/lub środek powierzchniowo czynny, ogólnie aby wspomóc rozproszenie i zawieszenie rozproszonej fazy w stałej wodnej fazie. Środek powierzchniowo czynny może również być użyteczny jeśli produkt jest przeznaczony do czyszczenia skóry. Dla wygody w opisie środki emulgujące będą umieszczone pod określeniem „środki powierzchniowo czynne”, zatem „środek(ki) powierzchniowo czynny(e)” będą stosowane jako odnośniki do powierzchniowo czynnych środków czy stosowane jako środki emulgujące czy jako inne środki powierzchniowo czynne w celach takich jak oczyszczania skóry. Znane lub tradycyjne środki powierzchniowo czynne mogą być stosowane w kompozycji, pod warunkiem, że wybrany środek jest chemicznie i fizycznie kompatybilny z zasadniczymi składnikami kompozycji i dostarczają żądane właściwości. Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują nie pochodzące od silikonu materiały, i ich mieszaniny, wszystkie środki powierzchniowo czynne dyskutowane w zgłoszeniu WO 00/24372 powinny być uważane za odpowiednie do stosowania w obecnym wynalazku.

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać od około 0,05% do około 15% środka powierzchniowo czynnego lub mieszaniny środków powierzchniowo czynnych. Dokładny środek powierzchniowo czynny lub mieszanina środków powierzchniowo czynnych wybranych będzie zależeć od pH kompozycji i innych składników obecnych.

Pomiędzy niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi, które są użyteczne w opisie są to te, które mogą być szeroko zdefiniowane jako produkty kondensacji długołańcuchowych alkoholi, np. C8-30 alkohole, z cukrowymi lub skrobiowymi polimerami to jest glikozydami. Inne użyteczne niejonowe środki powierzchniowo czynne obejmują produkty kondensacji alkilenowe tlenki z kwasami tłuszczowymi (to jest estry tlenku alkilenowego z kwasami tłuszczowymi). Te materiały mają ogólny wzór RCO(X)nOH, w którym R oznacza grupę C10-30 alkilową, X oznacza -OCH2CH2- (to jest pochodząca z etylenowego glikolu lub tlenku) lub -OCH2CHCH3- (to jest pochodzący z glikolu propylenowego lub tlenku), i n oznacza liczbę od około 6 do około 200. Inne niejonowe środki powierzchniowo czynne są produktami kondensacji tlenków alkilenu z 2 molami kwasów tłuszczowych (to jest diestry tlenku alkilenu z kwasami tłuszczowymi). Te materiały mają ogólny wzór RCO(X)nOOCR, w którym R oznacza grupę C10-30 alkilową, X oznacza -OCH2CH2- (to jest pochodząca z etylenowego glikolu lub tlenku) lub -OCH2CHCH3- (to jest pochodząca z etylenowego glikolu lub tlenku), i n oznacza liczbę od około 6 do około 100. Środek emulgujący do stosowania w opisie jest korzystniej mieszaniną estrów kwasów tłuszczowych w oparciu o mieszaninę estru kwasu tłuszczowego sorbitanu i estru kwasu tłuszczowego sacharozy, zwłaszcza mieszanina stearynianu sorbitonu i kokoinianu sacharozy. Są one dostępne na rynku z ICI pod nazwą handlową Arlatone 2121. Nawet również odpowiednie przykłady obejmują mieszaninę cetearylowych alkoholi, cetearylo glukozydów, takich jak te dostępne pod nazwą handlową Montanov 68 z Seppic i Emulgade PL68/50 są dostępne z Henkel.

Hydrofilowe środki powierzchniowo czynne użyteczne w opisie mogą w innym rozwiązaniu lub dodatkowo obejmować dowolny duży wybór kationowych, anionowych, amfeterycznych, i amfoterycznych środków powierzchniowo czynnych, takich jak znane w stanie techniki. Patrz np., McCutcheon's, Detergents D and Emulgators, North American Edition (1986), opublikowana w przez Allured Publishing Corporation; Opis patentowy U.S. Nr 5,011,681, Ciotti i wsp., wystawiony 30 kwietnia 1991; Opis

PL 210 859 B1 patentowy U.S. Nr 4,421,769, Dixon i wsp., wystawiony 20 grudnia 1983 i Opis patentowy U.S. Nr 3,755,560, Dickert i wsp., wystawiony 28 sierpnia 1973. Duży wybór anionowych środków powierzchniowo czynnych jest również użyteczny w obecnym opisie. Patrz np., opis patentowy U. S. Nr 3,929,678, Laughlin i wsp., wystawiony 30 grudnia 1975.

Duży wybór anionowych środków powierzchniowo czynnych jest również użyteczny w obecnym opisie. Patrz np., Opis patentowy U.S. Nr 3,929,678, Laughiin i wsp., wystawiony 30 grudnia 1975. Przykładowe anionowe środki powierzchniowo czynne obejmują alkilo isetioniany (np., C12-C30), alkilo i alkilo etero siarczanów i ich sole, alkilo i alkilo etery fosforany i ich sole, alkilo metylo taurany (np., C12-C30), i mydła (np., sole metali alkalicznych, np., sole sodowe lub potasowe) kwasów tłuszczowych.

Amfoteryczne i dwubiegunowe środki powierzchniowo czynne są również użyteczne w obecnym opisie. Przykłady dwubiegunowych i amfoterycznych środków powierzchniowo czynnych, które mogą być stosowane w kompozycjach według wynalazku są to te, które są szeroko opisane jako pochodne alifatycznych drugorzędowych i trzeciorzędowych amin, w których alifatyczne rodniki mogą być o prostych lub o rozgałęzionych łańcuchach i w których jeden z alifatycznych podstawników zawiera od około 8 do około 22 atomów węgla (korzystnie C8-C18) i jeden zawiera anionową grupę rozpuszczalną w wodzie, np., karboksy, sulfonian, sulfat, fosforan, lub fosfonian. Przykłady obejmują alkilo imino acetaty, i iminodialkanoniany i aminoalkanoniany, imidazolinium i amonowe pochodne. Inne odpowiednie amfoteryczne i dwubiegunowe środki powierzchniowo czynne są wybrane z grupy obejmującej betainy, sultany, hydroksysultainy i rozgałęzione i nierozgałęzione alkanolo sarkozyniany i ich mieszaniny.

Pewne emulsje według wynalazku może obejmować zawierający silikon emulgator lub środek powierzchniowo czynny. Duży wybór silikonowych środków emulgujących jest użyteczny w obecnym opisie. Te silikonowe środki emulgujące są typowo organicznie zmodyfikowanymi organopolisiloksanami, również znane osobom biegłym w dziedzinie jako silikonowe środki powierzchniowo czynne. Użyteczne silikonowe środki emulgujące obejmują dimetikon kopoliole. Te materiały są polidimetylo siloksanami, które były zmodyfikowane, tak aby obejmowały polieterowe łańcuchy boczne, takie jak łańcuchy polietylenowe tlenków, łańcuchy polipropylenowe tlenku, mieszaniny tych łańcuchów i łańcuchy polieterów zawierające części cząsteczek pochodzące z obu, tlenku etylenu i tlenku propylenu. Inne przykłady obejmują alkilo-zmodyfikowane Dimetikon kopoliole, to jest, związki które zawierają C2-C30 grupy boczne łańcuchów. Nadal inne użyteczne Dimetikon kopoliole obejmują materiały mające różne kationowe, anionowe, dwubiegunowe i amfoteryczne grupy boczne części cząsteczek.

Polimeryczne środki zagęszczające

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać przynajmniej jedno polimeryczne środka zagęszczającego. Poiimeryczne środki zagęszczające użyteczne w opisie korzystnie mają pewną liczbę średniej masy cząsteczkowej wyższą niż 20,000, korzystniej wyższą niż 50,000 i zwłaszcza wyższą niż 100,000. Kompozycje według wynalazku mogą zawierać od około 0,01% do około 10%, korzystnie od około 0,1% do około 8% i korzystniej od około 0,5% do około 5% wagowo kompozycji polimerycznego środka zagęszczającego, lub mieszaniny tych związków.

Korzystne polimerowe środki zagęszczające do stosowania w opisie obejmują niejonowe środki zagęszczające i anionowe środki zagęszczające, lub mieszaniny tych związków. Odpowiednie niejonowe środki zagęszczające obejmują poliakrylamidowe polimery, usieciowane poli(N-winylopirolidony), polisacharydy, naturalne lub syntetyczne gumy, poliwinylopirolidony i poliwinyloalkohol. Odpowiednie anionowe środki zagęszczające obejmują kopolimery kwasu akrylowego/etylo akrylanu, karboksywinylo polimery i usieciowane kopolimery alkilo winyle eterów i bezwodnik maleinowy. Szczególnie korzystne środki zagęszczające do stosowania w opisie stanowią niejonowe poliakrylamidowe polimery takie jak poliakrylamid i Izoparafina i lauret-7, dostępne pod nazwą handlową Sepigel 305 z Seppic Corporation, i kopolimery kwas akrylowy/etylo akrylanu i karboksywinylo polimery sprzedawane przez B. F. Goodrich Company pod nazwą handlową żywicy Karbopol, lub mieszaniny tych związków. Odpowiednie żywice Karbopol mogą być hydrofobowe zmodyfikowane i inne odpowiednie żywice są opisane w opisie WO 98/22085, lub mieszaniny tych związków.

PL 210 859 B1

Olej silikonowy

Obecne kompozycje mogą zawierać, przynajmniej jedną fazę oleju silikonowego. Faza(y) oleju silikonowego ogólnie zawiera od około 0,1% do około 20%, korzystnie od około 0,5% do około 10%, korzystniej od około 0,5% do około 5%, kompozycji. Jedna lub każda faza olejów silikonowych korzystnie zawiera przynajmniej jeden składnik silikonowy.

Silikonowe składniki mogą być płynne, obejmując silikony o prostych łańcuchach, rozgałęzionych i cykliczne. Odpowiednie oleje silikonowe użyteczne w opisie obejmują silikony włącznie z olejem polialkilo siloksanu, olejem poliarylo siloksanu, cykliczne i liniowe polialkilosiloksany, polialkoksylowane silikony, amino i czwartorzędowe amonowe zmodyfikowane silikony, polialkiloarylo siloksan lub kopolimer polieteru siloksanu i ich mieszaniny. Oleje silikonowe mogą być lotne lub nielotne. Oleje silikonowe ogólnie mają wagowo średnie masy cząsteczkowej mniejsze niż około 200,000. Odpowiednie oleje silikonowe mają masy cząsteczkowe około 100,000 lub mniej, korzystnie około 50,000 lub mniej, korzystniej około 10,000 lub mniej. Korzystnie olej silikonowy jest wybrany z olejów silikonowych mających wagowo średnią masy cząsteczkowej w zakresie od około 100 do około 50,000 i korzystnie od około 200 do okoł o 40,000.

Typowo, oleje silikonowe mają lepkość w zakresie od około 0,65 do około 600 000 mm².s^-1, korzystnie od około 0,65 do około 10 000 mm².s^-1 przy 25°C. Lepkość może być zmierzona za pośrednictwem lepkościomierza ze szklaną kapilarą jak opisano w Dow Corning Corporate Test Metod CTM0004, 29 lipiec 1970. Odpowiednie polidimetylo siloksany, które mogą być stosowane w opisie obejmują te dostępne, na przykład, z General Electric Company jako serie SF i Viscasil (RTM) i z Dow Corning jako serie Dow Corning 200. Również użyteczne są zasadniczo nielotne polialkiloarylosiloksany, na przykład, polimetylofenylosiloksany, mające lepkości około 0,65 do 30,000 mm².s^-1 przy 25°C. Te siloksany są dostępne, na przykład, z General Electric Company jako SF 1075 olej metylo fenylowy lub z Dow Corning jako 556 Cosmetic Grade Fluid. Cykliczne polidimetylosiloksany są odpowiednie do stosowania w opisie te mające pierścieniową strukturę włączając od około 3 do około 7(CH3)2SiO części cząsteczek.

Żywice silikonowe mogą również być stosowane w obecnym opisie. Określenie żywica silikonowa tutaj oznacza silikony o wysokiej masie cząsteczkowej mające wagowo średnie masy cząsteczkowe powyżej około 200,000 i korzystnie od około 200,000 do około 4,000,000. Objęte są nielotne polialkilo i poliarylo siloksanowe gumy. W korzystnym rozwiązaniu, faza oleju silikonowego zawiera żywicę silikonową lub mieszaninę silikonów obejmujących żywicę silikonową. Typowo, żywice silikonowe mają lepkość przy 25°C powyżej około 1,000,000 mm².s^-1. Żywice silikonowe obejmują Dimetikony jak opisano przez Petrarch i inne objęte opisem US-A-4,152,416, 1 maj 1979, Spitzer, i wsp., i Noll, Walter, Chemistry and Technology of Silicones. New York: Academic Press 1968. Również opisane są żywice silikonowe w General Electric Silikon Rubber Produkt Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 i SE 76. Specyficzne przykłady żywic silikonowych obejmują kopolimer polidimetylosiloksan, (polidimetylosiloksan) (metylowinylosiloksan), kopolimer poli(dimetylosiloksan) (difenylo) (metylowinylosiloksan) i ich mieszaniny. Korzystne żywice silikonowe do stosowania w opisie stanowią żywice silikonowe mające masy cząsteczkowe od około 200,000 do około 4,000,000 wybrane z dimetikonolu, Dimetikonu kopoliolu, Dimetikonu, i ich mieszanin.

Faza silikonowa w opisie korzystnie zawiera żywicę silikonową włączoną do kompozycji jako część mieszaniny żywicy-oleju silikonowych. Gdy żywica silikonowa jest włączona jako część mieszaniny żywicy-oleju silikonowych, żywica silikonowa korzystnie zawiera od około 5% do około 40%, zwłaszcza od około 10% do 20% wagowo mieszanin żywicy-oleju silikonowych.

Odpowiednie mieszaniny żywicy-oleju silikonowych w opisie są mieszaninami złożonymi zasadniczo z:

(i) silikonu mającego masę cząsteczkową od około 200,000 do około 4,000,000 wybranego z dimetikonolu, fluorosilikonu i Dimetikonu i ich mieszanin (ii) nośnika, który jest olejem silikonowym, nośnik mający lepkość od około 0,65 mm².s^-1 do około 100 mm².s^-1, w którym stosunek i) do ii) wynosi od około 10: 90 do około 20: 80 i w którym ten składnik oparty na żywicy silikonowej ma końcową lepkość od około 100 mm².s^-1 do około 100,000 mm².s^-1, korzystnie od 500 mm².s^-1 do około 10,000 mm².s^-1.

Dalsze silikonowe składniki odpowiednie do stosowania w fazie oleju silikonowego w opisie są usieciowanymi poliorganosiloksanowymi polimerami, opcjonalnie zdyspergowanymi w płynnym nośniku. Ogólnie, gdy są obecne, usieciowane poliorganosiloksanowe polimery, razem z ich nośnikiem

PL 210 859 B1 (jeśli jest obecny) stanowią 0,1% do około 20%, korzystnie od około 0,5% do około 10%, korzystniej od około 0,5% do około 5% kompozycji. Takie polimery zawierają poliorganosiloksanowe polimery usieciowane przez środek sieciujący. Odpowiednie środki sieciujące ujawniono w opisie WO98/22085. Przykłady odpowiednich poliorganosiloksanowych polimerów do stosowania w opisie obejmują metylo winylo Dimetikon, metylo winylo difenylo Dimetikon i metylo winylo fenylo metylo difenylo Dimetikon.

Inna klasa silikonu składników odpowiednia do stosowania w fazie oleju silikonowego w opisie obejmuje polidiorganosiloksano-polioksyalkilenowe kopolimery zawierające przynajmniej jeden polidiorganosiloksanowy segment i przynajmniej jeden polioksyalkilenowy segment. Odpowiednie segmenty polidiorganosiloksanowe i ich kopolimery ujawniono w opisie WO98/22085.

Odpowiednie polidiorganosiloksanowe-polialkilenowe kopolimery są dostępne komercyjnie pod nazwami handlowymi Belsil (RTM) z Wacker-Chemie GmbH, Geschaftsbereich S, Postfach D-8000 Munich 22 i Abil (RTM) z Th. Goldschmidt Ltd., Tego House, Victoria Road, Ruislip, Middlesex, HA4 OYL, na przykład Belsil (RTM) 6031 i Abil (RTM) B88183. Szczególnie korzystna płynna mieszanina kopolimerów do stosowania w opisie obejmuje Dow Corning DC3225C który ma oznaczenie CTFA Dimetikon/Dimetikon kopoliol.

Filtry przeciwsłoneczne

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać organiczny filtr przeciwsłoneczny.

Odpowiednie filtry przeciwsłoneczne mogą mieć właściwości absorbowania UVA, właściwości absorbowania UVB lub ich mieszanin. Dokładna ilość aktywnego filtra przeciwsłonecznego będzie różna w zależności od żądanego współczynnika ochrony przed słońcem (Sun Protection Factor - SPF) kompozycji jak i żądanego poziomu ochrony przed UV. Kompozycje według wynalazku korzystnie mają SPF przynajmniej 10, korzystnie przynajmniej 15. SPF jest ogólnie stosowaną miarą ochrony przed promieniowaniem filtrów przeciwsłonecznych przeciwko rumieniowi. SPF zdefiniowano jako stosunek energii promieniowania utrafioletowego koniecznego do wytworzenia minimalnego rumienia na zabezpieczonej skórze do tej samej dawki koniecznej do wytworzenia minimalnego rumienia na niezabezpieczonej skórze tej samej osoby. Patrz Federal Register, 43, Nr 166, str. 38206-38269, August 25,1978). Ilości filtra przeciwsłonecznego stosowanego są typowo od około 2% do około 20%, więcej typowo od około 4% do około 14%. Odpowiednie filtry przeciwsłoneczne obejmują, między innymi, te występujące w CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7me wydanie, tom 2 str. 1672, red. przez Wenninger i McEwen (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D. C, 1997).

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać absorbujący UVA aktwyny filtr przeciwsłoneczny który absorbuje promieniowanie UV o długości fali od około 320 nm do około 400 nm. Odpowiednie aktywne filtry przeciwsłoneczne absorbujące UVA są wybrane z dibenzoilometanowe pochodne, antranilanowe pochodne takie jak metyloantranilan i homometyl, 1-N-acetylantranilan i ich mieszaniny. Przykłady dibenzoilometanowych aktywnych filtrów przeciwsłonecznych opisano w opisie patentowym US Nr 4,387,089, Depolo i w Sunscreens: Development, Evaluation, and Regulatory Aspects pod red. N. J. Lowe i N. A. Shaath, Marcel Dekker, Inc. (1990). Aktywne filtry przeciwsłoneczne absorbujące UVA są korzystnie obecne w ilości dostatecznie zabezpieczającej przed szerokim widmem UVA zarówno niezależnie, jak i w połączeniu z, innymi substancjami aktywnymi chroniącymi przed UV, które mogą być obecne w kompozycji.

Odpowiednie substancje aktywne filtrów przeciwsłonecznychi UVA stanowią dibenzoilo metanowe substancje aktywne filtrów przeciwsłonecznych i ich pochodne. Obejmują one, między innymi, te wybrane z 2-metylodibenzoilometanu, 4-metylodibenzoilometanu, 4-izopropylodibenzoilometanu, 4-tertbutylodibenzoilometanu, 2,4-dimetylodibenzoilometanu, 2,5-dimetylodibenzoilometanu, 4,4'-diizopropylobenzoilometanu, 4-(1,1-dimetyloetylo)-4'-metoksydibenzoilometanu, 2-metylo-5-izopropylo-4'-metoksydibenzoilometanu, 2-metylo-5-tert-butylo-4'-metoksydibenzoilometanu, 2,4-dimetylo-4'-metoksy- dibenzoilometanu, 2,6-dimetylo-4'-tert-butylo-4'metoksydibenzoilometanu, i ich mieszanin. Korzystne dibenzoilowe substancje aktywne filtrów przeciwsłonecznych obejmują te wybrane z 4-(1,1-dimetyloetylo)-4'-metoksydibenzoilometanu, 4-izopropylodibenzoilometanu i ich mieszanin. Korzystną substancją aktywną filtrów przeciwsłonecznych jest 4-(1,1-dimetyloetylo)-4'-metoksydibenzoilometan.

Substancja aktywna filtrów przeciwsłonecznych 4-(1,1-dimetyloetylo)-4'-metoksydibenzoilometanu, która jest również znana jako butylo metoksydibenzoilometan lub Avobenzon, jest dostępna na rynku pod nazwami Parasol® 1789 z Givaudan Roure (International) S. A. (Basel, Szwajcaria) i Eusolex®; 9020 z Merck & Co., Inc (Whitehouse Station, NJ). Filtr przeciwsłoneczny 4-izoproplydibenzoilometanowy,

PL 210 859 B1 który jest również znany jako izopropylodibenzoilometan, jest dostępny na rynku z Merck pod nazwą Eusolex®; 8020.

Kompozycje według wynalazku mogą również zawierać substancję aktywną filtrów przeciwsłonecznych UVB które absorbują promieniowanie UV mające długość fali od około 290 nm do około 320 nm. Kompozycje zawierają taką ilość substancją aktywną filtrów przeciwsłonecznych przeciwko UVB, która bezpiecznie i skutecznie dostarcza zabezpieczenie przed UVB zarówno niezależnie, lub w połączeniu z, substancją aktywną filtrów przeciwsłonecznych chroniącą przed UV, która może być obecna w kompozycji. Kompozycje mogą zawierać od około 0,1% do około 16%, korzystniej od około 0,1% do około 12%, i korzystniej od około 0,5% do około 8% wagowo, organicznego filtra przeciwsłonecznego absorbującego UVB.

Różne substancje czynne filtra przeciwsłonecznego UVB są odpowiednie do stosowania w obecnym opisie. Nieograniczaj ą ce przykł ady takich organicznych substancji czynnych filtra przeciwsłonecznego są opisane w opisie patentowym US Nr 5,087,372 wystawionym 11 lutego 1992, Haffey i wsp. i opisie patentowym US Nr 5,073,371 i Nr 5,073,372 oba wystawione 17 grudnia1991, Turner i wsp. i Segarin, i wsp., w rozdziale VIII, strony 189 i następne, w 'Cosmetics Science and Technology. Nadal inne użyteczne filtry przeciwsłoneczne obejmują te ujawnione w opisie patentowym U.S. Nr 4, 937, 370, to Sabatelli, issued June 26,1990 i Opis patentowy U.S. Nr 4,999,186, Sabatelli i wsp., wystawionym 12 marca, 1991. Korzystne substancje czynne filtra przeciwsł onecznego UVB są wybrane z 2-etyloheksylo-2-cyjano-3,2-etyloheksylo-N,N-dimetylo-paminobenzoesanu, kwasu p-aminobenzoesowego, oksybenzonu, homomentylo salicylanu, oktylo salicylanu, 4,4'-metoksy-t-butylodibenzoilometanu, 4-izopropylo dibenzoilometanu, 3-benzylideno kamfory, 3-(4-metylobenzylideno)kamfory, 3-difenyloakrylanu (oznaczony jako octocrylene), kwasu 2-fenylo-benzimidazolo-5-sulfonowego (PBSA), cynamonianów i ich pochodnych takich jak 2-etyloheksylo-p-metoksycynamonian i oktylo-p-metoksycynamonian, salicylan TEA, oktylodimetylo PABA, kamforowe pochodne i ich pochodne, i ich mieszaniny. Korzystne organiczne substancje czynne filtra przeciwsłonecznego są to 2-etyloheksylo-2-cyjano-3,3-difenyloakrylan (oznaczony jako oktokrylen), kwas 2-fenylo-benzimidazolo-5-sulfonowy (PBSA), oktylo-p-metoksycynamonian, i ich mieszaniny. Sól i zobojętniony kwas kwaśnych filtrów przeciwsłonecznych są również użyteczne w obecnym opisie.

Środek może również być dodany do dowolnej kompozycji użytecznej w obecnym wynalazku aby stabilizować filtr przeciwsłoneczny UVA, aby zapobiegać jego foto-degradacji w wyniku narażenia na promieniowanie UV i dzięki temu utrzymując jego skuteczne działanie ochronne przeciwko UVA. Szeroki wybór związków cytowano jako zapewniających te właściwości stabilizujące i powinien on być wybrany aby odpowiadał filtrowi przeciwsłonecznemu UVA i kompozycji jako całości. Odpowiednie stabilizujące środki obejmują, między innymi, te opisane w opisach patentowych US Nr 5,972,316; 5,968,485; 5,935,556; 5,827,508 i opisie patentowym WO 00/06110. Korzystne przykłady środków stabilizujących do stosowania w obecnym wynalazku obejmują 2-etyloheksylo-2-cyjano-3,3-difenyloakrylan (oznaczono jako oktokrylen), etylo-2-cyjano-3, 3-difenyloakrylan, 2-etyloheksylo-3, 3-difenyloakrylan, etylo-3, 3-bis (4-metoksyfenylo) akrylan, i ich mieszaniny. 2-etyloheksylo-2-cyjano-3, 3-difenyloakrylan jest najkorzystniejszy.

Środek może również być dodany do dowolnej kompozycji użytecznej w obecnym wynalazku aby poprawić substantywność tych kompozycji, szczególnie aby wzmacniać ich odporność na zmywanie przez wodę, lub ścieranie. Korzystny środek który zapewnia te korzyści jest kopolimerem etylenu i kwasu akrylowego. Kompozycje zawierają ce ten kopolimer ujawniono w opisie patentowym U.S. Nr 4,663,157, Brock, z 5 maja 1987.

Oprócz organicznych filtrów przeciwsłonecznych, kompozycje według wynalazku mogą dodatkowo zawierać nieorganiczne fizyczne substancje blokujące promieniowanie słoneczne. Nieograniczające przykłady takich odpowiednich fizycznych substancji blokujących promieniowanie słoneczne opisano w CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 6th Edition, 1995, str. 1026-28 i 1103, Sayre, R. M. i wsp., Physical Sunblocks, J. Sec. Cosmet. Chem., tom 41, nr 2, str. 103-109 (1990). Korzystne nieorganiczne fizyczne substancje blokujące promieniowanie słoneczne stanowią tlenek cynku i dwutlenek tytanu, i ich mieszaniny.

Gdy są stosowane, nieorganiczne fizyczne substancje blokujące promieniowanie słoneczne są obecne w ilości takiej, że obecne kompozycje są przezroczyste na skórze (to jest nie są białe), korzystnie mniejszej niż lub równej około 5%. Gdy jest stosowany tlenek tytanu, może on mieć strukturę anatazu, rutylu, lub amorficzną. Fizyczne cząsteczki substancji blokującej promieniowanie słoneczne, np. dwutlenek tytanu i tlenek cynku, mogą być niepowlekane lub powlekane różnymi materiałami

PL 210 859 B1 obejmującymi nie ograniczając zakresu aminokwasami, związki glinu takie jak ałun, stearynian glinu, laurynian glinu, i tym podobne; kwasy karboksylowego i ich sole np. kwas stearynowy i jego sole; fosfolipidy takie jak lecytyna; organiczne silikonowe związki; nieorganiczne silikonowe związki takie jak krzemionka i krzemiany i mieszaniny tych związków. Korzystny dwutlenek tytanu jest dostępny na rynku z Tayca (Japan) i jest rozprowadzany przez Tri-K Industries (Emerson, NJ) jako mikrojonizowane serie MT (np. MT 100SAS). Kompozycje według wynalazku mogą zawierać od około 0,1% do około 10%, korzystniej od około 0,1% do około 4%, i korzystniej od około 0,5% do około 2,5%, wagowo, nieorganicznego filtra przeciwsłonecznego.

Przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze aktywności

Kompozycje w opisie mogą również zawierać przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze aktywności.

Nieograniczające przykłady przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych aktywności użytecznych w opisie obejmują leki B-laktam, leki chinolonowe, ciprofloksacynę, norfloksacynę, tetracyklinę, erythromycynę, amikacynę, eter 2,4,4'-trichloro-2'-hydroksy difenylowy, 3,4,4'-trichlorobanilid, fenoksyetanol, fenoksy propanol, fenoksyizopropanol, doksycyklinę, capreomycynę, chlorheksydynę, chlortetracyklinę, oksytetracyklinę, clindamycynę, etambutol, isetionian heksamidyny, metronidazol, pentamidynę, gentamicynę, kanamycynę, lineomycynę, methacyklinę, metenaminę, minocyklinę, neomycynę, netilmicynę, paromomycynę, streptomycynę, tobramycynę, mikonazol, chlorowodorek tetracykliny, erytremycynę, cynkowa erythromycynę, estolan erytromycyny, stearynian erytromycyny, amikacyny siarczan, chlorowodorek doksycykliny, siarczan capreomycyny, glukonian chlorheksidyny, chlorowodorek chlorheksydyny, chlorowodorek chlortetracykliny, chlorowodorek oksytetracykliny, chlorowodorek clindamycyny, chlorowodorek etambutolu, chlorowodorek metronidazolu, chlorowodorek pentamidyny, siarczan gentamicyny, siarczan kanamycyny, chlorowodorek neomycyny, chlorowodorek metacykliny, hipuran metenaminy, mandelan metenaminy, chlorowodorek minocykliny, siarczan neomycyny, siarczan netilmycyny, siarczan paromomycyny, siarczan streptomycyny, siarczan tobramycyny, chlorowodorek mikonazolu, chlorowodorek amanfadyny, siarczan amanfadyny, oktopiroks, parachlorometa ksylenol, nystatynę, tolnaftat, klotrimazol, chlorek cetylopirydyny (CPC), pirokton laminy, siarczek selenu, ketokonazol, triklokarbon, triklosan, pirytion cynku, itrakonazol, kwa azjatyczny, hinokitiol, mipirocyna i te opisane w opisie patentowym EPA 0,680,745 (tutaj włączone jako odnośnik), chlorowodorek clinacycyny, pertlenek benzoilowy, pertlenek benzylowy, minocyklinę, fenoksy izopropanol, i ich mieszaniny.

Inne opcjonalne składniki

Różne opcjonalne składniki takie jak środki zobojętniające, perfumy i środki barwiące, również mogą być dodane do kompozycji w obecnym opisie. Korzystnie aby wszelkie dodatkowe składniki wzmacniały miękkość /gładkość skóry, stanowiąc korzyści produktu. Ponadto korzystnie aby każdy z takich skł adników nie wpł ywał negatywnie na estetyczne wł a ś ciwoś ci produktu. Z tego wzglę du tak wysokie poziomy białek takich jak kolagen i elastyna nie są korzystne w kompozycjach według wynalazku.

Kompozycje według wynalazku mogą również zawierać od około 0,01% do około 10%, korzystnie od około 0,1% do około 5% pantenolowego środka nawilżającego. Pantenolowy środek nawilżający może być wybrany z D-pantenolu ([R]-2,4-dihydroksy-N-[3-hydroksypropylo)]-3,3-dimetylobutamid), DL-pantenol, pantoteinianu wapnia, mleczka pszczelego, pantetiny, pantoteiny, pantenylo etylowego eteru, kwasu pangamowego, pirydoksyny i pantoilo laktozy.

Środki zobojętniające odpowiednie do stosowania do zobojętniania kwasowych grup zawierających hydrofilowe środki żelujące w opisie obejmują wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu wodorotlenek amonu, monoetanolaminy, dietanolaminy, amino metylo propanol, bufor Tris i trietanolaminę.

Inne opcjonalne materiały obejmują keratolityczne środki; rozpuszczalne w wodzie lub rozpuszczone konserwanty korzystnie na poziomie od około 0,1% do około 5%, takie jak Germall 115, metylo, etylo, propylo i butylo estry kwasu hydroksybenzoesowego, benzylowy alkohol, DMDM hydantoino jodopropanylo butylokarbanian dostępne pod nazwą handlową Glydant Plus z Lonza, EDTA, Euxyl (RTM) K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) i fenoksypropanol; anty-bakteryjne takie jak Irgasan (RTM) i fenoksyetanol (korzystnie przy poziomach od 0,1% do około 5%); rozpuszczalne lub koloidalnie-rozpuszczalne nawilżające środki takie jak kwas hilaronowy i szczepione na skrobi poliakrylany sodu takie jak Sanwet (RTM) IM-1000, IM-1500 i IM-2500 są dostępne z Celane Superabsorbent Materials, Portsmith, VA, USA i opisane w opisie USA-A-4,076,663; witaminy takie jak witamina A, witamina C, witamina E i ich pochodne i elementy budulcowe takie jak fitantriol i witamina K i ich składniki takie jak alkohol tłuszczowy dodekatrienol; alfa i beta hydroksykwasy; żywica aloesowa; sfin28

PL 210 859 B1 gozyny i fitosfingozyny, cholesterol; środki wybielające skórę; N-acetylo cysteina; środki barwiące; antibakteryjne środki takie jak TCC/TCS, również znane kalp triklosan i trichlorokarbon; perfumy i rozpuszczalniki perfum. Przykłady alfahydroksy kwasów obejmują kwas glikolowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas cytrynowy, kwas glikolowy w połączeniu z glikolanem amonu, kwas alfa-hydroksy etanolowy, kwas alfa-hydroksyoktanonolowy, alfa-hydroksykaprylowy, kwas hydroksykaprylowy, mieszaniny kwasów owocowych, tri-alfa hydroksy kwasy owocowe, potrójne kwasy owocowe, ekstrakt z trzciny cukrowej, kwas alfa hydroksylowy i zawierają cy botaniczny kwas l-alfa hydroksylowy i glikomer w usieciowanych kwasami tłuszczowymi alfa nutrium. Korzystne przykłady alfa hydroksy kwasów obejmują kwas glikolowy i kwas mlekowy. Korzystnie alfa hydroksy kwasy są stosowane na poziomach do 10%.

Bezpieczna i skuteczna ilość przeciwzapalnego środka może być dodana do kompozycji przedmiotowego wynalazku, korzystnie od około 0,1% do około 5%, korzystniej od około 0,1% do około 2%, kompozycji. Przeciwzapalny środek poprawia wygląd skóry i stanowi korzyści wynalazku, np., takie środki mają udział w uzyskaniu bardziej jednorodnego i akceptowanego kolorytu i barwy skóry. Dokładna ilość przeciwzapalnego środka, która ma być stosowana w kompozycjach będzie zależeć od poszczególnych przeciwzapalnych środków stosowanych, gdyż takie środki różnią się bardzo pod względem mocy.

Kompozycje przedmiotowego wynalazku mogą dalej obejmować przeciw utleniacze/akceptory wolnych rodników. Przeciw utleniacze/akceptory wolnych rodników są zwłaszcza użyteczne do zapewniania ochrony przeciwko promieniowaniu UV, które może powodować zwiększone łuszczenie lub zmiany w teksturze w warstwie rogowej i przeciwko innym środowiskowym czynnikom, które mogą powodować uszkodzenie skóry. Odpowiednie ilości wynoszą od około 0,1% do około 10%, korzystniej od około 1% do około 5%, kompozycji. Przeciw utleniacze/akceptory wolnych rodników takie jak kwas askorbinowy (witamina C) i ich sole.

Włączenie środka chelatującego jest zwłaszcza użyteczne do zapewnienia ochrony przeciwko promieniowaniu UV, które może brać udział w nadmiernym łuszczeniu lub zmianach w teksturze skóry i przeciwko innym czynnikom ś rodowiskowym, które mogą powodować uszkodzenie skóry. Odpowiednie ilości to od około 0,01% do około 1%, korzystniej od około 0,05% do około 0,5%, kompozycji. Przykładowe chelatory, które są użyteczne w opisie ujawniono w opisie patentowym U.S. Nr 5,487,884, włączonym w opisie jako odnośnik. Korzystne chelatory użyteczne w kompozycjach przedmiotowego wynalazku stanowią kwas etyloenodiamino tetraoctowy (EDTA), furildioksym i ich pochodne.

Kompozycje według wynalazku mogą również zawierać środek rozjaśniający skórę. Gdy stosowane, kompozycje korzystnie będą zawierać od około 0,1% do około 10%, korzystniej od około 0,2% do około 5%, również korzystnie od około 0,5% do około 2%, środka rozjaśniającego. Odpowiednie środki rozjaśniające skórę obejmują te znane w stanie techniki, obejmując kwas kojikowy, arbutynę, kwas askorbinowy i ich pochodne, np., askorbylo fosforan magnezu. Dalsze środki rozjaśniające skórę odpowiednie do stosowania w opisie również obejmują te opisane w WO 95/34280 i WO 95/23780; każde włączone w opisie jako odnośnik.

Inne opcjonalnie materiały obejmują rozpuszczalne w wodzie lub rozpuszczalne konserwanty korzystnie na poziomie od około 0,1% do około 5%, takich jak Germall 115, metylo, etylo, propylo i butylo estry kwasu hydroksybenzoesowego, benzylowy alkohol, DMDM hydantoino jodopropanylo butylokarbanian dostępne pod nazwą handlową Glydant Plus z Lonza, EDTA, Euxyl (RTM) K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol) i fenoksypropanol; anty-bakteryjne takie jak Irgasan (RTM) i fenoksyetanol (korzystnie na poziomach od 0,1% do okoł o 5%). Antibakteryjne ś rodki takie jak TCC/TCS, również znane jako triklosan i trichlorokarbon są również użyteczne w kompozycjach według wynalazku.

Inne opcjonalnie materiały w opisie obejmują pigmenty, które gdy nierozpuszczalne w wodzie, biorą dział i obejmują w całkowitym poziomie składniki olejowej składniki fazy. Pigmenty odpowiednie do stosowania w kompozycjach według wynalazku mogą być organiczne i/lub nieorganiczne, również obejmując w określeniu pigment materiały mające słaby kolor lub błyszczące takie jak środki do wykończenia matowego jak również środki rozpraszające światło. Korzystnie kompozycje według wynalazku zawierają w postaci lotne materiały cząstek stałych mające współczynnik załamania od około 1,3 do około 1,7, w postaci lotnych cząstek stałych materiałów, które zostały zdyspergowane w kompozycji i mające średnicę cząstek o wielkości od około 2 do około 30 μm. Korzystnie cząstki stałe użyteczne w opisie mają stosunkowo wąskie rozmieszczenie, co ma oznaczać więcej niż 50% cząsteczek

PL 210 859 B1 w zakresie 3 μm zarówno bocznej odpowiedniej wartości środkowej. Również korzystnie jest, że więcej niż 50%, korzystnie więcej niż 60%, korzystniej więcej niż 70% cząsteczek są w zakresie wielkości przepisanych do odpowiednich środkowych wartości. Odpowiednie w postaci lotny cząstek stałych materiały są organicznymi lub organosilikonowymi i korzystnie organosilikonowymi polimerami. Korzystne cząsteczki są wolno przemieszczającymi się, stałymi materiałami. Przez stałe rozumie się, że cząsteczki nie są puste. Przestrzeń w środku pustych cząsteczek może prowadzić do przeciwnego efektu we współczynniku załamania i dlatego wzrokowe działanie cząsteczek na skórę lub kompozycję.

Odpowiednie organiczne w postaci lotnych cząstek stałych materiały obejmują te przeprowadzone z polimetylosilseskwioksanem, z odwołaniem powyżej, poliamid, politen, poliakrylonitryl, polikwas akrylowy, kwas polimeta akrylowy, polistyren, politetrafluoroetyloen (PTFE) i chlorek poli(winylidenu). Kopolimery pochodzące monomerów wymienionych powyżej materiałów mogą również być stosowane. Nieorganiczne materiały obejmują azotek krzemu i boranu. Reprezentatywne dostępne na rynku przykłady użytecznych w postaci lotnych cząstek stałych materiałów w opisie obejmują Tospearl® 145 który ma środkową cząstkę wielkości około 4,5 μm i EA-209 z Kobo który jest kopolimerem etyleno/kwas akrylowy mającym środkową cząstkę o wielkości około 10 um, Nylon-12 dostępny pod nazwą handlową Orgasol 2002 z Elf Atochem, Francja, lub mieszaniny tych związków.

Dalsze przykłady odpowiednich pigmentów obejmują dwutlenek tytanu, wstępnie zdyspergowany dwutlenek tytanu z Kobo np. Kobo GWL75CAP, tlenki żelaza, acyglutaminianowe tlenki żelaza, błękit ultramaryna, barwniki D & C, karmin i ich mieszaniny. W zależności od rodzaju kompozycji, mieszanina pigmentów będzie normalnie stosowana. Korzystne pigmenty do stosowania w opisie z punktu widzenia nawilżania, uczucia na skórze, wyglądu skóry i kompatybilności emulsji są pigmenty poddane obróbce. Pigmenty mogą być poddane działaniu związków takich jak aminokwasy, silikony, lecytyna i oleje estrowe.

Odpowiednio, pH kompozycji w opisie jest w zakresie od około 6,1 do około 10,0, w którym pH końcowej kompozycji jest dostosowane przez addycję kwasowych, zasadowych lub buforowanych soli jeśli konieczne.

Przygotowanie kompozycji

Kompozycje według wynalazku są wytworzone standardowymi technikami dobrze znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Ogólnie wodna faza i/lub olejowa może być wytworzona oddzielnie, stosując dodawanie materiałów rozdzielających o podobnej fazie w dowolnej kolejności. Jeśli końcowy produkt jest emulsją, dwie fazy będą następnie połączone przy silnymi mieszaniu. Dowolne składniki w preparacie o wysokiej lotności, lub które są podatne na hydrolizę w wysokich temperaturach, mogą być dodane z łagodnym mieszaniem ku końcowi procesu, po utworzeniu emulsji jeśli jest to odpowiednie.

Proteazy o zmniejszonym działaniu uczulającym mogą również być stosowane w traktowaniu tkanin. Traktowanie tkanin obejmuje proces w którym tkaniny, poszczególne przędze lub włókna, które mogą być tkane, spilśnione lub dziane w tkaniny lub ubiory są traktowane aby spowodować żądaną właściwość. Przykłady takich żądanych właściwości obejmują spranie, depilowanie, odwłaszanie, usuwanie apretury przędzalniczej, zmiękczanie i inne traktowanie tkanin dobrze znane biegłym w dziedzinie.

Szczepionki i środki terapeutyczne mogą być stosowane w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Jak stosowano w obecnym opisie, farmaceutycznie dopuszczalny składnik jest odpowiedni do stosowania u ludzi i/lub zwierząt, jeśli nie powoduje nadmiernie szkodliwych działań ubocznych (takich jak toksyczność, podrażnienie i odpowiedź alergiczna) proporcjonalnie do uzasadnionego stosunku korzyść/ryzyko. Jak stosowano w obecnym opisie, farmaceutyczny nośnik jest farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem, środkiem zawieszającym lub nośnikiem dostarczającym proteazę mającą zmniejszone działanie uczulające u zwierząt lub ludzi. Nośnik może być płynny lub stały i jest wybrany odpowiednio do planowanego sposobu podawania. Przykładowe płynne nośniki obejmują sterylną solankę, woda, bufory, organiczne rozpuszczalniki i ich połączenia.

Podawana ilość będzie różna w dużym zakresie zależnie od gatunku stałocieplnych zwierząt lub ludzi, i leczonego wirusa. Podawanie dawkowania będzie, oczywiście, różne w zależności od znanych czynników, takich jak farmakodynamiczne właściwości poszczególnych środków i jego trybu i sposobu podawania, wieku, stanu zdrowia i/lub masy przyjmującego środek; własności i rozmiarów objawów; właściwości metabolicznych leku i pacjenta, rodzaju równoczesnego leczenia; częstości leczenia; lub żądanego działania.

PL 210 859 B1

Ogólnie dawkowanie tak niewielkie jak około 1 miligram (mg) na kilogram (kg) masy ciała jest odpowiednie, lecz korzystnie tak niewielkie jak 10 mg/kg i do około 10 000 mg/kg może być stosowane. Korzystnie od 10 mg/kg do około 5000 mg/kg jest stosowane. Korzystniej dawki są od 250 mg/kg do około 5000 mg/kg. Dawki użyteczne w miejscowym obniżaniu odpowiedzi immunologicznej wynoszą 250 mg/kg, 500 mg/kg, 2500 mg/kg, 3500 mg/kg, 4000 mg/kg, 5000 mg/kg i 6000 mg/kg. Dowolny zakres dawek może być stosowany. Ogólnie zmieniona immunogenna proteaza może być podawana na zasadzie dziennej, przynajmniej jeden raz w ciągu dnia, lub obniżone immunogenne proteazy mogą być podawane jeden do czterech razy na tydzień lub jako pojedyncza dawka lub oddzielne dawki podczas dnia. Dwukrotnie w ciągu tygodnia dawkowanie w czasie przynajmniej kilku tygodni jest korzystne i często dawkowanie będzie kontynuowane przez przedłużony okres, a możliwe że przez całe życie pacjenta. Jednakże, dawkowanie i tryb podawania będzie różny zależnie od zdolności pacjenta do utrzymywania żądanego i skutecznego poziomu w osoczu środków wirusowych we krwi.

Dożylnie, najkorzystniejsze dawki mogą być w zakresie od około 1 do około 10 mg/kg/minutę podczas stałych infuzji o stałej szybkości.

Dawkowanie ludziom jest ogólnie mniejsze niż stosowane u myszy i jest typowo około 1/12 dawki, która jest skuteczna u myszy. Zatem, jeśli 500 mg/kg było skuteczne u myszy, dawka 42 mg/kg mogłaby być stosowana u ludzi. Dla 60 kg człowieka, ta dawka byłaby 2520 mg.

Związki według wynalazku mogą być podawane każdym odpowiednim środkiem obejmującym, nie ograniczając zakresu, na przykład, podawanie doustne, doodbytnicze, donosowe, miejscowe (obejmujące przezskórne, aerozole, do jamy ustnej i podjęzykowe), dopochwowe, pozajelitowe (obejmujące podskórnie, domięśniowe, dożylne i przezskórne), dopęcherzowe lub iniekcje do lub wokół wirusa.

Dawkowane ilości zależą od skutecznych hamujących stężeń obserwowanych w badaniach przeciwwirusowych. Korzystny tryb podawania będzie różny w zależności od (1) stanu i wieku osoby otrzymującej, (2) jaki wirus jest leczony (3) własności zakażenia i (4) żądanego poziomu we krwi. Uważa się, że pozajelitowe leczenie przez dożylne, podskórnie, lub domięśniowe podawanie związków według wynalazku w postaci preparatu z odpowiednim nośnikiem, innymi przeciwwirusowymi środkami lub związkami lub rozcieńczalnikami, aby ułatwić podawanie, będą korzystnym sposobem podawania związków stałocieplnym zwierzętom.

Poniżej zaprezentowano wynalazek za pomocą przykładów, lecz nie są one skonstruowane aby ograniczyć zakres podany w zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1 Produkty do pielęgnacji skóry

Drugorzędne są włączone: modyfikatory pH, konserwanty, środki modyfikujące lepkość i perfumy.

Ilości oznaczają przybliżony procent wagowy, jeśli nie wskazano inaczej i nie jest przeznaczony aby wskazywał znaczące liczby.

Nawilżający środek do mycia ciała pH = 7

Materiał surowy	Ilość
Dejonizowana Woda	dopełnienie
Gliceryna	4,0
PEG-6 kaprylowy/gliceryd kaprynowy	4,0
Kwasy tłuszczowe z nasion palmy	3,0
Sól sodowa siarczanowanego, oksyetylenowanego alkoholu laurylowego (Sodium Laureth-3 Sulphate)	45,0
Kokamid MEA	3,0
Lauroamfooktan sodu	25,0
Olej sojowy	10,0
Poliquaternium-10 (JR30M)	0,70
Proteaza	1000 ppm

PL 210 859 B1

Środek do mycia ciała	pH 6,5	pH 7	pH 8,5
Materiał surowy	Ilość	Ilość	Ilość
Dejonizowana woda	dopełnienie	dopełnienie	dopełnienie
Sól sodowa siarczanowanego, oksyetylenowanego alkoholu laurylowego (Sodium Laurethi Sulphate)	12	15	8
Kokamidopropylo Betaina	8	10	15
APG glukozyd (Plantacare 2000 1)	0	2	1
Poliquaternium-10 (JR30M)	0,25	0	0
Poliquaternium-7 (Mackam 55)	0	0	0,7
Proteazy	250 ppm	500 ppm	1000 ppm

1-Cognis

Płyn do ciała	pH 7	pH 7	pH 7,5	pH 7
Materiał surowy	Ilość	Ilość	Ilość	Ilość
Dejonizowana woda	dopełnienie	dopełnienie	dopełnienie	dopełnienie
Gliceryna	8	8	10	12
Izoheksadekan	3	3	3	6
Niacynamid	0	3	5	6
Izostearynian izopropylu	3	3	3	3
Poliakrylamid, Izoparafina, Laureth-7 (Sepigel 3052)	3	3	3	3
Petrolatum	4	4	4	2
Nylon 12	2	2	2,5	2,5
Dimetikon(DC1404)	2	2	2,5	2,5
Sacharoza z poliolejów z nasion bawełny	1,5	1,5	1,5	1,5
Alkohol stearylowy 97%	1	1	1	1
D pantenol	1	1	1	1
Oktan DL-alfatokoferolu	1	1	1	1
Alkohol cetylowy 95%	0,5	0,5	0,5	1
Alkohol behynylowy	1	1	1	0,5
Emulgade PL 68/50	0,4	0,4	0,5	0,5
Kwas stearynowy	0,15	0, 15	0,15	0,15
Peg-100-stearynian (MYRJ 591)	0,15	0,15	0,15	0,15
Proteaza	50 ppm	50 ppm	250 ppm	1000 ppm

- Uniqema

- Seppic

- Dow Corning

PL 210 859 B1

Silnie nawilżający do twarzy krem/lotion	pH 7	pH 7
Materiał surowy	Ilość	Ilość
Dejonizowana woda	dopełnienie	dopełnienie
Gliceryna	12	5
PEG 4006	0	10
Niacynamid	5	7
Izoheksadekan	5	5
Dimetikon (DC 14033)	3	2
Poliakrylamid, Izoparafina, Laureth-7 (Sepigel 305 3 3 Izostearynian izopropylu	2	2
Polimetylosilseschinooksan	2	2
Alkohol cetylowy 95%	1	1
Sacharoza z poliolejów z nasion bawełny	1	1
D-Pantenol	1	1
Witamina E (Oktan tokoferolu)	1	1
Alkohol stearylowy 95%	0,5	0,5
Glukozyd cetearylowy	0,5	0,5
Dwutlenek tytanu	0,3	0,3
Kwas stearynowy	0,15	0,15
PEG-100-Stearynian (Myrj 59 4)	0,15	0,15
Proteaza	500 ppm	500 ppm

- Seppic

- Dow Corning

- Uniqema

- Scher Chemicals 6 - Dow Chemicals

Nawilżający krem do twarzy	pH7	pH 7	pH 7,5
Materiał surowy	Ilość	Ilość	Ilość
Dejonizowana woda	dopełnienie	dopełnienie	dopełnienie
Gliceryna	3	5	10
Petrolatum 3	3	0
Alkohol cetylowy 95%	1,5	1,5	1
Dimetikon Copoliol (DC 3225C4)	2	2	2
Izopropyle Palmitate	1	1	0,5
Karbomer 954 2	0,7	0,7	0,7
Dimetikon (DC 200/350cs4)	1	1	1
Alkohol stearylowy 97%	0,5	0,5	1
Kwas stearynowy	0,1	0,1	0,1
Peg-100-stearynian (MYRJ 591)	0,1	0,1	0,1
Dwutlenek tytanu	0,3	0,3	0,3
Proteazy	50 ppm	250 ppm	1000 ppm

- Uniqema

- BF Goodrich 4 - Dow Corning

PL 210 859 B1

P r z y k ł a d 2

Test identyfikacji peptydowych epitopów rozpoznawanych przez limfocyty T stosując nie mające do tej chwili kontaktu z bodźcem limfocyty T

Świeże z ludzkiej krwi obwodowej komórki pobrano od „nie mających do tej chwili kontaktu z bodźcem ludzi, to jest, osoby, o których uważano, że nie były narażone na lub uczulone na proteazy z Bacillus lentus, w celu wyznaczenia antygenowych epitopów w proteazie z Bacillus lentus i ludzkiej subtylizynie. Nie mające do tej chwili kontaktu z bodźcem ludzie ma oznaczać, że osoba ta nie wie, że była narażona na, lub u której nie rozwinęła się reakcja na proteazy w przeszłości. Obwodowe jednojądrowe komórki krwi (przechowywane w temperaturze pokojowej, nie starsze niż 24 godziny) przygotowano do zastosowania następująco: W przybliżeniu 30 ml roztworu preparatu kożuszka z jednej jednostki całej krwi doprowadzono do 50 ml roztworem buforu fosforanowego Dulbecco's (DPBS) i podzielono na dwie probówki. Próbki stawiono pod skosem z 12,5 ml o temperaturze pokojowej pożywki do gęstościowego rozdziału lymfoprep (gęstość Nykomedu 1,077 g/ml). Probówki wirowano przez trzydzieści minut przy 600 g. Obszar między dwoma fazami zebrano, połączono i przemyto w DPBS. Gęstość komórek otrzymanego roztworu zmierzono hemocytometrem. Żywotność zmierzono przez wypieranie błękitu trypanu.

Z otrzymanego roztworu założono hodowlę zróżnicowanych dendrytycznych komórek, stosując próbkę krwi obwodowej zawierającej jednojądrowe komórki przy gęstości 10⁸ komórek na 75 ml kolbę do hodowli w roztworze jak następuje:

(1) 50 ml pozbawionego surowicy pożywki AIM V (Gibco) uzupełniono 1:

100 rozcieńczeniem beta-merkaptoetanolu (Gibco). Kolby ustawiano płasko na dwie godziny w temp. 37°C w 5% CO2 aby umożliwić przyleganie monocytów do ścianek kolby.

(2) Różnicowanie monocytowych komórek w komórki dendrytyczne przebiegało następująco: nie przylegające limfocyty T usuwano i otrzymane przylegające limfocyty T (monocyty) połączono z 30 ml AIM V, 800 jednostek/ml GM-CSF (Endogen) i 500 jednostek/ml IL-4 (Endogen); otrzymaną mieszaninę hodowano przez 5 dni w warunkach przy 37°C w 5% CO₂. Po pięciu dniach, cytokina TNFa (Endogen) dodano do 0,2 jednostek/ml i cytokinę IL-1a (Endogen) dodano do końcowego stężenia 50 jednostek/ml i mieszaninę inkubowano w temp. 37°C w 5% CO2 przez dwa kolejne dni.

(3) Siódmego dnia, Mitomycynę C dodaną do stężenia 50 mikrogramów/ml dodano, aby zatrzymać wzrost hodowli obecnie zróżnicowanych dendrytycznych komórek. Roztwór inkubowano przez 60 minut w temp. 37°C w 5% CO2. Komórki dendrytyczne zebrano przez łagodne zdrapanie przylegających limfocytów T do dna kolby narzędziem do zeskrobywania komórek. Przylegające i nieprzylegające limfocyty T następnie wirowano przy 600 g przez 5 minut, przemyto w DPBS i zliczano.

(4) Wytworzone komórki dendrytyczne umieszczano na 96 studzienkowych okrągłodennych szalkach przy 2x10⁴/studzienkę w 100 mikrolitrach całkowitej objętości pożywki AIM V.

Limfocyty T CD4+ wytworzono z zamrożonych odmierzonych próbek komórkowych z krwi obwodowej stosowanych do wytwarzania komórek dendrytycznych stosując ludzkie CD4+ Cellect Kit (Biotex) zgodnie z instrukcjami producenta z poniższymi modyfikacjami: odmierzone próbki rozmrożono i przemyto tak, że w przybliżeniu 10⁸ komórek nanoszono na kolumnę Cellect; komórki ponownie zawieszono w 4 ml DPBS i 1 ml odczynnika komórkowego z zestawu Cellect, roztwór utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Otrzymany roztwór wirowano przez pięć minut przy 600xg w temperaturze pokojowej i osad ponownie zawieszono w 2 ml DPBS i naniesiono na kolumny Cellect. Efluent z kolumn zebrano w 2% ludzkiej surowicy w DPBS. Otrzymany roztwór limfocytów CD4+ wirowano, ponownie zawieszono w pożywce AIMV i gęstość obliczano.

Zawiesinę limfocytów T CD4+ ponownie zawieszono do miana 2x10⁶/ml w pożywce AIMV aby ułatwić skuteczne manipulacje szalką 96 studzienkową.

Peptydowy antygen wytworzono z 1 M roztworu wyjściowego w DMSO przez rozcieńczenie w pożywce AIMV w stosunku 1:10. 10 mikrolitrów roztworu wyjściowego umieszczono w każdej studzience z szalki 96-studzienkowej zawierającej zróżnicowane komórki dendrytyczne. 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny limfocytów T CD4+ jak wytworzono powyżej następnie dodawano do każdej studzienki. Użyteczne kontrole obejmują rozcieńczone DMSO puste próby, i kontrole pozytywne z toksoidem tężca.

Końcowe stężenia w każdej studzience, przy 210 mikrolitrowej całkowitej objętości są następujące:

2x10⁴ CD4+

2x10⁵ komórki dendrytyczne (R: S jak 10: 1) mM peptydu

PL 210 859 B1

P r z y k ł a d 3

Badanie obniżonego działania uczulającego przez odmiany proteaz testem proliferacji całych enzymatycznych/ludzkich komórek in vitro

Uzasadnienie:

Test ten został zaprojektowany do badania in vitro proliferacyjnej odpowiedzi ludzkich z krwi obwodowej jednojądrowych komórek (PBMC) na peptyd według wynalazku (P1, BPN'-Y217L) i jego odmiany. P1 i odmiany enzymu inaktywowano przez działanie fenylo metylo sulfonyl fluorku (PMSF). Ludzkie PBMC hodowano przy zwiększanych dawkach inaktywowanej P1 i wszystkich odmian, które miały być badane. Odmiany badane w tych doświadczeniach były następujące:

LAP 1: BPN'-Y217L; I79A

LAP 2: BPN'-Y217L; I79A; I122A

LAP 3: BPN'-Y217L; N76D; I122A

LAP 4: BPN'-Y217L; N76D; I79A; I122A

LAP 5: BPN'-Y217L; N76D

Proliferacja w odpowiedzi na P1 wskazywała, że cała cząsteczka została poddana obróbce i prezentowana limfocytom T przez komórki prezentujące antygen w populacji PBMC. Braki proliferacji w wyniku działania odmian może wskazywać gdzie aminokwasowe modyfikacje spowodowały z sukcesem zahamowaną obróbkę, prezentację i/lub rozpoznanie przez limfocyty T epitopów P1.

Sposoby:

Ludzkie próbki kożuszka krwi otrzymano z Centrum Krwi ze Stanford University (Palo Alto, CA). PBMC wyizolowano przez rozdział gęstościowy, przemyto w roztworem soli Dulbecco's buforowanym fosforanem (DPBS) i zliczano.

P1 i jego odmiany inaktywowano PMSF: 100 mM PMSF w 100% etanolu dodano do 2 mg/ml roztworu enzymów przy rozcieńczeniu 1: 50. Mieszaninę worteksowano i pozostawiono, aby stała w temperaturze pokojowej przez 5 minut. PMSF dodano znowu przy rozcieńczeniu 1: 50, i pozostawiono, aby stała przez kolejne 5 minut. PMSF dodano trzeci raz, pozostawiono, aby stała dodatkowe 5 minut i pozostałą aktywność enzymatyczną oznaczano testem kolorymetrycznym z substratem sukcynilo-Ala-Ala-Pro-Phe-para-nitroanilidem (Delmar, EG, i wsp., (1979)).

PBMC ponownie zawieszono przy stężeniu 2 x 10⁶ komórki/ml w 5% ludzkiej surowicy AB, RPMI 1640 (pen/strep/glutamina). Komórki umieszczano na szalkach przy 2 ml/studzienkę w 24 studzienkowych szalkach i dodawano enzymy. Każdego dawcę badano P1, i tak wieloma odmianami jak tylko mogły być przebadane (ograniczenie w liczbie komórek). Stężenia enzymu stosowanego przez większość tych badań wynosiły 1,5 10 i 20 μg/ml. Ostatnie dziewięć doświadczeń wykonywano przy zwiększonym zakresie dawek 5, 10, 20 i 40 μg/ml enzymu. Jednakże, w celu zachowania ciągłości dane połączono tutaj w oparciu o górną dawkę 20 μg/ml. Hodowle inkubowano przy 37°C, 5% CO₂ przez 5 dni. Piątego dnia, hodowle ponownie zawieszono przez pipetowanie i 100 μl replikantów z każdej studzienki przenoszono na 96 studzienkowe szalki. Studzienki poddano pulsacji mianowaną tymidyną (0,5 uCi/studzienkę) i pozostawiono do inkubacji przez 6 godzin w temperaturze 37°C.

Z szalek następnie zbierano komórki i wbudowane zliczenia określono.

Wyniki:

Od 30 do 40 osobników badano pod kątem ich odpowiedzi na P1 i odmiany oparte na P1 (np., LAP1-LAP5). Enzym LAP5 dodano do protokołu później i tylko 18 osobników badano tą odmianą. Wyniki dla wszystkich osób połączono i przedstawiono w tabeli i na wykresie poniżej. Wynik był określany jako dodatni (tak) jeżeli indeks stymulacji (S.I.) był wyższy niż lub równy 2,0 przy większych dawkach. Odpowiedź była nazwana słabą jeśli S.I. był mniejszy niż 2,0, lecz powyżej indeksu tła (Fig. 4).

Sześćdziesiąt procent wszystkich dawców badanych wzniosło się do proliferacyjnej odpowiedzi na P1 przy S.I. 2,0 lub lepszym. Odpowiedzi dla wszystkich 6 enzymów zestawiono, i przedstawiono w tabeli poniżej:

T a b e l a 1

P1	LAP1	LAP2	LAP3	LAP4	LAP5
n=40	n= 40	n=37	n=34	n=33	n= 18
22% nie	87% nie	65% nie	82% nie	69% nie	83% nie
17% słabe	2% słabe	11% słabe	3% słabe	18% słabe	11% słabe
60% tak	10% tak	24% tak	15% tak	12% tak	5% tak

PL 210 859 B1

Wiele osobników, u których stwierdzono pozytywne odpowiedzi na odmiany miało znacznie niższe odpowiedzi niż na wyjściową cząsteczkę P1.

Wnioski:

Wszystkie odmiany badane indukują niższy procent respondentów. Wszystkie odmiany obejmują aminokwasowe zmiany w regionie 70-84, bądź zmianę N76D, lub zmianę I79A. Kilku dawców odpowiadało na każdą z odmian, co sugeruje, że odmiany mogły zostać poddane obróbce i mogły być prezentowane przez komórki prezentujące antygen w hodowlach. Jednakże, odpowiedzi na te odmiany były zawsze niższe niż na wyjściową cząsteczkę P1. Tylko u jednej osoby z 40 badanych (T78186) wystąpiła odpowiedź na odmianę przy braku odpowiedzi na wyjściowy enzym. Dawca ten odpowiadał na LAP1 i LAP2, lecz nie na LAP3, LAP4 lub LAP5.

P r z y k ł a d 4

Wyznaczenie specyficzne zmienionej reszty uczulającej w epitopie.

Odmiany peptydu oparte na sekwencji 70-84 z P1 badano testem mapowania Sticklera, i wsp. na 20 próbkach krwi ze społeczności dawców. Zestaw peptydów skonstruowano w Mimostopes (San Diego, CA), dla każdej odmiany peptydu, przesunięcie o 3 aminokwasy 15-merów skonstruowano aby pokryć cały region o proponowanej zmianie. Wykonano to aby zapewnić, że nie tworzymy nowych epitopów rozpoznawanych przez limfocyty T w innym 3-merowej ramce odczytu gdy odmiana jest włączona do słabo uczulających proteaz. Wyjściowe białka w zestawie analizowano spektrometrią mas i stwierdzono, że obejmują w przybliżeniu 70% nietkniętego 15-meru.

Peptydowe sekwencje były następujące:

Peptyd
70-84	GTVAALNNSIGVLGV
I79A	GTVAALNNSAGVLGV
N76D	GTVAALDNSIGVLGV
N76D/I79A	GTVAALDNSAGVLGV
V81A	GTVAALNNSIGALGV
N76DA/81A	GTVAALDNSIGALGV
I79T	GTVAALNNSTGVLGV
N76D/I79T	GTVAALDNSTGVLGV

Przesunięć o trzy jednostki w każdym regionie nie wykazano ze względu na przejrzystość.

Dwadzieścia próbek krwi stosowano do badania wszystkich odmian peptydu. Peptydy stosowano przy 5 μΜ. W tej grupie, stwierdzono, że 50% dawców odpowiadało na region 70-84 Fig. 4b. Wszystkie z odmian 70-84 indukowały znacząco mniej liczne odpowiedzi. Proszę zauważyć, że tylko jedna osoba odpowiadała na peptyd I79A i nikt nie odpowiadał na peptyd N76D, co ilustruje obniżenie odpowiedzi immunologicznej na kolejne odmiany przy wyszczególnionych modyfikacjach peptydu.

P r z y k ł a d 5

Wyznaczanie w obrębie drugiego epitopu reszty specyficznie zmieniającej działanie uczulające

Zestaw peptydów podstawionych alaniną opisujących region 109-123 P1 badano standardową testową procedurą wstrzykiwania (Stickler, MM, i wsp. J. Immunother. 23 (6): 654-660 (2000). Sekwencja 109-123 była następująca: NGIEWAIANNMDVIN. Peptydy podstawione alaniną są jak przedstawiono na Fig. 6. Osoby nie odpowiadające przedstawiono na Fig. 4c.

Badano całkowitą liczbę grupy o dwudziestu dawcach. Dwa osobniki osiągnęły indeks stymulacji [SI] 3 lub więcej (Fig. 5), zgodnie z niskim procentem nie stykających się dotąd z bodźcem respondentów w tym regionie. Wartość stymulacji 1,0 jest równa poziomowi linii podstawowej. Na przykład, wartość indeksu stymulacji 2 znaczy, że odpowiedź była dwa razy taka jak na podstawowym poziomie. W celu wytworzenia bardziej solidnego przypisania reszt kotwiczących, dana dla wszystkich osobników, których odpowiedzi SI względem kontrolnego peptydu wynosiły 2 lub lepiej również zebrano (Fig. 7). Z tych danych, zmiana w pozycji 13 została uznana za najlepiej obniżającą immunogenność, gdyż żadna z nie reagujących osób nie osiągnęła odpowiedzi przy tej zmianie (Fig. 7) i wszyscy respondenci z SI 2 lub lepszym na kontrolny peptyd wykazali obniżoną proliferację na ten zmieniony

PL 210 859 B1 peptyd. Zmianę aminokwasową w peptydzie nr 13 oznaczono jako I122A, i miałaby taką sekwencję: NGIEWAIANNMDVAN.

Ponadto, z tych danych, zmiana w pozycji 11 została uznana za najlepszą do zwiększania odpowiedzi immunologicznej gdyż troje do pięciorga respondentów o SI 2 lub lepszej na kontrolny peptyd wykazywała zwiększoną proliferację na ten zmieniony peptyd. Zmiana aminokwasu w peptydzie nr 11 jest oznaczona D120A i miałaby taką sekwencję: NGIEWAIANNMAVIN.

P r z y k ł a d 6

Redukcja alergenności in vivo myszy HLA-DR3/DQ2 odpowiedzi limfocytów T na P1

Sposoby:

Transgen HLA-DR3/DQ2 został prowadzony na podłożu MHC klasy II knockout (C2D) tworząc myszy stosowane tym badaniu (Cosgrove D, i wsp.. Cell 6: 1051-66 (1991). Zarówno żeńskie jak i męskie myszy stosowano w tych badaniach. Zwierzęta w wieku w zakresie od jednego roku do 6-8 tygodnia. Wszystkie zwierzęta hodowano i utrzymano w zwierzętarniach Aviron Animal Facility (Mountain View, CA), obiektach przyjętych przez AALAC. Zwierzęta sprawdzano cytometrią przepływową i stwierdzono, że prowadzą ekspresję na wysokich poziomach HLA-DR i niskich poziomach HLA-DQ stosując dwa różne odczynniki przeciwciała anty-HLA-DQ. U samic zachodzi ogólna ekspresja na wyższych poziomach cząsteczki HLA u samców. Zwierzęta immunizowano różnymi sposobami, obejmującymi immunizację na poduszeczce łapy zwierzęcia w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA), dootrzewnową immunizację w CFA, i dootrzewnową immunizację P1 wytrąconym alumem. Pewne zwierzęta immunizowano wieloma drogami.

Wyniki:

Aby sprawdzić, że u myszy HLA-DR3/DQ2 następuje obróbka i prezentacja epitopów 70-84 i/lub 109-123 z nienaruszonego enzymu P1 odpowiedzi limfocytów śledzionowych zostały zmapowane epitopowo u myszy immunizowanych P1. Samice i samce myszy immunizowano trzy razy 10 ug P1 w ałunie, w dniu 1, 3 i 10. Śledziony usuwano w 15 dniu. Limfocyty śledzionowe od samic myszy umieszczano in vitro przy 10⁶ komórek na studzienkę z 50 ug/ml peptydu P1. Limfocyty śledzionowe od 5 samców myszy połączono, i podwójne hodowle założono jak opisano dla limfocytów śledzionowych samic myszy. Hodowle pulsacyjnie traktowano 0,5 uCi mianowaną tymidyną przez 24 godziny i zbierano po 48 godzinach. Zliczenia w replikach hodowli uśredniano i linię podstawową odejmowano. Zliczenia linii podstawowej dla każdej hodowli wynosiły 2486 ±218 cpm dla samic HLA-Dr3/DQ2 P1 w ałunie (Fig. 7a) i 5314±529 cpm dla samców HLA-DR3/DQ2 P1 w ałunie (Fig. 7B). Samice myszy odpowiadały na 20 ug/ml P1 inaktywowanego PMSF w hodowli przy SI 2,2, limfocyty śledzionowe samców przy SI 1,7. Odpowiedzi na 10 ug/ml PHA były silne, dla samic wykazywały SI = 18 i samców SI = 10.

Obie grupy myszy (samce i samice opisane powyżej) osiągały znaczącą odpowiedź na peptyd 109-123. Odpowiedź na 70-84 tracono u samic myszy immunizowanych tą drogą. Jednakże, samce myszy wykazywały odpowiedź na ten peptyd.

P r z y k ł a d 7

Konstrukcja słabo alergennych stabilnych odmian proteazy

Po wyznaczeniu lokalizacji epitopu rozpoznawanego przez limfocyty T, odmiany proteaz skonstruowano stosując ustalone techniki inżynierii białkowej. Odmiany skonstruowano tak, by wysoce uczulająca sekwencja aminokwasowa białka została zastąpiona odpowiadającą jej sekwencją z mniej uczulającego homologu. W tym przypadku, różne reszty podstawiono do zmutowanej subtylizyny z B. amyloliquefaciens (P1). Wytwarzanie proteazy P1 ujawniono w opisie patentowym US RE 34,606, europejskim opisie patentowym 130,756 i opisie patentowym US Nr 5,441,882. Gen kodujący odmianę P1 i gen markerowy chloramfenikolu były flankowane przez powtórzoną sekwencję odpowiadającą resztom z sekwencji 5' do apre E loci w celu amplifikacji liczby kopii, stosując selekcję chloramfenikolem.

Trzy zmutowane proteazy skonstruowano.

LAP2

Odmianę proteazy LAP 2 wprowadzono do P1 (BPN'-Y217L) przez przekształcenie I79 w alaninę i I122 w alaninę przez skierowaną punktowo mutagenezę w wektorze opartym na pBluescript.

W otrzymanym plazmidzie LAP 2, sekwencję 5' do aprE locus powtarzano po genie chloramfenikolu w celu amplifikacji liczby kopii genu stosując zwiększające się stężenia chloramfenikolu. Szczep produkujący Bacillus transformowano plazmidem LAP2 stosując standardową procedurę transformacji. Transformanty selekcjonowano na szalkach z LA zawierających 5 ug/ml chloramfenikolu. TransPL 210 859 B1 formanty hodowano i utworzono hodowle następcze w pożywce LB przy zwiększanych poziomach chloramfenikolu w celu amplifikacji liczby kopii genu LAP2 w chromosomie. Po amplifikacji szczepów z LAP2 w 25 μ g/ml chloramfenikolu, transformanty LAP2 umieszczano w LA+25 μ g/ml chloramfenikolu zawierającym 1% odtłuszczone mleko i badano pod kątem obecności obwódek, które wskazywały aktywność proteazy. Szczepy ze zamplifiowanym LAP2 wytwarzały obwódki w teście na szalkach z odtłuszczonym mlekiem.

LAP 3

Odmianę proteazy LAP3 wprowadzono do P1 przez zastąpienie N76 resztą kwasu asparaginowego i zastąpienie I122 alaniną przez skierowaną punktowo mutagenezę w wektorze opartym na pBluescript tworząc LAP3. Szczep produkujący Bacillus transformowano plazmidem LAP3 i amplifikowano jak opisano powyżej, i umieszczano na szalkach z odtłuszczonym mlekiem. Transformanty LAP3 wytwarzały obwódki w teście na szalkach z odtłuszczonym mlekiem.

LAP4

Odmianę proteazy LAP 4 wprowadzono do P1 przez zastąpienie N76 resztą kwasu asparaginowego, I79 resztą alaniny i I122 w alaninę przez skierowaną punktowo mutagenezę w wektorze opartym na pBluescript tworząc LAP4. Szczep produkujący Bacillus transformowano plazmidem LAP4 i amplifikowano jak opisano powyżej, i umieszczano na szalkach z odtłuszczonym mlekiem. Transformanty LAP4 wytwarzały obwódki w teście na szalkach z odtłuszczonym mlekiem.

P r z y k ł a d 8

Mutacje stabilizujące słabo alergenne proteazy (N76D, I79A, I122A, N218S, Q206L, P40Q, D41A, H238Y)

Odmiany wytworzone w celu zwiększenia stabilności przez mutacje skierowane punktowo wymieniono poniżej:

P1-N76D/I79A/I122A/N218S;

P1-N76D/I79A/I122A/Q206L;

P1-N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S;

P1-I79A/I122A/Q206L;

P1-I79A/I122A/N218S;

P1-I79A/I122A/P40Q;

P1-I79A/I122A/D41A i

P1-I79A/I122A/H238Y

Każdą odmianę proteazy wprowadzono do P1 przez zastąpienie odpowiedniej reszty według potrzeby (np. N76 resztą kwasu asparaginowego, I79 resztą alaniny, I122 resztą alaniny, Q206 resztą lizyny, N218 resztą seryny, P40 resztą glutaminy, D41 resztą alaniny, i H238 resztą tyrozyny) przez mutagenezę skierowaną punktowo w wektorze opartym na pBluescript tworząc odpowiednie stabilizowane odmiany LAP. Szczep produkujący Bacillus transformowano plazmidem LAP każdej stabilizowanej odmiany i amplifikowano jak opisano powyżej i umieszczano na szalkach z odtłuszczonym mlekiem. Transformanty LAP wytwarzały obwódki w teście na szalkach z odtłuszczonym mlekiem.

P r z y k ł a d 9

Mutacje stabilizujące słabo alergenne proteazy (A216K, D181G, S101V, G215A, A216E, L217S, R247Y, R247S, R247Q, G48S, S101Q/S154G, G128S, S182T, S101R, Y104W/I107V, L250G, T254G, T254A, G258S, M50A, G47S, A48G, S182R, S183R, Q185A, S101R/I107V, S248G, Y262F)

Odmiany wytworzone w celu zwiększenia stabilności przez mutacje skierowane punktowo wymieniono poniżej:

P1-N76D/I79A/1122A/A216K;

P1-N76D/I79A/I122A/D181G;

P1-N76D/I79A/I122A/S101V;

P1-N76D/I79A/I122A/G215A;

P1-N76D/I79A/I122A/A216E;

P1-N76D/I79A/I122A/L217S;

P1-N76D/I79A/I122A/R247Y;

P1-N76D/I79A/I122A/R247S;

P1 -N76D/I79A/I122A/R247Q;

P1-N76D/I79A/I122A/G46S;

P1-N76D/179A/I122A/S101Q/S154G;

PL 210 859 B1

P1-N76D/I79A/I122A/G128S;

P1-N76D/I79A/I122A/S182T;

P1-N76D/I79A/I122A/S101R;

P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V;

P1-N76D/I79A/I122A/L250G;

P1-N76D/I79A/I122A/LT254G;

P1-N76D/I79A/I122A/T254A;

P1-N76D/I79A/I122A/G258S;

P1-N76D/I79A/I122A/M50A;

P1-N76D/I79A/I122A/G47S;

P1-N76D/I79A/I122A/A48G;

P1-N76D/I79A/I122A/S182R;

P1-N76D/I79A/I122A/S183R;

P1-N76D/I79A/122A/Q185A;

P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V;

P1-N76D/I79A/I122A/S248G i

P1-N76D/I79A/I122A/Y262F;

Każdą odmianę proteazy wprowadzono do P1 przez zastąpienie odpowiedniej reszty według potrzeby (np. N76 resztą kwasu asparaginowego, I79 resztą alaniny, I122 resztą alaniny, A216 resztą lizyny, D181 resztą glicyny, S101 resztą waliny, G215 resztą alaniny, itp.) przez mutagenezę skierowaną punktowo w wektorze opartym na pBluescript tworząc odpowiednie stabilizowane odmiany LAP. Szczep produkujący Bacillus transformowano plazmidem LAP każdej stabilizowanej odmiany i amplifikowano jak opisano powyżej i umieszczano na szalkach z odtłuszczonym mlekiem. Transformanty LAP wytwarzały obwódki w teście na szalkach z odtłuszczonym mlekiem.

P r z y k ł a d 10

Hydroliza dimetylo kazeiny (DMC) przez zmutowaną odmianę subtylizyny

Zmutowane odmiany subtylizyny (P1, LAP2, LAP3, i LAP4), wyizolowano i oczyszczono sposobami opisanymi w obecnym opisie, analizowano pod kątem ich zdolności do hydrolizy komercyjnego syntetycznego substratu, dimetylo kazeiny (Sigma C-9801). Roztwór substratu 5 mg/ml DMC wytworzono w odpowiednim buforze (5 mg/ml DMC, 0,005% (udział masowy) Tween 80®; (mono-oleinian polioksyetyleno sorbitanu. Sigma P-1754)). Odpowiednie bufory do substratu DMC były następujące: 50 mM octan sodowy przy pH 5,5; 50 mM N kwas tris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetano sulfonowy (TES) przy pH 6,5; 50 mM kwas piperazyno-N-N'-bis-2-etano sulfonowy (PIPES) przy pH 7,5 i 50 mM Tris przy pH 8,5. 200 μl o żądanym pH substratu przenoszono do 96-studzienkowych mikrotitracyjnych szalki i wstępnie inkubowano w temp. 37°C przez dwadzieścia minut przed dodaniem enzymu. Solą 2,4,6-trinitrobenzeno sulfonianową (TNBS) w badanej reakcji określono na spektrofotometrze Spectra Max 250. Test ten mierzy enzymatyczną hydrolizę DMC na peptydy zawierające wolne grupy aminowe. Te grupy aminowe oddziałują z kwasem 2,4,6-trinitrobenzeno sulfonowym, aby utworzyć żółto zabarwiony kompleks, jak przedstawiono na poniższej reakcji:

Zatem im bardziej intensywnie zabarwiona reakcja, tym większa aktywność jest mierzona. Test wykrywania TNBS wykonywano na supernatancie po dwóch godzinach inkubacji przy 37°C. 1 mg/ml roztworu TNBS wytworzono w odczynniku (2,4 g NaOH, 45,4 g Na2B4)7 10H2O rozpuszczonym przez ogrzewanie w 1000 ml). 60 μl podzielono na równe ilości w 96-studzienkowej szalce mikrotitracyjnej. 10 μl inkubowanego roztworu enzymu opisanego powyżej dodawano do każdej studzienki i mieszano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 20 μl roztworu NaH₂PO₄ (70,4 g NaH₂PO₄-H₂O i 1,2 g Na2SO3 w 2000 ml) mieszano przez 1 minutę w studzience aby zatrzymać reakcję i określano absorbancję przy 405 nm spektrofotometrem SpectraMax 250. Pustą próbę (sam roztwór TNBS bez enzymu) również wytworzono. Hydrolizę określono poniższym wzorem: Absorbancja405 (roztwór enzymu)- Absorbancja405 (bez enzymu) przy różnych stężeniach enzymu (0; 2,5; 5; 7,5 i 10 ppm). Dane na fig. 8a-10 przedstawiają porównawczo zdolność zmutowanej odmiany do hydrolizy takiego substratu względem proteazy ze znanej zmutowanej odmiany (P1).

Jak widać na rysunku, wszystkie trzy enzymy wykazywały znaczącą hydrolizę substratów DMC przy różnych wartościach pH i różnych stężeniach enzymu.

P r z y k ł a d 11

Hydroliza kolagenu, elastyny, i keratyny przez odmiany proteaz

PL 210 859 B1

Zmutowane odmiany subtylizyny (P1, LAP2, LAP3, i LAP4), wyizolowano i oczyszczono sposobami opisanymi powyżej, analizowano pod kątem zdolności do hydrolizy komercyjnych substratów, bydlęcy kolagen (Sigma C-9879), bydlęcą elastynę (Sigma E-1 625), i bydlęcą keratynę (ICN Biomedical 902111). Wytworzono 5 mg/ml roztwór substratu (0,005% Tween 80®). Każdy substrat wytworzono w odpowiednim pH jak opisano (np. pH 5,5; 5; 7,5 i 8,5). 1,5 ml każdego substratu przenoszono do 24-studzienkowej szalki Costar przy 37°C. Szalki wstępnie inkubowano przy 37°C przez dwadzieścia minut przed dodaniem enzymu. Test wykrywania TNBS jak opisano powyżej wykonywano na supernatancie po dwóch godzinach inkubacji przy 37°C.

Dane na fig. 11-13 przedstawiają porównawczo zdolność zmutowanych odmian do hydrolizy takich substratów względem proteazy ze znanej zmutowanej odmiany (P1). Aktywności są stosunkowo blisko. Odmiana LAP 3 hydrolizowała kolagen lepiej niż znana odmiana P1 i lepiej niż wcześniej opisane proteazy hybrydowe.

Jak widać na rysunku, wszystkie trzy enzymy wykazywały znaczącą hydrolizę substratów kolagenu, elastyny i keratyny przy różnych wartościach pH i różnych stężeniach enzymu.

P r z y k ł a d 12

Stabilność termiczna odmian proteazy w buforze kwasu piperazyno-N-N'-bis-2-etano sulfonowego (PIPES)

Parametry: Określone w urządzeniu do termocyklingu PCR typu Stratagen Robocycler 5,0 ppm enzymu (zastosowanie jednego z P1, LAP2, LAP3, LAP4), pobrano w pięciu punktach czasowych (5, 10, 20, 40 i 60 minut) przy pH 6,5 w każdej temperaturze (w zakresie od 42-56°C przy dwóch okresach w powyżej opisanym urządzeniu do termocyklingu PCR), zmierzono stabilność przy każdym stopniu C od 42 do 56.

Wytworzono 50 mM buforu PIPES (50 mM PIPES, 0,005% Tween 80®). pH doprowadzono do 6,5.

Próbki badano stosując standardowy test sukcynilo-ala-ala-pro-phe-para-nitro anilidu (SAAPFpNA) (Delmar, NP., i wsp., Anal. Biochem. 94 (1979) 316-320; Achtstetter, Arch. Biochem. Biophys 207; 445-54 (1981)) (pH 6.5,25 C). Próbki rozcieńczono do około 300 milliOD/minutę. Stabilność termiczną określono jako czas półtrwania enzymu (min) jak wyznaczono według: H. L. = In 2/nachylenie, w którym nachylenie oznacza nachylenie krzywej szybkości względem czasu dla każdej temperatury.

Jak widać na fig. 14 zmutowana odmiana LAP 4 ma najlepszą stabilność, lepszą niż stabilność kontrolnej P1 w wyższej temp. niż 52°C.

P r z y k ł a d 13

Stabilność termiczna odmian proteazy w kwasie N-tris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetano sulfonowym (TES)

Parametry: 5,0 ppm enzymu P1, LAP 2, LAP 3, LAP 4, pobrano w pięciu punktach czasowych (5, 10, 20, 40 i 60 minut) przy pH 6,5 w każdej temperaturze (w zakresie od 42 do 56°C z przerwami co dwa stopnie, stosując gradient temperatury w urządzeniu do termocyklingu PCR opisanym powyżej), zmierzono stabilność przy każdym stopniu C od 42 do 56.

Bufor TES wytworzono przez zmieszanie 50 mM TES (Sigma T 1375), 0,005% Tween 80®. pH dostosowano do 6,5.

Stabilność termiczną odmian określono jako aktywność pozostałych odmian jak zmierzono stosując test sukcynilo-ala-ala-pro-phe-para-nitroanilidu (AAPFpNA) (Sigma no. S7388, Mol. Wt. 624.6 g/mole) (NP. Delmar i wsp., Anal. Biochem. 94 (1979) 316320, Achtstetter Arch. Biochem. Biophys 207: 445-454 (1981)) pH 6,5, 25°C). Utworzony (żółty) p-nitronanilid (pNA) zmierzono spektrofotometrycznie przy 410 nm: ε_ω =8,480 M^-1cm^-1, () spektrofotometrem SpectraMax 250, próbki rozcieńczono do około 300 mOD/min. Stabilność termiczną określono jako czas półtrwania enzymu (min) jak opisano powyż ej.

Jak widać na fig. 15 zmutowana odmiana LAP 4 ma najlepszą stabilność, lepszą niż stabilność kontrolnej P1 w wyższej temp. niż 50°C.

P r z y k ł a d 14

Hydroliza dimetylo kazeiny (DMC) i keratyny przez zmutowaną odmianę subtylizyny

Porównano aktywność enzymatyczną odmian wytworzonych jak opisano w przykładzie 9 względem aktywności enzymatycznej LAP 2 stosując substraty DMC i keratynę jak opisano w sposobach przedstawionych w przykładach 10 i 11.

PL 210 859 B1

Wyniki podsumowano w tabeli 2.

T a b e l a 2

Mutacja	Aktywność enzymu w porównaniu do LAP2
	DMC	Ke raty na
LAP2-A216K		>
LAP2-D181G	>	>
LAP2-S101V	>	>
LAP2-G215A	>	>
LAP2-A216E	>	>
LAP2-L217LS	>	>
LAP2-R247Y	>	>
LAP2-R247S	>	>
LAP2-R247Q	>	>
LAP2-G46S	>	>
LAP2-S101G-S154G	>	>
LAP2-G128S	>	>
LAP2-S182T	>	>
LAP2-S101R	>	>
LAP2-Y104W-1107V	>	>
LAP2-L250G	>	>
LAP2-T254G LAP2-T254A	>	>
LAP2-G258S	>	>
LAP2-M50A	>	>
LAP2-G47S	>	>
LAP2-A48G	>	>
LAP2-S182R		>
LAP2-S183R	>	>
LAP2-Q185A	>
LAP2-S101 R-I107V	>
LAP2-S248G	>	>
LAP2-Y262F	>

P r z y k ł a d 15

Stabilność odmiany proteaz w roztworze środka do mycia ciała

Stosując sklonowane enzymy (jak opisano w przykładzie 1), stabilność różnych odmian proteaz zmierzono stosując poniższy protokół. Wyniki podsumowano w tabeli poniżej.

Sposób pomiaru stabilności roztworu środka do mycia ciała

Parametry: (P1, LAP2, LAP3, LAP4), 30 minut w temp 45°C w jednym badaniu i 30 minut w temp. 50°C w drugim badaniu.

50/50 (udział masowy) roztworu środka do mycia ciała wytworzono przez zmieszanie środka do mycia ciała sprzedawanego pod nazwą, znakiem towarowym ZEST ® (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio), z dejonizowaną wodą. pH mieszaniny buforowej wynosiło około 6,8.

Badane enzymy rozcieńczono tak, aby ich końcowe stężenia wynosiły 50% wagowych płynu do mycia ciała: dejonizowana woda w roztworze wytwarzając zmiany w OD₄₀₅ 0,5 do 1,0 gdy 10 μ! enzyPL 210 859 B1 mu/roztworu do mycia ciała badano stosując test SAAPFpNA, sposób punktu końcowego (Delmar, i wsp. 1979). Gdy wartość rozcieńczenia została potwierdzona, 200 ul rozcieńczonej mieszaniny umieszczono w 96-studzienkowych szalkach mikrotitracyjnych. Szalki szczelnie zamykano i umieszczono w łaźni wodnej przy 40°C, w jednym badaniu i przy 50°C, w innym badaniu. Szalki usuwano z łaźni wodnej po 45 minutach i 10 ul próbki badano sposobem punktu końcowego. % pozostały obliczono jako 100 krotną końcową aktywność podzieloną przez wstępną aktywność.

T a b e l a 3 % pozostałej aktywności przy 40 i 50°C.

odmiana	40°	50°
Y217L*	84	11
Y217L, N76D, I122A	- -	71
Y217L, N79A, I122A	56	11
Y217L, N76D, N79A, I122A	75	29
Y217L, N76D, N79A, I122A, N218S	94	64
Y217L, N76D, N79A, I122A, Q206L	90	58
Y217L, N76D, N79A, I122A, Q206L, N218S 105	84
Y217L, N79D, I122A4, Q206L	76
Y217L, N79D, I122A4, N218S	85
Y217L, N79D, I122A4, P40Q	72
Y217L, N79D, I122A4, D41A	77
Y217L, N79D, I122A4, H238Y	73

*BPN'= B. amyloliquefaciens (Y217-> L)

Jak widać w tabeli 3, odmiany obejmujące N76D mają zwiększoną pozostałą aktywność enzymatyczną a zatem mają szerszą stabilność termiczną niż P1. Na przykład, przy 50°C, związki N76D miały 71%, 29%, 64%, 58% i 84% aktywności pozostałej podczas gdy P1, odmiana bez reszt stabilizujących, miały tylko 11% pozostałej aktywności. Ponadto, podczas gdy Q206L; N218S, P40Q, D41A, i H238Y miały 76%, 85%, 72%, 77%, i 73% pozostałej aktywności podczas gdy LAP2 miała 56% pozostałej aktywności, odmiana bez reszt stabilizujących. Wszystkie enzymy miały zwiększoną stabilność w obecności środka do mycia ciała w 50°, lecz P1-N76D, N79A, I122A, Q206L, N218S miały najlepszą stabilność.

PL 210 859 B1

Wykaz sekwencji <110> Estell, David A.

Ganshaw, Grant C.

Harding, Fiona A.

Larenas, Edmund A.

Poulose, Ayrookaran J.

Sikorski, Elizabeth E.

Russell/ Elliott P.

<120 Białka wytwarzające zmienioną odpowiedź immunologiczną i sposoby otrzymywania i stosowania tych białek <130> GC683-2 <140> US 10/104,693 <141> 2002-03-22 <160> 31 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Bacillus amyloiguefaciens <400> 1 ggtc bactaa ttattctgca gti Lgctgtt aggcggcagg gcacgatgag agcaattcaa tgaaaaaaga agtccgtgcc ctggatcaaa taaaggtagc actctcacgg taggcgttgc gccaatacag

Ltaacatgag ccgttgcatc caagcacagt gcagcaacca gcgtatctat tggcatctcc caaacactca actatggaaa cttggccccg cggatggctc aacggccaag gtaacggtcg aatattattc aatgaaaaaa tgctttagcg gaaatcaaac cgccgctaag atatgtagac cccgagcgtc ttaoggcgta tgttaaagta aggcggagcc aactcacgtt gocaagcgca otggatcatt cctcggcgga cggcgtcgta gggctaccct aagagcatct ccaaagcacg gcacgttgcc agtccgcagc agggctgatc ccggtttttt cctctgaaaa rcctgaaacg gcggcgtttt catactatac aggagaggat ttaatcttta ggggaaaaga aagaaagatg gcagcttcag gcttacgttg tcacaaatta gcggttatcg agcatggttc gccggcacag tcactttacg aacggaatcg ccttctggtt gtcgttgcgg ggtaaatacc ttctcaagcg cttcctggaa ggagcggctg agtttagaaa aacgtacagg atttttcttc ttttaacgag tctcaatcgc ccigataccg aattaataca aaagagtgag cgatggcgtt aatatattgt tcatttctga ctacattaaa aagaagatca aagcccctgc acagcggtat cttctgaaac ttgcggctct ctgtaaaagt agtgggcgat ctgctgcttt cagccggtaa cttctgtcat zaggacctga acaaatacgg ctttgattct acaccactac cggcagotca ctccgcatgt aaacggcggg cgcttcccgg ggagacggca cagaataatc aggcaaaaaa cggcagcaca cgggittaaa aaaaggcggg cgaaaaagct cgtagcacat tctgcactct cgattcttct aaatccrttc taataactca tctcggtgct cgcaaacaat aaaagcggca cgaaggcact tgcagtaggc gcttgatgtc ggcgtacaac ttctaagcac saaacttggt g Laaaacata tcaatccgct ttgacccggc tttccggtca ttcgtaatcg tgtctattgg gtatgga Lca tcctctgccc cagacaatga aaagtgcaaa gtaaaagaat gcgtacgcgc caaggctaca catcctgatt caagacaaca atcggtgtar gacggttccg atggacgtta gttgataaag tccggcagcL gctgttgaca atggcacctg ggtacgtcaa ccgaactgga gattctttot aaaaaccggc ccataatcga tcagtcccgt gctcaatgcc gat c

120 180 240 300 360 420 480 540 60C 660 720 780 340 900 960 1020 1080 114 0 1200 1260 1320 1380 1440 1494 <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Bacillus amyloiguefaciens <400 2

PL 210 859 B1

Met

Arg

Gly Lys

Lys

Val

Trp

Ile

Ser

Leu

Leu

Phe

Ala

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Ile

Phe

Thr Met

Ala

Phe

Gly

Ser

Thr

Ser

Ser

Ala

Gin

Ala

Ala

Gly

20

25

30

Lys

Ser

Asn Gly

Glu

Lys

Lys

Tyr

Ile

Val

Gly

Phe

Lys

Gin

Thr

Met

35

40

45

Ser

Thr

Met Ser

Ala

Ala

Lys

Lys

Lys

Asp

Val

Ile

Ser

Glu

Lys

Gly

50

55

60

Gly

Lys

Val Gin

Lys

Gin

Phe

Lys

Tyr

Val

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Thr

65

70

75

80

Leu

Asn

Glu Lys

Ala

Val

Lys

Glu

Leu

Lys

Lys

Asp

Pro

Ser

Val

Ala

85

90

95

Tyr

Val

Glu Glu

Asp

His

Val

Ala

Ηϊ s

Ala

Tyr

Ala

Gin

Ser

Val

Pro

100

105

110

Tyr

Gly

Val Ser

Gin

Ile

Lys

Ala

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Gin

Gly

Tyr

115

120

125

Thr

Gly

Ser Asn

Val

Lys

Val

Ala

Val

Ile

Asp

Ser

Gly

Ile

Asp

Ser

130

135

140

Ser

His

Pro Asp

Leu

Lys

Val

Ala

Gly

Gly

Ala

Ser

Met

Val

Pro

Ser

145

150

155

160

Glu

Thr

Asn Pro

Phe

Gin

Asp

Asn

Asn

Ser

His

Gly

Thr

His

Val

Ala

165

170

175

Gly

Thr

Vai Ala

Ala

Leu

Asn

Asn

Ser

Ile

Gly

Val

Leu

Gly

Val

Ala

180

185

190

Pro

Ser

Ala Ser

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

Gly

Ala

Asp

Gly

Ser

195

200

205

Gly

Gin

Tyr Ser

Trp

Ile

Ile

Asn

Gly

Ile

Glu

Trp

Ala

Ile

Ala

Asn

210

215

220

Asn

Met

Asp Val

Ile

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Gly

Ser

Ala

225

230

235

24 0

Ala

Leu

Lys Ala

Ala

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

Ser

Gly

Val

Val

Val

245

250

255

Val

Ala

Ala Ala

Gly

Asn

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser

Thr

V a 1

260

265

270

Gly

Tyr

Pro Gly

Lys

Tyr

Pro

Ser

Val

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Val

Asp

275

280

285

Ser

Ser

Asn Gin

Arg

Ala

Ser

Phe

Ser

Ser

Val

Gly

Pro

Glu

Leu

Asp

290

295

300

Val

Met

Ala Pro

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Ser

Thr

Leu

Pro

Gly

Asn

Lys

305

310

315

320

Tyr

Gly

Ala Tyr

Asn

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Ser

Pro

His

Val

Ala

Gly

325

330

335

Ala

Al a

Ala Leu

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Pro

Asn

Trp

Thr

Asn

Thr

Gin

340

345

350

Val

Arg

Ser Ser

Leu

Glu

Asn

Thr

Thr

Thr

Lys

Leu

Gly

Asp

Ser

Phe

355

360

365

Tyr

Tyr

Gly Lys

Gly

Leu

Ile

Asn

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Gin

370 375 380 <21.0> 3 <211> 275 <212> PRT

<213> Bacillus amyloiguefaciens
<400> 3
Ala Gin Ser	Val Pro Tyr Gly Val	Ser	Gin	Ile	Lys	Ala	Pro	Ala	Leu
1	5		10					15
His Ser Gin	Gly Tyr Thr Gly Ser	Asn	Val	Lys	Val	Ala	Val	Ile	Asp
	20	25					30
Ser Gly Ile	Asp Ser Ser His Pro	Asp	Leu	Lys	Val	Ala	Gly	Gly	Ala

40 45

PL 210 859 B1

Ser

Met 50

Val

Pro

Ser

Glu

Thr 55

Asn

Pro

Phe

Gin

Asp 60

Asn

Asn

Ser

His

Gly

Thr

His

Val

Ala

Gly

Thr

Val

Ala

Ala

Leu

Asn

Asn

Ser

Ile

Gly

65

70

75

80

Val

Leu

Gly

Val

Ala

Pro

Ser

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

85

90

95

Gly

Ala

Asp

Gly

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser

Trp

Ile

lie

Asn

Gly

Ile

Glu

100

105

110

Trp

Ala

Ile

Ala

Asn

Asn

Met

Asp

Val

Ile

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Pro

Ser

Gly

Ser

Ala

Ala

Leu

Lys

Ala

Ala

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

130

135

140

Ser

Gly

Val

Val

Val

Val

Ala

Ala

Ala

dy

Asn

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

Ser

Ser

Thr

Val

Gly

Tyr

Pro

Gly

Lys

Tyr

Pro

Ser

Val

Ile

Ala

165

170

175

V a 1

Gly

Ala

Val

Asp

Ser

Ser

Asn

Gin

Arg

Ala

Ser

Phe

Ser

Ser

Val

180

185

190

Gly

Pro

Glu

Leu

Asp

Val

Met

Ala

Pro

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Ser

Thr

195

200

205

Leu

Pro

Gly

Asn

Lys

Tyr

Gly

Ala

Leu

Asn

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Ser

210

215

220

Pro

His

Val

Ala

Gly

Ala

Ala

Ala

Leu

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Pro

Asn

225

230

235

240

Trp

Thr

Asn

Thr

Gin

Val

Arg

Ser

Ser

Leu

Glu

Asn

Thr

Thr

Thr

Lys

245

250

255

Leu

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Tyr

Gly

Lys

Gly

Leu

Ile

Asn

Val

Gin

Ala

260

265

270

Ala

Ala

Gin

275 <210> 4 <211> 269 <212> PRT

<213> Bacillus lentus

<40C

i> 4

Ala

Gin

Ser

Val

Pro

Trp

Gly

Ile

Ser

Arg

Val

Gin

Ala

Pro

Ala

Ala

1

5

10

15

His

Asn

Arg

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Val

Lys

Val

Ala

Val

Leu

Asp

20

25

30

Thr

Gly

Ile

Ser

Thr

His

Pro

Asp

Leu

Asn

Ile

Arg

Gly

Gly

Ala

Ser

35

40

45

Phe

Val

Fro

Gly

Glu

Pro

Ser

Thr

Gin

Asp

Gly

Asn

Gly

His

Gly

Thr

50

55

60

His

Val

Ala

Gly

Thr

Ile

Ala

Ala

Leu

Asn

Asn

Ser

Ile

Gly

Val

Leu

65

70

75

80

Gly

Val

Ala

Pro

Ser

Ala

Glu

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

Gly

Ala

85

90

95

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Val

Ser

Ser

Ile

Ala

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ala

100

105

110

C-ly

Asn

Asn

Gly

Met

His

Val

Ala

Asn

Leu

Ser

Leu

Gly

Ser

Pro

Ser

115

120

125

Pro

Ser

Ala

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Val

Asn

Ser

Ala

Thr

Ser

Arg

Gly

130

135

140

Val

Leu

Val

Val

Ala

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Gly

Ala

Gly

Ser

Ile

Ser

145

150

155

160

Tyr

Pro

Ala

Arg

Tyr

Ala

Asn

Ala

Met

Ala

Val

Gly

Ala

Thr

Asp

Gin

165

170

175

Asn

Asn

Asn

Arg

Ala

Ser

Phe

Ser

Gin

Tyr

Gly

Ala

Gly

Leu

Asp

Ile

180 185 190

PL 210 859 B1

Val

Ala

Pro 195

Gly

Val

Asn

Val

Gin 200

Ser

Thr

Tyr

Pro

G1 y 205

Ser

Thr

Tyr

Ala

Ser

Leu

Asn

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Thr

Pro

His

Val

Ala

Gly

Ala

210

215

220

Ala

Ala

Leu

Val

Lys

Gin

Lys

Asn

Pro

Ser

Trp

Ser

Asn

Val

Gin

Ile

225

230

235

240

Arg

Asn

His

Leu

Lys

Asn

Thr

Ala

Thr

Ser

Leu

Gly

Ser

Thr

Asn

Leu

245

250

255

Tyr

Gly

Ser

Gly

Leu

Val

Asn

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

260 265 <210> 5 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 5

Ala

Gin

Thr

Val

Pro

Tyr

Gly

Ile

Pro

Leu

Ile

Lys

Ala

Asp

Lys

Val

1

5

10

15

Gin

Ala

Gin

Gly

Phe

Lys

Gly

Ala

Asn

Val

Lys

Val

Ala

Val

Leu

Asp

20

25

30

Thr

Gly

Ile

Gin

Ala

Ser

His

Pro

Asp

Leu

Asn

Vai

Val

Gly

Gly

Ala

35

40

45

Ser

Phe

Val

Ala

Gly

Glu

Ala

Tyr

Asn

Thr

Asp

Gly

Asn

Gly

His

Gly

50

55

60

Thr

His

Val

Ala

Gly

Thr

Val

Ala

Ala

Leu

Asp

Asn

Thr

Thr

Gly

Val

65

70

75

80

Leu

Gly

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Ser

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

Asn

85

90

95

Ser

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Tyr

Ser

Gly

Ile

Val

Ser

Gly

Ile

Glu

Trp

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Asn

Gly

Met

Asp

Val

Ile

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Gly

Ala

115

120

125

Ser

Gly

Ser

Thr

Ala

Met

Lys

Gin

Ala

Val

Asp

Asn

Ala

Tyr

Ala

Arg

130

135

140

Gly

Val

Val

Val

Val

Ala

Ala

Ala

Gly

Asn

Ser

Gly

?isn

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Thr

Asn

Thr

Ile

Gly

Tyr

Pro

Ala

Lys

Tyr

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Va 1

165

170

175

Gly

Ala

Val

Asp

Ser

Asn

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Phe

Ser

Ser

Val

Gly

180

185

190

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Met

Ala

Pro

Gly

Ala

Gly

Val

Tyr

Ser

Thr

Tyr

195

200

205

Pro

Thr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Thr

Leu

Asn

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Ser

Fro

210

215

220

His

Val

Ala

Gly

Ala

Ala

Ala

Leu

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Pro

Asn

Leu

225

230

235

240

Ser

Ala

Ser

Gin

Val

Arg

Asn

Arg

Leu

Ser

Ser

Thr

Ala

Thr

Tyr

Leu

245

250

255

Gly

Ser

Ser

Phe

Tyr

Tyr

Gly

Lys

Gly

Leu

Ile

Asn

Val

Glu

Ala

Ala

260

265

270

Ala Gin <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> test sukcynylo-AAPF-para nitroanilidowy według cytowania

PL 210 859 B1 <400> 6

Ala Ala Pro Phe 1 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> odmiana peptydu oparta na sekwencji PI <400> 7

Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn	Ser	Ile Gly Val 10	Leu	Gly	Val 15
1	5
<210>	8
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	8
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn	Ser	Ala Gly Val	Leu	Gly	Val
1	5		10			15
<210>	9
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	9
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn	Ser	Ile Gly Val	Leu	Gly	Val
1	5		10			15
<210>	10
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	10
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn	Ser	Ala Gly Val	Leu	Gly	Val
l·	5		10			15

<210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> odmiana peptydu oparta na sekwencji PI

PL 210 859 B1 <400> 11

Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn	Ser	Ile Gly . 10	Ala	Leu	Gly	Val 15
1	5
<210>	12
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	12
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn	Ser	Ile Gly	Ala	Leu	Gly	Val
1	5		10				15
<210>	13
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	13
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn	Ser	Thr Gly	Val	Leu	Gly	Val
1	5		10				15
<210>	14
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	odmiana peptydu oparta na	sekwencji PI
<400>	14
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn	Ser	Thr Gly	Val	Leu	Gly	Val
1	5		10				15
<210>	15
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	peptyd o podstawionej alaninie regionu	L PI
<400>	15
Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala	Asn	Asn Met	Asp	Val	Ile	Asn
1	5		10				15

<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> podstawiony peptyd regionu PI

PL 210 859 B1 <4C0> 16

Asn Gly Ile Glu Trp Ala Tle Ala Asn Asn Met Asp Val Ala Asn 15 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> podstawiony peptyd regionu Pl <400> 17

Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Ala Val Ile Asn 15 10 15 <210> 18 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 18

Ala 1

Gin

Ser

Val

Pro 5

Tyr

Gly

Ile

Ser

Gin 10

Ile

Lys

Ala

Pro

Ala 15

Leu

His

Ser

Gin

Gly

Tyr

Thr

Gly

Ser

Asn

Val

Lys

Val

Ala

Val

Ile

Asp

20

25

30

Ser

Gly

Ile

Asp

Ser

Ser

His

Pro

Asp

Leu

Asn

Val

Arg

Gly

Gly

Ala

35

40

4 5

Ser

Phe

Val

Pro

Ser

Glu

Thr

Asn

Pro

Tyr

Gin

Asp

Gly

Ser

Ser

His

50

55

60

Gly

Thr

His

Val

Ala

Gly

Thr

Ile

Ala

Ala

Leu

Asn

Asn

Ser

Ile

Gly

65

70

75

80

Val

Leu

Gly

Val

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

85

90

95

Asp

Ser

Thr

Gly

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser

Trp

Ile

Ile

Asn

Gly

Ile

Glu

100

105

110

Trp

Ala

Ile

Ser

Asn

Asn

Met

Asp

Val

Ile

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Pro

Thr

Gly

Ser

Thr

Ala

Leu

Lys

Thr

Val

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ser

130

135

140

Ser

Gly

Ile

Val

Val

Ala

Ala

Ala

Ala

Gly

Asn

Glu

Gly

Ser

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

Thr

Ser

Thr

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Ala

Lys

Tyr

Pro

Ser

Thr

Ile

Ala

165

170

175

Val

Gly

Ala

Val

Asn

Ser

Ser

Asn

Gin

Arg

Ala

Ser

Phe

Ser

Ser

Ala

180

185

190

Gly

Ser

Glu

Leu

Asp

Val

Met

Ala

Pro

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Ser

Thr

195

200

205

Leu

Pro

Gly

Gly

Thr

Tyr

Gly

Ala

Tyr

Asn

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Thr

210

215

220

Pro

His

Val

Ala

Gly

Ala

Ala

Ala

Leu

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Pro

Thr

225

230

235

240

Trp

Thr

Asn

Ala

Gin

Val

Arg

Asp

Arg

Leu

Glu

Ser

Thr

Ala

Thr

Tyr

245

250

255

Leu

Gly

Asn

Ser

Phe

Tyr

Tyr

Gly

Lys

Gly

Leu

Ile

Asn

Val

Gin

Ala

260

265

270

Ala

Ala

Gin

275

<210> 19

PL 210 859 B1 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 19

Ala Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 20

Asn Ala Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 15 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 21

Asn Gly Ala Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 15 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 22

Asn Gly Ile Ala Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 15 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 23

Asn Gly Ile Glu Ala Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 15 10 15 <210> 24 <211> 15

PL 210 859 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 24

Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ala Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 25

Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile	Ala	Asn	Asn 10	Met	Asp	Val	Ile	Asn 15
1	5
<210>	26
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Odmiana peptydu PI
<400>	26
Asn Giy Ile Glu Trp Ala Ile	Ala	Ala	Asn	Met	Asp	Val	Ile	Asn
1	5			10					15
<210>	27
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Odmiana peptydu PI
<400>	27
Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile	Ala	Asn	Ala	Met	Asp	Val	Ile	Asn
1	5			10					15
<210>	28
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Odmiana peptydu PI
<400>	28
Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile	Ala	Asn	Asn	Ala	Asp	Val	Ile	Asn

10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT

PL 210 859 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Odmiana peptydu PI <400> 29

Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile 1 5	Ala	Asn	Asn 10	Met	Asp	Ala	Ile	Asn 15
<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> Odmiana peptydu PI
<400> 30 Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile 1 5	Ala	Asn	Asn 10	Met	Asp	Val	Ile	Ala 15

<210> 31 <211> 275 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> konserwowane sekwencje subtylizyny z Bacillus amyloliąuefaciens i Bacillus lentus <221> ODMIANA <222> (1) ... (275) <223> Xaa = Dowolny aminokwas lub brak aminokwasu <400> 31

Ala 1

Gin

Ser

Val

Pro 5

Xaa

Gly

Xaa

Xaa

Xaa 10

Xaa

Xaa

Ala

Pro

Ala 15

Xaa

His

Xa a

Xaa

Gly

Xaa

Thr

Gly

Ser

Xaa

Val

Lys

Val

Al a

Val

Xaa

Asp

20

25

30

Xaa

Gly

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

His

Pro

Asp

Leu

Xaa

Xaa

Xaa

Gly

Gly

Ala

35

40

45

Ser

Xaa

Val

Pro

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Gin

Asp

Xaa

Asn

Xaa

His

50

55

60

Gly

Thr

His

Val

Ala

Gly

Thr

Xaa

Ala

Al a

Leu

Asn

Asn

Ser

Ile

Gly

65

70

75

80

Val

Leu

Gly

Val

Ala

Pro

Ser

Ala

Xaa

Leu

Tyr

Ala

Val

Lys

Val

Leu

85

90

95

Gly

Ala

Xaa

Gly

Ser

Gly

Xaa

Xaa

Ser

Xaa

Leu

Xaa

Xaa

Gly

Xaa

Glu

100

105

110

Trp

Ala

Xaa

Asn

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Val

Xaa

Asn

Xaa

Ser

Leu

Gly

Xaa

115

120

125

Pro

Ser

Xaa

Ser

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Ala

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

130

135

140

Xaa

Gly

Val

Xaa

Val

Val

Ala

Ala

Xaa

Gly

Asn

Xaa

Gly

Xaa

Xaa

Xaa

145

150

155

160

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Tyr

Pro

Xaa

Xaa

Tyr

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Ala

165

170

175

Val

Gly

Ala

Xaa

Asp

Xaa

Xaa

Asn

Xaa

Xaa

Ala

Ser

Phe

Ser

Xaa

Au a

180

185

190

Gly

Xaa

Xaa

Leu

Asp

Xaa

Xaa

Ala

Pro

Gly

Val

Xaa

Xaa

Gin

Ser

Thr

195

200

205

PL 210 859 B1

Xaa

Pro 210

Gly

Xaa

Xaa

Tyr

Xaa 215

Xaa

Xaa

Asn

Gly

Thr 220

Ser

Met

Ala

Xaa

Pro

His

Val

Ala

Gly

Ala

Ala

Ala

Leu

Xaa

Xaa

Xaa

Lys

Xaa

Xaa

Xaa

225

230

235

240

Trp

Xaa

Xaa

Xaa

Gin

Xaa

Arg

Xaa

Xaa

Leu

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Xaa

Xaa

245

250

255

Leu

Gly

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Tyr

Gly

Xaa

Gly

Leu

Xaa

Asn

Xaa

Xaa

Ala

260

265

270

Ala

Xaa

Xaa

275

Zastrzeżenia patentowe

Claims (23)

1. Odmiana subtylizyny zawierają ca zmieniony epitop limfocytów T, róż ny od epitopu znanej subtylizyny, co prowadzi do różnej odpowiedzi immunologicznej u człowieka, znamienna tym, że epitop limfocytów T odmiany proteazy obejmuje podstawienia aminokwasowe odpowiadające pozycji I122A i jednej lub obu pozycjom N76D i I79A subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens, a odpowiedź immunologiczna wywoływana przez tę odmianę jest mniejsza niż odpowiedź immunologiczna wywoływana przez subtylizynę.

2. Odmiana wedł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e odpowiedź immunologiczna wywoł ywana przez tę odmianę charakteryzuje się mniejszą zdolnością do wywołania alergii in vivo.

3. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, ż e odpowiedź immunologiczna wywoływana przez tę odmianę charakteryzuje się mniejszą zdolnością do wywołania alergii in vitro.

4. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, że ma podstawienie w pozycji I122A, w jednej lub obu pozycjach N76D i I79A, i przynajmniej w jednej z pozycji 3, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206 i 217.

5. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, ż e zawiera połączone grupy podstawień wybrane spośród grupy obejmującej pozycje odpowiadające Y217L/I79A/I122A; Y217L/N76D/I122A i Y217L/N76D/I79A/I122A.

6. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, ż e zawiera połączone grupy podstawień wybrane z grupy obejmującej Y217L/N76D/I79A/I122A/N218S; Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L; Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S; Y217L/I79A/I122A/Q206L; Y217L/I79A/I122A/N218S; Y217L/I79A/I122A/P40Q; Y217L/I79A/I122A/D41A i Y217L/I79A/I122A/H238Y.

7. Odmiana wedł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e zawiera połączone grupy podstawień wybrane z grupy obejmującej

Y217L/N76D/I122A/N218S;

Y217L/N76D/I122A/Q206L;

Y217L/N76D/I122A/Q206L/N218S;

Y217L/N76D/I122A/P40Q;

Y217L/N76D/I122A/D41A i

Y217L/N76D/I122A/H238Y.

8. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera również podstawienie w subtylizynie w przynajmniej jednej z pozycji równoważnej do pozycji wybranej z grupy obejmującej 216, 181, 101, 215, 216, 217, 247, 46, 154, 128, 182, 104, 107, 250, 254, 258, 50, 47, 48, 182, 183, 185, 248 i 262 subtylizyny z Bacillus amyloliquefaciens.

9. Odmiana wed ług zastrz. 8, znamienna tym, że to kolejne podstawienie w przynajmniej jednej z pozycji jest wybrane z grupy pozycji obejmującej A216H, D181G, S101V, G215A, A216E, Y217S, R247Y, R247S, R247Q, G46S, S101Q, S154G, G128S, S182T, S101R, Y104W, I107V, L250G, T254G, T254A, G258S, M50A, G47S, A48G, S182R, S183R, Q185A, S101R, S248G i Y262F.

10. Odmiana według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto podstawienie w subtylizynie w przynajmniej jednej z pozycji równoważnej do wybranej z grupy obejmującej 3, 76, 31, 40, 41, 111, 147, 218, 206 i 217 z subtylizyny Bacillus amyloliquefaciens.

11. Odmiana według zastrz. 10, znamienna tym, że dalsze podstawienia są wybrane z grupy obejmującej S3T, N76D, I31L, P40Q, D41A, I111V, V147P, N218S, Q206L, i Y217M.

12. Kwas nukleinowy kodujący odmianę określoną w jednym z zastrz. 1-11.

13. Wektor ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy określony w zastrz. 12.

PL 210 859 B1

14. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 13.

15. Kompozycja farmaceutyczna albo kompozycja do pielęgnacji skóry, kompozycja do mycia, produkt do higieny osobistej, szampon, płyn do ciała, lub kompozycja do higieny jamy ustnej, znamienna tym, że zawiera odmianę określoną w jednym z zastrz. 1-11.

16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

17. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera kosmetycznie dopuszczalny nośnik.

18. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 17, znamienna tym, że jako nośnik zawiera hydrofilowy rozcieńczalnik wybrany z grupy obejmującej wodę, glikol propylenowy, etanol, propanol, glicerol, glikol butylenowy, glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej od około 200 do około 600, glikol polipropylenowy o masie cząsteczkowej od około 425 do około 2025 i ich mieszaniny.

19. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera również aktywną substancję do pielęgnacji skóry.

20. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 19, znamienna tym, że aktywna substancja do pielęgnacji skóry jest wybrana z grupy obejmującej składnik witaminy B3, pantenol, witaminę E, octan witaminy E, retinol, propionian retinolu, palmitynian retinolu, kwas retynowy, witaminę C, teobrominę, kwas alfahydroksylowy, farnezol, fitrantriol, kwas salicylowy, palmitylo peptapeptyd-3 i ich mieszaniny.

21. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 20, znamienna tym, że składnikiem witaminy B3 jest amid kwasu nikotynowego.

22. Kompozycja do pielęgnacji skóry według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera dodatkowo glicerynę.

23. Kompozycja do pielęgnacji skóry, znamienna tym, że zawiera:

a) od około 0,00001% do około 1% wagowych odmiany określonej w jednym z zastrz. 1-11;

b) od około 0,01% do około 20% wagowych środka pochłaniającego wilgoć;

c) od około 0,1% do około 20% wagowych aktywnej substancji do pielęgnacji skóry;

d) od około 0,05% do około 15% wagowych środka powierzchniowo czynnego oraz

e) od około 0,1% do około 20% wagowych silikonu.