PL207728B1

PL207728B1 - Sposób oczyszczania LH z próbki, zastosowanie rekombinowanego hLH oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL207728B1
Application number: PL362891A
Authority: PL
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2011-01-31
Also published as: YU60302A; RS50416B; EA200200893A1; CA2399100C; JP4959898B2; KR100808149B1; HK1052014A1; PL362891A1; CN100480258C; ZA200206108B; HRP20020651A2; BG65761B1; DK1261622T3; DE60127100T2; BRPI0108553B8; EP1261622A2; CY1108056T1; UA78676C2; HU227007B1; SK287041B6

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania LH z próbki, zastosowanie rekombinowanego hLH oraz kompozycja farmaceutyczna.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania hormonu luteinizującego (LH), w szczególności oczyszczania rekombinowanego LH (r-LH) z próbki surowego rekombinanowanego LH obejmującego łączne wykorzystanie chromatografii jonowymiennej i HPLC w odwróconym układzie faz.

Hormon luteinizujący (LH) jest gonadotropiną wydzielaną wraz z innym hormonem gonadotropowym folikulostymuliną (FSH) przez przedni płat przysadki mózgowej. Hormony te są heterodimerami składającymi się ze związanych ze sobą niekowalencyjnie dwóch podjednostek α i β.

Gonadotropiny te zarówno u kobiet jak i u mężczyzn stymulują prawidłowe funkcjonowanie gonad oraz wydzielanie hormonów płciowych. U kobiet folikulostymulina stymuluje rozwój i dojrzewanie pęcherzyków Graffa oraz komórek jajowych. Wraz z rozwojem pęcherzyk Graffa wytwarza estrogen w zwię kszają cych się iloś ciach, który w poł owie cyklu stymuluje uwolnienie LH. Prowadzi to do pę knięcia pęcherzyka Graffa, owulacji, a następnie przekształcenia pęcherzyka w ciałko żółte wydzielające progesteron. U mężczyzn hormon luteinizujący stymuluje wytwarzanie i wydzielanie testosteronu przez komórki śródmiąższowe jąder, co z kolei ma bezpośredni wpływ na działanie kanalików nasiennych. Substancje gonadotropowe o luteinizującej lub folikulostymulującej aktywności bądź obu jednocześnie są wykorzystywane w leczeniu bezpłodności, przede wszystkim u kobiet, lecz również u mężczyzn. Substancje te obejmują gonadotropinę kosmówkową, która posiada aktywność LH oraz gonadotropinę ludzką okresu przekwitania posiadającą aktywność zarówno LH, jak i FSH. Rekombinowany ludzki hormon luteinizujący otrzymany z DNA (rechLH) bada się jako alternatywę wobec gonadotropiny kosmówkowej albo do podawania w kombinacji z FSH.

W procesie izolacji i oczyszczania LH wykorzystywane był y liczne metody, takie jak chromatografia jonowymienna, chromatografia żelowa oraz chromatografia powinowactwa immunologicznego (Jack, G. W., Blazek, R., James, K., Boyd, J.E. & Mickiem, L.R. The automated production by immunoaffinity chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987).

Chromatografia jonowymienna była niejednokrotnie wykorzystywana w celu izolacji tych hormonów, mimo, że metoda ta wydaje się posiadać liczne powiązane ze sobą wady spowodowane znaczną niejednorodnością ładunków LH pochodzącego z tkanki przysadki mózgowej. Po pierwsze, na skutek tego, że glikoproteiny te oraz FSH wykazują pokrywające się wartości ładunków, ich całkowity rozdział jest skomplikowany i żmudny. Po drugie, wyizolowanie tych hormonów jako pojedynczej frakcji może okazać się skomplikowane (Stockell Hartree, A., Thomas, M., Fumival, B.E., Burns, T.W. & Langley, P. Thyroid-stimulating and lipolytic activities of purified preparation s of human thyroidstimulating hormone. Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972). W rezultacie podczas oczyszczania mogą zostać wyselekcjonowane tylko pewne obdarzone ładunkiem formy hormonu, jak to zaproponowano w przypadku LH (Storring, P.L. Zaidi, A.A., Mistry, Y.G. Lindberg, M., Stenning, B.E. & Diczfalusy, E. A comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). Selektywne oczyszczanie dodatkowo komplikuje charakteryzację tych heterogenicznych form obejmującą analizę strukturalną ich komponent węglowodorowych. Zróżnicowanie w zawartości anionowych oligosacharydów zawierających grupy sjalowe i siarczanowe może być główną przyczyną heterogeniczności LH.

Opisano konwencjonalne metody rozdziału w celu otrzymania ludzkiego hormonu luteinizującego (LH) z moczu z wydajnością w teście biologicznym 982 i.u./mg oraz 1166 i.u./mg w teście radioimmunologicznym (Donini S. & Donini P. Acta endocr., Copenh. 63, Suppl. 142, 257-277, 1969). Immunoadsorbent króliczej surowicy odpornościowej wobec oczyszczonej ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) użyto w celu oczyszczenia LH z głównej i pobocznych frakcji otrzymanych w takcie wytwarzania hormonu folikulostymulującego (FSH) z moczu kobiet w okresie przekwitania (van Heli, H., Schuurs A.H.W.M. & den Hollander, F.C.. In Symposium on gonadotrophins, New York, 17 June 1971. Eds B.B. Saxena, CG. Beling & H.M. Gandy. New York: John Wiley & Son, Inc, 1972). Uzyskany preparat charakteryzował się wyższymi wydajnościami LH, lecz równocześnie wyższym stosunkiem FSH:LH niż ten otrzymany przez Donini & Donini (1969).

Rekombinowany LH ma tę przewagę, że jest pozbawiony obecności innych hormonów gonadotropowych, takich jak FSH czy TSH. Surowy preparat rekombinanowanego LH zawiera jednak wszystPL 207 728 B1 kie inne białka i zanieczyszczenia komórek wykorzystywanych w czasie wytwarzania tego rekombinantu, tak, więc metoda pozwalająca na uzyskanie czystego rekombinanowanego hormonu luteinizującego jest szczególnie pożądana.

Ujawniono, że surowy preparat LH pochodzący z próbki pożywki hodowli otrzymanej po procesie rekombinacji lub z surowego koncentratu moczu kobiet po okresie przekwitania może być oczyszczony w takim stopniu, iż otrzymany LH jest praktycznie wolny od innych białek i/lub innych zanieczyszczeń zawartych w surowym preparacie LH. W zależności od materiału wyjściowego, białko i inne zanieczyszczenia są pochodzenia ludzkiego (wyjściowy materiał: ludzka gonadotropina menopauzalna) lub pochodzenia komórek gospodarza, np. komórek CHO, w przypadku komórek gospodarza CHO.

Sposób oczyszczania LH z próbki według wynalazku jest oparty na wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej z żywicą anionowymienną i chromatografii HPLC w odwróconym układzie faz. Ewentualnie dalsze wykorzystanie kolumny żelowej pozwala na usunięcie wszelkich pozostałych śladowych zanieczyszczeń z czystego preparatu LH.

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje etapy:

(a) poddania próbki chromatografii jonowymiennej z wytworzeniem pierwszego eluatu;

(b) poddania pierwszego eluatu HPLC w odwróconym układzie faz z wytworzeniem drugiego eluatu; i (c) poddania drugiego eluatu chromatografii żelowej.

Optymalny rezultat jest uzyskiwany, gdy przeprowadza się dwa etapy oczyszczania z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej oraz dwa etapy oczyszczania z wykorzystaniem HPLC w odwróconym układzie faz.

Sposób według wynalazku może być wykorzystany do oczyszczania rekombinowanego LH wychodząc od próbek pochodzących z pożywki hodowli, korzystnie pożywki hodowli komórek CHO, otrzymanych po procesie rekombinacji tak, że otrzymany wysoce oczyszczony LH jest praktycznie wolny, na przykład, od białek FBS często znajdujących się w pożywce hodowli, od kwasów nukleinowych oraz od innych zanieczyszczeń obecnych w komórkach gospodarza wykorzystanych w procesie rekombinacji.

Sposób według niniejszego wynalazku może być wykorzystany do oczyszczania zarówno LH z moczu, pochodzą cego z surowego koncentratu moczu kobiet po okresie przekwitania, a takż e w celu oczyszczenia LH pochodzącego od innych gatunków, w szczególności ssaków, obejmuj ących na przykład krowy, konie, świnie, owce, szczury, myszy i małpy. Korzystnie LH oczyszczany sposobem według wynalazku jest ludzkim LH.

Niniejszy wynalazek dostarcza zatem sposobu oczyszczania LH z próbki obejmującego łączne wykorzystanie chromatografii jonowymiennej i HPLC w odwróconym układzie faz. Sposób ten obejmuje etapy poddania próbki, (jeśli potrzeba zagęszczonej) chromatografii jonowymiennej oraz poddania eluatu HPLC w odwróconym układzie faz. Następny etap wymycia kolejnego eluatu na kolumnie żelowej może zostać przeprowadzony dodatkowo.

w zależ noś ci od stopnia czystoś ci wyjś ciowego preparatu oczyszczanie z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej i HPLC w odwróconym układzie faz korzystnie jest przeprowadzane dwukrotnie w celu uzyskania optymalnego rezultatu procesu oczyszczania. Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:

(a) eluowania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej DEAE Sepharose;

(b) eluowania z jonowymiennej kolumny chromatograficznej wypełnionej Q-Sepharose;

(c) eluowania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz wypełnionej krzemionką (d) dalszego eluowania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz wypełnionej krzemionką C18 (ewentualnie innym eluentem niż w etapie (c)); i (e) eluowania z kolumny żelowej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku wymywanie z kolumny jonowymiennej wypeł nionej DEAE Sepharose jest prowadzone z wykorzystaniem buforu fosforanu sodu przy pH 8.

Wymywanie z kolumny jonowymiennej Q-Sepharose korzystnie jest prowadzone buforem octanu amonu o pH 7,5.

Korzystnie etap (c) HPLC w odwróconym układzie faz korzystnie prowadzony jest z wykorzystaniem jako fazy ruchomej układu 2-propanol/octan amonu.

Korzystnie etap (d) HPLC w odwróconym układzie faz korzystnie prowadzony jest z wykorzystaniem układu 2-propanol/Tris-HCl jako fazy ruchomej.

PL 207 728 B1

W niniejszym wynalazku LH jest korzystnie ludzkim LH, a najkorzystniej jest rekombinowanym ludzkim LH pochodzącym z pożywki hodowli komórek ssaków (korzystnie komórek CHO) wykorzystywanych w procesie rekombinacji.

Dodatkowo przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość rekombinowanego hLH o swoistej bioaktywności w zakresie 20522 do 31229 lU/mg, korzystnie o swoistej bioaktywności wynoszącej około 25000 lU/mg, oraz odpowiednie zaróbki, korzystnie sacharozę, niezbędne do ustabilizowania liofilizowanego produktu. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ponadto obejmuje Tween 20, dwuwodzian fosforanu dwusodowego i jednowodzian fosforanu sodowego. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest odpowiednia do podawania podskórnego.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie rekombinowanego hLH o swoistej bioaktywności w zakresie 20522 do 31229 lU/mg, korzystnie o swoistej bioaktywności wynoszącej około 25000 lU/mg, do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń płodności.

Szczegółowy opis wynalazku.

Wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania LH, w szczególności oczyszczania rekombinowanego LH z surowego preparatu pochodzącego z pożywki hodowli procesu rekombinacji. Otrzymany r-hLH jest o wysokim stopniu czystości i wysokiej aktywności właściwej, i jest zasadniczo wolny od białek płodowej surowicy wołowej (FBS), gdy jest ona obecna w pożywce hodowli i od kwasów nukleinowych oraz innych zanieczyszczeń znajdujących się w komórkach gospodarza wykorzystywanych w procesie rekombinacji.

Wynalazek jest przeznaczony do stosowania z materiałami biologicznymi, w szczególności z surowymi mieszaninami zawierającymi LH oraz inne białka zanieczyszczające określanymi tutaj jako próbki substancji wyjściowej. Szczegółowo opisane poniżej przykłady wykorzystują próbki substancji wyjściowej, zawierające r-hLH otrzymany z supernatantu z podłoża hodowli z bioreaktora. Alternatywnie, próbką może być ludzka gonadotropiną menopauzalna (hMG), surowy koncentrat moczu kobiet po okresie przekwitania.

Próbkę stanowi świeżo zebrany znad pożywki supernatant hodowli komórek perfundowany przez bioreaktor. Korzystnie, jest on klarowany przez filtrację. Jeśli jest to konieczne nieoczyszczony roztwór może zostać zagęszczony i poddany ultrafiltracji w celu usunięcia cząstek o masie molekularnej mniejszej od 10. Ultrafiltracja umożliwia także wymianę buforu na fosforan sodu o pH 8.

Po tych etapach wstępnych próbka jest poddawana chromatografii jonowymiennej z anionowymienną żywicą i chromatografii HPLC w odwróconym układzie faz, które korzystnie są przeprowadzane dwukrotnie. Pierwszy etap wymiany jonowej korzystnie jest prowadzony z wykorzystaniem wymieniacza DEAE Sepharose. Jest to istotny etap „przepływu LH, w którym znaczna większość białek niebędących LH zostaje wyeliminowana. Drugi etap wymiany jonowej korzystnie jest prowadzony z wykorzystaniem kolumny Q-Sepharose. Jest to takż e etap „przepł ywu LH i jest konieczny w celu wyeliminowania potencjalnego DNA oraz zanieczyszczeń z komórek gospodarza lub średnich białkowych zanieczyszczeń. W korzystnym wykonaniu wynalazku etap ten jest prowadzony w temperaturze 5°C z wykorzystaniem jako eluentu buforu octanu amonu o pH 7,5.

Chromatografia w odwróconym układzie faz na żelu krzemionkowym C18 jest także korzystnie prowadzona dwukrotnie i jest ona skuteczna w usuwaniu śladowych ilości FBS, białek komórkowych oraz endotoksycznych zanieczyszczeń.

Pierwszy etap HPLC w odwróconym układzie faz korzystnie jest prowadzony z wykorzystaniem mieszaniny 2-propanol/octan amonu jako fazy ruchomej. Drugi etap HPLC z odwróconymi fazami korzystnie jest prowadzony z wykorzystaniem jako fazy ruchomej mieszaniny 2-propanol/Tris-HCl. Retentat jest wówczas zagęszczany i może być zregenerowany wodorowęglanem amonu o pH 8. Korzystnie zagęszczony produkt jest poddawany chromatografii żelowej na kolumnie Sephacryl S100 HR. W tym etapie, rozdział oparty na różnicy rozmiarów cząsteczek jest uzyskiwany na skutek wymywania wodorowęglanem amonu o pH 8 oraz korzystnie poddaniu następnie eluatu filtracji w celu usunięcia zanieczyszczeń wirusowych oraz ultrafiltracji buforem fosforanu sodu o pH 8 na membranie o przepuszczalności do 10 kD. Po przefiltrowaniu korzystnie oczyszczony LH jest przechowywany w jałowych butelkach w niskiej temperaturze.

P r z y k ł a d 1

Odczynniki

Kwas octowy (lodowy), czystość analityczna (Ph. Eur)

Octan amonu, czystość analityczna

PL 207 728 B1

Wodorowęglan amonu, czystość analityczna (B.P.)

Dwuzasadowy fosforan sodu, czystość analityczna Kwas chlorowodorowy, czystość analityczna (Ph. Eur.)

Kwas fosforowy, czystość analityczna (Ph. Eur)

2-propanol, czystość analityczna (Ph. Eur)

Chlorek sodu, czystość analityczna (Ph. Eur)

Jednozasadowy fosforan sodu, czystość analityczna Granulki wodorotlenku sodu, czystość analityczna (Ph. Eur)

Kwas trifluorooctowy (TFA), czystość HPLC Tris-(hydroksymetylo)aminometan, czystość analityczna Woda do iniekcji (WFI) (Ph. Eur.)

Blokowy schemat przedstawiający proces oczyszczania

Tabela 1 stanowi blokowy schemat podsumowujący proces oczyszczania r-hLH przedstawiający w zarysie zasady postępowania w każdym z etapów pośrednich.

Tabela 1: Schemat blokowy podsumowujący proces oczyszczania r-hLH

PL 207 728 B1

Klarowanie, zagęszczanie, dializa i filtracja zbiorów (Etap I)

W tym etapie (Etap I) wymieniono bufor, tak aby kontrolować jego skł ad i dokonano wstę pnego zagęszczenia. Etap ten prowadzono w temperaturze około +5°C oddzielnie dla każdego zbioru zebranego w czasie cyklu produkcyjnego z bioreaktora. Korzystnym zakresem temperatur jest 5 ± 3°C.

(i) Klarowanie zbioru

Po uzyskaniu świeżo zebranej pożywki hodowlanej z bioreaktora, materiał jest korzystnie poddany obróbce począwszy od klarowania roztworu supernatantu przez filtrację.

(ii) Zagęszczanie/dializa zbiorów

Membrany, przechowywane pomiędzy porcjami w 0,05 M wodorotlenku sodu, płukano WFI do czasu zmniejszenia się wartości pH do w przybliżeniu 8.

Wodę zastąpiono 0,025 M buforem fosforanu sodu do kalibracji o pH 8. Uprzednio kondycjonowany surowy roztwór r-hLH z bioreaktora zagęszczono i poddano dializie w celu usunięcia substancji o masie molekularnej mniejszej niż 10 kD (membrany o przepuszczalnoś ci do 10 kD).

Otrzymany koncentrat przechowywano w temperaturze około -15°C.

Chromatografia jonowymienna na DEAE Sepharose CL-6B (Etap II)

Ten etap chromatograficzny jest etapem „przepływu r-hLH, w którym znaczna część białek nie będących r-hLH zostaje usunięta, a roztwór poddawany jest następnie zagęszczaniu i dializie. Etapy chromatografii, podczas których produkt przepływa przez kolumnę prowadzono w zimnym pokoju, (i) Chromatografia jonowymienna na DEAE Sepharose CL-6B

Kolumnę upakowano słabo naładowanym anionitem dietyloaminoetanem (DEAE) sefarozy, skalibrowano w pierwszej kolejności 0,15 M fosforanem sodu o pH 8. Korzystnym pH jest 8 ± 0,3.

Następnie kolumnę kondycjonowano przepłukując buforem 0,025M fosforanu sodu o pH 8. Korzystnym pH jest 8 ± 0,3.

Roztwór zawierający r-hLH naniesiono na kolumnę poprzez aparat filtrujący nałożony jako ochrona na kolumnę.

Kolumnę zasilano 0,025 M fosforanem sodu o pH 8. Korzystnym pH jest 8 ± 0,3. Proces chromatografii monitorowano z wykorzystaniem spektrofotometrii przy długości fali 280 nm. Główny eluat odrzucano aż do momentu, gdy linia tła przekroczyła 5% wartości absorbancji. Niezwiązaną frakcję zawierającą r-hLH zbierano do momentu, gdy linia tła spadła do 10%.

(ii) Ultrafiltracja

Aparaturę do ultrafiltracji wyposażono w membranę o przepuszczalności do 100 kD przechowywaną w 0,05 M NaOH i przepłukano WFI do momentu uzyskania pH przesączu równego w przybliżeniu 8.

Wodę zastąpiono buforem równoważącym 0,08 M octanu amonu o pH 7,5. Korzystnym pH jest 7,5 ± 0,3.

Zebrany w tym etapie chromatografii jonowymiennej roztwór r-hLH poddano ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 100 kD, a frakcję przesączu zbierano.

Ultrafiltr przemywano porcjami 0,08 M octanu amonu o pH 7,5 a wszystkie frakcje przemywające zbierano do roztworu przesączu.

(iii) Zagęszczanie/Dializa

Przyrząd do ultrafiltracji wyposażono w membranę o przepuszczalności do 10 kD przechowywaną w 0,05 M NaOH i przepłukaną WFI do momentu uzyskania pH przesączu równego w przybliżeniu 8.

Wodę zastąpiono buforem równoważącym 0,08 M octanu amonu o pH 7,5.

Roztwór r-hLH zagęszczono. Do retentatu dodano 0,08 M octan amonu o pH 7,5 i roztwór zagęszczano. Dializę kontynuowano aż do czasu, gdy wartość pH i przewodnictwa retentatu stały się wyrównane w stosunku do wartości uzyskiwanych dla wchodzącego buforu. Uzyskany retentat odzyskiwano.

Chromatografia jonowymienna na szybko przepływowej Q Sepharose (Etap III)

Etap ten jest także jest etapem „przepływu r-hLH i jest zaplanowany w celu usunięcia potencjalnego DNA i białkowych zanieczyszczeń komórek gospodarza i bądź z podłoża.

(i) Równoważenie kolumny

Kondycjonowanie kolumny prowadzono przepłukując kolumnę buforem 0,08 M octanu amonu o pH 7,5. Korzystnym pH jest 7,5 ± 0,3.

(ii) Etap oczyszczania r-hLH na kolumnie Q-Sepharose FF

PL 207 728 B1

Roztwór zawierający r-hLH naniesiono na kolumnę przez aparat filtrujący nałożony jako ochrona na kolumnę.

Główny eluat odrzucano aż do momentu, gdy linia tła przekroczyła 5% wartości absorbancji.

Niezwiązaną frakcję zawierającą r-hLH zbierano do momentu, gdy linia tła spadła do 10%.

Roztwór r-hLH z Etapu III do późniejszego wykorzystania może być przechowywany zamrożony. Wówczas, gdy roztwór przechowywano w temperaturze równej lub niższej niż -15°C przed przeprowadzeniem HPLC z odwróconymi fazami (ETAP rV) produkt przejściowy r-hLH rozmrażano w temperaturze +5 ± 3°C, zazwyczaj przez okres 24 ± 8 godzin.

Pierwsza preparatywna HPLC w odwróconym układzie faz (Etap IV)

Etap ten, prowadzony w temperaturze pokojowej, jest skuteczny w usuwaniu śladowych ilość białek FBS/CHO oraz zanieczyszczeń endotoksycznych.

(i) Upakowanie kolumny i aktywacja żywicy

Kolumnę upakowano żelem krzemionkowym C18 o szerokich porach i, gdy nowa, żywicę C18 kondycjonowano 2-propanolem.

(ii) Kalibracja kolumny

Kolumnę równoważono 12,4% wag. roztworem 2-propanolu w buforze 0,05 M octanu amonu, pH 7. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2.

(iii) Dostosowanie pH i objętości roztworu r-hLH z Etapu III

Wartość pH roztworu r-hLH doprowadzono do pH 7 przy użyciu skoncentrowanego kwasu octowego. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2.

Wówczas objętość roztworu r-hLH zwiększono poprzez dodanie 2-propanolu aż do uzyskania końcowego stężenia 2-propanolu równego 12,4% wag.

(iv) Sączenie dostosowanego roztworu r-hLH

Urządzenie filtrujące wyposażone w 0,22 μm filtr przemyto 12,4% wag. roztworem 2-propanolu w buforze 0,05 M octanu amonu, pH 7. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2.

Dostosowany roztwór r-hLH przefiltrowano.

Przesącz przepłukano porcjami 12,4% wag. roztworu 2-propanolu w buforze 0,05 M octanu amonu, pH 7, przefiltrowano i przepłukujące porcje połączono z roztworem r-hLH. Korzystnym pH jest 7 ± 0.2.

(v) Etap oczyszczania r-hLH na pierwszej kolumnie RP-HPLC C18

Roztwór r-hLH nanoszono na kolumnę i chromatografię monitorowano przez pomiar spektrofotometryczny UV przy długości fali 280 nm.

Kolumnę zasilano 12,4% wag. roztworem 2-propanolu w buforze 0,05 M octanu amonu, pH 7 aż do momentu, gdy A280 wróciła do wartości tła, kiedy to niezwiązaną frakcję usuwano.

Następnie wymywanie r-hLH prowadzono przy użyciu układu 2-propano 1/0,05 M octan amonu jako fazy ruchomej przy liniowo zmieniającym się gradiencie stężenia 2-propanolu od 14,7% do 20,7% wag.

r-hLH zbierano, gdy rozpoczął się wzrost A280. Zebrano wszystkie frakcje r-hLH, których sygnały były większe niż 20% skali całkowitej.

Druga preparatywna HPLC w odwróconym układzie faz (Etap V)

(i) Upakowanie kolumny i aktywacja żywicy

(ii) Równoważenie kolumny

Kolumnę równoważono 14,7% wag. roztworem 2-propanolu w buforze 0,5M Tris-HCl, pH 7. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2.

(iii) Dostosowanie objętości i pH roztworu r-hLH z Etapu IV

Bufor 2M Tris-HCl o pH 7 dodawano do próbki r-hLH w celu zmniejszenia docelowego stężenia 2-propanolu do w przybliżeniu tej samej wartości, co w buforze do równoważenia kolumny (14,7%) wag.)

Wartości pH roztworu r-hLH doprowadzono do pH 7 wykorzystując 12 M HCl. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2.

(iv) Etap oczyszczania r-hLH na drugiej kolumnie RP-HPLC C18

Roztwór r-hLH naniesiono na kolumnę i chromatografię monitorowano poprzez pomiar spektrofotometryczny UV przy długości fali 280 nm.

PL 207 728 B1

Kolumnę zasilano 14,7% wag. roztworem 2-propanolu w buforze 0,5 M Tris-HCl, pH 7. Korzystnym pH jest 7 ± 0,2. Niezwiązaną frakcję usuwano.

Następnie wymywanie r-hLH prowadzono przy użyciu układu 2-propanol/0,5 M Tris-HCl jako fazy ruchomej przy liniowo zmieniającym się gradiencie stężenia 2-propanolu od 14,7% do 20,7% wag.

(v) Dializa

Roztwór r-hLH z drugiego etapu C18 RP-HPLC rozcieńczono WFI. Korzystnie użyto 8 objętości WFI.

Rozcieńczony roztwór r-hLH poddano dializie przez ultrafiltrację na membranie o przepuszczalności do 10 kD wobec WFI (patrz etap VI). Następnie, porcjami dodawano 0,5 M roztwór wodorowęglanu amonu o pH 8 i kontynuowano dializę aż do osiągnięcia właściwości charakterystycznych dla buforu wodorowęglanu amonu.

Roztwór retentatu zagęszczono do końcowej objętości około 1 litra i odzyskano. Ultrafiltr przemyto 0,5 M wodorowęglanem amonu o pH 8 i zebrane po przemyciu porcje dodano do retentatu i ewentualnie dodatkowo zagę szczono. Etap dodatkowego zagę szczania jest uzależ niony od rozmiaru kolumny wykorzystywanej w następnym etapie, tj. Etapie VI.

Chromatografia żelowa na Sephacryl S100 HR i ultrafiltracja (Etap VI)

W tym etapie, rozdział dokonywany jest w oparciu o róż nicę rozmiarów cząsteczek i mieszanina poddawana jest ultrafiltracji. Wszystkie działania prowadzone w tym etapie prowadzono w temperaturze około +5 ± 3°C (i) Chromatografia żelowa na kolumnie Sephacryl S100 HR

Kolumnę upakowano żelem Sephacryl S100 HR i wykalibrowano wpierw WFI.

Następnie kolumnę równoważono 0,5 M roztworem wodorowęglanu amonu o pH

Kolumnę zasilano 0,5 M wodorowęglanem amonu o pH 8. Proces chromatograficzny monitorowano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 280 nm.

Korzystnie, roztwór r-hLH wymyty z kolumny Sephacryl S100 HR przesączano przez filtr, np. Virosolve™ w celu usunięcia zanieczyszczeń wirusowych.

(ii) Dializa i zagęszczanie r-hLH

Membrany (membrany ultrafiltracyjne o przepuszczalności do 10 kD) przechowywane w 0,05 M roztworze wodorotlenku sodu pomiędzy seriami oczyszczania przemywano WFI do momentu, gdy pH przesączu zmalało w przybliżeniu do 8. Rozcieńczony roztwór r-hLH poddano dializie (poprzez ultrafiltrację przez membrany 10 kD) wobec WFI. Następnie, porcjami dodawano bufor 0,5 M fosforanu sodu o pH 8 i kontynuowano dializę aż do osiągnię cia wł a ś ciwoś ci charakterystycznych dla buforu fosforanu sodu.

Jeśli konieczne, roztwór retentatu zagęszczono do końcowej objętości około 500 ml i odzyskiwano. Ultrafiltr przemyto buforem 0,01 M fosforanu sodu o pH 8 i zebrane po przemyciu porcje dodano do retentatu.

Ewentualny kolejny etap zagęszczania LH może być przeprowadzony w zależności od wybranych warunków przechowywania.

Roztwór r-hLH filtrowano a przesącz zwierano w sterylnym naczyniu. Oczyszczony r-hLH jest przechowywany korzystnie w jałowych butelkach w około -15°C.

Odczynniki, bufory, eluaty i związki chemiczne

Żywice chromatograficzne

Obecnie w procesie oczyszczania stosowane są następujące żywice chromatograficzne. W procesie oczyszczania mogą być wykorzystane także inne odpowiedniki żywic.

Etap II: DEAE Sepharose CL-6B Etap III: Q-Sepharose Fast Flow Etap IV: krzemionka C18 RP-HPLC Etap V: krzemionka C18 RP-HPLC Etap VI: Sephacryl S100 HR

Dostawcami są:

Amersham Pharmacia Biotech,

Bjorkgatan 30 (Pharmacia) (Pharmacia) (Waters) (Waters) (Pharmacia)

Waters Corporation 34 Mapie Street

PL 207 728 B1

S-751 84, Uppsala Sweden

Milford, MA 01757 USA

Wyniki

Aktywność biologiczna

Aktywność biologiczną różnych partii r-hLH oczyszczonego zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku przedstawiono w tabeli 2. Stężenie białka (w mg LH/ml) określono przez pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 276,5 nm wykorzystując wartość współczynnika absorpcji a=0,812 wyznaczonego na podstawie analizy sekwencjonowania aminokwasów.

Średnia swoista aktywność preparatu r-LH jest szczególnie wysoka i wynosi około 25000 lU/mg (białka LH)

T a b e l a 2

Aktywność właściwa partii zawierających r-hLH

Nr partii	Akt. Właść.
	[lU/mg]
BLCA 9802	28173
BLCA 9803	25819
BLCA 9804	27472
BLCA 9805	31229
BLCA 9806	26995
BLCA 9808	26279
BLCA 9809	20522
BLCA9810	22275
BLCA9811	27642
BLCA9812	29941
BLCA9813	28345
BLCA9814	27581
BLCA9815	24541

Preparaty

Utworzono zamrożone suche preparaty zawierające wysoce oczyszczony rekombinowany LH otrzymany sposobem według niniejszego wynalazku.

Jako typowy przykład przygotowano zamrożone suche preparaty o mocy 75 lU w fiolkach DIN 2R wykorzystując jako zaróbkę sacharozę (tabela 3), które okazały się być trwałe w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy.

T a b e l a 3

Nazwa składnika	Skład jednostki
Składnik aktywny Rekombinowane ludzkie LH	3,4 μg (75 lU)
Inne składniki	47,75 mg
Sacharoza	0,05 mg
Tween 20	0,825 mg
dwuwodzian fosforanu dwusodowego jednowodzian fosforanu sodowego	0,052 mg

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oczyszczania LH z próbki, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie chromatografii jononowymiennej z anionowymienną żywicą oraz chromatografii HPLC w odwróconym układzie faz.

PL 207 728 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e obejmuje etapy (a) poddania próbki chromatografii jonowymiennej z wytworzeniem pierwszego eluatu;

(b) poddania pierwszego eluatu HPLC w odwróconym układzie faz z wytworzeniem drugiego eluatu; i (c) poddania drugiego eluatu chromatografii żelowej.
3. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e chromatografię jonowymienną i HPLC w odwróconym układzie faz prowadzi się dwukrotnie.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) eluowania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej wypełnionej DEAE Sepharose;

(b) eluowania z jonowymiennej kolumny chromatograficznej wypełnionej Q-Sepharose;

(c) eluowania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz wypełnionej krzemionką C18;

(d) dalszego eluowania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz wypełnionej krzemionką CIS; oraz (e) wymymywania z kolumny żelowej.
5. Sposób wedł ug zastrz. 4, znamienny tym, ż e eluowanie z jonowymiennej kolumny chromatograficznej wypełnionej DEAE Sepharose prowadzi się z stosując bufor fosforanu sodu przy pH 8.
6. Sposób wedł ug zastrz. 4, znamienny tym, ż e eluowanie z jonowymiennej kolumny chromatograficznej wypełnionej Q-Sepharose prowadzi się stosując bufor octanu amonu o pH 7,5.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że HPLC w odwróconym układzie faz z etapu (c) prowadzi się stosując układ 2-propanoI/octan amonu jako fazę ruchomą.
8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ż e HPLC w odwróconym układzie faz z etapu (d) prowadzi się stosując układ 2-propanol/Tris-HCl jako fazę ruchomą.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że LH jest ludzkim LH.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbka jest pożywką hodowli komórek CHO.
11. Zastosowanie rekombinowanego hLH o swoistej bioaktywności w zakresie 20522 do 31229 lU/mg, korzystnie o swoistej bioaktywności wynoszącej około 25000 lU/mg, do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń płodności.
12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość rekombinowanego hLH o swoistej bioaktywności w zakresie 20522 do 31229 lU/mg, korzystnie o swoistej bioaktywności wynoszącej około 25000 lU/mg, oraz odpowiednie zaróbki.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że zaróbką jest sacharoza.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że ponadto obejmuje Tween 20, dwuwodzian fosforanu dwusodowego i jednowodzian fosforanu sodowego.
15. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. 12 do 14, znamienna tym, że jest przeznaczona do podawania podskórnego.