PL205786B1 - Kwas nukleinowy, prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 i kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku Wynalazek dotyczy kwasu nukleinowego koduj acego ssacze przeciwcia lo anty-IL-12, prokario- tycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawieraj acej taki kwas nukleinowy oraz ssaczego przeciwcia la anty-IL-12 i kompozycji farmaceutycznych zawieraj acych takie przeciwcia lo oraz ich za- stosowa n w diagnostyce, profilaktyce lub leczeniu. Stan techniki Interleukina 12 (IL-12) jest heterodimeryczn a cytokin a zawieraj ac a glikozylowane la ncuchy poli- peptydowe o wielko sci 35 i 40 kD, które s a po laczone mostkiem disiarczkowym. Cytokina ta jest syn- tetyzowana i wydzielana przez komórki prezentuj ace antygen w laczaj ac w to komórki dendrytyczne, monocyty, makrofagi, komórki B, komórki Langerhansa i keratynocyty, jak równie z komórki NK (ang. Natural killer). IL-12 po sredniczy w wielorakich procesach biologicznych i zosta la poznana jako czyn- nik stymuluj acy komórki NK (NKSF), czynnik stymuluj acy komórki T, czynnik dojrzewania cytotok- sycznych komórek T i czynnik linii komórek B transformowanych EBV (Curfs, J.H.A.J., i wsp., Clinical Microbiology Reviews, 10:742-780 (1997)). Interleukina 12 mo ze wi aza c si e do receptora IL-12 wyra zanego na b lonie plazmatycznej komó- rek (np. komórek T, komórek NK), zmieniaj ac tym samym (np. inicjuj ac, zapobiegaj ac) procesy biolo- giczne. Na przyk lad wi azanie si e IL-12 do receptora IL-12 mo ze stymulowa c proliferacj e wcze sniej aktywowanych komórek T i NK, wzmacnia c aktywno sc cytolityczn a cytotoksycznych komórek T (CTL), komórek NK i komórek LAK (komórek cytotoksycznych aktywowanych limfokin a), indukowa c wytwa- rzanie interferonu gamma (IFN GAMMA) przez komórki T i komórki NK oraz indukowa c ró znicowanie sie naiwnych komórek Th0 w komórki Th1, które produkuj a IFN GAMMA i IL-2 (Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13:251-276 (1995)). W szczególno sci IL-12 jest istotna w generowaniu komó- rek cytolitycznych (np. NK, CTL) i we, wzmacnianiu komórkowej odpowiedzi immunologicznej (np. odpowiedzi immunologicznej za po srednictwem komórek Th1). Zatem IL-12 jest niezwykle wa zna w generowaniu i regulowaniu zarówno odporno sci ochronnej (np. zwalczanie infekcji), jak i patologicz- nych odpowiedziach immunologicznych (np. autoimmunizacji) (Hendrzak, J.A. i Brunda, M.J., Labora- tory Investigation, 72:619-637 (1995)). Skutkiem tego przez manipulowanie biologiczn a aktywno sci a IL-12 in vivo, na przyk lad za pomoc a przeciwcia la, mo zna wzmocni c, st lumi c lub zapobiec odpowiedzi immunologicznej (np. ochronnej lub patogennej). Przeciwcia la ssacze inne ni z ludzkie, chimerowe, poliklonalne (np. surowice odporno sciowe) i/lub przeciwcia la monoklonalne (MAb) i fragmenty (np. produkty ci ecia proteolitycznego lub fuzji bia l- kowych) s a potencjalnymi czynnikami terapeutycznymi, które s a badane w niektórych przypadkach prób leczenia pewnych chorób. Jednak ze takie przeciwcia la lub fragmenty mog a wywo lywa c odpo- wied z immunologiczn a po podaniu ludziom. Skutkiem takiej odpowiedzi immunologicznej mo ze by c usuwanie przeciwcia l lub fragmentów z krazenia poprzez kompleksowanie przez uk lad immunologicz- ny, co czyni powtórne podanie nieprzydatnym w terapii, zmniejszaj ac przez to terapeutyczn a korzy sc dla pacjenta i ograniczaj ac mo zliwo sc powtórnego podania przeciwcia la lub fragmentu. Na przyk lad powtórne podawanie przeciwcia l lub fragmentów obejmuj acych fragmenty pochodzenia innego ni z ludzkie mo ze prowadzi c do choroby posurowiczej i/lub anafilaksji. W celu unikni ecia tych i innych pro- blemów stosowano wiele podej sc, aby zmniejszy c immunogenno sc takich przeciwcia l i ich fragmen- tów, w laczaj ac w to wytwarzanie chimer i humanizacj e, dobrze znane w tej dziedzinie. Jednak ze te i inne podej scia mog a nadal powodowa c pewn a immunogenno sc przeciwcia l i fragmentów, ich niskie powinowactwo, nisk a zach lanno sc wi azania lub problemy z hodowl a komórkow a, zwi ekszeniem skali produkcji, wytwarzaniem i/lub niskimi wydajno sciami otrzymywania. A zatem, takie przeciwcia la lub fragmenty mog a by c niewystarczaj aco przystosowane do produkcji lub zastosowania jako bia lka tera- peutyczne. Skutkiem tego istnieje potrzeba dostarczenia przeciwcia l anty-IL-12 lub ich fragmentów, które przezwyci eza przynajmniej jeden z tych problemów, jak równie z udoskonale n znanych przeciwcia l lub ich fragmentów. Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy koduj acy ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 posia- daj ace region zmienny lancucha ciezkiego o sekwencji SEQ ID NO:7 oraz region zmienny lancucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO: 8. Korzystnie przeciwcia lo stanowi przeciwcia lo ludzkie. Korzystnie przeciwcia lo ma sta la powinowactwa pomi edzy 1 x 10 9 a 7 x 10 12 .PL 205 786 B1 3 Przedmiotem wynalazku jest ponadto prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, charakteryzuj aca si e tym, ze zawiera kwas nukleinowy okre slony powy zej. Korzystnie kwas nukleinowy koduje ludzkie przeciwcia lo anty-IL-12. Korzystnie przeciwcia lo ma sta la powinowactwa pomi edzy 1 x 10 9 a 7 x 10 12 . Przedmiotem wynalazku jest tak ze ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 posiadaj ace region zmienny lancucha ciezkiego o sekwencji SEQ ID NO: 7 oraz region zmienny lancucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO: 8. Korzystnie jest ono przeciwcia lem ludzkim. Korzystnie przeciwcia lo to ma sta la powinowactwa pomi edzy 1 x 10 9 a 7 x 10 12 . Przedmiotem wynalazku jest te z przeciwcia lo okre slone powy zej do zastosowania w diagnozo- waniu lub leczeniu. Przedmiotem wynalazku jest tak ze przeciwcia lo okre slone powy zej do zastosowania w leczeniu luszczycy. Przedmiotem wynalazku jest równie z przeciwcia lo okre slone powy zej do zastosowania w lecze- niu luszczycowego zapalenia stawów, sarkoidozy albo patologii Crohna. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, charakteryzuj aca si e tym, ze zawiera: (a) przeciwcia lo okre slone powy zej, i (b) farmaceutycznie dopuszczalny no snik lub rozcie nczalnik. Przedmiotem wynalazku jest tak ze kompozycja farmaceutyczna okre slona powy zej do zasto- sowania w diagnozowaniu lub leczeniu. Przedmiotem wynalazku jest te z kompozycja farmaceutyczna okre slona powy zej do zastoso- wania w leczeniu luszczycy. Przedmiotem wynalazku jest równie z kompozycja farmaceutyczna okre slona powy zej do zasto- sowania w leczeniu luszczycowego zapalenia stawów, sarkoidozy albo patologii Crohna. Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwcia la anty-IL-12 - ludzkie, naczelnych, gry- zoni, ssacze, chimerowe, humanizowane i/lub ze zmienion a domen a CDR, jak równie z kompozycje zawieraj ace przeciwcia la anty-IL-12, koduj ace kwasy nukleinowe, komórki gospodarza, kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowania, jak opisano i przedstawiono tutaj w po laczeniu w tym co jest zna- ne w stanie techniki. Przeciwcia lo wed lug wynalazku mo ze nieograniczaj aco by c pochodn a przeciwcia la ssaczego w tym nieograniczaj aco ludzkiego, mysiego, króliczego, szczurzego, gryzonia, naczelnego lub ich kombinacj a i tym podobnych. Niniejszy opis ujawnia wyizolowane cz asteczki kwasu nukleinowego zawieraj ace komplemen- tarny lub hybrydyzuj acy do niego polinukleotyd koduj acy przynajmniej jedno anty-idiotypowe przeciw- cia lo IL-12 zawieraj ace przynajmniej jedn a specyficzn a sekwencj e, domen e, czes c lub wariant. Niniej- szy opis ujawnia ponadto rekombinowane wektory zawieraj ace cz asteczki kwasów nukleinowych ko- duj ace to anty-idiotypowe przeciwcia lo IL-12, komórki gospodarza zawieraj ace takie kwasy nukleino- we i/lub rekombinowane wektory, jak równie z sposoby ich wytwarzania i/lub stosowania takich kwa- sów nukleinowych koduj acych przeciwcia lo anty-idiotypowe, wektorów i/lub komórek gospodarza. Niniejszy opis ujawnia tak ze przynajmniej jeden sposób ekspresji przynajmniej jednego prze- ciwcia la anty-IL-12 lub anty-idiotypowego przeciwcia la IL-12 w komórce gospodarza obejmuj acy ho- dowanie opisanej tu komórki gospodarza w warunkach, w których przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 ulega ekspresji w wykrywalnych i/lub mo zliwych do oczyszczenia ilo sciach. Niniejszy wynalazek dostarcza tak ze przynajmniej jedn a kompozycj e zawieraj ac a (a) opisane tu wyizolowane przeciwcia lo i (b) odpowiedni no snik lub rozcie nczalnik. No snik lub rozcie nczalnik opcjo- nalnie mog a by c farmaceutycznie akceptowalne, stosownie do znanych no sników i rozcie nczalników. Kompozycja mo ze opcjonalnie zawiera c przynajmniej jeden dalszy sk ladnik, bia lko lub kompozycj e. Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycj e z przeciwcia lem an- ty-IL-12 do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce w celu modulowania lub leczenia przy- najmniej jednego zwi azanego z IL-12 stanu w komórce, tkance, organie, zwierz eciu lub u pacjenta, przed, po, lub w trakcie wyst epowania tego stanu. Niniejszy opis ujawnia tak ze przynajmniej jedn a kompozycj e, urz adzenie i/lub sposób dostar- czania terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilo sci przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL- -12 wed lug niniejszego wynalazku.PL 205 786 B1 4 Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycj e z przeciwcia lem an- ty-IL-12 do diagnostyki przynajmniej jednego zwiazanego z IL-12 stanu w komórce, tkance, organie, zwierz eciu lub u pacjenta i/lub przed, po lub w trakcie trwania tego stanu. Niniejszy opis ujawnia tak ze przynajmniej jedn a kompozycj e, urz adzenie i/lub sposób dostar- czania do diagnostyki przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku. Opis figur Fig. 1A i 1B s a wykresami pokazuj acymi zale zne od st ezenia wi azanie si e ludzkich anty-IL-12 mAb do immobilizowanych ludzkich IL-12. Przeciwcia la anty-IL-12 zosta ly seryjnie rozcie nczone w 1% BSA/PBS i inkubowane przez 1 godzin e w 37°C na p lytkach pokrytych rhIL-12. P lytki zosta ly dwukrot- nie przemyte 0,02% Tween 20 (monolaurynian polioksyetyleno(20)sorbitanu), 0,15 M roztworem soli fizjologicznej, a nast epnie hybrydyzowane w temperaturze pokojowej przez 1 godzin e z sond a w po- staci koziego specyficznego przeciwcia la przeciwko ludzkiej IgG kappa o znakowanego peroksydaz a chrzanow a (HRP). P lytki zosta ly ponownie przemyte, wywo lane substratem o-feny-lenodiamin a (OPD) i zosta la zmierzona g esto sc optyczna (OD) ka zdej studzienki przy 490 nm. Fig. 2: Scie zki od lewej do prawej na Fig. A i B zawieraj a ludzkie IL-12, ludzkie IL-12 p40, mysie IL-12 i wybarwiony standard wielko sci. Fig. 2A pokazuje wybarwione pr azki z ca lkowitej frakcji bia lek. Najsilniejsze pr azki w ka zdej scie zce s a to ludzkie IL-12 (75 kD), p40 ludzkiej IL-12 (40 kD) i mysie IL-12 (75kD). Fig. 2B pokazuje filtr Western przygotowany z zelu identycznego do tego pokazanego na Fig. 2A. Filtr zosta l poddany reakcji z C340, potem ze znakowanym HRP kozim przeciwko ludzkiej IgG i specyficznie wykrywa l jedynie ludzk a IL-12 (monomer i multimery) oraz ludzkie p40 IL-12. Filtr kontrolny (nie pokazany) poddany reakcji z kozim antyludzkim IgG znakowanym HRP nie ujawni l zad- nych pr azków. Fig. 3: Analiza PCR z etapem odwrotnej transkrypcji ekspresji genu IFN ? w ludzkich PBL trak- towanych IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 z lub bez przeciwcia la anty-IL-12 C340, izotypowego przeciwcia la kontrolnego 8.6.2. Calkowity RNA zosta l poddany odwrotnej transkrypcji, zamplifikowany za pomoc a PCR z u zyciem starterów specyficznych dla genów. Poziom mRNA ß-aktyny w ka zdej próbce zosta l równie z okre slony, co s lu zy lo jako kontrola jako sci i sk ladu mRNA. Fig. 4 jest histogramem pokazuj acym, ze ludzkie mAb anty-IL-12 (C340) hamuje wytwarzanie interferonu ? (IFN ?) przez pozbawione monocytów jednoj adrzaste komórki krwi obwodowej CD3+ (PBMC) stymulowane IL-2 plus IL-12. PBMC by ly hodowane przez piec godzin w po zywce kontrolnej (bez dodatku cytokin), po zywce z dodatkiem IL-12 (0,1 ng/ml) plus IL-2 (50 IU/ml)(IL-12/IL-2), po zyw- ce kontrolnej zawieraj acej mAb C340 (10 µg/ml) i po zywce IL-12/IL-2 zawieraj acej mAb C340 (10 µg/ml). Wewn atrzkomórkowy IFN ? zosta l zmierzony przez dwubarwne immunobarwienie z CD3- -PE i IFN ?-FITC. Dane pokazane dla jednego dawcy. Fig. 5 jest wykresem pokazuj acym zale zne od dawki zahamowanie wydzielania IFN ? przez sty- mulowane IL-2 plus IL-12 limfocyty krwi obwodowej w dwóch ró znych próbkach ludzkich mAb anty-IL-12 (C340). Ludzkie PBL (8x10 6 /ml) by ly hodowane przez 24 godziny z 10 U/ml IL-2, IL-2 plus 400 pg/ml IL-12 lub IL-2 plus IL-12 i mAb C340, jak to zosta lo zaznaczone. Supernatanty z hodowli komórkowych zosta ly usuni ete i testowane na obecno sc IFN ? za pomoc a EIA. Fig. 6 jest histogramem pokazuj acym zale zne od dawki zahamowanie indukowane] przez IL-12 plus IL-2 cytotoksyczno sci komórek LAK przez ludzkie anty-IL-12 mAb (C340). Komórki efektorowe LAK (ludzkie PBL, 8x10 6 /ml) by ly hodowane przez 24 godziny z IL-12 (400 pg/ml) plus IL-2 (10 U/ml) i mAb C340 (5000 ng/ml lub 50 ng/ml, jak to zosta lo zaznaczone). Komórki efektorowe LAK by ly prze- mywane i hodowane przez cztery godziny ze znakowanymi 51 Cr komórkami docelowymi Raji przy stosunku komórek efektorowych do docelowych (E:T) 80:1 i oznaczono ilo sc 51 Cr uwolnionego do po zywki po lizie komórek Raji. Wyniki s a wyra zone jako b lad standardowy sredniej z trzech zdrowych dawców. Pozytywn a kontrol a dla IL-12 (IL-12) s a komórki efektorowe inkubowane z IL-12 i bez prze- ciwcia la. T lem (BKGD) s a komórki efektorowe inkubowane bez IL-12 lub przeciwcia la. Fig. 7A i 7B s a histogramami pokazuj acymi, ze indukowana przez IL-12 plus IL-2 ekspresja CD95 na jednoj adrzastych komórkach krwi obwodowej CD3+ jest hamowana przez ludzkie mAb anty- IL-12 (C340). PBMC by ly hodowane przez 72 godziny w po zywce zawieraj acej 0,1 ng/ml IL-12 i suboptymaln a dawk e IL-2 (50 IU/ml) w obecno sci lub nieobecno sci mAb C340 (10 µg/ml). Ekspresja CD95 zosta la zmierzona za pomoc a cytometrii przep lywowej komórek wybarwionych anty-CD95- FITC. Bramkowanie zosta lo wykonane u zywaj ac dwubarwnej analizy (CD3 lub CD56-PE wzgl edem CD95-FITC) i rozpraszania swiat la pod lu znego wzgl edem prostopad lego.PL 205 786 B1 5 Fig. 8 jest wykresem pokazuj acym, ze rekombinowane ludzkie przeciwcia la przeciwko ludzkiej IL-12 (rC340) wi az a si e do immobilizowanej IL-12 w sposób, który jest nieodró znialny od oczyszczo- nych mAb C340. St ezenie rC340 w supernatancie z trzech produkuj acych rC340 rekombinowanych linii komórkowych zosta lo okre slone i supernatanty zosta ly poddane oszacowaniu wi azania IL-12 w tescie ELISA. P lytki zosta ly pokryte 2 µg/ml ludzkiej IL-12 i inkubowane z mAb C340 oczyszczonym z orginalnej hybrydomy (standard) lub z supernatantów z rekombinowanych linii komórkowych. Prze- ciwcia lo wi azace IL-12 zosta lo wykryte u zywaj ac kozich antyludzkich IgG ( lancuch ciezki + lancuch lekki) sprz ezonych z alkaliczn a fosfataz a. Fig. 9A-9C s a wykresami pokazuj acymi kinetyk e wzrostu i ilo sc przeciwcia la wydzielanego przez trzy niezale znie wyprowadzone podklony rekombinowanej komórki produkuj acej rC340 (Fig. 9A, podklon C379B; Fig. 9B, podklon C381A; Fig. 9C, podklon C389A). Komórki rekombinowane zosta ly wysiane do kolb T75 przy pocz atkowej g esto sci 2 x 10 5 komórek/ml w standardowej po zywce. W ró z- nych momentach czasu komórki zosta ly ponownie zawieszone i okre slona zosta la liczba zywych ko- mórek i ilosc ( µg/ml) rC340 w po zywce. Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowane, rekombinowane i/lub syntetyczne przeciwcia la przeciwko IL-12 - ludzkie, naczelnych, gryzoni, ssacze, chimerowe, humanizowane lub ze zmienion a domen a CDR, jak równie z kompozycje i koduj ace cz asteczki kwasu nukleinowego zawieraj ace przy- najmniej jeden polinukleotyd koduj acy przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 wed lug wynalazku. Niniejszy opis ujawnia tak ze, mi edzy innymi, zastosowanie takich przeciwcia l wed lug wynalazku w diagnostycznych i terapeutycznych kompozycjach, sposobach i urz adzeniach. Stosowane tutaj terminy „przeciwcia lo przeciwko interleukinie 12", „przeciwcia lo anty-IL-12", „czes c przeciwcia la anty-IL-12" lub „fragment przeciwcia la anty-IL-12" i/lub „wariant przeciwcia la anty- IL-12" i tym podobne dotycz a dowolnego bia lka lub peptydu zawieraj acego cz asteczk e, która sk lada sie przynajmniej z cz esci cz asteczki immunoglobulinowej, takiej jak nieograniczaj aco region determi- nuj acy komplementarno sc (CDR) ci ezkiego lub lekkiego la ncucha lub ligand wi azacy jego fragment, region zmienny ci ezkiego lub lekkiego la ncucha, region sta ly ci ezkiego lub lekkiego lancucha, region zr ebowy lub dowolny jego fragment lub przynajmniej jeden fragment receptora IL-12 lub bia lka wiaz a- cego, które mo ze by c wlaczone do przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku. Takie przeciwcia lo mo ze ponadto opcjonalnie oddzia lywa c ze specyficznym ligandem, w taki sposób, nie b ed acy jednak ograniczeniem, ze przeciwcia lo moduluje, zmniejsza, zwi eksza, dzia la w sposób antagonistyczny, agonistyczny, podnosi, blokuje, hamuje, znosi i/lub interferuje z przynajmniej jedn a aktywno scia lub wi azaniem IL-12 lub z aktywno sci a lub wi azaniem receptora IL-12, in vitro, in situ i/lub in vivo. Nie- ograniczaj acym przyk ladem jest odpowiednie przeciwcia lo anty-IL-12, jego specyficzny fragment lub wariant, które mo ze wi aza c przynajmniej jedn a IL-12 lub jej specyficzne fragmenty, warianty lub do- meny. Odpowiednie przeciwcia lo anty-IL-12, jego specyficzny fragment lub wariant, mo ze tak ze w sposób opcjonalny wp lywa c na przynajmniej jedn a aktywno sc lub funkcj e IL-12, jak nie b ed aca ograniczeniem synteza RNA, DNA lub bia lka, uwalnianie IL-12, sygnalizacja receptora IL-12, ci ecie b lonowej IL-12, aktywno sc IL-12, produkcja i/lub synteza IL-12. Ponadto sugeruje si e, aby termin „przeciwcia lo" obejmowa l przeciwcia la, fragmenty po trawieniu, ich specyficzne fragmenty i warianty, w laczaj ac w to mimetyki przeciwcia l lub obejmowa l fragmenty przeciwcia l, które na sladuj a struktur e i/lub funkcj e przeciwcia la lub jego specyficznego fragmentu lub cz esci. Funkcjonalne fragmenty obej- muja fragmenty wiazace antygen, które wiaz a si e do ssaczej IL-12. Na przyk lad fragmenty zdolne do wi azania IL-12 lub ich cz esci obejmuj a nieograniczaj aco fragmenty Fab (np. przez trawienie papaina), Fab' (np. przez trawienie pepsyn a i cz esciow a redukcj e) i F(ab') 2 (np. przez trawienie pepsyn a), facb (np. przez trawienie plazmin a), pFc' (np. przez trawienie pepsyn a lub trawienie plazmin a), Fd (np. przez trawienie pepsyn a, cz esciow a redukcj e i ponown a agregacj e), Fv lub scFv (np. przez techniki biologii molekularnej), (zobacz np. Colligan, Immunology, jak wyzej). Takie fragmenty mog a by c otrzymane przez ci ecie enzymatyczne, przy u zyciu technik syntezy lub rekombinacji genetycznej, które s a znane w tej dziedzinie i/lub tu opisane. Przeciwcia la mog a by c otrzymane w postaci ró znych form skróconych przy u zyciu genów przeciwcia l, w których na lewo od naturalnego miejsca ko nca translacji zosta l wprowadzony jeden lub wi eksza liczba kodonów stop. Na przyk lad kombinacja genu koduj aca fragment F(ab') 2 lancucha ciezkiego mo ze by c tak zaprojektowa- na, aby zawiera c sekwencje DNA koduj ace domen e CH 1 i/lub region lacz acy lancucha ciezkiego. Ró zne fragmenty przeciwcia l moga by c ze sob a laczone chemicznie przy u zyciu klasycznych technik lub mog a by c otrzymane jako jeden fragment bia lkowy przy u zyciu technik in zynierii genetycznej.PL 205 786 B1 6 Stosowany tutaj termin „ludzkie przeciwcia lo" dotyczy przeciwcia la, w którym zasadniczo ka zda cz esc bia lka (np. CDR, region zr ebowy, C L , domeny C H (np. C H 1, C H 2, C H 3), region lacz acy (V L , V H )) jest zasadniczo nieimmunogenny dla ludzi, z niewielkimi tylko zmianami sekwencji lub odst epstwami. Podobnie przeciwcia la oznaczone jako przeciwcia la naczelnych (ma lpa, pawian, szympans, itp.) gry- zoni (mysz, szczur, królik, swinka morska, chomik i tym podobne) i innych ssaków wskazuj a dany gatunek, podrodzaj, rodzaj, podrodzin e i rodzin e. Ponadto, przeciwcia la chimerowe zawieraj a kombi- nacje powy zszych. Takie zmiany lub odst epstwa w sposób opcjonalny i zalecany zatrzymuj a lub zmniejszaj a odpowied z immunologiczn a u ludzi lub innych gatunków w porównaniu z przeciwcia lami niemodyfikowanymi. Tak wi ec, ludzkie przeciwcia lo jest ró zne od przeciwcia la chimerowego lub hu- manizowanego. Nale zy podkre sli c, ze ludzkie przeciwcia lo mo ze by c wytwarzane przez zwierz e inne ni z cz lowiek lub przez komórk e prokariotyczn a lub eukariotyczn a, która jest zdolna do ekspresji funk- cjonalnie zmienionych genów ludzkich immunoglobulin (np. la ncucha ci ezkiego i/lub lancucha lekkie- go). Ponadto, je zeli ludzkie przeciwcia lo jest przeciwcia lem o pojedynczym la ncuchu, mo ze ono za- wiera c peptyd lacz acy, który nie wyst epuje w natywnych ludzkich przeciwcia lach. Na przyk lad Fv mo- ze zawiera c peptyd lacz acy, taki jak dwie do o smiu glicyn lub innych reszt aminokwasowych, które lacz a region zmienny lancucha ci ezkiego i region zmienny lancucha lekkiego. Uwa za si e, ze takie peptydy lacz ace s a pochodzenia ludzkiego. Jako przeciwcia la monoklonalne mog a by c zastosowane równie z przeciwcia la bispecyficzne, heterospecyficzne, heterokoniugatowe lub podobne, zw laszcza przeciwcia la ludzkie lub humanizowa- ne, które posiadaj a specyficzno sci wi azania do przynajmniej dwóch ró znych antygenów. W tym przy- padku, jedna ze specyficzno sci wi azania dotyczy przynajmniej jednego bia lka IL-12, inna za s dowol- nego innego antygenu. Sposoby wytwarzania specyficznych przeciwcia l s a znane w tej dziedzinie. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja bispecyficznych przeciwcia l opiera si e na koekspresji dwóch par immunoglobulinowy la ncuch ciezki- la ncuch lekki, przy czym dwa lancuchy ciezkie posiadaj a ró zne specyficzno sci (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Z powodu losowego laczenia si e lancuchów ciezkich i lekkich immunoglobuliny te hybrydomy (kwadromy) produkuj a potencjaln a mieszank e 10 ró znych cz asteczek przeciwcia l, z których tylko jedna ma w la sciw a struktur e bispecyficzn a. Oczysz- czanie w la sciwej cz asteczki, które jest zazwyczaj wykonywane przy u zyciu chromatografii powinowac- twa, jest raczej trudne a wydajno sci otrzymywania s a raczej niskie. Podobne procedury s a ujawnione w np. WO 93/08829, patentach USA nr 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121:210 (1986). Przeciwcia la anty-IL-12 (okre slane tak ze przeciwcia lami IL-12) mog a by c w sposób opcjonalny scharakteryzowane przez wysokie powinowactwo wi azania si e do IL-12 i w sposób opcjonalny nisk a toksyczno sc. W szczególno sci przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku jest szczególnie u zyteczne w niniejszym wynalazku, je zeli jego poszczególne sk ladniki, takie jak region zmienny, region sta ly, region zr ebowy, ka zdy z osobna lub wszystkie razem w sposób opcjonalny i zalecany posiadaj a nisk a immunogenno sc. Przeciwcia la, które mog a by c u zyte w niniejszym wynalazku s a w sposób opcjonalny scharakteryzowane przez ich zdolno sc do stosowania u pacjentów przez wyd lu zony okres czasu przy mierzalnej poprawie objawów chorobowych oraz niskiej i/lub akceptowalnej toksyczno sci. Ni- ska lub akceptowalna immunogenno sc i/lub wysokie powinowactwo, jak równie z inne zalecane w la- sciwo sci, mog a przyczynia c si e do osi agni ecia rezultatów terapeutycznych. „Niska immunogennosc" jest zdefiniowana tutaj jako istotnie wzrastaj ace odpowiedzi HAHA, HACA lub HAMA u mniej ni z oko lo 75% lub zw laszcza mniej ni z oko lo 50% leczonych pacjentów i/lub wzrastaj ace niskie miana u leczonych pacjentów (mniejsze ni z oko lo 300, zw laszcza mniejsze ni z oko lo 100 w przypadku pomiaru w enzymatycznym te scie immunologicznym z podwójnym antygenem) (Elliott i wsp., Lancet 344:1125-1127 (1994). Zastosowanie Wyizolowane kwasy nukleinowe wed lug niniejszego wynalazku mog a by c u zyte do otrzymania przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 lub jego specyficznego wariantu, który mo ze by c u zyty do pomiaru lub wp lywu na komórk e, tkank e, organ lub zwierz e (w laczaj ac w to ssaki i ludzi), do dia- gnostyki, monitorowania, modulowania, leczenia, ul zenia cierpieniu, jako pomoc w zapobieganiu skut- ków lub zmniejszeniu objawów chorobowych przynajmniej jednego stanu chorobowego zwi azanego z IL-12, wybranego nieograniczaj aco spo sród zaburzenia lub choroby immunologicznej, zaburzeniaPL 205 786 B1 7 lub choroby sercowo-naczyniowej, zaburzenia lub choroby infekcyjnej, zwi azanej z nowotworem z lo- sliwym lub neurologicznej lub innego znanego b ad z wyszczególnionego stanu zwi azanego z IL-12. Taki sposób mo ze obejmowa c podawanie skutecznej dawki kompozycji lub kompozycji farma- ceutycznej zawieraj acej przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 komórce, tkance, organowi, zwie- rz eciu lub pacjentowi potrzebuj acemu takiej modulacji, leczenia, ul zenia w cierpieniu, ochrony lub zmniejszenia objawów, skutków lub mechanizmów. Skuteczna dawka mo ze obejmowa c ilosc od oko lo 0,001 do 500 mg/kg przy podawaniu pojedynczej dawki (np. w postaci jednej du zej dawki), podawaniu wielokrotnym lub ci ag lym albo przy podawaniu dawki jednorazowo, wielokrotnie lub ci agle, do osi a- gni ecia st ezenia 0,01-5000 µg/ml surowicy lub dowolnego innego zakresu lub warto sci w nim zawar- tych jak to zrobiono i oznaczono przy u zyciu znanych sposobów, jak tu opisano lub jak jest to znane w tej dziedzinie. Odes lania Wszystkie publikacje lub patenty cytowane tutaj pokazuj a stan techniki w chwili opracowywania niniejszego wynalazku i/lub dostarczaj a opisu i realizacji niniejszego wynalazku. Publikacje dotycz a dowolnych naukowych lub patentowych publikacji lub dowolnej innej informacji w formacie medialnym, w laczaj ac w to nagrania, format elektroniczny lub posta c wydrukowan a. Poni zsze odes lania nale zy wymieni c w szczególno sci: Ausubel i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001). Przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku Przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c w sposób opcjonalny wytwarzane przez lini e komórkow a, mieszan a lini e komórkow a, komórk e unie smiertelnion a lub klonaln a populacj e komórek unie smiertelnionych, jak jest to dobrze znane w tej dziedzinie. Zobacz np. Ausubel, i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001). Ludzkie przeciwcia la, które s a specyficzne dla ludzkich bia lek IL-12 lub ich fragmentów, mog a by c wzbudzane przeciwko odpowiedniemu antygenowi immunogennemu, takiemu jak wyizolowany antygen i/lub bia lko IL-12 lub jego fragment (w laczaj ac w to cz asteczki syntetyczne, takie jak synte- tyczne peptydy). Inne specyficzne lub ogólnie ssacze przeciwcia la mog a by c wzbudzane w podobny sposób. Wytwarzanie przeciwcia l immunogennych i wytwarzanie przeciwcia l monoklonalnych mo ze by c zrealizowane przy u zyciu dowolnej dogodnej techniki. W jednym z podej sc wytwarzana jest hybrydoma poprzez fuzj e odpowiedniej unie smiertelnionej linii komórkowej (np. linii komórkowej szpiczaka, takiej jak miedzy innymi Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, 243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A lub podobnej, lub heteroszpiczaków, ich produktów fuzyjnych lub dowolnej komórki lub fuzji komórkowej z nich wyprowadzonej, lub dowolnej odpowiedniej linii komórkowej znanej w tej dzie- dzinie. Zobacz np.www.atcc.org, www.lifetech.com i podobne z komórkami wytwarzaj acymi przeciw- cia la, takimi jak wyizolowane lub sklonowane komórki sledziony, krwi obwodowej, limfy, migda lków lub inne komórki obejmuj ace komórki uk ladu immunologicznego lub komórki B lub dowolne inne komórki z ekspresj a sekwencji sta lych lub zmiennych lub zr ebowych lub CDR lancucha ciezkiego lub lekkiego, zarówno w postaci endogennego jak i heterologicznego kwasu nukleinowego, w postaci rekombino- wanego lub endogennego, wirusowego, bakteryjnego, pochodz acego z glonów, prokariotycznego, pochodz acego ze zwierz at ziemnowodnych, owadziego, gadziego, rybiego, ssaczego, pochodz acego z gryzoni, zwierz at jednokopytnych, dwukopytnych, koziego, owczego, pochodz acego z naczelnych, eukariotycznego, genomowego DNA, cDNA, rDNA, mitochondrialnego DNA lub RNA, chloroplastowe- go DNA lub RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, jednoniciowego, dwuniciowego, trójniciowego, hybrydyzowa- nego i tym podobnych lub jako dowolna ich kombinacja. Zobacz np. Ausubel, jak wy zej, i Colligan, Immunology, jak wy zej, rozdzia l 2.PL 205 786 B1 8 Komórki produkuj ace przeciwcia la mog a by c tak ze uzyskane z krwi obwodowej lub, w sposób bardziej zalecany, ze sledziony lub w ez lów ch lonnych ludzi lub innych stosownych zwierz at, które zostaly zaimmunizowane antygenem b ed acym przedmiotem zainteresowania. Do ekspresji heterolo- gicznego lub endogennego kwasu nukleinowego koduj acego przeciwcia lo, jego specyficzny fragment lub wariant mo ze zosta c u zyta dowolna inna odpowiednia komórka gospodarza. Fuzje komórkowe (hybrydomy) lub komórki rekombinowane mog a by c wyizolowane przy u zyciu selektywnych warunków hodowli lub innych znanych odpowiednich sposobów i klonowane przez rozcie nczenie do pojedyn- czych komórek lub przez sortowanie komórek lub innymi znanymi sposobami. Komórki, które produku- ja przeciwcia la z pozadan a specyficzno scia mog a zosta c wyselekcjonowane przez zastosowanie od- powiedniego oznaczenia (np. testu ELISA). Zastosowa c mo zna inne odpowiednie sposoby wytwarzania lub izolacji przeciwcia l o wymaga- nej specyficzno sci, w laczaj ac w to nieograniczaj aco sposoby s lu zace do selekcji rekombinowanego przeciwcia la z biblioteki peptydowej lub biblioteki bia lek (przyk ladowo ale nieograniczaj aco biblioteka bakteriofagów, rybozymów, oligonukleotydów, RNA, cDNA lub podobna, biblioteka oparta na prezen- tacji, np. dost epna w Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martin- sreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Zobacz np., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); USA 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/-02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); lub stochastycznie wygenerowanych peptydów lub bia lek - USA 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, obecnie Applied Molecular Evolution (AME), lub które polegaj a na immunizacji transgenicznych zwierz at (np. myszy SCID, Nguyen i wsp., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu i wsp., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren i wsp., Immunol. 93:154-161 (1998), jak równie z pokrewne patenty i zastoso- wania, w wyniku których mo zna otrzyma c ró zne ludzkie przeciwcia la, jak jest to znane w tej dziedzinie i/lub tu opisane. Takie techniki nieograniczaj aco obejmuja prezentacj e na rybosomie (Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); technologie otrzymywania przeciwcia la z pojedynczej komórki (np. sposób selekcji przeciwcia la z wybranego limfocytu ("SLAM") (Patent USA Nr 5627052, Wen i wsp., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); mikrokropelki zelowe i cytometri e przep lywow a (Powell i wsp., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray i wsp., J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kennyetal., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selekcj e komórek B (Steenbakkers i wsp., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak i wsp., Progress Biotech, Tom 5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Bor- rebaeck, wyd., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)). Sposoby obróbki lub humanizowania innych ni z ludzkie lub ludzkich przeciwcia l moga by c tak ze zastosowane i s a one dobrze znane w tej dziedzinie. Ogólnie humanizowane lub poddane obróbce przeciwcia lo posiada jedn a lub wi eksz a liczb e reszt aminokwasowych ze zród la, które jest inne ni z ludzkie, np. nieograniczajaco myszy, szczura, królika, naczelnych innych ni z cz lowiek lub innych ssa- ków. Te ludzkie reszty aminokwasowe cz esto s a okre slane jako reszty „importowane", które s a za- zwyczaj wzi ete z „importowanej" zmiennej, sta lej lub innej domeny znanej ludzkiej sekwencji. Znane ludzki sekwencje Ig s a ujawnione np. w www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/pedro/researchtools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.PL 205 786 B1 9 www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.ac.jp/yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/fccl/protocol.html; www.isacnet.org/sites~geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrccpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V~mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/www.abgen.html; www.unizh.ch/honegger/AH0seminar/Slide0l.html; www.cryst.bbk.ac.uW~ubog07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stataim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/fmolinaAVeb-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frproducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), ka zde w laczone tutaj jako odniesienie. Takie importowane sekwencje mog a by c u zyte do zmniejszenia immunogenno sci lub zmniej- szania, wzmacniania lub modyfikacji wi azania, powinowactwa, szybko sci wi azania, szybko sci oddyso- cjowania, zach lanno sci wi azania, okresu pó ltrwania lub innej odpowiedniej cechy, jak jest to znane w tej dziedzinie. Ogólnie, cz es c lub ca lo sc ludzkich lub innych ni z ludzkie sekwencji CDR jest zacho- wywana, podczas gdy regiony zmienne lub sta le s a zast epowane przez aminokwasy wyst epuj ace w sekwencji ludzkiej lub innej. Przeciwcia la w sposób opcjonalny mog a by c humanizowane z pozo- stawieniem silnego powinowactwa do antygenu i innych po zadanych w la sciwo sci biologicznych. Aby to osi agn ac, humanizowane przeciwcia la mog a by c w sposób opcjonalny przygotowane przez proces analizy sekwencji wyj sciowych i ró znych opracowanych produktów humanizowanych przy u zyciu przestrzennych modeli sekwencji wyj sciowych i humanizowanych. Modele przestrzenne immunoglo- bulin s a powszechnie dost epne i s a znane specjalistom w tej dziedzinie. Dost epne s a programy kom- puterowe, które obrazuj a i przedstawiaj a prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wy- branych sekwencji immunoglobulin. Przegl ad tych przedstawie n pozwala na analiz e przypuszczalnej roli reszt aminokwasowych w funkcjonowaniu wybranej sekwencji immunoglobulinowej, tj. analiz e reszt aminokwasowych, które wp lywaj a na zdolno sc wybranej sekwencji immunoglobulinowej do wi a- zania swojego antygenu. W ten sposób reszty aminokwasowe FR mog a by c wybrane i po laczone z sekwencjami najwy zszej zgodno sci i importowanymi tak, ze uzyskana zostaje odpowiednia cecha przeciwcia la taka, jak zwi ekszone powinowactwo do antygenu (antygenów). Ogólnie reszty amino- kwasowe CDR s a w sposób bezpo sredni i najbardziej znacz acy zaanga zowane we wp lyw na wi azanie antygenu. Humanizowanie lub projektowanie przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c wykonane przy u zyciu dowolnego znanego sposobu, takiego jak nieograniczaj aco opisany w Winter (Jones i wsp., Nature 321:522 (1986); Riechmann i wsp. Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239:1534 (1988)), Sims i wsp., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:4285 (1992); Presta i wsp., J. Immu- nol. 151:2623 (1993), patentach USA nr: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246. Przeciwcia lo anty-IL-12 mo ze by c ewentualnie wytworzone przez immunizacj e zwierz ecia transgenicznego (np. myszy, szczura, chomika, naczelnych innych ni z cz lowiek i tym podobnych) zdolnego do produkcji repertuaru przeciwcia l ludzkich, jak tutaj opisano i/lub jak jest to znane w tejPL 205 786 B1 10 dziedzinie. Komórki, które wytwarzaj a ludzkie przeciwcia lo anty-IL-12 moga by c wyizolowane z takich zwierz at i unie smiertelnione przy u zyciu stosownych sposobów takich, jak sposoby opisane tutaj. Myszy transgeniczne, które mog a wytarza c repertuar ludzkich przeciwcia l, które wiaz a si e z ludzkimi antygenami, mog a by c otrzymane znanymi sposobami (np. nieograniczaj aco patenty USA nr: 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 i 5789650 na rzecz Lonberg i wsp.; Jakobovits i wsp. WO 98/50433, Jakobovits i wsp. WO 98/24893, Lonberg i wsp. WO 98/24884, Lonberg i wsp. WO 97/13852, Lonberg i wsp. WO 94/25585, Kucherlapate i wsp. WO 96/34096, Kucherlapate i wsp. EP 0463 151 B1, Kucherlapate i wsp. EP 0710 719 Al, Surani i wsp. Patent USA Nr 5545807, Bruggemann i wsp. WO 90/04036, Bruggemann i wsp. EP 0438 474 B1, Lonberg i wsp. EP 0814 259 A2, Lonberg i wsp. GB 2 272 440 A, Lonberg i wsp. Nature 368:856-859 (1994), Taylor i wsp., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green i wsp, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez i wsp., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor i wsp., Nucleic Acids Re- search 20(23): 6287-6295 (1992), Tuaillon i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg i wsp., Int Rev Immuzlol 13(l):65-93 (1995) i Fishwald i wsp., Nat Biotechnol 14 (7):845-851 (1996). Ogólnie myszy te zawieraj a przynajmniej jeden transgen zawieraj acy DNA z przynajmniej jednego locus ludzkiej immunoglobuliny, który uleg l funkcjonalnej rearan zacji lub który mo ze przej sc funkcjonaln a rearan zacj e. Endogenne loci immunoglobulinowe u takiej myszy mo ze by c uszko- dzone lub usuni ete w celu wyeliminowania zdolno sci zwierz ecia do produkcji przeciwcia l przez endogenne geny. Przeszukiwanie przeciwcia l w celu znalezienia specyficznego wi azania si e do podobnych bia lek lub fragmentów mo ze by c wykonane przy u zyciu bibliotek prezentacji peptydów. Sposób ten polega na przeszukiwaniu du zych kolekcji peptydów w celu znalezienia pojedynczych jej cz lonków posiadaj a- cych pozadan a funkcj e lub struktur e. Przeszukiwanie przeciwcia lami takich bibliotek prezentacji pep- tydów jest dobrze znane w tej dziedzinie. Prezentowane sekwencje peptydowe mog a posiada c d lu- gosc od 3 do 5000 lub wi ecej aminokwasów, cz esto d lugo sc od 5 do 100 aminokwasów i najcz esciej d lugo sc od oko lo 8 do 25 aminokwasów. Ponadto oprócz sposobów generowania bibliotek peptydo- wych bezpo srednio sposobami syntezy chemicznej, opisano kilka sposobów z u zyciem rekombinowa- nego DNA. Jeden typ polega na prezentacji sekwencji peptydowej na powierzchni bakteriofaga lub komórki. Ka zdy bakteriofag lub komórka zawiera sekwencj e nukleotydow a koduj ac a poszczególne prezentowane sekwencje peptydowe. Takie sposoby s a opisane w publikacjach Patentowych PCT Nr 91/17271, 91/18980, 91/19818, i 93/08278. Inne systemy wytwarzania bibliotek peptydowych po- siadaj a aspekty zarówno syntezy chemicznej, jak i sposobów rekombinacji DNA. Zobacz publikacje patentowe Nr 92/05258, 92/14843 i 96/19256. Zobacz tak ze patenty USA Nr 5658754 i 5643768. Bi- bioteki peptydowe, wektory i zestawy do przeszukiwania s a komercyjnie dost epne u takich dostawców jak Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Zobacz np. patenty USA nr 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456 na rzecz Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500 na rzecz Dyax, 5427908, 5580717, na rzecz Affymax; 5885793 na rzecz Cambridge Antibody Technologies; 5750373 na rzecz Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417 na rzecz Xoma, Col- ligan, jak wy zej; Ausubel, jak wy zej; lub Sambrook, jak wy zej. Przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mog a by c otrzymane przy u zyciu przynajmniej jed- nego kwasu nukleinowego koduj acego przeciwcia lo anty-IL-12, do dostarczenia transgenicznym zwie- rz etom lub ssakom, takim jak kozy, krowy, konie, owca i tym podobne, które produkuja takie przeciw- cia la w swoim mleku. Takie zwierz eta mog a by c otrzymane przy zastosowaniu znanych sposobów. Zobacz np. nieograniczaj aco patenty USA nr 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489 i tym podobne. Przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mog a by c ponadto otrzymane przy u zyciu przy- najmniej jednego kwasu nukleinowego koduj acego przeciwcia lo anty-IL-12, w celu dostarczenia go transgenicznym ro slinom i hodowanym komórkom ro slinnym (np. nieograniczaj aco tytoniu i kukury- dzy), które wytwarzaj a takie przeciwcia la, specyficzne fragmenty lub warianty w komórkach lub cz e- sciach ro slin z nich wyhodowanych. Jako nieograniczaj acy przyk lad, li scie transgenicznego tytoniu z ekspresj a rekombinowanych bia lek zosta ly z powodzeniem u zyte do otrzymania du zych ilo sci re- kombinowanych bia lek, np. przy u zyciu promotora indukowanego. Zobacz np. Cramer i wsp., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) i odes lania tam cytowane. Tak ze transgeniczna kukury- dza zosta la u zyta do ekspresji na skal e przemys low a ssaczych bia lek, których aktywno sci biologiczne s a równowa zne z bialkami otrzymywanymi w innych systemach rekombinowanych lub oczyszczanymiPL 205 786 B1 11 ze zróde l naturalnych. Zobacz, np., Hood i wsp., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) i referencje tam cytowane. Przeciwcia la by ly tak ze otrzymywane w du zych ilo sciach z nasion ro slin transgenicz- nych, w laczaj ac w to fragmenty przeciwcia l, takie jak przeciwcia la jedno lancuchowe (scFv's), w tym nasiona tytoniu i bulwy ziemniaka. Zobacz np. Conrad i wsp., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) i odno sniki tam cytowane. Tak wi ec, przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mog a by c tak ze otrzymane przy u zyciu transgenicznych ro slin wed lug znanych sposobów. Zobacz tak ze np. Fischer i wsp., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999), Ma i wsp., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma i wsp., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam i wsp., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994) i odes lania tam cytowane. Przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mog a wi aza c si e z ludzk a IL-12 w du zym zakresie powinowactwa (K D ). W zalecanym wykonaniu przynajmniej jedno ludzkie mAb wed lug niniejszego wynalazku mo ze w sposób opcjonalny wi aza c si e z ludzkim IL-12 z wysokim powinowactwem. Na przyk lad, ludzkie mAb mo ze wi aza c si e z ludzk a IL-12 z K D równ a lub mniejsz a ni z 10 -7 M, tak a jak nieograniczaj aco 0,1-9,9 (lub dowolny zakres lub warto sc spo sród wymienionych) X 10 -7 ,10 -8 ,10 -9 , 10 -10 , 10 -11 , 10 -12 , 10 -13 lub dowolny zakres lub wartosc spo sród wymienionych. Powinowactwo lub zach lannosc wi azania przeciwcia la wzgl edem antygenu mo ze by c oznaczo- na do swiadczalnie przy u zyciu stosownego sposobu. (Zobacz na przyk lad Berzofsky, i wsp., "Anti- body-Antigen Interactions" w Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman i Company: New York, NY (1992); i sposoby opisane tutaj). Mierzone powinowactwo poszczególnych interakcji przeciwcia lo-antygen mo ze zmienia c si e przy pomiarze w ró znych warunkach (np. st ezenie soli, pH). Tak wi ec, pomiary powinowactwa i innych parametrów wi azania antygenu (np. K D , K a , K d ) w sposób zalecany s a wykonywane w standaryzowa- nych roztworach przeciwcia la i antygenu, takich jak opisany tutaj bufor. Cz asteczki kwasu nukleinowego Cz asteczka kwasu nukleinowego wed lug niniejszego wynalazku koduj aca przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 mo ze zosta c otrzymana przy zastosowaniu sposobów opisanych tutaj lub zna- nych w tej dziedzinie. Cz asteczki kwasów nukleinowych wed lug niniejszego wynalazku mog a by c w postaci RNA, ta- kiego jak mRNA, hnRNA, tRNA lub dowolnej innej jego postaci lub w postaci DNA, w laczaj ac w to, mi edzy innymi cDNA, DNA genomowy uzyskany przez klonowanie lub otrzymany na drodze syntezy albo dowoln a ich kombinacj e. DNA mo ze by c trójniciowy, dwuniciowy lub jednoniciowy, lub by c do- woln a ich kombinacj a. Dowolny fragment przynajmniej jednej nici DNA lub RNA mo ze by c nici a kodu- jac a, znan a tak ze jako ni c sensowna lub mo ze by c nici a niekoduj ac a, nazywan a tak ze nici a antysen- sown a. Wyizolowane cz asteczki kwasu nukleinowego tu ujawnione mog a obejmowa c cz asteczki kwasu nukleinowego zawieraj ace otwart a ramk e odczytu (ORF), opcjonalnie z jednym lub kilkoma intronami, np. nieograniczaj aco przynajmniej jeden specyficzny fragment przynajmniej jednego regionu CDR, takiego jak CDR1, CDR2 i/lub CDR3 przynajmniej jednego lancucha ciezkiego (np. SEK ID NR:1-3) lub la ncucha lekkiego (np. SEK ID NR:4-6); cz asteczki kwasu nukleinowego zawieraj ace sekwencj e koduj ac a przeciwcia lo anty-IL-12 lub region zmienny (np. SEK ID NR: 7, 8) oraz cz asteczki kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencj e nukleotydow a zasadniczo inn a od tych opisanych powy zej, ale która dzi eki zdegenerowaniu kodu genetycznego, nadal koduje przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 jak opisano tutaj i/lub jest to znane w tej dziedzinie. Oczywi scie, kod genetyczny jest do- brze znany w tej dziedzinie. Tak wi ec, stworzenie takich zdegenerowanych wariantów kwasu nukle- inowego, które koduj a specyficzne przeciwcia la anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku jest rutyno- w a czynno sci a dla specjalisty w tej dziedzinie. Zobacz np. Ausubel, i wsp. jak wy zej. Nie stanowi ace ograniczenia przyk lady wyizolowanych cz asteczek kwasu nukleinowego obejmuj a sekwencje SEK ID NR:1-8 odpowiadaj ace nie stanowi acym ograniczenia przyk ladom kwasu nukleinowego koduj acego odpowiednio HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, region zmienny HC i region zmienny LC. Jak tutaj opisano cz asteczki kwasu nukleinowego wed lug niniejszego wynalazku, które zawiera- ja kwas nukleinowy koduj acy przeciwcia lo anty-IL-12 mog a obejmowa c, ale nieograniczaj aco cz a- steczki samodzielnie koduj ace sekwencj e aminokwasow a fragmentu przeciwcia la; sekwencje koduj a- ce ca le przeciwcia lo lub jego cz es c; sekwencje koduj ace przeciwcia lo, jego fragment lub cz esc, jak równie z sekwencje dodatkowe, takie jak sekwencja koduj aca przynajmniej jeden sygna l liderowy lub bia lko fuzyjne z lub bez powy zej wspomnianych dodatkowych sekwencji koduj acych, takich jak przy-PL 205 786 B1 12 najmniej jeden intron, razem z dodatkowymi sekwencjami niekoduj acymi, wlaczaj ac w to, ale nieogra- niczaj aco niekoduj ace sekwencje 5' i 3', takie jak ulegaj ace transkrypcji, ale nie ulegaj ace translacji sekwencje, które odgrywaj a rol e w transkrypcji, obróbce mRNA, w laczaj ac w to wycinanie intronów i sygna ly poliadenylacji (na przyk lad wi azanie rybosomów i stabilno sc mRNA); dodatkow a sekwencj e koduj ac a, która koduje dodatkowe aminokwasy, takie jak te, które dostarczaj a dodatkowych funkcji. Tak wi ec, sekwencja koduj aca przeciwcia lo mo ze by c poddana fuzji z sekwencj a znacznikow a, tak a jak sekwencja koduj aca peptyd, który u latwia oczyszczanie przeciwcia la poddanego fuzji zawieraj ace- go fragment lub cz es c przeciwcia la. Polinukleotydy, które selektywnie hybrydyzuj a do opisanego tutaj polinukleotydu Niniejszy opis ujawnia wyizolowane kwasy nukleinowe, które hybrydyzuj a w warunkach selek- tywnej hybrydyzacji do ujawnionego tutaj polinukleotydu. Tak wi ec tego rodzaju polinukleotydy mog a by c zastosowane do izolowania, wykrywania i/lub mierzenia ilo sci kwasów nukleinowych zawieraj a- cych takie polinukleotydy. Na przyk lad, polinukleotydy mog a by c u zyte do identyfikacji, izolacji lub amplifikacji klonów o cz esciowej lub pe lnej d lugo sci w zdeponowanej bibliotece. W pewnych wykona- niach polinukleotydy s a wyizolowanymi sekwencjami genomowymi lub cDNA, lub wr ecz przeciwnie, komplementarnymi do cDNA z biblioteki ludzkich lub ssaczych kwasów nukleinowych. Zalecane jest by biblioteka cDNA zawiera la przynajmniej 80% sekwencji o pe lnej d lugo sci, zw laszcza 85% lub 90% sekwencji o pe lnej d lugo sci i w szczególno sci przynajmniej 95% sekwencji pe lnej d lugo sci. Biblioteki cDNA mog a by c normalizowane w celu zwiekszenia reprezentacji rzadkich sekwencji. Lagodne lub po srednie warunki hybrydyzacji s a zazwyczaj, ale nie wy lacznie, stosowane do sekwencji maj acych zmniejszon a identyczno sc sekwencji w stosunku do sekwencji komplementar- nych. Umiarkowane lub restrykcyjne warunki hybrydyzacji mog a by c opcjonalnie zastosowane do sekwencji o wi ekszej identyczno sci. Lagodne warunki hybrydyzacji pozwalaja na selektywn a hybrydy- zacj e sekwencji maj acych oko lo 70% identyczno sci i mog a by c zastosowane do identyfikacji sekwencji ortologów lub paralogów. Opcjonalnie polinukleotydy b ed a kodowa c przynajmniej cz esc przeciwcia la kodowanego przez tutaj opisane polinukleotydy. Polinukleotydy obejmuj a sekwencje kwasów nukleinowych, które mog a by c wykorzystane do selektywnej hybrydyzacji do polinukleotydu koduj acego przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku. Zobacz np. Ausubel, jak wy zej; Colligan, jak wy zej. Konstruowanie kwasów nukleinowych Wyizolowane kwasy nukleinowe wed lug niniejszego wynalazku mog a zosta c wytworzone przy u zyciu (a) sposobów rekombinacji genetycznej, (b) technik syntezy, (c) technik oczyszczania lub ich kombinacji, jak jest to dobrze znane w tej dziedzinie. Kwasy nukleinowe mog a w sposób dogodny obejmowa c sekwencje dodatkowe w stosunku do polinukleotydu wed lug niniejszego wynalazku. Na przyk lad miejsce wielokrotnego klonowania zawie- rajace jedno lub kilka miejsc ci ecia dla endonukleaz mo ze by c dodane do kwasu nukleinowego w celu u latwienia izolacji polinukleotydu. Tak ze sekwencje ulegaj ace translacji mog a by c dodane w celu u la- twienia izolacji ulegaj acego translacji polinukleotydu wed lug niniejszego wynalazku. Na przyk lad znacznik o sekwencji sze sciu histydyn dostarcza dogodnego sposobu oczyszczania bia lek wed lug niniejszego wynalazku. Kwas nukleinowy wed lug niniejszego wynalazku, wy laczaj ac sekwencje kodu- jace - w sposób opcjonalny jest wektorem, adaptorem lub linkerem do klonowania i/lub ekspresji po- linukletotydu wed lug niniejszego wynalazku. Do sekwencji do klonowania i/lub ekspresji mog a by c dodane dodatkowe sekwencje w celu optymalizacji ich funkcji w klonowaniu i/lub ekspresji, w celu u latwienia izolacji polinukleotydu, lub w celu poprawy wprowadzania polinukleotydu do komórki. Zastosowanie wektorów do klonowania, wektorów ekspresyjnych, adaptorów i linkerów jest dobrze znane w tej dziedzinie. (Zobacz np. Ausu- bel, jak wy zej; lub Sambrook, jak wy zej). Sposoby rekombinacji genetycznej stosowane do konstrukcji kwasów nukleinowych Kompozycje w postaci wyizolowanego kwasu nukleinowego, takiego jak RNA, cDNA, genomo- wy DNA lub dowolnej ich kombinacji, mog a by c uzyskane ze zróde l biologicznych przy u zyciu szeregu metod klonowania znanych specjalistom w tej dziedzinie. W pewnych wykonaniach, sondy oligonukle- otydowe, które hybrydyzuj a selektywnie w surowych warunkach hybrydyzacji do polinukleotydów we- d lug niniejszego wynalazku s a stosowane do identyfikacji po zadanej sekwencji w bibliotece cDNA lub genomowego DNA. Izolacja RNA i konstrukcja cDNA i bibliotek genomowych jest dobrze znana spe- cjalistom w tej dziedzinie. (Zobacz, np. Ausubel, jak wy zej; lub Sambrook, jak wy zej).PL 205 786 B1 13 Sposoby izolacji i przeszukiwania kwasów nukleinowych Bibioteka cDNA lub genomowa mo ze by c przeszukana przy u zyciu sondy sporz adzonej na podstawie sekwencji polinukleotydu wed lug niniejszego wynalazku, takiej jak te ujawnione tutaj. Son- dy mog a by c u zyte do hybrydyzacji z sekwencjami genomowego DNA lub cDNA w celu izolacji genów homologicznych w tych samych lub ró znych organizmach. Specjali sci w tej dziedzinie doceni a, ze w tej metodzie mog a by c zastosowane ró zne poziomy restrykcyjno sci warunków hybrydyzacji; za- równo roztwór do hybrydyzacji, jak i roztwór do p lukania mog a by c odpowiednio silne. Wraz ze wzro- stem restrykcyjno sci warunków hybrydyzacji musi zwi eksza c si e stopie n komplementarno sci pomi edzy sond a i jej celem, aby pojawi lo si e formowanie dupleksów. Stopie n restrykcyjno sci warunków hybrydy- zacji mo ze by c kontrolowany przez jeden lub wi ecej parametrów, takich jak temperatura, si la jonowa, pH i obecno sc czesciowo denaturuj acego rozpuszczalnika, takiego jak formamid. Na przyk lad restryk- cyjno sc hybrydyzacji jest w sposób dogodny zmieniana przez zmian e polarno sci roztworu reakcyjne- go, manipulacj e stezeniami formamidu w zakresie od 0 do 50%. Stopie n komplementarno sci (iden- tyczno sci sekwencji) wymagany do wykrywalnego wi azania b edzie si e zmienia c wraz ze zmianami restrykcyjno sci roztworu hybrydyzacyjnego i/lub roztworu do p lukania. Stopie n komplementarno sci b edzie wynosi l optymalnie 100%, 70-100% lub dowolny zakres lub wartosc spo sród wymienionego. Jednak ze powinno by c zrozumia le, ze niewielkie zmiany sekwencji w sondach i starterach mog a by c skompensowane przez zmniejszenie restrykcyjno sci roztworu do hybrydyzacji i/lub p lukania. Sposoby amplifikacji RNA lub DNA s a dobrze znane w tej dziedzinie i mog a by c u zyte w niniej- szym wynalazku bez zbytniego eksperymentowania, na podstawie informacji i wskazówek tutaj przed- stawionych. Znane sposoby amplifikacji DNA lub RNA obejmuj a nieograniczaj aco la ncuchow a reakcj e poli- merazy (PCR) i pokrewne procesy namna zania (zobacz np. Patenty USA Nr 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 na rzecz Mullis, i wsp.; 4795699 i 4921794 na rzecz Tabor, i wsp; 5142033 na rzecz Innis; 5122464 dla Wilson, i wsp.; 5091310 dla Innis; 5066584 na rzecz Gyllensten, i wsp; 4889818 na rzecz Gelfand, i wsp; 4994370 na rzecz Silver, i wsp; 4766067 na rzecz Biswas; 4656134 na rzecz Ringold) i amplifikacj e za po srednictwem RNA, która wykorzystuje RNA antysensowny do sekwencji docelowej jako matryc e do syntezy dwuniciowego DNA (Patent USA Nr 5130238 na rzecz Ma lek, i wsp, z handlow a nazw a NASBA). (Zobacz np. Ausubel, jak wy zej; lub Sambrook, jak wy zej.) Na przyk lad, technologia la ncuchowej reakcji polimerazy (PCR) mo ze by c u zyta do amplifikacji sekwencji polinukleotydów wed lug niniejszego wynalazku i genów pokrewnych bezpo srednio z biblio- tek genomowego DNA lub cDNA. PCR i inne sposoby amplifikacji in vitro mog a by c u zyteczne na przyk lad do sklonowania sekwencji kwasu nukleinowego, które koduj a bia lka ulegaj ace ekspresji, do zastosowania kwasów nukleinowych jako sondy do detekcji obecno sci po zadanego mRNA w prób- kach, do sekwencjonowania kwasów nukleinowych lub w innych celach. Przyk lady technik wystarcza- jacych do wprowadzenia osób bieg lych w tej dziedzinie do sposobów amplifikacji in vitro mo zna zna- lezc w Berger, jak wy zej, Sambrook, jak wy zej, i Ausubel, jak wy zej, jak równie z w Mullis, i wsp., Pa- tent USA Nr 4683202 (1987); i Innis, i wsp., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Wyd., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Znane s a w tej dziedzinie dost epne komercyjnie zestawy do amplifikacji genomowego DNA technik a PCR. Zobacz, np. Advantage-GC Genomie PCR Kit (Clontech). Ponadto do poprawy wydajno sci otrzymywania d lugich produktów PCR mo ze by c u zyty gen bia lka 32 T4 (Boehringer Mannheim). Syntetyczne sposoby konstruowania kwasów nukleinowych Wyizolowane kwasy nukleinowe wed lug niniejszego wynalazku mog a by c tak ze przygotowane znanymi sposobami przez bezpo sredni a syntez e chemiczn a (zobacz np. Ausubel, i wsp., jak wy zej). Synteza chemiczna ogólnie prowadzi do powstania jednoniciowego oligonukleotydu, który mo ze by c przekszta lcony do dwuniciowego DNA przez hybrydyzacj e z sekwencj a komplementarn a, lub przez polimeryzacj e przy u zyciu polimerazy DNA stosuj ac pojedyncz a nic jako matryc e. Specjalista w tej dziedzinie rozpozna, ze podczas gdy chemiczna synteza DNA mo ze by c ograniczona do oko lo stu lub wi ecej nukleotydów, d luzsze sekwencje mog a by c uzyskane przez ligacj e krótszych sekwencji. Rekombinowane kasety ekspresyjne W niniejszym opisie ujawniono ponadto rekombinowane kasety ekspresyjne zawieraj ace kwas nukleinowy wed lug niniejszego wynalazku. Sekwencja kwasu nukleinowego wed lug niniejszego wyna- lazku, na przyk lad sekwencja cDNA lub genomowa koduj aca przeciwcia lo wed lug niniejszego wyna- lazku mo ze zosta c u zyta do skonstruowania rekombinowanej kasety ekspresyjnej, która mo ze zosta c wprowadzona do przynajmniej jednej po zadanej komórki gospodarza. Rekombinowana kaseta eks-PL 205 786 B1 14 presyjna b edzie zazwyczaj zawiera c polinukleotyd wed lug niniejszego wynalazku w funkcjonalny spo- sób po laczony z sekwencjami reguluj acymi inicjacj e transkrypcji, które b ed a sterowa c transkrypcj a polinukleotydu w u zytej komórce gospodarza. Do sterowania ekspresj a kwasów nukleinowych wed lug niniejszego wynalazku mog a by c u zyte zarówno promotory heterologiczne, jak i nieheterologiczne (np. endogenne). W pewnych wykonaniach wyizolowane kwasy nukleinowe s luzace jako promotor, wzmacniacz transkrypcji lub inne elementy mog a by c w laczone w odpowiedniej pozycji (na prawo, na lewo lub w intronie) w nieheterologicznej postaci polinukleotydu wed lug niniejszego wynalazku tak, aby zwi ek- sza c lub zmniejsza c ekspresj e polinukleotydu wed lug niniejszego wynalazku. Na przyk lad endogenne promotory mog a by c zmienione in vivo lub in vitro przez mutacj e, delecj e i/lub substytucj e. Wektory i komórki gospodarza W niniejszym opisie ujawniono tak ze wektory, które zawieraj a cz asteczki wyizolowanego kwasu nukleinowego wed lug niniejszego wynalazku, komórki gospodarza, do których s a wprowadzane re- kombinowane wektory i produkcj e przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 technikami rekombi- nacji genetycznej, jak jest to dobrze znane w tej dziedzinie. Zobacz np. Sambrook, i wsp., jak wy zej; Ausubel, i wsp., jak wy zej. Polinukleotydy mog a opcjonalnie by c po laczone z wektorem zawieraj acym znacznik selekcyjny wyra zany w gospodarzu. Ogólnie wektor plazmidowy jest wprowadzany w precypitacie, takim jak pre- cypitat fosforanu wapnia, lub w kompleksie z naladowanym lipidem. Je zeli wektorem jest wirus, mo ze on by c zapakowany in vitro przy u zyciu odpowiedniej pakuj acej linii komórkowej i nast epnie transdu- kowany do komórek gospodarza. Wstawka DNA powinna by c przy laczona w sposób funkcjonalny do odpowiedniego promotora. Konstrukty ekspresyjne b ed a ponadto zawiera c miejsca inicjacji i terminacji transkrypcji oraz w regio- nie ulegaj acym transkrypcji miejsce wi azania rybosomu potrzebne do translacji. Koduj aca cz es c doj- rza lych transkryptów ulegaj acych ekspresji z konstruktów b edzie w sposób zalecany zawiera c kodon inicjacji translacji na pocz atku i kodon stop (np. UAA, UGA or UAG) odpowiednio umieszczony na ko ncu mRNA ulegaj acego translacji, przy czym preferowane s a kodony UAA i UAG w przypadku eks- presji w komórce ssaczej lub eukariotycznej. Wektory ekspresyjne b ed a w sposób zalecane, ale opcjonalnie zawiera c mog a przynajmniej je- den znacznik selekcyjny. Takie znaczniki obejmuj a przyk ladowo ale nieograniczaj aco dla hodowli komórek eukariotycznych geny oporno sci na metotreksat (MTX), reduktaz e dihydrofolianu (DHFR, patenty USA nr 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ampicylin e, neomycyn e (G418), kwas mykofenolowy, lub syntetaz e glutaminy (GS, patenty USA nr 5122464; 5770359; 5827739) a w przypadku hodowli E. coli i innych bakterii lub komórek prokariotycznych geny oporno- sci na tetracyklin e lub ampicylin e. Odpowiednie po zywki i warunki hodowlane dla wszystkich opisa- nych powy zej komórek gospodarza s a znane w tej dziedzinie. Odpowiednie wektory mog a by c z la- two scia zidentyfikowane przez specjalist e w tej dziedzinie. Wprowadzenie konstruktu wektora do ko- mórki gospodarza mo ze odbywa c si e przez transfekcj e z fosforanem wapnia, transfekcj e za po sred- nictwem DEAE-dekstranu, transfekcj e za po srednictwem lipidów kationowych, elektroporacj e, transdukcj e, infekcj e lub innymi znanymi sposobami. Takie sposoby s a opisane w tej dziedzinie, jak np. Sambrook, jak wy zej, rozdzia ly 1-4 i 16-18; Ausubel, jak wy zej, rozdzia ly 1, 9, 13, 15, 16. Przynajmniej jedno przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku mo ze ulega c ekspresji w zmie- nionej formie, takiej jak bia lko fuzyjne, i mo ze zawiera c nie tylko sygna ly sekrecji, ale dodatkowo hete- rologiczne regiony funkcjonalne. Na przyk lad, region dodatkowych aminokwasów, szczególnie na la- dowanych aminokwasów, mo ze by c dodany do ko nca N przeciwcia la w celu poprawienia stabilno sci i trwa lo sci w komórce gospodarza, podczas oczyszczania lub podczas pó zniejszej obróbki i przecho- wywania. Do przeciwcia la mog a by c tak ze dodane fragmenty peptydowe u latwiaj ace oczyszczanie. Takie regiony mog a by c usuni ete przed ostatecznym przygotowaniem przeciwcia la lub przynajmniej jednego jego fragmentu. Takie sposoby s a opisane w wielu standardowych podr ecznikach laborato- ryjnych, takich jak Sambrook, jak wy zej, rozdzia ly 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, jak wy zej, roz- dzia ly 16, 17 i 18. Specjali sci w tej dziedzinie posiadaj a odpowiedni a wiedz e na temat licznych systemów ekspre- syjnych zdolnych do ekspresji kwasu nukleinowego koduj acego bia lko wed lug niniejszego wynalazku. Alternatywnie kwasy nukleinowe wed lug niniejszego wynalazku mog a ulega c ekspresji w ko- mórkach gospodarza przez w laczenie (przez manipulacj e) w komórce gospodarza, która zawiera en- dogenny DNA koduj acy przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku. Takie sposoby s a dobrze znanePL 205 786 B1 15 w tej dziedzinie, np. jak opisano w patentach USA nr 5580734, 5641670,5733746 i 5733761, w ca lo sci w laczonych tutaj jako odniesienie. Przyk ladowymi hodowlami komórkowymi u zytecznymi do wytwarzania przeciwcia l, ich specy- ficznych fragmentów lub wariantów s a komórki ssacze. Systemy komórek ssaczych cz esto b ed a w postaci monowarstwy komórek, chocia z zawiesiny lub bioreaktory komórek ssaczych tak ze s a u zy- wane. W tej dziedzinie opracowano szereg odpowiednich linii komórek gospodarza zdolnych do eks- presji nienaruszonych glikozylowanych bia lek obejmuj acych linie komórkowe COS-1 (np. ATCC CRL 1650), COS-7 (np. ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (np. ATCC CRL-10), CHO (np. ATCC CRL 1610) i BSC-1 (np. ATCC CRL-26), komórki Cos-7, komórki CHO, komórki hep G2, komórki P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293, komórki HeLa i tym podobne, które s a latwo dost epne z, na przy- k lad, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www. atcc. org). Preferowane komórki gospo- darza obejmuj a komórki pochodzenia limfoidalnego, takie jak komórki szpiczaka i ch loniaka. Szcze- gólnie preferowanymi komórkami gospodarza s a komórki P3X63Ag8.653 (Numer Dost epu ATCC CRL-1580) i komórki SP2/0-Agl4 (Numer Dost epu ATCC CRL-1851). W szczególnie zalecanym wy- konaniu rekombinowan a komórk a jest komórka P3X63Ab8.653 lub SP2/0-Agl4. Wektory ekspresyjne dla tych komórek mog a zawiera c jeden lub wi eksz a liczb e nast epuj acych sekwencji kontroluj acych ekspresj e, takich jak, mi edzy innymi, miejsce startu replikacji, promotor (np. pó zne lub wczesne promotory SV40, promotor CMV (patenty USA nr 5168062; 5385839), promotor tk HSV, promotor pgk (kinaza fosfoglicerolowa), promotor EF-1 alfa (patent USA nr 5266491), przynajm- niej jeden promotor ludzkiej immunoglobuliny; wzmacniacz transkrypcji, i/lub miejsca zawierajace in- formacj e o obróbce mRNA, takie jak miejsca wi azania rybosomu, miejsca wycinania intronów z RNA, miejsca poliadenylacji (np. miejsce dodawania poli(A) z du zego Ag T) i sekwencje terminacji tran- skrypcji. Zobacz, np. Ausubel i wsp., jak wy zej; Sambrook, i wsp., jak wy zej. Inne komórki u zyteczne w produkcji kwasów nukleinowych lub bia lek wed lug niniejszego wynalazku s a znane i/lub dost epne, na przyk lad z Katalogu Linii Komórkowych i Hybrydom American Type Culture Collection (www.atcc.org) lub innych znanych lub komercyjnych zróde l. W przypadku eukariotycznych komórek gospodarza, sekwencje poliadenylacji lub terminacji transkrypcji s a zazwyczaj w laczane do wektora. Przyk ladem sekwencji terminatora jest sekwencja poliadenylacji z genu krowiego hormonu wzrostu. Sekwencje do dok ladnego wycinania intronów z transkryptu (splicingu) tak ze mog a by c w laczone. Przyk ladem sekwecji wycinania intronu jest in- tron VP1 z SV40 (Sprague, i wsp., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Dodatkowo do wektora mog a by c w laczone sekwencje genowe kontroluj ace replikacj e w komórce gospodarza, jak jest to znane w tej dziedzinie. Oczyszczanie przeciwcia la Przeciwcia lo anty-IL-12 mo ze by c odzyskane i oczyszczone z hodowli rekombinowaych komó- rek dobrze znanymi sposobami, w laczaj ac w to, mi edzy innymi, oczyszczanie przy u zyciu bia lka A, wytr acanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcj e kwasem, chromatografi e aniono- lub kationo- wymienn a, chromatografi e na fosfocelulozie, chromatografi e oddzia lywa n hydrofobowych, chromato- grafi e powinowactwa, chromatografi e na hydroksyapatycie i chromatografi e z u zyciem lektyn. Do oczyszczania mo ze by c tak ze u zyta wysokosprawna chromatografia cieczowa („HPLC"). Zobacz, np. Colligan, Current Protocols in Immunology lub Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), np. rozdzia ly 1, 4, 6, 8, 9, 10. Przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku obejmuj a naturalnie oczyszczone produkty, produk- ty procedur syntezy chemicznej i produkty otrzymane przy u zyciu technik rekombinacji genetycznej z eukariotycznego gospodarza, w tym na przyk lad komórek dro zd zy, ro slin wy zszych, owadów i ssa- ków. W zale zno sci od gospodarza u zytego w procedurze wytwarzania przy u zyciu technik rekombina- cji genetycznej, przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c lub nie by c glikozylowane, przy czym zalecane jest glikozylowane. Takie sposoby s a opisane w wielu standardowych podr ecznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook, jak wy zej, dzia ly 17.37-17.42; Ausubel, jak wy zej, rozdzia ly 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, jak wy zej, rozdzia ly 12-14. Przeciwcia la anty-IL-12 Wyizolowane przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku obejmuj a przeciwcia lo kodowane przez dowolny z polinukleotydów wed lug niniejszego wynalazku, jak to dok ladniej zosta lo opisane tutaj, lub dowolne wyizolowane lub otrzymane przeciwcia lo. Zalecane jest aby ludzkie przeciwcia la wi aza ly si e z ludzkim IL-12 i przez to cz esciowo lub zasadniczo neutralizowa ly przynajmniej jedn a aktywnosc biologiczn a bia lka. Przeciwcia lo, które cz esciowo lub dogodnie zasadniczo neutralizujePL 205 786 B1 16 przynajmniej jedn a aktywno sc biologiczn a przynajmniej jednego bia lka IL-12 lub jego fragmentu mo ze wi aza c bia lko lub jego fragment i przez to hamowa c aktywno sci zale zne od wi azania IL-12 do recepto- ra IL-12 lub przez inne mechanizmy zale zne od IL-12 lub za po srednictwem IL-12. Stosowany tutaj termin „przeciwcia lo neutralizuj ace" dotyczy przeciwcia la, które mo ze hamowa c aktywnosc zale zn a od IL-12 o oko lo 20-120%, zw laszcza o przynajmniej oko lo 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% lub wi ecej w zale zno sci od oznaczenia. Zdolno sc prze- ciwcia la anty-IL-12 do hamowania aktywno sci zale znej od IL-12 jest w sposób zalecany szacowana na podstawie przynajmniej jednego odpowiedniego oznaczenia bia lka lub receptora IL-12, jak opisano tutaj i/lub jak jest to znane w tej dziedzinie. Ludzkie przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c dowolnej klasy (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itp.) lub izotypu i mo ze zawiera c la ncuch lekki kappa lub lambda. W jednym z wykona n ludzkie przeciwcia lo zawiera la ncuch ciezki IgG lub zdefiniowany frag- ment, na przyk lad przynajmniej jednego z izotypów IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Przeciwcia la tego typu mog a by c otrzymane przez u zycie transgenicznej myszy lub innego transgenicznego ssaka innego ni z cz lowiek zawieraj acego przynajmniej jeden transgen koduj acy ludzki la ncuch lekki (np. IgG, IgA i IgM (np. ?1, ?2, ?3, ?4), jak opisano to tutaj i/lub jest znane w tej dziedzinie. W innym wykonaniu, ludzkie przeciwcia lo przeciwko ludzkiemu IL-12 zawiera lancuch ci ezki IgG1 i lancuch lekki IgG1. Przynajmniej jedno przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku wiaze przynajmniej jeden wy- szczególniony epitop specyficzny dla przynajmniej jednego bia lka IL-12, jego podjednostki, fragmentu, cz esci lub dowolnej ich kombinacji. Przynajmniej jeden epitop mo ze zawiera c przynajmniej jeden re- gion wi azacy przeciwcia lo, który zawiera przynajmniej jeden fragment tego bia lka, którego epitop jest w sposób zalecany z lo zony z przynajmniej jednego zewn atrzkomórkowego, rozpuszczalnego, hydrofi- lowego, zewn etrznego lub cytoplazmatycznego fragmentu tego bia lka. Przynajmniej jeden wyszcze- gólniony epitop mo ze zawiera c dowoln a kombinacj e przynajmniej jednej sekwencji aminokwasowej z przynajmniej 1-3 aminokwasów dolaczonej do ca lego wyszczególnionego fragmentu ci ag lej se- kwencji aminokwasowej SEK ID NR:9. Przeciwcia lo wed lug wynalazku mog a by c otrzymane przez chemiczne polaczenie ze sob a ró z- nych fragmentów przeciwcia la (np. regionu CDR, regionu zr ebowego) przy u zyciu konwencjonalnych technik, przez wytworzenie i ekspresj e cz asteczki kwasu nukleinowego (tj. jednej lub wi ecej) koduj acej przeciwcia lo, przy u zyciu konwencjonalnych technik rekombinacji DNA lub przez zastosowanie innej odpowiedniej techniki. Przeciwcia lo anty-IL-12 zawiera region zmienny lancucha ciezkiego, opcjonalnie o sekwencji aminokwasowej SEK ID NR: 7 i region zmienny la ncucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej SEK ID NR:8. Przeciwcia la, które wi az a si e do ludzkiej IL-12 i które zawieraj a zdefiniowany region zmienny lancucha ciezkiego lub lekkiego mog a by c otrzymane przy u zyciu odpowiednich sposobów, takich jak prezentacja na fagach (Katsube, Y., i wsp., Int J Mol Med, 1 (5) : 863-868 (1998)) lub sposobów wyko- rzystuj acych transgeniczne zwierz eta, jak jest to znane w tej dziedzinie i/lub tutaj opisane. Na przyk lad mysz transgeniczna zawieraj aca transgen funcjonalnie przearan zowanego lancucha ciezkiego ludzkiej immunoglobuliny i transgen zawieraj acy DNA z locus la ncucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny mo ze zosta c poddana immunizacji ludzka IL-12 lub jej fragmentem w celu wywo lania produkcji prze- ciwcia l. Je zeli jest to pozadane, komórki produkuj ace przeciwcia lo mog a by c wyizolowane i mog a by c stworzone hybrydy lub inne unie smiertelnione komórki produkuj ace przeciwcia lo, jak opisano to tutaj i/lub jest to znane w tej dziedzinie. Alternatywnie przeciwcia lo, jego specyficzny fragment lub wariant mo ze ulega c ekspresji przy u zyciu koduj acego kwasu nukleinowego lub jego fragmentu w odpowied- nich komórkach gospodarza. Substytucje konserwowanych aminokwasów dotycz a zast apienia jednego aminokwasu przez drugi aminokwas, który posiada w la sciwo sci chemiczne i/lub fizyczne (np. ladunek, struktura, polar- nosc, hydrofobowo sc/hydrofilowo sc), które s a podobne do tych w la sciwo sci pierwszego aminokwasu. Konserwowane substytucje obejmuj a zast apienie jednego aminokwasu przez inny spo sród poni z- szych grup: lizyna (K), arginina (R) i histidyna (H); kwas asparaginowy (D) i glutaminowy (E); aspara- gina (N), glutamina (Q), seryna (S), treonina (T), tyrozyna (Y), K, R, H, D i E; alanina (A), walina (V), leucyna (L), izoleucyna (I), prolina (P), fenyloalanina (F), tryptofan (W), metionina (M), cysteina (C) i glicyna (G); F, W i Y; C, S i T. Kody aminokwasów Aminokwasy, z których zbudowane s a przeciwcia la anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku s a cz esto podane skrótowo. Nazwy aminokwasów mog a by c podane przez oznaczenie aminokwasów kodem jednoliterowym, kodem trójliterowym, pe lna nazw a lub kodonem(nami) w postaci trzech nukle-PL 205 786 B1 17 otydów, jak jest to dobrze zrozumia le w tej dziedzinie (zobacz Alberts, B., i wsp., Molecular Biology of The Cell, Wyd. trzecie, Garland Publishing, Inc., New York, 1994): Kod jednoliterowy Kod trzyliterowy Nazwa Kodony trzynukleotydowe A Ala Alanina GCA, GCC, GCG, GCU C Cys Cysteina UGC, UGU D Asp Kwas asparaginowy GAC, GAU E Glu Kwas glutaminowy GAA, GAG F Phe Fenyloalanina UUC, UUU G Gly Glicyna GGA, GGC, GGG, GGU H His Histydyna CAC, CAU I Ile Izoleucyna AUA, AUC, AW K Lys Lizyna AAA, AAG L Leu Leucyna UUA, WG, CUA, CUC, CUG, CUU M Met Metionina AUG N Asn Asparagina AAC, AAU P Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamina CAA, CAG R Arg Arginina AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S Ser Seryna AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T Thr Treonina ACA, ACC, ACG, AC U V Val Walina GUA, GUC, GUG, GUU W Trp Tryptofan UGG Y Tyr Tyrozyna UAC, UAU Przeciwcia lo anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mo ze zawiera c jedn a lub wi eksz a liczb e substytucji, delecji lub addycji aminokwasów pochodz acych zarówno z mutacji naturalnych, jak i mani- pulacji przez cz lowieka, jak tutaj wyszczególniono. Oczywi scie specjalista w tej dziedzinie uzale zni lby liczb e substytucji aminokwasów od wielu czynników, w laczaj ac w to te opisane powy zej. Mówi ac ogólnie, liczba substytucji aminokwasów, in- sercji lub delecji dla dowolnego podanego bia lka pochodnego IgG anty-IL-12, jego fragmentu lub wa- riantu nie b edzie wi eksza ni z 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, czyli 1-30 lub dowolny zakres lub warto sc spo sród tu wymienionych. Aminokwasy w przeciwciele anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku, które s a istotne dla jej funkcji mog a by c zidentyfikowane sposobami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak mutageneza ukie- runkowana lub mutageneza ze skanowaniem alanin (np. Ausubel, jak wy zej, rozdzia ly 8, 15; Cunnin- gham i Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). Druga procedura wprowadza pojedyncze mutacje wprowadzaj ace alanin e w ka zdej pozycji w cz asteczce. Powsta le zmutowane cz asteczki s a nast epnie testowane pod k atem obecno sci aktywno sci biologicznej, takiej jak nieograniczaj aco przynajmniej jedna aktywnosc neutralizuj aca IL-12. Miejsca, które s a krytyczne dla wi azania si e przeciwcia la mog aPL 205 786 B1 18 by c tak ze zidentyfikowane przez analiz e strukturaln a, tak a jak krystalizacja, magnetyczny rezonans jadrowy lub znakowanie przy u zyciu fotopowinowactwa (Smith, i wsp., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) i de Vos, i wsp., Science 255: 306-312 (1992)). Specjalista w tej dziedzinie dostrze ze, ze niniejszy wynalazek obejmuje przynajmniej jedno bio- logicznie aktywne przeciwcia lo wed lug niniejszego wynalazku. Biologicznie aktywne przeciwcia la po- siadaj a aktywnosc specyficzn a na poziomie przynajmniej 20%, 30% lub 40% i dogodniej na poziomie przynajmniej 50%, 60% lub 70% a najdogodniej na poziomie przynajmniej 80%, 90% lub 95%-1000% aktywno sci natywnego (niesyntetycznego), endogennego lub pokrewnego i znanego przeciwcia la. Sposoby oznaczania i oceny ilo sciowej aktywno sci enzymatyczej i specyficzno sci substratowej s a dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy ludzkich opisanych tu przeciwcia l, które mog a by c zmodyfikowane przez kowalencyjne do laczenie ugrupowania organicznego. Taka modyfikacja mo ze prowadzi c do powstania przeciwcia la o ulepszonych w la sciwo sciach farmakokinetycznych (np. wyd lu zonym okresie pó ltrwania in vivo w surowicy). Ugrupowanie organiczne mo ze by c liniow a lub rozga lezion a grup a polimeru, grup a kwasu t luszczowego lub grup a estru kwasu t luszczowego. W poszczególnych wykonaniach hydrofilowa grupa polimeru mo ze mie c mas e cz asteczkow a od oko lo 800 do oko lo 120000 Daltonów i mo ze by c glikolem polialkanowym (np. glikol polietylenowy (PEG), glikol polipropylenowy (PPG)), polimerem w eglowodanowym, polimerem aminokwasowym lub poliwi- nylopirolidonem, a grupa kwasu t luszczowego lub estru kwasu t luszczowego mo ze zawiera c od oko lo o smiu do oko lo czterdziestu atomów w egla. Zmodyfikowane przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku mog a obejmowa c jedn a lub wi ek- sz a liczb e ugrupowa n organicznych, które s a przy laczone kowalencyjnie bezpo srednio lub po srednio do przeciwcia la. Ka zde ugrupowanie organiczne, które jest przy laczone do przeciwcia la wed lug niniej- szego wynalazku mo ze niezale znie by c grup a hydrofilow a polimeru, grup a kwasu t luszczowego lub grup a estru kwasu t luszczowego. Stosowany tutaj termin „kwas t luszczowy" obejmuje kwasy jedno- karboksylowe i kwasy dwukarboksylowe. Stosowany tutaj termin „hydrofilowa grupa polimeru" dotyczy polimeru organicznego, który jest bardziej rozpuszczalny w wodzie ni z w oktanie. Tak wi ec przeciwcia- lo zmienione przez kowalencyjne do laczenie polilizyny jest obj ete niniejszym ujawnieniem. Polimery hydrofilowe odpowiednie do modyfikowania przeciwcia l wed lug niniejszego wynalazku mog a by c li- niowe lub rozga lezione i obejmowa c, na przyk lad, glikole polialakanowe (np. glikol monometoksypoli- etylenowy (mPEG), PPG i tym podobne), w eglowodany (np. dekstran, celuloza, oligosacharydy, poli- sacharydy i tym podobne) polimery hydrofilowych aminokwasów (np. polilizyny, poliargininy, poliaspa- raginianu i tym podobnych), tlenki polialkanu (np. tlenek polietylenu, tlenek polipropylenu i tym podob- ne), poliwinylopirolidon. Zalecany hydrofilowy polimer, który modyfikuje przeciwcia lo wed lug niniejsze- go wynalazku ma mas e cz asteczkow a od okolo 800 do oko lo 150000 Daltonów jako odr ebna cz a- steczka. Na przyk lad mog a by c u zyte PEG 5000 i PEG 20000 , przy czym indeks dolny okre sla sredni a mas e cz asteczkow a polimeru w Daltonach. Hydrofilowe grupy polimerowe mog a by c podstawione jedn a do oko lo sze sciu grup alkilowych, kwasów t luszczowych lub estrów kwasów t luszczowych. Hy- drofilowe polimery, które s a podstawione grup a kwasu t luszczowego lub estru kwasu t luszczowego mog a by c otrzymane przez zastosowanie odpowiednich sposobów. Na przyk lad polimer zawieraj acy grup e aminow a mo ze by c polaczony z grup a karboksylow a kwasu t luszczowego lub estru kwasu t luszczowego i zaktywowana grupa karboksylowa (np. zaktywowana przez N,N-karbonylodiimidazol) na kwasie t luszczowym lub estrze kwasu t luszczowego mo ze by c po laczona z grup a hydroksylow a polimeru. Kwasy t luszczowe lub estry kwasów t luszczowych odpowiednie do modyfikacji przeciwcia l we- d lug niniejszego wynalazku mog a by c nasycone lub mog a zawiera c jedno lub wi eksz a liczb e wi aza n nienasyconych. Kwasy t luszczowe, które s a odpowiednie do modyfikacji przeciwcia l wed lug niniejsze- go wynalazku obejmuj a, na przyk lad, kwas n-dodekanowy (C 12 , kwas laurowy), n-tetradekanowy (C 14 , kwas mirystynowy), n-oktadekanowy (C 18 , kwas stearynowy), n-eikozanowy (C 20 , kwas arachidowy), n-dokozanowy (C 22 , kwas behenowy), n-triakontanowy (C 30 ), n-tetrakontanowy (C 40 ,), cis- ?9-okta- dekanowy (C 18 ,kwas oleinowy), wszystkie kwasy cis- ?5,8,11,14-eikozatetraenowe (C 20 , kwas arachi- donowy), kwas oktanodiowy, kwas tetradekanodiowy, kwas oktadekanodiowy, kwas dokozanodiowy i tym podobne. Odpowiednie estry kwasów t luszczowych obejmuj a monoestry kwasów dwukarboksy- lowych, które zawieraj a liniow a lub rozga lezion a ni zsz a grup e alkilow a. Ni zsza grupa alkilowa mo ze zawiera c od jednego do oko lo dwunastu, zw laszcza od jednego do oko lo sze sciu atomów w egla.PL 205 786 B1 19 Zmodyfikowane ludzkie przeciwcia la mog a by c otrzymane przy u zyciu odpowiednich sposobów, takich jak reakcja z jednym lub wi eksz a liczb a czynników modyfikuj acych. Stosowany tutaj termin „czynnik modyfikuj acy" dotyczy odpowiedniej grupy organicznej (np. polimeru hydrofilowego, kwasu t luszczowego, estru kwasu t luszczowego), która zawiera grup e aktywuj ac a. „Grupa aktywuj aca" ozna- cza sk ladnik chemiczny lub grup e funkcyjn a, która w odpowiednich warunkach reaguje z drug a grup a chemiczn a formuj ac przez to wi azanie kowalencyjne pomi edzy czynnikiem modyfikuj acym a drug a grup a chemiczn a. Na przyk lad aktywuj ace reaktywne grupy aminowe obejmuj a grupy elektrofi lowe, takie jak tosylan, mesylan, chlorowcopochodne (chloro, bromo, fluoro, jodo), estry N-hydroksy- sukcynimidu (NHS) i tym podobne. Grupy aktywuj ace, które mog a reagowa c z tiolami obejmuj a, na przyk lad, imid kwasu maleinowego, dwusiarczek jodoacetylu, akrylolilu, pirydylu, tiol kwasu 5-tio-2-ni- trobenzoesowego (TNBtiol) i tym podobne. Aldehydowa grupa funkcyjna mo ze by c po laczona z cz asteczkami zawieraj acymi grup e aminow a lub hydrazydow a, a grupa azydkowa mo ze reagowa c z trójwarto sciow a grup a fosforow a tworz ac po laczenia fosforoamidowe lub fosforoimidowe. Odpo- wiednie sposoby wprowadzania grup aktywuj acych do cz asteczek s a znane w tej dziedzinie (zobacz na przyk lad Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques. Academic Press: San Diego, CA (1996)). Grupa aktywuj aca mo ze by c zwi azana bezpo srednio do grupy organicznej (np. polimeru hydrofilowe- go, kwasu t luszczowego lub estru kwasu t luszczowego), lub przez cz esc lacz ac a, na przyk lad dwu- warto sciow a grup e C 1-12 , w której jeden lub wi eksza liczba atomów w egla mo ze by c zast apiona przez heteroatomy, takie jak tlen, azot lub siarka. Odpowiednie cz esci wiazace obejmuj a, na przyk lad, glikol tetraetylenowy, -(CH 2 ) 3 -, -NH-(CH 2 ) 6 -NH-, -(CH 2 ) 2 -NH- i -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -O-CH-CH 2 -O-CH-NH-. Czynniki modyfikuj ace, które zawieraj a cz esc lacz ac a mog a by c otrzymane, na przyk lad, przez reak- cje mono-Boc-alkilodiaminy (np. mono-Boc-etylenodiaminy, mono-Boc-diaminoheksanu) z kwasem t luszczowym w obecno sci 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) w celu otrzymania wi azania amidowego pomi edzy woln a amin a i grup a karboksylow a kwasu t luszczowego. Grupa za- bezpieczaj aca Boc mo ze by c usuni eta z produktu przez traktowanie kwasem trifluorooctowym (TFA) w celu uwolnienia pierwszorz edowej aminy, która mo ze by c po laczona z inn a grup a karboksylow a, jak opisano, lub mo ze ulec reakcji z bezwodnikiem maleinowym, a powsta ly produkt mo ze ulec cyklizacji tworz ac zaktywowan a pochodn a maleimidow a kwasu t luszczowego. Zobacz, na przyk lad, Thompson, i wsp., WO 92/16221. Zmodyfikowane przeciwcia la tu opisane mog a by c otrzymane przez reakcj e ludzkiego przeciw- cia la z czynnikiem modyfikuj acym. Na przyk lad ugrupowania organiczne mog a by c do laczone do przeciwcia la w sposób niespecyficzny dla miejsca przez u zycie reaguj acego z aminami czynnika mo- dyfikuj acego, na przyk lad, estru NHS PEG. Zmodyfikowane ludzkie przeciwcia la mog a by c tak ze otrzymane przez redukcj e wi aza n dwusiarczkowych (np. wewn atrz la ncuchowych wi aza n dwusiarcz- kowych) przeciwcia la lub fragmentu wiaz acego antygen. Zredukowane przeciwcia lo mo ze nast epnie ulec reakcji ze srodkiem modyfikuj acym reaguj acym z grupami tiolowymi w celu otrzymania opisanego tu zmodyfikowanego przeciwcia la. Zmodyfikowane ludzkie przeciwcia la zawieraj ace ugrupowanie organiczne, które jest przy laczone do specyficznych miejsc przeciwcia la wed lug niniejszego wynalaz- ku mog a by c otrzymane przy zastosowaniu odpowiednich sposobów, takich jak odwrotna proteoliza (Fisch i wsp., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen i wsp., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran i wsp., Protein Sci. 6 (10): 2233-2241 (1997); Itoh i wsp., Bioorg. Chem., 24 (1): 59-68 (1996); Capellas i wsp., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456-463 (1997)), i sposobów opisanych w Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996). Kompozycje bia lkowe przeciwcia l anty-idiotypowych przeciw przeciwcia lom anty-IL-12 Obok monoklonalnych lub chimerowych przeciwcia l anty-IL-12 niniejszy opis ujawnia równie z przeciwcia la anty-idiotypowe (anty-Id), swoiste wobec takich przeciwcia l wed lug wynalazku. Przeciw- cia lo anty-Id jest przeciwcialem, które rozpoznaje determinanty swoiste, z regu ly zwi azane z obszarem wiaz acym antygen, innego przeciwcia la. Anty-Id mo zna otrzyma c immunizuj ac zwierz e tego samego gatunku i typu genetycznego (np. szczep myszy) jako zród lo przeciwcia la Id, za pomoc a przeciwcia la lub CDR, zawieraj acego jego cz esc. Immunizowane zwierz e rozpozna i odpowie na determinanty idiotypowe przeciwcia la immunizuj acego, wytwarzaj ac przeciwcia lo anty-Id. Przeciwcia lo anty-Id mo z- na równie z zastosowa c jako „immunogen", aby wywo lac odpowied z immunologiczn a u jeszcze innego zwierz ecia, otrzymuj ac tak zwane przeciwcia lo anty-anty-Id. Kompozycje bia lkowe przeciwcia la anty-IL-12 Niniejszy wynalazek dostarcza równie z przynajmniej jedn a kompozycj e przeciwcia la anty-IL-12, zawieraj ac a przynajmniej jedno, przynajmniej dwa, przynajmniej trzy, przynajmniej cztery, przynajm-PL 205 786 B1 20 niej pi ec, przynajmniej sze sc, lub wi ecej przeciwcia l anty-IL-12 wed lug tego wynalazku, zgodnych z opisem tu zawartym i/lub znanych w dziedzinie, które dostarcza si e w kompozycji, mieszaninie lub formie, nie wyst epuj acej w przyrodzie. Kompozycje przeciwcia la anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mog a ponadto zawiera c od- powiedni a i skuteczn a ilosc przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. nieograniczaj aco przeciwcia la TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, ich bia lek fuzyjnych lub niskocz a- steczkowego antagonisty TNF), leku przeciwreumatycznego (np. metotreksat, auranofin, aurotiogluko- za, azatiopryna, etanercept, tiojab lczan sodowo-z lotawy, siarczan hydroksychlorochinu, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczaj acego mi esnie, narkotyku, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), leku przeciwbólowego, srodka znieczulaj acego, srodka uspokajaj acego, srodka znieczulaj a- cego miejscowo, blokera nerwowo-miesniowego, leku przeciwdrobnoustrojowego (np. aminoglikozy- du, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpaso zytniczego, leku przeciwwirusowego, karbapenemu, cefalosporyny, fluorochinoliny, makrolidu, penicyliny, sulfonamidu, tetracykliny, innego leku prze- ciwdronoustrojowego), leku przeciw luszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, czynnika zwi azanego z cukrzyc a, substancji mineralnej, substancji od zywczej, czynnika tarczycowego, witami- ny, hormonu zwi azanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, srodka przeciwkaszlowego, srodka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, srodka przeczyszczaj acego, srodka przeciwkrzepliwe- go, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, srodka immunosupresyjnego (np. basiliksimab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku hormonalnej terapii zast epczej, modulatora receptora estrogenu, srodka rozszerzaj acego zrenice, srodka cykloplegicznego, czynnika alkiluj acego, antymetabolitu, inhi- bitora mitozy, srodka radioleczniczego, leku przeciwdepresyjnego, czynnika przeciw manii, czynnika przeciw psychozie, czynnika przeciwl ekowego, leku nasennego, srodka sympatykomimetycznego, srodka pobudzaj acego, donepezilu, takrynu, leku na astm e, agonisty beta, sterydu wziewnego, inhibi- tora leukotrienu, metyloksantyny, kromolinu, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Nieograniczaj ace przyk lady takich cytokin obejmuja IL-1 do IL-23. Stosowne dawkowanie jest dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Wells i wsp., wyd., Pharmacothe- rapy Handbook, wydanie 2, Appleton i Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000). Takie srodki przeciwnowotworowe lub przeciwzaka zne mog a równie z zawiera c cz asteczki tok- syn, które towarzysz a, s a zwi azane, wchodz a w sk lad tej samej kompozycji lub s a jednocze snie po- dawane z przynajmniej jednym przeciwcia lem wed lug niniejszego wynalazku. Toksyna mo ze ewentu- alnie s lu zy c do zabijania patologicznych komórek lub tkanek. Komórk a patologiczn a mo ze by c komór- ka rakowa lub inna komórka. Takie toksyny mog a nieograniczaj aco obejmowa c oczyszczone lub re- kombinowane toksyny lub fragmenty toksyn, zawieraj ace przynajmniej jedn a funkcjonaln a domen e cytotoksyczn a toksyny, np. wybran a spo sród przynajmniej jednej z rycyny, toksyny b lonicy, toksyny jadowej lub toksyny bakteryjnej. Termin toksyna obejmuje równie z endotoksyny oraz egzotoksyny, wytwarzane przez wszelkie wyst epuj ace w przyrodzie, zmutowane lub zrekombinowane bakterie b ad z wirusy, które mog a wywo lywa c u cz lowieka i innych ssaków dowolny stan patologiczny, w tym wstrz as toksyczny, który mo ze zako nczy c si e smierci a. Takie toksyny mog a nieograniczaj aco obejmowa c ter- mowra zliw a enterotoksyn e z wytwarzaj acych enterotoksyn e E. coli (LT), niewra zliw a na ciep lo entero- toksyn e (ST), cytotoksyn e Shigella, enterotoksyny Aeromonas, toksyny-1 zespo lu wstrz asu toksycz- nego (TSST-1), enterotoksyny A (SEA), B (SEB) lub C (SEC) Staphylococcus, enterotoksyny Strepto- coccus i tym podobne. Takie bakterie nieograniczaj aco obejmuj a szczepy wytwarzaj ace enterotoksy- n e E. coli (ETEC), jelitowo-krwotoczne E. coli (np. szczepy serotypu 0157:H7), gatunki Staphylococ- cus (np. Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), gatunki Shigella (np. Shigella dysente- riae, Shigella flexneri, Slaigella boydii i Shigella sonnei), gatunki Salmonella (np. Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis, Salmonella enteritidis), gatunki Clostridium (np. Clostridium perfringens, Clo- stridium dificile, Clostridiuna botulinum), gatunki Camphlobacter (np. Camphlobacter jejuni, Camphlo- bacter fetus), gatunki Heliobacter (np. Heliobacter pylori), gatunki Aeromonas (np. Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, gatunki Vibrios (np. Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), gatunki Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa oraz Streptococci. Zobacz np. Stein, wyd., INTERNAL MEDICINE, wyd. 3, str. 1-13, Little, Brown i Co., Boston, (1990); Evans i wsp., wyd., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, wyd. 2, str. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell i wsp., Principles and Prac- tice of Infectious Diseases, wyd. 3., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow i wsp., wyd.,PL 205 786 B1 21 The Merck Manual, wydanie 16, Merck and Co., Rahway, N. J., 1992; Wood i wsp., FEMS Microbiol- ogy Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack i wsp., Science, 248: 705-711 (1990). Zwi azki, kompozycje i kombinacje przeciwcia l anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mog a ponadto zawiera c przynajmniej jedn a spo sród wszelkich stosownych substancji pomocniczych, takich jak rozcienczalniki, substancje wiaz ace, stabilizatory, bufory, sole, rozpuszczalniki lipofilowe, konser- wanty, adiuwanty i tym podobne. Zalecane s a substancje pomocnicze farmaceutycznie akceptowalne. Nieograniczaj ace przyk lady i sposoby przygotowania takich roztworów sterylnych s a dobrze znane w dziedzinie, takie jak nieograniczaj aco opisane w Gennaro, wyd., Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Mo zna rutynowo dobra c akceptowalne farmaceutycznie no sniki, które s a stosowne do trybu podawania, rozpuszczalno sci i/lub trwa lo sci kompozycji przeciwcia la anty-IL-12, fragmentu lub wariantu, które s a dobrze znane w dziedzinie lub które tu opisano. Farmaceutyczne zaróbki i dodatki przydatne w niniejszej kompozycji nieograniczaj aco obejmuj a bia lka, peptydy, aminokwasy, lipidy i w eglowodany (np. cukry, w tym monosacharydy, di-, tri-, tetra- i oligosacharydy, pochodne cukrów takie jak alditole, kwasy aldonowe, cukry zestryfikowane i tym podobne oraz polisacharydy lub polimery cukrów), które mog a by c obecne pojedynczo lub w kombi- nacji, stanowi ac samodzielnie lub w kombinacji 1-99,99% wagowych lub obj eto sciowych. Do przyk la- dowych zaróbek bia lkowych nale za albumina osocza, taka jak ludzka albumina osocza (HSA), rekom- binowana albumina ludzka (rHA), zelatyna, kazeina i tym podobne. Reprezentatywne aminokwa- sy/sk ladniki przeciwcia l, które mog a równie z dzia la c jako bufory, obejmuj a alanin e, glicyn e, arginin e, betain e, histydyn e, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, cystein e, lizyn e, leucyn e, izoleucyn e, wa- lin e, metionin e, fenyloalanin e, aspartam, i tym podobne. Jednym z zalecanych aminokwasów jest glicyna. Zaróbki w eglowodanowe, odpowiednie do zastosowania w tym wynalazku obejmuj a na przyk lad monosacharydy, takie jak fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-mannoza, sorboza i tym podobne; disacharydy, takie jak laktoza, sacharoza, trehaloza, celobioza i tym podobne, polisacharydy, takie jak rafinoza, melezytoza, maltodekstryny, dekstrany, skrobie i tym podobne oraz alditole, takie jak manni- tol, ksylitol, maltitol, laktitol, ksylitol, sorbitol (glucytol), mioinozytol i tym podobne. Zaróbkami w eglo- wodanowymi, których zastosowanie w niniejszym wynalazku jest zalecane, s a mannitol, trehaloza i rafinoza. Kompozycje przeciwcia la anty-IL-12 mog a równie z zawiera c bufor lub czynnik ustalaj acy pH, zazwyczaj bufor jest sol a utworzon a z kwasu lub zasady organicznej. Do reprezentatywnych buforów nale za sole kwasów organicznych, takie jak sole kwasu cytrynowego, kwasu askorbinowego, kwasu glukonowego, kwasu w eglowego, kwasu winowego, kwasu bursztynowego, kwasu octowego lub kwa- su ftalowego; Tris, chlorowodorek trometaminy lub bufory fosforanowe. Buforami, których zastosowa- nie jest zalecane w niniejszym wynalazku, s a sole kwasów organicznych, takie jak cytrynian. Dodatkowo kompozycje przeciwcia la anty-IL-12 wed lug wynalazku mog a zawiera c zarób- ki/dodatki polimeryczne, takie jak poliwinylopirolidony, fikole (cukier polimeryczny), dekstrany (np. cyklodekstryny, takie jak 2-hydroksypropylo-(3-cyklodekstryna), glikole polietylenowe, czynniki sma- kowe, czynniki przeciwbakteryjne, substancje s lodz ace, przeciwutleniacze, czynniki antystatyczne, czynniki powierzchniowo czynne (np. polisorbaty, takie jak „TWEEN 20" i „TWEEN 80"), lipidy (np. fosfolipidy, kwasy t luszczowe), sterydy (np. cholesterol), i czynniki chelatuj ace (np. EDTA). Te i dodatkowe znane zaróbki i/lub dodatki farmaceutyczne, odpowiednie do zastosowania w kompozycjach przeciwcia l anty-IL-12 wed lug wynalazku s a znane w dziedzinie, np. wymieniane w „Remington: The Science & Practice of Pharmacy", wyd. 19, Williams & Williams, (1995), i w „Phy- sician's Desk Reference", wyd. 52, Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Zalecanymi materia lami no sników lub zaróbek s a w eglowodany (np. sacharydy i alditole) i bufory (np. cytrynian) lub czynniki polimerowe. Kompozycje Jak zaznaczono powy zej niniejszy wynalazek dostarcza trwa lych kompozycji, to znaczy w szczególno sci z buforem fosforanowym z sol a fizjologiczn a lub wybran a sol a, a tak ze konserwowa- nych roztworów i kompozycji zawieraj acych konserwant oraz konserwowanych kompozycji do wielo- krotnego u zytku, odpowiednich do zastosowania farmaceutycznego lub weterynaryjnego, zawieraj a- cych przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 w kompozycji akceptowalnej farmaceutycznie. Kom- pozycje konserwowane zawieraj a przynajmniej jeden konserwant znany lub ewentualnie wybrany z grupy, zawieraj acej przynajmniej jeden spo sród fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezo-PL 205 786 B1 22 lu, alkoholu benzylowego, azotynu fenylort eciowego, fenoksyetanolu, formaldehydu, chlorobutanolu, chlorku magnezu (np. heksahydratu), alkiloparabenu (metyl, etyl, propyl, butyl i podobne), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, dehydrooctanu sodowego i timerosalu, lub ich mieszanin w rozcie nczalniku wodnym. Mo zna u zy c wszelkich stosownych steze n znanych w tej dziedzinie, takich jak 0,001-5%, lub dowolnego zakresu lub warto sci z tego zakresu, takich jak, mi edzy innymi 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, lub dowolne zakresy lub warto sci z tego zakresu. Nieograniczaj ace przyk lady obejmuj a brak konserwantu, 0,1-2% m-krezolu (np. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% alkoholu benzylowego (np. 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% timerosalu (np. 0,005, 0,01), 0,001-2,0% fenolu (np. 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% alkiloparabe- nu(ów) (np. 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) i tym podobnie. Jak opisano powy zej zgodnie z wynalazkiem opisano produkt obejmuj acy opakowanie i przy- najmniej jedn a fiolk e zawieraj ac a roztwór przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 z przepisanymi buforami i/lub konserwantami, ewentualnie w rozcie nczalniku wodnym, przy czym to opakowanie za- wiera etykiet e, która wskazuje, ze ten roztwór mo ze by c przechowywany przez okres 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 godzin lub d lu zej. Zgodnie z wynalazkiem opisano ponad- to produkt obejmuj acy opakowanie, pierwsz a fiolk e zawieraj ac a zliofilizowane przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 i drug a fiolk e zawieraj ac a rozcie nczalnik wodny przepisanego buforu lub kon- serwantu, przy czym to opakowanie zawiera etykiet e, która instruuje pacjenta by rozpu scil przynajm- niej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 w rozcie nczalniku wodnym, by utworzy c roztwór, który mo ze by c przechowywany przez okres dwudziestu czterech godzin lub d lu zej. To przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12, stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, mo ze zosta c wyprodukowane srodkami rekombinacji, w laczaj ac w to preparaty transgeniczne i ko- mórki ssacze, lub mo ze zosta c oczyszczone z innych zróde l biologicznych, jak opisano tutaj lub w sposób znany w dziedzinie. Zakres przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 w produkcie tu opisanym obejmuje ilo sci, które daj a po rozpuszczeniu, w uk ladzie substancja sucha/roztwór, st ezenia od oko lo 1,0 µg/ml do oko lo 1000 mg/ml, cho c mo zna zastosowa c ni zsze i wy zsze stezenia, zale znie od zamierzonego no- snika podawania, np. kompozycje roztworów b ed a si e ró zni c od plastra przezskórnego i sposobów dostarczania op lucnego, przez sluzówkowych lub osmotycznych, albo z u zyciem mikropomp. Zalecane jest by rozcie nczalnik wodny zawiera l ponadto ewentualnie dopuszczalny farmaceu- tycznie konserwant. Do zalecanych konserwantów nale za takie, które wybiera si e z grupy sk ladaj acej sie z fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, alkiloparabenu (metylo, etylo, propylo, butylo i podobnych), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, de- hydrooctanu sodowego i timerosalu lub ich mieszanin. Stezenie konserwantu zastosowanego w kom- pozycji jest st ezeniem wystarczaj acym do uzyskania efektu przeciwdrobnoustrojowego. Takie st ezenia zale za od wybranego konserwantu i mo ze je latwo ustali c wyszkolony wykonawca. Do rozcie nczalnika ewentualnie i dogodnie mo zna doda c inne zaróbki, np. czynniki izotoniczne, bufory, przeciwutleniacze, wzmacniacze konserwantów. Powszechnie stosuje si e czynnik izotoniczny, taki jak gliceryna, w znanych stezeniach. Zalecany jest dodatek tolerowanego fizjologicznie buforu w celu poprawy kontroli pH. Kompozycje mog a mie c szeroki zakres pH, taki jak od oko lo pH 4 do oko- lo pH 10, w przypadku zalecanym zakres od oko lo pH 5 do oko lo pH 9, a w najbardziej zalecanym przypadku zakres od oko lo 6,0 do oko lo 8,0. Zalecane pH kompozycji wed lug niniejszego wynalazku wynosi od oko lo 6,8 do oko lo 7,8. Do zalecanych buforów nale za bufory fosforanowe, najbardziej za- lecany jest fosforan sodu, a w szczególno sci buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS). Ewentualnie, w celu obni zenia agregacji, mo zna doda c do kompozycji inne substancje dodat- kowe, takie jak akceptowalne farmaceutycznie susbtancje u latwiaj ace rozpuszczanie, w rodzaju Twe- en 20 (monolaurynian polioksyetyleno(20)sorbitanu), Tween 40 (monopalmitynian polioksyetyle- no(20)sorbitanu), Tween 80 (monooleinian polioksyetyleno(20)sorbitanu), Pluronic F68 (kopolimery blokowe polioksyetylenu i polioksypropylenu) i PEG (glikol polietylenowy) lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne, takie jak polisorbinian 20 lub 80 lub poloksamer 184 lub 188, polile Pluro- nic®, inne kopolimery blokowe i chelatory, takie jak EDTA i EGTA. Te substancje dodatkowe s a szczególnie przydatne, gdy do podawania kompozycji jest stosowana pompa lub pojemnik plastikowy.PL 205 786 B1 23 Obecno sc substancji powierzchniowo czynnej akceptowalnej farmaceutycznie os labia sk lonno sc bia l- ka do agregacji. Kompozycje wed lug niniejszego wynalazku mo zna wytworzy c w procesie, który obejmuje mie- szanie przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 i konserwantu, wybranego z grupy, sk ladaj acej sie z fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, alkiloparabenu (metyl, etyl, propyl, butyl i podobne), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, dehydro- octanu sodowego i timerosalu, lub ich mieszanin w rozcie nczalniku wodnym. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 i konserwantu w rozcie nczalniku wodnym przeprowadza si e stosuj ac konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzyma c odpowiedni a kompozycj e, laczy sie na przyk lad odmierzon a ilosc przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 w zbuforowanym roz- tworze z po zadanym konserwantem w zbuforowanym roztworze w ilo sciach wystarczaj acych dla do- starczenia bia lka i konserwantu w po zadanych stezeniach. Modyfikacje tego procesu b ed a jasne dla osób o zwyk lej znajomo sci dziedziny. Na przyk lad kolejno sc, w jakiej dodawane s a sk ladniki, czy sto- suje si e dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH, w jakich wykonuje si e kompozycj e, s a czyn- nikami, które mo zna zoptymalizowa c dla stosowanego stezenia i srodków podawania. Kompozycje mo zna dostarcza c pacjentom jako czyste roztwory lub jako pary fiolek, w sk lad któ- rych wchodzi fiolka zawieraj aca zliofilizowane przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12, które roz- puszcza si e za pomoc a drugiej fiolki zawieraj acej wod e, konserwant i/lub zaróbki, w przypadku zale- canym jest to bufor fosforanowy i/lub sól fizjologiczna oraz wybrana sól, w rozcie nczalniku wodnym. Zarówno fiolka z pojedynczym roztworem, jaki i para fiolek, wymagaj aca rozpuszczania, mo ze by c u zywana wielokrotnie i mo ze wystarczy c na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, daj ac tym samym schemat leczniczy dogodniejszy od dost epnego obecnie. Opisane tu produkty nadaj a si e do podawania w okresie od natychmiast do dwudziestu czte- rech godzin lub d lu zej. Zgodnie z tym, opisane tu produkty daj a pacjentowi znacz ace korzy sci. Kom- pozycje wed lug wynalazku mo zna ewentualnie bezpiecznie przechowywa c w temperaturach od oko lo 2 do oko lo 40 °C, zachowuj ac aktywnosc biologiczn a bia lka przez d luzszy okres czasu, co pozwala na podanie na etykiecie opakowania, ze roztwór mo zna stosowa c i/lub przechowywa c przez okres 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 lub 96 godzin albo d luzej. Je sli stosuje sie rozcie nczalnik z konserwantem, to taka etykieta mo ze informowa c o mo zliwo sci stosowania do 1-12 miesi ecy, pó l, pó ltora i/lub dwóch lat. Roztwory przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 wedlug wynalazku mo zna wytworzy c w procesie, który obejmuje mieszanie przynajmniej jednego przeciwcia la z rozcie nczalnikiem wodnym. Mieszanie przeprowadza si e stosuj ac konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzyma c odpowiedni rozcie nczalnik, laczy si e na przyk lad odmierzon a ilo sc przynajmniej jednego przeciwcia la w wodzie lub buforze w ilo sciach wystarczaj acych dla dostarczenia bia lka i ewentualnie konserwantu lub buforu w pozadanych stezeniach. Modyfikacje tego procesu b ed a jasne dla osób o zwyk lej znajomo sci dziedziny. Na przyk lad kolejno sc, w jakiej dodawane s a sk ladniki, czy stosuje si e dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH w jakich wykonuje si e kompozycj e, s a czynnikami, które mo zna zoptymalizowa c dla stosowanego stezenia i srodków podawania. Opisane tu produkty mo zna dostarcza c pacjentom jako czyste roztwory lub jako pary fiolek, w sk lad których wchodzi fiolka ze zliofilizowanym przynajmniej jednym przeciwcia lem anty-IL-12, które rozpuszcza si e za pomoc a drugiej fiolki zawieraj acej rozcie nczalnik wodny. Zarówno fiolka z pojedyn- czym roztworem, jak i para fiolek wymagaj aca rozpuszczania, mog a by c u zywane wielokrotnie i mog a wystarczy c na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, daj ac tym samym schemat leczniczy do- godniejszy od dost epnego obecnie. Opisane tu produkty mo zna dostarcza c pacjentom po srednio, przez dostarczenie do aptek, kli- nik lub innych instytucji i zak ladów czystych roztworów lub par fiolek, w sk lad których wchodzi fiolka ze zliofilizowanym przynajmniej jednym przeciwcia lem anty-IL-12, które rozpuszcza si e za pomoc a dru- giej fiolki zawieraj acej rozcie nczalnik wodny. Czysty roztwór w tym przypadku mo ze mie c obj etosc jednego litra lub nawet wi eksz a, w postaci du zego zbiornika, z którego mo zna jednokrotnie lub wielo- krotnie pozyskiwa c mniejsze porcje roztworu przynajmniej jednego przeciwcia la, dla przeniesienia do mniejszych fiolek i dostarczenia przez aptek e b ad z klinik e klientom i/lub pacjentom. Do uznanych urz adze n, zawieraj acych te systemy z jedn a fiolk a, naleza urz adzenia do wstrzyk- ni ec, dostarczaj ace roztwory, takie jak BD Pen, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, i OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, np. takie jak wykonane lub udoskonalone przez Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetro-PL 205 786 B1 24 nic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Do uznanych urz adze n, zawieraj acych systemy z par a fiolek nale za te urz adzenia do wstrzykniec, które rozpuszczaj a zliofilizowany lek w kasecie, dostarczaj ac otrzymany roztwór, takie jak HumatroPen®. Opisane tu produkty zawieraj a opakowanie. Opakowanie dostarcza, w uzupe lnieniu do informa- cji wymaganych przez w ladze administracyjne, warunki, w jakich mo zna zastosowa c produkt. Opako- wanie tego rodzaju dostarcza instrukcji dla pacjenta, ze nale zy rozpu sci c przynajmniej jedno przeciw- cia lo anty-IL-12 w rozcie nczalniku wodnym, by uzyska c roztwór i zastosowa c roztwór w okresie 2-24 godzin lub d lu zszym dla produktu z dwiema fiolkami, w przypadku uk ladu substancja su- cha/roztwór. Dla produktu z jedn a fiolk a i roztworem etykieta wskazuje, ze taki roztwór mo zna zasto- sowa c w okresie 2-24 godzin lub d lu zszym. Opisane tu produkty mo zna stosowa c zgodnie z za- stosowaniami dla produktów farmaceutycznych dla ludzi. Kompozycje wed lug niniejszego wynalazku mo zna wytworzy c w procesie, który obejmuje mie- szanie przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 i wybranego buforu, zw laszcza buforu fosforano- wego, zawieraj acego sól fizjologiczn a lub wybran a sól. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwcia la i buforu przeprowadza si e stosuj ac konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzy- ma c odpowiedni a kompozycj e laczy si e na przyk lad odmierzon a ilosc przynajmniej jednego przeciw- cia la w wodzie lub buforze z po zadanym czynnikiem buforuj acym w wodzie w ilo sciach wystarczaj a- cych dla dostarczenia bia lka i buforu w pozadanych st ezeniach. Modyfikacje tego procesu b ed a jasne dla specjalistów w tej dziedzinie. Na przyk lad kolejno sc, w jakiej dodawane s a sk ladniki, czy stosuje sie dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH w jakich wykonuje si e kompozycj e, s a czynnikami, które mo zna zoptymalizowa c dla stosowanego stezenia i srodków podawania. Opisane tu trwa le lub konserwowane kompozycje mo zna dostarcza c pacjentom jako czyste roz- twory lub jako pary fiolek, w sk lad których wchodzi fiolka ze zliofilizowanym przynajmniej jednym prze- ciwcia lem anty-IL-12, które rozpuszcza si e za pomoc a drugiej fiolki zawieraj acej konserwant lub bufor i zaróbki w rozcie nczalniku wodnym. Zarówno fiolka z pojedynczym roztworem, jaki i para fiolek, wy- magaj aca rozpuszczania, mog a by c u zywane wielokrotnie i mog a wystarczy c na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, daj ac tym samym schemat leczniczy dogodniejszy od dost epnego obecnie. Przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12, zarówno w opisanych tu kompozycjach trwa lych, jak i konserwowanych, mo zna podawa c pacjentowi w zgodzie z niniejszym wynalazkiem za pomoc a szeregu sposobów dostarczania, w laczaj ac w to wstrzykni ecia podskórne lub domiesniowe, sposoby przezskórne, dop lucne, przez sluzówkowe, za pomoc a implantu, pompy osmotycznej, kasety, mikro- pompy i innych srodków, znanych wykszta lconemu wykonawcy, co jest dobrze znane w dziedzinie. Zastosowania terapeutyczne Przeciwcia lo lub kompozycja farmaceutyczna wed lug wynalazku mog a by c przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby zwi azanej z odporno sci a w komórce, tkance, narz adzie, zwierz eciu lub u pacjenta, nieograniczaj aco w laczaj ac w to przynajmniej jedn a spo sród goscca przewlek lego post epuj acego, m lodzie nczego reumatoidalnego zapalenia stawów, ogólnoustro- jowego m lodzie nczego reumatoidalnego zapalenia stawów, artropatii luszczycowej, zesztywniaj acego zapalenia stawów kr egos lupa, wrzodów zoladka, artropatii surowiczo-ujemnych, zapalenia ko sci i stawów, choroby zapalnej jelit, wrzodziej acego zapalenia okreznicy, liszaja rumieniowatego uogól- nionego, zespo lu antyfosfolipidowego, zapalenia t eczówki i cia la rz eskowego/zapalenia b lony naczy- niowej oka/zapalenia nerwu wzrokowego, samoistnego zw lóknienia p luc, ogólnoustrojowego zapale- nia naczy n/ziarniniaka Wegenera, sarkoidozy, zapalenia j ader, procedur odwracaj acych wazektomi e, chorób alergicznych/atopowych, astmy, alergicznego nie zytu nosa, egzemy, alergicznego kontakto- wego zapalenia skóry, alergicznego zapalenia spojówek, zapalenia p luc z nadwra zliwo sci, przeszcze- pów, odrzucenia przeszczepu narz adu, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, zespo lu ogólno- ustrojowej reakcji zapalnej, zespo lu posocznicy, posocznicy gram-dodatniej, posocznicy gram- -ujemnej, posocznicy z nieobecno scia kultur, posocznicy grzybicowej, gor aczki neutropenicznej, po- socznicy moczopochodnej, infekcji meningokokowej, urazu/krwotoku, oparze n, ekspozycji na promie- niowanie jonizuj ace, ostrego zapalenia trzustki, zespo lu zaburze n oddechowych doros lych, goscca przewlek lego post epuj acego, alkoholowego zapalenia w atroby, przewlek lych stanów zapalnych, sar- koidozy, choroby Crohna, anemii sierpowatej, cukrzycy, nerczycy, chorób atopowych, reakcji nadwra z- liwo sci, alergicznego nie zytu nosa, kataru siennego, ca lorocznego nie zytu nosa, zapalenia spojówek, endometriozy, astmy, pokrzywki, anafilaksji ogólnoustrojowej, zapalenia skóry, niedokrwisto sci z lo sli-PL 205 786 B1 25 wej, choroby hemolitycznej, trombocytopenii, odrzucenia przeszczepu dowolnego organu lub tkanki, odrzucenia przeszczepu nerki, odrzucenia przeszczepu serca, odrzucenia przeszczepu w atroby, od- rzucenia przeszczepu trzustki, odrzucenia przeszczepu p luca, odrzucenia przeszczepu szpiku kost- nego (BMT), odrzucenia aloprzeszczepu skóry, odrzucenia przeszczepu tkanki chrzestnej, odrzucenia przeszczepu ko sci, odrzucenia przeszczepu jelita cienkiego, odrzucenia przeszczepu grasicy p lodo- wej, odrzucenia przeszczepu przytarczyc, odrzucenia przeszczepu mi edzygatunkowego dowolnego organu lub tkanki, odrzucenia aloprzeszczepu, antyreceptorowych reakcji nadwra zliwo sci, choroby Gravesa, choroby Raynouda, cukrzycy insulinoopornej typu B, astmy, zaniku mi esni, cytotoksyczno sci zale znej od przeciwcia l, reakcji nadwra zliwo sci typu III, uogólnionego liszaja rumieniowatego, zespo lu POEMS (zespo lu polineuropatii, organomegalii, endokrynopatii, gammopatii monoklonalnej i zmian skórnych) polineuropatii, organomegalii, endokrynopatii, gammopatii monoklonalnej, zespo lu zmian skórnych, zespo lu antyfosfolipidowego, p echerzycy, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki lacz- nej, idiopatycznej choroby Addisona, cukrzycy, przewlek lego aktywnego zapalenia w atroby, zó lciowej pierwotnej marsko sci w atroby, bielactwa nabytego, zapalenia naczy n, zespo lu otwarcia serca pozawa- lowego, reakcji nadwra zliwo sci typu IV, kontaktowego zapalenia skóry, zapalenia p luc z nadwra zliwo- sci, odrzucenia aloprzeszczepu, ziarniniaków wywo lanych przez organizmy wewn atrzkomórkowe, wra zliwo sci na leki, metabolicznej/idiopatycznej, choroby Wilsona, hemochromatozy, niedoboru alfa-1- -antytrypsyny, retinopatii cukrzycowej, zapalenia tarczycy Hashimoto, osteoporozy, oceny osi pod- wzgórze-przysadka-nadnercza, marsko sci w atroby zó lciowej pierwotnej, zapalenia tarczycy, zapalenia mózgu i rdzenia, kacheksji, mukowiscydozy, przewlek lej choroby p luc noworodków, przewlek lej obtu- racyjnej choroby p luc (COPD), rodzinnej limfohistiocytozy hematofagocytycznej, stanów dermatolo- gicznych, luszczycy, lysienia, zespo lu nerczycowego, zapalenia nerki, k lebuszkowego zapalenia nerki, ostrej niewydolno sci nerki, hemodializy, mocznicy, zatrucia, stanu przedrzucawkowego, terapii okt3, terapii anty-cd3, terapii cytokinowej, chemioterapii, radioterapii (np. nieograniczaj aco astenii, niedo- krwisto sci, kacheksji i tm podobnych), przewlek lego zatrucia salicylanami i tym podobnych. Zobacz np. Merck Manual, wydania 12-17, Merck & Company, Rahway, NJ (1972,1977,1982,1987,1992,1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells i wsp., wyd., Wydanie Drugie, Appleton i Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000). Przeciwcia lo lub kompozycja farmaceutyczna wed lug wynalazku mog a by c przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby sercowo-naczyniowej w komórce, tkance, na- rz adzie, zwierz eciu lub u pacjenta. Przeciwcia lo lub kompozycja farmaceutyczna wed lug wynalazku mog a by c podawane przed, jednocze snie z lub po podawaniu przynajmniej jednego srodka wybranego spo sród przynajmniej jed- nego antagonisty TNF (np. nieograniczaj aco przeciwcia lo TNF lub jego fragment, rozpuszczalny re- ceptor TNF lub jego fragment, ich bia lka fuzyjne lub niskocz asteczkowy antagonista TNF), leku prze- ciwreumatycznego (np. metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, tiojab lczan sodowo-z lotawy, siarczan hydroksychlorochinu, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczaj acego mi e- snie, narkotyku, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), przeciwbólowego, srodka znieczula- jacego, srodka uspokajaj acego, srodka znieczulaj acego miejscowo, blokera nerwowo-miesniowego, leku przeciwbakteryjnego (np. aminoglikozydu, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpaso zytniczego, leku przeciwwirusowego, karbapenemu, cefalosporyny, fluorochinoliny, makrolidu, penicyliny, sulfo- namidu, tetracykliny, innego leku przeciwbakteryjnego), leku przeciwluszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, czynnika zwi azanego z cukrzyc a, substancji mineralnej, substancji od zywczej, czynnika tarczycowego, witaminy, hormonu zwi azanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, srod- ka przeciwkaszlowego, srodka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, srodka przeczyszczaj a- cego, srodka przeciwkrzepliwego, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupo- gen), sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, srodka immunosupresyjnego (np. basiliksimab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku hormonalnej terapii zast epczej, modulatora receptora estrogenu, srodka rozszerzaj acego zrenice, srodka cykloplegicznego, czynnika alkiluj acego, antymetabolitu, inhibitora mitozy, srodka radioleczniczego, leku przeciwdepresyjnego, czynnika przeciw manii, czynnika przeciw psychozie, czynnika przeciwl ekowego, leku nasennego, srodka sympatykomimetycznego, srodka pobudzaj acego, donepezilu, takrynu, leku na astm e, agoni- sty beta, sterydu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromolinu, epinefryny lub jej ana- logu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Nieograniczaj ace przyk lady takich cytokin obejmuj a nieograniczaj aco IL-1 do IL-23. Stosowne dawkowanie jest dobrze znane w dziedzi- nie. Zobacz np. Wells i wsp., wyd., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton i Lange, Stam-PL 205 786 B1 26 ford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tara- scon Publishing, Loma Linda, CA (2000). Antagoni sci TNF odpowiedni w niniejszym wynalazku obejmuj a, mi edzy innymi, przeciwcia la anty-TNF, ich fragmenty wi azace antygen i cz asteczki receptorów, które wiaz a si e swoi scie do TNF; zwi azki, które zapobiegaj a i/lub hamuj a syntez e TNF, wydzielanie TNF lub jego dzia lanie na komórki docelowe, takie jak talidomid, tenidap, inhibitory fosfodiesterazy (np. pentoksyfilina i rolipram), agoni- sci receptorów adenozynowych A2b i zwi azki pobudzaj ace receptory adenozynowe A2b, zwi azki które zapobiegaj a i/lub hamuj a przekazywanie sygna lu przez receptor TNF, takie jak inhibitory kinazy bia l- kowej, aktywowanej przez mitogeny (MAP); zwi azki które blokuj a i/lub hamuj a ci ecie TNF w b lonie, takie jak inhibitory metaloproteaz, zwi azki które blokuj a i/lub hamuj a aktywnosc TNF, takie jak inhibito- ry enzymu konwertuj acego angiotensyn e (ACE) (np. kaptopryl) oraz zwi azki które blokuj a i/lub hamuj a wytwarzanie i/lub syntez e TNF, takie jak inhibitory kinazy MAP. Zgodnie z zastosowaniem tutaj „przeciwcia lo dla czynnika martwicy nowotworów", „przeciwcia lo TNF", „przeciwcia lo TNF", lub jego fragment i tym podobne, obni za, blokuje, hamuje, znosi lub zak lóca aktywnosc TNF in vitro, in situ i/lub, zw laszcza, in vivo. Na przyk lad odpowiednie ludzkie przeciwcia lo TNF tu opisane mo ze wi aza c TNF a, i obejmuje przeciwcia la anty-TNF, ich fragmenty wiaz ace antygen i ich okre slone mutanty lub domeny, które wi aza si e swoi scie do TNF a. Odpowiednie przeciwcia lo TNF a lub fragment mo ze równie z obni za c, blokowa c, hamowa c, znosi c lub zak lóca c syntez e RNA, DNA lub bia lka TNF, wydzielanie TNF, przekazywanie sygna lu TNF, ci ecie TNF w b lonie, aktywnosc TNF, wytwarzanie i/lub syntez e TNF. Przeciwcia lo chimerowe cA2 sk lada si e z wi azacego antygen obszaru zmiennego neutralizuj a- cego mysiego przeciwcia la IgG1 anty-TNF a cz lowieka o wysokim powinowactwie, oznaczonego A2 oraz obszary sta le immunoglobuliny cz lowieka IgG1, kappa. Obszar Fc IgG1 cz lowieka poprawia allo- geniczn a funkcj e efektorow a przeciwcia la, wyd lu za okres pó ltrwania w osoczu krwi i obni za immuno- gennosc przeciwcia la. Aktywno sc i swoistosc epitopu dla przeciwcia la chimerowego cA2 pochodz a od obszaru zmiennego przeciwcia la A2 myszy. W szczególnym wykonaniu zalecanym zród lem kwasów nukleinowych koduj acych obszar zmienny przeciwcia la A2 myszy jest linia komórek hybrydomy A2. Chimerowe A2 (cA2) neutralizuje efekt cytotoksyczny ludzkiego TNF a, zarówno naturalnego, jak i rekombinowanego, w sposób zale zny od dawki. Na podstawie testów wi azania przeciwcia la chi- merowego cA2 i rekombinowanego ludzkiego TNF a obliczono stala powinowactwa przeciwcia la chi- merowego cA2 jako 1,04 x 10 -10 M -1 . Zalecane sposoby wyznaczania swoisto sci i powinowactwa prze- ciwcia l monoklonalnych za pomoc a hamowania kompetycyjnego mo zna znale zc w Harlow, i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. i Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozbor i wsp., Immunol. Today, 4: 72-79 (1983); Ausubel i wsp., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000) oraz Muller, Meth. Enzymol., 92: 589-601 (1983). W konkretnym wykonaniu mysie przeciwcia lo monoklonalne A2 jest wytwarzane przez lini e ko- mórkow a, oznaczon a c134A. Przeciwcia lo chimerowe cA2 jest wytwarzane przez lini e komórkow a, oznaczon a c168A. Dodatkowe przyk lady przeciwcia l monoklonalnych anty-TNF, które mo zna zastosowa c w niniej- szym wynalazku opisano w dziedzinie (zobacz np. patent USA nr 5231024; Moller, A. i wsp., Cytokine 2(3): 162-169 (1990); zg loszenie USA nr 07/943852 (z lo zone 11 wrze snia 1992); Rathjen i wsp., Pu- blikacja Mi edzynarodowa nr WO 91/02078 (opublikowana 21 lutego 1991); Rubin i wsp., Publikacja Patentowa EPO nr 0218868 (opublikowana 22 kwietnia 1987); Yone i wsp. Publikacja Patentowa EPO nr 0288088 (26 pa zdziernika, 1988); Liang i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager i wsp., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly i wsp. Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman i wsp., Hybridoma 6: 489-507 (1987) oraz Hirai i wsp., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987). Cz asteczki receptorów TNF Zalecanymi cz asteczkami receptora TNF, które mog a by c u zyteczne w niniejszym wynalazku s a takie, które wi az a TNF z wysokim powinowactwem (zobacz, np. Feldmann i wsp., mi edzynarodowa publikacja nr WO 92/07076 (opublikowana 30 kwietnia 1992); Schall i wsp., Cell 61: 361-370 (1990) oraz Loetscher i wsp., Cell 61: 351-359 (1990) i ewentualnie posiadaj a nisk a immunogenno sc. W ni- niejszym wynalazku s a u zyteczne w szczególno sci receptory TNF z powierzchni komórki. Skrócone postaci tych receptorów, zawieraj ace domeny pozakomórkowe (ECD) lub ich funkcjonalne cz esci (zo- bacz np. Corcoran i wsp., Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)) mog a by c równie z u zyteczne w ni-PL 205 786 B1 27 niejszym wynalazku. Skrócone postaci receptorów TNF zawieraj ace ECD, wykrywane w moczu i oso- czu krwi jako hamuj ace bia lka wiaz ace TNF a o masach 30 kDa i 40 kDa (Engelmann, H. i wsp., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)), multimerowe bia lka receptorowe i cz asteczki fuzyjne immuno- receptorów TNF, ich pochodne i fragmenty lub cz esci, s a dodatkowymi przyk ladami cz asteczek recep- torowych TNF, które mog a by c przydatne w niniejszym wynalazku. Cz asteczki receptorowe TNF, które mo zna zastosowa c w wynalazku mog a by c stosowane w leczeniu pacjentów przez d lu zsze okresy czasu, z dobrym lub doskona lym z lagodzeniem objawów i nisk a toksyczno scia. W osi aganych wyni- kach terapeutycznych mog a mie c udzia l niska immunogenno sc i/lub wysokie powinowactwo, a tak ze inne, niezdefiniowane w lasciwo sci. Multimerowe cz asteczki receptorów TNF, przydatne w niniejszym wynalazku, sk ladaj a si e z ca- losci lub cz esci funkcjonalnej ECD dwóch lub wi ekszej ilo sci receptorów TNF, po laczonych za pomoc a jednego lub wi ekszej ilo sci laczników polipeptydowych lub innych laczników niepeptydowych, takich jak glikol polietylenowy (PEG). Cz asteczki multimerowe mog a ponadto zawiera c peptyd sygna lowy bia lka wydzielanego, aby kierowa c ekspresj a cz asteczki multimerowej. Te cz asteczki multimerowe i sposoby ich wytwarzania opisano w zg loszeniu USA nr 08/437533 (z lo zonym 9 maja 1995). Cz asteczki fuzyjne immunoreceptorów TNF, które mog a by c u zyteczne w niniejszym wynalazku zawieraj a przynajmniej jedn a cz esc jednego lub wi ekszej liczby cz asteczek immunoglobulin oraz ca- losc lub cz esc funkcjonaln a jednego lub wi ekszej liczby receptorów TNF. Te cz asteczki fuzyjne immu- noreceptorów mog a laczy c si e jako monomery lub hetero- lub homomultimery. Cz asteczki fuzyjne immunoreceptorów TNF mog a by c równie z monowalentne lub multiwalentne. Przyk ladem takiej cz a- steczki fuzyjnej immunoreceptora TNF jest bia lko fuzyjne receptor TNF/IgG. Cz asteczki fuzyjne immu- noreceptorów TNF i sposoby ich wytwarzania opisano w tej dziedzinie (Lesslauer i wsp., Eur. J. Im- munol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel i wsp., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994); Butler i wsp., Cytokine 6 (6): 616-623 (1994); Baker i wsp., Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler i wsp., patent USA nr 5447851 i zg loszenie USA nr 08/442133 (z lo zone 16 maja 1995). Sposoby wytwarzania cz asteczek fuzyjnych immunoreceptorów mo zna równie z znalezc w Capon i wsp., patent USA nr 5116964; Capon i wsp., patent USA nr 5225538 oraz Capon i wsp., Nature 337: 525-531 (1989). Ekwiwalent funkcjonalny, pochodna, fragment lub region cz asteczki receptora TNF odnosz a si e do cz esci cz asteczki receptora TNF lub cz esci sekwencji cz asteczki receptora TNF, która koduje cz a- steczk e receptora TNF, która posiada rozmiar i sekwencj e wystarczaj ac a by przypomina c funkcjonal- nie cz asteczki receptora TNF, które mozna zastosowa c w niniejszym wynalazku (np. wi az a TNF z du zym powinowactwem i posiadaj a nisk a immunogenno sc). Ekwiwalent funkcjonalny cz asteczki receptora TNF obejmuje równie z zmodyfikowane cz asteczki receptora TNF które przypominaj a funk- cjonalnie cz asteczki receptora TNF, które mo zna zastosowa c w niniejszym wynalazku (np. wi aza TNF z du zym powinowactwem i posiadaja nisk a immunogenno sc). Na przyk lad ekwiwalent funkcjonalny cz asteczki receptora TNF mo ze zawiera c kodon „NIEMY" lub jedn a lub wi eksz a liczb e podstawie n aminokwasowych, delecji lub addycji (np. podstawienie jednego aminokwasu kwasowego innym ami- nokwasem kwasowym lub podstawienie kodonu koduj acego taki sam lub inny aminokwas hydrofobo- wy innym kodonem, koduj acym aminokwas hydrofobowy. Zobacz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. i Wiley-Interscience, New York (1987-2000). Do cytokin nale za wszelkie znane cytokiny. Zobacz np. CopewithCytokines.com. Antagoni sci cytokin obejmuj a mi edzy innymi dowolne przeciwcia la, fragmenty lub mimetyki, dowolne rozpuszczal- ne receptory, fragmenty lub mimetyki, dowolne antagonisty niskocz asteczkowych lub dowoln a ich kombinacj e. Leczenie Przeciwica lo lub kompozycja farmaceutyczna wed lug niniejszego wynalazku mog a by c stoso- wane w leczenia zaburzenia, w którym po sredniczy IL-12, obejmuj acym podawanie skutecznej ilo sci przeciwcia la anty-IL-12 lub kompozycji farmaceutycznej do komórki, tkanki, narz adu, zwierz ecia lub pacjentowi tego potrzebuj acemu. Taki sposób mo ze równie z ewentualnie zawiera c wspó lpodawanie lub terapi e skojarzon a do leczenia takich chorób immunologicznych, gdzie podawanie tego przeciw- cia la anty-IL-12 lub kompozycji farmaceutycznej obejmuje podawanie przed, jednocze snie z lub po przynajmniej jednego wybranego spo sród przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. nieograniczaj a- co przeciwcia lo TNF lub jego fragment, rozpuszczalny receptor TNF lub jego fragment, ich bia lka fu- zyjne lub niskocz asteczkowy antagonista TNF), leku przeciwreumatycznego (np. metotreksat, aurano-PL 205 786 B1 28 fin, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, tiojab lczan sodowo-z lotawy, siarczan hydroksychlorochi- nu, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczaj acego mi esnie, narkotyku, niesterydowego leku przeciw- zapalnego (NSAID), leku przeciwbólowego, srodka znieczulaj acego, srodka uspokajaj acego, srodka znieczulaj acego miejscowo, blokera nerwowo-mi esniowego, leku przeciwdrobnoustrojowego (np. aminoglikozydu, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpaso zytniczego, leku przeciwwirusowego, kar- bapenemu, cefalosporyny, fluorochinoliny, makrolidu, penicyliny, sulfonamidu, tetracykliny, innego leku przeciwdrobnoustrojowego), leku przeciw luszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, czynnika zwi azanego z cukrzyc a, substancji mineralnej, substancji od zywczej, czynnika tarczycowego, witaminy, hormonu zwi azanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, srodka przeciwkaszlowego, srodka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, srodka przeczyszczaj acego, srodka przeciw- krzepliwego, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, srodka immunosupresyjnego (np. basiliksimab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku hormonalnej terapii zast epczej, modulatora recep- tora estrogenu, srodka rozszerzaj acego zrenice, srodka cykloplegicznego, czynnika alkiluj acego, an- tymetabolitu, inhibitora mitozy, srodka radioleczniczego, leku przeciwdepresyjnego, czynnika przeciw manii, czynnika przeciw psychozie, czynnika przedwiekowego, leku nasennego, srodka sympatyko- mimetycznego, srodka pobudzaj acego, donepezilu, takrynu, leku na astm e, agonisty beta, sterydu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromolinu, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Typowo, leczenie stanu patologicznego prowadzi si e, podaj ac skuteczn a ilosc lub dawk e przy- najmniej jednej kompozycji anty-IL-12, która zawiera srednio ilo sc z zakresu od przynajmniej oko lo 0,01 do 500 miligramów przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 na kilogram masy cia la pacjen- ta na dawk e, w przypadku zalecanym od oko lo 0,1 do 100 miligramów na kilogram masy cia la pacjen- ta na dawk e podawan a jednorazowo lub wielokrotnie, w zale zno sci od aktywno sci swoistej, zawartej w kompozycji. Alternatywnie, efektywne st ezenie w osoczu mo ze wynosi c 0, 1 - 5000 µg/ml osocza na podanie jednokrotne lub wielokrotne. Odpowiednie dawkowanie znane jest praktykuj acym lekarzom, w zale zno sci oczywi scie od konkretnego stanu chorobowego, aktywno sci swoistej podawanej kompo- zycji i danego pacjenta poddanego leczeniu. W pewnych przypadkach, aby osi agnac po zadan a ilo sc terapeutyczn a, mo ze okaza c si e konieczne powtarzanie podawania, tj. powtarzane indywidualne po- dawanie konkretnej dawki monitorowanej lub odmierzonej dawki, a podawanie danej osobie kontynu- uje si e a z do osi agni ecia pozadanej dawki dziennej lub efektu. Do zalecanych dawek nale za ewentualnie 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 i/lub 100-500 mg/kg/podanie, lub dowolny zakres, warto sc lub cz es c z tego zakresu, lub do osi agni ecia stezenia w osoczu 0,1; 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5; 2,9; 3,0; 3, 5; 3, 9; 4,0; 4,5; 4,9; 5,0; 5,5; 5,9; 6,0; 6,5, 6,9; 7,0; 7,5; 7,9; 8,0; 8,5; 8,9; 9,0; 9,5; 9,9; 10; 10,5; 10,9; 11; 11,5; 11,9; 20; 12,5; 12,9; 13,0; 13,5; 13,9; 14,0; 14,5; 4,9; 5,0; 5,5; 5,9; 6,0; 6,5; 6,9; 7,0; 7,5; 7,9; 8,0; 8,5; 8,9; 9,0; 9,5; 9,9; 10; 10,5; 10,9; 11; 11,5; 11,9; 12; 12,5; 12,9; 13,0; 13,5; 13,9; 14; 14,5; 15; 15,5; 15,9; 16; 16,5; 16,9; 17; 17,5; 17,9; 18; 18,5; 18,9; 19; 19,5; 19,9; 20; 20,5; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 96; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800; 900; 1000; 1500; 2000; 2500; 3000; 3500; 4000; 4500 i/lub 5000 µg/ml osocza krwi na jednorazowe lub wielokrotne podanie dawki lub dowolny zakres, warto sci lub cz es c z tych zakresów. Alternatywnie, dawka podawana mo ze si e zmienia c w zale zno sci od znanych czynników, takich jak charakterystyka farmakodynamiczna danego czynnika, sposób i droga jego podania, wiek, stan zdrowia i masa pacjenta, charakter i nasilenie objawów, rodzaj leczenia równoleg lego, cz estotliwo sc leczenia i po zadany efekt. Zazwyczaj dawka sk ladnika aktywnego mo ze wynosi c oko lo 0,1 do 100 miligramów na kilogram masy cia la. Zwykle do uzyskania po zadanych wyników wystarczy 0,1 do 50, a w przypadku zalecanym 0,1 do 10 miligramów na kilogram jednorazowo lub w przypadku po- astaci o przed luzonym uwalnianiu. Jako nieograniczaj acy przyk lad podawanie mo zna przeprowadzi c u ludzi lub zwierz at poprzez podawanie jednorazowe lub periodyczne przynajmniej jednego przeciwcia la niniejszego wynalazku w dawce 0,1 do 100 mg/kg, tak jak 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 45; 50; 60; 70; 80; 90 lub 100 mg/kg, naPL 205 786 B1 29 dzie n, przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 lub 40 dni lub alternatywnie albo dodatko- wo przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 lub 52 tygodni lub alternatywnie albo dodatkowo przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 lat, lub ich wszelk a kombinacj e, z zastosowaniem dawki pojedynczej, wlewu lub dawek powtarzanych. Postaci dawkowania (kompozycja), odpowiednie dla podawania wewn etrznego, zawieraj a za- sadniczo od oko lo 0,1 miligrama do oko lo 500 miligramów sk ladnika aktywnego na jednostk e lub opa- kowanie. W tych kompozycjach farmaceutycznych sk ladnik aktywny jest zazwyczaj obecny w ilo sci oko lo 0,5-99,999% wagowych, w stosunku do masy ca lkowitej kompozycji. Do podawania pozajelitowego przeciwcia lo mo ze by c preparowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub zliofilizowany proszek, dostarczany osobno lub wraz z akceptowalnym farmaceutycznie no snikiem pozajelitowym. Przyk ladami takich no sników s a woda, sól fizjologiczna, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i albumina osocza krwi cz lowieka 1 - 10%. Mo zna równie z zastosowa c liposomy lub no sniki niewodne, takie jak oleje zestalone. No snik lub zliofilizowany proszek mog a zawiera c dodatki, które zapewniaj a izotonicznosc (np. chlorek sodu, mannitol) i trwa losc chemiczn a (np. bufory i kon- serwanty). Kompozycj e poddaje si e sterylizacji za pomoc a znanych lub stosownych technik. Odpowiednie no sniki farmaceutyczne opisano w najnowszym wydaniu Remington's Pharma- ceutical Sciences, A. Osol, standardowym podr eczniku w tej dziedzinie. Podawanie alternatywne Do podawania skutecznych farmaceutycznie ilo sci przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mo zna zastosowa c wiele znanych i udoskonalonych trybów tu opisa- nych. W nast epuj acym opisie stosuje si e podawanie dop lucne, ale zgodnie z wynalazkiem mo zna zastosowa c inne tryby podawania ze stosownymi wynikami. Przeciwcia la IL-12 wed lug niniejszego wynalazku mo zna podawa c w no sniku, jako roztwór, emulsj e, koloid, zawiesin e, lub jako suchy proszek, stosuj ac dowolny spo sród wielu sposobów i urz a- dze n odpowiednich do podawania wziewnego lub innych trybów, opisanych tutaj lub znanych w dzie- dzinie. Kompozycje i podawanie pozajelitowe Kompozycje do podawania pozajelitowego mog a zawiera c jako typowe zaróbki ja low a wod e lub sól fizjologiczn a, glikole polialkilenowe, takie jak glikol polietylenowy, oleje pochodzenia ro slinnego, uwodornione naftaleny i tym podobne. Zawiesiny wodne lub olejowe do iniekcji mo zna wykona c z u zy- ciem odpowiedniego emulgatora lub srodka zwil zaj acego oraz czynnika u latwiaj acego powstanie za- wiesiny, wed lug znanych sposobów. Czynnikami do iniekcji mog a by c nietoksyczne czynniki rozcie n- czaj ace, nienadaj ace si e do podawania doustnego, takie jak roztwór wodny lub ja lowy roztwór do in- iekcji lub zawiesina w rozpuszczalniku. Dopuszczalne jako stosowalne no sniki lub rozpuszczalniki s a woda, roztwór Ringera, izotoniczna sól fizjologiczna itp.; ja lowy nielotny olej mo ze zosta c u zyty jako zwyk ly rozpuszczalnik lub rozpuszczalnik do tworzenia zawiesin. Do tych celów mo zna zastosowa c nielotny olej lub kwas t luszczowy ka zdego rodzaju, w laczaj ac w to naturalne lub syntetyczne lub pó l- syntetyczne oleje t luszczowe lub kwasy t luszczowe, naturalne lub syntetyczne lub pó lsyntetyczne mono- lub di- lub triglicerydy. Podawanie pozajelitowe jest znane w dziedzinie i obejmuje, lecz nie jest ograniczone do konwencjonalnych sposobów wstrzykiwania, bezig lowego urz adzenia do iniekcji, z zastosowaniem gazu pod ci snieniem, jak opisano w patencie USA nr 5851198 oraz laserowego urz adzenia do perforacji, jak opisano w patencie USA nr 5839446. Dostarczanie alternatywne Wynalazek dotyczy ponadto podawania przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 w trybie pozajelitowym, podskórnym, domi esniowym, do zylnym, dostawowym, dooskrzelowym, dobrzusznym, dotorebkowym, dochrz estnym, dojamowym, do jamy cia la, domó zd zkowym, do komory mózgu, do- okr ezniczym, doszyjkowym, do zoladkowym, dow atrobowym, do mi esnia sercowego, dokostnym, do- miedniczym, doosierdziowym, dootrzewnowym, doop lucnowym, doprostatowym, wziewnym, doodbyt- niczym, donerkowym, dosiatkówkowym, do rdzenia, domaziówkowym, do klatki piersiowej, domacicz- nym, dop echerzowym, w jednej du zej dawce, dopochwowym, doodbytniczym, policzkowym, podj ezy- kowym, donosowym lub przezskórnym. Kompozycj e przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 mo zna przygotowa c do zastosowania do podania pozajelitowego (podskórnego, domi esniowego lub do zylnego) lub jakiegokolwiek innego, szczególnie w postaci roztworu lub zawiesiny p lynnej; do za-PL 205 786 B1 30 stosowania do podania dopochwowego lub doodbytniczego, szczególnie w postaciach pó lsta lych, takich jak nieograniczaj aco kremy i czopki; do podania policzkowego lub podj ezykowego, tak jak nie- ograniczaj aco w postaci tabletek lub kapsu lek; lub donosowego, tak jak nieograniczaj aco w postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli lub pewnych czynników; lub przezskórnego, tak jak nieograni- czaj aco w postaci zeli, ma sci, balsamów, zawiesin lub plastrowych trybów podawania, z chemicznymi substancjami wspomagaj acymi, takimi jak dimetylosulfotlenek, w celu albo modyfikacji struktury skóry, albo zwi ekszenia st ezenia leku w plastrze przezskórnym (Junginger i wsp. w "Drug Permeation En- hancement"; Hsieh, D. S., wyd., str. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, albo za pomoc a czynników utleniaj acych, które umo zliwiaj a podawanie kompozycji zawieraj acych bia lka i peptydy na skór e (WO 98/53847), albo zastosowa n pól elektrycznych do wytworzenia przej sciowych szlaków transportu, takich jak elektroporacja, lub by zwiekszy c ruchliwo sc na ladowanych leków przez skór e, takich jak jonoforeza, lub zastosowanie ultrad zwi eków, takie jak sonoforeza (patenty USA nr 4309989 i 4767402). Podawanie dop lucne/donosowe W przypadku podawania dop lucnego zalecane jest by kompozycj e przynajmniej jednego prze- ciwcia la anty-IL-12 dostarcza c w rozmiarze cz astek skutecznym do osi agni ecia dolnych drog odde- chowych p luc lub zatok. Zgodne z wynalazkiem przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 mo zna dostarczy c za pomoc a szeregu urz adze n wziewnych lub donosowych, znanych w dziedzinie, s luza- cych do podawania wziewnego czynników terapeutycznych. Do tych urz adze n, zdolnych do wprowa- dzania kompozycji w postaci aerozolu do zatok lub p echerzyków p lucnych, zalicza si e inhalatory z odmierzonymi dawkami, nebulizery, generatory suchych proszków, rozpylacze i tym podobne. W dziedzinie s a równie z znane inne urz adzenia, odpowiednie do przeprowadzenia podania dop lucne- go lub donosowego przeciwcia l. We wszystkich tych urz adzeniach mog a by c wykorzystane kompozy- cje odpowiednie do podawania przeciwcia la w aerozolu. Takie aerozole mog a zawiera c albo roztwory (zarówno wodne, jak i niewodne) albo cz astki sta le. W inhalatorach z odmierzonymi dawkami, takich jak inhalator z odmierzonymi dawkami Ventolin®, zazwyczaj stosuje sie gaz nap edowy i wymagana jest aktywacja podczas wdechu (zobacz np. WO 94/16970, WO 98/35888). W inhalatorach suchych proszków, takich jak Turbuhaler™ (Astra), Rotahalere® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalator Spiros™ (Dura), urz adzeniach sprzedawanych przez Inhale Therapeutics oraz inhalatorze proszkowym Spinha- ler® (Fisons), wykorzystywana jest aktywacja mieszanego proszku oddechem (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fi- sons). W nebulizerach, takich jak AERx™ Aradigm, nebulizer Ultravent® (Mallinckrodt) i nebulizer Acorn II® (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376) aerozole wytwarzane s a z roztworów, podczas gdy inhalatory z odmierzonymi dawkami, inhalatory suchych proszków itp. wytwarzaj a aerozole ma lych cz astek. Te szczególne przyk lady dost epnych komercyjnie urz adze n do inhalacji maj a by c reprezentatywnymi przyk ladami konkretnych urz adze n, odpowiednich do realizacji tego wynalazku, ale nie maj a ogranicza c jego zakresu. W zalecanym przypadku kompozycja zawiera- jaca przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 dostarczana jest przez inhalator suchego proszku lub rozpylacz. Istnieje kilka po zadanych cech urz adzenia do inhalacji do podawania przynajmniej jednego przeciwcia la wed lug niniejszego wynalazku. Na przyk lad w zalecanej sytuacji dostarczanie przez urz adzenie do inhalacji jest pewne, powtarzalne i dok ladne. Urz adzenie do inhalacji mo ze ewentualnie dostarcza c ma le suche cz astki, np. mniejsze ni z oko lo 10 µm, w przypadku zalecanym oko lo 1-5 µm, dla dobrego wdychania. Podawanie kompozycji przeciwcia la IL-12 w postaci rozpylonej. P lyn rozpylony, zawieraj acy kompozycji bia lkow a przeciwcia la IL-12, mo zna wytworzy c przez przepchni ecie zawiesiny lub roztworu przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 przez dysz e pod cisnieniem. Wielko sc i uk lad dyszy, przy lozone ci snienie i pr edko sc podawania p lynu mo zna dobra c tak, by uzyska c pozadany wyp lyw i wielko sc cz astek. Mo zna na przyk lad wytworzy c elektrosprej za pomoc a pola elektrycznego, w po laczeniu z kapilara lub doprowadzeniem do dyszy. W przypadku zalecanym cz astki kompozycji bia lkowej przeciwcia la IL-12, podawane przez rozpylacz, maj a wielko sc cz astek mniejsz a ni z oko lo 10 µm, w przypadku zalecanym od oko lo 1 µm do oko lo 5 µm, a zw laszcza oko lo 2 µm do oko lo 3 µm. Kompozycje z co najmniej jedn a kompozycj a bia lkow a przeciwcia la anty-IL-12, odpowiednie do zastosowania w rozpylaczu na ogó l zawieraj a kompozycj e bia lkow a przeciwcia la w roztworze wodnym o st ezeniu oko lo 0,1 mg do oko lo 100 mg przynajmniej jednej bia lkowej kompozycji przeciwcia la anty-IL-12 na ml roztworu lub mg/gm lub dowolny zakres lub wartosc z niego, np. nieograniczaj acoPL 205 786 B1 31 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 45; 50; 60; 70; 80; 90 lub 100 mg/ml lub mg/gm. Kompo- zycja mo ze zawiera c czynniki, takie jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, srodek po- wierzchniowo czynny i w przypadku zalecanym, cynk. Kompozycja mo ze równie z zawiera c zaróbk e lub czynnik do stabilizacji kompozycji bia lkowej przeciwcia la, taki jak bufor, czynnik redukuj acy, bia lko wype lniaj ace lub w eglowodan. Do bia lek wype lniaj acych, przydatnych do preparowania kompozycji bia lkowych przeciwcia l, nale za albumina, protamina i tym podobne. Do typowych w eglowodanów, przydatnych do komponowania bia lkowych kompozycji przeciwcia l, nale za sacharoza, mannitol, lakto- za, trehaloza, glukoza i tym podobne. Preparat kompozycji bia lkowej przeciwcia la mo ze równie z za- wiera c srodek powierzchniowo czynny, który mo ze ograniczy c lub zapobiec indukowanej przez kon- takt z powierzchni a agregacji bia lkowej kompozycji przeciwcia la, spowodowanej przez atomizacj e roztworu podczas tworzenia aerozolu. Mo zna wykorzysta c ró zne konwencjonalne srodki powierzch- niowo czynne, takie jak estry kwasów t luszczowych i polioksoetyleno-alkoholi oraz estry kwasów t luszczowych i polioksoetyleno-sorbitolu. Ilo sci z regu ly mieszcz a si e w zakresie od 0,001 do 14% wagowych kompozycji. Srodkami powierzchniowo czynnymi, szczególnie zalecanymi dla potrzeb tego wynalazku, s a monooleinian polioksoetyleno-sorbitanu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub podobne. Do kompozycji mo zna równie z w laczy c dodatkowe czynniki znane w dziedzinie tworzenia kompozycji bia lkowych takich jak przeciwcia la dla IL-12 albo okre slone cz esci lub warianty. Podawanie kompozycji przeciwcia la IL-12 za pomoc a nebulizera Bia lkow a kompozycj e przeciwcia la mo zna podawa c za pomoc a nebulizera, takiego jak nebuli- zer strumieniowy lub nebulizer ultrad zwi ekowy. Z regu ly w nebulizerze do wytworzenia strumienia powietrza o du zej pr edko sci stosowane jest strumieniowe zród lo sprezonego powietrza, wyp lywaj ace przez otwór. Podczas rozpr ezania gazu poza dysz a powstaje obszar niskiego ci snienia, który wci aga roztwór bia lkowej kompozycji przeciwcia la przez rurk e kapilarn a po laczon a ze zbiornikiem cieczy. Strumie n cieczy z rurki kapilarnej podczas opuszczania rurki ulega rozpadowi na niestabilne filamenty i kropelki, wytwarzaj ac aerozol. Dla osi agni ecia po zadanej charakterystyki dzia lania danego nebulize- ra strumieniowego mo zna wykorzysta c szereg konfiguracji, pr edko sci przep lywu i rodzajów deflektora. W nebulizerze ultrad zwi ekowym energia elektryczna o wysokiej cz estotliwo sci jest stosowana do wy- tworzenia wibracyjnej energii mechanicznej, na ogó l przy zastosowaniu przetwornika piezoelektrycz- nego. Ta energia jest przekazywana kompozycji bia lkowej kompozycji przeciwcia la albo bezpo sred- nio, albo poprzez p lyn sprz egaj acy, wytwarzaj ac aerozol zawieraj acy bia lkow a kompozycj e przeciw- cia la. W przypadku zalecanym cz astki kompozycji bia lkowej przeciwcia la, podawane przez nebulizer, maja wielkosc cz astek mniejsz a ni z oko lo 10 µm, w przypadku zalecanym w zakresie od oko lo 1 µm do okolo 5 µm, a zw laszcza oko lo 2 µm do oko lo 3 µm. Kompozycje przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12, odpowiednie do zastosowania w nebulizerze strumieniowym albo ultrad zwi ekowym, zazwyczaj zawieraj a st ezenie oko lo 0,1 mg do oko lo 100 mg przynajmniej jednego bia lka przeciwcia la anty-IL-12 na ml roztworu. Kompozycja mo ze zawiera c czynniki, takie jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, srodek powierzchniowo czynny i, w przypadku zalecanym, cynk. Kompozycja mo ze równie z zawiera c zaróbk e lub czynnik do stabilizacji kompozycji bia lkowej przeciwcia la, taki jak bufor, czynnik redukuj acy, bia lko wype lniaj ace lub w eglowodan. Do bia lek wype lniaj acych, przydatnych do preparowania kompozycji bia lkowych przeciwcia la, nale za albumina, protamina i tym podobne. Do typowych w eglowodanów, przydatnych do preparowania kompozycji bia lkowych przeciwcia la, naleza sacharoza, mannitol, laktoza, trehaloza, glukoza i tym podobne. Kompozycja przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 mo ze równie z za- wiera c srodek powierzchniowo czynny, który mo ze ograniczy c lub zapobiega c indukowanej przez kontakt z powierzchni a agregacji kompozycji bia lkowej przeciwcia la, spowodowanej przez atomizacj e roztworu podczas tworzenia aerozolu. Mo zna wykorzysta c ró zne konwencjonalne srodki powierzch- niowo czynne, takie jak estry kwasów t luszczowych i polioksoetyleno-alkoholi oraz estry kwasów t luszczowych i polioksoetyleno-sorbitolu. Ilo sci z regu ly mieszcz a si e w zakresie od 0,001 do 4% wa- gowych kompozycji. Srodkami powierzchniowo czynnymi szczególnie zalecanymi w wynalazku s a monooleinian polioksoetyleno-sorbitanu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub podobne. Do kompozycji mo zna równie z w laczy c dodatkowe czynniki znane w dziedzinie preparowania kompozycji bia lkowych takich jak bia lka przeciwcia l. Podawanie kompozycji przeciwcia la dla IL-12 za pomoc a inhalatora z odmierzonymi dawkami W inhalatorze z odmierzonymi dawkami (MDI) gaz nap edowy, przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 i dowolne zaróbki lub inne substancje dodatkowe znajduj a si e w zbiorniku w postaci mie-PL 205 786 B1 32 szaniny zawieraj acej sprezony gaz ciek ly. Aktywacja zaworu odmierzaj acego uwalnia mieszanin e w postaci aerozolu, w przypadku zalecanym zawieraj acego cz astki z zakresu wielko sci mniejszych ni z oko lo 10 µm, zw laszcza oko lo 1 µm do oko lo 5 µm a w szczególno sci oko lo 2 µm do oko lo 3 µm. Po- zadany rozmiar cz astek aerozolu mo zna uzyska c, wykorzystuj ac preparat kompozycji bia lkowej prze- ciwcia la, otrzymany za pomoc a ró znych sposobów znanych specjalistom w dziedzinie, w tym pulwery- zacji, suszenia rozpryskowego, kondensacji w punkcie krytycznym lub podobnych. Do zalecanych inhalatorów z odmierzonymi dawkami nale za te, które wytwarza 3M lub Glaxo, w których wykorzysta- ny jest fluorow eglowodorowy gaz nap edowy. Kompozycje przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 do zastosowania w inhalatorze z odmierzonymi dawkami zawieraj a w przypadku ogólnym bardzo drobny proszek, zawieraj acy przy- najmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 w postaci zawiesiny w o srodku niewodnym, na przyk lad zawie- szone w gazie nap edowym za pomoc a srodka powierzchniowo czynnego. Gazem nap edowym mo ze by c ka zdy konwencjonalny materia l stosowany dla tego celu, taki jak zwiazek chlorofluorow eglowy, zwi azek chlorofluorow eglowodorowy, zwi azek fluorow eglowodorowy, lub w eglowodór, w laczaj ac w to trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, HFA- -134a (wodorofluoroalkan-134a), HFA-227 (wodorofluoroalkan-227) lub podobne. Zalecanym gazem nap edowym jest zwiazek fluorow eglowodorowy. Mo zna dobra c srodek powierzchniowo czynny do zabezpieczenia owego przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 przed rozk ladem chemicznym i tym podobnymi. Do odpowiednich srodków powierzchniowo czynnych nale za trioleinian sorbitanu, lecytyna sojowa, kwas oleinowy i tym podobne. W pewnych przypadkach zalecane s a aerozole zawie- rajace roztwory, stosuj ace takie rozpuszczalniki jak etanol. Kompozycja mo ze równie z zawiera c do- datkowe czynniki, znane w dziedzinie preparowania bia lek, takie jak bia lko. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje si e, ze sposoby tu opisane mog a zosta c zrealizowane za pomoc a podawania wziewnego kompozycji przynajmniej jednego przeciwcia la anty-IL-12 z u zyciem urz adze n tutaj nie opisanych. Kompozycje i podawanie doustne Kompozycje do podawania doustnego opieraj a si e na wspó lpodawaniu adiuwantów (np. rezor- cynoli i niejonowych srodków powierzchniowo czynnych, takich jak eter polioksoetylenowo-oleinowy i eter n-heksadecylo-polietylenowy), aby sztucznie zwi ekszy c przepuszczalnosc scian jelita, a tak ze wspó lpodawanie inhibitorów enzymów (np. inhibitorów trypsyny z trzustki, fluorofosforanu diizopropy- lowego (DFF) i trasylolu), aby zahamowa c rozk lad enzymatyczny. Zwi azek, b ed acy sk ladnikiem ak- tywnym formy sta lej dawkowania do podawania doustnego mo ze zosta c zmieszany z przynajmniej jedn a substancj a dodatkow a, w tym sacharoz a, laktoz a, celuloz a, mannitolem, trehaloz a, rafinoz a, maltitolem, dekstranem, skrobiami, agarem, alginianami, chitynami, chitozanami, pektynami, gu- m a tragakantow a, gum a arabsk a, zelatyn a, kolagenem, kazein a, albumin a, polimerem syntetycz- nym lub pó lsyntetycznym i glicerydem. Te formy dawkowania mog a równie z zawiera c inny(inne) ro- dz aj(rodzaje) substancji dodatkowych, np. nieaktywne czynniki rozcie nczaj ace, srodek po slizgowy, taki jak stearynian magnezu, paraben, czynnik konserwuj acy, taki jak kwas sorbowy, kwas askorbino- wy, tokoferol alfa, przeciwutleniacz, taki jak cysteina, substancj e rozpraszaj ac a, substancj e lacz ac a, substancj e zag eszczaj ac a, czynnik buforuj acy, czynnik s lodz acy, czynnik smakowy, czynnik zapa- chowy itp. Tabletki i pigu lki mo zna przekszta lci c dalej w preparaty powlekane warstw a zabezpieczaj ac a przed dzia laniem soku zoladkowego. Do preparatów ciek lych do podawania doustnego nale za emul- sja, syrop, eliksir, zawiesina i roztwór, dopuszczalny do zastosowania medycznego. Te preparaty mo- g a zawiera c nieaktywne czynniki rozcie nczaj ace, stosowane zazwyczaj w tej dziedzinie, np. wod e. Opisano równie z liposomy, jako uk lady dostarczania leków dla insuliny i heparyny (pat. USA nr 4239754). Ostatnio do dostarczania substancji farmaceutycznych zastosowano mikrosfery sztucznych polimerów mieszanin aminokwasów (proteinoidy (pat. USA nr 4925673). Ponadto do dostarczania doustnego czynników aktywnych biologicznie stosuje si e zwi azki no snikowe, opisane w pat. USA nr 5879681 i pat. USA nr 55871753. Kompozycje i podawanie do sluzówkowe Dla absorpcji przez powierzchni e b lon sluzowych, kompozycje i sposoby podawania przynajm- niej jednego przeciwcia la anty-IL-12 obejmuj a emulsj e zawieraj ac a wiele cz astek submikronowych, makrocz asteczk e mukoadhezyjn a, peptyd bioaktywny oraz ci ag la faz e wodn a, która u latwia absorpcj e przez powierzchni e b lon sluzowych dzi eki uzyskaniu mukoadhezji cz astek emulsji (pat. USA nr 5514670). Do b lon sluzowych odpowiednich do nak ladania emulsji tu opisanej, nale za: droga poda-PL 205 786 B1 33 wania rogówkowa, spojówkowa, policzkowa, podj ezykowa, nosowa, dopochwowa, dop lucna, do zolad- kowa, dojelitowa, i doodbytnicza. Kompozycje do podawania dopochwowego lub doodbytniczego, np. czopki, mog a zawiera c zaróbki, na przyk lad glikole polialkilenowe, wazelin e, mas lo kakaowe i tym podobne. Kompozycje dla podawania donosowego mog a by c cia lem sta lym i zawiera c jako zaróbki na przyk lad laktoz e lub mog a by c roztworami wodnymi b ad z olejowymi kropli do nosa. Zaróbki dla poda- wania policzkowego obejmuj a cukry, stearynian wapnia, stearynian magnezu, skrobi e z zelowan a i tym podobne (pat. USA nr 5849695). Kompozycje i podawanie przezskórne Do podawania przezskórnego opisane przynajmniej jedno przeciwcia lo anty-IL-12 jest zamyka- ne w urz adzeniu do podawania, takim jak liposom lub nanocz astki polimerowe, mikrocz astki, mikro- kapsu lki lub mikrosfery (zbiorczo nazywane mikrocz astkami, o ile nie stwierdza si e inaczej). Znany jest szereg odpowiednich urz adze n, w tym mikrocz astki wykonane z polimerów syntetycznych, takich jak polihydroksykwasy, takie jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy i ich kopolimery, ortopoliestry, polibezwodniki i polifosfazeny oraz polimerów naturalnych, takich jak kolagen, poliaminokwasy, albu- mina i inne bia lka, alginian i inne polisacharydy, i ich kombinacje (pat. USA nr 5814599). Kompozycje i podawanie przed lu zone Czasem pozadane mo ze by c dostarczanie opisanych tu zwi azków pacjentowi przez d lu zszy okres czasu, na przyk lad przez okres od jednego tygodnia do jednego roku, od pierwszego podania. Mo zna wykorzysta c ró zne postaci dawkowania o powolnym uwalnianiu, typu depot lub implanty. Na przyk lad posta c dawkowania mo ze zawiera c akceptowaln a farmaceutycznie nietoksyczn a sól zwi azku, który rozpuszcza si e w p lynach ustrojowych w niskim stopniu, na przyk lad (a) kwasowa sól addycyjna z kwasem wielozasadowym, takim jak kwas fosforowy, kwas siarkowy, kwas cytrynowy, kwas winowy, tanina, kwas paminowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenomono- lub disulfono- we, kwas poligalakturonowy i tym podobne; (b) sól z wielowarto sciowym jonem metalu, takim jak cynk, wap n, bizmut, bar, magnez, glin, mied z, kobalt, nikiel, kadm i tym podobne, albo z kationem organicz- nym, powsta lym z np. N,N'-dibenzyloetylenodiaminy lub etylenodiaminy; albo (c) kombinacji (a) i (b), np. sol a cynkowo-taninow a. Dodatkowo zwi azki tu opisane lub, w przypadku zalecanym, wzgl ednie nierozpuszczalna sól, taka jak te w la snie opisane, mo ze by c preparowana w postaci zelu, np. zelu monostearynianu glinu z np. olejem sezamowym, odpowiednim do iniekcji. Szczególnie zalecane s a sole cynku, sole taninowe cynku, sole kwasu pamowego i tym podobne. Inny rodzaj kompozycji depot o powolnym uwalnianiu, do iniekcji, mo ze zawiera c dyspersj e zwi azku lub soli do enkapsulacji w roz- k ladaj acym si e powoli, nietoksycznym, nieantygenicznym polimerze, takim jak polimer kwasu polimle- kowego/kwasu poliglikolowego, na przyk lad tak, jak opisano w pat. USA nr 3773919. Zwi azki, lub w zalecanym przypadku wzgl ednie nierozpuszczalne sole, takie jak opisane powy zej, mog a równie z by c preparowane w granulkach silastikowych z macierz a cholesterolow a, w szczególno sci do zasto- sowania u zwierz at. W literaturze znane s a inne kompozycje o powolnym uwalnianiu, typu depot lub implantów, np. liposomy gazowe lub ciek le (pat. USA nr 5770222 i „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1978). Po ogólnym opisie wynalazku mo zna ten wynalazek latwiej zrozumie c odwo luj ac si e do nast e- puj acych przyk ladów, które podane s a dla ilustracji a nie ograniczania. P r z y k l a d 1: Klonowanie i ekspresja przeciwcia la anty-IL-12 w komórkach ssaczych Typowy ssaczy wektor ekspresyjny zawiera przynajmniej jeden element promotorowy, po sred- nicz acy w inicjacji transkrypcji mRNA, sekwencj e koduj ac a przeciwcia lo i sygna ly wymagane dla ter- minacji transkrypcji i poliadenylacji transkryptu. W sród dodatkowych elementów s a wzmacniacze, sekwencje Kozak i sekwencje intronowe otoczone przez miejsca donorowe i akceptorowe dla sk lada- nia RNA. Wysokowydajn a transkrypcj e mo zna osi agnac z wczesnych i pó znych promotorów SV40, d lugich ko ncowych powtórze n (LTR) z retrowirusów np. RSV, HTLVI, HIVI i z wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV). Niemniej mo zna u zy c tak ze elementów komórkowych (np. promotora genu aktyny cz lowieka). Do wektorów ekspresyjnych odpowiednich do wykorzystania w wynalazku nale za np. wektory takie jak pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN lub pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/), pcDNA/Zeo ( + /-) lub pcDNA3.1/Hygro ( + /-) (Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12MI (ATCC 67109). Do ssaczych komórek gospodarza, które mog a by c wykorzystane naleza ludzkie Hela 293, H9 i komórki Jurkat, mysie komórki NIH3T3 i C127, Cos 1, Cos 7 i CV 1, przepiórcze komórki QC1-3, mysie komórki L i komórki jajnikowe chomika chi nskiego (CHO).PL 205 786 B1 34 Alternatywnie, gen mo zna eksprymowa c w stabilnych liniach komórkowych zawieraj acych gen zintegrowany na chromosomie. Kotransfekcja markerem selekcyjnym takim jak oporno sc na dhfr, gpt, neomycyn e lub higromycyn e, pozwala na identyfikowanie i izolowanie stransfekowanych komórek. Gen, którym si e transfekuje mo ze by c równie z powielany w celu ekspresji du zych ilo sci kodo- wanego przeciwcia la. Marker DHFR (reduktazy dihydrofolianowej), jest u zyteczny w otrzymywaniu linii komórkowych nios acych nawet kilka tysi ecy kopii odpowiedniego genu. Innym u zytecznym markerem selekcyjnym jest enzym syntaza glutaminy (GS) (Murphy i wsp., Biochem. J. 227: 277279 (1991); Bebbington i wsp., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). U zywaj ac tych markerów, ssacze komórki hoduje si e na pod lo zu selekcyjnym i selekcjonuje si e komórki z wy zsz a oporno scia. Takie linie komór- kowe zawieraj a powielony(powielone) gen(geny) zintegrowane na chromosomie. Do produkcji prze- ciwcia l cz esto wykorzystuje si e komórki jajnika chomika chi nskiego (CHO) i komórki NSO. Wektory ekspresyjne pC1 i pC4 zawieraj a silny promotor (LTR) wirusa mi esaka Rousa (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)), dodatkowo zawieraj a fragment wzmacniacza CMV (Bos- hart i wsp., Cell 41: 521-530 (1985)). Miejsca wielokrotnego klonowania np. miejsca ci ecia dla enzy- mów restrykcyjnych BamHI, Xbal i Asp718 umo zliwiaj a klonowanie odpowiedniego genu. Wektory zawieraj a dodatkowo intron 3', sygna l poliadenylacji i terminacji szczurzego genu preproinsuliny. Klonowanie i ekspresja w komórkach CHO Do ekspresji przeciwcia la anty-IL-12 stosuje si e wektor pC4. Plazmid pC4 jest pochodn a pla- zmidu pSV2-dhfr (nr dost epu ATCC 37146). Plazmid zawiera mysi gen DHFR pod kontrol a wczesne- go promotora SV40. Komórki jajnika chomika chi nskiego lub inne komórki nie posiadaj ace aktywno sci reduktazy dihydrofolianowej, transfekowane tymi plazmidami mog a by c selekcjonowane przez wzrost na po zywce selekcyjnej (np. alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) uzupe lnionej metotreksatem, czynnikiem chemioterapeutycznym. Powielanie genów DHFR w komórkach opornych na metotreksat (MTX) zosta lo dobrze udokumentowane (zobacz np. F. W. Alt i wsp., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J.L. Hamlin i C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); i M. J. Page i M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Komórki hodowane przy wzrastaj acych st e- zeniach MTX rozwijaj a oporno sc na lek przez nadprodukcj e docelowego enzymu DHFR, osi agan a przez powielenie genu DHFR. Je zeli inny gen jest sprz ezony z genem DHFR jest zwykle razem z nim powielany i nadeksprymowany. Wiadomo, ze to podej scie mo ze by c u zyte do stworzenia linii komór- kowych nios acych ponad 1000 kopii powielanego genu(genów). Nast epnie, gdy wycofany zostanie metotreksat, otrzymuje si e linie komórkowe zawieraj ace powielony gen zintegrowany do jednego lub wi ecej chromosomów komórek gospodarza. Plazmid pC4 do ekspresji danego genu zawiera silny promotor d lugiego ko ncowego powtórze- nia (LTR) wirusa mi esaka Rous'a (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)), zawiera dodat- kowo fragment wyizolowany ze wzmacniacza najwcze sniejszych genów ludzkiego cytomegalovirusa (CMV) (Boshart i wsp., Cell 41: 521-530 (1985)). Poni zej promotora znajduj a si e miejsca ci ecia dla enzymów restrykcyjnych BamHI, Xbal i Asp718 umo zliwiaj ace pod laczanie genów. Za tymi miejscami klonowania plazmid zawiera 3' intron i miejsce poliadenylacji szczurzego genu preproinsuliny. Do eks- presji mog a by c u zyte inne, wysokowydajne promotory np. promotor ludzkiej ß-aktyny, wczesne lub pó zne promotory SV40 lub d lugie ko ncowe powtórzenia (LTRS) z retro wirusów np. HIV i HTLVI. Do ekspresji IL-12 w sposób regulowany w komórkach ssaczych mo zna u zy c systemów ekspresji genów Tet-Off i Tet-On firmy Clontech lub systemów podobne (M. Gossen i H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Do poliadenylacji mRNA mog a by c równie dobrze u zyte inne sekwencje sygna lowe np. z genów ludzkiego hormonu wzrostu lub globiny. Stabilne linie komórkowe nios ace odpowiedni gen zintegrowany do chromosomów mo zna równie z selekcjonowa c przez kotransfekcj e markerem selekcyjnym takim jak gpt, G418 i metotreksat. Plazmid pC4 trawi si e enzymami restrykcyjnymi, a nast epnie defosforyluje przy pomocy ciel ecej fosfatazy jelitowej w standardowy sposób. Wektor nast epnie izoluje si e z 1% zelu agarozowego. Stosuje si e sekwencj e DNA koduj ac a ca le przeciwcia lo IL-2, np. jak przedstawiono w SEK NR ID: 7 i 8, odpowiadaj ace regionom zmiennym HC i LC przeciwcia la IL-12 wed lug wynalazku, zgodnie ze znanymi metodami. Wyizolowany DNA koduj acy odpowiedni region zmienny i sta ly (tj. regiony HC i LC) jest równie z u zyty w tym konstrukcie (jak dostarczony w wektorze p1351). Wyizolowany DNA koduj acy region zmienny i sta ly oraz defosforylowany wektor s a nast epnie li- gowane ligaz a DNA faga T4. Transformuje si e komórki E. coli HB101 lub XL-1 Blue i identyfikuje si e bakterie zawieraj ace plazmid pC4 ze wstawk a, np. poprzez analiz e enzymami restrykcyjnymi.PL 205 786 B1 35 Do transfekcji wykorzystuje si e komórki jajnika chomika chinskiego (CHO) nie posiadaj ace ak- tywnego genu DHFR. Kotransfekcj e przeprowadza si e 5 µg plazmidu ekspresyjnego pC4 oraz 0,5 µg plazmidu pSV2-neo z u zyciem lipofektyny. Plazmid pSV2neo zawiera jako dominuj acy znacznik se- lekcyjny gen neo z transpozonu Tn5, koduj acy enzym odpowiedzialny za oporno sc na antybiotyki z grupy, do której nale zy G418. Komórki wysiewa si e na pod lo zu alpha minus MEM uzupe lnionym G418 w st ezeniu 1 µg/ml. Po dwóch dniach komórki trypsynizuje si e i wysiewa na szalki do klonowa- nia hybrydom (Greiner, Germany) na pod lozu alpha minus MEM uzupe lnionym metotreksatem w ste- zeniach 10, 25 lub 50 ng/ml i G418 w st ezeniu 1 µg/ml. Po oko lo 10-14 dniach pojedyncze klony trypsynizuje si e a nast epnie wysiewa na 6-studzienkowe szalki Petriego lub do 10 ml butelek przy ró znym st ezeniu metotreksatu (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klony hodowane na wy z- szym stezeniu metotreksatu przenosi si e na nowe 6-studzienkowe szalki Petriego z jeszcze wy zszym st ezeniem metotreksatu (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Procedur e t e powtarza si e do otrzyma- nia klonów rosn acych przy st ezeniach 100 - 200 mM. Ekspresj e produktów odpowiednich genów sprawdza si e przez np. SDS-PAGE i Western-blot albo chromatografi e HPLC z odwrócon a faz a. P r z y k l a d 2: Wytwarzanie ludzkich, monoklonalnych przeciwcia l IgG o wysokim powinowac- twie, reaguj acych z ludzk a IL-2 przy u zyciu transgenicznych myszy Streszczenie Wykorzystano transgeniczne myszy zawieraj ace ludzkie geny ci ezkich i lekkich lancuchów im- munoglobulin do wytwarzania w pe lni ludzkich, o wysokim powinowactwie, monoklonalnych przeciw- cia l, które mog a by c wykorzystane do zahamowania dzia lania IL-12 w terapii jednej lub wi ecej chorób zwi azanych z IL-12. Myszy hybrydowe z pokolenia F2 (CBA/J x C57/BL6/J) zawieraj ace ludzkie trans- geny rejonów zmiennych i sta lych zarówno dla ci ezkich, jak i lekkich la ncuchów przeciwcia l immunizu- je si e ludzk a, rekombinowan a IL-12 (Taylor i wsp., Intl. Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg i wsp., Nature 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826 (1996); Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14 : 845-851 (1996)). Z szeregu fuzji otrzymano jeden lub wi ecej zestawów w pe lni ludzkich, monoklonalnych przeciwcia l IgG reaguj acych z IL-12. Scharakteryzowano dalej w pe lni ludz- kie przeciwcia la anty-IL-12. Wszystkie nale za do klasy IgG1. Wykazano, ze przeciwcia la te maj a sta le powinowactwo w zakresie oko lo 1x10 9 i 9x10 12 . Nieoczekiwanie wysokie powinowactwo tych w pe lni ludzkich, monoklonalnych przeciwcia l czyni je odpowiednimi do zastosowa n terapeutycznych w cho- robach, patologiach lub zaburzeniach zwi azanych z IL-12. Skróty BSA - albumina surowicy bydl ecej CO 2 - dwutlenek w egla DMSO - dimetylosulfotlenek EIA - test immuno-enzymatyczny FBS - p lodowa surowica bydl eca H 2 O 2 - nadtlenek wodoru HRP - peroksydaza chrzanowa ID - sródskórnie Ig - immunoglobulina IL-12 - interleukina 12 IP - dootrzewnowo IV - do zylnie Mab - przeciwcia lo monoklonalne OD - g esto sc optyczna OPD - dihydrochlorek o-fenylenodiaminy PEG - glikol polietylenowy PSA - penicylina, streptomycyna, amfoterycyna RT - temperatura pokojowa SQ - podskórnie v/v - obj eto sc/obj etosc w/v - masa/obj eto sc Materia ly i Metody Zwierz eta Transgeniczne myszy zdolne do ekspresji ludzkich przeciwcia l s a znane w tej dziedzinie (i s a dost epne (np. z GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, i z innych firm) i za-PL 205 786 B1 36 chodzi w nich ekspresja ludzkich immunoglobulin, ale nie mysich IgM lub Ig. Na przyk lad, takie trans- geniczne myszy posiadaj a sekwencje ludzkich transgenów, w których nast epuje laczenie si e V(D)J, zmiany klasy ci ezkich la ncuchów i mutacje somatyczne, co pozwala na wytworzenie szerokiego reper- tuaru sekwencji ludzkich immunoglobulin (Lonberg i wsp., Nature 368: 856-859 (1994)). Transgen lekkiego lancucha mo ze pochodzi c np. czesciowo z klonów dro zd zowych posiadaj acych sztuczny dro zd zowy chromosom zawieraj acy blisko po low e ludzkiego regionu V kodowanego w linii komórek zarodkowych. Dodatkowo, transgen la ncucha ciezkiego mo ze kodowa c zarówno ludzkie regiony µ i 1 (Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)) i/lub 3 regiony sta le. W celu otrzymania w pe lni ludzkich, monoklonalnych przeciwcia l anty-IL-12 do procesu immunizacji i fuzji mo zna wyko- rzysta c myszy pochodz ace z odpowiednich genotypowo linii. Immunizacja Do otrzymania ludzkich hybrydom anty-IL-12 mo zna wykorzysta c jeden lub wi ecej trybów im- munizacyjnych. Kilka pierwszych fuzji mo ze by c wykonanych wed lug nast epuj acego, przyk ladowego protoko lu immunizacyjnego, przy czym mog a by c wykorzystane tak ze inne, znane, podobne protoko ly. Kilka samic w wieku 14-20 tygodni i/lub chirurgicznie wykastrowanych transgenicznych samców my- szy immunizuje si e IP i/lub ID 1 - 10000 µg rekombinowanej ludzkiej IL-12, zemulgowanej w równej obj eto sci TITERMAX lub pe lnego adiuwanta Freunda w ko ncowej obj eto sci 100-400 µl (np. 200). Ka zdej z myszy mo zna opcjonalnie poda c SQ 1-10 µg soli fizjologicznej na ka zde z 2 miejsc nastrzyk- ni ecia. Myszy mo zna nast epnie immunizowa c 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 i/lub 21-34 dni pó zniej przez podanie IP (1-400 µg) i SQ (1-400 µg x 2) IL-12 zemulgowanej w równej obj eto sci TITERMAX lub niekomletnego adiuwanta Freunda. Myszy mo zna skrwawi c w 12-25 i 25-45 dni pó zniej przez punkcj e oczodo low a bez zastosowania antykoagulantów. Krew krzepnie przez godzin e w RT, nast epnie zbie- rana jest surowica i oznaczane jest miano przeciwcia l w tescie EIA dla IL-12, wed lug znanych metod. Fuzje wykonuje si e, gdy ponawiane nastrzykni ecia nie wywo luj a wzrostu mian. Wtedy mo zna poda c myszy ostateczny zastrzyk przypominaj acy w postaci 1-400 µg IL-12 rozpuszczonej w 100 µl soli fizjo- logicznej. Trzy dni pó zniej myszy usypia si e przez przerwanie rdzenia kr egowego, pobierane s a ste- rylnie sledziony, zalewane nast epnie 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforano- wym (PBS), zawieraj acym 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny i 0,25 µg/ml amfoterycyny B (PSA). Splenocyty pobiera si e sterylnie przez p lukanie sledziony PSA-PBS. Komórki nast epnie p lucze sie jednokrotnie zimnym PSA-PBS, zlicza przez eliminacj e komórek martwych w te scie z b lekitem trypanu i zawiesza w pozywce RPMI 1640 zawieraj acej 25 mM Hepes. Fuzje komórkowe Fuzje mo zna przeprowadza c zgodnie z powszechnie znanymi sposobami, przy stosunku od 1:1 do 1:10 mysich komórek szpiczaka do zywych komórek sledziony. W nie ograniczaj acym przyk ladzie, komórki sledziony osadza si e razem z komórkami szpiczaka. Osad nast epnie wolno zawiesza si e, przez ponad 30 sekund w 1 ml 50% (w/v) roztworu PEG/PBS (PEG o masie o cz asteczkowej 1450, Sigma) w 37°C. Fuzj e mo zna nast epnie zatrzyma c przez wolne dodawanie 10,5 ml po zywki RPMI 1640 o zawieraj acej 25 mM Hepes (37°C) przez ponad 1 minut e. Polaczone komórki nast epnie wiruje sie przez 5 minut przy 500-1500 rpm. Nast epnie komórki zawiesza si e w po zywce HAT (po zywce RPMI 1640 zawieraj acej 25 mM Hepes, 10% surowic e Fetal Clone I (Hyclone), 1 mM pirogronianu sodu, 4 mM L-glutaminy, 10 µg/ml gentamycyny, 2,5% suplementu do hodowli Origen (Fisher), 10% kondycjonowanych po zywek RPMI 1640/Hepes 653, 50 µM 2-merkaptoetanolu, 100 µM hipoksantyny, 0,4 µM aminopteryny i 16 µM tymidyny) i wysiewa si e po 200 µl/studzienk e na pi etna scie 96-stu- dzienkowych, p laskodennych p lytek do hodowli komórkowych. P lytki umieszcza si e na 7-10 o dni w nawil zanym inkubatorze w 37°C, w 5% CO 2 i 95% powietrza. Wykrywanie ludzkich przeciwcia l IgG anty-IL-12 w mysiej surowicy Do sprawdzania obecno sci w mysiej surowicy ludzkich przeciwcia l IgG specyficznych dla ludz- kiej IL-12 wykorzystuje si e testy EIA na fazie sta lej. Pokrótce, p lytki pokrywa si e IL-12 przez inkubacj e przez noc w roztworze PBS z IL-12 w st ezeniu 2 µg/ml. Po p lukaniu w 0,15 M roztworze chlorku sodu zawieraj acym 0,02% (v/v) Tween 20 p lytki blokuje si e 1% (w/v) BSA w PBS, 200 µl/studzienk e przez 1 godzin e w RT. P lytki natychmiast zamra za si e w -20°C przed dalszym u zytkiem. Po 50 µl/studzienk e rozcie ncze n mysiej surowicy inkubuje si e na p lytkach pokrytych IL-12 przez 1 godzin e w RT. P lytki p lucze si e, a nast epnie inkubuje z kozim przeciwcia lem przeciwko ludzkiej IgG, specyficznym dla Fc, rozcie nczonym 1:30000 w 1% BSA-PBS przez 1 godzin e w RT. P lytki ponownie p lucze si e i dodaje sie na 15 minut w RT po 100 µl/studzienk e cytrynianowo-fosforanowego roztworu substratu (0,1 M kwasu cytrynowego, 0,2 M fosforanu sodu, 0,01% H 2 O 2 1 mg/ml OPD). Dodaje si e po 25 µl/studzienk ePL 205 786 B1 37 roztworu zatrzymuj acego (4N kwas siarkowy) i odczytuje si e OD przy 490 nm z u zyciem automatycz- nego spektrofotometru szalkowego. Wykrywanie w pe lni ludzkich immunoglobulin w supernatantach hybrydom Wzrastaj ace hybrydomy, wydzielaj ace w pe lni ludzkie immunoglobuliny wykrywa si e w odpo- wiednim te scie EIA. W skrócie, 96-studzienkowe p lytki typu pop-out (VWR, 610744) pokrywa si e ko- zim IgG przeciw ludzkiemu Fc inkubuj ac w roztworze 10 µg/ml tego przeciwcia la w buforze w eglanu sodu przez noc w 4°C. P lytki p lucze si e i blokuje si e 1% BSA-PBS przez 1 godzin e w 37°C i natych- miast u zywa lub zamra za w - 20°C. Na p lytkach inkubuje si e nierozcie nczane supernatanty hybrydom przez 1 godzin e w 37°C. P lytki p lucze si e a nast epnie inkubuje ze znakowanym HRP kozim przeciw- cia lem przeciw ludzkiemu kappa, rozcie nczonym 1:10000 w 1% BSA-PBS przez 1 godzin e w 37°C. P lytki nast epnie inkubuje si e z roztworem substratu tak jak opisano powy zej. Oznaczenie w pe lni ludzkiej reaktywno sci anty-IL-12 Powy zsze hybrydomy mo zna jednocze snie przetestowa c pod k atem reaktywno sci wzgl edem IL-12 stosuj ac odpowiedni RIA lub inny test. Na przyk lad, supernatanty inkubuje si e na p lytkach pokry- tych kozim przeciwcia lem przeciw ludzkiemu Fc IgG, tak jak opisano powy zej, p lytki p lucze si e i inku- buje z wyznakowan a radioaktywnie IL-12 przy odpowiedniej ilo sci zlicze n na studzienk e przez 1 go- dzin e w RT. Studzienki p lucze si e dwukrotnie PBS i zwi azan a znakowan a radioaktywnie IL-12 zlicza z u zyciem odpowiedniego licznika. Hybrydomy wydzielaj ace ludzkie IgG1 anty-IL-12 namna za si e w hodowli komórkowej i stop- niowo subklonuje przez odpowiednie rozcie nczenia. Otrzymane populacje klonalne namna za si e i zabezpiecza przez zamro zenie w ciek lym azocie w po zywce do zamra zania (95% FBS, 5% DMSO). Izotypowanie Oznaczanie izotypu przeciwcia l mo zna wykona c wykorzystuj ac EIA w sposób podobny do u zy- tego do przeszukiwania immunizowanych mysich surowic pod wzgl edem specyficznych mian. 96-stu- dzienkowe p lytki pokrywa si e IL-12 jak opisano powy zej i inkubuje z oczyszczonym przeciwcia lem w st ezeniu 2 µg/ml przez jedn a godzin e w RT. P lytk e p lucze si e i inkubuje z kozim przeciwcia lem przeciw ludzkim IgG 1 znakowanym HRP lub z kozim przeciwcia lem przeciw ludzkim IgG 3 znakowanym HRP, rozcie nczonymi 1:4000 w 1% BSA-PBS przez jedn a godzin e w RT. P lytki nast epnie p lucze si e i inkubuje z roztworem substratu tak jak opisano powy zej. Kinetyka wi azania ludzkich przeciwcia l przeciw ludzkiej IL-12 z ludzk a IL-12 Charakterystyka wi azania przeciwcia l mo ze zosta c odpowiednio wyznaczona z wykorzystaniem np. zatrzymywania IL-12 w EIA i technologii BIAcore. W opisanych powy zej oznaczeniach mo zna ocenia c ró zne st ezenia oczyszczonych ludzkich przeciwcia l IL-12 pod k atem wi azania do p lytek EIA, pokrytych 2 µg/ml IL-12. OD przedstawia si e jako pó llogarytmiczne wykresy pokazuj ace relatywne wydajno sci wi azania. Sta le ilo sciowe wi azania mo zna wyznaczy c np. tak jak przedstawiono poni zej lub inn a odpo- wiedni a, znan a metod a. Mikromacierz BIAcore CM-5 (karboksymetylowan a) umieszcza si e w urz a- dzeniu BIAcore 2000. Komor e przep lywow a macierzy przep lukuje si e buforem HBS (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% v/v substancji powierzchniowo czynnej P20, pH 7,4) w tempie 5 µl/minut e a z do osi agni ecia stabilnego odczytu linii podstawowej. Roztwór (100 µl) 15 mg EDC (chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dimetylo-aminopropylo)karbodiimidu) w 200 µl wody, dodaje si e do 100 µl roztworu 2,3 mg NHS (N-hydroksysukcynoimidu) w 200 µl wody. Na macierz nastrzykuje si e czterdzie sci (40) µl otrzymanego roztworu. Na macierz nastrzykuje si e 6 µl roztworu ludzkiej IL-12 (15 µg/ml w 10 mM octanie sodu, pH 4,8) co powoduje wzrost o ok. 500 RU. Bufor zmienia si e na bufor roboczy TBS/Ca/Mg/BSA (20 mM Tris, 0,15 M chlorek sodu, 2 mM chlorek wapnia, 2 mM octan magnezu, 0,5% Triton X-100, 25 µg/ml BSA, pH 7,4) i p lucze si e przez noc, aby zrównowa zy c macierz i osi agnac hydroliz e lub zabezpieczenie wszystkich nie utworzonych estrów sukcynoimidowych. Przeciwcia la rozpuszcza si e w buforze roboczym, w st ezeniach 33,33, 16,67, 8,33 i 4,17 nM. Tempo przep lywu ustala si e na 30 µl/min, a temperature pracy urz adzenia na 25°C. Do prób kinetyki wykorzystuje si e dwie komory przep lywowe, przy czym na jednej z nich zwi azana jest IL-12 (próba badana) a druga to niezmodyfikowana komora przep lywowa (próba slepa). Po 120 µl ka zdego ze st eze n przeciwcia l wstrzykuje si e do komory przep lywowej w tempie 30 µl/min (faza asocjacji), na- st epnie p lucze si e nieprzerywanym przep lywem buforu przez 360 sekund (faza dysocjacji). Po- wierzchni e macierzy regeneruje si e (rozdysocjowuje kompleks IL-12/przeciwcia lo) przez dwukrotne wstrzykniecie 30 µl 2 M rodanku guanidyny.PL 205 786 B1 38 Analiz e danych przeprowadza si e standardowo z u zyciem BIA wersja 3.0 lub CLAMP 2.0. Dla ka zdego ze st eze n przeciwcia l sensogram slepy odejmuje si e od sensogramu próby. Wykonuje si e globalne dopasowanie zarówno dla dysocjacji (k d , sec -1 ) jak i asocjacji (k a , mol -1 , sec -1 ) i wylicza si e (k d /k a ) sta la dysocjacji (K D , mol). Je zeli powinowactwo przeciwcia l jest wysokie tak, ze RU zatrzyma- nego przeciwcia la wynosz a 100 wykonuje sie prób e z dodatkowymi rozcie nczeniami przeciwcia la. Wyniki i dyskusja Otrzymanie monoklonalnych przeciwcia l przeciw ludzkiej IL-12 Wykonano kilka fuzji i ka zda fuzja zosta la wysiana na 15 p lytkach (1440 studzienek/fuzj e), co da lo kilkadziesi at rodzajów przeciwcia l specyficznych dla ludzkiej IL-12. Stwierdzono, ze cze sc z nich z lo zona jest z kombinacji la ncuchów ludzkich i mysich Ig. Pozosta le hybrydomy wydzielaj a przeciwcia- la anty-IL-12 sk ladaj ace si e wy lacznie z ludzkich lancuchów ciezkich i lekkich. Zak lada si e, ze wszyst- kie ludzkie hybrydomy s a klasy IgG1. Kinetyka wi azania ludzkich przeciwcia l przeciw ludzkiej IL-12 Analizy ELISA potwierdzaj a, ze oczyszczone przeciwcia la z wi ekszo sci hybrydom wi aza IL-12 w sposób zale zny od st eze n. Fig. 1-2 pokazuj a wzgl edn a wydajnosc wiazania tych przeciwcia l. W tym przypadku zmierzono zach lannosc wi azania przeciwcia l w stosunku do swojego antygenu (epitopu). Trzeba zauwa zy c, ze wi azanie IL-12 bezpo srednio do p lytki EIA mo ze wywo la c denaturacj e bia lka i obserwowane powinowactwo wi azania mo ze nie odzwierciedla c wi azania do niezdenaturowanego bia lka. Przy ró znych stezeniach obserwuje sie pi ecdziesi ecioprocentowa wydajnosc. Sta le ilo sciowe wi azania ludzkich przeciwcia l wyznacza si e przez analiz e metod a BIAcore i wy- kazuj a one, ze kilka ludzkich przeciwcia l monoklonalnych posiada bardzo wysokie powinowactwo z K D w zakresie od 1x10 -9 do 7x10 -12 . Wnioski Przeprowadza si e kilka fuzji z wykorzystaniem splenocytów z myszy hybrydowych posiadaj a- cych transgeny ludzkich zmiennych i sta lych rejonów przeciwcia l, immunizowanych ludzk a IL-12. Wy- twarza si e zestaw kilku w pe lni ludzkich, reaguj acych z IL-12 monoklonalnych przeciwcia l IgG izotypu IgG1. Nast epnie charakteryzuje si e w pe lni ludzkie przeciwcia la anty-IL-12. Kilka wytworzonych prze- ciwcia l posiada sta le powinowactwa pomi edzy 1x10 -9 a 9x10 -12 . Nieoczekiwanie wysokie powinowac- two tych w pe lni ludzkich, monoklonalnych przeciwcia l czyni je odpowiednimi do zastosowa n terapeu- tycznych w chorobach, patologiach lub zaburzeniach zwi azanych z IL-12. P r z y k l a d 3: C340 to neutralizuj ace ludzkie przeciwcia lo monoklonalne Pokazano, ze aktywno sc biologiczna IL-12 jest neutralizowana przez C340 w rozmaitych te- stach aktywno sci zale znych od IL-12. Poniewa z IL-12 wzmaga wytwarzanie IFN GAMMA przez ko- mórki NK i limfocyty T, badano wp lyw przeciwcia la C340 na podwy zszenie poziomu mRNA IFN GAMMA i wp lyw C340 na wytwarzanie bia lka IFN GAMMA (Trinchieri, G., Current Opinion in Immuno- logy, 9: 17-23 (1997), Morris, S. C, i wsp., Journal of Immunology, 152: 1047-1056 (1994)). Badano równie z zdolnosc C340 do kierowanej przez IL-12 neutralizacji indukcji aktywno sci komórek zabójców aktywowanych limfokin a (LAK) (Kutza, J. and Murasko, D. M., Mechanisms of Ageing and Deve- lopment, 90: 209-222 (1996), Stem, A. S., i wsp., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 87 : 6808-6812 (1990)). Wreszczie, testowano wp lyw C340 na podwy zszenie za po sred- nictwem IL-12 poziomu ekspresji CD95 na powierzchni komórek T i NK (Medvedev, A. E., i wsp., Cy- tokine, 9: 394404 (1997)). Inhibicja transkrypcji mRNA dla IFN gamma Przeprowadzono test oparty na reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR, aby okre sli c czy C340 ha- muje transkrypcj e genu IFN GAMMA indukowan a IL-12 i IL-2 w ludzkich PBL. Do amplifikacji cDNA otrzymanego dla stymulowanych ludzkich PBL u zyto specyficznych starterów dla ß-aktyny (jako kon- troli jako sci i ilo sci mRNA) i dla IFN GAMMA. Fig. 3 pokazuje, ze C340 negatywnie reguluje mRNA IFN GAMMA w aktywowanych IL-12/IL-2 PBMC (godzina 2). Inhibicja wewn atrzkomórkowego IFN GAMMA mierzona metod a cytometrii przep lywowej W odpowiedzi na szereg sygna lów i jako srodek aktywacji, komórki T i NK mog a by c pobudzone do wydzielania cytokin. Dok ladniej, PBL potraktowane IL-2 i IL-12 zaczynaj a po 4 do 8 godzinach od stymulacji intensywn a syntez e IFN GAMMA. Produkcja ta mo ze by c wykryta w cytoplazmie PBL trak- towanych Brefeldyn a-A metod a cytometrii przep lywowej. Na Fig. 4 pokazano 60% spadek produkcji IFN GAMMA w hodowlach, do których dodano na piec godzin C340 dla IL-12 w po laczeniu z IL-12.PL 205 786 B1 39 Inhibicja indukowanego przez IL-12 wydzielania IFN GAMMA Fig. 5 pokazuje wyra znie, ze dwa ró zne preparaty C340 hamuj a wydzielanie IFN GAMMA przez limfocyty krwi obwodowej w sposób zale zny od dawki. Czterysta pikogramów IL-12 wst epnie zmiesza- no z C340 w ró znej ilo sci i nast epnie dodano do stymulowanych IL-2 hodowli PBL. Gdy zmierzono IFN GAMMA w te scie EIA po 18-24 godzinach inkubacji, wykryto zauwa zalne zmniejszenie ilo sci IFN GAMMA ju z przy tak ma lej ilo sci przeciwcia la C340 jak 1 pg/ml w hodowli. Inhibicja indukowanej przez IL-12 cytotoksyczno sci komórek LAK Komórki Raji, linia komórkowa wywodz aca si e z wra zliwego na IL-12 ch loniaka Burkitt'a, s a odporne na komórki NK i wra zliwe na komórki LAK. Komórki Raji hodowano, w trzech powtórze- niach, przez cztery godziny z komórkami LAK aktywowanymi 400 pg/ml IL-12 i 10 U/ml IL-2 w obec- no sci lub przy braku ludzkiego, monoklonalnego przeciwcia la C340 (5000 ng/ml lub 50 ng/ml). Fig. 6 pokazuje wyniki dla trzech normalnych, zdrowych dawców. W wyniku aktywacji komórek efektoro- wych IL-12+IL-2 obserwowano wzrost aktywno sci cytotoksycznej w porównaniu do komórek akty- wowanych jedynie IL-2. Przeciwcia lo C340 hamowa lo efekt zale zny od IL-12. Wzrost hamowania zale za l od st ezenia przeciwcia la, przy najwy zszych testowanych st ezeniach obserwowano redukcje cytotoksyczno sci do poziomów t la. Inhibicja pozytywnej regulacji CD95 Przedstawiono wyniki opisuj ace indukowany IL-12 wzrost ilo sci CD95 na powierzchni PBL wy- soko oczyszczonych CD56+. Jak mo zna zauwa zy c na Fig. 7A i 7B, analiza metod a rozdzia lowej cy- tometrii przep lywowej wykaza la, ze ekspresja CD95 by la znacz aco wzmo zona na komórkach T CD3+ i komórkach NK CD56+, po potraktowaniu ich IL-12 plus IL-2 przez 72 godziny. Traktowanie miesza- nin a anty-IL-12 hamowa lo ekspresj e CD95 zarówno w populacjach CD3+ jak i CD56+. Komórki CD3 + by ly hamowane w ~ 50% (Fig. 7A) za s komórki CD56+ by ly hamowane w ~ 85% (Fig. 7B), inhibicj e okre slano poprzez zmniejszenie indeksu MFI (procent wi ekszy ni z nie stymulowanej kontroli). P r z y k l a d 4: Klonowanie i charakterystyka genów Sklonowano i oczyszczono fragmenty genomowego DNA zawieraj acego zarówno geny ci ezkie- go lancucha C340 lub lekkiego la ncucha C340. DNA genomowy wyizolowany z komórek hybrydom C340 zosta l cz esciowo strawiony enzymem restrykcyjnym Sau3A i rozdzielony pod wzgl edem masy przez wirowanie w gradiencie 10-40% sacharozy. Fragmenty DNA o wielko sci 15-23 kb zosta ly sklo- nowane na wektorze EMBL3, pochodnym bakteriofaga [komercyjnie dost epnym i zapakowane do cz astek faga. Kilka reakcji pakowania da lo bibliotek e 1 miliona klonów bakteriofagowych. Oko lo 600000 klonów z biblioteki przeszukano poprzez hybrydyzacj e lysinkow a z wykorzystaniem jako sond, znakowanych 32 P fragmentów genomowych DNA zawieraj acych zarówno sekwencje ludzkich regio- nów sta lych lancuchów ci ezkich IgG1 lub sekwencje ludzkich regionów sta lych la ncuchów lekkich kappa. Wykryto trzyna scie klonów la ncuchów ci ezkich i dziewi ec klonów lancuchów lekkich. Spo sród tych klonów po dwóch dodatkowych rundach przeszukiwania oczyszczono trzy klony ci ezkich lancu- chów i cztery klony lancuchów lekkich. Dzi eki analizie PCR DNA bakteriofagowego wykazano, ze jeden z klonów lancuchów ciezkich i dwa z klonów la ncuchów lekkich zawieraj a 5' i 3' ko nce se- kwencji koduj acych. Wstawka DNA w klonie H4 la ncucha ci ezkiego (HC) by la wielko sci 16 kb i zawiera la fragment 3,6 kb sekwencji flankuj acej 5' i przynajmniej 2 kb sekwencji flankuj acej 3'. Wstawka DNA w klonie LC1 la ncucha lekkiego (LC) by la wielko sci 15 kb i zawiera la fragment 4,4 kb sekwencji flankuj acej 5' i 6,0 kb sekwencji flankuj acej 3'. Pe lne wstawki zosta ly wyci ete z wektora bakteriofagowego jako fragmenty Sall i sklonowane pomi edzy miejsca XhoI i Sall plazmidowego wek- tora ekspresyjnego p1351, który dostarczy l jako markera selekcyjnego gen gpt. Poniewa z w obr ebie sekwencji koduj acej rejon zmienny lancucha ciezkiego znajdowa lo si e wewn etrzne miejsce Sall, trze- ba by lo przeniesc do wektora ekspresyjnego p1351 dwa fragmenty Sall z bakteriofaga H4. Otrzymane plazmidy ekspresyjne dla la ncuchów ci ezkich i lekkich nazwano odpowiednio p1560 i p1558. Orienta- cje genów la ncuchów ci ezkich i lekkich w tych dwu plazmidach, w stosunku do sekwencji wektora p1351, wyznaczono z u zyciem odpowiednio analizy enzymami restrykcyjnymi i PCR. W obu przypad- kach orientacja by la taka, ze 5' koniec genu Ab by l proksymalny w stosunku do 3' ko nca genu gpt. Zsekwencjonowano obie nici rejonów koduj acych sklonowanych genów. Sekwencje plazmidów p1560 i p1558 przedstawiono odpowiednio na Fig. 11A-11K i Fig. 13A-13J. P r z y k l a d 5: Wytwarzanie rekombinowanych linii komórkowych Plazmid p1560 lancucha ci ezkiego zosta l zlinearyzowany przez trawienie enzymem restrykcyj- nym Pvul a plazmid p1558 lancucha lekkiego zosta l zlinearyzowany przez trawienie enzymem restryk- cyjnym Sall. Komórki p3X63Ag8.653 (653) i komórki SP2/0-Ag14 (SP2/0) zosta ly oddzielnie stransfe-PL 205 786 B1 40 kowane wcze sniej zmieszanymi zlinearyzowanymi plazmidami przez elektroporacj e, dalej hodowano komórki i selekcjonowano transfektanty z kwasem mikofenolowym, tak jak to opisano wcze sniej (Kni- ght i wsp., Molecular Immunology 30: 1443 (1993)). Supernatanty komórkowe znad kolonii opornych na kwas mikofenolowy by ly testowane w dwa tygodnie pó zniej na obecnosc ludzkich IgG (np. rekom- binowanego C340 (rC340)). W tym celu supernatanty inkubowano na 96-studzienkowych p lytkach ELISA pokrytych kozimi przeciwcia lami specyficznymi dla cz esci Fc ludzkiego IgG. Ludzkie IgG zwi a- zane do pokrytej p lytki by ly wykrywane z wykorzystaniem koniugatu koziego przeciwcia la przeciwko ludzkiemu IgG ( lancuch ci ezki + lancuch lekki) z alkaliczn a fosfataz a oraz substratów dla alkalicznej fosfatazy, tak jak to opisano (Knight, i wsp., Molecular Immunology 30: 1443 (1993)). Komórki klonów o wysokiej produkcji przeniesiono na 24-studzienkowe p lytki hodowlane do standardowej po zywki i namno zono (IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamina, mieszanina selekcyjna z kwasem mikofenolowym). Ilosc wytwarzanych przeciwcia l (tzn. wydzielanych do po zywki w kulturach prowadzonych do ko nca) zostala dok ladnie okre slona w te scie ELISA z wykorzystaniem oczyszczonego mAb C340 jako stan- dardu. Wyselekcjonowane klony by ly nast epnie namna zane w butelkach T75 a produkcja ludzkich IgG przez te klony by la oznaczana w ELISA. Na podstawie tych warto sci subklonowano sze sc niezale z- nych transfektantów 653 i trzy niezale zne transfektanty SP2/0 (wysiewaj ac srednio jedn a komórk e na studzienk e, na 96-studzienkowych p lytkach), okre slono ilo sc wytwarzanych przez te subklony prze- ciwcia l testuj ac (ELISA) supernatanty znad kolonii poszczególnych subklonów. Do dalszych bada n wybrano trzy subklony, transfektanta 653 19-20 (C379B) i transfektanty SP2/0 84-81 (C381A) i 22-56 (C389A). Test wi azania antygenu przez rC340 Wcze sniej, przed subklonowaniem wybranych linii komórkowych w sposób opisany powy zej, supernatanty z trzech linii rodzicielskich (transfektanty 653 klon 2 i klon 18 oraz transfektant SP2/0 klon 1) zosta ly wykorzystane do okre slenia charakterystyki wi azania antygenu przez rC340. Najpierw okre slono st ezenie rC340 dla trzech próbek supernatantów komórkowych w ELISA. Próbki superna- tantów, w których mianowano ilo sc przeciwcia l lub oczyszczone C340 jako kontrola pozytywna by ly nast epnie inkubowane na 96-studzienkowych p lytkach pokrytych 2 µg/ml ludzkiej IL-12. Nast epnie zwi azane mAb by lo wykrywane z wykorzystaniem koniugatu koziego przeciwcia la anty-ludzkie IgG ( lancuch ci ezki + lancuch lekki) z alkaliczn a fosfataz a oraz odpowiednich substratów dla alkalicznej fosfatazy. Jak pokazano na Fig. 8, rC340 wi aza lo si e specyficznie do ludzkiej IL-12, w sposób nieroz- ró znialny od oryginalnego mAb C340. Charakterystyka wyselekcjonowanych linii komórkowych Wykonano analizy krzywych wzrostowych dla C379B, C381A i C389A wysiewaj ac komórki w butelkach T75 przy pocz atkowej g esto sci komórek 2 X 10 5 komórek/ml w standardowej po zywce lub w SFM-5 po zywce wolnej od surowicy i monitorowano codziennie ilo sc komórek oraz st ezenie rC340 a z do konca hodowli. Wyniki dla hodowli prowadzonych w po zywce standardowej pokazano na Fig. 9A - 9C. Maksymalne poziomy produkcji mAb C340 dla C379B, C381A i C389A to odpowiednio 135 µg/ml, 150 µg/ml i 110 µg/ml- Nie powiodly si e próby przystosowania komórek C379B do po zywki SFM-5. Komórki C381A wytwarza ly takie same ilo sci rC340 w po zywce SFM-5 jak w po zywce stan- dardowej, za s komórki C398A wytwarza ly jedynie po low e ilo sci rC340 w po zywce SFM-5 w stosunku do po zywki standardowej. Stabilnosc produkcji rC340 w czasie dla trzech subklonów wyznaczono hoduj ac komórki na 24-studzienkowych szalkach z po zywk a standardow a lub z po zywk a standardow a bez selekcji kwa- sem mikofenolowym dla ró znych przedzia lów czasowych. Zaobserwowano, ze linie C379B i C381A stabilnie wytwarza ly rC340 w obecno sci lub przy braku selekcji, odpowiednio przez okres 30 dni (mak- symalny testowany czas) i 75 dni. Linia C389A by la niestabilna i po 43 dniach hodowli wytwarza la jedynie 20% przeciwcia l w stosunku do pocz atku badania. Jest jasne, ze wynalazek mo ze by c realizowany w sposób inny ni z opisany w przedstawionym opisie i przyk ladach.PL 205 786 B1 41PL 205 786 B1 42PL 205 786 B1 43PL 205 786 B1 44PL 205 786 B1 45PL 205 786 B1 46PL 205 786 B1 47 PL PL PL

Claims (16)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Kwas nukleinowy koduj acy ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 posiadaj ace region zmienny la n- cucha ciezkiego o sekwencji SEQ ID NO:7 oraz region zmienny la ncucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO:8.

2. Kwas nukleinowy wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeciwcia lo stanowi przeciwcia lo ludzkie.

3. Kwas nukleinowy wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze przeciwcia lo ma stala powi- nowactwa pomi edzy 1x10 9 a 7x10 12 .

4. Prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, znamienna tym, ze zawiera kwas nukleinowy okre slony w zastrz. 1.

5. Komórka wed lug zastrz wed lug zastrz. 4, znamienna tym, ze kwas nukleinowy koduje ludz- kie przeciwcia lo anty-IL-12.

6. Komórka wed lug zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, ze przeciwcia lo ma sta la powinowactwa pomi edzy 1x10 9 do 7x10 12 .

7. Ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 posiadaj ace region zmienny lancucha ciezkiego o sekwencji SEQ ID NO: 7 oraz region zmienny lancucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO: 8.

8. Przeciwcia lo wed lug zastrz. 7, znamienne tym, ze stanowi przeciwcia lo ludzkie.

9. Przeciwcia lo wed lug zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, ze ma sta la powinowactwa pomiedzy 1x10 9 do 7x10 12 .

10. Przeciwcia lo okre slone w jednym z zastrz. 7 do 9, do zastosowania w diagnozowaniu lub le- czeniu.

11. Przeciwcia lo okre slone w jednym z zastrz. 7 do 9, do zastosowania w leczeniu luszczycy.

12. Przeciwcia lo okre slone w jednym z zastrz. 7 do 9, do zastosowania w leczeniu luszczycowe- go zapalenia stawów, sarkoidozy albo patologii Crohna.

13. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera: (a) przeciwcia lo okre slone w jednym z zastrz. 7 do 9, i (b) farmaceutycznie dopuszczalny no snik lub rozcie nczalnik.

14. Kompozycja farmaceutyczna okre slona w zastrz. 13, do zastosowania w diagnozowaniu lub leczeniu.

15. Kompozycja farmaceutyczna okre slona w zastrz. 13, do zastosowania w leczeniu luszczycy.

16. Kompozycja farmaceutyczna okre slona w zastrz. 13, do zastosowania w leczeniu luszczyco- wego zapalenia stawów, sarkoidozy lub patologii Crohna.PL 205 786 B1 48 RysunkiPL 205 786 B1 49PL 205 786 B1 50PL 205 786 B1 51PL 205 786 B1 52PL 205 786 B1 53PL 205 786 B1 54PL 205 786 B1 55PL 205 786 B1 56PL 205 786 B1 57PL 205 786 B1 58 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL PL