PL203789B1 - Kompozycje wywołujące u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną i ich zastosowanie do wywoływania u kręgowca ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec eukariotycznego pasożyta, wydzielone lipoglikany oraz otrzymane z nich wydzielone oligosacharydy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są kompozycje wywołujące u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną i ich zastosowanie do wywoływania u kręgowca ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec eukariotycznego pasożyta, wydzielone lipoglikany oraz otrzymane z nich wydzielone oligosacharydy.

Pasożyty zwierząt i ludzi stanowią ogólnoświatowy problem. Np., schistosomatoza, po malarii, jest najpospolitszym powodem zachorowalności i śmiertelności ludzi. Około 600 milionów ludzi jest zagrożonych infekcją przywr, a w przybliżeniu 200 milionów ludzi w 74 krajach jest zainfekowanych. 20 milionów ludzi (głównie dzieci) cierpi na ostre formy choroby, a 200000 umiera rocznie na chorobę.

Pasożyty ssaków, takie jak płazińce rodzajów Fasciola lub Schistosoma oraz pierwotniaki rodzaju Trichomonas, mogą unikać ataku układu odpornościowego i przeżywać miesiące lub lata w peł ni czynnym immunologicznie krę gowcu. Powierzchnia tych pasoż ytów ujawnia niezależ n ą od komórek T odpowiedź immunologiczną cechującą się dominującą produkcją przeciwciał IgM, lecz nie jest w stanie indukować niezależnej od komórek T odpowiedzi cechującej się wytwarzaniem izotypów IgG, IgE, i IgA przeciwciał.

Wytwarzanie IgG (jak też IgE i IgA) i ich wiązanie z zewnętrzem patogenu jest zwykle konieczne do zależnej od przeciwciała mediowanej przez komórkę cytotoksyczności, co jest mechanizmem wykazującym skuteczność w niszczeniu robaków pasożytniczych. Wiązanie zależnych od grasicy przeciwciał (IgG, IgE, i IgA) z zewnętrzem pozakomórkowych patogenów jest także zwykle konieczne do fagocytozy przez makrofagi gospodarza i innych funkcji immunologicznych zawartych w procesie aktywacji immunologicznej nazywanej „opsonizacją”. Opsonizacja jest mechanizmem immunologicznym często związanym z niszczeniem pozakomórkowych pasożytów pierwotniakowych. Sądzi się ogólnie, że kilka pasożytów ssaka unika ataku układu odpornościowego nie indukując powierzchniowo specyficznych zależnej od komórek T funkcji, takich jak wytwarzanie IgG, IgE, i IgA.

Wynalazek jest oparty na wydzielaniu nowych lipoglikanów z powierzchni płazińców. Te lipoglikany, jak też inne wydzielone z pewnych pierwotniakowych pasożytów, można stosować w kompozycjach do hamowania, leczenia, lub diagnostyki pasożytniczej infekcji.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja wywołująca u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną wobec gatunku z rodzaju Schistosoma, która obejmuje grupę nośnikową sprzężoną z oligosacharydem otrzymanym z wydzielonego lipoglikanu zawierającego grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, dwie do czterech grup glukozaminowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup ramnozowych na grupę fukozy, i jedną do trzech grup mannozowych na grupę fukozy.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja wywołująca u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną wobec gatunku z rodzaju Fasciola, która obejmuje grupę nośnikową sprzężoną z oligosacharydem otrzymanym z wydzielonego lipoglikanu zawierającego grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grupy galaktozoaminowych na grupę fukozy, siedem do jedenastu grup glukozaminowych na grupę fukozy, trzy do pięciu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, i trzy do pięciu grup mannozowych na grupę fukozy. Korzystnie oligosacharyd zawiera ponadto inozytol.

Korzystnie w obu odmianach kompozycji, lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa i odpowiada lipoglikanowi znajdowanemu na powierzchni eukarionta. Przy czym w przypadku pierwszej z wymienionych kompozycji korzystniej jest, gdy eukariontem jest gatunek z rodzaju Schistosoma, a w przypadku drugiej - gatunek z rodzaju Fasciola.

W obu odmianach kompozycji korzystnie grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker, przy czym dodatkowo korzystnie przez 2-(4-aminofenylo)etyloaminę.

Korzystnie, w obu odmianach kompozycji, grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu. Dodatkowo korzystnie mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da.

Korzystnie oligosacharydy w obu kompozycjach zawierają nieredukującą grupę końcową.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie wyżej wymienionych kompozycji do wywoływania u kręgowca ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec eukariotycznego pasożyta.

Korzystnie, w przypadku zastosowania zarówno pierwszej, bądź drugiej z kompozycji eukariontem jest pierwotniak lub dorosły płaziniec. Przy czym w przypadku zastosowania pierwszej z wymienionych

PL 203 789 B1 kompozycji korzystnej dorosły płaziniec jest z rodzaju Schistosoma, a w przypadku drugiej - z rodzaju Fasciola.

W obu odmianach zastosowania korzystnie ochronna odpowiedź immunologiczna obejmuje przeciwciało odpowiedzi zależne od komórki T.

Korzystnie, w przypadku zastosowania pierwszej, bądź drugiej kompozycji lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa. Korzystnie, gdy grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker, a korzystniej przez 2-(4-aminofenylo)etyloaminę. Także korzystnie grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu. Dodatkowo korzystnie mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da. Również korzystnie gdy oligosacharyd zawiera nieredukującą grupę końcową.

Przedmiotem wynalazku są również wydzielone lipoglikany, znajdowane na powierzchni eukarionta. Pierwszy z nich obejmuje grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, dwie do czterech grup glukozaminowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup ramnozowych na grupę fukozy, i jedną do trzech grup mannozowych na grupę fukozy. Korzystnie otrzymuje się go z gatunków rodzaju Schistosoma i korzystnie zawiera on, na każdą grupę fukozy, cztery grupy galaktozoaminowe, trzy grupy glukozaminowe, dwie grupy galaktozowe, dwie grupy glukozowe, jedną do dwu grup ramnozowych, i dwie grupy mannozowe.

Drugi z wydzielonych lipoglikanów obejmuje grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, siedem do jedenastu grup glukozaminowych na grupę fukozy, trzy do pięciu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, i trzy do pięciu grup mannozowych na grupę fukozy. Korzystnie otrzymuje się go z gatunków rodzaju Fasciola i korzystnie zawiera on na każdą grupę fukozy, cztery grupy galaktozoaminowe, dziewięć grup glukozaminowych, cztery grupy galaktozowe, jedną grupę glukozową, i cztery grupy mannozowe.

Również korzystnie lipoglikan ten zawiera ponadto inozytol.

Korzystnie oba wydzielone lipoglikany mają masę cząsteczkową około 180 kD.

Przedmiotem wynalazku są ponadto wydzielone oligosacharydy otrzymane z wyżej wymienionych lipoglikanów.

Lipoglikan jest cząsteczką, która zawiera, co najmniej jedną grupę lipidową i co najmniej jedną grupę węglowodanową. Wydzielony lipoglikan jest preparatem lipoglikanu o konkretnej masie cząsteczkowej, który stanowi co najmniej 60% wagowych interesującego lipoglikanu. Oczywiście, lipoglikan można wydzielić i oczyścić do wyższych poziomów czystości, np., co najmniej 80%, 90%, lub 95%, kompozycji jest żądanym lipoglikanem. Pozostałe 40% może obejmować inne makrocząsteczki, takie jak lipidy, białka, węglowodany i lipoglikany niemające tej konkretnej masy cząsteczkowej. Lipoglikan może być wolny od naturalnie występujących reszt aminokwasowych. Masę cząsteczkową lipoglikanu określa się metodą elektroforezy na dodecylosiarczanie sodu-żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) w warunkach redukujących.

W niniejszym opisie, „ochronna odpowiedź immunologiczna” oznacza odpowiedź immunologiczną zdolną do zapobiegania, osłabiania lub hamowania wytwórczej infekcji pasożytem. W przypadku profilaktycznej kompozycji, gospodarz ludzki lub zwierzęcy nie musi być zainfekowany, tak więc kompozycja zapobiega lub hamuje (częściowo lub zupełnie) dowolną wytwórczą infekcję lub jeden lub więcej objawów wytwórczej infekcji powodowanej przez późniejsze wystawienia na działanie pasożyta. W przypadku leczniczej kompozycji, gospodarz ludzki lub zwierzęcy wykazuje trwającą wytwórczą infekcję, i kompozycja osłabia lub kończy wytwórczą infekcję. Wytwórczą infekcją jest infekcja, w której żywotne pasożyty można wydzielić z gospodarza. Ochronna odpowiedź immunologiczna obejmuje wytwarzanie przeciwciała IgG i aktywację komórki T. Ochronna kompozycja, np., szczepionka, wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną.

Grupa nośnikowa jest cząsteczką, który po sprzężeniu z oligosacharydem, pomaga prezentować oligosacharydowy antygen układowi odpornościowemu ssaka. Przykłady grup nośnikowych obejmują białka, takie jak albumina surowicy bydlęcej (BSA), anatoksyna tężca, albumina jaja kurzego i biał ko pasoż yta.

Adiuwant jest substancją, którą włącza się lub podaje się jednocześnie z kompozycjami według wynalazku. Adiuwanty zwiększają czas trwania lub poziom odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia po podawaniu antygenu. Adiuwant może także ułatwiać dostarczanie antygenu zwierzęciu lub do konkretnych tkanek, komórek, lub miejsc w ciele zwierzęcia. Przykłady adiuwantów obejmują, między

PL 203 789 B1 innymi, niekompletny Freunda, kompletny Freunda i ałun; i mogą zawierać skwalen (np., MF59, Chiron Corp, Emeryville, CA), monofosfolipid A (np., DetoxJ, Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), saponiny (QS-21, Cambridge Biotech, Cambridge, MA), niejonowe surfaktanty (NISV, Proteus, Cheshire, Wielka Brytania), tokole (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5667784), biodegradowalny-biokompatybilny poli(D,L-laktydo-ko-glikolid) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki Patent nr 5417986), immunostymulacyjne kompleksy (ISCOM), i/lub liposomy.

Nieredukująca grupa końcowa, należąca do cukru, oznacza cukier nieredukujący reagentu Benedicta w teście Benedicta dla cukrów redukujących; patrz, np., http://www.acp.edu/web/genchem/thedisk/food/bened/bened.htm).

Wydzielone lipoglikany są przydatne w wytwarzaniu leczniczych i profilaktycznych kompozycji, takich jak ochronne szczepionki, wobec pasożytów. Z kolei, kompozycje są przydatne w wywoływaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec pasożyta, jak wyszczególniono w zastosowaniach według wynalazku.

Wydzielone lipoglikany, wydzielone oligosacharydy, kompozycje i zastosowania według wynalazku stanowią nowe środki wytwarzania i stosowania szczepionek wobec licznych eukariotycznych pasożytów, takich jak płazińce i pierwotniaki. W odróżnieniu od wielu pasożytów w naturalnej infekcji, różne aspekty wynalazku dają możliwość stymulowania zależnych od komórek T odpowiedzi immunologicznych u zwierzęcia lub człowieka, w tym specyficznego dla pasożyta wytwarzania IgG. Kompozycje według wynalazku można stosować do wzbudzania specyficznych wobec lipoglikanu przeciwciał przydatnych w diagnozowaniu infekcji. Wydzielone lipoglikany według wynalazku można także stosować w testach diagnostycznych, w których lipoglikany według wynalazku wiążą się z przeciwciałami obecnymi w biologicznej próbce.

Jeśli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy użyte w wynalazku mają takie same znaczenia jak normalnie rozumie fachowiec w dziedzinie, do której należy wynalazek. Chociaż odpowiednie sposoby i substancje dla stosowania lub testowania niniejszego wynalazku opisano poniżej, można także stosować inne sposoby i substancje podobne lub równoważne z opisanymi w wynalazku, dobrze znane w dziedzinie.

Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, opisy patentowe i inne odnośniki wspomniane tutaj dołącza się jako odnośniki w całości. W przypadku konfliktu niniejszy opis, w tym definicje, będzie przeważał. Ponadto substancje, sposoby i przykłady są tylko ilustracją i nie mają stanowić ograniczeń.

Inne cechy i korzyści z wynalazku będą oczywiste z następującego szczegółowego opisu, i z zastrzeż e ń .

Przedmiotem wynalazku są nowe lecznicze i profilaktyczne kompozycje do stosowania w leczeniu infekcji pasożytami, np., przez wywoływanie ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec pasożytów. Liczne pasożyty nie są immunogenne, lub nie są dostatecznie immunogenne, aby spowodować skuteczną odpowiedź immunologiczną. Rozwiązania według wynalazku oferują strategię prezentacji antygenu pasożyta, która wytwarza ochronną odpowiedź immunologiczną. Ta strategia obejmuje wydzielenie lipoglikanu z powierzchni pasożyta, wytworzenie oligosacharydów z lipoglikanu, sprzęganie oligosacharydów z grupą nośnikową, i podawanie koniugatu oligosacharydyl/grupa nośnikowa szczepionemu ssakowi. Takie szczepienia oferują ochronną odporność, przez, co najmniej częściowo, indukowanie specyficznego wobec pasożyta wytwarzania IgG, jak wyszczególniono w przykładach poniżej.

Lipoglikany i kompozycje według wynalazku można stosować do szczepienia ssaka wobec licznych pasożytów. Jedną ogólną klasą pasożytów są robaki należące do typu płazińców. Płazińce obejmują pasożytnicze robaki płaskie klasy trematoda (np., robaki rodzaju Schistosoma, takie jak S. bovis, S. indium, S. japonicum, S. mattheei, S. spindale, S. haematobium, S. in-tercalatum, S. mansoni, lub S. mekongi; robaki rodzaju Fasciola, takie jak F. hepatica, F. gigantica, i F. jacksoni; oraz robak Fascioloides magna), które infekują ludzi i zwierzęta hodowlane. Płazińce obejmują także tasiemce klasy cestoidea, które infekują ludzi (robaki rodzaju Taenia) lub psy (robaki rodzaju Mesocestoides). Inną ogólną klasą pasożytów są pierwotniaki, takie jak rodzaju Trichomonas, Tritrichomonas, Leishmania lub Entamoeba. Trichomonas vaginalis jest szczególnie istotny w Stanach Zjednoczonych Ameryki i moż e powodować objawowe infekcje dróg moczowo-p łciowych.

Ogólne procedury wydzielania lipoglikanów, stosowania kompozycji według wynalazku opisano poniżej.

Wydzielanie lipoglikanów z pasożytów

Pasożyty są zwykle dostępne od dostawców, takich jak American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Np., T. vaginalis jest dostępny jako nr kat. 30001 z ATCC. Ponadto, F. hepatica

PL 203 789 B1 metacercariae można nabyć od Baldwin Enterprises, Monmouth, OR, lub wydzielić ze ślimaków wodnych, naturalnego gospodarza pasożyta. Pasożyty są także dostępne z różnych laboratoriów badawczych, w tym wspieranych przez Światową Organizację Zdrowia. Alternatywnie, można je wydzielić z naturalnych gospodarzy lub ze środowiska (np., Fasciola i z rzeźni lub Fascioloides z polowych stacji hodowli zwierzyny płowej).

Preparacja pasożyta na różnych stadiach jego cyklu życiowego jest znana w dziedzinie. Np., świeżo po opuszczeniu cysty młode F. hepatica (NEJ) można wydzielić według publikacji Hanna, Exp. Parasitol., 50: 103-114, 1980. Bardziej dojrzałe robaki można ogólnie wydzielić według Gibbsa i in., The Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, tom 2, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, str. 261-275, 1996.

Lipoglikany można wydzielić z pasożyta sposobami znanymi w dziedzinie.

Typowo, pasożyty przemywa się solanką buforowaną fosforanem (PBS), a następnie lipidy o niskiej masie cząsteczkowej na powierzchni pasożyta, w tym proste i złożone lipidy, można ekstrahować organicznymi rozpuszczalnikami. Te surowe lipidy o niskiej masie cząsteczkowej, które obejmują glicerofosfolipidy, glikoglicerolipidy i sfingolipidy, można ekstrahować roztworem chloroform/metanol/woda (3:2:1), jak opisano u Turco i in., J. Biol. Chem., 259: 3883-3889,1984; i Bennetta, Parasitol., 77: 325-332,1978. Alternatywnie, surowe lipidy można ekstrahować z roztworu heksan/izopropanol (3:2), jak opisano u Radina, Meth. Enzymol., 72: 5-7,1981.

Wybór sposobu ekstrakcji będzie zależał od pasożyta. Np., lipoglikan z Fasciola hepatica można wydzielać przez wstępne traktowanie tkanki pasożyta przez ekstrakcję chloroformem/metanolem/wodą lub heksanem/izopropanolem (patrz przykład 1 poniżej) aby wybiórczo usunąć lipidy o niskiej masie czą steczkowej. Z drugiej strony, lipoglikan ze Schistosoma mansoni nie moż e być wydzielony przy pomocy rozpuszczalnika chloroform/metanol/woda. Jednakże te lipidy o niskiej masie cząsteczkowej można wybiórczo ekstrahować stosując sposób z heksanem/izopropanolem (patrz przykład 2 poniżej). Ekstrakcja chloroformem/metanolem/wodą lub heksanem/izopropanolem w przypadku Fasciola hepatica, lub heksanem/izopropanolem w przypadku Schistosoma mansoni pozostawia resztę, z której lipoglikan można ekstrahować rozpuszczalnikiem E.

Lipoglikan można wydzielić z reszty lipidu o niskiej masie cząsteczkowej przez ekstrakcję roztworem wody, etanolu, eteru dietylowego, pirydyny i NH4OH (15:15:5:1:0,017), także nazywanym rozpuszczalnikiem E, jak opisuje Turco i in., supra. Ekstrakt rozpuszczalnika E osusza się dla oddzielenia lipoglikanu. Można przeprowadzić dodatkowe procedury dla dalszego oczyszczenia lipoglikanu, takie jak filtracja żelowa, chromatografia hydrofobowa oraz strącanie metanolem.

Wydzielone lipoglikany można określić stosując SDS-PAGE dla ustalenia ich mas cząsteczkowych. Ponadto profil monosacharydowy dla węglowodanowej części lipoglikanu można otrzymywać poddając lipoglikan kwasowej hydrolizie i analizie w układzie wysokowydajnej anionowymiennej chromatografii wyposażonym w pulsacyjny amperometryczny detektor stosowany według instrukcji wytwórcy. Takie układy i detektory są dostępne z Dionex, Inc., Sunnyvale, CA.

Wytwarzanie koniugatów oligosacharyd/grupa nośnikowa

Dla wytworzenia antygenu przydatnego w kompozycji leczniczej lub profilaktycznej, takiej jak szczepionka przeciwpasożytowa, uwalnia się oligosacharydy z wydzielonego lipoglikanu. Można tego dokonać stosując, np., standardową łagodną kwasową hydrolizę lub traktowanie glikozydazą. Patrz np., Semprevivo i in., Carbohy. Res., 177: 222-227, 1988. Dodatkowe oczyszczanie (np., metodą kolumnowej chromatografii) oligosacharydów można przeprowadzić w celu wydzielenia oligosacharydów o konkretnym zakresie rozmiarów (np., 800-3000 Da). Takie oligosacharydy mogą obejmować nieredukujące grupy końcowe, powtarzalne podjednostki, i/lub części rdzeniowe lipoglikanu. Ponadto, oligosacharydy otrzymane z konkretnego LG może zawierać te same reszty węglowodanowe, jak w samym LG.

Oligosacharydy lub mieszaninę oligosacharydów sprzęga się następnie z grupą nośnikową konwencjonalnymi sposobami z wytworzeniem skutecznych immunogenów, ponieważ, jako hapteny, same oligosacharydy są raczej słabymi immunogenami. Grupy nośnikowe mogą być dowolnym polipeptydem, organicznym polimerem, lub mniejszą cząsteczką odpowiednią do podawania ssakowi. Po sprzężeniu z oligosacharydami grupy nośnikowe polepszają prezentację epitopów oligosacharydów układowi odpornościowemu ssaka, tym samym indukując odpowiedź immunologiczną specyficzną dla oligosacharydów i, przez rozszerzenie, dla lipoglikanu na powierzchni pasożyta. Zastosowanie mieszaniny wielu różnych oligosacharydów pomaga zapobiegać adaptowaniu i unikaniu odpowiedzi immunologicznej przez docelowy eukariont.

PL 203 789 B1

Można stosować dowolny standardowy linker chemiczny (np., dwufunkcyjny linker zawierający, np., reaktywne grupy aminowe) dla sprzęgania oligosacharydów do grupy nośnikowej. Przykłady takich linkerów obejmują tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyniowy, 4-(4-N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylohydrazyd oraz pochodną izotiocyjanianu fenetyloaminy. Patrz np., Lee i in., Vaccine, 14: 190-198, 1996; Ragupathi i in., Glycoconjugate J., 15: 217-221, 1998; Roy i in., Canad. J. Biochem. Cell Biol., 62: 270-275, 1984; i Smith i in., Methods Enzymol., 50: 169-171, 1978.

Chemia i techniki odpowiednie dla sprzęgania oligosacharydów z grupą nośnikową, taką jak BSA, są znane w dziedzinie. Np., grupa karbonylowa terminalnej redukującej reszty monosacharydowej oligosacharydu może reagować z pierwszorzędową grupą alkiloaminową linkera, taką jak 2-(4-aminofenylo)etyloamina, z wytworzeniem związku pośredniego. Ten związek pośredni redukuje się następnie borowodorkiem sodu dla wytworzenia nietrwałego związku pośredniego i ułatwienia kondensacji pomiędzy terminalną aryloaminową grupą części linkera związku pośredniego i mostkiem diazowym i resztami, np., resztami lizyny, polipeptydowego nośnika, takiego jak BSA. Patrz, np., Zopf i in., Meth. Enzymol., 50: 163-169, 1978; i Semprevivo i in., supra.

Chociaż różne cząsteczki oligosacharydów pochodzące z trawienia pojedynczego źródła lipoglikanu sprzęga się z grupą nośnikową stosując powyższe sposoby, oligosacharydy z więcej niż jednego lipoglikanu (np., lipoglikany z dwu gatunków pasożytów) można także łączyć w pojedynczą grupę nośnikową. Takie wielospecyficzne koniugaty są szczególnie przydatne do wytwarzania ochronnych szczepionek o szerokim zakresie działania.

Wytwarzanie kompozycji zawierających koniugaty oligosacharyd/grupa nośnikowa

Kompozycje mogą obejmować jedną lub więcej różnych typów koniugatów oligosacharyd/grupa nośnikowa. Np., koniugaty wytwarzane z różnych lipoglikanów można mieszać ze sobą w tej samej kompozycji dla wytworzenia krzyżowej ochronnej kompozycji szczepionki. Ogólnie, kompozycje szczepionki mogą być profilaktyczne (dla niezainfekowanych osobników) lub lecznicze (dla osobników już zainfekowanych).

Kompozycje ewentualnie obejmują farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, taką jak rozcieńczalnik, solanka buforowana fosforanem lub wodorowęglan (np., 0,24 M NaHCO3). Zarobki stosowane w nowych kompozycjach może dobrać fachowiec w dziedzinie, na podstawie sposobu i drogi podawania, oraz standardowej farmaceutycznej praktyki, bez zbędnych eksperymentów. Odpowiednie farmaceutyczne zarobki i rozcieńczalniki, jak też farmaceutyczne dodatki dla ich stosowania, są opisane, np., w Remington's Pharmaceutical Sciences. Adiuwant, np., toksynę cholery, nietrwałą termicznie enterotoksynę Escherichia coli (LT), liposom, lub immunostymulacyjny kompleks (ISCOM), można także włączać w kompozycje szczepionki.

Dla skomponowania leczniczych kompozycji, koniugaty oligosacharyd/grupa nośnikowa można następnie oczyszczać standardowymi sposobami dla usunięcia zanieczyszczeń, takich jak endotoksyny, jeśli są obecne. Końcowy preparat koniugatu można liofilizować i umieszczać w zawiesinie w sterylnej, dejonizowanej wodzie. Moż na nastę pnie dodać odpowiednie farmaceutyczne zaróbki.

Lecznicze kompozycje można komponować jako roztwór, zawiesinę, czopek, tabletkę, granulko, proszek, kapsułki, maść lub krem. Przy wytwarzaniu tych kompozycji można włączać, co najmniej jedną farmaceutyczną zaróbkę. Przykłady farmaceutycznych zarobek obejmują rozpuszczalnik (np., wodę lub fizjologiczną solankę), środek solubilizujący (np., etanol, polisorbaty, lub Cremophor EL7), środek dla uzyskania izotoniczności, konserwant, środek przeciw utlenianiu, laktozę, skrobię, krystaliczną celulozę, mannitol, maltozę, wodorofosforan wapnia, lekki bezwodnik kwasu krzemowego, węglan wapnia, środek wiążący (np., skrobia, poliwinylopirolidon, hydroksypropyloceluloza, etyloceluloza, karboksymetyloceluloza, lub guma arabska), środek smarujący (np., stearynian magnezu, talk lub utwardzone oleje), lub stabilizator (np., laktoza, mannitol, maltoza, polisorbaty, makrogole, lub polioksyetylenowane utwardzane oleje rącznikowe). Jeśli to pożądane, można dodawać glicerynę, dimetyloacetamid, 70% mleczan sodu, surfaktant, lub zasadową substancję, taką jak wodorotlenek sodu, etylenodiamina, etanoloamina, wodorowęglan sodu, arginina, meglumina, lub trisaminometan. Biodegradowalne polimery, takie jak poli-D,L-laktydo-koglikolid lub poliglikolid można stosować jako objętościową matrycę, jeśli jest pożądana kompozycja do powolnego uwalniania (patrz np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5417986, 4675381 i 4450150).

Farmaceutyczne preparaty, takie jak roztwory, tabletki, granulki lub kapsułki można formować z tych składników. Jeśli kompozycję podaje się doustnie, można dodawać środki smakowe i/lub barwiące.

Podawanie kompozycji zawierających koniugaty oligosacharyd/grupa nośnikowa

PL 203 789 B1

Nowe kompozycje można podawać dowolną odpowiednią drogą, np., dożylnie, dotętniczo, miejscowo, przez iniekcję, do-otrzewnowo, doopłucnowo, doustnie, podskórnie, domięśniowo, podjęzykowo, donosowo, przez inhalację, donaskórkowo, lub doodbytniczo.

Dawki podawane w praktyce wynalazku będą zależały od czynników takich, jak specyficzny antygen szczepionki i jego stężenie w kompozycji, czy podaje się adiuwant wspólnie z antygenem, typ wspólnie podawanego adiuwantu, sposób i częstość podawania, oraz żądany efekt (np., zabezpieczanie przed infekcją lub terapia istniejącej infekcji). Odpowiednie dawki, może określić specjalista w dziedzinie bez zbędnych doświadczeń. Ogólnie, nowe kompozycje można podawać w ilościach pomiędzy 0,01 μg i 1 mg koniugatu na kilogram masy ciała. Jeśli z kompozycjami podaje się adiuwanty, można stosować ilości tylko 1% dawek podanych tuż powyżej. Zakres dawek dla weterynaryjnym stosowania można ustalić według masy ciała.

Podawanie powtarza się w miarę potrzeby, jak może określić specjalista w dziedzinie. Np., w profilaktyce wstępna dawka może poprzedzać trzy dawki wspomagające w odstępach tygodniowych. Zastrzyk dawki wspomagającej można podawać 8 do 12 tygodni po pierwszym zaszczepieniu, i drugą dawkę wspomagającą można podać po 16 do 20 tygodniach, stosując ten sam preparat. Surowice lub komórki T można pobierać od osobnika dla przetestowania odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez kompozycję wobec pasożyta (lub antygenów powierzchni pasożyta) in vitro. Sposoby testowania przeciwciał, cytotoksyczne komórki T, lub inne mediatory funkcji odporności wobec specyficznego antygenu i ocena ich zdolności do zabijania pasożytów in vitro są dobrze znane w dziedzinie, obejmując opisane w przykładach poniżej. Patrz także, np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4656033; WO 90/02563; Vieira i in., Comp. Biochem. Physiol., 100B: 507-516, 1991; Butter-worth i in., Immunol. Res., 61: 5-39, 1982; Bickle i in., J. Immunol., 128: 2101-2106, 1982; i Simpson i in., Infect. Immun., 41: 591-597, 1983. Dodatkowe dawki wspomagające można podawać w miarę potrzeby. Zmieniając ilość immunogenu lub kompozycji można optymalizować protokół immunizacji dla wywołania maksymalnej odpowiedzi immunologicznej.

Przed podawaniem powyższej kompozycji ludziom można przeprowadzić testy toksyczności i skuteczności na zwierzętach. W przykładzie testu skuteczności, można zaszczepić myszy doustnie lub pozajelitowo kompozycją zawierającą antygen, koniugat oligosacharyd/grupa nośnikowa. Po początkowym zaszczepieniu lub po ewentualnej dawce wspomagającej szczepienia, mysz (i odpowiednie kontrolne myszy otrzymujące fałszywe szczepionki) prowokuje się dawką LD95 pasożyta. Ochronną odporność określa się następnie przez nieobecność lub zmniejszenie (np., zmniejszenie o 70%, 80%, 90%, 95%, 99% lub 100%) liczby żywotnych pasożytów. Alternatywnie, prowokacja jest dawką śmiertelną, a ochronną odporność określa się nieobecnością śmiertelności. Ogólnie, dawka śmiertelna Fasciola u myszy to pięć lub więcej cyst, a dawka śmiertelna przywry u myszy to około 50 lub more cerkariów.

Np., oligosacharydy z lipoglikanu przywry można sprzęgać z BSA, rozcieńczać w PBS i dostarczać myszom. Jako kontrolne nie specyficzne oligosacharydy (np., maltotriozę) można sprzęgać z BSA, rozcieńczać w PBS i dostarczać myszom tego samego dnia. Dawkę wspomagającą szczepienie podaje się około jeden miesiąc po pierwszym szczepieniu. Około dwu tygodni później myszy prowokuje się 50 do 500 cerkariami Schistosoma mansoni. Myszy zabija się i sekcjonuje około tydzień po prowokacji, i zlicza się liczbę żywotnych robaków w fazie płucnej w każdej myszy. Ochronną odporność nadaje się przez nieobecność lub zmniejszenie liczby żywotnych robaków u testowych myszy w porównaniu z obecnością żywotnych robaków myszy kontrolnych. Dodatkowe szczegóły dotyczące modeli zwierzęcych infekcji przywrą można znaleźć u Shera i in., J. Inf. Dis. 130: 626-633, 1974; oraz Berquista i in., Parasitol. Today 14: 99-104, 1998.

Szczepionkę opartą na koniugacie lipoglikanowy oligosacharyd Fasciola/grupa nośnikowa można testować w podobny sposób jak dla szczepionki przeciw płazińcom opisanej powyżej, poza tym, że czas następowania różnych etapów zmienia się odpowiednio, a bada się wątrobę, a nie płuca, zabitych myszy w poszukiwaniu infekcji. Ponownie, ochronną odporność nadaje się przez nieobecność lub zmniejszenie liczby żywotnych robaków u testowych myszy w porównaniu z obecnością żywotnych robaków myszy kontrolnych, lub osłabieniem objawów związanych z infekcją. Dodatkowe szczegóły dotyczące modeli zwierzęcych infekcji Fasciola można znaleźć u Morrisona i in., Vaccine 14: 16031612, 1996; Hughesa i in., Res. Vet. Sci. 30: 93-98, 1981; i Rajasekariah i in., Exp. Parasitol. 44: 233238, 1978.

Szczegóły dotyczące modeli zwierzęcych pierwotniakowych infekcji można znaleźć u Corbeila, Parasitol. Today 10: 103-106, 1994; Ghadirian i in., Parasite Immunol. 7: 479-487, 1985; Farrell, Exp. Parasitol. 40: 89-94,1976; i Gorczyński, Cell. Immunol. 94: 1-10, 1985.

PL 203 789 B1

Dawka koniugatu podawana pacjentowi będzie zwykle zależała od ostrości stanu, (jeśli taki jest), wieku, masy, płci, i ogólnego stanu pacjenta.

Lekarze, farmakologowie, i inni specjaliści są w stanie określić najbardziej leczniczo skuteczny reżim terapii, który będzie się zmieniał w zależności od pacjenta. Siłę konkretnej kompozycji i czas trwania jej działania może wymagać podawania nieregularnego, w tym podawania w implancie wytworzonym z polimeru, które pozwala na powolne uwalnianie koniugatu. Specjaliści wiedzą także, że reżim terapii musi odpowiadać problemom bezpieczeństwa i możliwych toksycznych skutków powodowanych przez koniugat lub inne składniki w kompozycji, takie jak adiuwanty.

Odmiany

Części cząsteczki lipoglikanu, które indukują ochronne przeciwciała, można określić powodując powstanie monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla konkretnych regionów lipoglikanu i określając, które z tych części lipoglikanu uczestniczą w niszczeniu pasożyta lub jego eliminacji. Ogólnie, przeciwciała można wytwarzać przez wstrzykiwanie zwierzęciu immunogennych kompozycji opisanych w wynalazku. Monoklonalne przeciwciała i hybrydomy tworzące je można klonować i selekcjonować (stosując kompleks oryginalnego antygenu jako ugrupowanie przechwytujące) z populacji komórek B wydzielonych z immunizowanych zwierząt stosując standardowe sposoby w dziedzinie biologii molekularnej.

Gdy wybierze się przeciwciała z użyciem tych selekcji, konkretne struktury oligosacharydów, z którymi się wiążą, moż na zidentyfikować co najmniej dwoma sposobami. W pierwszym sposobie, przeciwciała stosuje się do selekcji biblioteki cząsteczek oligosacharydów, przy czym każdy element bibliotek mający znaną strukturę chemiczną. W drugim sposobie, przeciwciała stosuje się do „wyłowienia” konkretnych oligosacharydów z kompleksowej mieszaniny oligosacharydów wytwarzanych przez trawienie lipoglikanu z użyciem sposobów opisanych w wynalazku. Strukturę konkretnych oligosacharydów zidentyfikowano chromatograficznymi, spektrometrycznymi, lub innymi fizycznymi i/lub chemicznymi sposobami znanymi w dziedzinie chemii węglowodorów.

Inna odmiana obejmuje dobór grup nośnikowych. Infekcja pasożytem typowo obejmuje specyficzne humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne u gospodarza. Jednakże białka pasożyta same rzadko indukują znaczącą oporność na homologiczną prowokację. Te białka pasożyta mogą stanowić, więc idealne nośniki, z którymi można sprzęgać lipoglikoligosacharydy. Te białka, które dają odpowiedź immunologiczną wcześnie w infekcji, mogą funkcjonować jako skuteczne grupy nośnikowe dla indukowania oporności na infekcję.

Można także polepszać środki sprzęgania oligosacharydów z grupami nośnikowymi. Dostępnych jest kilka procedur i linkerów, które ułatwiają sprzęganie węglowodanów z cząsteczkami nośników, jak opisano powyżej.

P r z y k ł a d y

Wynalazku opisano dalej w następujących przykładach, które nie ograniczają zakres lub zawartość wynalazku w żaden sposób.

P r z y k ł a d 1: Ochronna szczepionka wobec Fasciola

Zbadano najpierw, czy Fasciola hepatica może unikać odpowiedzi immunologicznej gospodarza przez ograniczenie odpowiedzi na wytwarzanie przeciwciała IgM.

Wydzielanie lipoglikanu

Dla wydzielenia lipoglikanu przydatnego do wytwarzania szczepionki wobec pasożytów, dorosłe F. hepatica przetworzono standardowymi sposobami dla usunięcia zawartości jelit (Lang i in., J. Parasitol. 63: 1046-1049, 1977), a następnie zamrożono rzutowo. Zaraz po zebraniu z gospodarza, dorosłe przywry przemyto nadmiarem sterylnej solanki buforowanej fosforanem (pH 7,2) w temperaturze około 37°C do 38°C przez 30 minut, następnie przemyto drugi raz w tym samym roztworze przez 20 minut. Tusze F. hepatica, w tym powierzchniowe powłoki, potraktowano wstępnie przez odlipidowanie powierzchniowej powłoki izopropanolem/heksanem (2:3), jak opisuje Radin, supra, następnie ekstrakcję rozpuszczalnikiem E opisanym u Turco i in., supra. Ekstrakt osuszono w strumieniu suchego azotu, dając pozostałość.

W odrębnym eksperymencie, określono, że ekstrakcji chloroformem/metanolem/wodą (1,0:1,0:0,3), jak opisuje Turco i in., supra, w miejsce ekstrakcji izopropanolem/heksanem, można także użyć do delipidowania powłoki powierzchniowej przed traktowaniem rozpuszczalnikiem E ekstraktu lipoglikanu.

Pozostałość z rozpuszczalnika E zawieszono ponownie w 40 mM wodorotlenku amonu i zanalizowano metodą: 1) procedury orcynol-kwas siarkowy w modyfikacji White i in., Oligosaccharides, rozdz. 2, w: Carbohydrate Analysis, A Practical Approach (red. Chaplin i in.), IRL Press Ltd., Oxford,

PL 203 789 B1 str. 38., 1986; i 2) w modyfikacji Petersona mikrometodzie Lowry dla ilościowego zliczenia białka (Yamamoto i in., Lipid, 5: 442, 1970) stosując dostępny w handlu zestaw (Sigma Catalog No. P 5656).

Te analizy wskazują, że ekstrakt z rozpuszczalnika E zawierał około 0,5 mg węglowodanu na 1 g tkanki. Wykryto śladowe ilości białka.

Pozostałość z rozpuszczalnika E oczyszczono następnie przez filtrację żelową na kolumnie Sepharose CL-4B (Pharmacia). Kolumnę CL-4B (2,5 x 40 cm) eluowano roztworem zawierającym 40 mM wodorotlenek amonu i 1 mM EDTA, i obserwowano odczyty OD490 każdej frakcji. Zebrano szczytowe frakcje 12 do 33 i podano na hydrofobową kolumnę oktylo-Sepharose równoważoną roztworem zawierającym 0,1 M octanu amonu i 5% n-propanolu. Kolumnę oktylo-Sepharose (Pharmacia) eluowano n-propanolem (gradient 5-60%), i obserwowano ponownie OD490. Dodatkowe szczegóły powyższej procedury wydzielania można znaleźć u Singha i in., J. Biol. Chem., 269: 21972-21982, 1994. Lipoglikan w szczytowych frakcjach z kolumny oktylo-Sepharose wydzielono przez wytrą canie metanolem.

Struktura lipoglikanu

Dla oceny rozmiarów lipoglikanu F. hepatica, wydzielony lipoglikan poddano redukującemu SDS-PAGE na 12% żelu. Pasma węglowodanowe w żelu wizualizowano stosując nadjodowy kwas-reagent Schiffa, ujawniając zestaw nieznacznie oddalonych pasm rozmiarów około 180 kDa. Barwienie błękitem Coomassie żelu nie zdołało wykryć żadnego białka w wydzielonym preparacie lipoglikanu.

Dla określenia składu monosacharydowego lipoglikanu, preparat poddano łagodnej kwasowej hydrolizie przez inkubację. Około 225 μg lipoglikanu potraktowano 2 ml 2,5 N kwasu trifluorooctowego w temperaturze 100°C przez 3 godziny (Singh, Mol. Biochem. Parasitol. 57: 281-294, 1993). Takie traktowanie niespecyficznie rozcina wiązania glikozydowe w węglowodanowym składniku lipoglikanu. Powstałe monosacharydy zanalizowano następnie na systemie wysokowydajnej wymiany anionowej wyposażonej w pulsacyjny amperometryczny detektor (Dionex, Inc., Sunnyvale, CA), jak opisuje Hardy i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 3289-3293, 1988. Próbki lipoglikanu hydrolizowano stosując 2,5 N kwas trifluorooctowy, jak opisano powyżej, w zamykanych pokrywkami probówkach Pyrex 13 x 100 mm. Pokrywki uszczelniono teflonowymi uszczelnieniami. Probówki ochłodzono i kwas usunięto na wyparce obrotowej w temperaturze około 40°C. Próbki rozpuszczono następnie w 15 mM NaOH i podano na kolumnę Carbopac-PAl stosując 15 mM NaOH jako eluent. Skład monosacharydowy określono metodą wysokowydajnej chromatografii anionowymiennej wyposażonej w pulsacyjny amperometryczny detektor (Dionex Corp., Sunnyvale, CA). Konkretne monosacharydy zidentyfikowano porównując eksperymentalne czasy retencji z czasami dla podobnie potraktowanych kontrolnych monosacharydów, które zakupiono w Sigma. Proporcje molowe określono całkują pole pod pikami chromatograficznymi reprezentującymi konkretne cukry.

Analizy ujawniły, że lipoglikan zawierał fukozę, galaktozoaminę, glukozaminę, galaktozę, glukozę i mannozę w stosunku 1,0:4,0:9,0:4,0:1,0:3,8.

Identyczność terminalnych monosacharydów w lipoglikanie ujawniono trawiąc lipoglikan β-galaktozydazą, α-fukozydazą i α-mannozydazą (Oxford Biosystems). Uwolnione monosacharydy zidentyfikowano systemem wysokowydajnej wymiany anionowej opisanym powyżej. Trawienie ujawniło, że terminalne reszty e-1,4-związanej galaktozy, terminalne α-fukozy i terminalne α-mannozy były składnikami lipoglikanu. Połączenie β-1,4-galaktozy potwierdzono przez wiązanie lektyny.

Połączenie e-1,4-galaktozy potwierdzono stosując unieruchomioną rycyną lektynę. Lipoglikan radioznakowany oksydazą galaktozy/NaB[³H]4 wprowadzono na kolumnę (1 x 2 cm) aglutyniny-1 Ricinus communis (RCA-1). Lektynę RCA-1 kowalencyjnie związaną z kulką agarozową (EY Laboratories, Inc.) równoważono PBS, pH 7,4. Załadowaną kolumnę najpierw przemyto PBS i następnie 0,2 M laktozą. PBS zawierający 0,1% Triton X-100 użyto do przepłukania kolumny. Frakcje (1,2 ml) zebrano i mierzono na radioaktywność. Lipoglikan (LG) zatrzymał się na kolumnie i uwalnia go tylko roztwór zawierający laktozę, potwierdzając obecność wiązania e-1,4-galaktozy.

Te dane wskazały, że składnik węglowodanowy lipoglikanu F. hepatica obejmuje rozgałęziony polisacharyd mający różne terminalne monosacharydy.

Określono także zawartość fosforu lipoglikanu. Lipoglikan poddano trawieniu nadchlorowemu i dalszej analizie według Barletta, J. Biol. Chem., 234: 466-468, 1959.

Mikroadaptacji sposobu opisanego przez Fiske i in., J. Biol. Chem. 66: 375, 1925, w modyfikacji Barletta i in., J. Biol. Chem. 234: 4 66-4 68,195 9, użyto do wykrywania fosforu w LG Fasciola i Schistosoma. W tej procedurze osuszony LG pasożyta rozpuszczono w 100 μl 10 N H₂SO₄ i ogrzewano do 160°C przez trzy godziny. Wszystkie dalsze reagenty dodano w 1/5 objętości lub masy wskazanej przez Barletta i in., supra. Wyniki odczytano przy 830 nm, z zawartością fosforu określoną z użyciem standardowej krzywej opracowanej z użyciem wodorofosforanu sodu.

PL 203 789 B1

200 μg osuszonego LG przywry wykorzystano w procedurze ilościowego wykrywania fosforanu opisanej u Bartletta i in., supra. Doświadczenie wykazało, że 200 fg LG przywry zawierało w przybliżeniu 0,1 fg fosforu. Te wyniki sugerują, że kilka reszt fosforowych występuje w każdej cząsteczce LG przywry, lecz część glikanowa cząsteczki nie zawiera powtarzalnych grup fosfodiestrowych, jakie znaleziono w LG pierwotniaka. Wiązania fosfodiestrowe pomiędzy grupami cukru, jakie stwierdzono w pierwotniakowych LG, powodują niezwykłą nietrwałość tych cząsteczek na łagodne warunki kwasowe. Proporcja fosforu do węglowodanu w pierwotniakowym LG wynosi około 1:3 (Singh i in., J. Biol. Chem. 269: 21972- 21982, 1994).

Odkrycie, że LG przywry nie jest szczególnie podatny na łagodną kwasową hydrolizę i że stosunek ilości fosforu do węglowodanu w tej cząsteczce jest także niski, sugeruje, że LG przywry nie zawierają wiązania fosfodiestrowe pomiędzy grupami węglowodanowymi. Odkrycie to jest spójne z innymi eksperymentami, w których stwierdzono, że lipoglikan nie był degradowany przez łagodną kwasową hydrolizę (przy 40 mM kwasie trifluorooctowym) lub przez deaminowanie kwasem azotawym.

Zbadano, czy inozytol był składnikiem lipoglikanu F. hepatica, tym samym wskazując, że lipoglikan istnieje jako zakotwiczona na glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) cząsteczka na powierzchni dorosłego robaka. Lipoglikan oznakowano ³H standardowymi procedurami i następnie potraktowano fosfolipazą C (Oxford GlycoSystems, Inc. Rosedale, NY) dla usunięcia reszt inozytolowych, jeśli takie występują. Znakowane LG otrzymano redukując cząsteczki LG wcześniej potraktowane oksydazą galaktozy (Boehringer Mannheim Biochemica) z NaB[³H]4 (New England Nuclear) (Gahmber i in., J. Biol. Chem. 248: 4311-4317, 1973). Trawiony i oddzielnie nietrawiony znakowany kontrolny lipoglikan, podano na kolumnę fenylo-Sepharose (Pharmacia), następnie eluowano stosując roztwór wodny zawierający 0,1 N kwas octowy i 0,1 M NaCl oraz, odrębnie, rozpuszczalnik E. Radioznakowany materiał z trawionej próbki eluowano przez wodną elucję, podczas gdy radioznakowany materiał z kontrolnej próbki eluowano tylko w organicznej elucji. Potwierdzono, że radioznakowany materiał eluujący w fazę wodną był inozytolem, metodą chromatografii gazowo/cieczowej, jak opisuje Singh i in., J. Biol. Chem., 269: 21972-21982, 1994; i Singh, Mol. Biochem. Parasitol., 57: 281-294, 1993.

Skład szczepionki na F. hepatica

Dla określenia, czy oligosacharydy pochodzące z wydzielonego lipoglikanu F. hepatica może służyć jako skuteczny immunogen, lipoglikan poddano łagodnej trifluoroacetolizie i derywatyzacji 2-(4-aminofenylo)etyloaminą, jak opisuje Semprevivo, supra. Derywatyzowany związek pośredni następnie sprzężono z BSA z wytworzeniem koniugatu oligosacharyd/BSA, jak opisuje Semprevivo, supra.

Wydzielony koniugat oligosacharyd/BSA zbadano metodą SDS-PAGE i hybrydyzacji Western. Przed sprzęganiem kontrolna próbka BSA wykazywała masę cząsteczkową około 67000 Da i była immunologicznie wykrywalny dostępnym w handlu przeciwciałem anty-BSA. Jednakże koniugat wykazywał lepszą ruchliwość na żelu i powinien być wykryty surowiczymi przeciwciałami z zainfekowanego F. hepatica szczura, jak też przeciwciałem anty-BSA, jak się spodziewano.

Maltotriozę (Sigma Catalog No. M 8378) sprzężono z BSA zgodnie z powyższą procedurą, z wytworzeniem negatywnego kontrolnego koniugatu.

Kompozycję szczepionki F. hepatica wykonano mieszając koniugat lipoglikoligosacharydowy z żelem wodorotlenku glinu (Malox). Żel wodorotlenku glinu jest adiuwantem odpowiednim do stosowania u ludzi i jest często określana jako ałun.

Ocena modelu gryzonia

Jako pozytywny kontrolny eksperyment dla eksperymentu szczepienia opisanego poniżej, pięciotygodniowe samce szczurów Wistar zaszczepiono doustnie 10 metacerkariami F. hepatica, prowokowano 7 tygodni później 20 metacerkariami, i wykrwawiono tydzień po prowokacji. Surowicę odpornościową z każdego infekowanego F. hepatica szczura otrzymano sposobem opisanym u Hanna, supra. Surowice otrzymano także z zainfekowanych F. hepatica szczurów, myszy, owiec i bydła.

Klasę przeciwciał obecnych w każdej próbce osocza określono przez pośrednią immunofluorescencję. Celem w każdym teście były żywe NEJ F. hepatica. NEJ mieszano z każdą z próbek osocza dla umożliwienia wiązania pomiędzy przeciwciałami surowicy i NEJ. Związane z przeciwciałami surowicy NEJ następnie inkubowano z wtórnym kozim przeciwciałem znakowanym fluoresceiną specyficznym wobec IgM lub IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Wtórne przeciwciało korespondowało z odpowiednim gatunkiem, z którego wydzielono surowicę. Rozcieńczenia wtórnych przeciwciał wynosiły około 1:200 do 1:300. Po inkubacji z wtórnym przeciwciałem, NEJ zbadano pod fluorescencyjnym mikroskopem. Intensywną fluorescencję zaobserwowano na NEJ potraktowanych IgM specyficznym wobec wtórnych przeciwciał, lecz nie IgG specyficznym wobec wtórnych

PL 203 789 B1 przeciwciał. Ten wynik wskazał, że, jak oczekiwano, ssaki zainfekowane F. hepatica nie były w stanie uzyskać zależnej od komórki T odpowiedzi immunologicznej, która obejmowała wytwarzanie korzystnych przeciwciał IgG.

Szczepienie gryzoni.

Dla eksperymentu szczepienia, dojrzałe samice szczurów (szczep Wistar, Charles River Laboratories) i dojrzałe samice myszy (szczep CDI, Charles River Laboratories) zaszczepiono koniugatami oligosacharydów i maltotriozy. Dawka na szczura wynosiła 40 μg koniugatu w 0,4 ml ałunu. Dawka na mysz wynosiła 20 μg koniugatu w 0,2 ml ałunu. Pewne zwierzęta zaszczepiono tylko ałunem, jako dodatkowe negatywne kontrole. To studium wykorzystuje 15 myszy i 15 szczurów, z pięcioma szczurami i pięcioma myszami otrzymującymi koniugat lipoglikanowy oligosacharyd/BSA, pięcioma szczurami i pięcioma myszami otrzymującymi koniugat maltotrioza/BSA, i pięcioma szczurami i pięcioma myszami otrzymującymi tylko ałun. 30 dni po szczepieniu zwierzęta otrzymały homologiczną dawkę wspomagającą 5 μg koniugatu zmieszaną z 0,1 ml ałunu lub sam ałun, w zależności od początkowego szczepienia. Surowice odzyskano z każdego zwierzęcia jeden dzień przed szczepieniem i 40 dni po szczepieniu.

Prowokacja szczepionych gryzoni

Zdrowe metacerkarie F. hepatica wybrano przy pomocy wy-preparowującego mikroskopu dla zapewnienia jednakowych prowokacji infekcyjnych szczepionych zwierząt. Tylko metacerkarialne cysty ze zdefiniowaną wewnętrzną morfologią wskazujące na żywotne larwy wybrano dla prowokacji. 40 dni po szczepieniu każde zwierzę doustnie zaszczepiono trzema (dla myszy) lub pięcioma (dla szczurów) metacerkarii F. hepatica. Zwierzęta zabito i sekcjonowano 30 dni po infekcji. Wątrobę wycięto z każdego zwierzęcia i zbadano na żywe robaki przez ogląd pod wypreparowującym mikroskopem i na oznaki choroby indukowanej robakiem, np., zapalenia wątroby lub nekrozy wątroby. Wątroby myszy otrzymujących ałun lub maltotriozowe negatywne kontrole miały średnio 2,4 płazińca na wątrobę i wykazywały zapalenie i martwicę. Wątroby myszy otrzymujących koniugat lipoglikanowy oligosacharyd/BSA F. hepatica nie ujawniły robaków i zapalenia lub martwicy. Podobne wyniki otrzymano u szczurów, poza tym, że wątroby negatywnych kontrolnych szczurów miały średnio 4,6 płazińca na wątrobę. Nie znaleziono robaków w wątrobach szczurów szczepionych koniugatem lipoglikanowy oligosacharyd/BSA F. hepatica.

Dla potwierdzenia, że immunogeniczność była spowodowana koniugatem lipoglikanowy oligosacharyd/BSA, serię kontrolnych szczepień prowadzono jak opisano powyżej, poza tym, że kompozycje szczepionki zawierały wydzielony lipoglikan, lipoglikanowe oligosacharydy, lub koniugat lipoglikanowy oligosacharyd/BSA, które potraktowano nadjodanem dla zdegradowania kompleksowych węglowodanów do monosacharydowych jednostek. Wiadomo, że działając nadjodanem, reszty węglowodanowe zawierające grupy glikolowe utlenia się do dialdehydów, lecz jeśli trzy sąsiadujące atomy węgla zawierają grupy hydroksylowe, powstaje kwas mrówkowy z otwierania pierścieni cukru, tym samym niszcząc konfigurację cukrów.

Szczury otrzymujące każde z tych kompozycji szczepionki w ten sam sposób, jak opisano powyżej, nie były nigdy zabezpieczano przed prowokacją F. hepatica. Ten wynik wskazuje, że (1) sam lipoglikan nie może wywoływać ochronnej odpowiedzi immunologicznej, (2) oligosacharydy pochodzące z samego lipoglikanu same nie mogą wywoływać ochronnej odpowiedzi immunologiczną, i (3) ochronna odpowiedź immunologiczna nadawana przez koniugat oligosacharyd/BSA jest zależna od kompleksowej struktury oligosacharydów.

Ocena surowic ze szczepionych szczurów

Surowice ze szczurów szczepionych szczepionką koniugatu oligosacharyd/BSA F. hepatica testowano na zdolność reakcji z i/lub zabijania żywych robaków in vitro. NEJ F. hepatica lub przywry z wątroby 30 dni po infekcji wydzielone z myszy użyto jako cele.

Pośrednia immunofluorescencja, przeprowadzona jak opisano powyżej, użyto do oceny reaktywności. Przywry w tym stadium z wątroby odrębnie hodowano przez 5 dni w pożywce Medium 199 (Sigma) uzupełnionym 15% surowicą szczura przed immunizacją. NEJ F. hepatica lub przywry z wątroby 30 dni po infekcji odrębnie inkubowano w (1) nierozcieńczonej surowicy szczura przed immunizacją; (2) surowic wydzielonych ze szczura, myszy, krowy lub owcy zainfekowanej F. hepatica; (3) surowic ze szczurów szczepionych koniugatem maltotrioza/BSA; lub (4) surowic ze szczurów szczepionych koniugatem oligosacharyd/BSA F. hepatica. Surowice rozcieńczono od 100 do 1000 razy w pożywce przed kontaktem z robakami F. hepatica.

PL 203 789 B1

NEJ wystawione na działanie surowic szczura przed immunizacją lub surowicy ze szczepionych maltotriozą/BSA szczurów były zdrowe i niezmienione. NEJ inkubowane w dowolnej z surowic ze zwierząt infekowanych F. hepatica wykazywały widoczne powierzchniowe osady powstające z kompleksów przeciwciała IgM. Chociaż mogły wytwarzać takie kompleksy, te surowice nie mogły zabić

NEJ lub przywr z wątroby 30 dni po infekcji in vitro.

W przeciwień stwie do tego, surowice ze szczurów szczepionych koniugatem oligosacharyd/BSA zabijały F. hepatica i przywry 30 dni po infekcji wątroby. Cytopatyczny efekt surowicy potwierdzono fizycznymi cechami robaków, takimi jak zaokrąglanie, rozwój pęcherzyków w powierzchniowej powłoce, i utrata powłoki ciała. Użyto optycznych mikroskopów do wykrywania ultrastrukturalnych defektów, takich jak pęcherzyki. Użyto mikroskopu elektronowego do wykrywania utraty powłoki ciała. Robaki nie były żywotne (to jest, martwe lub umierające) po inkubacji tymi surowicami. Tak więc nawet chociaż ochronna szczepionka na F. hepatica obejmowała oligosacharydy oryginalnie wydzielone tylko z dorosłych robaków, surowice ze szczepionych zwierząt także zabijały młode robaki. Ten wynik wskazywał, że jakakolwiek jest humoralna odpowiedź immunologiczna wywoływana przez koniugat oligosacharyd/BSA, odpowiedź wywołana była skuteczna wobec młodych i dorosłych stadiów robaków.

Dla potwierdzenia, że zabijanie in vitro przez surowice zależało od przeciwciał specyficznych dla kompleksowych oligosacharydowych struktur, a nie od przeciwciał wiążących proste jednostki monosacharydowe, przeprowadzono następujący eksperyment. Węglowodany lipoglikanu F. hepatica były zredukowane do indywidualnych jednostek monosacharydowych, jak opisano powyżej. Monosacharydy dodano następnie do inkubacji surowica/robak dla uzyskania stężenia 100 μm monosacharydu. Zdolność surowic do zabijania robaków nie została naruszona, wskazując, że zabójcza aktywność nie była spowodowana wiązaniem przeciwciała do prostej jednostki monosacharydowej na powierzchni robaka.

Klasę przeciwciała w surowicy ze szczepionych szczurów określono jak opisano powyżej. Wyniki wskazały, że przeciwciała IgG, a nie przeciwciała IgM, dominujące w tych surowicach.

Długookresowa ochrona

Dla określenia, czy szczepionka koniugat oligosacharyd/BSA dała długookresową ochronę, surowicę zebrano od pięciu szczepionych szczurów w czasie trzech lat. Każdą surowicę testowano wobec NEJ F. hepatica, jak opisano powyżej. Zdolność zabijania i reaktywność surowic nie spadała w czasie trzech lat. Ponadto szczepione szczury nie wykazują skróconego czasu życia i wydają się zdrowe podczas tego samego okresu, co sugeruje małą toksyczność lub jej brak związany ze szczepionką.

Ochrona krzyżowa

Dla zbadania, czy koniugat oligosacharyd/BSA otrzymany z lipoglikanu F. hepatica był zdolny do zapewniania ochrony krzyżowej wobec innego gatunku, surowice ze szczepionych szczurów przetestowano wobec młodych robaków Fasciola magna, jak opisano powyżej dla robaków F. hepatica. Młode płazińce F. magna potraktowane surowicą ze szczepionych szczurów zaokrągliły i padły w ciągu kilku dni. Kontrolne surowice (np., ze szczepionych koniugatem maltotrioza/BSA szczurów) nie wpływa na żywotność F. magna. Te wyniki wskazywały, że kompozycja szczepionki zawierająca koniugatem lipoglikanowy oligosacharyd/BSA F. hepatica jest zdolny do wywoływania krzyżowej ochrony wobec gatunku innego niż gatunek pochodzenia lipoglikanu.

Zauważono także, że przeciwciała IgG znalezione w surowicach szczepionych szczurów mogą wiązać się z wydzielonymi cząsteczkami lipoglikanu znajdowanymi na powierzchni płazińca Schistosoma mansoni (opisanego w przykładzie 2 poniżej), jak pokazano metodą hybrydyzacji Western. To sugeruje, że stopień ochrony krzyżowej mógłby być dość szeroki, aby obejmować ochronę wobec płazińca innego rodzaju.

Wyniki opisane w przykładzie 1 stanowiły wystarczającą podstawę do założenia, że szczepionka F. hepatica wytworzona powyżej i podawana w proporcji do masy ciała będzie chronić zwierzęta hodowlane, takie jak bydło, przed nową wytwórczą infekcją F. hepatica i jej robakami. Ponadto, te wyniki wskazały, że jeśli powyższa szczepionka może indukować odpowiedź IgG u już zainfekowanego bydła, takie bydło może pozbyć się początkowej wytwórczej infekcji.

P r z y k ł a d 2: Ochronna szczepionka wobec Schistosoma

Dla określenia, czy strategia szczepionki opisana w przykładzie 1 może także być użyta dla innych mniej spokrewnionych płazińców, lipoglikan wydzielono ze Schistosoma mansoni z użyciem procedury opisanej w przykładzie 1. W odrębnym eksperymencie zaobserwowano, że zastąpienie ekstrakcji izopropanolem/heksanem ekstrakcją chloroformem/metanolem/wodą, jak opisuje Turco i in.,

PL 203 789 B1 supra, w procedurze wydzielania nie może być stosowane do wydzielania lipoglikanu S. mansoni. Ten lipoglikan oceniono na około 180 kDa przy badaniu metodą redukującej SDS-PAGE i przemieszcza się on jako pojedyncze pasmo na żelu SDS-PAGE. Izolat lipoglikanu S. mansoni był wolny od innych nadjodowych kwasów-reagentów Schiffa i wolny od innych wykrywalnych białek.

Analizę monosacharydu składnika węglowodanowego lipoglikanu S. mansoni przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1. Te wyniki porównano następnie z analizą węglowodanową z użyciem chromatografii gazowej i spektrometrii masowej. Analiza wskazała, że lipoglikan zawierał fukozę, i że na każdą resztę fukozy lipoglikan zawierał 4 reszty galaktozoaminy, 3,1 reszt glukozaminy, 1,84 reszty galaktozy, 1,84 reszty glukozy, 1,45 reszt ramnozy i 2,17 reszty mannozy.

Oligosacharydy trawiono z lipoglikanu S. mansoni i sprzęgano z BSA, jak opisano w przykładzie 1. Ponadto, oligosacharydy sprzęgano z anatoksyną tężca (SSI-TetanusTox; Accurate Chemical and Scientific Corp.) jako nośnikiem stosując procedurę opisaną dla sprzęgania BSA w przykładzie 1. Kompozycje szczepionki zawierające koniugaty oligosacharydów wytworzono jak opisano wcześniej. Kontrole wytwarzano mieszając tylko BSA z ałunem lub tylko anatoksynę tężca z ałunem.

Myszy otrzymały początkowo szczepionkę i kontrolne kompozycje w ilościach wyspecyfikowanych w przykładzie 1. W 28 dni po początkowym zaszczepieniu podano dawkę wspomagającą, jak opisano w przykładzie 1. W 38 dni po początkowym zaszczepieniu myszy prowokowano cerkariami

S. mansoni. Myszy, które immunizowano oligosacharydem lipoglikanu form dorosłych sprzężonym z anatoksyną tężca, prowokowano 200 cerkariami na mysz. Myszy, które immunizowano oligosacharydem lipoglikanu form dorosłych sprzężonym z BSA, prowokowano 100 cerkariami na mysz. Każda z czterech grup pięciu zwierząt otrzymała odpowiednio BSA, koniugat oligosacharyd/BSA, anatoksynę tężca, lub koniugat oligosacharyd/anatoksyna tężca.

Sześć dni po prowokacji myszy zabito i sekcjonowano. Płuca z każdego zwierzęcia usunięto i robaki policzono i zbadano. Płuca myszy otrzymujących BSA zawierały średnio 20,2 robaka na zwierzę, podczas gdy płuca myszy otrzymujących koniugat oligosacharyd/BSA zawierały średnio 5,5 robaka na zwierzę. Ważniejsza niż ta 73% redukcja liczby robaków była obserwacja, że wszystkie robaki znalezione w płucach szczepionych myszy były martwe lub umierające, podczas gdy wszystkie robaki znalezione w płucach kontrolnych myszy były zdrowe i ruchliwe.

Płuca myszy otrzymujących anatoksynę tężca zawierały średnio 30,9 robaka na zwierzę, podczas gdy płuca myszy otrzymujących koniugatu oligosacharyd/anatoksyna tężca zawierały średnio 3,9 robaka na zwierzę. Ponownie ważniejsza niż ta 88% redukcja liczby robaków była obserwacja, że wszystkie robaki znalezione w płucach szczepionych myszy były martwe lub umierające, podczas gdy wszystkie robaki znalezione w płucach kontrolnych myszy były zdrowe i ruchliwe. Zastosowanie anatoksyny tężca jako nośnika także wskazało, że kompozycja szczepionki może obejmować oligosacharydy sprzężone z różnymi cząsteczkami nośników.

Dla ponownego potwierdzenia ochronnej odporności nadawanej przez koniugatu oligosacharyd lipoglikanu S. mansoni-anatoksyna tężca, Przeprowadzono drugi eksperyment szczepienia i prowokacji stosując procedury opisane tuż powyżej. Zmniejszenie liczby robaków w tym drugim eksperymencie wynosiło 89%, tym samym potwierdzając, że ochronna odporność wywoływana przez tę szczepionkę jest powtarzalna pomiędzy odrębnymi eksperymentami.

Zbadano także przeżywalność i zdrowie szczepionych względem nieszczepionych zwierząt po prowokacji S. mansoni. Pięć myszy zaszczepiono szczepionką koniugatu lipoglikan-anatoksyna tężca stosując protokoły opisane powyżej. Pięć dodatkowych myszy służyło jako nieszczepione zwierzęta kontrolne. Szczepione myszy otrzymały podtrzymanie raz w 28 dni po szczepieniu (początkowym), i wszystkie 10 myszy prowokowano przezskórnie 100 wirulentnymi cerkariami 93 dni po szczepieniu.

Następnie określono czas do stanu umierania, jeśli do niego dochodziło, dla każdego zwierzęcia. Te myszy obserwowano codziennie na ogólny wygląd i stan. 50 dni po infekcji, wszystkie nieszczepione myszy były w letargu lub wydawały się chore. Jedna mysz z kontrolnej grupy padła 55 dni po infekcji, inna 57 dni po infekcji. Pozostałe trzy myszy były widocznie umierające 58 dni po infekcji i zabito je dla skrócenia cierpień . Po sekcji, wszystkie kontrolne myszy miał y bardzo wiele jaj pasoż yta w wą trobie.

W przeciwieństwie do tego, wszystkie szczepione myszy były ż ywe i nie wykazywały objawów chorobowych 101 dni po prowokacji. Te wyniki wskazały, że szczepione myszy nie wykazywały patologicznych skutków związanych z masowym składaniem jaj przez pasożyta, co wspiera wniosek, że prowokujący pasożyt zginął i/lub nie mógł pomyślnie złożyć jaj.

PL 203 789 B1

Tak więc ochrona objawiła się jako silna redukcja liczby robaków w szczepionych zwierzętach, jak też eliminacja wszelkich widocznych objawów, w tym śmierci, typowo wywoływanej przez infekcję

S. mansoni. Ponadto, wszystkie robaki wydzielone ze szczepionych zwierząt były martwe lub umierające (to jest, nie żywotne).

Te wyniki, połączone z wynikami z przykładu 1, wskazują, że można wytworzyć drugą (koniugat BSA) i trzecia (koniugat tężca) ochronną szczepionkę wobec płazińca. Ponieważ mysi model infekcji przywrą jest znany specjalistom w dziedzinie jako dobrze przewidujący skuteczność u ludzi, wyniki opisana w tym przykładzie dają także rozsądną podstawę konkluzji, że szczepionka wobec S. mansoni opisana w wynalazku będzie, przy podawaniu proporcjonalnie do masy ciała, chronić ludzi przed infekcją przywrą (to jest, schistosomatozą).

P r z y k ł a d 3: Szczepionka wobec pierwotniaków

Powierzchniowe lipoglikany wydzielono z ludzkich pierwotniakowych patogenów Leishmania donovani, Leishmania tropi-ca, Trichomonas vaginalis i Tritrichomonas foetus według procedury opisanej w przykładzie 1.

Dla określenia, czy osobnicy zainfekowani każdym z tych pierwotniaków wytwarzają odpowiedź przeciwciała IgM lub IgG, pierwotniakowe lipoglikany unieruchomiono na nitrocelulozowej membranie w formacie hybrydyzacji kropkowej. Lipoglikany wystawiono nastę pnie na dział anie surowic otrzymanych od osobników zainfekowanych każdym z pierwotniaków w warunkach dostatecznych do umożliwienia wiązania przeciwciał surowicy z unieruchomionymi lipoglikanami. Dwa mikrogramy lipoglikanu rozpuszczone w 3 μΐ rozpuszczalnika E umieszczono na membranie z difluorku poliwinylidenu (PVDF) (BioRad, Hercules, CA) tworząc okrąg średnicy około 3 mm. Następnie określono poziom wiązania IgG lub IgM do lipoglikanów stosując znakowane zasadową fosfatazą przeciwciało anty-ludzkie IgM lub anty-ludzkie IgG. Po rozwinięciu przekształconego fosfatazą chromogennego reagentu zaobserwowano, że wiążącym przeciwciałem surowicy do wydzielonych lipoglikanów było głównie IgM. Tak więc te pierwotniaki nie indukują korzystnej odpowiedzi IgG, jak zauważono w przykładzie 1 u zwierząt zainfekowanych F. hepatica.

Grupy 5 myszy zaszczepiono każdą szczepionką koniugatu LG pierwotniaka (20 fg/mysz), a inne grupy 5 myszy zaszczepiono każdym z wydzielonych LG (20 fg/mysz). Pojedynczą grupę 5 myszy zaszczepiono tylko BSA (20 fg/mysz). Wszystkie myszy podtrzymano 28 dni później 10 fg tej samej substancji, którą otrzymały początkowo. Surowicę zebrano w dniu 27 i 35 po immunizacji. Myszy zaszczepione wydzielonym LG często nie wyzwalały specyficznych przeciwciał odpowiedzi lub miały słabą odpowiedź IgM. Myszy immunizowane szczepionkami koniugatu LG-oligosacharyd-białko wykazywały dominującą odpowiedź IgM w 27 dniu, lecz dominującą odpowiedź IgG w 35 dniu. Myszy szczepione BSA nie wytworzyły przeciwciał odpowiedzi anty-LG.

Ten wynik, w świetle wyników w przykładach 1 i 2, wskazał, że strategia szczepionki prowadzącej do ochronnej odporności wobec płazińców była także przydatna dla pierwotniaków.

Inne odmiany

Należy rozumieć, że chociaż wynalazek opisano w powiązaniu ze szczegółowym jego opisem, powyższy opis ma tylko ilustrować, a nie ograniczać zakresu wynalazku, który jest zdefiniowany zakresem zastrzeżeń. Inne aspekty, korzyści i modyfikacje mieszczą się w zakresie następujących zastrzeżeń.

Na przykład procedury opisane powyżej stosują się do innych płazińców. Struktura powłoki wszystkich płazińców, w tym bruzdossawców, jednorodców, dwurodców i tasiemców jest strukturowana zgodnie z pospolitym planem (Mehlhorn i in., Parasitology in Focus, Facts and Trends, Springer Verlag, NY, str. 238-240, 1988). Ta obserwacja sugeruje, że wszystkie pasożytnicze płazińce mogą uniknąć ataku układu odpornościowego mając powłokę lipoglikanów na powierzchni. W związku z treścią niniejszego opisu, szczepionka złożona ze specyficznych lipoglikanowych oligosacharydów powierzchni płazińca sprzężonych z nośnikiem białkowym może indukować ochronną odporność. Koniugat lub antyidiotyp można wytworzyć dla specyficznych LG licznych eukariotycznych pasożytów.

Tak więc ochronę przed dowolnym eukariotycznym pasożytem można uzyskać sposobami i kompozycjami według wynalazku. Eukariotyczne pasożyty podatne na ochroną nadawaną sposobami według wynalazku obejmują następujące: (1) dwurodne przywry, które są poważnymi patogenami ludzi i domowych zwierząt, w tym między innymi następujące (Fasciolopsis buski, Dicrocoelium dendriticum, Paragonimus westermani, i Clonorchis sinensis); (2) jednorodne płaskie pasożyty, które infekują ryby; i (3) tasiemce.

PL 203 789 B1

Szczególnie ważne jest opracowanie szczepionek wobec Taenia solium, Echinococcus granulosus i Echinococcus multilocularis. Szczepionka na te pasożyty będzie zwalczała dorosłe stadium u ludzi, w pierwszym przypadku, i u psowatych w dwu pozostałych.

Inne pasożyty, przed którymi można się zabezpieczyć, obejmują pasożyta malarii. Złożone węglowodany często działają jako antygen niezależny od T typu 2 (TI-2). Antygeny tego typu indukują niezależne od T reakcje immunologiczne powodujące późny rozwój, głównie odpowiedzi typu IgM niedające pamięci immunologicznej. Malaria typowo indukuje odporność, która może się rozwijać powoli, obejmuje podwyższenie poziomu przeciwciała IgM, i zanika w ciągu roku pozostawiając pacjenta podatnego na nową infekcję w następnym roku. Stosując niniejszy wynalazek, można określić, który z większych bogatych w węglowodany glikokoniugatów form malarii na etapie ssaka indukuje dominujące odpowiedzi IgM. Jest następnie możliwe zredukowanie tych glikokoniugatów do podjednostek oligosacharydów. Stosując procedury opisane powyżej, oligosacharydy można z kolei sprzęgać z nośnikiem białkowym jako środkiem indukowania zależnej od komórki T odpowiedzi immunologicznej na specyficzne węglowodany. Dla sprawdzenia tego podejścia, szczepione zwierzęta można prowokować wirulentnymi homologicznymi pasożytami dla ustalenia możliwości ochronnych cząsteczki szczepionki. To podejście będzie udane dla wszystkich członów rodziny Apicomplexa, do których należy pasożyt malarii.

Ochronne odpowiedzi immunologiczne wobec nicieni można także wytwarzać sposobami i kompozycjami według wynalazku. Jelito nicieni jest wyłożone pojedynczą warstwą komórek, które mają ciałka Golgiego i inkluzje ograniczone błoną. Jelito jest zabezpieczone na stronie światła przez luźno związaną warstwę bezpostaciowej substancji (Mehlhorn i in., Parasitology in Focus, Facts and Trends, rozdz. 3, Springer-Verlag, NY, 1988). Ta sytuacja przypomina powierzchnię pasożytniczych płazińców. Stosując opisane tutaj procedury, substancję stanowiącą luźno związaną warstwę można wydzielić i stosować do wytwarzania szczepionki koniugatu oligosacharydu. Taką szczepionkę można stosować do szczepienia gospodarzy wobec infekcji robakami obłymi, szczególnie członkami rodziny Trichostongylidae, której członkowie są poważnymi patogenami domowych zwierząt gospodarskich.

Anty-idiotypowe szczepionki także mieszczą się w wynalazku. Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał o wysokiej zachłanności anty-LG jest możliwe sposobami i kompozycjami według wynalazku. Znaną technikę monoklonalnego przeciwciała (mAb) można stosować do wytwarzania dużych ilości anty-idiotypu (anti-id) wobec regionu V (idiotypu) przeciwciała o wykazanej ochronnej wartości stosując standardowe techniki. Ochronną wartość specyficznego przeciwciała można ustalić stosując procedury inkubacji in vitro, w których żywe pasożyty zawiesza się w różnych stężeniach przeciwciała i obserwuje żywotność pasożyta z czasem. Zabezpieczenie ocenia się przez pasywny transfer specyficznych monoklonalnych przeciwciał do podatnych gospodarzy, następnie prowokację homologicznym wirulentnym pasożytem, np., jak opisano w tym opisie. Zdolność przeciwciała do zabijania żywych ssaków gospodarzy będzie uważana za najlepszy dowód leczniczej lub profilaktycznej wartości mAb. Ta procedura jest szczególnie dopasowana do takich sytuacji, gdy LG konkretnego eukariotycznego pasożyta jest trudne lub kosztowne do wytworzenia.

Claims (50)

1. Kompozycja wywołująca u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną wobec gatunku z rodzaju Schistosoma, znamienna tym, że, obejmuje grupę nośnikową sprzężoną z oligosacharydem otrzymanym z wydzielonego lipoglikanu zawierającego grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, dwie do czterech grup glukozaminowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup ramnozowych na grupę fukozy, i jedną do trzech grup mannozowych na grupę fukozy.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa i odpowiada lipoglikanowi znajdowanemu na powierzchni eukarionta.

3. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, znamienna tym, że eukariontem jest gatunek z rodzaju Schistosoma.

4. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że linkerem jest 2-(4-aminofenylo)etyloamina.

PL 203 789 B1

6. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienna tym, że grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu.

7. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienna tym, że oligosacharyd zawiera nieredukującą grupę końcową.

8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da.

9. Kompozycja wywołująca u ssaka ochronną odpowiedź immunologiczną wobec gatunku z rodzaju Fasciola, znamienna tym, że obejmuje grupę nośnikową sprzężoną z oligosacharydem otrzymanym z wydzielonego lipoglikanu zawierającego grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grupy galaktozoaminowych na grupę fukozy, siedem do jedenastu grup glukozaminowych na grupę fukozy, trzy do pięciu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, i trzy do pięciu grup mannozowych na grupę fukozy.

10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa i odpowiada lipoglikanowi znajdowanemu na powierzchni eukarionta.

11. Kompozycja według zastrz. 9, albo 10, znamienna tym, że eukariontem jest gatunek z rodzaju Fasciola.

12. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że linkerem jest 2-(4-aminofenylo)etyloamina.

14. Kompozycja według zastrz. 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, znamienna tym, że grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu.

15. Kompozycja według zastrz. 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, znamienna tym, że oligosacharyd zawiera nieredukującą grupę końcową.

16. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że oligosacharyd zawiera ponadto inozytol.

17. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da.

18. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1 do wywoływania u kręgowca ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec eukariotycznego pasożyta.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa.

20. Zastosowanie według zastrz. 18, albo 19, znamienne tym, że eukariontem jest pierwotniak.

21. Zastosowanie według zastrz. 18, albo 19, znamienne tym, że eukariontem jest dorosły płaziniec.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że dorosły płaziniec jest z rodzaju Schistosoma.

23. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że ochronna odpowiedź immunologiczna obejmuje przeciwciało odpowiedzi zależne od komórki T.

24. Zastosowanie według zastrz. 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, znamienne tym, że grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że linkerem jest 2-(4-aminofenylo)etyloamina.

26. Zastosowanie według zastrz. 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, znamienne tym, że grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu.

27. Zastosowanie według zastrz. 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, znamienne tym, że oligosacharyd zawiera nieredukującą grupę końcową.

28. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da.

29. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 9 do wywoływania u kręgowca ochronnej odpowiedzi immunologicznej wobec eukariotycznego pasożyta.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa.

31. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że eukariontem jest pierwotniak.

32. Zastosowanie według zastrz. 29, albo 30, znamienne tym, że eukariontem jest dorosły płaziniec.

33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że dorosły płaziniec jest z rodzaju Fasciola.

34. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że ochronna odpowiedź immunologiczna obejmuje przeciwciało odpowiedzi zależne od komórki T.

PL 203 789 B1

35. Zastosowanie według zastrz. 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 34, znamienne tym, że grupę nośnikową sprzęga się z oligosacharydem przez linker.

36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że linkerem jest 2-(4-aminofenylo)etyloamina.

37. Zastosowanie według zastrz. 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 34, albo 35, albo 36, znamienne tym, że grupę nośnikową sprzęga się z mieszaniną oligosacharydów otrzymanych z lipoglikanu.

38. Zastosowanie według zastrz. 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 34, albo 35, albo 36, albo 37, znamienne tym, że oligosacharyd zawiera nieredukującą grupę końcową.

39. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że mieszanina oligosacharydów zawiera oligosacharydy mające masę cząsteczkową od 800 do 3000 Da.

40. Wydzielony lipoglikan znajdowany na powierzchni eukarionta, obejmujący grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, dwie do czterech grup glukozaminowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup ramnozowych na grupę fukozy, i jedną do trzech grup mannozowych na grupę fukozy.

41. Lipoglikan według zastrz. 40, znamienny tym, że ma masę cząsteczkową około 180 kDa.

42. Lipoglikan według zastrz. 40, znamienny tym, że zawiera, na każdą grupę fukozy, cztery grupy galaktozoaminowe, trzy grupy glukozaminowe, dwie grupy galaktozowe, dwie grupy glukozowe, jedną do dwu grup ramnozowych, i dwie grupy mannozowe.

43. Lipoglikan według zastrz. 40, albo 41, albo 42, znamienny tym, że otrzymuje się go z gatunków rodzaju Schistosoma.

44. Wydzielony lipoglikan znajdowany na powierzchni eukarionta, obejmujący grupę lipidową, jedną lub więcej grup fukozowych, trzy do pięciu grup galaktozoaminowych na grupę fukozy, siedem do jedenastu grup glukozaminowych na grupę fukozy, trzy do pięciu grup galaktozowych na grupę fukozy, jedną do dwu grup glukozowych na grupę fukozy, i trzy do pięciu grup mannozowych na grupę fukozy.

45. Lipoglikan według zastrz. 44, znamienny tym, że lipoglikan ma masę cząsteczkową około 180 kDa.

46. Lipoglikan według zastrz. 44 albo 45, znamienny tym, że lipoglikan zawiera, na każdą grupę fukozy, cztery grupy galaktozoaminowe, dziewięć grup glukozaminowych, cztery grupy galaktozowe, jedną grupę glukozową, i cztery grupy mannozowe.

47. Lipoglikan według zastrz. 44 albo 45, znamienny tym, że otrzymuje się go z gatunków rodzaju Fasciola.

48. Lipoglikan według zastrz. 44 albo 45, znamienny tym, że zawiera ponadto inozytol.

49. Wydzielony oligosacharyd otrzymany z lipokglikanu określonego w zastrz. 40.

50. Wydzielony oligosacharyd otrzymany z lipokglikanu określonego w zastrz. 44.