PL198094B1 - Sposób zwiększania szybkości wzrostu i/lub kontrolowania aktywności metabolicznej bakterii kwasu mlekowego, sposób przedłużania okresu trwałości i/lub jakości produktu spożywczego, kompozycja kultury starterowej, bakteria kwasu mlekowego - Google Patents

Abstract

1. Sposób zwi ekszania szybko sci wzrostu i/lub kontrolowania aktywno sci metabolicznej szcze- pu bakterii kwasu mlekowego, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie szczepu w po laczeniu z organizmem pomocniczym bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt w metabolizmie pirogronianu. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania szybkości wzrostu, sposób przedłużania okresu trwałości, kompozycja kultury starterowej, bakteria kwasu mlekowego.

Bakterie kwasu mlekowego stosuje się powszechnie jako kultury początkowe w przemyśle spożywczym do wytwarzania fermentowanych produktów obejmujących produkty mleczarskie, takie jak np. jogurt albo ser, produkty mięsne, produkty piekarnicze, wino i produkty warzywne.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „bakterie kwasu mlekowego” dotyczy Gram-dodatnich, mikroaerofilowych albo anaerobowych bakterii, które fermentują cukry z wytworzeniem kwasów, w tym głównie kwasu mlekowego, kwasu octowego, kwasu mrówkowego i kwasu propionowego. Najbardziej przydatne przemysłowo bakterie kwasu mlekowego spotyka się wśród gatunku Lactococcus, takich jak Lactococcus lactis, gatunki Lactobacillus, gatunki Streptococcus, gatunki Leuconostoc, gatunki Pediococcus i gatunki Propionibacterium. Do grupy bakterii kwasu mlekowego zalicza się również ścisłe anaeroby, takie jak genus Bifidobacterium.

Gdy kulturę starterową bakterii kwasu mlekowego doda się do mleka, albo innego materiału spożywczego i zapewni się odpowiednie warunki wzrostu i aktywności metabolicznej, bakterie zaczynają się rozmnażać po okresie czasu zwanym okresem opóźnienia, podczas którego bakterie adaptują się do nowych warunków. Po rozpoczęciu namnażania bakterii następuje gwałtowna konwersja cytrynianu, laktozy albo innych cukrów do kwasu mlekowego/mleczanu, jako głównego metabolitu kwasowego i prawdopodobnie do innych kwasów w tym octanu, co powoduje spadek pH. Oprócz tego, podczas wzrostu bakterii kwasu mlekowego powstaje kilka innych metabolitów, takich jak np. aldehyd octowy, α-acetylomleczan, acetoina, diacetyl i glikol 2,3-butylenowy (butanodiol).

Szybkość wzrostu i aktywność metaboliczną kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego można kontrolować przez dobór odpowiednich warunków wzrostu dla zastosowanych określonych szczepów kultur starterowych, takich jak odpowiednia temperatura wzrostu, ciśnienie tlenu i zawartość czynników odżywczych.

W przemyśle mleczarskim wiadomo, że zmniejszenie zawartości tlenu w surowym materiale mleczarskim powoduje szybszy wzrost dodanych bakterii kwasu mlekowego, co z kolei powoduje szybsze kwaśnienie zaszczepionego mleka. Obecnie, takie zmniejszenie zawartości tlenu przeprowadza się przez podgrzanie mleka w układach otwartych, przez odpowietrzenie mleka pod próżnią albo przez traktowanie określane jako przedmuchanie. Alternatywne środki zmniejszania zawartości tlenu obejmują dodanie związków wymiatających tlen.

Kultury starterowe bakterii kwasu mlekowego stosuje się powszechnie w przemyśle spożywczym jako mieszane kultury szczepów obejmujące jeden albo kilka gatunków. Dla wielu mieszanych kultur szczepów, takich jak jogurtowe kultury starterowe obejmujące Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus, opisano symbiotyczne zależności między gatunkami, prawdopodobnie z powodu aktywności proteolitycznej przynajmniej jednego ze szczepów (Rajagopal i in., J. Dairy Sci., 1990 73:894-899). Opisano również, że w takich mieszanych kulturach jogurtowych pobudzenie wzrostu składnika Lactobacillus jest spowodowane tworzeniem kwasu mrówkowego przez Streptococcus thermophilus (Suzuki i in., 1986). Dalszy przykład zależności symbiotycznych między gatunkami w kulturze mieszanej ujawniono w EP 0 111 392 A2, gdzie wykazano, że wybrane szczepy Streptococcus thermophilus typu dzikiego wykazujące stosunkowo wysoki wychwyt tlenu polepszają przeżywanie ściśle anaerobowych gatunków Bifidobacterium, gdy są one połączone ze szczepem Streptococcus.

Jednakże, w stanie techniki nie opisano odpowiednich do stosowania ogólnego sposobów biologicznych, dzięki którym można byłoby zwiększyć wzrost i aktywność metaboliczną kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego. Stąd, podstawowym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie takich sposobów.

Sposób zwiększania szybkości wzrostu i/lub kontrolowania aktywności metabolicznej szczepu bakterii kwasu mlekowego według wynalazku polega na tym, że hoduje się szczep w połączeniu z organizmem pomocniczym bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt w metabolizmie pirogronianu.

Należy rozumieć, że zwiększenie tempa wzrostu dotyczy dowolnego działania powodującego większą liczbę komórek kultury starterowej w pożywce po danym okresie czasu, tzn. że komórki bakterii kwasu mlekowego namnażają się w tempie szybszym niż bez organizmu wspomagającego, albo komórki zaczynają namnażać się wcześniej z szybkością równą albo wyższą w porównaniu z namnażaniem się bakterii kwasu mlekowego bez organizmu wspomagającego.

PL 198 094 B1

W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „kontrolowanie aktywności metabolicznej” dotyczy zwiększonej albo zmniejszonej produkcji dowolnego metabolitu wytworzonego przez kulturę starterową, w tym kwasów, takich jak kwas mlekowy, octowy, mrówkowy i/lub propionowy. Przykłady innych istotnych metabolitów, których wytwarzanie można kontrolować, obejmują związki aromatyczne, takie jak aldehyd octowy, α-acetylomleczan, acetoina, diacetyl i glikol 2,3-butylenowy (butanodienol).

Korzystnie sposobem według wynalazku zwiększa się aktywność metaboliczną szczepu bakterii kwasu mlekowego prowadzącą do wzrostu wytwarzania kwasów.

Zgodnie z wynalazkiem, organizm wspomagający bakterie kwasu mlekowego ma defekt metabolizmu pirogronianu. W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „defekt metabolizmu pirogronianu” oznacza, że organizm pomocniczy w porównaniu ze szczepem rodzicielskim ma zmieniony metabolizm pirogronianu, tj. zwiększoną albo zmniejszoną produkcję jednego albo więcej metabolitów pochodzących z pirogronianu.

Korzystnie w sposobie według wynalazku organizm pomocniczy ma defekt w zdolności wyrażania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.

W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „defekt w zdolności wyrażenia powyższych enzymów” oznacza, że organizm pomocniczy, w porównaniu ze szczepem rodzicielskim, z którego pochodzi, wykazuje zmniejszoną produkcję enzymu, albo że enzym w ogóle nie jest wytwarzany, niezależnie od warunków wzrostu.

Korzystnie w sposobie według wynalazku organizmem pomocniczym jest pochodna bakterii kwasu mlekowego, korzystnie, która nie wytwarza kwasu mlekowego.

Przykłady organizmów pomocniczych bakterii kwasu mlekowego, które są niezdolne do wyrażania przynajmniej jednego z wyżej wymienionych enzymów, obejmują Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN223, zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11036, który jest niezdolny do wytwarzania liazy mrówczanowej pirogronianu (Pfl) i dehydrogenazy mleczanowej (Ldh) oraz Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN224, zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11037, który ma defekt Ldh.

W jednym z wykonań powyższego sposobu, hodowanie szczepu bakterii kwasu mlekowego z organizmem pomocniczym powoduje zwiększenie produkcji kwasu mlekowego przez szczep.

Oczywiste, że wyżej wspomniane wytwarzanie kwasów powoduje obniżenie pH pożywki zaszczepionej mieszaną kulturą starterową w połączeniu z organizmem pomocniczym stosowanym w sposobie według wynalazku, poniżej poziomu uzyskanego w pożywce zaszczepionej samą kulturą starterową. Różnica w pH pożywki zaszczepionej samą kulturą starterową oraz pożywki zaszczepionej kulturą mieszaną określa się jako ApH.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wzrost wytwarzania kwasu odpowiada wartości ApH co najmniej 0,05 po 3 godzinnej albo dłuższej hodowli, np. ApH przynajmniej 0,5 po 3 godzinnej albo dłuższej hodowli, np. ApH przynajmniej 1 po 3 godzinnej albo dłuższej hodowli.

Korzystnie w sposobie według wynalazku szczep hoduje się w pożywce o początkowym nasyceniu tlenem, które wynosi 10% albo więcej, korzystniej początkowe nasycenie tlenem pożywki wynosi 20% albo więcej.

W przydatnych wykonaniach, kultura starterowa bakterii kwasu mlekowego jest mieszaną hodowlą szczepów obejmującą przynajmniej 2 szczepy bakterii kwasu mlekowego. Przykłady takich mieszanych kultur szczepów opisane są w poniższych przykładach. Zatem, w szczególnie korzystnych wykonaniach wynalazku, organizm pomocniczy jest zdolny do zwiększania szybkości wzrostu przynajmniej jednego ze szczepów mieszanej kultury szczepów i/lub zdolny do kontrolowania aktywności metabolicznej przynajmniej jednego ze szczepów bakterii kwasu mlekowego kultury mieszanej szczepów. Warunki wzrostu pod każdym względem optymalne dla wszystkich szczepów takich mieszanych kultur szczepów bakterii kwasu mlekowego nie muszą być określone. Aktywność metaboliczną kultury mieszanej szczepów można kontrolować selektywnie przez dobór temperatury, która faworyzuje zwiększoną produkcję żądanych metabolitów przez jeden albo wiele szczepów, co z drugiej strony może spowodować zmniejszone wytwarzanie innych metabolitów przez inne szczepy. Jednakże, całkowitym efektem hodowania kultur mieszanych szczepów bakterii kwasu mlekowego z organizmem pomocniczym według wynalazku w porównaniu z hodowlą samej kultury mieszanych szczepów bakterii kwasu mlekowego, jest zwiększona liczba komórek, zwiększona produkcja jednego albo więcej

PL 198 094 B1 metabolitów, w tym kwasów i związków aromatycznych i/lub zmniejszona produkcja jednego albo więcej metabolitów.

Przemysłowe wytwarzanie produktów spożywczych zwykle obejmuje takie etapy procesu jak mieszanie, pompowanie albo chłodzenie, w związku z czym stopień nasycenia tlenem produktów spożywczych wzrasta i w wyniku tego materiał wyjściowy dla produktu spożywczego może mieć względnie wysoką zawartość początkową tlenu (wysoki stopień nasycenia tlenem), co jest niekorzystne dla kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego. Nieoczekiwanie stwierdzono, że gdy kulturę starterową hoduje się w materiale wyjściowym dla produktu spożywczego o początkowym stopniu nasycenia tlenem rzędu 10% albo wyżej, lub korzystnie 20% albo wyżej, w połączeniu z organizmem pomocniczym, jej tempo wzrostu jest zasadniczo zwiększone i/lub jej aktywność metaboliczna jest kontrolowana w porównaniu z hodowlą bez organizmu pomocniczego w tych samych warunkach.

W przydatnych wykonaniach wynalazku, organizmem pomocniczym jest bakteria kwasu mlekowego zdolna do zmniejszania ilości tlenu występującego w ośrodku.

Korzystnie w sposobie według wynalazku ilość tlenu obecna w pożywce, w której hodowane są szczep bakterii kwasu mlekowego i organizm pomocniczy zmniejsza się o co najmniej 1% na godzinę, w tym o co najmniej 10% na godzinę, jak co najmniej 20% na godzinę, np. o co najmniej 30% na godzinę. Zmniejszenie może wynosić nawet co najmniej 40% na godzinę, w tym co najmniej 50% na godzinę, jak co najmniej 60% na godzinę, np. co najmniej 70% na godzinę, jak co najmniej 80% na godzinę albo co najmniej 90% na godzinę.

Sposób zwiększania szybkości wzrostu i/lub kontrolowania aktywności metabolicznej według wynalazku powoduje, że zwiększoną szybkość wzrostu i/lub kontrolę aktywności metabolicznej kultury starterowej bakterii kwasu mlekowego można uzyskać nawet w ośrodku o niskim nasyceniu tlenem, takim jak np. w zakresie 1-10%. Jednakże, sposób może być szczególnie przydatny, gdy kultury starterowe bakterii kwasu mlekowego hoduje się w materiale wyjściowym produktu spożywczego o początkowym nasyceniu tlenem wynoszącym 10% albo więcej, np. 20% albo więcej, jak 40% albo więcej, np. 50% albo więcej, jak 60% albo więcej, np. 70% albo więcej, jak 80% albo więcej i np. 90% albo więcej, jak 95% albo więcej.

Organizm pomocniczy jest pochodną bakterii kwasu mlekowego. W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „pochodna bakterii kwasu mlekowego” obejmuje mutanta bakterii kwasu mlekowego, którego otrzymano przez selekcjonowanie spontanicznie powstałego mutanta szczepu typu dzikiego bakterii kwasu mlekowego albo alternatywnie, przez konstruowanie mutanta szczepu bakterii kwasu mlekowego typu dzikiego albo uprzednio zmutowanego szczepu. Takie konstruowanie można przeprowadzić przez poddanie szczepu dowolnemu konwencjonalnemu traktowaniu mutagenizującemu, w tym traktowaniu chemicznymi mutagenami i światłem UV.

Mutanta można również skonstruować przez genetyczne modyfikowanie szczepu rodzicielskiego, w tym przez delecje, insercje, substytucje nukleotydów. Te modyfikacje genetyczne można osiągnąć technikami wprowadzania modyfikacji znanymi w stanie techniki, w tym technikami rekombinacji DNA, jak kierowana mutageneza, technika reakcji łańcuchowej polimerazy, losowej i pseudo-losowej mutagenezy z użyciem mutagenu, mutagenezy in vitro, albo dowolną inną znaną metodą wprowadzania genetycznych modyfikacji do substancji obejmujących albo pochodzących z naturalnie występujących kwasów nukleinowych albo aminokwasów. Według wynalazku, pochodna bakterii kwasu mlekowego może pochodzić z gatunku Lactococcus, takiego jak Lactococcus lactis, gatunku Lactobacillus, gatunku Streptococcus, gatunku Leuconostoc, gatunku Pediococcus, gatunku Propionibacterium albo gatunku Bifidobacterium.

W tym kontekście, korzystnym gatunkiem jest Lactococcus lactis, w tym podtyp lactis, obejmujący biovar diacetylactis. Przykłady odpowiednich organizmów pomocniczych obejmują Lactococcus lactis, podtyp lactis szczep DN223, który zdeponowano pod numerem dostępu DSM 11036 i Lactococcus lactis, podtyp lactis szczep DN224, który zdeponowano pod numerem dostępu DSM 11037. DN223 i DN224 opisano w WO 98/07843. W poniższych przykładach odniesienia podano szczegóły izolacji tych szczepów.

Stwierdzono, że pochodne, takie jak DN223 i DN224, które w stosunku do szczepów rodzicielskich wykazują zmniejszone wytwarzanie kwasu, są szczególnie przydatne w powyższym sposobie zwiększania szybkości wzrostu albo kontrolowania aktywności metabolicznej.

Zwiększenie szybkości wzrostu i/lub kontrolowanie aktywności metabolicznej osiągnięte powyższym sposobem uzyskuje się, gdy kulturę starterową hoduje się w dowolnej pożywce podtrzymującej wzrost bakterii kwasu mlekowego.

PL 198 094 B1

Tak więc, efekt można uzyskać w wielu różnych produktach albo składnikach produktów spożywczych. Korzystnie w sposobie według wynalazku szczep bakterii kwasu mlekowego hoduje się w pożywce wybranej z grupy składającej się z mleka, mięsa, surowego ciasta z mąki, wina i surowca roślinnego, takiego jak warzywa, owoce lub pasza.

Kulturę starterową i organizm pomocniczy dodaje się w ilościach, które dostarczają liczbę żywych komórek w każdym ze składników, wynoszącą przynajmniej 10³ jednostek tworzących kolonie (CFU) na gram materiału wyjściowego produktu spożywczego, jak np. przynajmniej 10⁴ CFU/g, w tym przynajmniej 10⁵ CFU/g, jak np. 10⁶ CFU/g, np. przynajmniej 10⁷ CFU/g, jak przynajmniej 10⁸ CFU/g, np. przynajmniej 10⁹ CFU/g, jak przynajmniej 10¹⁰ CFU/g, np. przynajmniej 10¹¹ CFU/g materiału wyjściowego produktu spożywczego.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosunek pomiędzy komórkami organizmu pomocniczego a komórkami szczepu bakterii kwasu mlekowego mieści się w zakresie od 1000:1 do 1:1000; od 500:1 do 1:500, np. od 100:1 do 1:100, jak od 50:1 do 1:50, np. w zakresie od 20:1 do 1:20; jak w zakresie od 10:1 do 1:10 albo w zakresie od 5:1 do 1:5; jak w zakresie od 2:1 do 1:2.

Podczas metabolizmu bakterii kwasu mlekowego konieczna jest regeneracja NAD+. Kilka enzymów związanych z metabolizmem pirogronianu, w tym Ldh, jest zdolnych do tej regeneracji przez przekształcenie pirogronianu w mleczan. Zatem, w szczepie bakterii kwasu mlekowego, który wykazuje defekt metabolizmu pirogronianu, który powoduje że zdolność szczepu do regeneracji NAD+ jest zmniejszona, istnieje zapotrzebowanie na alternatywne sposoby zapewnienia pożądanej ilości tego istotnego związku. Jedną z takich alternatywnych dróg dostępnych dla bakterii kwasu mlekowego jest regeneracja przy użyciu oksydaz NADH, z których opisano trzy rodzaje (Condon, 1987). Pierwsze dwie są niehemowymi flawoproteinami, z których jedna katalizuje redukcję O2 do H2O2, druga zaś redukcję O2 do H2O. Jednym z przykładów tej drugiej grupy, tj. oksydaz NADH tworzących H2O, jest enzym kodowany przez gen nox. Enzym ten przy zużyciu tlenu regeneruje dwa odpowiedniki NAD+.

Stąd, rozważa się że zwiększone działanie organizmu pomocniczego zgodnie z wynalazkiem może być dalej poprawione przez nadekspresję enzymu redukującego O2 (tj. zużywającego O2), w tym enzymu kodowanego przez gen nox występujący w organizmie.

Korzystnie w sposobie według wynalazku gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 ulega nadekspresji w organizmie pomocniczym.

Bardziej korzystnie nadekspresji w organizmie pomocniczym ulega gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 i regeneracji NAD+.

W tym kontekście, określenie „nadekspresja” oznacza, że poziom ekspresji genu jest podwyższony w stosunku do poziomu w szczepie rodzicielskim, z którego pochodzi organizm pomocniczy z nadekspresją genu. Zatem, organizm pomocniczy, który jest zdolny do nadekspresji genu kodującego enzym regenerujący NAD+, korzystnie wyraża gen na poziomie, który jest przynajmniej 10% wyższy niż poziom, na którym gen ulega ekspresji w organizmie rodzicielskim, jak przynajmniej 25% wyższy, np. przynajmniej 50% wyższy. Szczególnie korzystnie poziom ekspresji jest przynajmniej 100% większy niż w organizmie rodzicielskim.

Nadekspresję genu można zapewnić sposobami znanymi w stanie techniki, jak np. przez wprowadzenie do organizmu pomocniczego wielokrotnych kopii genu na chromosomie i/lub elementach pozachromosomalnych, takich jak plazmidy, fagi albo kosmidy.

Alternatywnie, nadekspresja jest wynikiem funkcjonalnego połączenia genu albo genów naturalnie występujących w organizmie pomocniczym, albo genu/genów, które są wprowadzone do organizmu z sekwencją regulatorową, która zwiększa ekspresję albo na poziomie transkrypcji albo translacji. W tym kontekście, jednym z użytecznych podejść jest połączenie funkcjonalne genu z silnym homologicznym albo heterologicznym promotorem, który ewentualnie jest promotorem możliwym do regulowania. Interesującymi promotorami są promotory tRNA i rRNA, w tym promotory PI i PIl oraz promotor purD z Lactococcus lactis podtyp lactis jak opisano w WO 98/16086.

Możliwy do regulowania promotor regulujący ekspresję genu kodującego enzym regenerujący NAD+ można korzystnie regulować czynnikiem wybranym z grupy obejmującej pH, temperaturę wzrostu, zmianę temperatury wywołującą ekspresję genów szoku cieplnego, skład pożywki, w tym siłę jonową/zawartość NaCl oraz obecność/brak prekursorów nukleotydów purynowych, oraz fazę wzrostu/tempo wzrostu bakterii.

Możliwe jest również uzyskanie organizmu pomocniczego o zwiększonej aktywności regeneracyjnej NAD+ przez zmianę struktury enzymu np. przez modyfikowanie sekwencji kodującej albo post-translacyjnie

PL 198 094 B1 znanymi sposobami. W obecnym kontekście, przykładem odpowiedniego enzymu regenerującego NAD+ jest oksydaza NADH kodowana przez gen nox.

Zgodnie z niniejszym sposobem według wynalazku, organizm pomocniczy zdolny do nadekspresji enzymu regenerującego NAD+ obejmuje organizm, w którym korzystnie enzym katalizuje redukcję O2 do H2O albo H2O2. Korzystnie jest to oksydaza NaDH:H2O, enzym o sekwencji Id. Sekw. nr 2, jak pokazano niżej. Korzystnie organizmem pomocniczym jest szczep Ldh'.

Jak opisano wyżej, szczepy bakterii kwasu mlekowego, które mają defekt metabolizmu pirogronianu obejmują szczepy, które są zdolne do zmniejszania ilości tlenu w podłożu. Stwierdzono, że takie szczepy, zastosowane same, tj. bez równoczesnego dodania szczepu kultury starterowej, polepszają trwałość podczas przechowywania produktu spożywczego.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób przedłużania okresu trwałości i/lub jakości produktu spożywczego obejmujący dodawanie do produktu szczepu bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt metabolizmu pirogronianu.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „trwałość podczas przechowywania” oznacza czas, w którym produkt spożywczy nadaje się do spożycia.

W korzystnym sposobie przedłużania okresu trwałości i/lub jakości produktu spożywczego szczepem bakterii kwasu mlekowego jest szczep, który zasadniczo nie wytwarza kwasu mlekowego.

W korzystnym sposobie według wynalazku, szczep bakterii kwasu mlekowego, który jest przydatny do przedłużania trwałości podczas przechowywania produktów spożywczych, obejmuje szczep bakterii kwasu mlekowego z defektem w zdolności wyrażania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.

Powyższy efekt poprawy trwałości podczas przechowywania można osiągnąć w różnych składnikach produktów spożywczych, takich jak mleko w tym, mleko nie- pasteryzowane (surowe), mięso, surowe ciasto z mąki, wino i surowce roślinne, takie jak warzywa, owoce i pasze. Korzystnie w sposobie przedłużania okresu trwałości i/lub jakości produktu spożywczego produkt spożywczy jest wybrany z grupy składającej się z mleka, surowego ciasta z mąki, mięsa, wina i surowca roślinnego, korzystnie mleka niepasteryzowanego.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „mleko” ma oznaczać dowolny rodzaj mleka albo składników mleka, w tym np. mleko krowie, ludzkie, bawole, kozie, owcze, produkty mleczarskie wytworzone z takiego mleka albo serwatka.

Szybkość, z jaką powyższe kultury bakterii kwasu mlekowego usuwają tlen, jest zależna od warunków środowiska, np. od temperatury. Gdy temperatura składników produktu spożywczego jest niższa od temperatury pokojowej, taka jak poniżej 10°C, np. poniżej 5°C, szybkość z jaką usuwany jest tlen może być tak niska jak 1% na godzinę i nadal może mieć wpływ na czas trwałości i/lub jakość produktu spożywczego.

Zastosowaną według wynalazku nie-zakwaszającą kulturę bakterii kwasu mlekowego korzystnie miesza się z produktem spożywczym w miejscu wytwarzania. Tak więc, przykładowo, gdy produkt spożywczy jest niepasteryzowanym, surowym mlekiem, korzystnie szczep bakterii kwasu mlekowego dodaje się do surowego mleka po udoju.

Dogodnie, kulturę dodaje się do świeżego mleka w zbiorniku chłodzącym na farmie mleczarskiej albo do zbiornika do przechowywania w mleczarni.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto kompozycja kultury starterowej obejmująca bakterię kwasu mlekowego, która nie ma defektu w metabolizmie pirogronianu oraz organizm pomocniczy bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt w metabolizmie pirogronianu.

Zwykle, takie kompozycje zawierają bakterie w postaci stężonej, w tym koncentraty zamrożone, wysuszone albo liofilizowane, o stężeniu żywotnych komórek wynoszącym przynajmniej 10⁵ CFU/g kompozycji ja^{k p}rz^ynajmmej ^{106 CFU/g} w ^tym ^prz^ynajmnⁱej W⁷ C^FU/g n^p. ^prz^ynajmmej ^1o8cFU/g, np. przynajmniej 10¹⁰ CFU/g, jak przynajmniej 10¹¹ CFU/g, np. przynajmniej 10¹² CFU/g, jak 10¹³ CFU/g kompozycji. Kompozycja może dalej obejmować substancje krioprotekcyjne i/lub konwencjonalne dodatki, w tym substancje odżywcze, takie jak ekstrakt drożdżowy, cukry i witaminy.

Korzystnie organizm pomocniczy w kompozycji według wynalazku zasadniczo nie wytwarza kwasu mlekowego.

Korzystnie organizm pomocniczy ma defekt w zdolności wytwarzania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogonianowej,

PL 198 094 B1 dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.

Korzystnie organizmem pomocniczym jest Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN223 zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11036 lub Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN224 zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11037.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 ulega nadekspresji w organizmie pomocniczym.

Bardziej korzystnie w organizmie pomocniczym gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 i regeneracji NAD+ ulega nadekspresji, a enzym katalizuje redukcję O2 do H2O albo H2O2.

Najkorzystniej enzymem jest oksydaza NADH:H2O, w tym enzym o sekwencji Id. Sekw. nr 2.

Korzystnym organizmem pomocniczym w kompozycji według wynalazku jest szczep Ldh.

Korzystnie kompozycja według wynalazku obejmuje dwa albo więcej różnych szczepów bakterii kwasu mlekowego.

W zakres wynalazku wchodzą też bakterie kwasu mlekowego, które mają defekt co najmniej jednego enzymu związanego z metabolizmem pirogronianu, i w których gen zdolny do katalizowania redukcji O2 ulega nadekspresji.

Korzystnie bakterie według wynalazku mają defekt co najmniej jednego enzymu związanego z metabolizmem pirogronianu, a gen zdolny do katalizowania redukcji O2 i regeneracji NAD+ ulega w nich nadekspresji.

Bardziej korzystnie, gen zdolny do regeneracji NAD+, który ulega nadekspresji, koduje enzym katalizujący redukcję O2 do H2O lub H2O2, korzystnie oksydazę NADH:H2O, w tym enzym o sekwencji Id. Sekw. nr 2.

Korzystnie bakteria według wynalazku ma defekt w zdolności wyrażania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z liazy mrówczanowej pirogronianu, dehydrogenazy pirogonianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.

Korzystnie bakteria według wynalazku zawiera izolowany fragment DNA pochodzący z bakterii kwasu mlekowego, przy czym fragment DNA obejmuje gen kodujący polipeptyd o aktywności oksydazy NADH:H2O.

Korzystnie fragment DNA jest wybrany z grupy składającej się z sekwencji pokazanej na Id. Sekw. nr 1 i jej odmiany albo pochodnej, która jest w co najmniej 50% identyczna z tą sekwencją i ma tę samą funkcję.

Korzystnie bakteria według wynalazku zawiera rekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą fragment DNA określony powyżej.

Wynalazek jest dalej zilustrowany poniższymi przykładami odniesienia, przykładami oraz rysunkami, w których:

Na Fig. 1 pokazano wpływ na szybkość zakwaszania samego mezofilowego szczepu kultury starterowej bakterii kwasu mlekowego B-11, podczas hodowli w pełnym mleku nisko pasteryzowanym tylko w 30°C (0,01% wagowych) oraz w połączeniu z, odpowiednio, Lactococcus lactis podtyp lactis szczep DN223 i 224, w następujących stężeniach: 0,005% wagowych, 0,01% wagowych do 0,02% wag.

Na Fig. 2 pokazano wpływ na szybkość zakwaszania samego mezofilowego szczepu kultury starterowej bakterii kwasu mlekowego B-11, podczas hodowli w ekologicznym, pełnym mleku nisko pasteryzowanym w 30°C (0,01% wagowych) oraz w połączeniu z, odpowiednio, Lactococcus lactis podtyp lactis szczep DN223 i 224, w następujących stężeniach: 0,005% wagowych, 0,01% wagowych do 0,02% wagowych.

Na Fig. 3 pokazano wpływ na szybkość zakwaszania samego mezofilowego szczepu kultury starterowej bakterii kwasu mlekowego B-11, podczas hodowli w odtłuszczonym mleku wysoko pasteryzowanym w 30°C (0,01% wagowych) oraz w połączeniu z, odpowiednio, Lactococcus lactis podtyp lactis szczep DN223 i 224, w następujących stężeniach: 0,005% wag., 0,01% wagowych do 0,02% wagowych.

Na Fig. 4 pokazano zakwaszanie pełnego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową termofilowego szczepu bakterii kwasu mlekowego jogurtu YC-460 (0,02% wag.), organizmem pomocniczym DN223 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,003% wagowych).

Na Fig. 5 pokazano zakwaszanie pełnego, ekologicznego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową termofilowego szczepu bakterii kwasu mlekowego jogurtu YC-460

PL 198 094 B1 (0,02% wagowych), organizmem pomocniczym DN223 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,003% wagowych).

Na Fig. 6A pokazano zakwaszanie pełnego, ekologicznego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową termofilowego szczepu bakterii kwasu mlekowego jogurtu YC-460 (0,02% wagowych), organizmem pomocniczym DN223 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,003% wagowych).

Na Fig. 6B pokazano wpływ na stężenie tlenu w pełnym, ekologicznym mleku nisko pasteryzowanym, zaszczepionym kulturą starterową termofilowego szczepu bakterii kwasu mlekowego jogurtu YC-460 (0,02% wagowych), organizmem pomocniczym DN223 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,003% wagowych).

Na Fig. 7A pokazano zakwaszanie pełnego, ekologicznego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową termofilowego szczepu jogurtu bakterii kwasu mlekowego YC-460 (0,02% wagowych), organizmem pomocniczym DN224 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN224 (0,003% wagowych).

Na Fig. 7B pokazano wpływ na stężenie tlenu w pełnym, ekologicznym mleku nisko pasteryzowanym, zaszczepionym kulturą starterową termofilowego szczepu bakterii kwasu mlekowego jogurtu YC-460 (0,02% wagowych), organizmem pomocniczym DN224 (0,003% wagowych) i odpowiednio YC-460 (0,02% wagowych) w połączeniu z DN224 (0,003% wagowych).

Na Fig. 8A pokazano zakwaszanie ekologicznego, pełnego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową mezofilowych bakterii kwasu mlekowego B-11 (0,01% wagowych), DN223 (0,0015% wagowych) i B-11 (0,01% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,0015% wagowych).

Na Fig. 8B pokazano wpływ na stężenie tlenu w pełnym, ekologicznym mleku nisko pasteryzowanym, zaszczepionym kulturą starterową mezofilowych bakterii kwasu mlekowego B-11 (0,01% wagowych), DN223 (0,0015% wagowych) i B-11 (0,01% wagowych) w połączeniu z DN223 (0,0015% wagowych).

Na Fig. 9A pokazano zakwaszanie ekologicznego, pełnego mleka nisko pasteryzowanego, zaszczepionego kulturą starterową mezofilowych bakterii kwasu mlekowego B-11 (0,01% wagowych), DN224 (0,0015% wagowych) i B-11 (0,01% wagowych) w połączeniu z DN224 (0,0015% wagowych).

Na Fig. 9B pokazano wpływ na stężenie tlenu w pełnym, ekologicznym mleku nisko pasteryzowanym, zaszczepionym kulturą starterową mezofilowych bakterii kwasu mlekowego B-11 (0,01% wagowych), DN224 (0,0015% wagowych) i B-11 (0,01% wagowych) w połączeniu z DN224 (0,0015% wagowych).

P r z y k ł a d y o d n i e s i e n i a

Materiały i Metody

1. Szczepy bakteryjne, pożywki i warunki wzrostu

W przykładach odniesienia zastosowano następujące szczepy bakterii kwasu mlekowego: Lactococcus lactis podgatunek lactis szczepy 1FHCY-1, MG1363 i CHCC373 (Chr. Hansen Culture Collection) oraz Lactococcus lactis podgatunek lactis biovar. diactylactis DB1341.

Jako pożywki wzrostowe zastosowano: (i) pożywkę M17 (Terzaghi i in., 1975); (ii) określoną pożywkę DN buforowaną fosforanem (Dickley i in., 1995) z octanem sodu albo bez (odpowiednio, DN-Ac albo DN). Pożywka DN nie zawierała kwasu liponowego, ale zawierała dodatek mrówczanu sodu w stężeniu 0,6%; oraz (iii) rekonstytuowane odtłuszczone mleko w proszku, RSM zawierające 9,5% proszku odtłuszczonego mleka ogrzewanego w niskiej temperaturze (Milex 240 1h, MD Foods, Dania).

Szczepy hodowano w 30°C i monitorowano wzrost przez pomiar gęstości optycznej (OD) przy długości fali 600 nm i/lub pH. Warunki anaerobowe do wzrostu na płytkach agarowych uzyskano przez inkubowanie w zamkniętym pojemniku z użyciem układu Anaerocult® A (Merck, Darmstadt, Niemcy). Anaerobowe warunki wzrostu dla hodowli w pożywce ciekłej oznaczają hodowlę bez wytrząsania, zaś warunki aerobowe oznaczają wzrost z wytrząsaniem.

2. Mutageneza L. lactis

Pojedynczą kolonią L. lactis zaszczepiono 10 ml pożywki DN i inkubowano przez 16 godzin z gwałtownym wytrząsaniem. Do przerośniętej hodowli dodano 150 pl etylometano sulfonianu (EMS, Sigma) i inkubowano mieszaninę wytrząsając. Po 2 godzinach, 10 probówek, z których każda zawierała 2 ml pożywki DN, zaszczepiono 0,2 ml mutagenizowanej kultury. Probówki inkubowano do następnego dnia wytrząsając, w celu ekspresji fenotypu. Do hodowli dodano sterylnej gliceryny w stężeniu końcowym 15% objętościowych i hodowle przechowywano w -70°C do momentu zastosowania.

PL 198 094 B1

3. Określanie aktywności dehydrogenazy mleczajowej

Pojedynczą kolonią L. lactis zaszczepiono 10 ml pożywki M17 i hodowano przez noc. Po schłodzeniu przez 15 minut na lodzie, komórki zebrano przez odwirowanie przy 7000 obrotów na minutę przez 5 min., w 4°C, płukano 5 ml lodowatego buforu do testu Ldh (50 mM octan-Tris, pH 6,0, 0,5 mM fruktozo-1,6-difosforan) i zawieszono ponownie w 1 ml lodowatego buforu do testu Ldh. Zawieszone komórki przeniesiono do 5 ml probówki szklanej i sonikowano na lodzie stosując sonikator Branson Sonifier 250, nastawiony na następujące parametry: czas 4 min., cykl 25%, moc 4. Następnie, zawartość probówki przeniesiono do chłodzonej lodem probówki Eppendorfa i odwirowano przy 15000 x g przez 5 min., w 4°C. Supernatant przeniesiono do nowej chłodzonej lodem probówki Eppendorfa. Aktywność właściwą Ldh w bezkomórkowym ekstrakcie mierzono w 25°C w następujący sposób: 5 μΙ bezkomórkowego ekstraktu dodano do 495 μl buforu do testu Ldh, zawierającego 0,2 mM NADH i 25 mM pirogronianu. Jako kontrolę zastosowano test bez pirogronianu. Przekształcenie NADH w NAD+ śledzono w czasie przy długości fali 340 nm stosując spektrofotometr Spectronic® Genesys 5. Jedna jednostka odpowiadała przekształceniu 1 μη^οΐθ NADH min¹ ml'¹ ekstraktu bezkomórkowego. Aktywność właściwą wyrażano jako jednostki/mg białka. Do mierzenia stężenia białka ekstraktu bezkomórkowego zastosowano test z kwasem bicinchoninowym (BCA) (Pierce, Rockford, USA) z albuminą (Pierce) jako wzorcem białka.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a1

Zapotrzebowanie na octan podczas wzrostu L. lactis

Początkowo, L. lactis podgatunek lactis szczep 1FHCY-1 i MG1363 badano pod względem wzrostu na, odpowiednio, pożywce DN z (DN) albo bez (DN-Ac) octanu.

Powyższe szczepy rozprowadzono na płytkach agarowych, odpowiednio, DN i DN-Ac. Płytki inkubowano przez 24 godziny w warunkach, odpowiednio, aerobowych i anaerobowych. Wyniki podsumowano w Tabeli 1 poniżej:

T a b e l a 1

Zapotrzebowanie 1FHCY-1 i MG1363 na octan

	Aerobowe	Anaerobowe
	+Ac	-Ac	+Ac	-Ac
1FHCY-1	+++	-	+++	+++
MG1363	+++	-	+++	+++

+++ : wielkość kolonii 0,5-1 mm;

- : brak wzrostu po dłuższej inkubacji

Badane szczepy L. lactis wykazywały całkowite zapotrzebowanie na octan podczas wzrostu w warunkach aerobowych.

Szczep typu dzikiego L. lactis podgatunek lactis CHCC373 wyselekcjonowano z kolekcji kultur Chr. Hansen A/S, Horsholm, Dania i badano pod względem zapotrzebowania na octan podczas wzrostu w warunkach aerobowych i anaerobowych, przez rozprowadzenie płynnej kultury szczepu szeregu płytek agarowych DM zawierających wzrastające stężenia octanu sodu w zakresie od 0 do 0,2% (wag./obj.).

W warunkach aerobowych obserwowano słaby wzrost w stężeniu 0,01% octanu sodu i pełny wzrost w stężeniu 0,02%. Nie obserwowano wzrostu w stężeniach poniżej 0,005% octanu sodu. W anaerobowych warunkach wzrostu obserwowano pełny wzrost w stężeniu 0-0,2% octanu sodu.

W poniższym doświadczeniu zastosowano pożywkę DN z 0,1% octanem sodu (DN) albo niezawierającą octanu sodu (DN-Ac).

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 2

Izolowanie defektywnych mutantów Pfl Lactococcus lactis podgatunek lactis CHCC373 i Lactococcus lactis podgatunek lactis biovar diacetylactis DB1341 i ich charakterystyka

2.1. Izolowanie mutantów

Mutagenizowane zapasy szczepów CHCC373 i DB1341 wytworzono jak to opisano wyżej i wysiano w rozcieńczeniach na płytki agarowe DN, które inkubowano aerobowo przez 24 do 48 godzin. Z tych płytek dla każdego szczepu wyselekcjonowano po 980 kolonii i rozprowadzono na płytki agarowe DN i DN-Ac, i inkubowano te płytki przez 24 godziny w warunkach anaerobowych. Wyselekcjonowano

PL 198 094 B1 dwa szczepy oznaczone, odpowiednio, DN220 i DN221, z mutagenizowanego szczepu CHCC373 i jeden szczep oznaczony DN227 z mutagenizowanego szczepu DB1341, który był niezdolny do wzrostu pod nieobecność octanu w warunkach anaerobowych.

Chromosomalny DNA wyizolowano z DN220, DN221 i CHCC373 i trawiono EcoRI i porównywano wzorce fragmentów przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym. Wzorce fragmentów wykazały, że DN220 oraz DN221 pochodziły z CHCC373. Do dalszych doświadczeń wybrano DN221.

Próbkę DN220, DN221 i DN227 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, 26 czerwca, 1996 pod numerami dostępu, odpowiednio, DSM 11033, DSM 11034 i DSM 11040.

2.2. Wzrost DN221 na pożywce M17 i RSM

CHCC373 i DN221 zaszczepiono na M17 i inkubowano, odpowiednio, w warunkach aerobowych i anaerobowych. Podczas wzrostu w warunkach aerobowych, DN221 i CHCC373 rosły równie dobrze, jak oceniono przez pomiar OD600 i pH. Jednakże, szybkość wzrostu DN221 w M17 w warunkach anaerobowych była istotnie mniejsza niż CHCC373 i zmniejszała się przy niższej masie komórkowej. Wyniki te pokazują, że nieobecność octanu w M17 nie była powodem wolniejszego tempa wzrostu wyselekcjonowanych mutantów, ale wskazywała, że DN221 w porównaniu z CHCC373 jest pozbawiony zasadniczej cechy charakterystycznej i koniecznej do wzrostu anaerobowego. Wyniki te są zgodne z założeniem, że DN221 ma defekt w aktywności Pfl, powodujący zapotrzebowanie na octan i niższe tempo wzrostu w warunkach anaerobowych w porównaniu z CHCC373.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 3

Izolowanie mutantów defektywnych pod względem Pfl i Ldh

Wyjściowy DN221 mutagenizowano, jak to opisano wyżej w Materiałach i Metodach, i wysiano zmutagenizowane komórki w rozcieńczeniach na płytki agarowe z pożywką DN, które inkubowano aerobowo przez 24-48 godzin. Z tych płytek dla każdej kolonii wyselekcjonowano po 980 kolonii i wysiano na płytki agarowe DN, i inkubowano te płytki przez 24 godziny w warunkach anaerobowych i aerobowych. Wyselekcjonowano dwa szczepy (DN222 i DN223), które były niezdolne do wzrostu w warunkach anaerobowych.

Chromosomalny DNA wyizolowano z DN222, DN223 i CHCC373 i trawiono EcoRI. Porównywano wzorce fragmentów przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym. Wzorce fragmentów wykazały, że DN222 oraz DN223 pochodziły z CHCC373.

Próbkę DN222 i DN223 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, 26 czerwca, 1996 pod numerami dostępu, odpowiednio DSM 11035 i DSM 11036.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 4

Izolowanie spontanicznych mutantów DN223

Z pojedynczej kolonii DN223 założono płynną hodowlę i inkubowano w warunkach tlenowych przez noc. Około 10⁸ komórek przeniesiono na płytki z agarem DN, które inkubowano w warunkach anaerobowych. Wyizolowano trzy szczepy DN224, DN225 i DN226, w oparciu o ich zdolność do wzrostu w warunkach anaerobowych. Wszystkie trzy szczepy są mutantami albo wariantami DN223, które odzyskały zdolność do przekształcania NADH w NAD+ w warunkach anaerobowych przez mutację we wtórnym układzie do Ldh i Pfl, albo przez rewersję defektu Pfl albo Ldh.

Chromosomalny DNA wyizolowano z DN224, DN225, DN226 i CHCC373 i trawiono EcoRI i porównywano wzorce fragmentów przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym. Wzorce fragmentów wykazały, że DN224, DN225 oraz DN226 pochodziły z CHCC373.

Próbkę DN224, DN225 i DN226 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, 26 czerwca, 1996 pod numerami dostępu, odpowiednio DSM 11037, DSM 11038 i DSM 11039.

P r z y k ł a d y

Materiały i Metody

W Przykładach zastosowano następujące zamrożone koncentraty szczepów bakterii kwasu mlekowego jako organizmy pomocnicze: Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN223, który jest defektywny pod względem mrówczano-liazy pirogronianowej (Pfl) i dehydrogenazy mleczanowej (Ldh) i został zdeponowany 26 czerwca, 1996 pod numerem dostępu DSM 11036 oraz DN224, który jest defektywny pod względem Ldh i został zdeponowany 26 czerwca, 1996 pod numerem dostępu DSM 11037. Hodowle wytworzono według procedur znanych w stanie techniki i zatężono 20-krotnie przed zamrożeniem. Całkowita liczba komórek w zamrożonych koncentratach wynosiła około 3x10¹¹ CFU/ml.

PL 198 094 B1

P r z y k ł a d 1

Wpływ organizmów pomocniczych na szybkość zakwaszania mleka pasteryzowanego w niskiej temperaturze przez mezofilową kulturę starterową

Zamrożony koncentrat Direct Vat Set (F-DVS) mezofilowej kultury dostępnej w handlu od Chr. Hansen A/S, Horsholm, Dania, hodowano sam oraz w połączeniu z powyższym organizmem pomocniczym. Mezofilową kulturę starterową oznaczono CH-N 19.

CH-N 19 jest kulturą starterową o całkowitej liczbie komórek wynoszącej przynajmniej około 1x10¹⁰ CFU/g, zawierającą mieszaninę Lactococcus lactis podgatunek cremoris, gatunek L. Lactococcus lactis podgatunek lactis, gatunek Leuconostoc mesenteroides podgatunek cremoris i Lactococcus lactis podgatunek diacetylactis.

CH-N 19 zastosowano do zaszczepienia w ilości 0,01% wagowych. Organizm pomocniczy zastosowano w ilości 0,001% wagowych. Doświadczenia przeprowadzono na mleku pełnym nisko pasteryzowanym, w 30°C z rejestrowaniem pH w odstępach 1-godzinnych przez 6 godzin.

Zmianę pH w mleku pełnym pasteryzowanym w niskiej temperaturze, zaszczepionym samym CH-N 19 oraz CH-N 19 w połączeniu z DN223 i DN224, pokazano w Tabeli 1.1, poniżej.

T a b e l a 1.1

Zmiana pH w mleku zaszczepionym samym CH-N 19 oraz CH-N 19 w połączeniu z DN223 i DN224

Godziny od zaszczepienia	pH
	CH-N 19	CH-N 19 + DN223	CH-N 19 + DN224
3	6,53	6,52	6,51
4	6,40	6,36	6,37
5	6,16	6,04	6,02
6	5,80	5,64	5,60

Podczas hodowli w połączeniu z kulturą mezofilową wpływ organizmów pomocniczych DN223 i DN224 na tempo zakwaszania po 5 godzinach hodowli wynosiło odpowiednio, ApH 0,12 i 0,14. Wpływ organizmu pomocniczego dalej wzrósł po 6 godzinach hodowli do ΔρΗ 0,16 i 0,20, odpowiednio, tj. pH 5,8 osiągnięto 24 i 26 minut szybciej, gdy CH-N 19 był hodowany w połączeniu z DN223 i DN224, niż gdy był hodowany sam.

Z tych wyników widać, że szybkość zakwaszania przez badane mezofilowe kultury dla produktów mleczarskich można zwiększyć przez hodowanie w połączeniu z organizmem pomocniczym, takim jak DN223 i DN224, przy czym organizm pomocniczy stosuje się w stężeniu około 3x10⁶ CFU/g mleka, zaś kulturę mezofilową stosuje się w stężeniu około 1x106 CFU/g mleka. Większy wpływ na zwiększenie szybkości zakwaszania obserwowano w przypadku DN224 w porównaniu z DN223 w równoważnych warunkach doświadczalnych.

P r z y k ł a d 2

Wpływ organizmu pomocniczego na szybkość zakwaszania przez kultury starterowe termofilowych bakterii kwasu mlekowego

Trzy koncentraty F-DVS termofilowych kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego dostępne w handlu od Chr. Hansen hodowano same, (kontrola negatywna) i w połączeniu z DN223 i DN224. Zastosowane kultury termofilowe oznaczono odpowiednio TCC-20, YC-460 i YC-470.

TCC-20 jest termofilową kulturą starterową o całkowitej liczbie komórek przynajmniej 1x10 CFU/g, zawierającą Streptococcus thermophilus i Lactobacillus helveticus. Hodowlę stosuje się głównie do wytwarzania serów, np. serów typu szwajcarskiego, serów typu włoskiego, serów typu Mozzarella i Pizza.

YC-460 i YC-470 są mieszanymi szczepami kultur zawierającymi Streptococcus thermophilus i Lactobacillus delbrueckii, podgatunek bulgaricus. Kultury stosuje się głównie do wytwarzania jogurtu. Obie kultury dają normalny poziom aromatu w jogurcie, a YC-460 daje umiarkowaną lepkość, zaś YC-470 powoduje wysoką lepkość jogurtu.

Kultury TCC-20 zastosowano do zaszczepienia na poziomie 0,01% wagowych w temperaturze 37°C. YC-460 i YC-470 zastosowano na poziomie 0,02% wagowych w temperaturze 43°C. Organizmy pomocnicze stosowano do zaszczepienia w ilości 0,001% wagowych. Stosunek wagowy pomiędzy kulturami

PL 198 094 B1 starterowymi i DN223 i DN224, odpowiednio, wynosił 1:10 w przypadku TCC-20 i 1:20 w przypadku Kultur Jogurtowych. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w 200 ml nisko pasteryzowanego mleka pełnego, z rejestrowaniem pH przez 5 godzin w odstępach 1-godzinnych.

2.1. Wyniki otrzymane z kulturą mleczarską

TCC-20 Zakwaszanie mleka pełnego, pasteryzowanego niską temperaturą zaszczepionego samym TCC-20 albo w połączeniu z odpowiednio DN223 i DN224, przedstawiono w Tabeli 2.1, poniżej.

T a b e l a 2.1

Zmiany pH w mleku zaszczepionym TCC-20 samym i w połączeniu z, odpowiednio, DN223 i DN224

Godziny po zaszczepieniu	pH
	TCC-20	TCC-20 + DN223	TCC-20 + DN224
2	6,50	6,52	6,51
3	6,53	6,48	6,47
4	6,28	6,08	5,95
5	6,15	5,48	5,34

Po 4 godzinach wyniki hodowania TCC-20 w połączeniu z DN223 i DN224, wynosiły ΔρΗ 0,20 i 0,33, odpowiednio. Po 5 godzinach hodowli wpływ DN223 i DN224 wzrósł do ΔpH równej 0,67 i 0,81, odpowiednio. pH 6,2 w mleku osiągnięto 55 i 66 minut szybciej, niż gdy hodowla została zaszczepiona TCC-20 w połączeniu z DN223 i DN224 odpowiednio, niż podczas samej hodowli w TCC-20.

2.2. Wyniki otrzymane z mleczarską kulturą starterową YC-470

Zmianę pH w mleku, spowodowaną hodowaniem samego YC-470 i w połączeniu z DN223 i DN224 pokazano w Tabeli 2.2.

T a b e l a 2.2

Zmiana pH w mleku zaszczepionym samym YC-470 i w połączeniu DN223 i DN224, odpowiednio.

Godziny po zaszczepieniu	pH
	YC-470	YC-470 + DN223	YC-470 + DN224
1	6,50	6,50	6,51
2	6,38	6,35	6,34
3	6,32	6,03	6,00
4	5,94	5,11	5,06
5	5,47	4,51	4,46

Także ta hodowla skorzystała istotnie z obecności DN223 i DN224. Szybkość zakwaszania po 3 godzinach wzrastała odpowiednio do ΔpH 0,29 i 0,32, po 4 godzinach odpowiednio do ΔpH 0,83 i 0,88, zaś dalej po 5 godzinach do ΔpH 0,96 i 1,01.

Wzrost szybkości zakwaszania, wyrażony jako zmniejszenie czasu potrzebnego do zakwaszenia mleka do pH 6,0, przez kulturę YC-470 wynosił odpowiednio 49 i 51 minut, gdy kulturę YC-470 szczepiono w połączeniu z DN223 i DN224, w porównaniu z hodowaniem w samego YC-470.

2.3. Wyniki otrzymane z mleczarską kulturą starterową YC-460

Zmiany pH w mleku zaszczepionym YC-460 samym albo w połączeniu z DN223 i DN224, odpowiednio, przedstawiono w Tabeli 2.3. poniżej.

PL 198 094 B1

T a b e l a 2.3

Zmiany pH w mleku zaszczepionym samym YC-460 i w połączeniu z odpowiednio DN223 i DN224.

Godziny po zaszczepieniu	pH
	YC-460	YC-460 + DN223	YC-460 + DN224
1	6,53	6,52	6,52
2	6,43	6,42	6,42
3	6,43	6,18	6,12
4	6,14	5,23	5,14
5	5,87	4,53	4,45

Gdy hodowano w połączeniu z organizmem pomocniczym DN223 i DN224 wpływ na szybkość zakwaszenia obserwowano już po 3 godzinach hodowli z ΔρΗ równą 0,25 i 0,31, odpowiednio. Bardziej istotny wpływ hodowania YC-460 w połączeniu z organizmami pomocniczymi DN223 i DN224, odpowiednio, obserwowano po 4 godzinach z ΔpH równą 0,91 i 1,00, odpowiednio. Dalszy wzrost wpływu obserwowano po 5 godzinach z ΔpH równą 1,34 i 1,42 dla DN223 albo DN224, odpowiednio.

Wzrost szybkości zakwaszania wyrażony jako skrócenie czasu koniecznego do zakwaszenia mleka przez kulturę YC-460 do pH 6,0 wynosił, odpowiednio, 78 i 83 minuty, gdy kulturę YC-460 hodowano w kombinacji z DN223 i DN224, w porównaniu z kulturami hodowanymi bez organizmów pomocniczych.

Podobnie jak z kulturami mezofilowymi, większy efekt obserwowano, gdy hodowano termofilowe kultury początkowe w połączeniu z DN224 niż z DN223. Różnica pomiędzy dwoma organizmami pomocniczymi nie była tak zaznaczona, gdy stosowano je w połączeniu z kulturami termofilowymi. Wpływ organizmów pomocniczych zmierzony wzrostem szybkości zakwaszania był istotnie większy, gdy były stosowane w połączeniu z kulturami termofilowymi. Najkorzystniejsza dla kultur jogurtowych YC-460 i YC-470 była wspólna hodowla, odpowiednio, z DN223 i DN224, gdzie uzyskano wzrost szybkości zakwaszania równy po 5 godzinach około 1 jednostce pH przy stosunku wagowym kultur jogurtowych do DN223 i DN224 równym 1:20. Oba organizmy pomocnicze były zdolne do istotnego zmniejszania czasu koniecznego do zakwaszenia mleka do konkretnego pH, gdy szczepiono nimi na poziomie 0,001% wagowych substratu.

P r z y k ł a d 3

Wpływ organizmów pomocniczych na szybkość zakwaszania przez kultury starterowe bakterii kwasu mlekowego zawierające szczepy mezofilowe i termofilowe

Wpływ organizmów pomocniczych DN223 i DN224 na szybkość zakwaszania mleka określono dla mieszanych kultur starterowych przeznaczonych do wytwarzania sera duńskiego i kontynentalnego. Te mieszane kultury starterowe zawierały mezofilowe i termofilowe szczepy bakterii kwasu mlekowego. Kultury starterowe szczepiono jako zamrożone DVS. Zastosowano następujące kultury starterowe:

YY-62 i YY-63 są kulturami starterowymi obejmującymi mieszaninę mezofilowych i termofilowych szczepów bakterii kwasu mlekowego.

TH4 jest dostępną w handlu kulturą starterową zawierającą termofilowy szczep bakterii kwasu mlekowego.

B-11 jest dostępną w handlu mieszaną, mezofilową kulturą starterową obejmującą szczepy Lactococcus lactis podgatunek cremoris, Lactococcus lactis podgatunek lactis, Leuconostoc mesenteroides podgatunek cremoris i Lactococcus lactis podgatunek diacetylactis. Kultura miała całkowitą liczbę komórek wynoszącą przynajmniej 1x10 CFU/g. Kultura starterowa zawierała Leuconostoc mesenteroides podgatunek cremoris w zakresie 1-5°% całkowitej liczby komórek oraz Lactococcus lactis podgatunek diacetylactis w zakresie 5-30% całkowitej liczby komórek.

Badanie szybkości zakwaszania przeprowadzono przez zaszczepienie kulturami starterowymi pasteryzowanego mleka pełnego. Temperaturę kontrolowano automatycznie, generując typowy profil temperatury sera Danbo. Kultury starterowe inkubowano na poziomie wskazanym w poniższej Tabeli. Mleko przechowywano przez noc w temperaturze 4-7°C w butelkach z uchylonymi pokrywkami, w celu zapewnienia równego poziomu wysycenia tlenem we wszystkich butelkach.

PL 198 094 B1

Zmiany pH mierzono półautomatycznie przez 16 godzin inkubacji urządzeniem AAC firmy Intab A/B. Krzywe zakwaszania wytworzono stosując oprogramowanie Easyview wersja 3.2.0.4. Wartości pH zmierzone po 5 i 6 godzinach inkubacji przedstawiono w poniższych Tabelach.

3.1 Wpływ dodania organizmów pomocniczych DN223 i DN224 do kultury starterowej YY-62

Poziom zaszczepienia kulturą starterową YY-62 i/lub organizmem pomocniczym DN223 albo DN224 pokazano w Tabeli 3.1.

T a b e l a 3.1

Poziom zaszczepienia (% wagowy mleka) YY-62, DN223 i DN224

Kultura	Kultura	DN223/DN224	Całkowity poziom zaszczepienia
YY-62	0,0034%	0%	0,0034%
YY-62 + DN223	0,00331%	0,0014%	0,0048%
YY-62 + DN224	0,00338%	0,0015%	0,0049%

pH po 5 i 6 godzinach w pasteryzowanym pełnym mleku zaszczepionym samą kulturą starterową i w połączeniu z organizmami pomocniczymi DN223 i DN224 przedstawiono w Tabeli 3.2.

T a b e l a 3.2 pH po 5 i 6 godzinach w pasteryzowanym pełnym mleku zaszczepionym samą kulturą starterową YY-62 albo w połączeniu z organizmami pomocniczymi DN223 i DN224

Kultura	Jednostka	5 godzin	6 godzin
YY-62	pH	6,35	6,24
YY-62 + DN223	pH	6,19	6,01
YY-62 + DN224	pH	6,13	5,94
Temp. butli	°C	31,18	26,2

3.2. Wpływ dodania DN223 albo DN224 do kultury starterowej YY-63

Poziom szczepienia kulturą starterową YY-63 z albo bez organizmów pomocniczych DN223 albo DN224 przedstawiono w Tabeli 3.3.

T a b e l a 3.3

Poziom zaszczepienia (% wagowy mleka) YY-63, DN223 i DN224

Kultura	Kultura	DN223/DN224	Całkowity poziom zaszczepienia
YY-63	0,0034%	0%	0,0034%
YY-63 + DN223	0,00337%	0,0017%	0, 0051%
YY-63 + DN224	0,00347%	0,0015%	0,0050%

pH po 5 i 6 godzinach w pasteryzowanym pełnym mleku zaszczepionym samą kulturą początkową i w połączeniu z organizmami pomocniczymi DN223 i DN224 przedstawiono w Tabeli 3.4.

T a b e l a 3.4 pH po 5 i 6 godzinach w pasteryzowanym pełnym mleku zaszczepionym samą kulturą starterową YY-62 albo w połączeniu z organizmami pomocniczymi DN223 i DN224

Kultura	Jednostka	5 godzin	6 godzin
YY-63	pH	6,26	6,10
YY-63 + DN223	pH	6,04	5,75
YY-63 + DN224	pH	6,07	5,80
Temp. butli	°C	31,05	26,06

PL 198 094 B1

3.3. Wfpyw dodania organizmów pomocniczych DN223 albo DN222 do kultury starterowej >Ύ-43, mieszaniny UulUuoy sUntUetdwej B-11 i UulUuty sUntUetdwej TH4

Pdyirm zaszczepienia UulUuoą sUaoUetdwą YY-43, UUóoa jest mieszaniną UulUuoy sUaoUetdwej B-11 i UulUuty sUaotetdwej TH4, i/luO doaanizmów odmdhnizzyhh D2223 alOd D2224 otzeOsUawidnd w Tabeli 3.5.

T a O e l a 3.5

Pdzidm zaszczepienia (% waadwy mleUa) YY-43, D2223 i D2224

Kultuoa	Kultuoa	D2223/D2224	CałUdwity pdzidm zaszczeoienia
YY-43	0,0036%	0%	0,0036%
YY-43 + D2223	0,00345%	0,0015%	0,0050%
YY-43 + D2224	0,0034%	0,0014%	0,0049%

pH pd 5 i 6 adOzinazh w pastetyzdwanym peynym mleUu zaszhzepidnym samą UulUuoą staoteodwą i w pdyązzeniu z dtaanizmami pdmdhnizzymi D2223 i D2224 pozeOstawidnd w TaOeli 3.6.

T a O e l a 3.6 pH pd 5 i 6 adOzinazh w oasUetyzdwanym pełnym mleUu zaszczepidnym samą Uultuoą starteodwą YY-62 alOd w pdłąhzeniu z doaanizmami pdmdhnihzymi D2223 i D2224

Kultuoa	JeOndstUa	5 gdOzin	6 adOzin
YY-43	pH	6,17	5,97
YY-43 + D2223	pH	6,03	5,78
YY-43 + D2224	pH	6,03	5,81
Temp.	°C	30,85	25,83

3.6. WnidsUi

WyUazand znahząhy wpływ OdOania doaanizmów pdmdhnihzyhh weOłua wynalazUu na szyOUdść zaUwaszania tozehh oóżnyhh Uultuo staoteodwyhh OaUteoii Uwasu mleUdwead (3.1., 3.2. i 3.3.). TaU więh, pd 6 adOzinahh pH dOniżyłd się d 0,19-0,35 jeOndstUi pH Ola hdOdwli YY-62, YY-63 i YY-43. Td zwięUszenie szyOUdśhi zaUwaszania pozez Uultuoy staoteodwe wsUazuje, że żąOaną szyOUdść zaUwaszania mleUa mdżna dsiąanąć pozez zastdsdwanie 50% ndomalnead pdzidmu Uultuoy staoteodwej, aOy uzysUać oówndważne zaUwaszenie, aOy ten zmniejszdny pdzidm Uultuoy staoteodwej jest uzupełnimy doaanizmem wspdmaaająhym weOłua wynalazUu.

P o z y U ł a O 4

ReaUhja na OawUę doaanizmu pdmdhnihzead

4.1. Wpływ/ wzodstu OawUi doaanizmów pdmdhnihzyhh na zaUwaszenie oóżnyhh suOstoatów mlehznyhh pozez B-11

Wpływ odsnąhej ildśhi doaanizmu pdmdhnihzead na szyOUdść zaUwaszania pozez Uultuoę starteodwą OaOand stdsująh mezdfildwą Uultuoę dznahzdną B-11 hdOdwaną w pdłąhzeniu z D2223 alOd D2224, dOpdwieOnid.

B-11 jest mezdfildwą Uultuoą starteodwą dpisaną w PozyUłaOzie 3.

Zastdsdwand tozy suOstoaty: pełne mleUd pasteoyzdwane w nisUiej tempeoatuoze, pełne mleUd eUdldaihzne pasteoyzdwane w nisUiej tempeoatuoze doaz dOtłuszhzdne mleUd pasteoyzdwane w wysdUiej tempeoatuoze. Pdzidm zaszhzepiania B-11 wyndsił 0,01% waadwead. Ooaanizmy pdmdhnihze OaOand pozy hzteoehh pdzidmahh szhzepienia: 0% waadwyhh, 0,005% waadwyhh, 0,01% waadwyhh i 0,02% waadwyhh, dOpdwieOnid. WszystUie OdświaOhzenia pozepodwaOzdnd w 30°C, zaś pH suOstoatu mieozdnd pd 5 adOzinahh inUuOahji.

WyniUi Ola UażOead z pdwyższyhh suOstoatów pdUazand, dOpdwieOnid, na Fia. 1,2 i 3. WszystUie tozy OdświaOhzenia pdUazały, że zaUwaszenie suOstoatów Oyłd istdtnie zwięUszdne, aOy B-11 hdOdwand w pdłąhzeniu z D2223 i D2224, pozy hzym wpływ D2224 Oył zasaOnihzd lepszy niż D2223. Występdwały jeOynie niewielUie oóżnihe wpływu mięOzy oóżnymi suOstoatami. W mleUu pełnym występdwał znahzny spaOeU pH dO 5,97 Od 5,58 i 5,55, aOy B-11 hdOdwand w pdłąhzeniu z dOpdwieOnid 0,005%

PL 198 094 B1 wagowych. DN223 i DN224. Obniżenie pH było dalej nasilone, gdy DN223 i DN224 zastosowano na poziomie zaszczepienia równym 0,01% wagowych, dając, odpowiednio, pH 5,53 i 5,48. Gdy poziom zaszczepienia organizmami pomocniczymi zwiększono do 0,02% wagowych, nie obserwowano dalszego wzrostu szybkości zakwaszania.

Gdy kulturę starterową B-11 szczepiono na poziomie 0,01% wagowych i hodowano w połączeniu z DN223 i DN224, osiągnięto większy efekt niż z ilością organizmu pomocniczego równą 0,005% wagowych, zaś wynik w niewielkim tylko stopniu zależał od zastosowanego substratu.

4.2. Wpływ zwiękkzznia ddwki orggnizmu ppmoonicczeg naszztibośś zzkwaszznia ppsteryyzwanego pełnego mleka przez YC-460

Zmiany pH w 1000 ml pełnego mleka pasteryzowanego w niskiej temperaturze zaszczepionego 0,02% wagowych YC-460, 0,003% wagowych DN223 i 0,02% wagowych YC-460 w połączeniu z 0,003% DN223 pokazano na Fig. 4. Odpowiednie wyniki otrzymane z organizmem pomocniczym DN224 pokazano na Fig. 5.

Czas konieczny do zakwaszenia mleka do pH 6,0 był zmniejszony o około, odpowiednio, 92 i 96 minut, gdy YC-460 hodowano w połączeniu z DN223 i DN224, w porównaniu z hodowlą bez nich.

W porównaniu z wynikami otrzymanymi w Przykładzie 2.3. wzrost szybkości zakwaszania obserwowano, gdy poziom zaszczepienia organizmem pomocniczym zwiększono od 0,001% wag. do 0,003% wagowych. Czas konieczny do zakwaszenia mleka przez kulturę YC-460 do pH 6,0 został dalej skrócony o 13-14 minut, gdy ilość organizmu pomocniczego zwiększono od 0,001% wagowych do 0,003% wagowych.

pH 4,5 w mleku osiągnięto po 6 godzinach i 52 minutach, gdy mleko zaszczepiono samym YC-460 i, odpowiednio, po 4 godzinach i 44 minutach i 4 godzinach i 45 minutach, gdy zaszczepiono YC-460 z DN223 albo DN224.

P r z y k ł a d 5

Wpływ DN223 i DN224 na stężenie tlenu w mleku w odniesieniu do tempa zakwaszenia kultur starterowych

Zmiany pH i stężenia tlenu monitorowano w trakcie hodowania mleka z kulturami starterowymi zarówno typu mezofilnego, jak i termofilnego i z hodowlami starterowymi, odpowiednio, w połączeniu z DN223 i DN224. pH mierzono stosując urządzenie Chemap pH-amplifier i elektrodę Mettler Toledo HA 465-50-T-S-7, a stężenie tlenu mierzono stosując urządzenie Chemap O2-amplifier i elektrodę Ingold pO2. Negatywną kontrolą było mleko zaszczepione odpowiednio DN223 i DN224. Hodowle prowadzano w 40-litrowych fermentorach umiarkowanie mieszając i stosując jako substrat 30 l ekologicznego, pełnego mleka pasteryzowanego w niskiej temperaturze.

Cztery doświadczenia przeprowadzono równolegle w 3 fermentorach z następującymi dodanymi kulturami początkowymi i/lub organizmami pomocniczymi:

Doświadczenie A: id 0,02% wagowych YC-460, ii) 0,003% wagowych DN223 i iii) 0,02% wagowych YC-460 w połączeniu z 0,003% wagowych DN223.

Doświadczenie B: id 0,02% wagowydn YC-460.

ii) 0,003% wagowych DN224 i iii) 0,02% wagowych YC-460 w połączeniu z 0,003% wagowych DN224.

Doświadczenie C: id 0,01 %wagowychB1l1, ii) 0,0015% wagowych DN223 i iii) 0,01% wagowych B-11 w połączeniu z 0,0015% wagowych DN223.

Doświadczenie D: ίρ 0,01 %wagowychB1l1, ii) 0,0015% wagowych DN224 i iii) 0,01% wagowych B-11 w połączeniu z 0,0015% wagowych DN224

Utrzymywano temperaturę 43°C podczas hodowania kultury termofilnej YC-460 i 30°C podczas hodowania kultury mezofilnej B-11. pH i stężenie tlenu mierzono i zapisywano w półgodzinnych odstępach.

Wyniki uzyskane w doświadczeniu A pokazano odpowiednio na Fig. 6A i 6B, wyniki uzyskane w doświadczeniu B pokazano odpowiednio na Fig. 7A i 7B.

Z Figur 6A i 6B można zauważyć, że gdy sam szczep YC-460 hodowano tlen był zużywany w wolnym tempie, w wyniku czego po 4,5 godzinach otrzymano pożywkę pozbawioną tlenu. Zakwaszanie mleka było bardzo ograniczone, podczas gdy zawartość tlenu w mleku była wysoka i pH 6 osiągnięto po 4 godzinach.

PL 198 094 B1

Zaszczepienie mleka DN224 spowodowało gwałtowny spadek zawartości tlenu w mleku, tlen został całkowicie usunięty po 2,5 godzinach. Zasadniczo nie zaobserwowano w tych warunkach zakwaszenia mleka.

Zaszczepienie mleka YC-460 w połączeniu z DN-223 powodowało gwałtowny spadek zawartości tlenu w mleku, tlen został całkowicie usunięty po 2,5 godzinach. Tempo zakwaszenia mleka było wolne przy wysokich stężeniach tlenu w mleku, lecz przyspieszało wcześniej, niż gdy szczepiono mleko samym YC-460, tj. pH było poniżej 6 po zaledwie 2,5 godzinach.

Po porównaniu z odpowiednimi wynikami pokazanymi na Fig. 6A i 6B jest jasne, że zakwaszenie mleka przez YC-460 jest skorelowane ze stężeniem tlenu. Kultura starterowa YC-460 jest zdolna sama do usunięcia tlenu z pożywki, lecz powoli. Gdy zawartość tlenu była w zakresie 0-3 ppm, zakwaszenie pożywki YC-460 było znaczące. Obecność DN223 w połączeniu z YC-460 nasiliła usuwanie tlenu i tym samym skróciła czas do rozpoczęcia zakwaszania. Wcześniejszy początek zakwaszenia nie zależał od zakwaszenia pożywki przez DN223.

Podobne wyniki uzyskano ze skojarzonych hodowli YC-460 i DN224, pokazanych na Fig. 7A i 7B. Zaszczepienie mleka samym DN224 powodowało szybki spadek zawartości tlenu w mleku, pożywka była pozbawiona tlenu po zaledwie 1,5 godziny. Zasadniczo nie zaobserwowano zakwaszenia mleka.

Zakwaszenie mleka przez YC-460 powodowało osiągnięcie pH około 6 w ciągu 4,5-5 godzin, natomiast takie pH uzyskano w hodowli skojarzonej YC-460 i DN224 po zaledwie około 3 godzinach.

Nawet jeśli DN224 usuwa tlen z pożywki szybciej niż DN223, lepsze tempo zakwaszania YC-460 w połączeniu z DN224 było zasadniczo takie samo jak uzyskiwane z DN223, co wskazuje na to, że stężenie tlenu w pożywce jest jednym czynnikiem, który ma wpływ na zakwaszenie mleka przez kultury termofilne.

Wyniki doświadczenia C są pokazane na Fig. 8A i 8B, a wyniki doświadczenia D są pokazane na Fig. 9A i 9B.

Jak można zauważyć na figurach zaszczepienie mleka 0,001% wagowych DN223 i DN224 powoduje całkowite usunięcie tlenu po 2,5 godzinach przez oba organizmy pomocnicze. Odpowiada to wynikom uzyskanym podczas zaszczepienia mleka 0,003% wag. DN223. Po dwóch godzinach inkubacji wyższy poziom zaszczepienia DN223 zmniejszył stężenie tlenu do około 2 ppm, podczas gdy niższy poziom zaszczepienia zarówno DN223 i DN224 powoduje uzyskanie poziomu tlenu około 3 ppm. Z 0,003% wagowych DN224 tlen został całkowicie usunięty po 2 godzinach inkubacji, a po 1,5 godzinie stężenie tlenu wynosiło około 2,5 ppm.

Wyniki skojarzonej hodowli B-11 z odpowiednio DN223 i DN224 pokazują, że tempo zakwaszania tej hodowli jest poprawione przez obecność organizmów pomocniczych. Poprawione szybkości zakwaszenia były prawie takie same przy stosowaniu DN223 i DN224. Wartości pH 5,88 i 5,97 uzyskane po 5 godzinach inkubacji z B-11 w połączeniu, odpowiednio, z DN223 i DN224 mogą być porównane z 5,58 i 5,54 uzyskanymi w Przykładzie 3 z odpowiednio 0,005% wag. DN223 i DN224. Wpływ wzrastającej ilości organizmu pomocniczego od 0,0015% wagowych do 0,005% wagowych powoduje zmniejszenie pH po 5 godzinach z 5,88 do 5,58 z DN223 i z 5,97 do 5,54 z DN224.

Jak można zauważyć na Fig. 8A pH 5,2 w mleku osiągnięto po 7 godzinach i 24 minutach, gdy mleko zaszczepiono samym B-11 i po 6 godzinach i 22 minutach, gdy mleko zaszczepiono B-11 w połączeniu z DN223. Jak można zauważyć na Fig. 9A że pH 5,2 osiągnięto po 7 godzinach i 48 minutach podczas zaszczepienia mleka samym B-11 i po 6 godzinach i 39 minutach po zaszczepieniu B-11 w połączeniu z DN224.

Odnośniki

1. Condon, S. 1^(8. Responses of lacho acid bacteria to oxygene. FEMS Microbiology Review, 46, 269-280.

2. Dickely, F.. Niisson, D.. Hansen, E.B. and Johansen, E. 1995. ^ο^Ήοη oo Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a food-grade cloning vector. Molec; Microbiol., 15, 839-847.

3. RajagopaL S.N. and Sandine, W.E. 1990. Αοεοοϊθίϊνο gr^o\wtti and profeolysis oO StrepPococcus ihermophilus and Laciobacillus bulgaricus in skim milk. J. Dairy Sci., 73, 894-899.

4. Suzuki l.. Kato, S.. Kitada, T., Yano, N. and Monchii T. 1986. Growth d Lactobacćilus bulgaricus in milk. 1. Cell elongation and the role of formic acid in boiled milk. J. Dairy Sci., 69, 311-320.

5. Temagi! B.Eand Sandine, W.E. 1975. lrm^r^c^\^^rim^r^itnm tor thelacnc δίΓορΐοοοοοϊ and their bacteriophages. Appl. Microbiol., 29, 807-813.

PL 198 094 B1

Nr sprawy Zgłaszającego 09363 PC 0

Zgłoszenie PCT/Da98/00200

Wskazówki dotyczące zdeponowanego mikroorganizmu (PCT zasad 03bia)

A. Dotyczy mikrooroanizmuw/ymienionegon a str. 22wierez1 1o rogigalnejppUlikacji

B. ldentySikacjc a epozy^ Dalsze depozyty aa dodatoowcch srrosachX

Nazwa instytucji depozytowej

DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ud Zellkulturen GmbH

Adres instytucji Mascheroder Weg Ob,

D-38024 Braunschweig,

Niemcy

Data zdeponowania Nijme rdostpuu czerwca, O996 DSM 01035

C. DodatSowy wykazaniz apoyostawić pustajeżeli nie żotyczy)

W odniesieniu do odpowiednich Urzędów Patentowych wyznaczonych krajów, Zgłaszający żąda, żeby próbki zdeponowanych mikroorganizmów określonych powyżej były dostępne jedynie dla ekspertów wyznaczonych przez Zgłaszającego, do momentu udzielenia patentu albo do daty, kiedy zgłoszenie zostanie odrzucone albo wycofane albo uznane za wycofane.

D. Kraja wyznaczone, którychhotocząwykazówyi

E. Osonbz wykazówyι (pozostawić pustajeżelinie dotyczy)

Wskazówki podane niżej dostarczono do Biura Międzynarodowego później ()

X Dla Urzędu Przyjmującego Stronę otrzymano wraz ze zgłoszeniem międzynarodowym	Dla Biura Międzynarodowego
Upoważniony urzędnik (poOpie eiżzzytżley)	Upoważniony urzędnik

Formularz PCT/RO/034 (czerwiec 0 992)

Wskazówki dotyczące zdeponowanych mikroorganizmów (Zasada PCT 02bia)

Arkusz dodatkowy

Oprócz mikroorganizmów wskazanych na str. 38 (oryginalnej publikacji) następujące mikroorganizmy zdeponowano w DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ob, D-38024 Braunschweig, Niemcy, w datach wskazanych poniżej

Nr dostępu	Data zdeponowania	Strona oryginalnego opisu	Linia w opisie
DSM 0 0033	26 czerwca, 0996	20	6
DSM 0 0034	26 czerwca, 0996	20	6
DSM 0 0036	26 czerwca, 0996	22	00
DSM 0 0037	26 czerwca, 0996	23	3
DSM 0 0038	26 czerwca, 0996	23	3
DSM 0 0039	26 czerwca, 0996	23	3
DSM 0 0040	26 czerwca, 0996	20	6

Do wszystkich wyżej określonych depozytów stosuje się następujące dodatkowe wskazania:

W odniesieniu do odpowiednich Urzędów Patentowych wyznaczonych krajów, Zgłaszający żąda, żeby próbki zdeponowanych mikroorganizmów określonych powyżej były dostępne jedynie dla

PL 198 094 B1 ekspertów wyznaczonych przez Zgłaszającego, do momentu udzielenia patentu albo do daty, kiedy zgłoszenie zostanie odrzucone albo wycofane albo uznane za wycofane.

Claims (44)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sppsśó zwiękkszniasszybkści wzrostu i/iub kkntrolowaniaaktywności metaabliccnejsszczpu bakterii kwasu mlekowego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie szczepu w połączeniu z organizmem pomocniczym bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt w metabolizmie pirogronianu.
2. 2. Sppsób wzełub ζ^γο. /, zznmieenn tym, że zwiękkzz aktywnoSC metaadliccno szzczeu bakterii kwasu mlekowego prowadzącą do wzrostu wytwarzania kwasów.
3. 3. SppsZó wzełub znało. z, zznmieenn tym, Zż wzroot wztwzkozniaSwzkz zOdpwiaad iwć^rtc^cci ΔρΗ co najmniej 0,05 po 3 godzinnej albo dłuższej hodowli.
4. 4. Pposób według zastm. 1, znamienny tym, że szczep hoduje się w pożywce o początkowym nasyceniu tlenem, które wynosi 10% albo więcej.
5. 5. Pposób według zastrz. 4, znamienny tym, że początkowe nasycenie tlenem pożywki wynosi 20% albo więcej.
6. 6. Pposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość tlenu obecna w pożywce, w której hodowane są szczep bakterii kwasu mlekowego i organizm pomocniczy, zmniejsza się o co najmniej 1% na godzinę.
7. 7. Pposób według zastrz. 1, znamienny tym, że organizmem pomocniczym jest pochodna bakterii kwasu mlekowego.
8. 8. Pposób według zastrz. 7, znamienny tym, że organizm pomocniczy zasadniczo nie wytwarza kwasu mlekowego.
9. 9. Pposób według zastrz. 1, znamienny tym, że organizm pomocniczy ma defekt w zdolności wyrażania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.
10. 10. Pposób według zastrz. 9, znamienny tym, że organizmem pomocniczym jest Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN223 zdeponowany pod numerem dostępu DPM 11036.
11. 11. Pposób według zastm. 9, znamienny tym, że organizmem pomocniczym jest Lactococcus lactis podgatunek lactis szczep DN224 zdeponowany pod numerem dostępu DPM 11037.
12. 12. Pposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego hoduje się w pożywce wybranej z grupy składającej się z mleka, mięsa, surowego ciasta z mąki, wina i surowca roClinnego.
13. 13. Pposób według zastm. 1, znamienny tym, że stosunek pomiędzy komórkami organizmu pomocniczego a komórkami szczepu bakterii kwasu mlekowego wynosi od 1000:1 do 1:1000.
14. 14. Pposób według zastm. 1, znamienny tym, że w organizmie pomocniczym gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 ulega nadekspresji.
15. 15. Pposób według zastrz. 14, znamienny tym, że w organizmie pomocniczym gen kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O2 i regeneracji NAD+ ulega nadekspresji.
16. 16. Pposób według zastm. 15, znamienny tym, że enzym katalizuje redukcję O2 do H₂O lub H2O2.
17. 17. Pposób według zastrz. 16, znamienny tym, że enzymem jest oksydaza NADH:H₂O, w tym enzym o sekwencji Id. Pekw. nr 2.
18. 18. Pposób według zastrz. 14, znamienny tym, że organizmem pomocniczym jest szczep Ldh.
19. 19. Pposób przedłużania okresu trwałości i/lub jakości produktu spożywczego, znamienny tym, że obejmuje dodawanie do produktu szczepu bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt metabolizmu pirogronianu.
20. 20. Pposób według zastrz. 19, znamienny tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego zasadniczo nie wytwarza kwasu mlekowego.
21. 21. Pposób według zastrz. 19, znamienny tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego ma defekt w zdolności wyrażania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z liazy mrówczanowej pirogronianu, dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.

    PL 198 094 B1
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że produkt jest wybrany z grupy składającej się z mleka, surowego ciasta z mąki, mięsa, wina i surowca roślinnego.
23. 23. Spoośb weełuu zjairttr^. 22, znamienny tym, że produldem spoóywcczm j ees niepasteryzowane mleko.
24. 24. Sposób według zasfrz. 19, znamienny tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego dodaje się do produktu w miejscu wytwarzania.
25. 25. Sposób według zr^s^str^. 24, znamienny tym. że szczep bakkeni kwasu mlekowego dodaae się do surowego mleka po udoju.
26. 26. Kcjr^F^r^^y^yyć^ kultury starterower, znamienna tym, że obejmu-e bakkerię kwaau mlekoweeo, która nie ma defektu w metabolizmie pirogronianu oraz organizm pomocniczy bakterii kwasu mlekowego, który ma defekt w metabolizmie pirogronianu.
27. 27. Kc^rm^r^^\^c^j£j według zas^z. 22^, znamienna tym, że onanizm pomocniczy zasadnicco nie wytwarza kwasu mlekowego.
28. 28. weeług zasfry. 22 albo 27, znamienna tym, że onanizm pomooniczy ma defekt w zdolności wytwarzania co najmniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogonianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.
29. 29. Kompoozcje weełun zasfry. 26, znamienna tym, że oryanizmem pomocnicczm j jss Lactococcus lactis podgat. lactis szczep DN223 zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11036.
30. 30. Kompoozcje weełun zasfry. 22, znamienna tym, że oryanizmem pomocnicczm j Lactococcus lactis podgat. lactis szczep DN224 zdeponowany pod numerem dostępu DSM 11037.
31. 31. Kompoz:zyje weeług ζ88ϋζ. 22, znymienna tym, ze ggn w orygnizmiz ppm-cicczm kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O.-- ulega nadekspresji.
32. 32. Kompoozyje weeług ζ88ϋζ. 31, znamienna tym, że gm w odygnizmiz ppmc>ozicczm kodujący enzym zdolny do katalizowania redukcji O.·· i regeneracji NAD+ ulega nadekspresji.
33. 33. Kompo-zyża według zae^z. 32, znamienna tym, że enzym ka-allzu-e redukcję O₂ do H₂O albo H2O2.
34. 34. Kc^rn:^(^^\^c^j£j według 33, znamienna tym, że enzymem jess oksydaza NADH:H₂O, w tym enzym o sekwencji Id. Sekw. nr 2.
35. 35. Kompozycja według zastrz. 31, zaamieaaa tyi, że organizmem pomocniczym jest szczep Ldh.
36. 36. według zas-trz. 26, znamienna tym, że dwa albo więcej różnych szczepów bakterii kwasu mlekowego.
37. 37. Bakkena kwasu mlekowego, znamienna tym, że ma 0ο-θ^ co ^ιιπιθ- jednego enzymu związanego z metabolizmem pirogronianu, i w której gen zdolny do katalizowania redukcji O.-- ulega nadekspresji.
38. 38. Bakkeria według zas^z. 37, znamienna tym, że ma co γ^ιιι·^- jednego enzymu związanego z metabolizmem pirogronianu, i w której gen zdolny do katalizowania redukcji O.-- i regeneracji NAD+ ulega nadekspresji.
39. 39. Bakkena week-iy zzasz. 33, znamienaa tym, Zż g^n zzolny do ryegneryaji NAD⁺, którY ulega nadekspresji, koduje enzym katalizujący redukcję O.-- do H-O lub H2O2.
40. 40. Bakteria weeług ζ.^υ. ż3, znamienaa tym, Zż znyzmnm j ees zdksdoazNADH:H₂O, w ttm enzym o sekwencji Id. Sekw. nr 2.
41. 41. Bakkena według zassfz. 37, znamienna tym, że ma defekk w zdolnodci wyyażania co πθ-mniej jednego enzymu wybranego z grupy składającej się z mrówczano-liazy pirogronianowej, dehydrogenazy pirogonianowej, dehydrogenazy mleczanowej, syntetazy acetomleczanowej, drugiej syntetazy acetomleczanowej, dekarboksylazy acetomleczanowej i reduktazy diacetylowej.
42. 42. Bakkena według zasstz. 37, znamienna tym, że zawiera izolowany fragmeni DNA pochodzący z bakterii kwasu mlekowego, który obejmuje gen kodujący polipeptyd o aktywności oksydazy NADH:H2O.
43. 43. Bakkeria weeługzzkSey. Z4, znamienaa tym, zż ffyamnnt DNA jees weyryky z gryup sskaaojącej się z sekwencji przedstawionej w Id. Sekw. nr 1 i jej odmiany albo pochodnej, która jest w co najmniej 50% identyczna z tą sekwencją i ma tę samą funkcję.
44. 44. Bakkena według zasstz. 37, znamienna ty^ri, że zawiera rekombinowaną cząsseczkę DNA obejmującą fragment DNA określony w zastrz. 42 lub 43.