PL194415B1 - Method of obtaining Nα-urethane derivatives of L-ornitin - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania N a -uretanowych pochodnych L-ornityny z ornityny, na której wytwarza sie kompleks miedziowy(II), wprowadza tert-butoksykarbonyl na funkcje N d -aminowa, nastepnie rozklada sie kompleks miedziowy(II) za pomoca 8-hydroksychinoliny, wprowadza oslone uretanowa na funkcje N a -aminowa L-ornityny, znamienny tym, ze proces jest jednoetapowy, w którym na surowa pochodna N a -uretanowa N d -tert-butoksykarbonylo-L-ornityny dziala sie kwasem p-toluenosulfonowym we wrza- cym roztworze acetonowym, a po ochlodzeniu do temperatury pokojowej odparowuje sie rozpusz- czalniki, po czym dodaje: aceton, wode i trietyloamine. PL PL PLThe method of producing N a-urethane derivatives of L-ornithine from ornithine, on which the copper (II) complex is produced, introduces tert-butoxycarbonyl into N-d-amino functions, then decomposes the copper (II) complex with 8-hydroxyquinoline, introduces the shielded urethane on the N a-amino function of L-ornithine, characterized in that the process is a one-step process, in which the crude N a -ureane derivative of N d -tert-butoxycarbonyl-L-ornithine is treated with p-toluenesulfonic acid in a boiling acetone solution , after cooling to room temperature, the solvents are evaporated off, and then acetone, water and triethylamine are added. PL PL PL

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania N“-uretanowych pochodnych L-ornityny, a szczególnie N“-benzyloksykarbonylo-L-ornityny i N“-fluorenylometoksykarbonylo-L-ornityny przeznaczonych do syntezy pochodnych L-ornityny oraz do syntezy analogów hormonu wzrostu, pochodnych antyfolianów o potencjalnych właściwościach terapeutycznych, a także do syntezy krótkich, biologicznie aktywnych peptydów ornitynowych.The subject of the invention is a process for the preparation of N "-urethane derivatives of L-ornithine, in particular N" -benzyloxycarbonyl-L-ornithine and N "-fluorenylmethoxycarbonyl-L-ornithine intended for the synthesis of L-ornithine derivatives and for the synthesis of growth hormone analogs, antifolate derivatives and potential therapeutic properties, as well as for the synthesis of short, biologically active ornithine peptides.

Znane z publikacji W. Wiejak, E. Masiukiewicz, B. Rzeszotarska „A large scale synthesis of mono- and di-urethane derivatives of lysine” w Chemical and Pharmaceutical, Bulletin 47 (10) 1489-1490 (1999) sposoby wytwarzania pochodnych L-lizyny, a w szczególności diuretanowych pochodnych, adoptowane są do wytwarzania pochodnych L-ornityny jako homologu aminokwasu L-lizyny. Znany sposób wytwarzania diuretanowych pochodnych L-lizyny polega na tym, że w pierwszym etapie blokuje się reaktywność grupy aminowej fe/Y-butoksykarbonylem w pozycji d, a następnie wprowadza się benzyloksykarbonyl lub fluorenylometoksykarbonyl na grupę N“-aminową. Dla wytworzenia N“-uretanowej pochodnej L-ornityny ochrony wprowadzone na grupy: N“-aminową L-ornityny i N^d-aminową L-ornityny muszą być tak dobrane, aby osłonę z pozycji d można było łatwo usunąć bez naruszania osłony z grupy N“-aminowej. Na ogół w znanych sposobach, gdy wprowadza się na grupę N“-aminową benzyloksykarbonyl lub fluorenylometoksykarbonyl, dla zablokowania reaktywności grupy N^d-aminowej wprowadza się fe/Y-butoksykarbonyl, który usuwa się w warunkach acydolitycznych, spełnianych przez chlorowodór w rozpuszczalniku organicznym, kwas trifluorooctowy, a także inny kwas organiczny lub mineralny.Known from the publication of W. Wiejak, E. Masiukiewicz, B. Rzeszotarska "A large scale synthesis of mono- and di-urethane derivatives of lysine" in Chemical and Pharmaceutical, Bulletin 47 (10) 1489-1490 (1999) methods of producing L derivatives -lysines, and in particular diureane derivatives, are adopted for the preparation of L-ornithine derivatives as homologues of the amino acid L-lysine. The known method for the preparation of L-lysine diurethane derivatives consists in blocking the reactivity of the amino group of tep / Y-butoxycarbonyl in the d-position in a first step, and then introducing benzyloxycarbonyl or fluorenylmethoxycarbonyl onto the N "-amino group. For the preparation of the N "-urethane derivative of L-ornithine, the protections introduced on the N" -amine L-ornithine and N- ^d- amino groups of L-ornithine must be selected so that the d-position sheath can be easily removed without disturbing the N sheath. “-Amine. In general, in known processes, when a benzyloxycarbonyl or a fluorenylmethoxycarbonyl group is introduced into a N "-amino group, to block the reactivity of the N ^d -amino group, the / N -butoxycarbonyl is introduced, which is removed under acidolytic conditions of hydrogen chloride in an organic solvent, acid trifluoroacetic acid, as well as other organic or mineral acid.

Znane sposoby wytwarzania N“-uretanowych pochodnych L-lizyny i L-ornityny jako homologu aminokwasu L-lizyny są procesami wieloetapowymi, a tym samym czasochłonnymi, pracochłonnymi i kosztownymi.The known methods for the preparation of the N "-urethane derivatives of L-lysine and L-ornithine as the homologue of the amino acid L-lysine are multi-step processes, and thus time-consuming, labor-intensive and expensive.

Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że proces jest jednoetapowy, w którym na surową pochodną N“-uretanową N^d-fe/Y-butoksykarbonylo-L-ornityny działa się kwasem p-toluenosulfonowym we wrzącym roztworze acetonowym, a po ochłodzeniu do temperatury pokojowej odparowuje się rozpuszczalniki, po czym dodaje: aceton, wodę i trietyloaminę.The essence of the method according to the invention consists in that the process is one step in which a crude derivative of N 'N ^d -uretanową -fe / Y-butoxycarbonyl-L-ornithine treated with p-toluenesulfonic acid in boiling acetone solution and after cooling to a temperature After the solvents are evaporated off at room temperature, acetone, water and triethylamine are added.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się N“-uretanowe pochodne L-ornityny w jednoetapowym, prostym procesie bez wydzielania produktów pośrednich z mieszaniny reakcyjnej, co skraca proces syntezy czyniąc go przy tym wydajnym. Kwas p-tolueno-sulfonowy pozwala łatwo usunąć ochronę fe/Y-butoksykarbonylową i można go poprzez wytworzenie soli z trietyloaminą łatwo oddzielić od produktu, jakim jest pochodna N“-uretanowa L-ornityny. W procesie stosuje się proste techniki laboratoryjne i używa się tanich odczynników i rozpuszczalników. Otrzymuje się produkt z wysoką wydajnością o wysokiej jednorodności chemicznej, stwierdzonej przy pomocy metod chromatograficznych.The process according to the invention produces the N "urethane derivatives of L-ornithine in a one-step, simple process without separating the intermediates from the reaction mixture, which shortens the synthesis process and makes it efficient at the same time. The p-toluene sulfonic acid easily removes the β-butoxycarbonyl protection and can be easily separated from the product of the N "-urethane derivative of L-ornithine by salt formation with triethylamine. The process employs simple laboratory techniques and uses cheap reagents and solvents. The product is obtained in high yield, with high chemical homogeneity, confirmed by chromatographic methods.

Przykład 1Example 1

16,862 g chlorowodorku L-ornityny rozpuszcza się, ciągle mieszając, w 100 ml 2M wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, dodaje 9,982 g wodzianu octanu miedzi(II) rozpuszczonego w 50 ml wody, a po kilku minutach wprowadza się 28,37 g pirowęglanu di-fe/Y-butylowego w 100 ml acetonu i kontynuuje mieszanie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie dodaje się 100 ml acetonu i miesza przez kolejne 20 godzin, po czym odsącza się niebieski osad kompleksu miedzi(II) N^d-fe/Y-butoksykarbonylo-L-ornityny, który przemywa się najpierw 200 ml mieszaniny sporządzonej z acetonu i wody w stosunku 2:1, a następnie 2 porcjami wody po 250 ml każda. Wilgotny osad przenosi się do reaktora, dodaje 90 ml acetonu i miesza przez 15 minut, a następnie dodaje się 180 ml 10% wodnego roztworu węglanu sodu i wprowadza 13,06 g 8-hydroksychinoliny. Po 1,5 godzinnym mieszaniu dodaje się mieszaninę sporządzoną 0,5 godziny przed dodaniem z: 10,43 g N-hydroksysukcynimidu, 45 ml wody, 4,77 g węglanu sodu, 45 ml acetonu i 14 ml chloromrówczanu benzylu. Po 1 godzinnym mieszaniu odsącza się wytrącony zielony osad chinolinianu miedzi(II), przemywa 3 porcjami wody po 50 ml każda, a następnie z przesączu oddestylowuje się aceton. Warstwę wodną ekstrahuje się 4 porcjami chlorku metylenu po 50 ml każda, po czym zakwasza 2M kwasem solnym do pH = 3 i ekstrahuje octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się 100 ml 0,5M kwasu solnego i wodą, a rozpuszczalniki odparowuje do pozostałości w postaci spienionego oleju. Pozostałość tę rozpuszcza się w 50 ml acetonu, a rozpuszczalniki odparowuje. Czynności rozpuszczania i odparowania wykonuje się trzykrotnie. Oleistą pozostałość rozpuszcza się w 250 ml acetonu, dodaje 34,22 g wodzianu kwasu p-toluenosulfonowego i ogrzewa we wrzeniu przez 1 godzinę, a następnie rozpuszczalniki odparowuje się,16.862 g of L-ornithine hydrochloride are dissolved in 100 ml of 2M aqueous sodium hydroxide solution with constant stirring, 9.982 g of copper (II) acetate hydrate dissolved in 50 ml of water are added, and after a few minutes, 28.37 g of di-fe pyrocarbonate are added. [Beta] -butyl in 100 ml of acetone and continued stirring at room temperature for 24 hours. Thereafter 100 ml of acetone and stirred for a further 20 hours, then filtered blue precipitate copper (II) N ^d -fe / Y-butoxycarbonyl-L-ornithine, which is washed first with 200 ml of a mixture prepared from acetone and water 2: 1 ratio, followed by 2 portions of water of 250 ml each. The wet solid is transferred to the reactor, 90 ml of acetone are added and stirred for 15 minutes, then 180 ml of 10% aqueous sodium carbonate solution are added and 13.06 g of 8-hydroxyquinoline are introduced. After 1.5 hours of stirring, a mixture prepared 0.5 hour before the addition of: 10.43 g of N-hydroxysuccinimide, 45 ml of water, 4.77 g of sodium carbonate, 45 ml of acetone and 14 ml of benzyl chloroformate is added. After stirring for 1 hour, the green precipitate of copper (II) quinolinate is filtered off, washed with 3 portions of water, 50 ml each, and then acetone is distilled off the filtrate. The aqueous layer was extracted with 4 portions of 50 ml of methylene chloride each, then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 3 and extracted with ethyl acetate. The acetate layer is washed with 100 ml of 0.5M hydrochloric acid and water, and the solvents are evaporated to leave a foaming oil. The residue is dissolved in 50 ml of acetone and the solvents are evaporated off. The dissolution and evaporation activities are performed in triplicate. The oily residue is dissolved in 250 ml of acetone, 34.22 g of p-toluenesulfonic acid hydrate are added and refluxed for 1 hour, then the solvents are evaporated off.

PL 194 415 B1 dodaje 50 ml acetonu, 25 ml wody i wkrapla 25 ml trietyloaminy, a po godzinie 200 ml acetonu. Po 20 godzinach w temperaturze 5°C odsącza się osad i przemywa acetonem. Otrzymuje się 20,36 g N“-benzyloksykarbonylo-L-ornityny z 76,5% wydajnością liczoną na chlorowodorek L-ornityny. Produkt o temperaturze topnienia 186:187,5°C jest chromatograficznie jednorodny w układzie rozpuszczalników: n-butanol : kwas octowy : octan etylu : woda = 1:1:1:1; R_f = 0,63.50 ml of acetone, 25 ml of water are added, and 25 ml of triethylamine are added dropwise, and after an hour, 200 ml of acetone. After 20 hours at 5 ° C, the precipitate is filtered off and washed with acetone. 20.36 g of N "-benzyloxycarbonyl-L-ornithine are obtained with a yield of 76.5% based on L-ornithine hydrochloride. The product, m.p. 186: 187.5 ° C, is chromatographically homogeneous in the solvent system: n-butanol: acetic acid: ethyl acetate: water = 1: 1: 1: 1; R _f = 0.63.

HPLC: kolumna Alltech, Altima C₁₈, 15ąm, 150x4,6mm. Faza ruchoma: A-0,1% TFA, B-acetonitryl, A:B = 70:30, T_R = 2,60 min, jednorodność 100%, detekcja 210 ąm.HPLC: Alltech column, Altima C ₁₈ , 15 µm, 150 x 4.6 mm. Mobile phase: A-0.1% TFA, B-acetonitrile, A: B = 70:30, T _R = 2.60 min, homogeneity 100%, detection 210 µm.

Produkt jest związkiem o wzorze sumarycznym C₁₃H₁₈N₂O₄ i masie molowej 266 g/mol zawierającym z oznaczenia 58,4% węgla, 6,76% wodoru i 10,50% azotu, a z obliczeń: 58,63% węgla, 6,81% wodoru i 10,52% azotu.The product is a compound with the formula C ₁₃ H ₁₈ N ₂ O ₄ and the molar mass of 266 g / mol, containing 58.4% carbon, 6.76% hydrogen and 10.50% nitrogen from the determination, and 58.63% carbon from the calculation. , 6.81% hydrogen and 10.52% nitrogen.

Przykład 2Example 2

8,431 g chlorowodorku L-ornityny rozpuszcza się, ciągle mieszając, w 50 ml 2M wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, dodaje 4,991 g wodzianu octanu miedzi(II) rozpuszczonego w 25 ml wody i następnie wprowadza się 14,2 g pirowęglanu di-fe/Y-butylowego w 50 ml acetonu. Po 24 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej dodaje się 50 ml acetonu i miesza przez kolejne 20 godzin, po czym odsącza się niebieski osad kompleksu miedzi(II) N^d-fe/Y-butoksykarbonylo-L-ornityny, który przemywa się najpierw 100 ml mieszaniny sporządzonej z acetonu i wody w stosunku 2:1, a następnie 2 porcjami wody po 250 ml każda. Wilgotny osad przenosi się do reaktora, dodaje 45 ml acetonu i miesza kilkanaście minut, a następnie dodaje się 90 ml 10% wodnego roztworu węglanu sodu i wprowadza 6,53 g 8-hydroksychinoliny. Po 1 godzinie mieszania w temperaturze pokojowej dodaje się mieszaninę sporządzoną 0,5 godziny przed dodaniem z: 5,215 g N-hydroksysukcynimidu, 25 ml wody, 3,385 g węglanu sodu, 22,5 ml acetonu i 11,642 g chloromrówczanu fluorenylometoksylowego. Po 1 godzinie i 15 min mieszania odsącza się wytrącony zielony osad chinolinianu miedzi(II), przemywa wodą, a następnie z przesączu oddestylowuje się aceton. Warstwę wodną ekstrahuje się 3 porcjami toluenu po 70 ml każda i 3 porcjami octanu etylu po 70 ml każda. Warstwę octanową przemywa się 0,5M kwasem solnym, a następnie 0,25M kwasem solnym i wodą. Rozpuszczalniki odparowuje się. Do pozostałości w postaci osadu dodaje się 17,11 g wodzianu kwasu p-toluenosulfonowego, 135 ml acetonu i ogrzewa we wrzeniu przez 1 godzinę, a następnie rozpuszczalniki odparowuje się. Pozostałość rozpuszcza się w 135 ml wody, 45 ml acetonu i wkrapla 12,5 ml trietyloaminy, a po 15 min dodaje się 90 ml acetonu i pozostawia w temperaturze 5°C przez 20 godzin. Odsącza się osad N“-fluorenylometoksykarbonylo-L-ornityny w ilości 10,36 g z 58,5% wydajnością liczoną na chlorowodorek Lornityny. Produkt o temperaturze topnienia 165°C jest chromatograficznie jednorodny w układzie rozpuszczalników: n-butanol : kwas octowy : octan etylu : woda = 1:1:1:1; R_f = 0,68.8.431 g of L-ornithine hydrochloride are dissolved in 50 ml of 2M aqueous sodium hydroxide solution while stirring, 4.991 g of copper (II) acetate hydrate dissolved in 25 ml of water are added and 14.2 g of di-fe / Y-pyrocarbonate are then introduced. of butyl in 50 ml of acetone. After 24 hours of stirring at room temperature was added 50 ml of acetone and stirred for a further 20 hours, then filtered blue precipitate copper (II) N ^d -fe / Y-butoxycarbonyl-L-ornithine, which is washed first with 100 ml of made of acetone and water in a ratio of 2: 1, and then 2 portions of water, 250 ml each. The wet precipitate is transferred to the reactor, 45 ml of acetone are added and the mixture is stirred for several minutes, then 90 ml of 10% aqueous sodium carbonate solution are added and 6.53 g of 8-hydroxyquinoline are introduced. After 1 hour of stirring at room temperature, a mixture prepared 0.5 hour before the addition of: 5.215 g of N-hydroxysuccinimide, 25 ml of water, 3.385 g of sodium carbonate, 22.5 ml of acetone and 11.642 g of fluorenylmethoxy chloroformate is added. After 1 hour and 15 minutes of stirring, the green precipitate of copper (II) quinolinate is filtered off, washed with water, and then acetone is distilled off from the filtrate. The aqueous layer was extracted with 3 portions of toluene with 70 ml each and 3 portions of ethyl acetate 70 ml each. The acetate layer is washed with 0.5M hydrochloric acid followed by 0.25M hydrochloric acid and water. The solvents are evaporated off. 17.11 g of p-toluenesulfonic acid hydrate, 135 ml of acetone are added to the precipitate residue and refluxed for 1 hour, then the solvents are evaporated off. The residue is dissolved in 135 ml of water, 45 ml of acetone and 12.5 ml of triethylamine are added dropwise, and after 15 min, 90 ml of acetone are added and the mixture is allowed to stand at 5 ° C for 20 hours. The precipitate of N "-fluorenylmethoxycarbonyl-L-ornithine in an amount of 10.36 g with a yield of 58.5% based on lornithine hydrochloride is filtered off. The product with a melting point of 165 ° C is chromatographically homogeneous in the solvent system: n-butanol: acetic acid: ethyl acetate: water = 1: 1: 1: 1; R _f = 0.68.

HPLC: kolumna Alltech, Altima C₁₈, 5 ąm, 150x4,6 mm. Faza ruchoma: A-0,1% TFA, B-acetonitryl, A:B = 60:40, T_R = 3,33 min, jednorodność 97,6%, detekcja 210 ąm.HPLC: Alltech column, Altima C ₁₈ , 5 µm, 150 x 4.6 mm. Mobile phase: A-0.1% TFA, B-acetonitrile, A: B = 60:40, T _R = 3.33 min, homogeneity 97.6%, detection 210 µm.

Produkt jest związkiem o wzorze sumarycznym C₂₀H₂₂N₂O₄ i masie molowej 354,21 g/mol zawierającym z oznaczenia 67,90% węgla, 5,99% wodoru i 7,68% azotu, a z obliczeń: 67,76% węgla, 6,26% wodoru i 7,91% azotu.The product is a compound with the formula C ₂₀ H ₂₂ N ₂ O ₄ and the molar mass of 354.21 g / mol, containing 67.90% carbon, 5.99% hydrogen and 7.68% nitrogen from the determination, and 67.76 % carbon, 6.26% hydrogen, and 7.91% nitrogen.

Claims (1)

Sposób wytwarzania N“-uretanowych pochodnych L-ornityny z ornityny, na której wytwarza się kompleks miedziowy(II), wprowadza fe/Y-butoksykarbonyl na funkcję N^d-aminową, następnie rozkłada się kompleks miedziowy(II) za pomocą 8-hydroksychinoliny, wprowadza osłonę uretanową na funkcję N“-aminową L-ornityny, znamienny tym, że proces jest jednoetapowy, w którym na surową pochodną N“-uretanową N^d-fe/Y-butoksykarbonylo-L-ornityny działa się kwasem p-toluenosulfonowym we wrzącym roztworze acetonowym, a po ochłodzeniu do temperatury pokojowej odparowuje się rozpuszczalniki, po czym dodaje: aceton, wodę i trietyloaminę.The method for the preparation of N "-urethane derivatives of L-ornithine from ornithine, on which the copper (II) complex is produced, introduces the / Y-butoxycarbonyl on the N ^d -amino function, then decomposes the copper (II) complex with 8-hydroxyquinoline, introduces a urethane shield on the N "-amine function of L-ornithine, characterized in that the process is a one-step process in which the crude N" -ureane derivative N ^d -fe / Y-butoxycarbonyl-L-ornithine is treated with p-toluenesulfonic acid in boiling acetone solution, and after cooling to room temperature, the solvents are evaporated off, and then acetone, water and triethylamine are added.