PL186504B1

PL186504B1 - Pochodne benzamidowe i kompozycje farmaceutyczne zawierające te pochodne

Info

Publication number: PL186504B1
Application number: PL95316757A
Authority: PL
Inventors: Jean-François Rossignol
Original assignee: Romark Lab
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2004-01-30
Also published as: PL316757A1; SK281949B6; SK130796A3; CN1072654C; DE69526936T2; AP9600866A0; FI120258B; KR100348440B1; CA2187110C; EP0755386B1; AP645A; HU9602798D0; FI964031A0; CN1145621A; CA2187110A1; KR100373081B1; AU2344095A; AU689582B2; EP0755386A1; CZ287002B6

Abstract

1. Nowy zwiazek o wzorze I w którym podstawnik R1 oznacza grupe hydroksylowa, zas pozostale podstawniki R2 , R3, R4 i R5 oznaczaja atomy wodoru. 2. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca skladniki aktywne i ewentualnie zawierajaca czynnik zwilzajacy i pochodne skrobi jako skladniki pomocnicze, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera mieszanine zwiazku o wzorze I w którym R 1 = OH, zas R2 = R3 = R4 = R5 = H i zwiazku o wzorze II przy czym ilosc zwiazku o wzorze I w stosunku do ilosci mieszaniny zwiazku o wzorze I i zwiazku o wzorze II miesci sie w zakresie 0,5-20% wagowych PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do zwalczania chorobowych dolegliwości dolnych partii podbrzusza, przy czym wymieniona kompozycja zawiera aktywny składnik o wzorze I

NO₂

O

NH—(!

s) Λ²

H.

r₃

Rs Rą w którym podstawnik R, oznacza grupę hydroksylową, zaś pozostałe podstawniki R2, R₃, R4 i R₅ oznaczają atomy wodoru, i czynnik zwilżający, oraz wymieniona kompozycja korzystnie zawiera również pochodną skrobi.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc nowy związek o wzorze I

w którym podstawnik R, oznacza grupę hydroksylową, zaś pozostałe podstawniki R2, R3, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru.

Przedmiotem wynalazku jest również farmaceutyczna kompozycja zawierająca jako składnik aktywny związek o wzorze I, w którym R! oznacza grupę hydroksylową.

Kompozycja, jako składnik aktywny zawiera mieszaninę związku o wzorze I

w którym R, = OH, zaś R2 = R3 = R4 = R5 = H; oraz związku o wzorze II

Η H

186 504

Taka kompozycja łączy zasadniczo bezpośrednie działanie przeciwko pasożytom, grzybom, bakteriom i wirusom lub zasadniczo bezpośrednie działanie na dolegliwości jelitowe i tym samym przedłuża działanie lub leczenie.

Taka kompozycja jest odpowiednia do leczenia ludzkich dolegliwości lub do zapobiegania ludzkim dolegliwościom, takim jak, zakażenia pasożytami, zakażenia bakteriami, zakażenia grzybami, biegunka, lub inne dolegliwości jelitowe, takie jak, dolegliwości wywołane wirusami.

W kompozycji według wynalazku wagowa zawartość związku o wzorze I

HO H

w odniesieniu do masy mieszaniny związku o powyższym wzorze I, oraz związku o wzorze II

NO₂

zawarta jest między 0,5 i 20%, korzystnie między 0,5 i 10%, najkorzystniej między 0,5 i 5%.

Kompozycja według wynalazku zawierająca związek według niniejszego wynalazku może mieć zastosowanie jako czynnik przeciwpasożytmczr, czynnik przeciwbakteryjny, czynnik przeciwgrzybowy lub czynnik prraciwwirusowy.

Kompozycja może również zawierać inne aktywne czynniki, takie jak środek przeciwko robakom i środek przeciwko wirusom.

Kompozycja może także zawierać czynnik zwilżający i/lub pochodną skrobi i/lub substancję dodatkową.

Kompozycja według wynalazku korzystnie jest stałą kompozycją do podawania doustnie, do zwalczania dolegliwości lub zakażeń dolnych partii podbrzusza odcinków dróg pokarmowych, korzystnie chorób jelit i pochwy i zawiera:

- skuteczną ilość związku o wzorze II

- czynnik zwilżający i ewentualnie, lecz korzystnie

- przynajmniej jedną pochodną skrobi.

Η H

186 504

Ta ostatnia kompozycja może również zawierać inne aktywne czynniki, na przykład środki przeciwko robakom, takie jak febantel, praziquantel, lewamizol, albendazol, oksfendazol, moksydektynę, iwermektynę, milbemycynę i tym podobne.

Wytwarzanie i zastosowanie związku o wzorze Π zastrzeżono w opisach patentowych St. Zjedn. Ameryki nr 3.950.351 i 4.315.018.

Czynnik zwilżający, obecny w kompozycji zawierającej związek o wzorze I i ewentualnie związek o wzorze II, dogodnie jest anionowym czynnikiem powierzchniowo-czynnym i korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej estry cukrów, polioksyetylen, polioksypropylen, pochodne anhydroheksytolu, amidy alkoholi tłuszczowych, tlenki amin tłuszczowych, sacharozę, mannitol, sorbitol, lecytyny, poliwinylopirolidony, estry kwasów tłuszczowych, glicerydy sacharozy, estry ksylozy, glicerydy polioksyetylenu, estry kwasów tłuszczowych i eteru polioksyetylenu z alkoholami tłuszczowymi i polioksyetylenowymi estrami kwasu tłuszczowego z sorbitanem, polioksyetylenowe estry kwasów tłuszczowych z sorbitanem, estry glicerydopoliglicydowe alkoholi poliglicydowych i ich mieszaniny.

Szczególnie odpowiednimi czynnikami zwilżającymi są distearyniany sacharozy, PVP (poliwinylopirolidon) itp.

Kompozycja według niniejszego wynalazku korzystnie zawiera pochodną skrobi, zwłaszcza karboksylową pochodną skrobii, taką jak, karboksymetyloskrobię, jej sodową pochodną lub jej sól.

Kompozycja zawiera, na przykład do 20% wagowych, korzystnie 1 do 10% wagowych środka powierzchniowo-czynnego w odniesieniu do masy składnika aktywnego (składników aktywnych) i do 20% wagowych, korzystnie 1 do 10% wagowych pochodnej skrobi w odniesieniu do masy składnika aktywnego (składników aktywnych).

Przedmiotem wynalazku jest również galenowa forma do podawania doustnie przeciwko wirusom i/lub do zwalczania dolegliwości dolnych partii podbrzusza, takich jak, dolegliwości lub schorzenia jelitowe, pochwy lub dróg moczowo-płciowych, przy czym wymieniona postać galenowa zawiera rdzeń obejmujący:

- skuteczną ilość aktywnego środka czyli związku A i ewentualnie związku B,

- czynnik zwilżający i ewentualnie, lecz korzystnie

- pochodną skrobi lub jej sól,

- przy zawartości wody w wymienionej kompozycji mniejszej niz 25% wagowych, zaś wymieniony rdzeń korzystnie powleczony jest błoną. Taka błona może być błoną nierozpuszczalną w środowisku kwasu żołądkowego lecz rozpuszczalną w jelitach.

Korzystne kompozycje, zwilżające czynniki i tym podobne galenowe preparaty zastrzega się poniżej jako kompozycje według niniejszego wynalazku.

Kompozycja według wynalazku w postaci preparatu galenowego jest stosowana do zwalczania biegunki i zwalczania zaburzeń w pracy wątroby..

Kompozycja według wynalazku może mieć także postać maści lub żelu, kremu lub czopków do działania na organy dolnych odcinków dróg pokarmowych, takie jak, pochwa lub układ moczowo-płciowy, do zwalczania na nich zmian lub chorób, albo do zwalczania chorób odbytu. Maść, korzystnie żel, zawiera związek A o wzorze I i ewentualnie związek B, czynnik zwilżający, jak również zaróbkę.

Czynnik zwilżający korzystnie jest jednym z wymienionych powyżej dla kompozycji i/lub formy galenowej.

Ponadto kompozycja według wynalazku może być kompozycją przeciwbakteryjną zawierającą związek o wzorze I i/lub związek o wzorze II oraz czynnik zwilżający. Taka kompozycja jest aktywna przeciwko tlenowym, jak również beztlenowym bakteriom, tak więc wykazuje bardzo szeroki zakres aktywności.

Kompozycja według wynalazku ma właściwości zabijania bakterii lub zapobiegania obecności lub wzrastania bakterii w środowisku. W procesie takim bakteria lub środowisko jest poddawane działaniu bakteriobójczej kompozycji według niniejszego wynalazku, przykładowo za pomocą zraszania bakterii kompozycją, za pomocą włączania jej do podłoża i tym podobnych.

186 504

Kompozycja według niniejszego wynalazku do poZkwcnia doustnego, stosowana jest także w procesie zwalczania biegunki u zwierząt, korzystnie u ludzi, w którym stosuje się kompozycje zawierającą:

- skuteczną ilość aktywnego czynniec - związek o wzorze I i ewentualnie związek o wzorze II

- czynnik zwilżający

- pochodną skrobi.

Ponadto kompozycja według wznalcaeu może być też stosowana jako komayzzcjc żywnośziowc, taka jak pasta żywnościowa lub jogurt.

Rysunek na figurze 1 przedstawia widmo w ultrafiolecie związku o wzorze I

HO H

NO₂

Rysunek na figurze 2 przedstawia widmo w podczerwieni związku o wzorze I, oraz Rysunek na figurze 3 przedstawia zapis badania HPLC przy detekcji spektrografią masową związku o wzorze I.

Sposób wytwarzania czystego związku o wzorze I i Ro

NO₂

NH—C

Rs' *4 w którym podstawnik R, oznacza grupę hydroksylową, pydcaks gdy pozostałe podstawniki R₂, R₃, R4 i Rj oznaczają atomy wodoru, można prowadzić ąyzhoZaąz ze związków o wzorze I

w którym podstawnik Rj oznacak grupę acyloksylową, zaś pozostałe podstawniki R₂, R3, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru.

Powyższy związek w postaci zawiesiny umlnszcak się w słabej mlesakninie kwasu solnego i wody. Poddany temu daiałcniu związek następnie sączy się i przemywa wodą. Przemyty związek następnie ewentualnie suszy się.

186 504

P r z y k ł a d wytwarzania. Wytwarzanie związku o wzorze I.

g 2-(acetoliloksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu (to znaczy PH 5776) - związku o wzorze II, wytworzonego sposobem zastrzeżonym w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3.950.351, zawiesza się w 20 ml 37% kwasu solnego. Całość utrzymuje się w temperaturze 50°C w czasie 24 godzin i powoli miesza, po czym sączy się w celu wydzielenia stałych cząstek. Wymienione cząstki przemywa się wodą do uzyskania wartości pH 7 i suszy w suszarce w temperaturze 50°C. Uzyskuje się produkt w postaci mikrokrystalicznych igieł o barwie żółtej, o temperaturze topnienia 254°C (pomiar temperatury topnienia przeprowadza się w kapilarze przy użyciu aparatu Mettler FP).

Budowę potwierdza się metodą analizy elementarnej, widmem w nadfiolecie (patrz rysunek Fig. 1), widmem w podczerwieni (patrz rysunek Fig. 2) oraz widmem gazowej chromatografii masowej (patrz rysunek Fig. 3).

Otrzymano następujące wyniki: C₁₀, H₇, N3, O4, Si: 258

Obliczono: C46,5 1% 37^% 1% N 40,40% S 40,40%

Znaleziono: 45,98% 2,63% 16,71% 16,667/% ^max = 350 nm (OD = 0,605).

Test 1

Wytwarzanie kompozycji O

Kompozycję według wynalazku wytwarza się za pomocą zmieszania PH 5776 i związku uzyskanego sposobem opisanym powyżej, przy czym wagowa zawartość związku o wzorze I w odniesieniu do masy związku o wzorze I i PH 5776 wynosi 4%.

Kompozycja A1

100g nitazoksanidu (PH 5776) miesza się w 100ml wody z 10g poliwinylopirolidonem (czynnik zwilżający) i 5g skrobi karboksymetylowej. Mieszaninę suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem.

Wymienioną kompozycję można następnie stosować do wytwarzania granulek, saszetek, tabletek lub kapsułek do podpoliczkowego lub doustnego podawania.

Kompozycje B1, C1, D1, E1, F1, G1

Wytwarza się kompozycje podobne do kompozycji A1, z tą różnicą, że stosuje się tylko 5g i 2g poliwinylopirolidonu oraz 2g i 1g skrobi karboksymetylowej.

W poniższej tabeli zamieszcza się zawartości (g) nitazoksanidu „N”, poliwinylopirolidonu „PVP” i skrobi karboksymetylowej „CS” w kompozycjach.

Kompozycja	N (g)	PVP(g)	CS (g)
Bl	100	5	5
Cl	100	2	2
Dl	100	5	2
El	100	5	1
Fl	100	2	1
Gl	100	5	0

Kompozycje H1, I1, J1

Kompozycje zawierające nitazoksanid, jak również inny aktywny czynnik można wytwarzać za pomocą przygotowania wodnej mieszaniny zawierającej PVP i skrobię karboksymetylową i dodania do wymienionej mieszaniny nitazoksanidu i innego czynnika aktywnego. Następnie mieszaninę suszy się do uzyskania produktu o zawartości wody niższej niż 5%.

186 504

Kompozycja	N (g)	PVP	CS	Inne czynniki aktywne (g)	Zawartość wody (%)
HI	50	5	2	Praziąuantel 50	2
11	75	5	2	Praziąuantel 50	1
Jl	75	5	2	Praziąuantel 50	2

Kompozycje A2 do J2

Przygotowuje się kompozycje A2 do J2 podobne do kompozycji Al do Jl.

Kompozycje A2 do J2 różnią się od kompozycji Al - Jl tylko tym, ze zawierają one mieszaninę nitazoksanidu (PH 5776 - związek o wzorze II) i związku o wzorze I:

(zamiast samego nitazoksanidu w kompozycjach Al - Jl).

W poniższej tabeli zestawia się ilość związków o wzorze I i związku o wzorze II, które stosuje się do przygotowania kompozycji A2 - J2.

Kompozycja	Związek o wzorze I (g)	Związek wzorze II (g)
A2-G2	4	96
H2	2	48
12	3	72
J2	3	72

Wytwarzanie form galenowych Preparat Kl

500 g nitazoksanidu w postaci proszku miesza się z 10 g poliwinylopirolidonu, 20 g skrobi karboksymetylowej, 25 g skrobi kukurydzianej, 5 g stearynianu magnezu i 50 g wody, po czym z otrzymanej mieszaniny formuje się granulki o masie 560 mg (to znaczy granulki zawierające 500 mg aktywnego czynnika). Uzyskane granulki o średnicy około 1 cm suszy się w temperaturze około 50°C.

Tak uzyskane mikrogranulki poddaje się następnie procesowi powlekania za pomocą spryskiwania gorącym roztworem cukru. Powlekający cukier tworzy błonę.

Preparat K2

Sproszkowaną mieszaninę 480g nitazoksanidu (PH 5776) i 20g związku o wzorze I miesza się z lOg poliwinylopirolidonu, 20g skrobi karboksymetylowej, 25g skrobi kukurydzianej, 5g stearynianu magnezu i 50g wody i z tak otrzymanej mieszaniny formuje się granulki o masie 560mg (to znaczy zawierające 500mg czynnika aktywnego). Granulki te posiadają średnicę 1 cm i suszy się je w temperaturze około 50°C. Tak uzyskane mikrogranulki poddaje się następnie procesowi powlekania za pomocą spryskiwania gorącym roztworem cukru. Powlekający cukier tworzy błonę.

186 504

Jest oczywiste, że mikrogranulki mogą zawierać ponadto jeden lub więcej dodatków lub innych aktywnych czynników, takich jak celuloza mikrokrystaliczna (Avicel® FMC), metylocelulozę, etylocelulozę, karboksymetylocelulozę, hydroksyetylocelulozę, hydroksypropylocelulozę, skrobię i tym podobne.

Ponadto błona może również zawierać:

- dopuszczony do stosowania w farmacji dodatek, taki jak plastyfikator, barwnik, wypełnienie, czynnik zwilżający, czynnik poślizgowy, lub ich mieszaninę, oraz

- kompozycję tworzącą błonę, która zawiera substancje nierozpuszczalne w kwasie żołądkowym lecz rozpuszczalne w soku jelitowym, substancje polimerowe lub nie, na przykład, acetoftalan celulozy, acetoftalan poliwinylowy, hydroksypropylometyloceluloza).

Testy Test 1

Podczas I fazy badań, badania farmakokinetyczne przeprowadza się na 6 ochotnikach, którzy otrzymują pojedynczą dawkę 500 mg doustnie w postaci kompozycji O. W przybliżeniu 3 mcg/ml 2-(hydroksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu oznacza się we krwi za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Produkt ten wydziela się w postaci niezmienionej w moczu w czasie 24 pierwszych godzin po podaniu. Nie stwierdza się śladów 2-(acetoliloksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu we krwi i w moczu.

W czasie II fazy badań klinicznych, próby przeprowadzano na 80 pacjentach. Po poddaniu leczeniu pobierano próbki kału i/lub wymazy z pochwy. Stwierdzono, że kompozycja Al podawana w dawkach 500 mg dwa razy dziennie w czasie kolejnych 3 do 7 dni była wysoce skuteczną (60-95%) przeciwko Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Gardia lamblia, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Taenia solium, Diphylobottrium latum i Hymenolepis nana. Obserwowano dobrą tolerancję i tylko kilka przypadków bólu w okolicy nadbrzusznej, nudności, wymiotów i biegunki u około 10 % pacjentów, wywołanych w czasie leczenia. Przed i po podaniu kompozycji przeprowadzano badania chemiczne i hematologiczne krwi, które wykazały brak wpływu kompozycji na krew.

W badaniach in vitro przeciwko Trichomonas vaginalis stwierdzono, że podczas gdy 2-(acetoliloksy)-N-(5-nitro-2-tiazoliło)benzamid wykazuje najmniejsze stężenie hamujące w granicach 0,5 do 1,25 mcg/ml to w tych samych warunkach doświadczalnych 2-(hydroksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamid charakteryzuje wartość 1 do 1,25 mcg/ml. Dane te demonstrują, że aktywność 2-(hydroksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu przeciwko pasożytom jest równoważna aktywności 2-(acetoliloksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu. Jednak w badaniach tych wykazano, że 2-(hydroksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo) wykazuje działanie zasadniczo natychmiastowe, którego nie stwierdza się w przypadku 2-(acetoliloksy)-N-(5-nitro-2-tiazolilo)benzamidu.

Końcowe badania in vitro wykazały, że kompozycja była skuteczna przeciwko gram-dodatnim i gram-ujemnym bakteriom tlenowym, takim jak, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sonei, Helicobacter pylon; beztlenowym bakteriom, takim jak, Bacteroides fragilis, Fusobacterium ulcerans, YeilloneUa alcadescens, Gardnerella vaginalis, dermatofitycznym drożdżom i grzybom, takim jak, Trichophyton mentographytes, Microsporum audovini, Epidermophyton Flocosum i Candida albicans.

Przy użyciu związku A o wzorze I

186 504 w którym R, oznacza grupę hydroksylową, gdy pozostałe podstawniki R2, R3, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru, nawet w bardzo niewielkich ilościach, możliwe jest zwiększenie skuteczności związków o wzorze II, zwłaszcza związku PH 5776.

Testy 2 i 3

W celu określenia skuteczności kompozycji według wynalazku, dwie grupy po 5 myszy (w wieku 4-8 tygodni i wadze 18-20 g każda) poddaje się badaniu. Każda z grup zostaje zakażona szczepem Cryptosporidium parmum. Zakażone myszy ulegają przewlekłej biegunce. Przed poddaniem leczeniu myszy chore na przewlekłą biegunkę określa się za pomocą analizy kału. Leczenie przeprowadza się przy użyciu kompozycji Dl z nitazoksanidem, zastrzeżonej powyżej. Myszom chorym na przewlekłą biegunkę za pomocą doustnego zgłębnika podaje się codziennie około 0,01 g nitazoksanidu (to znaczy około 0,6 g/kg wagi ciała) w czasie jednego tygodnia. Po upływie jednego tygodnia nie można było określić za pomocą analizy kału, która grupa myszy uprzednio chorowała na biegunkę. Zakażone myszy leczono również przy użyciu kompozycji D2. Wymienionym myszom za pomocą doustnego zgłębnika w czasie jednego tygodnia podawano codziennie około 0,0096 g nitazoksanidu i około 0,0004 g związku o wzorze I.

Przed końcem tygodnia w którym przeprowadzano leczenie nie można było określić za pomocą analizy kału, która grupa myszy uprzednio chorowała na biegunkę.

Testy 4 i 5

Przygotowuje się wodną kompozycję (100 g) zawierającą 10 g aktywnego czynnika.

W przypadku kompozycji zawierającej jako czynnik aktywny nitazoksanid lub mieszaninę nitarnksanidu (9,6 g) i związku o wzorze I, kompozycja zawiera ponadto 0,5 g distearynianu sacharozy.

Kompozycje stosuje się przeciwko różnym pasożytom, robakom, bakteriom i grzybom. Aktywność tych kompozycji podano w poniższej tabeli.

	Aktywność
P1	P2	P3	P4	P5
1	2	3	4	5	6
Protozoa Trichomonas vaginalis	+	+	Nie	Nie	+
Trichomonas inestinalis	+	+	Nie	Nie	+
Entamoeba histolytica	+	+	Nie	Nie	+
Entamoeba dispar	+	+	Nie	Nie	+
Entamoeba coli	+	+	Nie	Nie	+
Endolimax nana	+	+	Nie	Nie	+
Balantidium coli	+	+	Nie	Nie	+
Dientamoeba fragilis	+	+	Nie	Nie	+
Giarda lamblia	+	+	Nie	Nie	+
Isospora belli	+	+	±	Nie	+
Cryptosporidium parvum		+	Nie	Nie	Nie
Bladtocystis hominis	+	+	Nie	Nie	Nie 1

186 504 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5	6
Enterocytozoon bieneusi	+	+	Nie	Nie	Nie
Septata intestinalis	+	+	Nie	Nie	Nie

P1 = Nitazoksanid + distearynian sacharozy

P2 = Nitazoksanid + związek o wzorze I + distearynian sacharozy P3 = Albendazol

P4 = Mebendazol

P5 = Metronidazol

	Aktywność
P1	P2	P3	P4	P5
Robaki Enterobius vermicularis	+	+	+	+	Nie
Ascaris lumbricoides	+	+	+	+	Nie
Necator americanus	+	+	+	+	Nie
Anycylosloma duodenale	+	+	+	+	Nie
Trichuris trichiura	+	+	+	+	Nie
Strongyloides stercoralis	+	+	Nie	Nie	Nie
Taenia saginata	+	+	Nie	Nie	Nie
Taenia solium	+	+	Nie	Nie	Nie
Hymenolepsis nana	+	+	Nie	Nie	Nie
Bakterie tlenowe Staphylococcus aureus	+	+	Nie	Nie	Nie
Escherichia coli	+	+	Nie	Nie	Nie
Proteus vulgaris	+	+	Nie	Nie	Nie

P1 = Nitazoksanid + distearynian sacharozy

P2 = Nitazoksanid + związek o wzorze I + distenryyiny sacharozy P3 = Albendazol

P4 = Mebendazol

P5 = Metronidazol

186 504

	Aktywność
P1	P2	P3	P4	P5
Bakterie beztlenowe Szczepy Clostridium	+	+	Nie	Nie	+
Szczepy Bacteroides	+	+	Nie	Nie	+
Szczepy Peptococcus	+	+	Nie	Nie	+
Peptostreptococcus SPP	+	+	Nie	Nie	+
Fusobacterium SPP	+	+	Nie	Nie	+
Grzyby Candida Albicans Trychophyton	+	+	Nie	Nie	Nie
Men tagrophytes	+	+	+	Nie	Nie
Microsporum audovini	+	+	+	Nie	Nie
Epidermophyton flocosum	+	+	+	Nie	Nie

P1 - Nitazoksanid + distearynian sacharozy

P4 = Mebendazol

P5 = Metronidazol

Test 5

Ogólny sposób postępowania dla oznaczania przeciwwirusowej skuteczności i toksyczności przedstawia się poniżej.

Przepis laboratoryjny oznaczania przeciwwirusowej skuteczności i toksyczności

A. Wytwarzanie fibroblastowych komórek z ludzkich napletków

Napletki ludzkich noworodków uzyskuje się w wyniku obrzezania i umieszcza w minimalnym podłożu podstawowym (MEM) zawierającym wankomycynę, fungizon, penicylinę i gentamycynę, w zwykle stosowanych stężeniach w czasie czterech godzin. Następnie usuwa się podłoże, napletki rozdrabnia na małe kawałki i przemywa wielokrotnie, dotąd aż usunie się czerwone komórki. Tkankę poddaje się trypsynowaniu przy użyciu typsyny w stężeniu 0,25% mieszając w czasie 15 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po upływie okresów 15 minutowych pozostawia się aby tkanka osiadła na dnie naczynia. Roztwór z nad osadu, zawierający komórki przeprowadza się przez tkaninę typu ang. cheesecloth do kolby zawierającej MEM i 10% krowiej surowicy płodowej. Kolbę zawierającą pożywkę utrzymuje się w lodzie w czasie przeprowadzania trypsynizowania. Po każdym dodaniu komórek tkaninę przemywa się niewielką ilością MEM zawierającej surowicę. Za każdym razem do kawałków napletków dodaje się świeżą trypsynę i postępowanie powtarza się aż do zaprzestania uwalniania się komórek. Pożywkę zawierającą komórki poddaje się wirowaniu przy 1000 obrotach/minutę w temperaturze 4°C w czasie dziesięciu minut. Ciecz z nad osadu odrzuca się i komórki zawiesza w niewielkiej ilości MEM z 10% FGS (krowia

186 504 surowica płodowa). Następnie komórki umieszcza się w odpowiedniej ilości kolb do prowadzenia hodowli tkankowych o powierzchni 25 cm². Gdy komórki zlewają się i wymagają trypsynizacji, to stopniowo przenosi się je do większych kolb. Komórki utrzymuje się w obecności wankomycyny i fugizonu do czwartego pasażu.

B. Próba hamowania efektu cytopatycznego - HSV, HCMV, VZV

Komórki fibroblastowe ludzkiego napletka z niskich pasaży, wysiewa się do 96-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej na 24 godziny przed zastosowaniem, przy stężeniu komórek wynoszącym 2,5 x 10⁴ komórek w ml, w 0,1 ml minimalnego podłoża zasadniczego (MEM) uzupełnionego 10% krowiej surowicy płodowej (FBS). Komórki inkubuje się w czasie 24 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po inkubacji usuwa się podłoże i 100 fil MEM zawierającej 2% FBS dodaje się do wszystkich poza pierwszym rzędem. W pierwszym rzędzie 125 μ1 badanego leku dodaje się w trójkach studzienek. Samo podłoże dodaje się do komórkowych i wirusowych studzienek kontrolnych. Lek w pierwszym rzędzie studzienek rozcieńcza się kolejno 1:5 do pozostałych studzienek poprzez przeniesienie 25 jil przy użyciu urządzenia Cetus Liquid Handling Machine. Po rozcieńczeniu leku, do każdej studzienki dodaje się 100 mikrolitrów roztworu o odpowiednim stężeniu wirusa, poza studzienkami kontrolnymi do których wprowadza się 100 pl MEM. Dla prób z HSV-1 i HSV-2 wirus stosuje się w stężeniu 1000 PFU na studzienkę. Dla prób z CMZ i VZV wirus dodaje się w stężeniu 2500 PFU na studzienkę. Płytki inkubuje się następnie w temperaturze 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w ciągu trzech dni w przypadku HSV-1 i HSV-2, dziesięciu dni w przypadku VZV lub 14 dni w przypadku CMV. Po okresie inkubacji pożywkę odsysa się i komórki barwi 0,1% roztworem fioletu krystalicznego w czasie 30 minut. Następnie usuwa się barwnik i płytki przemywa za pomocą wody wodociągowej aż do usunięcia nadmiaru barwnika. Płytki pozostawia się do wyschnięcia w czasie 24 godzin i następnie odczytuje przy pomocy urządzenia S^ki^^^on Plate Reader przy 620 nm.

C. Próba zmniejszania łysinek dla HSV-1 i HSV-2 przy pomocy półstałej warstwy nakładanej

Dwa dni przed zastosowaniem komórki HFF (fibroblasty ludzkiego napletka) umieszcza się w sześciostudzienkowych płytkach i inkubuje w temperaturze 37°C, przy 5% dwutlenku węgla i wilgotności 90%. W dniu przeprowadzania próby lek przygotowuje się w dwóch pożądanych stężeniach w 2 x MEM i następnie seryjnie rozcieńcza 1:5 w 2xMEM, po czym seryjnie rozcieńcza 1:5 w 2xMEM otrzymując sześć roztworów o różnych stężeniach leku. Początkowe wyjściowe stężenie wynosi zwykle 200 pg/ml, zaś dolne 0,06 pg/ml. Stosowany wirus rozcieńcza się MEM zawierającym 10% FBS do pożądanego stężenia, które będzie dawało 20-30 łysinek w studzience. Następnie podłoże wysysa się ze studzienek i dodaje 0,2 ml roztworu wirusa do każdej pary studzienek oraz 0,2 ml pożywki do studzienek z próbami toksyczności leku. Płytki inkubuje się w czasie jednej godziny wytrząsając po każdych 15 minutach. Po okresie inkubacji do każdego rozcieńczenia leku dodaje się równą mu objętość 1% roztworu agarozy. Powoduje to, że końcowe stężenie leku zaczyna się od 100 pg/ml i kończy przy 0,03 pg/ml oraz końcowe stężenie nalewanej warstwy agarozy wynosi 0,5%. Mieszaninę leku i agarozy stosuje się do każdej studzienki w objętości 2 ml, płytki inkubuje w czasie trzech dni, po czym komórki wybarwia się za pomocą 1,5% roztworu obojętnej czerwieni. Po zakończeniu 4-6 godzinnej inkubacji, barwnik wysysa się i zlicza łysinki przy pomocy stereomikroskopu o 10-krotnym powiększeniu .

Wartość ED50 (stężenie 50% skuteczności) oznacza stężenie konieczne do zahamowania cytopatogeniczności wirusa w 50%.

Wartość IC₅₀ (stężenie hamujące 50%) oznacza stężenie konieczne do zahamowania proliferacji komórek w 50%.

Wartość współczynnika selektywności (S.I.) oznacza stosunek IC50/EC₅0

186 504

D. Próba zmniejszenia łysinek VZV - przy pomocy półstałej warstwy nakładanej

Próbę przeprowadza się zasadniczo sposobem identycznym jak dla łysinek HSV opisanym powyżej z dwoma różnicami:

1. Po dodaniu leku płytki inkubuje się w czasie 10 dni.

2. W dniu trzecim i szóstym dodatkowo nakłada się warstwę lml z równych ilości 2xMEM i 1% roztworu agarozy.

E. Próba z łysinkami cMv - za pomocą półstałej warstwy nakładanej

Powtarza się sposób postępowania prawie identyczny jak dla HSV z kilkoma niewielkimi zmianami. Agarozę stosuje się w stężeniu raczej 0,8% niż 1%o zarówno w początkowej warstwie nakładanej jak i w dwóch kolejnych warstwach nakładanych. Próby inkubuje się w czasie 14 dni z dodatkowo nadkładaną warstwą o objętości 1 ml w dniu czwartym i ósmym.

F. Próba zmniejszenia łysinek przy użyciu ciekłej warstwy nakładanej

Dla próby z ciekłą warstwą nakładaną na łysinki stosuje się sposób postępowania podobny do stosowanego dla nakładanej agarozy. Sposób dodawania wirusa jest taki sam jak typowych prób z łysinkami. Roztwory leku o odpowiednich stężeniach przygotowuje się przy użyciu MEM z 2% FBS. Leku nie przygotowuje się przy stężeniach wykonywanych 2x, jak czyni się to w poprzednich próbach lecz uzyskuje się pożądane stężenia. Dla wirusów HSV-1 i HSV-2, preparat z przeciwciałem uzyskany z Baxter Health Care Corporation rozcieńcza się w stosunku 1:500 i dodaje do pożywki, w której rozpuszcza się lek. Dla wirusa CMV i VZV nie stosuje się przeciwciała w nakładanej warstwie. W próbie z wirusem CMV dodaje się dodatkowe podłoże bez nowego leku w piątym dniu i pozostawia do inkubowania łącznie w czasie 10 dni. W próbie z VZV dodatkową pożywkę dodaje się piątego dnia i inkubuje łącznie w czasie 10 dni. Pod koniec okresu inkubacji we wszystkich próbach dodaje się 2 ml rozcieńczonego w stosunku 1:10 podstawowego roztworu obojętnego do każdej ze studzienek i inkubuje w czasie 6 godzin. Następnie ciecz odsysa się i zlicza łysinki przy użyciu stereomikroskopu.

G. Próby przesiewania i potwierdzenia dla wirusa EBV

1. Wirus

Występują dwa prototypy zakażającego wirusa EBV. Przykładem jednego jest wirus uzyskany z cieczy zlewanej z nad hodowli komórkowej P3HR-1. Ta linia komórkowa wytwarza nietransformujący wirus, który wywołuje wytwarzanie wczesnego antygenu (EA) po pierwszym zakażeniu lub superinfekcję linii komórkowych B. Przykładem innego prototypu jest wirus B-95-8. Wirus ten utrwala sznury limfocytów krwi i wywołuje nowotwory u małpek z rodzaju Callithrix, Leontocebus i tym podobnych. Nie wywołuje jednak przerywanych zakażeń, również w liniach komórkowych niosących kopie genomu EBV. W naszych próbach stosowano wirus P3HR-1.

2. Linie komórkowe

Ramos jest wyjątkową linią komórkową B uzyskiwaną z guza chłoniaka Burkitt’a lecz zawierającą niewykiywalne kopie genomu eBv i jest negatywna w odniesieniu do EBNA. Ramos/AW uzyskuje się za pomocą in vitro zakażenia Ramos wirusem P3RH-1 i zawiera jedną rezydującą kopię genomu EBV w komórce. Raji jest linią komórkową chłoniaka Burkitt’a zawierającą 60 genomów EBV w komórce i będzie pierwszą komórką zastosowaną do oznaczania przeciwwirusowej aktywności przeciwko EA ekspresji wirusa EBV. Daudi jest producentem niskiego poziomu i zawiera 152 kopii genomu EBV w komórce. Spontanicznie poddaje EA ekspresji EBV w 0,25% - 0,5% komórkach. Będzie on zastosowany w dalszych badaniach w celu potwierdzenia aktywności. Te linie komórkowe odpowiadają za superinfekcje wirusem EBV przez ekspresję EA(D), EA(R) i VCA. Wszystkie linie komórkowe utrzymuje się w podłożu RPMI-1640 wzbogaconym 10% FCS, L-glutaminą i 100 pg/ml gentamycyny. Hodowle karmi się dwukrotnie w czasie tygodnia i stężenie komórek doprowadza do wartości 3 x 10⁵/ml. Komórki utrzymuje się w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenku węgla.

186 504

3. Immunofluorescencyjne próby z monoklonalnymi przeciwciałami

Komórki zakaża się szczepem P3HR-1 EBV i badany lek dodaje się po adsorbcji (45 minut w temperaturze 37°C) i przemyciu hodowli komórkowej. Hodowle inkubuje się w czasie dwóch dni w kompletnym podłożu i pozwala na ekspresję genu wirusa. Po upływie 48 godzin inkubowania zlicza się ilość komórek w każdej próbie i rozsmarowuje. Monoklonalne przeciwciała dla różnych EA komponentów i VCA dodaje się do komórek, inkubuje i przemywa. Powtarza się proces z fluoresceiną związaną z króliczymi przeciwmysimi Ig przeciwciałami; po czym zlicza się fluoresceino-pozytywne komórki w wymazach. Następnie oblicza się i porównuje łączną liczbę komórek w hodowlach pozytywnych w odniesieniu do EA lub VCA.

H. Próba proliferacji komórek - toksyczność godziny przed przeprowadzeniem badania, komórki HFF wysiewa się na 6-studzienkowych płytkach przy stężeniu 2,5 x 104 komórki/studzienkę w MEM zawierającym 10% FBS. W dniu próby leki rozcieńcza się seryjnie w MEM zawierającym 10% FBS przy wzroście 1:5, co odpowiada zakresowi stężeń od 100 pag/ml do 0,03 pg/ml. Dla leków, które muszą być rozpuszczane w dimetylosulfotlenku, do kontrolnych studzienek wprowadza się MEM zawierający 10% dimetylosulfotlenku. Następnie pożywkę ze studzienek wysysa się i do każdej studzienki dodaje się 2 ml roztworu leku o badanym stężeniu. Komórki inkubuje się następnie w inkubatorze o temperaturze 37°C z dwutlenkiem węgla w czasie 72 godzin. Pod koniec tego czasu usuwa się pożywkę i roztwór leku i komórki przemywa. Do każdej studzienki dodaje się 1 ml 0,25% roztworu trypsyny i inkubowanie kontynuuje się dotąd aż komórki zaczynają opuszczać płytkę. Mieszaninę komórek i podłożą odpipetowuje się, silnie wstrząsa w celu rozerwania zawiesiny komórek, po czym 0,2 ml mieszaniny dodaje się do 9,8 ml roztworu Isoton III i oznacza przy użyciu Coulter Counter. Każdą próbkę oznacza się trzykrotnie i stosuje się trzy studzienki dla jednej próbki.

I. Próba MTT dla komórkowej cytotoksyczności godziny przed przeprowadzeniem próby komórki HFF umieszcza się w 96-studzienkowych płytkach przy stężeniu 2,5 x 104 komórki/studzienkę. Po upływie 24 godzin wysysa się podłoże i dodaje 125 jul leku do pierwszego rzędu studzienek i następnie rozcieńcza seryjnie w stosunku 1:5 przy użyciu automatycznego urządzenia Cetus Liquid Handling System sposobem podobnym do opisanego dla próby CPE. Płytki inkubuje się w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37°C w czasie 7 dni. W tym czasie do każdej studzienki wprowadza się 50 jj.11 pigml roztworu MTT w solance buforowanej fosforanem według Dulbecco. Płytki inkubuje się następnie w czasie dodatkowych 4 godzin. Po tym czasie podłoże usuwa się i zastępuje 100 jil 0,04 normalnego roztworu chlorowodoru w izopropanolu. Krótko wytrząsa się i płytki odczytuje przy użyciu urządzenia do odczytywania płytek przy 550 nm.

J. Próba z obojętną czerwienią - toksyczność

Stosuje się taki sam sposób umieszczenia komórek na płytkach i dodawania leku jaki opisano dla próby MTT. Po dodaniu leku płytki inkubuje się w czasie 7 dni w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37°C. Po tym czasie podłoże i lek odsysa się i dodaje 200 pl/studzienkę 0,01% roztworu obojętnej czerwieni w DPBS. Płytki inkubuje się w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w czasie jednej godziny. Barwnik odsysa się i komórki przemywa za pomocą Nunc Plate Washer. Po usunięciu przemycia DPBS dodaje się 200 pl/studzienkę 50% etanolu w wodzie z dodatkiem 1% lodowatego kwasu octowego. Płytki poddaje się wirowaniu w czasie 15 minut i odczytuje gęstości optyczne przy 550 nm za pomocą urządzenia do odczytywania płytek.

Test 5a

Przeciwwirusowa aktywność przeciwko replikacji HBV w hodowlach (Hepatites B)

Protokół badania aktywności przeciwwirusowej związków w hodowlach komórek 2.2.15 można w skrócie przedstawić w sposób następujący (Karba i Milman, 1991, Antiviral Res. 217,217):

186 504

- Chronicznie HBV-wytwarzaj ące komórki ludzkiej wątroby (Acs i współpracownicy, 1987, PNAS 84,4641) wysiewa się na 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej i poddaje wzrostowi do zlewania.

- Badane związki dodaje się codziennie dla zapewnienia ciągłego okresu dziewięciodniowego. Podłoże hodowlane (zmieniane codziennie w czasie trwania badania) zbiera się i przechowuje w celu analizy zewnątrzkomórkowej (wirion) HBV DNA w dniach 0, 3, 6 i 9 po poddaniu działaniu.

- Komórki poddane działaniu poddaje się lizie po upływie 24 godzin od dnia 9 próby w celu zanalizowania wewnątrzkomórkowych form genomowych HBV.

- HBV DNA analizuje się ilościowo i jakościowo dla wszystkich poziomów DNA HBV (zarówno zewnątrzkomórkowy jak i wewnątrzkomórkowy DNA) oraz określa się względną szybkość replikacji HBV (wewnątrzkomórkowy DNA).

Protokół określania toksyczności związków w hodowlach komórek 2.2.15 można w skrócie przedstawić w następujący sposób (Korba i Gerin, praca przedłożona do publikacji):

- komórki 2.2.15 poddaje się wzrostowi do zlewania w 96 studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej z warstwą tłuszczu na dnie. Płytki poddaje działaniu związków (0,2 ml podłoża hodowlanego na studzienkę) sposobem opisanym powyżej. Każdy związek bada się w czterech stężeniach, każde w trzykrotnie powtórzonych hodowlach, w 3 do 10 etapach.

- Niepoddawane działaniu związków, kontrolne hodowle utrzymuje się na każdej 96-studzienkowej płytce. Na każdej 96-studzienkowej płytce, studzienki nie zawierające komórek wykorzystuje się w celu korekty rozpraszania światła.

- Toksyczność określa się za pomocą hamowania zwiększania ilości barwnika obojętnej czerwieni, określanego za pomocą absorbancji przy 510 nm w stosunku do absorbancji dla komórek niepoddawanych działaniu związków (Finter i jego współpracownicy, 1969, J. Med. Chem. 5,419) w próbie wykonywanej 24 godziny po 9 dniu działania.

Przeciwwirusowa aktywność związku o wzorze I porównuje się z aktywnością, zalcitabiny.

Stwierdza się, że dla związku o wzorze I stężenie skuteczne (EC5₀) wynosi 1,8 ± 0,1 pg/ml w odniesieniu do 50% hamowania wirusowej cytopatogeniczności, zaś stężenie cytotoksyczne (w odniesieniu do 50% hamowania proliferacji komórek) było większe niż 1000 μ-gml. Współczynnik selektywności SI dla związku o wzorze I był tym samym większy niż stosunek 1000/1,8, to znaczy współczynnik był większy niż 500.

Dla zalcitabiny badania wykazały następujące wyniki: EC50: 1,8 ± 0,2 pg-rnl; CC50: 261 ± 24 pg/ml, to znaczy współczynnik selektywności wynosi 261/1,8, to znaczy wynosi około 145.

Jak wynika z badania przeprowadzonego w tym teście, związek o wzorze I był mniej toksyczny niż zalcitabina, tym samym wykazuje bardziej odpowiednie działanie przeciwko replikacji HBV z mniejszymi drugorzędowymi efektami.

Test 5b

Przeciwwirusowa aktywność przeciwko VZV

Mieszaninę nitazoksanidu (96%) i związku o wzorze I (4%) stosuje się w celu określenia jej aktywności przeciwko Varicetta Zoster Vrus (standardowy szczep laboratoryjny).

Oznacza się EC50 4 ptgml i CC50 34 |J.gml dla wymienionej mieszaniny przeciwko wymienionemu Varicetta Zoster Virus, to znaczy współczynnik S.I. wynosi około 8,5.

Ze względu na niską toksyczność i na jej skuteczność mieszanina jest szczególnie odpowiednia dla zwalczania VariceUa Zoster Virus, który znany jest z oporności na działanie takich czynników przeciwwirusowych jak acyklowir.

Związek o wzorze I i kompozycję według wynalazku można podawać doustnie, na przykład w postaci tabletek.

Kompozycje według wynalazku, zwłaszcza zawierające PH 5776 i/lub inny czynnik przeciwwirusowy są kompozycjami o szerokim zakresie działania na wirusy Herpes, takie jak:

Herpes Simplex Vi.rus typu 1 (HSV-1, HSV-1 oporny na działanie acyklowiru);

Herpes Simplex Virus typu 2 (HSV-S, HSV-2 oporny na działanie acyklowiru);

186 504 ludzki Cytomegalovirus (HCMV, HCMV oporny na działanie gancyklowiru);

Vaaicella Zoster Virus (YZV, VZV oporny na działanie azzklowirz);

Epstein Barr Biruss (EBV);

mysi Cytomegalovirus (MCMV).

Kompozycje mogą zawierać dodatki znane jako odpowiednie do wytwarzania form odpowiednich do podawknia doustnie.

Kompozycje korzystnie zawierają czynnik zwilżający i ewentualnie zawierają pochodną skrobi.

186 504

4—

CŁ

OJ

-+

-Η

C4 —Η co c5

-4O <5.

o o

o

OJ

186 504

ο ο

ο

Ο

LD

Ο

IX.

186 504

Intensywność

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy związek o wzorze I

NO₂

NH—C

R/ Rą w którym podstawnik R! oznacza grupę hydroksylowa, zaś pozostałe podstawniki R2, R₃, R₄ i R₅ oznaczają atomy wodoru.
2. Kompozycja farmaceutycznu zawierająca rkładniki cdrtywne i ewentualnie zawierająca czynnik zwilżający i pochodne skrobi jako składniki pomocnicze, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera mieszaninę związku o wzorze I i związku o wzorze II przy czym ilość związku o wzorze I w stosunku do ilości mieszaniny związku o wzorze I i związku o wzorze II mieści się w zakresie 0,5-20% wagowych.
3. Forma galengwe do poc^woma douarnie, znamienna tym, t^em star^owtirour zz^erający kompozycję obejmującą:

- skuteczną ilość związku o wzorze I

186 504 w którym podstawnik R oznacza grupę hydroksylowa, zaś pozostałe podstawniki R2, R3, R4 i R₅ oznaczają atomy wodoru, zmieszanego ze związkiem o wzorze II

- czynnik zwilżający, i

- pochodną skrobi, przy zawartości wody w wymienionej kompozycji mniejszej niż 25% wagowych, przy czym ilość związku o wzorze I w stosunku do ilości mieszaniny związku o wzorze I i związku o wzorze II mieści się w zakresie 0,5-20% wagowych.
4. Forma oalengwa według :dłstrz.3, znamienna tym, że zawiera k;eboksrbnetyloskrobię lub jej sól.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowy związek o wzorze (I) w którym podstawnik R] oznacza grupę hydroksylową, podczas gdy pozostałe podstawniki R2, R3, R4 i R₅ oznaczają atomy wodoru; oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wymieniony związek, znajdujące zastosowanie jako środka przaciwpasożytnicrego, przeciwbaeteryjnago, przeciwgrzybowego oraz pr'zeciwwirusowago.

Nitrotiazolowy związek PH 5776 (2-(acetoliloksr)-N-(5-nitro-2-tiαzolilo)banrαmid) jest związkiem o wzorze I i Ro

Rs w którym R] oznacza grupę o wzorze O-COCH3, zaś R2 = R3= R4 = R₅ = H. Wytwarzanie i zastosowanie tego związku (określanego niżej jako Związek o wzorze II) zastrzeżono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3.950.351 jak również przedstawiono w publikacji zgłaszającego.

186 504

W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3.950.351 związek o wzorze II wytwarza się w reakcji związku o wzorze w którym Hal oznacza atom chlorowca, ze związkiem o wzorze

NO₂ nh₂

Reakcja ta nie jest odpowiednia do uzyskania czystego związku o wzorze I w którym podstawnik Rj oznacza grupę hydroksylową, zaś pozostałe podstawniki R₂, R3, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru.

Ponadto, w przeciwieństwie do faktu znanego w tej dziedzinie dotychczas, to znaczy stwierdzenia, że obecność grupy acyloksylowej jest konieczna dla nadania związkowi aktywności i skuteczności działania przeciwko bakteriom i pasożytom, obecnie stwierdzono, że związek o wzorze I

NO₂

R₃ w którym podstawnik R, oznacza grupę hydroksylową, zaś pozostałe podstawniki R₂, R3, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru, wykazuje zadowalającą skuteczność działania przeciwko pasożytom, bakteriom i grzybom, jakkolwiek nie posiada grupy acyloksylowej. Związek o wzorze I ma zasadniczo natychmiastowe działanie przeciwko pasożytom, grzybom i bakteriom. Stwierdzono również, że związek charakteryzuje aktywność przeciwko wirusom.

Stwierdzono także, że kompozycja zawierająca wymieniony związek I, korzystnie zawiera również czynnik zwilzający. Najkorzystniej kompozycje takie zawierają czynnik zwilżający i pochodną skrobi.

186 504

Badania wykonane przez zgłaszającego wykazały, że zastosowanie odpowiedniego związku według wynalazku i czynnika zwilżającego, powoduje znaczne zwiększenie skuteczności związku i zastosowanie takiej mieszaniny umożliwia zwalczanie chorobowych dolegliwości dolnych partii podbrzusza, takich jak dolegliwości jelitowe (biegunka), zakażenia żołądkowo-jelitowe, zakażenia jelitowe, zakażenia przenoszone drogą stosunków płciowych, zakażenia pochwy, oraz zakażenia dróg moczowo-płciowych.