PL186211B1 - Sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu węża - Google Patents
Sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu wężaInfo
- Publication number
- PL186211B1 PL186211B1 PL97328568A PL32856897A PL186211B1 PL 186211 B1 PL186211 B1 PL 186211B1 PL 97328568 A PL97328568 A PL 97328568A PL 32856897 A PL32856897 A PL 32856897A PL 186211 B1 PL186211 B1 PL 186211B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- matrix
- solution
- protease
- ancrod
- eluate
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 20
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 23
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 claims description 19
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 claims description 19
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 6
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims description 5
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims description 5
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims description 5
- 241000271039 Agkistrodon Species 0.000 claims description 4
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 4
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 2
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 claims 1
- 241000271064 Calloselasma rhodostoma Species 0.000 claims 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims 1
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000761389 Copa Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób oczyszczania trombinopodobnej proteazy z jadu weza wybranej z grupy skla- dajacej sie z Ancrod i silnie zasadowych proteaz, który to sposób obejmuje: a) otrzymanie roztworu zawierajacego proteaze; b) wprowadzanie roztworu proteazy na matryce dla chromatografii powinowactwa lub zywice anionowymienna; c) elucje proteazy w roztworze eluatu z matrycy dla chromatografii powinowactwa lub zywicy anionowymiennej; d) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu c) na matryce kulek szklanych, przy czym wspomniane kulki szklane maja srednice porów od 25 do 35 nm i wymiary czastek od 30 do 60 µm a wspomniany eluat jest wprowadzany na matryce kulek szklanych w postaci roztworu zasadowego o pH od 7,5 do 9,0, dzieki czemu kulki szklane adsorbuja trombino- podobna proteaze z jadu weza; e) elucje proteazy w roztworze eluatu z matrycy kulek szklanych; f) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu e) na matryce do chromatografii zelowej lub matryce kulek szklanych, przy czym wspomniane kulki szklane maja rozmiary porów od 25 do 35 nm i rozmiary czastek od 30 do 60 µm, zas eluat jest wprowadzany na matryce szklana w roztworze kwasnym; g) elucje i odzyskiwanie oczyszczonej proteazy. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oczyszczanie w etapie f) prowadzi sie stosujac matryce zelowa do chromatografii zelowej. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu węża. który to sposób obejmuje:
a) otrzymanie roztworu zawierającego proteazę;
186 211
b) wprowadzanie roztworu proteazy na matrycę dla chromatografii powinowactwa lub żywicę anionowymienną;
c) elucję proteazy w roztworze eluatu z matrycy dla chromatografii powinowactwa lub żywicy anionowymiennej;
d) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu c) na matrycę kulek szklanych, przy czym wspomniane kulki szklane mają średnice porów od 25 do 35 nm i wymiary cząstek od 30 do 60 pm a wspomniany eluat jest wprowadzany na matrycę kulek szklanych w postaci roztworu zasadowego o pH od 7,5 do 9,0, dzięki czemu kulki szklane adsorbują trombinopodobną proteazę z jadu węża;
e) elucję proteazy w roztworze eluatu z matrycy kulek szklanych;
f) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu e) na matrycę do chromatografii żelowej lub matrycę kulek szklanych, przy czym wspomniane kulki szklane mają rozmiary porów od 25 do 35 nm i rozmiary cząstek od 30 do 60 pm, zaś eluat jest wprowadzany na matrycę szklaną w roztwOrze kwaśnym;
g) elucję i odzyskiwanie oczyszczonej proteazy.
Korzystnie w sposobie wg wynalazku oczyszczanie w etapie f) prowadzi się stosując matrycę żelową do chromatografii żelowej, przy czym korzystnie w etapie f roztwór eluatu wprowadza się na matrycę kulek szklanych.
Korzystnie w sposobie według wynalazku jad węża pochodzi od węża gatunku Agkistrodon, korzystnie od węża Agkistrodon rhodostroma.
W sposobie według wynalazku oczyszczonym produktem jest ancrod.
Przedmiotem wynalazku są ponadto trombinopodobne proteazy z jadu węża o czystości wynoszącej 95 - 100%.
Wskazane jest przeprowadzanie etapu d oczyszczania przez adsorpcję na szkle, zaś etapu f za pomocą chromatografii żelowej.
W szczególnie korzystnej postaci wykonania wynalazku zarówno w etapie d jak też w etapie f oczyszczanie prowadzi się przez adsorpcję względnie chromatografię na szkle.
Do oczyszczania wstępnego przez chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji nadaje się zwłaszcza agmatyno-, arginino- albo heparyno-Sepharose.
Jako zasadowe wymieniacze jonów do wstępnego oczyszczania nadają się szczególnie celuloza DEAE i Sepharose DEAE.
Jako bufory do chromatografii jonowymiennej można wymienić zwłaszcza bufor TRISfosforanowy i fosforan sodu.
Chromatografię jonowymienną przeprowadza się przy wartości pH wynoszącej 5-9, korzystnie 6 - 8,5.
W przypadku oczyszczania wstępnego z surowego enzymu usuwa się około 70 - 80% obcych protein i innych składników.
Jeżeli drugi etap oczyszczania przeprowadza się przy użyciu wymieniacza kationowego, to w rachubę wchodzą słabo kwasowe wymieniacze takie, jak CM-SEPHAROSE, wartość pH 5 - 9, oraz AMBERLlTE CG50, wartość pH 5 - 9.
Chromatografia na szkle oznacza, że Ancrod i pokrewne trombinopodobne enzymy oraz silnie zasadowe proteazy przy wartościach pH 7,5 - 9,0, korzystnie 8,0 - 8,5, zostają związane na matrycy szklanej. Około 60% przede wszystkim kwasowych protein obcych niezwiązanych zostaje wymyte z kolumny buforem równoważącym (korzystnie buforem TRIS-fosforanowym względnie fosforanem sodu). Ancrod eluowany jest ze szkła w sposób frakcjonowany o czystości powyżej 90% w ten sposób, że moc jonową buforu podnosi się przez dodanie soli kuchennej na 0,3 - 1,0 M.
W drugim etapie oczyszczania enzym zostaje wzbogacony do około 90%.
Do chromatografii żelowej jako etapu c oczyszczania w rachubę wchodzą zwłaszcza SEPHACRY1 S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEK, ULTROGEL i SUPEROSE.
Jeżeli dla tego etapu c oczyszczania wybiera się chromatografię na szkle, wówczas w kwasowym zakresie pH wynoszącym 4 - 6 zasadowe proteiny obce z roztworu Ancrod'u zostają zaadsorbowane na powierzchni szkła, natomiast Ancrod o czystości dużo powyżej
186 211
95% można eluować z kolumny wprost w buforze równoważącym. Pożądaną moc jonową buforu można regulować przez dodanie soli, jak soli kuchennej.
Nowy sposób nadaje się całkiem szczególnie do wytwarzania czystego Ancrod'u, który tym sposobem oczyszczania otrzymuje się o czystości wyraźnie powyżej 95%.
Przykład I
a. Oczyszczanie wstępne g wysuszonego jadu malajskiej żmii kopalnianej rozpuszczono w 50 ml buforu tri(hydroksymetylo)-aminometan (TRIS)-fosforanowego, pH 8,5, nierozpuszczalne składniki komórek jadu odwirowano i klarowny, żółty roztwór naniesiono na kolumnę chromatograficzną o średnicy 1,6 cm, wypełnioną do wysokości 30 cm DEAE-SEPHAROSE'ą-FF (firmy Pharmacia). Trombinopodobne enzymy jadu oraz proteiny o kwasowym charakterze zostały związane na matrycy. Chromatografię przeprawadzano z pr<^(^H^<ością przepływu wynoszącą 150 - 200 ml/godzinę. Przez przemycie kolumny w temperaturze pokojowej przy użyciu około 300 ml buforu równoważącego (10 mM TRIS-fosforanowego, pH 8,5), aż wartość A280mm eluatu spadła poniżej 0,5, i dalsze przemycie przy użyciu 400 ml 35 mM buforu TRISfosforanowego, pH 6,0, aż wartość A280mm eluatu wynosiła < 0,4, eluowano około 70 - 80% obcych protein (w odniesieniu do wartości absorpcji roztworu wyjściowego przy 280 nm). Główną frakcję z Ancrod'em eluowano z 85% wydajnością w 150 -200 ml l50 mM buforu TRlS-fosforanowego, pH 6,0.
b. Oczyszczanie główne
Eluat zawierający Ancrod zatężono do 20 ml za pomocą ultrafiltracji na membranie z nominalną granicą rozdziału wynoszącą 10000 daltonów i zbuforowano stosując 100 mM buforu TRlS-fosforanowego, pH 8,0. Roztwór ten przeniesiono na kolumnę o średnicy 1,6 cm, wypełniona do wysokości wynoszącej 115 cm szkłem BIORAN-CPG (frnny Sehott. średnica porów: 25 - 35 nm, uziarnienie: 30 - 60 pm). Przez przemycie kolumny w temperaturze pokojowej 300 ml 100 mM buforu TRIS-fosforanowego, pH 8,0, iż prędkością przepływu wynoszącą 250 ml/godzinę eluowano z kolumny około 60% obcych protein (w odniesieniu do wartości absorpcji naniesienia przy 250 nm).
Do eluowania użyto 0,5 M roztwór chlorku sodu, który został zbuforowany do wartości pH 8,0 za pomocą 100 mM TRIS-fosforanu. Eluat wychwytywano automatycznie wokoło 10 ml frakcjach. Trombinopadobne enzymy eluowano w piku z dołączonym zakresem Tailing'a. Aby główny składnik (Ancrod) otrzymać w postaci zawierającej najwyżej 5% trombinopodobnych składników ubocznych, przy przejściu od głównego piku do zakresu Tailing'a badano za pomocą HPLC z odwróconymi fazami poszczególne frakcje zarówno na ich właściwą aktywność fibrynogenazy, jak też na ich skład. Z pikiem głównym (około 80 ml) łączono tylko frakcje, które posiadały właściwą aktywność większą niż 1700 U/OD280nm i które w HPLC wykazywały mniej niż 10% składników ubocznych. Z kolumny BIORAN otrzymano z wydajnością 72% główny składnik o czystości wynoszącej 96%.
c. Oczyszczanie dokładne
Eluat z głównym składnikiem, to jest Ancrod'em, zatężono do 2 ml przez ultrafiltrację na membranie YM 10 (firmy Amicon) i otrzymany koncentrat naniesiono na kolumnę 0 średnicy 1,6 cm, wypełnioną do wysokości wynoszącej 85 cm SEPHARYL'em S-100 HR. Kolumnę zrównoważono uprzednio buforem 100 mM chlorku sodu i 100 mM fosforanu sodu, który wykazywał wartość pH wynoszącą 6,9. Za pomocą tej chromatografii żelowej oddzielono od Ancrod'u pozostałe proteazy oraz TRIS. Wydajność w tym etapie wynosiła około 90%.
Przykład II
a. Oczyszczanie wstępne
2,1 g wysuszonego nado malajskiaj żmji kopalnianen rozpuozczono w 50 ml 3m mM mufom TRIS-fosforanowego, pH 8,5, nierozpuszczalne składniki komórek jadu odwirowano i klarowny, żółty roztwór eaeiesioea na kolumnę chromatograficzną o średnicy 1,6 cm, wypełnioną do wysokości 30 cm DEAE-SEPHAROSE'ą-FF (firmy Pharmacia) i zrównoważoną wyżej wymienionym buforem. Przez przemycie kolumny w temperaturze pokojowej przy użyciu 600 ml buforu równoważącego, aż wartość A280 eluatu wynosiła < 0,2, eluowmo około 70% obcych protein (w odniesieniu do wartości absorpcji roztworu wyjściowego przy
186 211
280 nm). Główną frakcje eluowano z 90 - 100% wydajnością za pomocą 200 - 250 ml 150 mM buforu TRIS-fosforanowego, pH 6,0.
b. Oczyszczanie główne
Eluat zatężono, jak w przykładzie I, do 20 ml i zbuforowano 50 mM fosforanu sodu
- buforem o pH 8,5. Roztwór ten naniesiono no kolumnę ze szkłem BIORAN-CPG (średnica: 1,6 cm wysokość: 15 cm. średnica porów: 25 - 35 nm, uziamienie: 30 - 60 pin). Przez przemycie kolumny w temperaturze pokojowej za pomocą 300 ml 50 mM fosforanu sodu - buforu 0 pH 8,5 i z prędkością przepływu wynoszącą 250 ml/godzinę eluowano z kolumny około 60% obcych protein (w odniesieniu do wartości absorpcji naniesienia przy 280 nm).
Do eluowania trombinopodobnych enzymów użyto 1 M roztwór chlorku sodu, który był zbuforowany do wartości pH 8,0 za pomocą 50 mM fosforanu sodu. Przy użyciu 150 ml buforu eluowano około 80 % naniesionych jednostek enzymu.
c. Oczyszczanie dokładne
Eluat zatężono, jak wyżej, do 20 ml i zbuforowano za pomocą 50 mM fosforanu sodu
- buforu wykazującego wartość pH 5,0. Roztwór ten naniesiono na kolumnę, która również miała średnicę 1,6 cm i wypełniona była do wysokości 15 cm szkłem BIORAN-CPG, które jednak posiadało średnicę porów 90 - 110 nm i uziamienie 30 - 60 pm. Przy pH 5,0 do szkła BIORAN przyłączyły się tylko zasadowe proteiny oraz składniki uboczne, natomiast buforem równoważącym został wyeluowany z kolumny główny składnik, to znaczy Ancrod, o czystości wynoszącej prawie 100% i z około 80 - 90% wydajnością (w odniesieniu do naniesionych jednostek).
Przykład III a, b. Oczyszczanie wstępne i główne
2,1 g wysuszonego)adu malujskiej jśikin kopai nianejpoddanowstępnemu frmcj onowaniu analogicznie do przykładu II na DEAE-SEPHAROSE, eluat, analogicznie do przykładu I, załężono do 20 ml i zbuforowena 40 mM buforu TRIS-fosforanowego, pH 6,2. Roztwór ten neniesiana na kolumnę chromatograficzną o średnicy 1,6 cm, wypełnioną do wysokości wynoszącej 20 cm CM-SEPHAROSE'ą-FF (firmy Phermacie) oraz zrównoważoną wymienionym wyżej buforem. Przez przemycie kolumny w temperaturze pokojowej za pomocą 300 ml buforu równoważącego i przy prędkości przepływu wynoszącej 250 mJ/goWzinę wyeluowano z kolumny około 60% obcych protein (w odniesieniu do wartości absorpcji naniesienia przy 280 nm).
Do eJuawanie trombinopodobnych enzymów użyto, analogicznie do przykładu II, IM roztwór chlorku sodu, który zbuforowano do wartości pH 8,0 za pomocą 50 mM fosforanu so-du. Przy użyciu 150 ml buforu eluowano około 80 % naniesionych jednostek trombinopodobnych enzymów.
c. Oczyszczanie dokładne
Oczyszczanie dokładne AncroWu przeprowadzono analogicznie do przykładu II na szkle BIORAN-CPG (średnica porów: około 100 nm, uziarnienie: 30 - 60 pm przy użyciu 50 mM buforu fosforanowego, pH 5,0. Z kolumny eluowano Ancrod o czystości powyżej 95% i z około 85% wydajnością (w odniesieniu do naniesionych jednostek).
186 211
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 2,00 zł.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób oczyszczania trombinopodobnej proteazy z jadu węża wybranej z grupy składającej się z Ancrod i silnie zasadowych proteaz. który to sposób obejmuje:a) otrzymanie roztworu zawierającego proteazą;b) wprowadzanie roztworu proteazy na matrycę dla chromatografii powinowactwa lub żywicę anionowymienną;c) elucję proteazy w roztworze eluatu z matrycy dla chromatografii powinowactwa lub żywicy anionowymiennej;d) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu c) na matrycę kulek szklanych. przy czym wspomniane kulki szklane mają średnice porów od 25 do 35 nm i wymiary cząstek od 30 do 60 pm a wspomniany eluat jest wprowadzany na matrycę kulek szklanych w postaci roztworu zasadowego o pH od 7.5 do 9.0. dzięki czemu kulki szklane adsorbujątrombinopodobnąproteazę z jadu węża;e) elucję proteazy w roztworze eluatu z matrycy kulek szklanych;f) wprowadzanie roztworu eluatu z etapu e) na matrycę do chromatografii żelowej lub matrycę kulek szklanych. przy czym wspomniane kulki szklane mają rozmiary porów od 25 do 35 nm i rozmiary cząstek od 30 do 60 pm. zaś eluat jest wprowadzany na matrycę szklaną w roztworze kwaśnym;g) elucję i odzyskiwanie oczyszczonej proteazy.
- 2. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym. że oczyszczanie w etapie f) prowadzi się stosując matrycę żelową do chromatografii żelowej.
- 3. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym. że w etapie f) roztwór eluatu wprowadza się na matrycę kulek szklanych.
- 4. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym. że jad węża pochodzi od węża gatunku Agkistrodon.
- 5. Sposób według zastrz. 4. znamienny tym. że jad węża pochodzi od węża Agkistrodon rhodostroma.
- 6. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym. że oczyszczonym produktem jest Ancrod.Przedmiotem omawianego wynalazku jest sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu węża.Przykładami takich proteaz są Batroxobin. Crotałase. a zwłaszcza Ancrod. który jest antykolagulantem wyodrębnionym z jadu węża Agkistrodon rhodostoma (Merck-Index 1989. nr 664. W celu jego wytworzenia z jadu węża przedstawiono już szereg metod (opisy patentowe GB-PS 1.094.301. GB-PS 1.177.506. GB-PS 1.293.793. US-PS 3.743.722. US-PS 3.879.369. DE-OS 2.428.955. DE-OS 2.734.427). Sposoby te bazują zasadniczo na etapach chromatograficznych i dostarczają Ancrod z różną wydajnością i czystością.Dotychczas nie udało się wytworzenie Ancrod'u o wysokiej czystości. Wyodrębniano zawsze mieszaninę enzymów z Ancrod'em jako głównym składnikiem. która zależnie od sposobu wyodrębniania była więcej albo mniej zanieczyszczona obcymi proteinami.Obecnie opracowano drogę, na której wytwarza się trombinopodobne proteazy z jadu węża w postaci o wysokiej czystości.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19607210A DE19607210A1 (de) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | Verfahren zur Reinigung von thrombinähnlichen Proteasen aus Schlangengiften |
| PCT/EP1997/000755 WO1997032015A1 (de) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Verfahren zur reinigung von thrombinähnlichen proteasen aus schlangengiften |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL328568A1 PL328568A1 (en) | 1999-02-01 |
| PL186211B1 true PL186211B1 (pl) | 2003-11-28 |
Family
ID=7786490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97328568A PL186211B1 (pl) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu węża |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6200791B1 (pl) |
| EP (1) | EP0883684B1 (pl) |
| JP (1) | JP3817269B2 (pl) |
| KR (1) | KR100493835B1 (pl) |
| CN (1) | CN1188517C (pl) |
| AR (1) | AR005995A1 (pl) |
| AT (1) | ATE283350T1 (pl) |
| AU (1) | AU711650B2 (pl) |
| BG (1) | BG64875B1 (pl) |
| BR (1) | BR9707738A (pl) |
| CO (1) | CO4771158A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ292482B6 (pl) |
| DE (2) | DE19607210A1 (pl) |
| ES (1) | ES2233997T3 (pl) |
| HK (1) | HK1017380A1 (pl) |
| HR (1) | HRP970108B1 (pl) |
| HU (1) | HU225489B1 (pl) |
| ID (1) | ID16046A (pl) |
| IL (1) | IL125395A (pl) |
| MX (1) | MX9806304A (pl) |
| MY (1) | MY130458A (pl) |
| NO (1) | NO319561B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ331120A (pl) |
| PL (1) | PL186211B1 (pl) |
| PT (1) | PT883684E (pl) |
| RU (1) | RU2186849C2 (pl) |
| SK (1) | SK284874B6 (pl) |
| TR (1) | TR199801668T2 (pl) |
| TW (1) | TW505696B (pl) |
| UA (1) | UA46831C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997032015A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA971597B (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102173C (zh) * | 1999-03-26 | 2003-02-26 | 福建医科大学 | 蕲蛇酶及其生产工艺 |
| US20030219431A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Empire Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of neuronal and neurological damage associated with spinal cord injury |
| EP2043767B1 (en) | 2006-07-14 | 2020-03-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
| CN103160486A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-06-19 | 黑龙江迪龙制药有限公司 | 一种猪凝血酶的制备方法 |
| CN109929020A (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 浙江京新药业股份有限公司 | 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品 |
| CN108559740B (zh) * | 2018-05-12 | 2021-05-18 | 吉林天衡康泰生物技术有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用 |
| CN109652398B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-07-20 | 上海太阳生物技术有限公司 | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ |
| CN110016471B (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-02 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1177506A (en) | 1964-02-21 | 1970-01-14 | Nat Res Dev | Improvements relating to Anticoagulants. |
| GB1094301A (en) * | 1964-02-21 | 1967-12-06 | Nat Res Dev | Improvements relating to anticoagulants |
| GB1293793A (en) | 1969-04-28 | 1972-10-25 | Chrysler United Kingdom Ltd Fo | Improvements in or relating to valves |
| US3743722A (en) * | 1971-07-14 | 1973-07-03 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation |
| US3879369A (en) | 1972-05-12 | 1975-04-22 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography |
| GB1472574A (en) | 1973-09-03 | 1977-05-04 | Biochimici Fargal Pharmasint S | Process for the extraction of components having anticoagulant activity -in vivo- from snake venoms and related products |
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| CH626917A5 (pl) | 1976-08-17 | 1981-12-15 | Pentapharm Ag | |
| JPS5569595A (en) * | 1978-11-20 | 1980-05-26 | Suguru Abe | Novel substance having fibrinolytic activity, remedy for thrombotic embolic disease comprising it, and its preparation |
| EP0328256A1 (en) * | 1988-01-21 | 1989-08-16 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Glass fibers coated with agarose for use as column packing or chromatographic media for bioseparations |
| US5712117A (en) * | 1995-02-08 | 1998-01-27 | Zymogenetics, Inc. | Cytoplasmic antiproteinase-2 and coding sequences |
-
1996
- 1996-02-26 DE DE19607210A patent/DE19607210A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-18 PT PT97903312T patent/PT883684E/pt unknown
- 1997-02-18 BR BR9707738A patent/BR9707738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-18 MX MX9806304A patent/MX9806304A/es unknown
- 1997-02-18 NZ NZ331120A patent/NZ331120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 JP JP53055397A patent/JP3817269B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 EP EP97903312A patent/EP0883684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 DE DE59712093T patent/DE59712093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 AT AT97903312T patent/ATE283350T1/de active
- 1997-02-18 WO PCT/EP1997/000755 patent/WO1997032015A1/de active IP Right Grant
- 1997-02-18 SK SK1132-98A patent/SK284874B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 HU HU9900505A patent/HU225489B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 KR KR10-1998-0706648A patent/KR100493835B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 IL IL12539597A patent/IL125395A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 US US09/125,374 patent/US6200791B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 RU RU98117870/13A patent/RU2186849C2/ru active
- 1997-02-18 CZ CZ19982697A patent/CZ292482B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 TR TR1998/01668T patent/TR199801668T2/xx unknown
- 1997-02-18 AU AU17913/97A patent/AU711650B2/en not_active Ceased
- 1997-02-18 PL PL97328568A patent/PL186211B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 CN CNB971925852A patent/CN1188517C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 ES ES97903312T patent/ES2233997T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 UA UA98094992A patent/UA46831C2/uk unknown
- 1997-02-21 TW TW086102111A patent/TW505696B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 ID IDP970561A patent/ID16046A/id unknown
- 1997-02-24 MY MYPI97000700A patent/MY130458A/en unknown
- 1997-02-25 ZA ZA971597A patent/ZA971597B/xx unknown
- 1997-02-25 AR ARP970100755A patent/AR005995A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-25 CO CO97010013A patent/CO4771158A1/es unknown
- 1997-02-26 HR HR970108A patent/HRP970108B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-31 BG BG102663A patent/BG64875B1/bg unknown
- 1998-08-25 NO NO19983893A patent/NO319561B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-06-10 HK HK99102524A patent/HK1017380A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0139209B1 (ko) | 단백질 정제방법 | |
| PL186211B1 (pl) | Sposób oczyszczania trombinopodobnych proteaz z jadu węża | |
| GB2025977A (en) | Process for the purification and concentratio of urokinease | |
| HU219828B (hu) | Eljárás K-vitamin-függő proteinek izolálására és tisztítására | |
| Brophy et al. | Copurification of choline kinase and ethanolamine kinase from rat liver by affinity chromatography | |
| US4990597A (en) | Process for the purification of placental tissue protein PP4 | |
| Modi et al. | The isolation of prothrombin, factor IX and factor X from human factor IX concentrates | |
| Pastore et al. | [23] Pteroyllysine-agarose in the purification of dihydrofolate reductase | |
| Karlstam et al. | A simple purification method of squeezed krill for obtaining high levels of hydrolytic enzymes | |
| Johnson et al. | Purification to homogeneity of the human skin chymotryptic proteinase “chymase” | |
| CA2247016C (en) | Purification of thrombin-like proteases from snake venoms | |
| CA1309961C (en) | Recovery of urokinase compounds | |
| WO1992016625A1 (en) | Purification of active and inactive/latent forms of plasminogen activator inhibitor-1 | |
| EP0358274B1 (en) | Method for purifying tissue plasminogen activator | |
| Ikeda et al. | Purification of Tonin by Chromatography Using Soybean Trypsin Inhibitor Coupled CH-Sepharose 4B: THE 10th CONFERENCE ON THE PATHOGENESIS OF HYPERTENSION | |
| Pick et al. | Purification of the proteinaceous α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris by affinity chromatography with immobilized enzyme or antibody | |
| Andersson et al. | [74] Alcohol dehydrogenase from horse liver by affinity chromatography | |
| Prigent et al. | Purification of rat heart cyclic nucleotide phosphodiesterase on column of immobilized phenylbutenolide inhibitor | |
| KR970043041A (ko) | 구인 혈전용해효소의 분리, 정제방법 및 구인 혈전용해효소를 코드화하는 cDNA 유전 | |
| PT97311A (pt) | Processo para a preparacao de trombina ultra-pura | |
| JPS6317436B2 (pl) | ||
| JPS6176419A (ja) | 精製された組織性プラスミノ−ゲンアクチベ−タの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120218 |