PL184354B1 - Method of producing a factor capable to enhance pesticidal activity of bacillus - Google Patents

Method of producing a factor capable to enhance pesticidal activity of bacillus

Info

Publication number
PL184354B1
PL184354B1 PL96323468A PL32346896A PL184354B1 PL 184354 B1 PL184354 B1 PL 184354B1 PL 96323468 A PL96323468 A PL 96323468A PL 32346896 A PL32346896 A PL 32346896A PL 184354 B1 PL184354 B1 PL 184354B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uscillus
thuringiensis subsp
bacillus
thuringiensis
subsp
Prior art date
Application number
PL96323468A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL323468A1 (en
Inventor
Denise C. Manker
William D. Lidster
Susan C. Macintosh
Robert L. Starnes
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of PL323468A1 publication Critical patent/PL323468A1/en
Publication of PL184354B1 publication Critical patent/PL184354B1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/04—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C275/06—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic and saturated carbon skeleton
    • C07C275/16—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic and saturated carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

This invention is directed to a method for obtaining a factor which potentiates the pesticidal activity of a Bacillus related pesticide, a chemical pesticide and/or a virus with pesticidal properties.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania i identyfikowania czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus.The invention relates to a method of enhancing the pesticide activity of a Bacillus related pesticide. In particular, the invention relates to a method of obtaining and identifying a Bacillus related pesticide potentiator.

Każdego roku szkodniki powodują ogromne straty w rolnictwie, leśnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Do zwalczania takich szkodników stosowano różne strategie.Every year, pests cause enormous losses in agriculture, forestry and public health. Various strategies have been used to control such pests.

Jedną ze strategii jest stosowanie pestycydów chemicznych o szerokim zakresie lub spektrum aktywności. Jednakże, stosowanie pestycydów chemicznych ma różne wady. Zwłaszcza, z uwagi na ich szerokie spektrum aktywności, pestycydy te mogą niszczyć organizmy nie-docelowe, takie jak owady pożyteczne i pasożyty szkodników6. Ponadto, pestycydy chemiczne są często toksyczne dla zwierząt i ludzi. Co więcej, u docelowych szkodników często rozwija się oporność, jeśli powtarzalnie poddaje się je działaniu takich substancji.One strategy is to use chemical pesticides with a wide range or spectrum of activity. However, the use of chemical pesticides has various disadvantages. Especially because of their broad spectrum of activity, these pesticides can destroy non-target organisms such as beneficial insects and pest parasites 6 . Moreover, chemical pesticides are often toxic to animals and humans. Moreover, target pests often develop resistance when repeatedly exposed to such substances.

Inna strategia obejmuje stosowanie biopestycydów do zwalczania plag owadów, grzybów i chwastów. Biopestycydy są naturalnie występującymi patogenami i/lub substancjami wytwarzanymi przez te patogeny. Zaletą stosowania biopestycydów jest to, że, w porównaniu z pestycydami chemicznymi, są one generalnie mniej szkodliwe dla organizmów6, które nie są celem ich działania oraz dla środowiska jako całości.Another strategy involves the use of biopesticides to control the infestation of insects, fungi and weeds. Biopesticides are naturally occurring pathogens and / or substances produced by these pathogens. The use of biopesticides has the advantage that, compared to chemical pesticides, they are generally less harmful to non-target organisms 6 and to the environment as a whole.

1. Bacillus thhringiensis1. Bacillus thhringiensis

Najpowszechniej stosowanym biopestycydem jest Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis jest ruchliwą, Gram-dodatnią bakterią w kształcie pałeczki, która jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie, zwłaszcza w glebie i środowiskach bogatych w owady. Podczas wytwarzania przetrwalników Bacillus thuringiensis wytwarza paraprzetrwalnikowe krystaliczne inkluzje, które są owadobójcze po spożyciu przez podatne larwy owadów z rzędów motyli, muchówek i chrząszczy. Inkluzje mogą różnić się kształtem, liczbą i składem. Składają się one z jednego lub kilku białek zwanych endotoksynami delta, których wielkość może pozostawać w zakresie 27-140 kDa. Owadobójcze endotoksyny delta są na ogół przekształcane przez proteazy w jelicie larwy na skrócone polipeptydy toksyczne, powodujące uszkodzenie jelita środkowego i, ostatecznie, śmierć owada (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255).The most commonly used biopesticide is Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis is a mobile, rod-shaped gram-positive bacterium that is widespread in nature, especially in soil and insect-rich environments. When producing bacillus thuringiensis spores, it produces para-spore crystalline inclusions that are insecticidal when ingested by susceptible larvae of the orders of butterflies, flies and beetles. Inclusions can vary in shape, number and composition. They are made up of one or more proteins called delta endotoxins that can range in size in the range of 27-140 kDa. Insecticidal delta endotoxins are generally converted by proteases in the larvae intestine into truncated toxic polypeptides causing midgut injury and, ultimately, insect death (Hófte and Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255).

Istnieje kilka szczepów Bacillus thuriggiegtit, które są powszechnie stosowane jako biopestycydy w leśnictwie, rolnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Bacillus thuringinntis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. i aizawai wytwarzają endotoksyny delta specyficzne wobec motyli. Endotoksynę delta specyficzną wobec chrząszczy wytwarza Bacillus thuringiensis subsp. tenebriogis (Krieg i in., 1988, opis patentowy US 4 766 203).There are several strains of Bacillus thuriggiegtit that are widely used as biopesticides in forestry, agriculture, and public health. Bacillus thuringinntis subsp. kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp. and aizawai produce butterfly-specific delta endotoxins. The beetle-specific delta endotoxin is produced by Bacillus thuringiensis subsp. tenebriogis (Krieg et al., 1988, US Patent 4,766,203).

184 354184 354

Ponadto, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis wytwarza endotoksyny delta specyficzne wobec muchówek (Goldberg, 1979, opis patentowy US 4 166 112).Moreover, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produces flyfly specific delta endotoxins (Goldberg, 1979, US Patent 4,166,112).

Opisano również inne szczepy Bacillus thuringiensis specyficzne wobec szkodników należących do muchówek. Ujawniono izolat Bacillus thuringiensis, który jest toksyczny wobec muchówek i motyli (Hodgman i in., 1993, FEMS Microbiology Letters 114: 17-22). Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS oczyszczonej krystalicznej endotoksyny delta z tego izolatu ujawniła trzy rodzaje białek, które odpowiadają toksynom CryIA(b), CryIB i CryIIA. Ujawniono również izolat Bacillus thuringiensis, który wytwarza kryształ aktywny wobec muchówek złożony z białek o masach cząsteczkowych 140, 122, 76, 72 i 38 kDa (Payne, 1994, opis patentowy US 5 275 815). W europejskim opisie patentowym nr 480 762 ujawniono pięć szczepów B.t, z których każdy jest aktywny wobec szkodników należących do muchówek; każdy z nich posiada także unikalny wzór endotoksyn delta kryształów.Other strains of Bacillus thuringiensis specific for flyfly pests have also been described. An isolate of Bacillus thuringiensis has been disclosed that is toxic to flies and butterflies (Hodgman et al., 1993, FEMS Microbiology Letters 114: 17-22). SDS polyacrylamide gel electrophoresis of the purified crystalline delta endotoxin from this isolate revealed three types of proteins which correspond to the CryIA (b), CryIB and CryIIA toxins. Also disclosed is a Bacillus thuringiensis isolate which produces a fly-fly active crystal composed of proteins with molecular weights of 140, 122, 76, 72 and 38 kDa (Payne, 1994, US Patent 5,275,815). European Patent No. 480,762 discloses five B.t strains, each of which are active against pests belonging to flies; each also has a unique delta crystal endotoxin pattern.

Opisano kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które posiadają aktywność pestycydową wobec szkodników innych niż motyle, chrząszcze i muchówki. Ujawniono pięć szczepów Bacillus thuringiensis, które wytwarzają endotoksyny delta toksyczne dla nicieni (Edwards, Payne i Soares, 1988, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 303 426 B1). Ujawniono również szczep PS81F Bacillus thuringiensis, który można stosować do leczenia ludzi i zwierząt będących żywicielami pasożytniczych pierwotniaków (Thompson i Gaertner, 1991, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 461 799 A2). Ujawniono także kilka izolatów Bacillus thuringiensis o działaniu roztoczobójczym. Izolaty te wytwarzają kryształy składające się z białek o masach cząsteczkowych w zakresie od 35 kDa do 155 kDa (Payne, Cannon i Bagley, 1992, zgłoszenie PCT 92/19106). Ujawniono również szczepy Bacillus thuringiensis aktywne wobec szkodników z rzędu błonkówek (Payne, Kennedy, Randall, Meier i Uick, 1992, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 516 306 A2), aktywne wobec szkodników z rzędu pluskwiaków (Payne i Cannon, 1993, opis patentowy US 5 262 159); aktywne wobec szkodników należących do przywr (Hickle, Sick, Schwab, Narva i Payne, 1993, opis patentowy US 5 262 399) oraz aktywne wobec szkodników z rzędu wszy zwierzęcych (Payne i Hickle, 1993, opis patentowy US 5 273 746). Ponadto, ujawniono, że inny szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, WB3S-16, wyizolowany z wełny po strzyży owiec australijskich, jest toksyczny dla wszy Damalinia ovis, szkodnika z rzędu wszy zwierzęcych (Drummond, Miller i Pinnock, 1992, J Invert. Path. 60: 102-103).Several strains of Bacillus thuringiensis have been described that have pesticidal activity against pests other than butterflies, beetles and flies. Five strains of Bacillus thuringiensis have been disclosed which produce delta endotoxins toxic to nematodes (Edwards, Payne and Soares, 1988, European Patent Application No. 0 303 426 B1). Also disclosed is the PS81F Bacillus thuringiensis strain that can be used to treat humans and animals hosting parasitic protozoa (Thompson and Gaertner, 1991, European Patent Application No. 0 461 799 A2). Several Bacillus thuringiensis isolates with acaricidal activity have also been disclosed. These isolates produce crystals composed of proteins with molecular weights ranging from 35 kDa to 155 kDa (Payne, Cannon and Bagley, 1992, PCT application 92/19106). Strains of Bacillus thuringiensis active against hymenoptera pests have also been disclosed (Payne, Kennedy, Randall, Meier and Uick, 1992, European patent application No. 0 516 306 A2), active against pests of the order of bugs (Payne and Cannon, 1993, US patent specification. 5,262,159); active against trematode pests (Hickle, Sick, Schwab, Narva, and Payne, 1993, US Patent 5,262,399) and active against animal lice pests (Payne and Hickle, 1993, US Patent 5,273,746). Moreover, it was disclosed that another strain of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, WB3S-16, isolated from Australian sheep shearing wool, is toxic to Damalinia ovis lice, an animal louse pest (Drummond, Miller and Pinnock, 1992, J Invert. Path. 60: 102-103).

Endotoksyny delta kodowane są przez geny ery (białka krystaliczne), które na ogół zlokalizowane są w plazmidach. Geny cry podzielono w oparciu o względną homologię aminokwasową i specyficzność wobec szkodników na sześć klas i kilka podklas. Główne klasy są specyficzne wobec motyli (cryI); motyli i muchówek (cryII); chrząszczy (cryIII); muchówek (cryIV) (Hofte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255); chrząszczy i motyli (określane jako geny cryV przez Taylora i in., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217) oraz nicieni (określane jako geny cryVi cryVI) przez Feitelsona i in., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).Delta endotoxins are encoded by era genes (crystal proteins), which are generally located on plasmids. The cry genes have been classified into six classes and several subclasses based on relative amino acid homology and pest specificity. The main classes are butterfly-specific (cryI); butterflies and flies (cryII); beetles (cryIII); flies (cryIV) (Hofte and Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255); beetles and moths (referred to as cryV genes by Taylor et al., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217) and nematodes (referred to as cryVi cryVI genes by Feitelson et al., 1992, Bio / Technology 10: 271-275) .

Endotoksyny delta wytwarzane są metodami rekombinacji DNA. Endotoksyny delta otrzymane metodami rekombinacji DNA mogą ewentualnie być w postaci kryształów.Delta endotoxins are produced by recombinant DNA methods. Alternatively, delta endotoxins obtained by recombinant DNA methods may be in the form of crystals.

Wykazano, że niektóre szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają termostabilny pestycydowy analog nukleotydów adenylowych, znany jako egzotoksyna β typu I lub turyngiensyna, która sama ma własności pestycydowe (Sebesta i in., w: H.D. Burges (red.), Microbiol Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, Nowy Jork, 1980, str. 249-281). Egzotoksynę β typu I znaleziono w supematantach niektórych hodowli Bacillus thuringiensis. Posiada ona masę cząsteczkową 701 i składa się z adenozyny, glukozy i kwasu alarynowego (Farkas i in., 1977, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42: 909-929; Luthy i in., w: Kurstak (red.) Microbiol and Viral Pesticides, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1982, str. 35-72). W zakres ich żywicieli wchodzą między innymi Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster i Tetranychus cinnabarinus. Uważa się, że toksyczność egzotoksyny β typu I powodowana jest hamowaniem zależnej od DNA polimerazyCertain strains of Bacillus thuringiensis have been shown to produce a thermostable pesticidal adenyl nucleotide analogue known as β type I exotoxin or thuringiensin, which itself has pesticidal properties (Sebesta et al., In HD Burges (ed.), Microbiol Control of Pests and Plant Diseases , Academic Press, New York, 1980, pp. 249-281). Type I β exotoxin was found in the supernatants of some Bacillus thuringiensis cultures. It has a molecular weight of 701 and is composed of adenosine, glucose and alarinic acid (Farkas et al., 1977, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42: 909-929; Luthy et al., In: Kurstak (ed.) Microbiol and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp. 35-72). Their hosts include, but are not limited to, Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranyus urticae, Drosophila melanogaster and Tetranyus cinnabarinus. It is believed that the toxicity of the β-exotoxin type I is due to the inhibition of DNA-dependent polymerase

184 354184 354

DNA poprzez współzawodnictwo z ATP. Wykazano, że egzotoksyna β typu I kodowana jest przez plazmid cry w pięciu szczepach Bacillus thuringiensis (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksyna β typu I wytwarzana jest przez Bacillus thuringensis subsp. Thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringensis subsp. tolworthi serotyp 9, Bacillus thuringensis subsp. darmstadiensis serotyp 10.DNA by competition with ATP. The type I beta exotoxin has been shown to be encoded by the cry plasmid in five Bacillus thuringiensis strains (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). It has been found that the β type I exotoxin is produced by Bacillus thuringensis subsp. Thuringiensis serotype 1, Bacillus thuringensis subsp. tolworthi serotype 9, Bacillus thuringensis subsp. Darmstadiensis serotype 10.

Opisano również inną egzotoksynę β, sklasyfikowaną jako egzotoksyna β typu II (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksyna β typu II wytwarzana jest przez Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab oraz, że jest ona aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata. Struktura egzotoksyny β typu II nie jest w pełni znana, ale znacząco różni się ona od struktury egzotoksyny β typu I pod tym względem, że w miejscu adeniny znajduje się reszta pseudourydyny, i w której przyłączenie do pierścienia rybozy znajduje się w pozycji, która w innym wypadku byłaby zajęta przez proton (Levinson, w: Hinckle i Finch (red.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Waszyngton, D.C., 1990, str. 114-136). Ponadto, w protonowym widmie NMR występuje tylko jeden sygnał odpowiadający zasadzie nukleozydu (przy 7,95 ppm) i brak jest sygnału anomerycznego protonu typu rybozy (5,78 ppm).Another β exotoxin has also been described, classified as type II β exotoxin (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). It has been found that the β type II exotoxin is produced by Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotype 8ab and that it is active against Leptinotarsa decemlineata. The structure of the β type II exotoxin is not fully known, but it differs significantly from the structure of the β type I exotoxin in that there is a pseudouridine residue at the adenine site and where the attachment to the ribose ring is at a position otherwise would be occupied by a proton (Levinson, in: Hinckle and Finch (eds.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington, DC, 1990, pp. 114-136). Moreover, in the proton NMR spectrum there is only one signal corresponding to the nucleoside base (at 7.95 ppm) and no anomeric proton of the ribose type (5.78 ppm) signal.

Inne rozpuszczalne w wodzie substancje, które wyizolowano z Bacillus thuringiensis, obejmują egzotoksynę alfa, która jest toksyczna dla larw Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbial. Lett. 8: 1-7), egzotoksyny gamma, które są różnymi enzymami, obejmującymi lecytynazy, chitynazy i proteazy, których działanie toksyczne przejawia się tylko łącznie z egzotoksynami beta i endotoksynami delta (Forsberg i in., 1976, Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); egzotoksynę sigma, która posiada strukturę podobną do egzotoksyny beta i która również jest aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata (Argauer i in., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213; a także anhydroturyngiensynę (Prystas i in., 1975, Coll. Czechosslovak Chem:. Comm. 40: 1775).Other water-soluble substances that have been isolated from Bacillus thuringiensis include alpha exotoxin, which is toxic to Musca domestica larvae (Luthy, 1980, FEMS Microbial. Lett. 8: 1-7), gamma exotoxins, which are various enzymes, including lecithinases. , chitinases and proteases, which are toxic only together with beta exotoxins and delta endotoxins (Forsberg et al., 1976, Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality , Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); a sigma exotoxin, which has a structure similar to beta exotoxin and which is also active against Leptinotarsa decemlineata (Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213; as well as anhydroturingiensin (Prystas et al., 1975, Coll Czechosslovak Chem: Comm. 40: 1775).

2. Zwittermycyna2. Zwittermycin

Zwittermycyna jest substancją wyizolowaną z Bacillus cereus, która hamuje wzrost patogenu roślinnego Phytophora medicaginis i redukuje infekcje lucerny (patrz na przykład opisy patentowe US 4 877 738 i 4 878 936). Nie ujawniono żadnej innej aktywności. Dla zwittermycyny A ustalono następującą strukturę (He i in., Tet. Lett. 35: 2499-2502):Zwittermycin is a substance isolated from Bacillus cereus that inhibits the growth of the plant pathogen Phytophora medicaginis and reduces alfalfa infection (see, for example, US Patents 4,877,738 and 4,878,936). No other activity was disclosed. For zwittermycin A, the following structure was established (He et al., Tet. Lett. 35: 2499-2502):

3. Cel wynalazku3. Purpose of the invention

W badaniach dążono do uzyskania wyższej śmiercionośności preparatów B.t. Dotychczasowe sposoby obejmowały poszukiwania nowych szczepów o zwiększonej śmiercionośności, próby modyfikowania istniejących szczepów oraz próby zaprojektowania bardziej skutecznych preparatów przez łączenie przetrwalników i kryształów B.t. z nowymi nośnikami pestycydowymi, pestycydami chemicznymi lub czynnikami wzmacniającymi (patrz na przykład opis patentowy US 5 250 515, inhibitor trypsyny). Wynalazek podaje sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydów związanych z Bacillus.The studies aimed at achieving a higher lethality of B.t. Methods to date have included the search for new strains with increased lethality, attempts to modify existing strains, and attempts to design more effective preparations by combining B.t. spores and crystals. with new pesticidal carriers, chemical pesticides or enhancing agents (see, for example, US Patent 5,250,515, trypsin inhibitor). The invention provides a method of enhancing the pesticidal activity of Bacillus related pesticides.

184 354184 354

4. Istota wynalazku4. The essence of the invention

Według wynalazku sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus przez zastosowanie czynnika wzmacniającego, wyodrębnionego z supematantu po hodowli szczepu Bacillus i stosowanie czynnika wzmacniającego łącznie z pestycydem związanym z Bacillus, polega na tym, że po hodowli szczepu Bacillus, z supematantu izoluje się, a następnie stosuje łącznie z pestycydem związanym z Bacillus, czynnik wzmacniający o wzorze IaAccording to the invention, a method of enhancing the pesticidal activity of a Bacillus-related pesticide by using an enhancer, isolated from the supernatant after culturing a Bacillus strain, and using an enhancing agent together with a Bacillus-related pesticide, is that after culturing the Bacillus strain, the supernatant is isolated and then uses in conjunction with the Bacillus related pesticide, an enhancing agent of Formula Ia

posiadający w widmie *H NMR przesunięcia przy około 8 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43,having a 1 H NMR spectrum shifts at about 8 of 1.5, 3.22, 3.29, 3.35, 3.43,

3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2,3.58, 3.73, 3.98, 4.07, 4.15, 4.25, 4.35 and in the spectrum of 13 C shifts at about 31.6, 37.2,

51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6,158,3, 170,7 i 1171,3 lub jego sól.51.1, 53.3, 54.0, 54.4, 61.5, 61.6, 64.1, 65.6, 158.3, 170.7 and 1171.3 or a salt thereof.

Korzystnie szczep Bacillus hoduje się w podłożu fermentacyjnym. Czynnik wzmacniający izoluje się z supematantu hodowli drogą chromatografii kolumnowej.Preferably, the Bacillus strain is grown in a fermentation medium. The enhancer is isolated from the culture supernatant by column chromatography.

Jako szczep Bacillus hoduje się szczep Bacillus thuringiensis wybrany z grupy składającej się ze szczepów Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entemocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis i Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.As a Bacillus strain, a Bacillus thuringiensis strain selected from the group consisting of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. Darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entemocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. force, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.

Korzystnie jako szczep Bacillus thuringiensis stosuje się szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.Preferably, the strain Bacillus thuringiensis subsp. Is used as the Bacillus thuringiensis strain. kurstaki.

Pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.The Bacillus associated pesticide includes the Bacillus thuringiensis delta endotoxin or a pesticidally active fragment thereof.

Endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment wybiera się z grupy składającej się z CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.The delta endotoxin Bacillus thuringiensis or a pesticidally active fragment thereof is selected from the group consisting of CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV, and CryVI.

Korzystną, endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIA Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.A preferred Bacillus thuringiensis delta endotoxin or a pesticidally active fragment thereof is the Bacillus thuringiensis delta CryIA endotoxin or a pesticidally active fragment thereof.

184 354184 354

Również korzystną endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.Also a preferred Bacillus thuringiensis delta endotoxin or a pesticidally active fragment thereof is the Bacillus thuringiensis delta CryIC endotoxin or a pesticidally active fragment thereof.

Wymieniony powyżej pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.The Bacillus related pesticide mentioned above includes Bacillus thuringiensis spores.

Sposób otrzymywania czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus obejmuje:A method of obtaining an enhancer of a Bacillus related pesticide pesticide activity includes:

(a) hodowanie szczepu Bacillus;, (b) odzyskiwanie czynnika wzmacniającego z supematantu hodowli z etapu (a).(a) culturing the Bacillus strain; (b) recovering the enhancer from the culture supernatant from step (a).

W szczególności, szczep Bacillus dobiera się z grupy obejmującej się z Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis i Bacillus thuringiensis. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik wzmacniający jest zasadniczo czysty. Czynnik „zasadniczo czysty” oznacza czynnik wzmacniający, który zawiera mniej niż 10% zanieczyszczeń, na przykład, białka endotoksyny delta. Taki zasadniczo czysty czynnik można otrzymać przez wyodrębnienie, na przykład przez chromatografię kolumnową.In particular, the Bacillus strain is selected from the group consisting of Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus thuringiensis. In a preferred embodiment, the enhancing agent is substantially pure. "Substantially pure" factor is an enhancer that contains less than 10% of impurities, for example, delta endotoxin proteins. Such substantially pure factor can be obtained by isolation, for example, by column chromatography.

Otrzymywany czynnik o wzorze la jest czynnikiem wzmacniającym. Przez „czynnik wzmacniający” należy rozumieć substancję, która nie posiada znaczącej aktywności pestycydowej, np. jej LC50 wynosi powyżej około 3000 mg/g (według oznaczenia w próbie biologicznej przedstawionej poniżej w części 6), ale działa zwiększając aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus o co najmniej około 50% i nie powoduje zahamowania rozwoju larwalnego. Jak stwierdzono w stanie techniki, inne znane w nauce substancje zdolne do wzmacniania aktywności pestycydowej, takie jak inhibitory trypsyny i egzotoksyny, posiadają działanie pestycydowe.The resulting factor of formula Ia is an enhancing agent. By "enhancer" is meant a substance that does not have significant pesticidal activity, e.g. its LC5 0 is greater than about 3000 mg / g (as determined in a bioassay below in section 6), but acts to increase the pesticide activity of the Bacillus related pesticide by at least about 50% and does not inhibit larval development. As stated in the art, other substances known in the art capable of enhancing pesticidal activity, such as trypsin and exotoxin inhibitors, have pesticidal activity.

Czynnik wzmacniający jest rozpuszczalny w wodzie. W niniejszym opisie, substancja lub związek jest „rozpuszczalny w wodzie”, oznacza, że co najmniej około 1 mg substancji można rozpuścić w 1 ml wody.The enhancer is water soluble. As used herein, the substance or compound is "water-soluble", meaning that at least about 1 mg of the substance can be dissolved in 1 mL of water.

Czynnik Ia może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych, ale w zasadzie przeznaczony jest do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.Factor Ia may also enhance the pesticidal activity of a chemical pesticide and / or a virus with pesticidal properties, but is essentially intended to enhance the pesticidal activity of a Bacillus related pesticide.

Przez „pestycyd związany z Bacillus’” należy rozumieć szczep, przetrwalnik lub substancję Bacillus (np. Bacillus thuringiensis lub Bacillus subtilis), np. białko lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki, bądź mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki (np. endotoksynę delta Bacillus thuringiensis) oraz odpowiedni nośnik. Przykłady takich nośników podano poniżej. Szkodnikiem może być, na przykład, owad, nicień, roztocze lub ślimak. Mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment wykazujący aktywność wobec lub zabijający szkodniki zasiedla filosferę (powierzchnię liści roślin) i/lub ryzosferę (glebę otaczającą korzenie roślinne) i/lub środowiska wodne i jest zdolny do efektywnego współzawodniczenia w określonym środowisku (rośliny uprawne i inne naturalne siedliska owadów) z mikroorganizmami typu dzikiego oraz zapewnia stabilne utrzymywanie i ekspresję genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują, ale nie ograniczają się do bakterii, np. z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas. Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes i Clostridium; glonów, np. z rodzin Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmakophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae i Chlorophyceae; oraz grzybów, szczególnie drożdży, np. z rodzajów Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula i Aureobasidium.By "Bacillus associated pesticide" is meant a Bacillus strain, spore or substance (e.g., Bacillus thuringiensis or Bacillus subtilis), e.g. a protein or fragment thereof having activity against or killing pests, or a microorganism capable of expressing a Bacillus gene encoding a Bacillus protein or a fragment thereof having activity against or killing pests (eg Bacillus thuringiensis delta endotoxin) and a suitable carrier. Examples of such carriers are given below. The pest can be, for example, an insect, a nematode, a mite or a snail. A microorganism capable of expressing the Bacillus gene encoding the Bacillus protein or its fragment showing activity against or killing pests inhabits the phylosphere (surface of plant leaves) and / or the rhizosphere (soil surrounding plant roots) and / or aquatic environments and is able to compete effectively in a specific environment ( crops and other natural habitats of insects) with wild-type microorganisms, and ensures the stable maintenance and expression of the Bacillus gene encoding the Bacillus protein or fragment thereof having activity against or killing pests. Examples of such microorganisms include, but are not limited to, bacteria, e.g. from the genera Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas. Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes and Clostridium; algae, e.g. from the families Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmakophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae; and Chlorophyceae; and fungi, especially yeasts, e.g. from the genera Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula and Aureobasidium.

184 354184 354

Przez „aktywność pestycydową” należy rozumieć skuteczność działania na szkodniki mierzoną poprzez uśmiercanie lub hamowanie wzrostu szkodnika bądź ochronę rośliny przed zarażeniem szkodnikami.By "pesticidal activity" is meant the effectiveness of the treatment of pests as measured by killing or inhibiting the growth of a pest or protecting the plant from pest infestation.

Otrzymanemu czynnikowi wzmacniającemu la można nadawać postać kompozycji zawierającej czynnik Ia i nośnik pestycydowy, jak również czynnik Ia i pestycyd związany z Bacillus, ewentualnie pestycyd chemiczny i/lub wirus o właściwościach pestycydowych. Kompozycje te można stosować do zwalczania szkodników, zmniejszania odporności szkodnika na pestycyd związany z Bacillus poprzez wystawienie szkodnika na działanie kompozycji zawierającej czynnik wzmacniający i pestycydowo dopuszczalny nośnik, lub do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.The resulting enhancer Ia may be formulated into a composition comprising factor Ia and a pesticidal carrier as well as factor Ia and a bacillus related pesticide, optionally a chemical pesticide and / or a virus with pesticidal properties. These compositions can be used to control pests, reduce the resistance of the pest to a Bacillus related pesticide by exposing the pest to a composition comprising an enhancer and a pesticidally acceptable carrier, or to enhance the pesticidal activity of a Bacillus related pesticide.

Wynalazek obejmuje również sposób identyfikowania czynnika wzmacniającego przez:The invention also includes a method of identifying an enhancer factor by:

(a) hodowanie szczepu Bacillus;(a) growing a strain of Bacillus;

(b) odzyskiwanie supematantu hodowli z etapu (a); i (c) oznaczania supematantu (b) pod kątem wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus.(b) recovering the culture supernatant from step (a); and (c) assaying the supernatant (b) for potentiation of the Bacillus related pesticide.

5. IKrtki opis rysunków5. Brief description of the drawings

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia schematycznie ogólną procedurę stosowaną do oczyszczania czynnika wzmacniającego aktywność; fig. 2 przedstawia widmo 13C NMR, a fig. 3 przedstawia widmo protonowe NMR czynnika Ia.In the accompanying drawings, Fig. 1 schematically shows the general procedure used to purify an activity-enhancer; FIG. 2 shows the 13 C NMR, and Fig. 3 shows the proton NMR spectrum of Ia agent.

Figura 4 przedstawia wyniki doświadczeń z acetylowaną pochodną czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową.Figure 4 shows the results of experiments with an acetylated derivative of the pesticidal activity enhancer.

Szczegółowy opis wynalazkuDetailed description of the invention

Czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus może mieć masę cząsteczkową od około 350 do około 1200 lub, zwłaszcza od około 350 do około 700. Wzmacnia on aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus co najmniej około 1,5 krotnie do nawet około 1000 krotnie, korzystnie od około 100 do około 400 krotnie. W szczególności czynnik Ia wzmacnia aktywność pestycydową białka endotoksyny delta Bacillus obejmującej, ale nie ograniczonej do CryI (CryIA, CryIB i CtyIC), CryII,The pesticidal activity enhancer of the Bacillus related pesticide may have a molecular weight of from about 350 to about 1200 or, more preferably from about 350 to about 700. It enhances the pesticidal activity of the Bacillus related pesticide by at least about 1.5 fold to as much as about 1000 fold, preferably from about 100 to about 400 times. Specifically, factor Ia enhances the pesticidal activity of the Bacillus delta endotoxin protein including but not limited to CryI (CryIA, CryIB and CtyIC), CryII,

CryIII, CryIV, CryV lub CryVI w postaci o pełnej długości lub postaci proteolitycznie zmodyfikowanej, skróconej, od około 1,5 do około 1000 razy. W szczególności, czynnik Ia wzmacnia endotoksynę delta B.t. od około 100 do 400 razy. Czynnik Ia może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.CryIII, CryIV, CryV, or CryVI in full length or proteolytically modified, truncated form from about 1.5 to about 1000 times. In particular, factor Ia enhances the endotoxin delta B.t. from about 100 to 400 times. Factor Ia may also enhance the pesticidal activity of a chemical pesticide and / or a virus with pesticidal properties.

Czynnik o wzorze Ia charakteryzuje się tym, że może być rozpuszczany w wodzie, jest stabilny w wodzie do temperatury około 100°C przez co najmniej 5 minut, jest stabilny przy poddawaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej około 10 godzin i/lub stabilny w pH około 2 w ciągu około 10 dni. Czynnik Ia posiada 13 atomów węgla. Ponadto, czynnik Ia może posiadać w widmie Ή NMR przesunięcia przy około d 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35.An agent of formula Ia is characterized in that it can be dissolved in water, it is stable in water up to a temperature of about 100 ° C for at least 5 minutes, it is stable when exposed to direct sunlight for at least about 10 hours and / or it is stable. at a pH of about 2 within about 10 days. The factor Ia has 13 carbon atoms. Moreover, the factor Ia may have shifts in the Ή NMR spectrum at d 1.5, 3.22, 3.29, 3.35, 3.43, 3.58, 3.73, 3.98, 4.07, 4.15, 4.25, 4.35.

Czynnik wzmacniający przedstawiony jest wzorem IaThe reinforcing factor is represented by the formula Ia

może być w postaci jego soli. Sól powinna być zdolna do wzmacniania aktywności pestycydu związanego z Bacillus.it may be in the form of its salt. The salt should be capable of enhancing the activity of the Bacillus related pesticide.

184 354184 354

6.1 Otrzymywanie czynnika wzmacniającego Ia6.1 Obtaining the enhancer factor Ia

Czynnik Ia otrzymuje się ze szczepu Bacillus (na przykład, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis lub Bacillus thuringiensis) w kolbach do wytrząsania lub w fermentorze. W szczególności czynnik la można otrzymać z supematantu hodowli Bacillus thuringiensis, który obejmuje, ale nie ogranicza się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus. Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi i Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik la można otrzymać z supematantu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai lub Bacillus thuringiensis subsp. galleriae lub ich mutantów wykazujących zasadniczo takie same aktywności wzmacniające. W szczególności czynnik la odzyskuje się z mutanta cry spo‘ Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.Factor Ia is obtained from a Bacillus strain (for example, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis or Bacillus thuringiensis) in shake flasks or in a fermenter. In particular, factor la can be obtained from a Bacillus thuringiensis culture supernatant that includes, but is not limited to, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. Darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus. Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi and Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. In a preferred embodiment, factor Ia can be obtained from the supernatant Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai or Bacillus thuringiensis subsp. galleriae or mutants thereof showing essentially the same enhancing activities. In particular, factor la is recovered from the mutant cry spo 'Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

Bacillus można hodować stosując znane podłoża i techniki fermentacyjne (patrz na przykład, Rogoff i in., 1969, J. Invertebrate Patb. 14: 122-129; Dulmage i in., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage i in., w: Microbiol Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, red., Academic Press, N.Y., 1980). Po zakończeniu cyklu, supernatant można odzyskać przez oddzielenie przetrwalników i kryształów B.t:. od brzeczki hodowlanej (fermentacyjnej) sposobami dobrze znanymi, na przykład przez wirowanie i/lub ultrafiltrację. Czynnik la zawarty jest w supernatancie, który można odzyskać znanymi sposobami, np. przez ultrafiltrację, odparowanie i suszenie rozpyłowe. Procedurę tę opisano bardziej szczegółowo poniżej (w części 7).Bacillus can be cultivated using known fermentation media and techniques (see, for example, Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Patb. 14: 122-129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage et al., In Microbiol Control of Pests and Plant Diseases, HD Burges, ed., Academic Press, NY, 1980). At the end of the cycle, the supernatant can be recovered by separating B.t .: spores and crystals. from the culture (fermentation) broth by well-known methods, for example centrifugation and / or ultrafiltration. The factor Ia is contained in the supernatant which can be recovered by known methods, e.g. ultrafiltration, evaporation and spray drying. This procedure is described in more detail below (in section 7).

Oczyszczanie czynnika Ia można przeprowadzić różnymi technikami np. stosując chromatografię (np. jonowymienną na bazie powinowactwa i sączenia molekularnego), procedur elektroforetycznych, różnicowej rozpuszczalności, ekstrakcji, lub jakąkolwiek inną znaną techniką.The purification of factor Ia can be performed by various techniques, e.g., using chromatography (e.g., affinity-based ion exchange and molecular filtration), electrophoretic procedures, differential solubility, extraction, or any other known technique.

Aktywność czynnika Ia wzmacniającą aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus wobec różnych szkodników można oznaczać stosując znane procedury, takie jak wprowadzenie sztucznej diety dla owadów, pokrywanie sztuczną dietą, malowanie liści, zanurzanie liści i spryskiwanie listowia. Szczegółowe przykłady takich oznaczeń podano poniżej (w części 7).The activity of factor Ia in enhancing the pesticidal activity of the Bacillus-related pesticide against a variety of pests can be determined using known procedures such as introducing an artificial insect diet, artificial diet coating, leaf painting, leaf dipping and foliar spraying. Detailed examples of such determinations are provided below (in section 7).

6.2 Kompozycje zawierające czynnik wzmacniający6.2 Compositions containing a tonic

Czynnik wzmacniający może być w kompozycji sam do następnego stosowania z pestycydem związanym z Bacillus lub razem z pestycydem związanym z Bacillus, którym zgodnie z powyższą definicją jest szczep Bacillus, przetrwalnik, białko lub jego fragment, lub inna substancja pochodząca z nich aktywna wobec szkodników wraz z dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję(e) pestycydową(e) można sporządzić w postaci na przykład zawiesiny, roztworu, emulsji, proszku do opylania, granulek dyspergowalnych, proszku zawiesinowego, koncentratu emulgującego, aerozolu lub impregnowanych granulek.The enhancing agent may be in the composition alone for subsequent use with the Bacillus related pesticide or together with the Bacillus related pesticide, which as defined above is a Bacillus strain, a spore, a protein or a fragment thereof, or other pest active substance derived therefrom, including acceptable carrier. The pesticidal composition (e) may be formulated as, for example, a suspension, solution, emulsion, dusting powder, dispersible granules, wettable powder, emulsifiable concentrate, aerosol or impregnated granules.

Przykładowe szczepy Bacillus obejm^ą ale nie ograniczają się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (sprzedawany jako DIPElÓ przez Abbot Laboratories, Inc., JAVELINO przez Sandoz, BIOBiTo przez Novo Nordisk A/S, FORAYÓ przez Novo Nordisk A/S, BIOCOTÓ przez Novo Nordisk A/S,· MVPÓ przez Mycogen, BACTOSPEINEÓ przez Novo Nordisk A/S i THURICIDEO przez Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (sprzedawany jako FLORBACÓ przez Novo Nordisk A/S i XENTARIO przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis suibsp. tenebrionis (spr:,eedawamy jako NOVODORO przez Novo Nordisk A/S, TRIDENTÓ przez Sandoz, M-TrAkó i MONEÓ przez Mycogen); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (sprzedawany jako albo BACTIMOSÓ, albo SKEETALÓ przez Novo Nordisk A/S, TEKNARO przez Sandoz i YECTOBACÓ przez Abbott Laboratories, Inc.); BacillusExemplary Bacillus strains include, but are not limited to, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (marketed as DIPElÓ by Abbot Laboratories, Inc., JAVELINO by Sandoz, BIOBiTo by Novo Nordisk A / S, FORAYÓ by Novo Nordisk A / S, BIOCOTÓ by Novo Nordisk A / S, MVPÓ by Mycogen, BACTOSPEINEÓ by Novo Nordisk A / S and THURICIDEO by Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (marketed as FLORBACÓ by Novo Nordisk A / S and XENTARIO by Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis suibsp. tenebrionis (spr: eed as NOVODORO by Novo Nordisk A / S, TRIDENTÓ by Sandoz, M-TrAkó and MONEÓ by Mycogen); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (marketed as either BACTIMOSÓ or SKEETALÓ by Novo Nordisk A / S, TEKNARO by Sandoz and YECTOBACÓ by Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus

184 354 thuringiensis kurstskUtenebrionis (sprzedawany jako FOILÓ przez Ecogen); Uscillus thuringiensis kurstaki/sizswsi (sprzedawany jako CONDORO przez Ecogen i AGREEÓ przez Ciba-Geigy) oraz Uscillus thuringiensis kurstski/kurstski (sprzedawany jako CUTLASSÓ przez Ecogen). Związane z Uscillus białko można wybrać z grupy obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.Thuringiensis kurstskUtenebrionis (marketed as FOILO by Ecogen); Uscillus thuringiensis kurstaki / sizswsi (marketed as CONDORO by Ecogen and AGREEÓ by Ciba-Geigy) and Uscillus thuringiensis kurstski / Kurstski (marketed as CUTLASSÓ by Ecogen). The Uscillus related protein may be selected from the group consisting of, but not limited to, Cryl, CryII, CryIII, CryIV, CryV, and CryVI.

W kompozycjach zawierających czynnik la i pestycyd związany z Uscillus, czynnik Ia może występować w ilości co najmniej około 0,1 g/BIU lub 0,05 g czynnika Ia na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus, ewentualnie do około 300 g/BIU lub 150 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus, korzystnie 2 g/BIU lub 1 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus. W niniejszym opisie „BIU” oznacza miliard jednostek międzynarodowych określonych w oznaczeniu biologicznym, w którym porównuje się próbkę ze standardowym materiałem odniesienia Uscillus. Jako standardowy owad testowy stosuje się Trichoplusis ni lub inny szkodnik. Siłę działania określa się przez podzielenie LC5q materiału odniesienia i następnie pomnożenie przez siłę działania standardu odniesienia.In compositions containing factor la and a Uscillus related pesticide, factor Ia may be present in an amount of at least about 0.1 g / BIU or 0.05 g of factor Ia per g of delta endotoxin and Uscillus spores, optionally up to about 300 g / BIU or 150 g substance per g delta endotoxin and Uscillus spores, preferably 2 g / BIU or 1 g substance per g delta endotoxin and Uscillus spores. As used herein, "BIU" means one billion International Units as defined in the Bioassay in which a sample is compared with a Uscillus standard reference material. Trichoplusis ni or another pest is used as the standard test insect. The potency is determined by dividing the LC 5 q of the reference material and then multiplying by the reference standard potency.

W innym rozwiązaniu, kompozycja może zawierać czynnik wzmacniający w zasadniczo czystej postaci lub supernatant pochodzący z hodowli Uscillus w postaci suchej, zatężonej lub płynnej wraz z pestycydowo dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję można stosować oddzielnie na rośliny, np. rośliny transgeniczne. W szczególności, kompozycję można nanosić na roślinę wcześniej zawierającą i eksprymującą gen Uscillus thuringiensis. W innym wykonaniu, kompozycję można nanosić na roślinę uprzednio wystawioną na działanie kompozycji Uscillus thuringiensis. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycję można stosować w środowiskach szkodliwych muchówek, np. wodzie lub glebie. Czynnik Ia występuje w kompozycji w stężeniu od około 0,001% do około 60% (w/w).In another embodiment, the composition may contain the enhancer in substantially pure form or Uscillus culture supernatant in dry, concentrated or liquid form along with a pesticidally acceptable carrier. The composition can be applied separately to plants, e.g., transgenic plants. In particular, the composition can be applied to a plant previously containing and expressing the Uscillus thuringiensis gene. In another embodiment, the composition may be applied to a plant previously exposed to the Uscillus thuringiensis composition. In yet another embodiment, the composition can be used in noxious fly tying environments, e.g., water or soil. Factor Ia is present in the composition at a concentration of from about 0.001% to about 60% (w / w).

Kompozycję zawierającą substancję i pestycydowo dopuszczalny nośnik, poza zwalczaniem szkodnika, można również stosować do obniżania odporności szkodnika na pestycyd. Alternatywnie, kompozycję można również stosować do wzmacniania pestycydu związanego z Uscillus. W jednym wykonaniu, kompozycję można stosować w tym samym czasie, co pestycyd, w ilości co najmniej około 2 g substancji/BIU do ewentualnie około 300 g substancji/BIU. W innym wykonaniu, kompozycję można stosować, do około 24 godzin po pestycydzie, jako adiuwant dla zwiększenia skuteczności pozostałego pestycydu.A composition comprising the substance and a pesticidally acceptable carrier, in addition to controlling the pest, can also be used to reduce the resistance of the pest to a pesticide. Alternatively, the composition can also be used to fortify a Uscillus related pesticide. In one embodiment, the composition may be used at the same time as the pesticide in an amount of at least about 2 g of the substance / BIU to optionally about 300 g of the substance / BIU. In another embodiment, the composition can be used, up to about 24 hours after the pesticide, as an adjuvant to increase the effectiveness of the remaining pesticide.

Takie opisane powyżej kompozycje można otrzymać przez dodanie środka powierzchniowo czynnego, obojętnego nośnika, środka konserwującego, środka pochłaniającego wilgoć, środka pobudzającego żerowanie, środka wabiącego, czynnika kapsułkującego, spoiwa, emulgatora, barwnika, czynnika, zabezpieczającego przed UV, buforu, środka poprawiającego płynność lub innego składnika dla ułatwienia manipulowania i stosowania produktu wobec konkretnych szkodników docelowych.Such compositions as described above may be prepared by the addition of a surfactant, inert carrier, preservative, humectant, feeding stimulant, attractant, encapsulating agent, binder, emulsifier, colorant, UV-protectant, buffer, flow agent, or another ingredient to facilitate the handling and application of the product to specific target pests.

Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują związki anionowe, takie jak sole kwasów karboksylowych, na przykład, sól długołańcuchowego kwasu tłuszczowego z metalem; N-acylosarkozynian; mono- lub diestry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub sole takich estrów; siarczany alkoholi tłuszczowych, takie jak siarczan sodowy dodecylu, siarczan sodowy oktadecylu lub siarczan sodowy cetylu; siarczany etoksylowanych alkoholi tłuszczowych; siarczany etoksylowanych alkilofenoli; sulfoniany ligniny; sulfoniany naftowe; sulfoniany alkiloarylowe, takie jak sulfonian alkilobenzenowy lub sulfoniany alkilonaftalenu o krótkim łańcuchu alkilowym, np. sulfonian butylonaftalenu; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem; sole sulfonowanych produktów kondensacji fenolu z formaldehydem lub bardziej złożone sulfoniany, takie jak amidosulfoniany, np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu oleinowego i N-metylotauryny lub sulfobursztyniany dialkilowe, np. sulfonian sodowy bursztynianu dioktylowego. Środki niejonowe obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych tłuszczową grupą alkilową lub alkenylową z tlenkiem etylenu, estry kwasów tłuszczowych i polihydroksylowych alkoholoeterów, np. estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu, produkty kondensacji takich estrówSuitable surfactants include anionic compounds such as carboxylic acid salts, for example a metal salt of a long chain fatty acid; N-acylsarcosinate; phosphoric acid mono- or diesters of fatty alcohol ethoxylates, or salts of such esters; fatty alcohol sulfates such as sodium dodecyl sulfate, sodium octadecyl sulfate or sodium cetyl sulfate; ethoxylated fatty alcohol sulfates; ethoxylated alkylphenol sulfates; lignin sulfonates; petroleum sulfonates; alkylaryl sulfonates such as alkyl benzene sulfonate or short chain alkyl naphthalene sulfonates, e.g. butyl naphthalene sulfonate; salts of sulfonated naphthalene condensation products with formaldehyde; salts of sulfonated phenol-formaldehyde condensates or more complex sulfonates such as sulfamates, e.g. sulfonated oleic acid and N-methyl taurine condensation products, or dialkyl sulfosuccinates, e.g. dioctyl sodium succinate sulfonate. Nonionic agents include condensation products of fatty acid esters, fatty alcohols, fatty acid amides or phenols substituted with a fatty alkyl or alkenyl group with ethylene oxide, fatty acid esters of polyhydroxy alcohol ethers, e.g. fatty acid sorbitan esters, condensation products of such esters

184 354 z tlenkiem etylenu, np. estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenosorbitanu, kopolimery blokowe tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe, takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decyno-4,7-diol, lub etoksylowane glikole acetylenowe. Przykłady, kationowych środków powierzchniowo czynnych obejmują, na przykład, alifatyczną mono-, di- lub poliaminę, taką jak octan, naftenian lub oleinian; aminę zawierającą tlen, taką jak tlenek aminy polioksyetynylowanej alkiloaminy; aminę z wiązaniem amidowym przygotowaną przez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą, bądź czwartorzędową sól amonową.184 354 with ethylene oxide, e.g. polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, acetylene glycols such as 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, or ethoxylated glycols acetylene. Examples of cationic surfactants include, for example, an aliphatic mono-, di-, or polyamine such as acetate, naphthenate, or oleate; an oxygen-containing amine such as a polyoxyethinylated alkylamine amine oxide; an amide-bonded amine prepared by condensation of a carboxylic acid with a di- or polyamine, or a quaternary ammonium salt.

Przykłady obojętnych materiałów obejmują mineralne substancje nieorganiczne, takie jak kaolin, mika, gips, nawóz sztuczny, filokrzemiany, węglany, siarczany lub fosforany; materiały organiczne, takie jak cukier, skrobie lub cyklodekstryny; lub materiały botaniczne, takie jak produkty z drewna, korek, sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżu, łupiny orzechów ziemnych i łupiny orzechów włoskich.Examples of the inert materials include mineral inorganic substances such as kaolin, mica, gypsum, fertilizer, phyllosilicates, carbonates, sulfates or phosphates; organic materials such as sugar, starches or cyclodextrins; or botanical materials such as wood products, cork, powdered corncobs, rice husks, peanut shells and walnut shells.

Kompozycje mogą mieć postać odpowiednią do bezpośredniego stosowania lub koncentratu bądź pierwotnej kompozycji, która przed zastosowaniem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika. Stężenie pestycydu będzie różne w zależności od charakteru konkretnej postaci, szczególnie od tego, czy jest ona koncentratem, czy jest przeznaczona do bezpośredniego stosowania. Kompozycja zwykle zawiera 1 do 98% stałego lub płynnego obojętnego nośnika i od 0 do 50%, korzystnie od 0,1 do 50% środka powierzchniowo czynnego. Kompozycje te będą stosowane w ilości określonej dla produktu handlowego, korzystnie od około 0,012 do 6 kg/ha, jeśli są w postaci stałej, i od około 0,014 do 35 l/ha jeśli mająpostać płynną.The compositions may be in a form suitable for direct application or as a concentrate or primer composition which requires dilution with a suitable amount of water or other diluent before use. The concentration of the pesticide will vary depending on the nature of the particular form, particularly whether it is a concentrate or is intended for direct application. The composition usually contains 1 to 98% of a solid or liquid inert carrier and 0 to 50%, preferably 0.1 to 50% of a surfactant. These compositions will be applied in an amount as specified for the commercial product, preferably from about 0.012 to 6 kg / ha if in solid form and from about 0.014 to 35 l / ha if in liquid form.

W dalszym rozwiązaniu, krystaliczną endotoksynę delta Bacillus thuringiensis i/lub czynnik la można, przed utworzeniem z nich preparatu, poddawać działaniu mającemu na celu wydłużenie aktywności pestycydowej po zastosowaniu w środowisku docelowego, szkodnika, pod warunkiem, że to działanie wstępne nie szkodzi krystalicznej delta-endotoksynie lub czynnikowi la. Takie traktowanie może być przeprowadzone za pomocą środków chemicznych i/lub fizycznych o ile takie traktowanie nie wywiera ujemnego wpływu na właściwości kompozycji. Przykłady reagentów chemicznych obejmują, ale nie ograniczają się do nich chlorowcujących, aldehydów, takich jak formaldehyd i glutaraldehyd; przeciwinfekcyjnych, takich jak chlorek zefiranu; alkoholi, takich jak izopropanol i etanol; oraz utrwalaczy histologicznych, takich jak utrwalacz Bouina i utrwalacz Helly'ego (patrz, na przykład, Humason, Animal Tissue Techniąues, W.H. Freeman and Co., 1967).In a further embodiment, the crystalline Bacillus thuringiensis delta endotoxin and / or Factor Ia may, prior to formulation thereof, be treated to extend the pesticidal activity after application to the target environment of the pest, provided that the pre-treatment does not harm the crystalline delta- endotoxin or factor Ia. Such treatment may be carried out by chemical and / or physical means as long as the properties of the composition are not adversely affected by such treatment. Examples of chemical reagents include, but are not limited to, halogenating aldehydes such as formaldehyde and glutaraldehyde; anti-infective agents such as zefiran chloride; alcohols such as isopropanol and ethanol; and histological fixatives such as Bouin's fixer and Helly's fixer (see, for example, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co., 1967).

Kompozycje można nanosić bezpośrednio na rośliny przez, na przykład, rozpylanie lub opylanie, w czasie, gdy szkodnik zaczyna pojawiać się na roślinie lub zapobiegawczo przed pojawieniem się szkodników. Rośliny, które mogą być chronione według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do zbóż (pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa, ryżu, sorgo i zbliżonych roślin uprawnych), buraków (buraka cukrowego i buraka pastewnego), pestkowców, drzew jabłkowatych i owoców miękkich (jabłoni, gruszy, śliw, brzoskwini, migdałowców, wiśni, truskawek, malin, i jeżyn), roślin strączkowych (lucerny, fasoli, soczewicy, grochu, soi), roślin oleistych (rzepiku, gorczycy, maku, oliwek, słoneczników, palm kokosowych, rącznika, kakaowców, orzechów ziemnych), dyniowatych (ogórków, dyni, melonów), roślin włóknistych (bawełny, lnu, konopi, juty), owoców cytrusowych (pomarańczy, cytryn, grejpfrutów, mandarynek), warzyw (szpinaku, sałaty, szparagów, kapusty i innych kapustnych, marchwi, cebuli, pomidorów, ziemniaków), wawrzynowatych (awokado, cynamonowca, kamforowca), drzew liściastych i iglastych (lip, cisów, dębów, olszy, topoli, brzóz, jodeł, modrzewi, sosen) lub takich roślin, jak kukurydza, rośliny darniowe, tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośl, chmiel, banany i rośliny kauczukowe, jak również rośliny ozdobne. Kompozycje można stosować na liście, do bruzd, w postaci granulek do rozsiewania rzutowego, „bocznicowo” lub przez drenaż gleby. Ogólnie rzecz biorąc ważne jest uzyskanie skutecznego zwalczania szkodników na wczesnych etapach wzrostu roślin, ponieważ jest to czas, w którym rośliny mogą ulec najsilniejszym uszkodzeniom. Jeśli zachodzi taka potrzeba, kompozycja do rozpylania lub opylania może zawierać inny pestycyd.The compositions can be applied directly to the plants by, for example, spraying or dusting, while the pest begins to appear on the plant, or as a preventive measure before the appearance of the pest. Plants that may be protected according to the present invention include, but are not limited to, cereals (wheat, barley, rye, oats, rice, sorghum and related crops), beet (sugar beet and fodder beet), stone fruit, apple trees and fruit. soft (apple, pear, plum, peach, almond, cherry, strawberry, raspberry and blackberry), legumes (alfalfa, beans, lentils, peas, soybeans), oilseeds (turnip, mustard, poppy, olive, sunflower, palm) coconut, castor, cocoa, peanuts), cucurbits (cucumbers, pumpkins, melons), fiber plants (cotton, flax, hemp, jute), citrus fruits (oranges, lemons, grapefruits, mandarins), vegetables (spinach, lettuce, asparagus , cabbage and other brassicas, carrots, onions, tomatoes, potatoes), laurel (avocado, cinnamon, camphor), deciduous and coniferous trees (linden, yew, oak, alder, poplar, birch, fir, larch, pine) or such plants , like corn, plants turf, tobacco, nuts, coffee, sugarcane, tea, grapevines, hops, bananas, and rubber plants, as well as ornamental plants. The compositions may be applied to the foliage, furrows, flasher granules, "lateral" application, or soil drainage. Overall, it is important to achieve effective pest control in the early stages of plant growth, as this is the time when plants can suffer the most damage. If desired, the spray or dust composition may contain another pesticide.

184 354184 354

Korzystnie kompozycję stosuje się bezpośrednio na roślinę. Kompozycję można również stosować bezpośrednio do stawów, jezior, strumieni, rzek, wód stojących i innych obszarów zagrożonych plagą szkodliwych muchówek, a zwłaszcza szkodnikami mającymi związek ze zdrowiem publicznym. Kompozycję można stosować przez rozpyliinie, opylanie, zraszanie lub podobne.Preferably the composition is applied directly to the plant. The composition can also be applied directly to ponds, lakes, streams, rivers, stagnant waters and other areas threatened by the infestation of harmful flies, especially public health pests. The composition can be applied by spraying, dusting, sprinkling or the like.

Kompozycje mogą być skuteczne wobec szkodliwych owadów z rzędu motyli, np. Achroie griseOle, AcOeris gOoverene, Acleris variane, Adoxophyes orana, Agrotis ipsiOon, AOebeme argiOlecee, Alsophile pometerie, AmyeOois trensiteOOe, Anegaste kuehnieOOe, Anersie lineeteOOe, Anisote senetorie, Anthereee pernyi, Anticersie gemmeteOis, Archips sp., Argyroteenie sp., Athetis mindera, Bombyx mori, BeccuOetrix thurberieUe, Cedre cautelle, Choristoneure sp., Cichylis hospes, CoOies eurytheme, Corcyre cepheOonice, Cydia Oatiferreanus, Cydie pomonella, Datana integerrime, DendroOimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphenie hyeOineete, Diaphanie nitideOis, Dietreee grandiosella, Dietreee saccharalis, Ennomos subsignerie, Eoreume Ooftini, Ephestie eOuteOOe, Erannis tiliaria, Estigmene ecree, Eulia salubricole, Eupoeclia embigueda, Euproctis chrysorrhoea, Euxoe messoria, GeOOerie melloneOlaGrephoOite moOesta, Herrisine emericene, HeOicoverpe subflexa, Helicoverpe zea, HeOiothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosome eOecteUum, Hyphentrie cunee, Keiferia Oycopersicella, Lembdine fiscellaria fiscedaria, Lembdine fiscellaria lugubrosa, Leucome salicis, Lobesie botrene, Loxostege sticticalis, Lymentrie disper, Macalla thyrsisalis, MeOecosome sp, Memestre bressicee, Memestre configureta, Menduce quinquemecuOete, Menduce sexte, Meruce testuOeOis, MeOenchre picta, Operophtere brumeka, Orgyia sp, Ostrinie nubilalis, Peleacrite vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypieOOe, Phrygenidie cali/ornica, PhyOOnorycter blencerdella, Pieris nepi, Pieris rapae, POethypene scebra, POetynote flouendana, POetynote sultana, POetyptiOie carduidectyla, POodie interpuncteda, Plutella xyOosleOOa. Pontie protodice, PseudeOetie unipuncte, Pseudoplusia includens, SebuOodes eegrotete, Schizure concinna, Sitotroge cereelella, Spdonote ocellena, Spodoptere sp, Thaurnstopoea pityocempa, TineoOe bisselliella, Trichoplusie ni, Udee rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeute padella; rzędu muchówek,, np. Aedes sp, Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anestrephe suspensa, Anopheles berberi, AnopheOes quadrimaculatus, Armigeres subeObetus, CeUiphore stygien, Celliphora vicina, Ceretitis cepitete, Chironomus tentens, Chrysomye rufifacies, CochOiomyie mecellaria, CuOex sp, Culisete inornete, Dacus oleee, DeOie entiqua, Ddie platura, DeOie redicum, Drosophde melanogaser; Eupeodes corollae, GOossine austeni, GOossine brevipalpis, GOossine fuscipes, GOossine morsitens centralis, GOossine morsitens morsitens, GOossine morsitens submorsitens, GOossine pallidipes, GOossine peOpeOis gembiensis, GOossine peOpeOis peOpeOis, GOossine tachinoides, Heemegogus equinus, Heemetobie irritans, Hypoderme bovis, Hypoderme Oineetum, Leucopis ninee, LuciOOe cuprine, Lucilla sericata, Lutzomyie Oonglpeipis, Lutzom-yie shennoni, LycorieOOe meli, MeyetioOe destructor, Musce aulumnalis, Musce domestice, NeobeOOierie sp, Nephrotoma suturalis, Ophyre eenescens, Pheenicie sericete, PhOebotomus sp, Phormie regina, Sebethes cyeneus, Secrophege bulleta, Scetophege stercoraria, Stomoxys calcitrens, Toxorhynchites emboinensis, Tripteroides bambusa. Jednakże, kompozycje według wynalazku mogą również być aktywne wobec szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, np. Leptinotarse sp, AcenthosceOides obtectus, CeOOosobrunchus chinensis, EpiOachne verivestis, PyrrhaOta Outeola, CyOes formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, SitophiOus sp, CycOocephaOa boreelis, CycOocephaOa immaculata, MecrodactyOus subspinosus, PopiOOie japonica, Rhizotrogus majeOis, AOphitobius diaperinus, PeOorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, TriboOium castaneum, TriboOium confusum, Tribolius destructor; roztoczy, np. OOigonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tckranychus urticae; błonkówek, np. Iridomyrmex humilis, SoOenopsis invicta; termitów, np. ReticuOitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis engusticoOOis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; pcheł, np. Ceratophyllus gaOOinae, CeratophyOOus niger, Nosopsyllus fasciatus, LeptopsyOOa segnis, CtenocepheOides canis, Ctenocephelides felis, Echicnophaga gallinecee, Pulex irritans,The compositions may be effective against insect pests from the order of butterflies, e.g. Achroie griseOle, AcOeris gOoverene, Acleris variane, Adoxophyes orana, Agrotis ipsiOon, AOebeme argiOlecee, Alsophile pometerie, AmyeOois trensiteOOe, Anegaste, Anegastee, Antoriehnieoete, Antoriehnieeetie, Antoriehnieoete, gemmeteOis, Archips sp., Argyroteenie sp., Athetis mindera, Bombyx mori, Beccu Oetrix thurberieUe, Cedre cautelle, Choristoneure sp., Cichylis hospes, CoOies eurytheme, Corcyre cepheOonice, Cydia Oatiferreanus, DendicieOerronus, DendicieOetrix, funeralOeralusi Diaphenie hyeOineete, Diaphanie nitideOis, Dietreee grandiosella, Dietreee saccharalis, Ennomos subsignerie, Eoreume Ooftini, Ephestie eOuteOOe, Erannis tiliaria, Estigmene ecree, Eulia salubricole, Eupoeclia embigueda, EuprocoverOela, EuprocoverOela, EuprocoverOela, EuprocoverOela, Euprocoorea, Euprocoorea, EuprocoRhonea, Euprocoorea, Euprocovera, zea, HeOiothis virescens, Hemileuca olivia e, Homoeosome eOecteUum, Hyphentrie cunee, Keiferia Oycopersicella, Lembdine fiscellaria fiscedaria, Lembdine fiscellaria lugubrosa, Leucome salicis, Lobesie botrene, Loxostege st. testOeOis, MeOenchre picta, Operophtere brumeka, Orgyia sp, Ostrinie nubilalis, Peleacrite vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypieOOe, Phrygenidie cali / ornica, PhyOOnorycter blencerdella, Pieris nepétiela, POnorycter blencerdella, Pieris nepbraidiela, POUltis rapetae nepotela, POUltetyn rapetae, sepaultana interpuncteda, Plutella xyOosleOOa. Pontie protodice, PseudeOetie unipuncte, Pseudoplusia includens, SebuOodes eegrotete, Schizure concinna, Sitotroge cereelella, Spdonote ocellena, Spodoptere sp, Thaurnstopoea pityocempa, TineoOe bisselliella, Trichopomelusesie ni, Xylee rubonigalisie, Xylee rubonygalisie; of the order of the flies, e.g. Aedes sp, Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anestrephe suspensa, Anopheles berberi, AnopheOes quadrimaculatus, Armigeres subeObetus, CeUiphore stygien, Celliphora vicina, Ceretitis cepitochete, Chiriesonome rimeteis, Ceretitis cepitochete, Chiriesomye tentensaria, Chiriesomye tentensaria, Chiriesonome tentensaria , Dacus oleee, DeOie entiqua, Ddie platura, DeOie redicum, Drosophde melanogaser; Eupeodes corollae, GOossine austeni, GOossine brevipalpis, GOossine fuscipes, GOossine morsitens centralis, GOossine morsitens morsitens, GOossine morsitens submorsitens, GOossine pallidipes, GOossine peOpeOis gossine peoepeus, GOossine peOpeus, GOossine peOpe Leucopis ninee, LuciOOe cuprine, Lucilla sericata, Lutzomyie Oonglpeipis, Lutzom-yie shennoni, LycorieOOe meli, MeyetioOe destructor, Musce aulumnalis, Musce domestice, NeobeOOierie sp, Nephroteteus suturalis, OphyreOenebicieic, PhyreOenebicieic, Phyre, Phormene sericens, Phyre, Phormene sericens, Phyreoenebiotescens Secrophege bulleta, Scetophege stercoraria, Stomoxys calcitrens, Toxorhynchites emboinensis, Bamboo Tripteroides. However, the compositions according to the invention may also be active against harmful insects of the order of the beetles, e.g. Leptinotarse sp, AcenthosceOides obtectus, CeOOosobrunchus chinensis, EpiOachne verivestis, PyrrhaOta Outeola, CyOes formicarius elegantulus, Listronotus oregoconisha, CycophOiepacusa, immocarius CycophOiepa, O, subspinosus, PopiOOie japonica, Rhizotrogus majeOis, AOphitobius diaperinus, PeOorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, TriboOium castaneum, TriboOium confusum, Tribolius destructor; mites, e.g., OOigonychus pratensis, Panonychus ulmi, TckNYCHus urticae; Hymenoptera, e.g. Iridomyrmex humilis, SoOenopsis invicta; termites, e.g. ReticuOitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis engusticoOOis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; fleas, e.g. Ceratophyllus gaOOinae, CeratophyOOus niger, Nosopsyllus fasciatus, LeptopsyOOa segnis, CtenocepheOides canis, Ctenocephelides felis, Echicnophaga gallinecee, Pulex irritans,

184 354184 354

Xenopsylla cheopis, Xegopsylla vexabilis, Tunga pngntrags oraz nicieni z rodziny węgorkowatych, np. Mnlodidogygn igcoggita, Pratylenchus pngntrags.Xenopsylla cheopis, Xegopsylla vexabilis, Tunga pngntrags, and nematodes of the nematode family, e.g., Mnlodidogygn igcoggita, Pratylenchus pngntrags.

Poniższe przykłady przedstawiono w celu zilustrowania wynalazku nie ograniczając jego zakresu.The following examples are presented to illustrate the invention without limiting its scope.

7. Przykłady7. Examples

Charakterystykę czynnika wzmacniającego. Jego odzyskiwanie i oczyszczanie przedstawiono szczegółowo poniżej.Characteristics of the enhancing factor. Its recovery and purification are detailed below.

7.1. Odzyskiwanie i oczyszczanie czynnika wzmacniającego7.1. Recovery and purification of the enhancing factor

Fermentację szczepu EMCC0086 B. thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowanego w NRRL jako B-21147) prowadzono w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza i źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat białkowy lub namok kukurydziany. Tworzenie się czynnika Ia wykrywano w 13 godzinie fermentacji. Najwyższą aktywność stwierdzano w około 30 godzinie.Fermentation of the strain EMCC0086 B. thuringiensis subsp. kurstaki (deposited with the NRRL as B-21147) was run for 72 hours at 30 ° C in a medium containing a carbon source such as starch, starch hydrolyzate or glucose and a nitrogen source such as protein, protein hydrolyzate or corn steep. The formation of factor Ia was detected at 13 hours of fermentation. The highest activity was found at about 30 hours.

Supematant z fermentacji B. thuringiensis subsp. kurstaki odzyskiwano przez wirowanie, a następnie klarowano drogą ultrafiltracji przez membranę MW-CO o przepuszczalności do 30 kDa, stosując w tym celu układ UF Rhone Poulenc. Filtracja przez membrany o przepuszczalności do 30 kDa doprowadziła do usunięcia pozostałych szczątków komórek, krystalicznej delta-endotoksyny, przetrwalników i białek rozpuszczalnych o masie cząsteczkowej wyższej niż 30 kDa. Przesącz zagęszczono 10-krotnie przez odparowanie. Przesącz odwirowano, a następnie przefiltrowano przez membranę o średnicy porów 0,2 m w celu dalszego usunięcia nierozpuszczalnych składników brzeczki, otrzymując klarowną brzeczkę zawierającą czynnik Ia.Supplement from the fermentation of B. thuringiensis subsp. kurstaki was recovered by centrifugation and then clarified by ultrafiltration through a MW-CO membrane with permeability up to 30 kDa using the Rhone Poulenc UF system. Filtration through membranes with permeability up to 30 kDa removed residual cell debris, crystalline delta-endotoxin, spores and soluble proteins with a molecular weight greater than 30 kDa. The filtrate was concentrated 10 times by evaporation. The filtrate was centrifuged and then filtered through a 0.2 m membrane to further remove the insoluble components of the broth to obtain a clear broth containing factor Ia.

Oczyszczanie czynnika Ia do jednorodności uzyskano stosując wieloetapową procedurę oczyszczania przedstawioną schematycznie na fig. 1. W procesie opisanym powyżej, oczyszczanie prowadzono za pomocą ultrafiltracji. Przesącz otrzymany w wyniku ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa adsorbowano na złożu kationowymiennym Sulphopropyl (SP) i eluowano roztworem octanu amonu. Związek zagęszczono następnie około 30-krotnie przez liofilizację, a sól i inne zanieczyszczenia usunięto stosując kolumnę do sączenia molekularnego P2 BioRad. Połączone frakcje z kolumny P2 rozdzielano na kolumnie SP HPLC do wysokorozdzielczej chromatografii kationowymiennej, co prowadzi do uzyskania homogenicznego związku. Zanieczyszczająca sól usuwa się przez kilkakrotną liofilizację.The purification of factor Ia to homogeneity was achieved using the multistage purification procedure schematically shown in Fig. 1. In the process described above, purification was carried out by ultrafiltration. The filtrate obtained as a result of ultrafiltration through a membrane with a permeability of up to 5 kDa was adsorbed on a Sulphopropyl (SP) cation exchange bed and eluted with ammonium acetate solution. The compound was then concentrated approximately 30-fold by lyophilization, and the salt and other impurities were removed using a P2 BioRad gel filtration column. The pooled fractions from the P2 column were separated on a SP HPLC column for high resolution cation exchange chromatography resulting in a homogeneous compound. Contaminating salt is removed by lyophilization several times.

Aktywność monitorowano za pomocą mikrooznaczenia biologicznego z wykorzystaniem Spodoptera exigua, a czystość oznaczano za pomocą elektroforezy kapilarnej. Próbki zawierające 50 ml czynnika Ia i 50 ml białka CryIA(c) (15 mg/ml) oczyszczonego z BIOBIT™ FC (100 ml) nanoszono do pojedynczych studzienek w galaretowatej podstawce, zawierających 500 ml zestalonej sztucznej diety dla owada. Podstawki zawierające różne próbki suszono na powietrzu. Do studzienek zawierających wysuszone próbki podano dwa do czterech owadów Spodoptera exigua w fazie drugiej lub wczesnej trzeciej wylinki. Studzienki zamknięto mylarem z otworami i inkubowano w ciągu 2-3 dni w temperaturze 30°C. Następnie zarejestrowano stopień zahamowania rozwoju oraz śmiertelność w procentach. Zazwyczaj prowadzi się 5 powtórzeń identycznych studzienek dla każdej próbki.Activity was monitored by micro-bioassay using Spodoptera exigua and purity was determined by capillary electrophoresis. Samples containing 50 ml of factor Ia and 50 ml of CryIA (c) protein (15 mg / ml) purified from BIOBIT ™ FC (100 ml) were applied to individual wells in a jelly-like tray containing 500 ml of solidified artificial insect diet. The stands containing the various samples were air dried. Two to four Spodoptera exigua insects in the second or early third instar phase were applied to the wells containing the dried samples. The wells were closed with orifice mylar and incubated for 2-3 days at 30 ° C. Then the degree of growth inhibition and the percentage mortality were recorded. Typically, 5 replicates of identical wells are run for each sample.

7.2. Określenie struktury7.2. Definition of the structure

Stwierdzono, że aktywny związek jest rozpuszczalny w wodzie, a nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych. Jest on dodatnio naładowany i reaguje z ninhydryną, co udowodniono stosując chromatografię cienkowarstwową na krzemionce. NMR 13C i protonowy związku przedstawiono odpowiednio na fig. 2 i 3. Badania 13C NMR wykazały obecność 13 atomów węgla (odnoszące się do kwasu 3-(trimetylosililopropionowego). Doświadczenie DEPT wykazało, że w związku tym występują trzy czwartorzędowe atomy węgla (C), siedem grup metinowych (CH), trzy grupy metylenowe (CH2) i żadnej grupy metylowej (CH3). Stosując odsprzęgania protonów'', takie jak odsprzęganie 1-D i COSY, zidentyfikowano jeden duży układ spinowy zawierający osiem atomów węgla. Ponadto, obecny jest mniejszy układThe active compound has been found to be water-soluble and insoluble in organic solvents. It is positively charged and reacts with ninhydrin as evidenced by silica thin layer chromatography. The 13 C NMR and the proton of the compound are shown in Figures 2 and 3, respectively. 13 C NMR studies showed the presence of 13 carbon atoms (related to 3- (trimethylsilylpropionic acid). The DEPT experiment showed that there are three quaternary carbon atoms (C ), seven groups of methine (CH), three methylenes (CH2) and no methyl group (CH3). Using the proton-decoupled '', such as decoupling one-D COZY identified one large spin system containing eight carbon atoms. In addition, , a smaller layout is present

184 354 spinowy zawierający dwa atomy węgla. Eksperyment korelacyjny węglowo-protonowy (HMBC) umożliwił wyznaczenie rezonansu każdego protonu w cząsteczce do związanego z nim atomu węgla.184 354 spin containing two carbon atoms. The carbon-proton correlation experiment (HMBC) made it possible to determine the resonance of each proton in a molecule to its associated carbon atom.

W wyniku traktowania aktywnego związku (13 mg) bezwodnikiem octowym w pirydynie powstaje acetylowana pochodna, która jest znacznie mniej polarna. Pochodną tą oczyszczono przez HPLC, uzyskując 3 mg czystej zacetylowanej pochodnej. Analiza z wykorzystaniem spektroskopii masowej wykazała, że pochodna ta posiada 7 grup acetylowych i masę cząsteczkową 690, co daje masę cząsteczkową aktywnego związku 396 i wskazuje, że obecna jest parzysta liczba atomów azotu. Wykryto również fragmenty zawierające 6 grup acetylowych i 5 grup acetylowych. Dane o wysokiej rozdzielczości dla jonów potomnych zawierających 5 i 6 grup acetylowych wynoszą 645,2594 (6 grup acetylowych) i 607,2519 (5 grup acetylowych), co wskazuje na następujący wzór cząsteczkowy czynnika Ia, C|1H28N6°8.Treatment of the active compound (13 mg) with acetic anhydride in pyridine produces an acetylated derivative which is much less polar. This derivative was purified by HPLC to give 3 mg of pure acetylated derivative. Mass spectroscopy analysis showed this derivative to have 7 acetyl groups and a molecular weight of 690, giving the molecular weight of active 396 and indicating that an even number of nitrogen atoms are present. Fragments containing 6 acetyl groups and 5 acetyl groups were also detected. The high resolution data for the daughter ions containing 5 and 6 acetyl groups are 645.2594 (6 acetyl groups) and 607.2519 (5 acetyl groups), indicating the following factor Ia molecular formula, C | 1 H 2 8 N 6 ° 8 .

Działanie na aktywny związek (13 mg) 6 N HCl prowadzi do wytworzenia pochodnej dającej dodatnią reakcję z ninhydryną. Wyniki te wskazują na obecność wiązań amidowych. Pochodna ma taką samą wartość Rf, jaką wyznaczono przez chromatografię cienkowarstwową dla kwasu 2,3-diaminopropionowego. Wyniki te wraz z danymi NMR sugerują obecność kwasu 2,3-diaminopropionowego.Treatment of the active compound (13 mg) with 6N HCl leads to the formation of a derivative giving a positive reaction with ninhydrin. These results indicate the presence of amide bonds. The derivative has the same Rf value as determined by thin layer chromatography for 2,3-diaminopropionic acid. These results, together with NMR data, suggest the presence of 2,3-diaminopropionic acid.

Inną techniką wykorzystaną do analizy czynnika Ia była nOe (jądrowy efekt Overhausera), dzięki której można wyznaczyć wzajemną bliskość protonów w przestrzeni. nOe prowadzono na zacetylowanej pochodnej. W dwukierunkowym doświadczeniu nOe (NOESY), nOe zaobserwowano pomiędzy protonem N-H przy 8,06 ppm i protonem 5,17 (fig. 4).Another technique used to analyze factor Ia was nOe (nuclear Overhauser effect), thanks to which it is possible to determine the mutual proximity of protons in space. nOe was run on the acetylated derivative. In the two-way nOe experiment (NOESY), nOe was observed between the N-H proton at 8.06 ppm and the 5.17 proton (Fig. 4).

Ustalono następującą strukturę czynnika Ia:The following structure of factor Ia was established:

OHOH

Związek ten można zaliczyć do ureidoamidów. Jego składniki obejmują 2 grupy amidowe, mocznik, dwie aminy i pięć grup hydroksylowych. Zawiera on siedem centrów chiralnych.This compound can be classified as ureidamides. Its components include 2 amide groups, urea, two amines and five hydroxyl groups. It contains seven chiral centers.

7.3 Właściwości czynnika Ia7.3 Properties of factor Ia

Stwierdzono, że wyizolowany czynnik Ia wzmacnia aktywność białek pestycydowych krystalicznej delta-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. aizawai wobec Spodoptera exigua bez względu na postać białek pestycydowych. Wzmacniana jest aktywność pestycydowa preparatów B.t.k, wyizolowanych kryształów i białek CrylA, o pełnej długości (masa cząsteczkowa 130 kDa) lub skróconych (masa cząsteczkowa około 65 kDa). Wzmacniana jest również aktywność inkluzji CryII i CryIC. Stwierdzono również wzmacnianie aktywności pojedynczych, skróconych białek CryIA(a), (b) i (c). Nie stwierdzono, aby czas inkubacji czynnika Ia z białkiem Cry miał zasadnicze znaczenie dla aktywności biologicznej. Jednakże, sam czynnik Ia jest nieaktywny. Stwierdzono, że poziom wzmocnienia jest 100-200 krotny dla skróconych białek CryIA oraz inkluzji CryII i CryIC i około 320 krotny dla pełnej długości CryIA(c) (patrz odpowiednio tabela 1 i 2). Szczególnie w przypadku białka o pełnej długości, stężenie 0,75 mg/ml CryIA(c) powodowało taką samą śmiertelność owadów/stopień zahamowania rozwoju, gdy dodano czynnik Ia,The isolated factor Ia was found to enhance the activity of Bacillus thuringiensis subsp. Crystal delta-endotoxin pesticidal proteins. kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp. aizawai against Spodoptera exigua regardless of the form of the pesticidal proteins. The pesticidal activity of B.t.k preparations, isolated CryIA crystals and proteins, full length (molecular weight 130 kDa) or truncated (molecular weight approximately 65 kDa) is enhanced. The activity of CryII and CryIC inclusions is also enhanced. It was also found to enhance the activity of single, truncated CryIA proteins (a), (b) and (c). The time of incubation of factor Ia with the Cry protein was not found to be essential for biological activity. However, factor Ia itself is inactive. The level of enhancement was found to be 100-200 fold for truncated CryIA proteins and CryII and CryIC inclusions and approximately 320 fold for full length CryIA (c) (see Tables 1 and 2, respectively). Particularly for the full length protein, a concentration of 0.75 mg / ml CryIA (c) resulted in the same insect mortality / inhibition rate when factor Ia was added.

184 354 jak 240 mg/ml samego białka CryIA(c). W przypadku skróconego CryIA(c), przy OD,8q wynoszącym 0,0006 w połączeniu z czynnikiem Ia otrzymano taki sam stopień zahamowania rozwoju, jak dla próbki samego CryIA(c) przy OD28() wynoszącym 0,075. Inkluzje CryII w stężeniu 0,6 mg/ml w połączeniu z czynnikiem Ia dawały taki sam stopień zahamowania rozwoju i podobną śmiertelność jak samo białko CryII w stężeniu 75 mg/ml, co stanowi 125-krotne wzmocnienie. Inkluzje CryIC przy stężeniu 0,3 mg/ml z dodatkiem czynnika Ia dają podobną śmiertelność i stopień zahamowania rozwoju, jak samo białko CryIC w stężeniu 75 mg/ml, co odzwierciedla 250-krotny poziom wzmocnienia. Stężenie białka CryIA, które powodowało zahamowanie rozwoju, po dodaniu czynnika Ia prowadziło do śmierci.184 354 as well as 240 mg / ml CryIA protein alone (c). In the case of truncated CryIA (c), the OD, 8 q ratio of 0.0006 in combination with a factor of Ia to give the same degree of growth inhibition, as for the sample of CryIA (c) at 28 () of 0.075. CryII inclusions at a concentration of 0.6 mg / ml in combination with factor Ia produced the same degree of growth inhibition and similar mortality as the CryII protein alone at a concentration of 75 mg / ml, which is a 125-fold enhancement. CryIC inclusions at a concentration of 0.3 mg / ml with the addition of factor Ia gave similar mortality and inhibition rates as the CryIC protein alone at a concentration of 75 mg / ml, reflecting a 250-fold enhancement level. The concentration of CryIA protein, which inhibited growth, resulted in death after addition of factor Ia.

W oznaczeniu biologicznym opisanym w części 7.1, stwierdzono, że czynnik Ia zachowuje stabilność w temperaturze wrzenia w ciągu 5 minut, ale traci całą aktywność podczas autoklawowania (>190°C). Ponadto, jest on stabilny po poddaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej 10 godzin. Czynnik Ia jest stabilny w pH 2 w ciągu 3 dni, ale niestabilny w pH 12. Stwierdzono, że traci całą aktywność po wystawieniu na działanie kwasu nadjodowego lub stężonego HCl.In the bioassay described in section 7.1, factor Ia was found to be stable at boiling point for 5 minutes, but lost all activity upon autoclaving (> 190 ° C). Furthermore, it is stable when exposed to direct sunlight for at least 10 hours. Factor Ia is stable at pH 2 for 3 days, but unstable at pH 12. It has been found to lose all activity when exposed to periodic acid or concentrated HCl.

Tabela 1Table 1

Wzmacniający wpływ czynnika Ia na oczyszczone skrócone białka Bacillus thuringiensisEnhancement effect of factor Ia on the purified truncated proteins of Bacillus thuringiensis

Białko Bt Bt protein Czynnik Factor Spodoptera Exigua Spodoptera Exigua Typ T yp od280 from 280 Śmiertelność’ Mortality' Stopień zahamowania rozwoju1 Development inhibition level 1 CryIa(a) CryIa (a) 0,055 0.055 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 0,040 0.040 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 0,020 0.020 - - 0/5 0/5 2,0 2.0 0,020 0.020 + + 2/5 2/5 0,0 0.0 0,010 0.010 + + 0/5 0/5 0,2 0.2 0,005 0.005 + + 0/5 0/5 0,0 0.0 0,0025 0.0025 + + 0/5 0/5 0,4 0.4 0,0012 0.0012 + + 0/5 0/5 1,8 1.8 0,0006 0.0006 + + 0/5 0/5 1,6 1.6 CryIA(c) CryIA (c) 0,075 0.075 - - 0/5 0/5 3,4 3.4 0,040 0.040 - - 0/5 0/5 2,6 2.6 0,020 0.020 - - 0/5 0/5 2,8 2.8 0,020 0.020 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 0,010 0.010 + + 0/5 0/5 0,2 0.2 0,005 0.005 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 0,0025 0.0025 + + 2/5 2/5 2,0 2.0 0,0012 0.0012 + + 0/5 0/5 1,0 1.0 0,0006 0.0006 + + 1/5 1/5 1,0 1.0 Brak Lack + + 0/5 0/5 4,0 4.0 Brak Lack - - 0/5 0/5 4,0 4.0

* ,*,

Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach.Mortality = number of dead insects / total number of insects after 2 days.

t Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowana jako średnia wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = próba kontrolna nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.t Growth inhibition defined as the mean live insect larva size at the end of the bioassay: 4.0 = untreated control, 3.0 = 75% of the control size, 2.0 = 50% of the control size, 1.0 = 25% of the control size , 0.0 = no growth or size unchanged from the start of the experiment.

184 354184 354

Tabela 2Table 2

Wzmacniający wpływ czynnika Ia na białko BtThe enhancing effect of factor Ia on the Bt protein

Białko Bt Bt protein Czynnik Factor Spodoptera Exigua Spodoptera Exigua Typ Type OD280 FROM 280 Śmiertelność* Mortality* Stopień zahamowania rozwoju t The degree of inhibition of development t 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 CryIA(c) CryIA (c) 240 240 ' - '- 1/5 1/5 0,5 0.5 120 120 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 60 60 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 30 thirty - - 0/5 0/5 4,0 4.0 60 60 + + 5/5 5/5 — - 30 thirty + + 5/5 5/5 — - 15 15 + + 4/5 4/5 0,0 0.0 3 3 + + 4/5 4/5 1,0 1.0 0,8 0.8 + + 2/5 2/5 1,6 1.6 CryII CryII 300 300 - - 1/5 1/5 0,8 0.8 150 150 - - 2/5 2/5 0,7 0.7 75 75 - - 1/5 1/5 0,2 0.2 38 38 - - 0/5 0/5 0,8 0.8 19 19 - - 0/5 0/5 1,6 1.6 9 9 - - 0/5 0/5 1,8 1.8 5 5 - - 1/5 1/5 4,0 4.0 38 38 + + 3/5 3/5 1,0 1.0 19 19 + + 2/5 2/5 0,5 0.5 9 9 + + 3/5 3/5 0,0 0.0 5 5 + + 1/5 1/5 0,5 0.5 2,4 2.4 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 1,2 1.2 + + 3/5 3/5 0,5 0.5 0,6 0.6 + + 2/5 2/5 0,3 0.3 CryII CryII 300 300 - - 2/5 2/5 0,3 0.3 150 150 - - 2/5 2/5 0,0 0.0 75 75 - - 1/5 1/5 0,8 0.8 38 38 - - 0/5 0/5 3,2 3.2 38 38 + + 5,5 5.5 — - 19 19 + + 5/5 5/5 - - 9 9 + + 5/5 5/5 — - 5 5 + + 4/5 4/5 0,0 0.0 2,4 2.4 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 1,2 1.2 + + 5/5 5/5 - -

184 354 ciąg dalszy tabeli 2184 354 table 2 continued

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 0,6 0.6 + + 3/5 3/5 1,5 1.5 0,3 0.3 + + 2/5 2/5 1,3 1.3 Brak Lack - - 0/5 0/5 4,0 4.0 Brak Lack + + 0/5 0/5 4,0 4.0

* ,*,

Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach.Mortality = number of dead insects / total number of insects after 2 days.

* Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowana jako średnia wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.* Grade of inhibition defined as the mean live insect larva size at the end of the bioassay: 4.0 = untreated control, 3.0 = 75% of the control size, 2.0 = 50% of the control size, 1.0 = 25% of the control size, 0.0 = no growth or size not changed from the start of the experiment.

7.4 Ocena innych podgatunków Bacillus thuringiensis i innych gatunków Bacilli7.4 Assessment of other subspecies of Bacillus thuringiensis and other Bacilla species

Kilka gatunków Bacilli oceniono pod kątem wytwarzania czynnika Ia. Szczepy poddawano fermentacji w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza, oraz źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat białkowy lub namok kukurydziany. Supematanty testowano pod kątem wytwarzania czynnika Ia stosując opisane powyżej mikrooznaczenie biologiczne z wykorzystaniem Spodoptera exigua. Stwierdzono, że szczepy B. thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21148) i B. thuringiensis subsp. galleriae (zdeponowany w NRRL) wytwarzają czynnik Ia w przybliżeniu w takim samym stężeniu, jak B. thuringiensis subsp. kurstaki.Several species of Bacilli have been evaluated for factor Ia production. The strains were fermented for 72 hours at 30 ° C in a medium containing a carbon source such as starch, starch hydrolyzate or glucose, and a nitrogen source such as protein, protein hydrolyzate or corn steep. Supernatants were tested for factor Ia production using the Spodoptera exigua microbial assay described above. It was found that strains of B. thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 (deposited with the NRRL as NRRL B-21148) and B. thuringiensis subsp. galleriae (deposited with NRRL) produce factor Ia in approximately the same concentration as B. thuringiensis subsp. kurstaki.

Według oznaczenia elektroforezą kapilarną, czynnik Ia wytwarzają również B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. darmstadiensis, B.t. subsp. dendrolimus, B.t. subsp. entomocidus, B.t:. subsp. finitimus, B.t:. subsp. israelensis, B.t:. subsp. kenyae, B.t. subsp. morrisoni, B.t. subsp. subtoxicus, B.t:. subsp. tenebrionis, B.t. subsp. thuringiensis, B.t:. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis i mutant cry- spo- B. thuringiensis subsp. kurstaki.According to the capillary electrophoresis determination, factor Ia is also produced by B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. Darmstadiensis, B.t. subsp. dendrolimus, B.t. subsp. entomocidus, B.t .:. subsp. finitimus, B.t .:. subsp. israelensis, B.t .:. subsp. kenyae, B.t. subsp. morrisoni, B.t. subsp. subtoxicus, B.t .:. subsp. tenebrionis, B.t. subsp. thuringiensis, B.t .:. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis and the cryspo mutant B. thuringiensis subsp. kurstaki.

Do ilościowego oznaczenia czynnika Ia korzystnie stosuje się urządzenie Beckman P/ACE Capillary Electrophoresis System wyposażone w nieopłaszczoną kapilarę o wymiarach 50 mm x 57 cm, 0,2 M bufor fosforanowy pH 6,8, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Objętości próbek wynoszą 20 nl, a czas rozdziału 25 minut.For the quantification of Factor Ia, a Beckman P / ACE Capillary Electrophoresis System device equipped with a 50 mm x 57 cm uncoated capillary, 0.2 M phosphate buffer pH 6.8, voltage 15KV and detection at 200 nm wavelength is preferably used. The sample volumes are 20 nl and the separation time is 25 minutes.

Krzywą standardową tworzy się stosując jako standard oczyszczony czynnik Ia w stężeniach 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml oraz 0,078 mg/ml. Tworzy się liniową krzywą kalibracyjną. Do obliczania stężenia czynnika Ia w każdej próbce stosuje się otrzymane równanie y = mx + b.A standard curve is constructed using purified factor Ia as standard at the concentrations 1.25 mg / ml, 0.625 mg / ml, 0.3125 mg / ml, 0.156 mg / ml and 0.078 mg / ml. A linear calibration curve is created. The equation y = mx + b obtained is used to calculate the concentration of factor Ia in each sample.

Przed każdym rozdzielaniem kapilarę przemywa się buforem do elektroforezy (0,2 M bufor fosforanowy, pH 6,8) w przeciągu trzech minut. Po każdym trwającym 25 minut rozdzielaniu kapilarę przemywa się 1 N NaOH w ciągu 1 minuty, wodą filtrowaną przez HPLC w ciągu 1 minuty, 0,5 M kwasem fosforowym w ciągu 3 minut i wodą filtrowaną przez HPLC w ciągu 1 minuty. Pole powierzchni pod każdym pikiem całkuje się i określa się pole powierzchni piku oraz oblicza się stężenie końcowe na podstawie krzywej standardowej.Before each run, the capillary is washed with electrophoresis buffer (0.2 M phosphate buffer, pH 6.8) for three minutes. After each 25 minute run, the capillary was washed with 1 N NaOH for 1 minute, HPLC filtered water for 1 minute, 0.5M phosphoric acid for 3 minutes, and HPLC filtered water for 1 minute. The area under each peak is integrated and the area of the peak is determined and the final concentration is calculated from the standard curve.

7.5. Ocena produktów B.t.7.5. Product evaluation of B.t.

Ilość czynnika Ia obecnego w różnych komercyjnie dostępnych produktach określono przez elektroforezę kapilarną opisaną powyżej. BACTOSPEiNe™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ i BIOBIT™ uzyskano z Novo Nordisk A/S. XENTARI™ i DIPEL™ uzyskano z Abbot Laboratories, AGREE™ uzyskano z Ciba-Geigy: MVP™ uzyskano z Mycogen i CUTLASS™ uzyskano z Ecogen.The amount of factor Ia present in various commercial products was determined by the capillary electrophoresis described above. BACTOSPEiNe ™, JAVELIN ™, NOVODOR ™, SPHERIMOS ™, BACTIMOS ™, FORAY ™, FLORBAC ™ and BIOBIT ™ were obtained from Novo Nordisk A / S. XENTARI ™ and DIPEL ™ were obtained from Abbot Laboratories, AGREE ™ was obtained from Ciba-Geigy: MVP ™ was obtained from Mycogen and CUTLASS ™ was obtained from Ecogen.

Wyniki przedstawione w tabeli 3 wskazują, że czynnik Ia występuje w zróżnicowanych ilościach, w zakresie od mniej niż 0,001 g Ia/BlU do 0,071 g Ia/BIU.The results in Table 3 show that factor Ia is present in varying amounts, ranging from less than 0.001 g Ia / BlU to 0.071 g Ia / BIU.

184 354184 354

Tabela 3Table 3

Czynnik la w produktach Bacillus thuringiensisThe la factor in Bacillus thuringiensis products

Produkt Product Typ T yp Numer serii Serial number Siła działania The power of action Ia g/BIU Ia g / BIU JAVELINO WG JAVELINO ACC Btk Btk 9942281 9942281 32000 IU/mg 32,000 IU / mg 0,071 0.071 XENTARIO XENTARIO Bta Bta 58715PG 58715PG 15000 IU/mg 15,000 IU / mg 0,06 0.06 agreeó agreeó Bta/Btk Bta / Btk RA2080 RA2080 25000 IU/mg 25,000 IU / mg 0,033 0.033 BIOBITÓ HPWP HPWP BIOBIT Btk Btk 5012 5012 48950 U/mgPIA 48950 U / mg PIA 0,018 0.018 biobitó FC biobitó FC Btk Btk AG46669071 AG46669071 8 BIU/L 8 BIU / L 0,013 0.013 FORAYÓ 48B FORAYÓ 48B Btk Btk BBN7018 BBN7018 12,6 BIU/L 12.6 BIU / L 0,012 0.012 DIPELÓ DIPELÓ Btk Btk 58739PG 58739PG 32000 IU/mg 32,000 IU / mg 0,011 0.011 FORAYÓ 76B FORAYÓ 76B Btk Btk 20,0 BIU/L 20.0 BIU / L 0,007 0.007 BACTOSPEINEÓ BACTOSPEINEÓ Btk Btk BOBOOl BOBOOl 123653 IU/mg 123653 IU / mg 0,003 0.003 BACTOSPEINEÓ BACTOSPEINEÓ Btk Btk KX02A KX02A 100000 IU/mg 100,000 IU / mg 0,003 0.003 BACTOSPEINEÓ BACTOSPEINEÓ Btk Btk WP WP 16000 IU/mg 16,000 IU / mg <0,001 <0.001 NOVODORO NOVODORO Btt Btt 9024 9024 16,3 miliona LTU/qt 16.3 million LTU / qt 9,5x10-9 g/LTU9.5x10- 9 g / LTU FLORBACÓ FLORBACÓ Bta Bta 082-31-1 082-31-1 30000 U/mg E 30000 U / mg E <0,001 <0.001 spherimosó spherimosó B. sphr B. sphr BSN006 BSN006 brak lack mvpó mvpó Btk Btk 21193542 21193542 brak lack cutlassó cutlassó Btk/Btk Btk / Btk brak lack BACTIMOSÓ BACTIMOSÓ Bti Bti B1B0024 B1B0024 11700 IU/mg 11700 IU / mg brak lack

7.6 Próby biologiczne wprowadzania do pokarmu7.6 Biological tests of introduction into food

Aktywność B.t.k. oznaczano w próbach biologicznych przez wprowadzania do sztucznego pokarmu larw Spodoptera exigua w stadium trzeciej wylinki, larw Helicoverpa zea w stadium drugiej wylinki, larw Spodoptera frugiperda w stadium trzeciej wylinki, larw Heliothis virescens w stadium drugiej wylinki, larw Trichoplusia ni w stadium trzeciej wylinki, larw Pseudoplusia includens w stadium trzeciej wylinki, larw Plutella xylostella w stadium trzeciej wylinki, larw Spodoptera littoralis w stadium trzeciej wylinki i larw Mamestra brassicae w stadium trzeciej wylinki.B.t.k.'s activity were determined in biological tests by introducing into artificial food larvae of Spodoptera exigua in the third instar stage, Helicoverpa zea larvae in the second exodus stage, Spodoptera frugiperda larvae in the third exodus stage, Heliothis virescens larvae in the second exuviation stage, Trichoplusia ni larvae in the third exuviation stage, larvae Pseudoplusia includens in the third instar, Plutella xylostella in the third instar, Spodoptera littoralis in the third instar, and Mamestra brassicae in the third instar.

W celu określenia poziomu wzmocnienia w wyniku dodania czynnika Ia do produktów B.t:. i ustalenia zakresu owadów ulegających wpływowi czynnika Ia, przeprowadzono oznaczenia biologiczne przez wprowadzanie do pokarmu. W doświadczeniach z wysokimi stężeniami czynnika Ia wobec Spodoptera exigua (7,4-23,7 g czynnika Ia/BIU), oczyszczony czynnik Ia (70% składnika aktywnego, 30% octanowego jonu o przeciwnym ładunku) stosuje się do wzmocnienia BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej). Pozostałe dane podane w tabeli 4 przedstawiają wzmocnienie BIOBIT™ HPWP (proszek zawiesinowy o wysokiej sile działania) przez czynnik Ia (0,658% aktywnego czynnika Ia). S. Littoralis i M. Brassicae testowano stosując FLORBAC™ HPWP i czynnik Ia.To determine the level of enhancement by adding factor Ia to B.t products :. and to determine the range of insects affected by factor Ia, biological assays were performed by feeding. In experiments with high concentrations of factor Ia against Spodoptera exigua (7.4-23.7 g factor Ia / BIU), purified factor Ia (70% active ingredient, 30% acetate ion with opposite charge) is used to enhance BIOBIT ™ FC ( FC stands for concentrate for liquefaction). The remaining data in Table 4 show the enhancement of BIOBIT ™ HPWP (high potency wettable powder) by factor Ia (0.658% active factor Ia). S. Littoralis and M. Brassicae were tested using FLORBAC ™ HPWP and Factor Ia.

Różne produkty B.t:. zważono i dodano czynnik Ia w ilości odpowiadającej 0,1 do 237 g czynnika Ia/BIU. Objętość regulowano za pomocą 0,1% Tween™. Próbki poddano ultradźwiękom w ciągu 1 minuty, a następnie rozcieńczono do objętości końcowej. Przygotowano również próbki samego pestycydu (bez czynnika wzmacniającego) i substancji odniesienia. Substancje odniesienia obejmują B.t.k.. HD-1-S-1980 (otrzymany z NRRL) o oznaczonej sile działania 16 000 jednostek międzynarodowych (IU) na miligram, i .EWELIN'™ WG o oznaczonej sile działania 53 000 jednostek Spodoptera (SU)/mg.Various B.t products :. was weighed and an amount of factor Ia corresponding to 0.1 to 237 g of factor Ia / BIU was added. The volume was adjusted with 0.1% Tween ™. The samples were sonicated for 1 minute and then diluted to the final volume. Samples of the pesticide alone (without the enhancer) and reference substances were also prepared. Reference substances include Btk. HD-1-S-1980 (derived from NRRL) rated at 16,000 International Units (IU) per milligram, and .EWELIN '™ WG rated at 53,000 Spodopteran Units (SU) / mg .

184 354184 354

Standardowy sztuczny pokarm złożony z wody, agaru, cukru, kazeiny, kiełków pszenicy, parabenu metylowego, kwasu sorbinowego, oleju lnianego, celulozy, soli i witamin przygotowano w ogrzewanym kotle o pojemności 20 litrów. Zapewnia to wystarczającą ilość pokarmu do przetestowania 10 do 12 próbek dla siedmiu różnych stężeń każdej testowanej substancji. Roztwory B.t. poddano kolejnym rozcieńczeniom uzyskując próbki o objętości 16 ml. Każdą próbkę dodawano do 184 g płynnego pokarmu. Mieszaninę następnie homogenizowano, a potem wlano do plastikowej płytki zawierającej 40 pojedynczych komór. Dla każdej partii pokarmu przygotowano po trzy płytki kontrolne. Po schłodzeniu i zestaleniu, do każdej komory wprowadzono jednego owada o znanym wieku (stadium 2-3 wylinki) i płytki przykryto arkuszem przejrzystego mylar z otworami. Płytki umieszczono w statywach i inkubowano przez cztery dni w temperaturze 28°C i 65% wilgotności względnej.Standard artificial food consisting of water, agar, sugar, casein, wheat germ, methyl paraben, sorbic acid, linseed oil, cellulose, salt and vitamins was prepared in a 20 liter heated kettle. This provides enough food to test 10 to 12 samples for seven different concentrations of each test substance. B.t. solutions were subjected to successive dilutions to obtain samples of 16 ml. Each sample was added to 184 g of the liquid food. The mixture was then homogenized and then poured into a plastic plate containing 40 individual chambers. Three control plates were prepared for each batch of food. After cooling and solidifying, one insect of a known age (2-3 moult stage) was introduced into each chamber and the plates were covered with a sheet of clear mylar with holes. The plates were placed in racks and incubated for four days at 28 ° C and 65% relative humidity.

Po czterech dniach określono śmiertelność owadów. Każdą płytkę uderzano mocno 0 blat stołu i larwy, które się nie poruszały, zliczono jako martwe. Obliczono % śmiertelności i dane przeanalizowano wykorzystując równoległą analizę probit. Oceniano LC50, LCę0, nachylenie linii regresji, współczynnik wariacji i siły działania. Próbki analizowano minimum trzy razy lub dopóki trzy wartości siły działania nie różniły się o więcej niż 20% od obliczonej średniej dla każdej próbki. W celu obliczenia, wzrostu aktywności związanego z każdym stężeniem czynnika Ia, w LC50 próbki B.t./czynnik Ia uwzględniano poprawkę, tak aby odzwierciedlało ilość B.t:. w próbce. LC50 sparowanych próbek bez czynnika Ia dzielono przez poprawione wartości LC50 otrzymując wielokrotność obniżenia LC50 związaną z czynnikiem Ia.After four days, the mortality of the insects was determined. Each plate was struck hard against the table top and larvae that did not move were counted as dead. % Mortality was calculated and the data analyzed using parallel probit analysis. The LC 50 , LCę 0 , slope of the regression line, coefficient of variation and potency were assessed. The samples were analyzed a minimum of three times or until the three potency values were not more than 20% different from the calculated mean for each sample. To calculate the increase in activity associated with each concentration factor Ia LC 5 0 of the sample Bt / Ia applies the correction factor to reflect the amount of Bt :. in the sample. LC50 paired samples without Ia factor divided by the corrected LC50 values to give the multiple 0 LC5 reduction factor associated with Ia.

W oznaczeniu z Lobesia bothrana stosowano następującą procedurę. Winoroślą zaatakowane Lobesia bothrana zbierano z nieopryskiwanych upraw i usuwano larwy. Wykonano szereg rozcieńczeń czynnika Ia (250 mg/ml, 500 mg/ml i 1000 mg/ml) w wodzie. Jedną larwę umieszczano na środku szalki Petri'ego. Po zaobserwowaniu picia przez larwę, przenoszono ją na świeżo ścięte winogrona. Larwy utrzymywano w temperaturze 22°C w ciągu 3-4 dni.The following procedure was used in the determination of Lobesia botany. The vines infested with Lobesia bothrana were harvested from unsprayed crops and larvae were removed. A series of factor Ia dilutions (250 mg / ml, 500 mg / ml, and 1000 mg / ml) were made in water. One larva was placed in the center of a petri dish. After the larva was observed drinking, it was transferred to freshly cut grapes. The larvae were kept at 22 ° C for 3-4 days.

Jak przedstawiono w tabeli 4, obserwowano znaczące obniżenia LC50 dla wszystkich gatunków.As shown in Table 4, significant reductions in LC50 were observed for all species.

Tabela 4Table 4

Oznaczenia biologiczne wprowadzania do pokarmuBiological determinations of introduction into food

Owad Insect Czynnik g/BIU G / BIU factor Wzrost aktywności/Wielokrotność obniżenia, LCS0Increase in activity / Multiple decrease, LC S 0 1 1 2 2 3 3 Spodoptera exigua (BIOBITÓ HPWP) Spodoptera exigua (HPWP BIOBIT) 0,1 0.1 1,5 1.5 0,2 0.2 1,7 1.7 2,0 2.0 4,3 4.3 4,0 4.0 7,5 7.5 Spodoptera exigua (BIOBITÓ FC) Spodoptera exigua (BIOBITÓ FC) 7,4 7.4 13 13 15 15 26 26 30 thirty 34 34 118 118 59 59 237 237 79 79 Spodopterafrugiperda (BIOBITÓ HPWP) Spodopterafrugiperda (HPWP BIOBIT) 0,2 0.2 2,2 2.2 0,8 0.8 3,9 3.9 2,0 2.0 7,2 7.2 4,0 4.0 11,6 11.6

184 354 ciąg dalszy tabeli 4184 354 table 4 continues

1 1 2 2 3 3 Trichoplusia ni (BIOBITÓ HPWP) Trichoplusia ni (BIOBITÓ HPWP) 0,1 0.1 1,1 1.1 0,2 0.2 1,2 1.2 2,0 2.0 2,0 2.0 4,0 4.0 3,1 3.1 Pseudoplusia includens (BIOBITÓ HPWP) Pseudoplusia includens (HPWP BIOBIT) 0,1 0.1 0 0 0,2 0.2 1,2 1.2 0,8 0.8 2,1 2.1 2,0 2.0 2,4 2.4 4,0 4.0 3,4 3.4 Plutella xylostella (BIOBITÓ HPWP) Plutella xylostella (HPWP BIOBIT) 0,2 0.2 16 16 0,8 0.8 1,3 1.3 2,0 2.0 1,4 1.4 4,0 4.0 1,9 1.9 Helicoverpa zea (BIOBITÓ HPWP) Helicoverpa zea (BIOBIT HPWP) 3,2 3.2 12,6 12.6 Heliothis virescens (BIOBITÓ HPWP) Heliothis virescens (HPWP BIOBIT) 3,2 3.2 4,2 4.2 Lobesia bothrana (BIOBITÓ HPWP) Lobesia bothrana (HPWP BIOBIT) 2,0 2.0 3,0 3.0 Spodoptera littoralis (FLORBACO HPWP) Spodoptera littoralis (FLORBACO HPWP) 2,0 2.0 8,6 8.6 Mamestra brassicae (FLORBACO HPWP) Mamestra brassicae (FLORBACO HPWP) 2,0 2.0 4,9 4.9

Wzmocnienie przez czynnik Ia różnych produktów wobec Spodoptera exigua określano stosując opisane powyżej oznaczenie biologiczne wprowadzania do pokarmu. Ilość dodanego czynnika Ia/BIU produktu przedstawiono w tabeli 5 poniżej. Mieszaninę czynnik Ia/produkt B.t. wprowadzano do pokarmu na bazie agaru zawierającego kiełki pszenicy i kazeinę. Owady umieszczano na pokarmie na cztery dni w temperaturze 28°C. Śmiertelność rejestrowano i analizowano wykorzystując analizę probit. LC50, I.Cyo i siłę działania obliczano przez porównanie z produktem nie zawierającym czynnika Ia. Wyniki przedstawione w tabeli 5 wskazują, że czynnik Ia wzmacnia różne produkty B.t.k.. i B.t.a. uzyskane z różnych źródeł. Szczepy B.t.. zawarte w tych produktach opisano w części 5.2.The Factor Ia enhancement of various products against Spodoptera exigua was determined using the dietary bioassay described above. The amount of factor Ia / BIU added of the product is shown in Table 5 below. The factor Ia / Bt product mixture was incorporated into an agar-based diet containing wheat germ and casein. The insects were placed on the food for four days at 28 ° C. Mortality was recorded and analyzed using probit analysis. LC 50 , IC yo and potency were calculated by comparison with the product not containing factor Ia. The results presented in Table 5 show that factor Ia potentiates various Btk products. and Bta obtained from various sources. The Bt strains. included in these products are described in section 5.2.

Tabela 5Table 5

Wzmacnianie produktów B.t. wobec Spodoptera exiguaStrengthening B.t. towards Spodoptera exigua

Produkt Product g czynnika Ia na BIU g of factor Ia in BIU Wzrost aktywności/Wielokrotność obniżenia, LC50Increase in activity / Multiple decrease, LC 5 0 1 1 2 2 3 3 BACTOSPEINEÓ WP BACTOSPEINEÓ WP 0,4 0.4 1,04 1.04 1,7 1.7 2,3 2.3 CONDORO CONDORO 0,4 0.4 2,4 2.4 1,7 1.7 5,1 5.1 AGREEÓ AGREEÓ 0,4 0.4 1,1 1.1 1,7 1.7 1,6 1.6

184 354 ciąg dalszy tabeli 5184 354 table 5 continued

1 1 2 2 3 3 CUTLASSÓ CUTLASSÓ 0,4 0.4 1,1 1.1 1,7 1.7 2,5 2.5 MVPÓ MVPO 0,4 0.4 6,0 6.0 1,7 1.7 7,7 7.7 2,0 2.0 12,1 12.1 FLORBACÓ HPWP FLORBACÓ HPWP 0,2 0.2 hi hi 0,8 0.8 2,0 2.0 DIPELÓ 2x DIPELÓ 2x 0,2 0.2 1,2 1.2 0,8 0.8 2,3 2.3 2,0 2.0 3,9 3.9 JAVELINÓ WG JAVELINÓ ACCORDING TO 0,2 0.2 0 0 0,8 0.8 1,08 1.08 2,0 2.0 2,9 2.9 XENTARIÓ XENTARIÓ 0,2 0.2 1,2 1.2 0,8 0.8 1,6 1.6 2,0 2.0 2,4 2.4

7.7 Próby biologiczne na liściach7.7 Biological tests on leaves

Próby biologiczne na liściach prowadzono z larwami Spodoptera exiguana w stadium drugiej wylinki na brokułach, stosując BIOBITÓ FC i czynnik Ia. Stosunek czynnika Ia do BIOBITÓ FC jest taki sam, 2 g czynnika Ia/BIU BIOBITO FC. Brokuły traktowano w objętości nośnika 180 l/ha stosując rozpylacz gąsienicowy. Po wyschnięciu rozpylonego środka liście usuwano, a następnie infekowano larwami Spodoptera exigua w stadium drugiej wylinki. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. 100% śmiertelności obserwowano przy ilości 8,7 BI U/hektar BIOBITÓ FC + czynnik la, podczas gdy sam BIOBITO FC zabija 92% larw w ilości 58,8 BlU/hektar i 8% w ilości 17,6 BlU/hektar. Traktowane rośliny poddano również bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu ośmiu godzin, po czym liście wycięto i zainfekowano. Po ośmiu godzinach na ś^wii^t-Iie, sam BIOBITÓ FC w ilości 58,8 BIU/hektar powodował 27% śmiertelności, podczas gdy BIOBITÓ FC + czynnik Ia powodują 100% śmiertelności w ilości 8,7 BlU/hektar.Leaf bioassays were carried out with second instar Spodoptera exiguan larvae on broccoli using BIOBITÓ FC and factor Ia. The ratio of factor Ia to BIOBITO FC is the same, 2 g of factor Ia / BIU BIOBITO FC. The broccoli was treated in a carrier volume of 180 L / ha using a caterpillar sprayer. After the spray dries, the leaves are removed and then infected with second instar Spodoptera exigua larvae. The results are shown in Table 6. 100% mortality was observed at 8.7 BIU / hectare BIOBITO FC + factor Ia, while BIOBITO FC alone kills 92% of the larvae at 58.8 BU / hectare and 8% at 17.6 BLU / hectare. The treated plants were also exposed to direct sunlight for eight hours, after which the leaves were dissected and infected. After eight hours on springtime, BIOBIT FC alone at 58.8 BIU / hectare caused 27% mortality, while BIOBIT FC + factor Ia caused 100% mortality at 8.7 BLU / hectare.

W oznaczeniu na liściach wykonanym z larwami we wczesnym stadium czwartej wylinki stwierdzono 75% śmiertelności dla samego BIOBITÓ FC w ilości 52 BlU/hektar i 100% śmiertelności dla BIOBITÓ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej) + czynnik Ia w ilości 13 BlU/hektar.In the determination on leaves carried out with early stage fourth instar larvae, 75% mortality was found for BIOBITÓ FC alone in the amount of 52 BlU / hectare and 100% mortality for BIOBITÓ FC (FC stands for a concentrate for obtaining a liquid form) + factor Ia in the amount of 13 BlU / hectare.

Tabela 6Table 6

Oznaczenie biologiczne na liściachBiological determination on leaves

Traktowanie Treatment BlU/hektar BLU / hectare % śmiertelności % mortality Wylinka larwalna Larval moult 1 1 2 2 3 3 4 4 BIOBITÓ FC BIOBITÓ FC 58,8 58.8 92% 92% 2 2 BIOBITÓ FC BIOBITÓ FC 17,6 17.6 8% 8% 2 2 BIOBITÓ FC + 1a BIOBITÓ FC + 1a 8,7 8.7 100% 100% 2 2

184 354 ciąg dalszy tabeli 6184 354 table 6 continued

1 1 2 2 3 3 4 4 BIOBITÓ FC + 8h światła słonecznego BIOBITÓ FC + 8 hours of sunlight 58,8 58.8 27% 27% 2 2 BIOBITÓ FC + Ia + 8h światła słonecznego BIOBITÓ FC + Ia + 8h of sunlight 8,7 8.7 100% 100% 2 2 BIOBITÓ FC BIOBITÓ FC 52 52 75% 75% 4 4 BIOBITÓ FC Ia BIOBITÓ FC Ia 13 13 100% 100% 4 4

7.8. PRÓBY POLOWE7.8. FIELD TESTS

Próby polowe na fasoli odmiany garbonzo (Spodopters exigus) wykazały, że sam BIOB1TÓ FC w ilości 70 BlU/hektar zapewnia 51% zwalczania szkodnika, podczas gdy 2 g czynnika Ia/BIU BIOBITÓ FC w ilości 40 BlU/hektar zapewnia 89% zwalczania (w porównaniu z brakiem traktowania). JAVELINÓ WG w ilości 45 BlU/hektar zapewnia 51% zwalczania.Field trials on Garbonzo beans (Spodopters exigus) showed that BIOB1TÓ FC alone at 70 BLU / hectare provided 51% pest control, while 2 g of Ia / BIU BIOBITÓ FC at 40 BLU / hectare provided 89% of control (in compared with no treatment). JAVELINÓ WG at 45 BLU / hectare provides 51% of control.

Próby polowe na kukurydzy cukrowej (Spodopters frugiperds) wykazały, że przy ilości 39,5 BlU/hektar, 2 g czynnik Ia/BIU BIOBITÓ FC zapewnia 84% zwalczania.Field trials with sweetcorn (Spodopters frugiperds) showed that at an amount of 39.5 BLU / hectare, 2 g of factor Ia / BIU BIOBITÓ FC provided 84% of the control.

7.9. Stosunki oporności7.9. Resistance ratios

Oznaczeniu biologicznemu poddano wrażliwe i oporne kolonie Plutells xylostells. Próbki opornych ciem zebrano z pól z Florydy gdzie rozwinęła się oporność na U.t, w wyniku intensywΛ Λ nej ekspozycji na JAVELINO WG. BIOBITO HPWP z czynnikiem Ia poddano analizie stosując oznaczenie biologiczne z zanurzaniem liści. Oporność na JAVELINÓ i XENTARIÓ określano bez czynnika Ia. Krążki liści kapusty o średnicy 6 cm zanurzono na 10 sekund w jednym z ośmiu różnych stężeń produktów U. t. lub preparatów U. t./czynnik Ia. Stosowano stężenia w zakresie od 1 do 1000 ppm. Krążki liściowe pozostawiano na dwie godzżny do wysclrnięcia na powietrzu, a następnie umieszczono w plastikowych szalkach Petri'ego z larwami w stadium drugiej wylinki (0,2 do 0,4 mg). 25 owadów/dawkę/dzień podwojono otrzymując 50 owadów/dawkę. Po 72 godzinach w temperaturze 27°C rejestrowano śmiertelność. Regresję zależności dawka-śmiertelność analizowano wykorzystując analizę probit. Stosunki oporności obliczono dzieląc wartości LC50 i LC90 dla wrażliwych ciem. Wyniki przedstawiono w tabeli 7 i wskazująone, że BIOBITÓ HPWP ulega wzmocnieniu dla 2 g czynnika Ia/BIU i 4 g czynnika Ia/BIU. Zwłaszcza dla 4 g czynnika Ia/BIU występuje 2-krotne obniżenie stosunku oporności LC50 i 10-krotne obniżenie stosunku oporności LCM.Susceptible and resistant Plutells xylostells colonies were bioassayed. Samples of resistant moths were collected from Florida fields where resistance to Ut developed following intensive exposure to JAVELINO WG. BIOBITO HPWP with factor Ia was analyzed by leaf immersion bioassay. JAVELINÓ and XENTARIÓ resistance was determined without factor Ia. Cabbage leaf discs with a diameter of 6 cm were immersed for 10 seconds in one of eight different concentrations of U.t. products or U.t./factor Ia preparations. Concentrations ranging from 1 to 1000 ppm were used. The leaf discs were allowed to air dry for two hours, then placed in plastic Petri dishes with second instar larvae (0.2 to 0.4 mg). 25 insects / dose / day were doubled for 50 insects / dose. The mortality was recorded after 72 hours at 27 ° C. Dose-mortality regression was analyzed using probit analysis. Resistance ratios were calculated by dividing the LC 50 and LC 90 values for the sensitive moths. The results are shown in Table 7 and indicate that BIOBITH HPWP is enhanced for 2 g of factor Ia / BIU and 4 g of factor Ia / BIU. Especially for factor 4 g Ia / BIU there is a 2 fold decrease in the resistance ratio LC 5 0 and a 10-fold decrease in the LC resistance ratio M.

Tabela 7Table 7

Stosunki oporności Plutells xylostells (opornych na U.t.k.)Resistance ratios of Plutells xylostells (U.t.k. resistant)

Testowany produkt Tested product Stosunek oporności LC5o Resistance ratio LC50 Stosunek oporności LC9) Resistance ratio LC9) JAVELINÓ WG JAVELINÓ ACCORDING TO 302,6 302.6 3829,7 3829.7 BIOBITÓ HPWP HPWP BIOBIT 20,5 20.5 98,5 98.5 2,0 g Ia/BIU BIOBITO HPWP 2.0 g Ia / BIU BIOBITO HPWP 23,2 23.2 88,0 88.0 4,0 g Ia/BIU BIOBITO HPWP 4.0 g Ia / BIU BIOBITO HPWP 10,4 10.4 11,5 11.5 XENTARIÓ XENTARIÓ 9,7 9.7 8,2 8.2

184 354184 354

8. DEPOZYT MIKROORGANIZMÓW8. DEPOSIT OF MICRO-ORGANISMS

Następujące szczepu Bacillus thuriggingsis zdeponowano na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego w Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604,USA.The following Bacillus thuriggingsis strain has been deposited under the terms of the Budapest Agreement with the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Szczep Strain Numer dostępu Access number Data depozytu Date of deposit EMCC0086 EMCC0086 NRRL B-21147 NRRL B-21147 6 października 1993 October 6, 1993

Szczepy zdeponowano na warunkach, które zapewniają, że dostęp do kultur podczas trwania postępowania patentowego tego zgłoszenia patentowego będzie możliwy dla osób określonych przez Kierownika Biura Patentowego i Znaków Towarowych, upoważnionego do tego na podstawie 37 C.F.R. §1.14 i 35 U.S.C. §122. Depozyt stanowi zasadniczo czystą kulturę każdego ze zdeponowanych szczepów Depozyt jest dostępny, zgodnie z wymaganiami zagranicznego prawa patentowego w krajach, w których złożono kopie niniejszego zgłoszenia lub jego odpowiedniki.The strains have been deposited under conditions that ensure that access to the cultures during the pending patent proceedings of this patent application will be available to persons designated by the Head of the Patent and Trademark Office authorized to do so pursuant to 37 C.F.R. §1.14 and 35 U.S.C. §122. The deposit is essentially a pure culture of each of the deposited strains. Deposit is available as required by foreign patent law in countries where copies of this application or its equivalents have been filed.

184 354184 354

Obserwowane nOeObserved nOe

8.28.2

8.068.06

5.175.17

5.17,5.345.17,5.34

(8.06, 5.54) (8.06, 5.17) (8.2, 5.17)(8.06, 5.54) (8.06, 5.17) (8.2, 5.17)

9.9.

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 5.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 38.5 8.0 7.5 7.0 6.5 5.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3

Fig. 4Fig. 4

184 354184 354

Fig. 3Fig. 3

184 354184 354

CMCM

LLLL

184 354184 354

10-krotnie zatężony supematant po fermentacji Btk NB7510-fold concentrated supernatant after Btk NB75 fermentation

IAND

WirowanieSpinning

Sączek o średnicy porów 0,2 μιη Nieoczyszczony supernatant po sączeniu przez sączek o średnicy porów 0,2 pm l0.2 μιη filter Crude supernatant after filtering through a 0.2 μl filter

Ultrafiltracja przez błonę o przepuszczalności do 5 kDa iUltrafiltration through a membrane with a permeability of up to 5 kDa i

Permeat o przepuszczalności do 5 kDa lPermeate with permeability up to 5 kDa l

Wymiana kationowa na SPCationic exchange on SP

Zebrane frakcje po SPCollected fractions after SP

Zatężanie przez liofilizacjęConcentration by lyophilization

IAND

Sączenie molekularne na P2 4/Molecular filtration on P2 4 /

Zebrane frakcje po P2 1Collected fractions after P2 1

SP HPLCSP HPLC

Połączone frakcje zebrane po SP HPLCPooled fractions collected on SP HPLC

IAND

Wielokrotna liofilizacja łMultiple lyophilization

Czysty związekPure relationship

Fig. 1Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 70 copies

Cena 4,00 zł.Price PLN 4.00.

Claims (11)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Sposób wzmacniania aktywnoścć pestycydowej pwstycydu awiązzcego n Bacillus obejmujący hodowlę szczepu Uscillus, izolację czynnika wzmacniającego z supematantu hodowli i stosowanie czynnika wzmacniającego łącznie z pestycydem związanym z Uscillus, znamienny tym, że po hodowli szczepu Uscillus, z supematantu izoluje się, a następnie stosuje łącznie z pestycydem związanym z Uscillus, czynnik wzmacniający o wzorze i posiadający w widmie *H NMR przesunięcia przy około δ 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43,1.A method of enhancing the pesticidal activity of n Bacillus binding pesticide comprising culturing a Uscillus strain, isolating the enhancer from the culture supernatant and using the enhancer together with the Uscillus related pesticide, characterized in that after culturing the Uscillus strain, the supernatant is isolated and then used together with the Uscillus related pesticide, enhancer of the formula i having in the * H NMR spectrum shifts at about δ 1.5, 3.22, 3.29, 3.35, 3.43, 3,58, 3,73, 3,9δ, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2,3.58, 3.73, 3.9δ, 4.07, 4.15, 4.25, 4.35 and in the spectrum of 13 C shifts at about 31.6, 37.2, 51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6, 158,3, 170,7 i 171,3 lub jego sól.51.1, 53.3, 54.0, 54.4, 61.5, 61.6, 64.1, 65.6, 158.3, 170.7 and 171.3 or a salt thereof. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Uscillus hoduje się w podłożu fermentacyjnym.2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the Uscillus strain is grown in a fermentation medium. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik wzmacniający izoluje się z supematantu hodowli przez chromatografię kolumnową.3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the enhancer is isolated from the culture supernatant by column chromatography. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Uscillus stanowi szczep Uscillus thuringiensis.4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the Uscillus strain is a Uscillus thuringiensis strain. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że szczep Uscillus thuringiensis wybiera się z grupy składającej się ze szczepów Uscillus thuringiensis subsp. sizswsi, Uscillus thuringiensis subsp. slesti, Uscillus thuringiensis subsp. csnsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. colmeri, Uscillus thuringiensis subsp. coresnensis, Uscillus thuringiensis subsp. dskots, Uscillus thuringiensis subsp. dsrmstsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Uscillus thuringiensis subsp. entemocidus, Uscillus thuringiensis subsp.finitimus, Uscillus thuringiensis subsp. gsllerise, Uscillus thuringiensis subsp. indisns, Uscillus thuringiensis subsp. isrselensis, Uscillus thuringiensis subsp. kenyse, Uscillus thuringiensis subsp. kumsmotoensis, Uscillus thuringiensis subsp. kurstski, Uscillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Uscillus thuringiensis subsp. jsponensis, Uscillus thuringiensis subsp. mexcsnensis, Uscillus thuringiensis subsp. morrisoni, Uscillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Uscillus thuringiensis subsp. nigerise, Uscillus thuringiensis subsp. ostrinise, Uscillus thuringiensis subsp. pskistsni, Uscillus thuringiensis subsp. pondicheriensis. Uscillus thuringiensis subsp. shsndongiensis, Uscillus thuringiensis subsp. siło, Uscillus thuringiensis subsp. sotto, Uscillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Uscillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Uscillus thuringiensis subsp. thompsoni, Uscillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Uscillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Uscillus thuringiensis subsp. tolworthi, Uscillus thuringiensis subsp. toumsnoffi, Uscillus thuringiensis subsp. wuhsnensis i Uscillus thuringiensis subsp. yunnsnensis.5. The method according to p. The method of claim 4, wherein the Uscillus thuringiensis strain is selected from the group consisting of Uscillus thuringiensis subsp. sizswsi, Uscillus thuringiensis subsp. slesti, Uscillus thuringiensis subsp. csnsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. colmeri, Uscillus thuringiensis subsp. coresnensis, Uscillus thuringiensis subsp. dskots, Uscillus thuringiensis subsp. dsrmstsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Uscillus thuringiensis subsp. entemocidus, Uscillus thuringiensis subsp.finitimus, Uscillus thuringiensis subsp. gsllerise, Uscillus thuringiensis subsp. indisns, Uscillus thuringiensis subsp. isrselensis, Uscillus thuringiensis subsp. kenyse, Uscillus thuringiensis subsp. kumsmotoensis, Uscillus thuringiensis subsp. Kurstski, Uscillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Uscillus thuringiensis subsp. jsponensis, Uscillus thuringiensis subsp. mexcsnensis, Uscillus thuringiensis subsp. morrisoni, Uscillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Uscillus thuringiensis subsp. nigerise, Uscillus thuringiensis subsp. ostrinise, Uscillus thuringiensis subsp. pskistsni, Uscillus thuringiensis subsp. pondicheriensis. Uscillus thuringiensis subsp. shsndongiensis, Uscillus thuringiensis subsp. force, Uscillus thuringiensis subsp. sotto, Uscillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Uscillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Uscillus thuringiensis subsp. thompsoni, Uscillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Uscillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Uscillus thuringiensis subsp. tolworthi, Uscillus thuringiensis subsp. toumsnoffi, Uscillus thuringiensis subsp. wuhsnensis and Uscillus thuringiensis subsp. yunnsnensis. 184 354184 354 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że szczepem Bacillus thuringiensis jest szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.6. The method according to p. The method of claim 4, wherein the Bacillus thuringiensis strain is Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.7. The method according to p. The method of claim 1, wherein the Bacillus related pesticide comprises Bacillus thuringiensis delta endotoxin or a pesticidally active fragment thereof. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment wybiera się z grupy składającej się z CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.8. The method according to p. The method of claim 7, wherein the Bacillus thuringiensis delta endotoxin or a pesticidally active fragment thereof is selected from the group consisting of CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV and CryVI. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIA Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.9. The method according to p. The method of claim 8, wherein the delta Bacillus thuringiensis endotoxin or a pesticidally active fragment thereof is a Bacillus thuringiensis delta CryIA endotoxin or a pesticidally active fragment thereof. 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.10. The method according to p. The method of claim 7, wherein the delta Bacillus thuringiensis endotoxin or a pesticidally active fragment thereof is a Bacillus thuringiensis delta CryIC endotoxin or a pesticidally active fragment thereof. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.11. The method according to p. The method of claim 1, wherein the Bacillus related pesticide comprises Bacillus thuringiensis spores.
PL96323468A 1995-06-06 1996-05-30 Method of producing a factor capable to enhance pesticidal activity of bacillus PL184354B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47028995A 1995-06-06 1995-06-06
PCT/US1996/007807 WO1996039037A1 (en) 1995-06-06 1996-05-30 Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323468A1 PL323468A1 (en) 1998-03-30
PL184354B1 true PL184354B1 (en) 2002-10-31

Family

ID=23866995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323468A PL184354B1 (en) 1995-06-06 1996-05-30 Method of producing a factor capable to enhance pesticidal activity of bacillus

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0831708A1 (en)
JP (1) JP3773265B2 (en)
KR (1) KR19990022529A (en)
AU (1) AU708302B2 (en)
CA (1) CA2223034C (en)
CZ (1) CZ373197A3 (en)
HU (1) HUP9901114A3 (en)
PL (1) PL184354B1 (en)
RU (1) RU2192744C2 (en)
WO (1) WO1996039037A1 (en)
ZA (1) ZA963323B (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919447A (en) * 1996-11-18 1999-07-06 Agraquest, Inc. Strain of bacillus for controlling plant disease
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
CZ20013239A3 (en) * 1999-03-30 2002-04-17 Agraquest, Inc. Biologically pure culture, preparation, isolated metabolite, supernatant, partially purified fraction, water soluble substance, process for producing a fungicidal supernatant, process of the supernatant partial purification, method for increasing insecticidal activity
RU2452181C2 (en) * 2010-07-02 2012-06-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный аграрный университет" (ФГБОУВПО КГАУ) Composition for adaptation of biopesticides
CN117440757A (en) 2021-06-02 2024-01-23 Sds生物技术株式会社 Agricultural/horticultural insecticidal composition and method for controlling agricultural/horticultural insect pests

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR24186A (en) * 1988-04-11 1991-05-30 Monsanto Co YOENTEM TO INCREASE THE ACTIVITY OF POISONOUS POISONS
ZA938163B (en) * 1992-11-05 1994-06-06 Novo Nordisk Entotech Inc Potentiator of bacillus pesticidal activity

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996039037A1 (en) 1996-12-12
AU5935896A (en) 1996-12-24
CA2223034A1 (en) 1996-12-12
JP3773265B2 (en) 2006-05-10
ZA963323B (en) 1997-01-08
CZ373197A3 (en) 1998-05-13
EP0831708A1 (en) 1998-04-01
AU708302B2 (en) 1999-07-29
PL323468A1 (en) 1998-03-30
HUP9901114A2 (en) 1999-07-28
JP2001516201A (en) 2001-09-25
KR19990022529A (en) 1999-03-25
HUP9901114A3 (en) 2001-11-28
CA2223034C (en) 2008-01-08
RU2192744C2 (en) 2002-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2859963B2 (en) Bacillus insecticidal activity enhancer
CA2194658C (en) Novel dipteran-active compound and bacillus thuringiensis strain
DE69531731T2 (en) NEW PESTICIDE COMPILATIONS AND BACILLUS THURINGIENSIS TRIBES
PL184354B1 (en) Method of producing a factor capable to enhance pesticidal activity of bacillus
JP4150071B2 (en) Novel pesticide composition and Bacillus thuringiensis strain
US6268181B1 (en) Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US5976564A (en) Pesticidal composition and bacillus thurigiensis strain
US5976563A (en) Pesticidal composition and Bacillus thuringiensis strain
AU717681B2 (en) Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity
US6277624B1 (en) Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US6406691B1 (en) Potentiator of Bacillus pesticidal activity
MXPA97007017A (en) Novedous pesticide composition and bacillus thuringien seed