CZ373197A3 - Process for preparing potentiator of pesticidal activity of bacillus strain - Google Patents

Abstract

This invention is directed to a method for obtaining a factor which potentiates the pesticidal activity of a Bacillus related pesticide, a chemical pesticide and/or a virus with pesticidal properties.

Description

Způsob výroby potenciátoru pesticidní účinnosti kmene BacillusMethod for producing a potentiator of the pesticidal activity of a Bacillus strain

Tato patentová přihláška je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/295,283, podané. .23.,, srpna 1994, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/146,852, podané 3. listopadu 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/095,240, podané 20. července 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 07/990,202, podané 14. prosince 1992, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 07/971,786, podané 5. listopadu 1992.This patent application is a partial continuation application of patent application No. 08 / 295,283, filed. 23, 1994, which is a partial continuation application of Patent Application No. 08 / 146,852, filed November 3, 1993, which is a partial continuation application of Patent Application No. 08 / 095,240, filed July 20, 1993, which is a partial continuation Patent Application No. 07 / 990,202, filed December 14, 1992, which is a partial continuation application of Patent Application No. 07 / 971,786, filed November 5, 1992.

Oblast technikyTechnical field

Vynález se vztahuje na způsob získání a identifikace faktoru potencujícího pesticidní aktivitu pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.The invention relates to a method for obtaining and identifying a factor which potentiates the pesticidal activity of a pesticide related to a Bacillus species, a chemical pesticide and / or a virus having pesticidal properties.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Škůdci, působící každoročně škody v zemědělství, lesnictví a na obecnén zdraví, představují ztráty v milionech dolarů. Pro zvládnutí takových škůdců byly využity různé strategie ._________________________—------------^- Pests that cause damage to agriculture, forestry and general health every year represent losses in millions of dollars. Various strategies have been used to control such pests ._________________________—------------ ^-

Jedna ze strategií .je užívání chemických*pesticidů se I širokým rozsahem nebo spektrem účinnosti. Použití chemických pesticidů však přináší řadu nevýhod. Tyto pesticidy, zejména pro své široké spektrum účinnosti, mohou ničit orgamismy, na které nebyly zamířeny, jako je blahodárný hmyz a paraziti ničivých škůdců. Navíc jsou chemické pesticidy obvykle ♦ ··»One strategy is to use chemical pesticides with a wide range or spectrum of efficacy. However, the use of chemical pesticides presents a number of disadvantages. These pesticides, especially because of their broad spectrum of activity, can destroy non-target orgamisms such as beneficial insects and parasites of destructive pests. In addition, chemical pesticides are usually ♦ ·· »

IAND

toxické pro zvířata a lidi. Dále si škůdci, na které jsou zaměřeny, často vytvářejí resistenci na takové látky, pokud j im j sou opakovaně vystavovány.toxic to animals and humans. Furthermore, the pests they target often develop resistance to such substances when they are repeatedly exposed to them.

Jinou strategii pro ovládání zamoření hmyzem, houbami a plevelem představuj e^. užití, biopesticidů. Biopesticidy^j-jsou * ** ¹ J ^A' přirozeně se vyskytující pathogeny a/nebo substance těmito pathogeny vytvářené. Výhoda použití biopesticidů tkví v tom, že jsou v celkovém srovnání s chemickými pesticidy obyčejně méně škodlivé pro organismy, na které nejsou zaměřeny, a pro okolní prostředí.Another strategy for controlling insect, fungal, and weed infestation is represented. use, biopesticides. Biopesticides are ^j * ** ¹ J ^' naturally occurring pathogens and / or the substances produced by these pathogens formed. The advantage of the use of biopesticides is that they are generally less harmful to organisms that are not targeted and to the environment compared to chemical pesticides as a whole.

1. Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis

Nejrozšířenějším biopesticídem thuringiensis. Bacillus thuringiensis tyčinkovitá, gram-positivní bakterie, rozšířená, zejména v půdě a v prostředí Během sporulace formě krystalických inklusí, které insekticidní pro citlivé hmyzí larvy řáduThe most widespread biopesticide thuringiensis. Bacillus thuringiensis rod-shaped, gram-positive bacteria, widespread, especially in soil and environment During sporulation form crystalline inclusions, which insecticidal to susceptible insect larvae of the order

- Diptexa a Coleoptera. Inkluse se mohou lišit v a složení. Jsou tvořeny jedním delta-endotoxiny, jejichž velikost se až 140 kDa.- Diptexa and Coleoptera. Inclusions may vary in composition. They consist of one delta-endotoxin whose size is up to 140 kDa.

vnitřnostech larev přeměňovány proteázami toxické polypeptidy způsobující destrukci a konečně uhynutí hmyzu (Hofte a —MicFobi-oíogÍ-cal—RevťewsS3~2A2~^:-~2'55y-.within the larvae, the proteases have been transformed into protease-destroying and ultimately insect-killing polypeptides (Hofte and Microfobobiolog-cal-RevsS3 ~ 2A2 ~ ^: ~ -2'55y-).

w»». Existuje několik kmenů Bacillus thuringiensis, které sew »». There are several strains of Bacillus thuringiensis that are

Bačillas pohyblivá, široce jeBacillas movable, broadly

Je přírodě bohatém na hmyz. vytváří Bacillus thuringiensis inklusí, které jsou hmyzí paraspory ve po požití Lepidoptera, tvaru, počtu nebo více proteiny nazývanými může pohybovat mezi 27 Insekticidní delta-endotoxiny jsou obvykle ve na menší (zkrácené) vyživovacího kanálu Vhiteley, 1989, jako biopesticidy široce užívají v lesnictví, zemědělstvíIt is insect-rich in nature. produces Bacillus thuringiensis inclusions that are insect paraspores in ingestion of Lepidoptera, shape, number or more proteins called can range between 27 Insecticidal delta-endotoxins are usually in the smaller (truncated) nutritional channel Vhiteley, 1989, as biopesticides widely used in forestry, agriculture

V a oblastech obecného zdraví. Bacillus thuringiensis subsp.In and areas of general health. Bacillus thuringiensis subsp.

kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produkují delta-endotoxiny specifické pro Lepidoptera. Delta-endotoxin specifický pro Coleoptera produkuje Bacillus thuringiensis • 4 444 4kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produce delta-endotoxins specific for Lepidoptera. Coleoptera-specific delta-endotoxin is produced by Bacillus thuringiensis • 4,444 4

subsp, tenebrionis (Krieg a spol., 1988, U.S. patent č.subsp, tenebrionis (Krieg et al., 1988, U.S. Pat.

.4,766,203). A dále Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produkuje delta-endotoxin specifický pro Diptera (Goldberg, 1979, U.S. patent č. 4,166,112).4,766,203). Furthermore, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produces a delta-endotoxin specific for Diptera (Goldberg, 1979, U.S. Patent No. 4,166,112).

Pro dvoj křídle škůdce byly popsány i jiné specifické kmeny Bacillus thuringiensis. Byl popsán isolát Bacillus thuringiensis, který je toxický pro Diptera a Lepidoptera (Hodgman a spol. , 1993, FEMS Microbiology Letters 114.Ί7Other specific strains of Bacillus thuringiensis have also been described for the two wings of the pest. Bacillus thuringiensis isolate, which is toxic to Diptera and Lepidoptera, has been described (Hodgman et al., 1993, FEMS Microbiology Letters 114.Ί7).

- 22). Elektroforesa přečištěného krystalu delta-endotoxinu z tohoto isolátu na SDS polyakrylamidovém gelu odhalila tři proteinové species, které souvisejí s toxiny, CrylA(b), CrylB a CrylIA. Byl rovněž popsán isolát Bacillus thuringiensis, který produkuje na Diptera účinnou krystalickou látku složenou z proteinů s molekulovou hmotností 140, 122, 76, 72 a 38 kDa (Payne, 1994, U.S. patent č. 5,275,815). EPO 480,762 uvádí pět kmenů Bacillus thuringensis, z nichž je každý účinný proti dvojkřídlým škůdcům a každý také má jedinečné složení krystalického delta-endotoxinu.- 22). Electrophoresis of the purified delta-endotoxin crystal from this isolate on an SDS polyacrylamide gel revealed three toxin-related protein species, CryIA (b), CryIA and CryIA. Bacillus thuringiensis isolate which produces an active crystalline substance on Diptera composed of proteins having molecular weights of 140, 122, 76, 72 and 38 kDa has also been described (Payne, 1994, U.S. Patent No. 5,275,815). EPO 480,762 discloses five Bacillus thuringensis strains, each of which is effective against double-winged pests and each also has a unique crystalline delta-endotoxin composition.

Bylo popsáno také několik kmenů Bacillus thuringiensis,, které vykazují pesticidní účinnost proti jiným škůdcům, než jsou Lepidoptera, Coleoptera a Diptera. Bylo objeveno pět druhů Bacillus thuringiensis produkujících endotoxiny, které jsou toxické vůči hlíštičím (Edwards, Payne a Soares, 1988, Evropská patentová přihláška č. 0 303 426 Bl). Byl také popsán kmen Bacillus thuringiensis, PS81F, který může být používán při ošetřování lidí a zvířat, hostících parazitická ___________p.ro_t.ozoa__(-Thompson—a—Gae-rtner-;--199±; Evropská patentová ‘ .- -i -Přihláška č. 0 461 799 A2) . Bylo popsáno⁷ několik isolátůSeveral strains of Bacillus thuringiensis have also been described which exhibit pesticidal activity against pests other than Lepidoptera, Coleoptera and Diptera. Five endotoxin-producing endotoxin species that are toxic to nematodes have been discovered (Edwards, Payne and Soares, 1988, European Patent Application No. 0 303 426 B1). A strain of Bacillus thuringiensis, PS81F, has also been described which can be used in the treatment of humans and animals hosted by parasitic ___________ p.ro_t.ozoa __ (- Thompson - and - Gauter -; 199 ± - European patent). Application No. 0 461 799 A2). ^Seven isolates have been described

Bacillus thuringiensis s účinností proti akariosám. Tyto isoláty produkují krystaly složené z proteinůs molekulovou hmotností v (širokém) rozmezí od 35 kDa do 155 kDa (Payne,Bacillus thuringiensis with activity against acariasis. These isolates produce crystals composed of proteins with a molecular weight in the (wide) range of 35 kDa to 155 kDa (Payne,

Cannon a Bagley, 1992, PCT přihláška č. VO 92/19106). Byly rovněž popsány kmeny Bacillus thuringiensis s účinností proti • · « · « *Cannon and Bagley, 1992, PCT Application No. WO 92/19106). Bacillus thuringiensis strains having activity against Bacillus thuringiensis have also been described.

škůdcům patřícím do řádu Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier a Uick, 1992, Evropská patentová přihláška č. 0 516 306 A2), dále s účinností proti škůdcům řádu Hemiptera (Payne a Cannon, 1993, U.S. patent č. 5,262,159), nebo účinností, proti- škodlivým- motolicím''(Hicklě, Sick Γ SchwatT,** Narva a Payne, 1993, U.S. patent . č. U.S. 5,262,399) a s účinností proti škůdcům řádu Phthiraptera (Payne a Hicle, 1993, U.S. patent č. 5,273,746). 0 jiném kmeni Bacillus thuringiensis supsp. kurstaki, VB3S-16, který byl isolován z vlněné stříže australských ovcí, bylo dále zjištěno, že je toxický pro štípavou veš Damalinia ovis, škůdce Phthiraptera (Drummond, Miller a Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60:102 - 103).pests belonging to the order Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier, and Uick, 1992, European Patent Application No. 0 516 306 A2), and further with activity against pests of the order Hemiptera (Payne and Cannon, 1993, US Patent No. 5,262,159), or anti-harmful efficacy (Hickle, Sick-SchwatT, ** Narva and Payne, 1993, US Patent No. 5,262,399) and efficacy against Phthiraptera pests (Payne and Hicle, 1993, US Patent No. 5,262,399). 5,273,746). Another strain of Bacillus thuringiensis supsp. kurstaki, VB3S-16, which was isolated from wool flock of Australian sheep, was further found to be toxic to the splitting louse Damalinia ovis, a pest of Phthiraptera (Drummond, Miller and Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60: 102-103) ).

a pesticidní jsou Lepidoptera-speciíická (cry Diptera-specifická (cry II) III) > 1989, Lepidoptera-specifickáand pesticidal are Lepidoptera-specific (cry Diptera-specific (cry II) III)> 1989, Lepidoptera-specific

V geny Tailorem a spol., 1992, 6:1211-1217) a Nematoda-speciíická(Genes Tailor et al., 1992, 6: 1211-1217) and Nematoda-specific

V a cry VI Feitelsonem a spol.,V and cry VI by Feitelson et al.,

Delta-endotoxiny jsou kódovány pomocí cry (krystalický protein) genů, které jsou obvykle umístěny v plasmidech. Cry geny byly rozděleny do šesti tříd a několika podtříd založených na relativní homologii aminokyselin specifičnosti. Hlavní třídy I) , Lepidoptera- a Coleoptera-specifická (cry (Hófte a Vhiteley, 53:242-255), Coleoptera- a jako cry Microbiology jako cry V a cry Bio/Technology 10:271-275).Delta-endotoxins are encoded by cry (crystalline protein) genes, which are usually located in plasmids. The cry genes were divided into six classes and several subclasses based on the relative amino acid specificity homology. Major Class I), Lepidoptera- and Coleoptera-specific (cry (Hofte and Vhiteley, 53: 242-255), Coleoptera-a as cry Microbiology as cry V and cry Bio / Technology 10: 271-275).

(cry(cry

Diptera-speciíická (cry IV)Diptera-specific (cry IV)

Microbiological Reviews (označovaná Molecular (označovaná 1992,Microbiological Reviews (labeled Molecular (labeled 1992,

Delta-endotoxiny DNA. Delta-endotoxiny mohou anebo nemusí býtDelta-endotoxins of DNA. Delta-endotoxins may or may not be

U některých kmenů byly získávány metodami^rekombinantní získané metodami rekombinantní DNA v krystalické formě.In some strains, recombinant DNA methods were obtained by recombinant DNA methods in crystalline form.

Bacillus thuringiensis se ukázalo, že produkuji tepelně stálý pesticidní analog adenin nukleotidu, známý jako β-exotoxin typu I neboli thuringiensin, který je sám pesticidní (Šebesta a spol., v H.D. Burges [editor], · a ·· *Bacillus thuringiensis has been shown to produce a thermally stable pesticide analog adenine nucleotide, known as β-exotoxin type I, or thuringiensin, which is itself a pesticide (Šebesta et al., In H. D. Burges [editor], · a ·· *

I *« aI * «a

Microbial Control of Pests and Plant diseases, Academie press, New York, 1980, str. 249-281). β-Exotoxin typu I byl nalezen v matečném louhu některých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 701 a skládá seMicrobial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, 1980, pp. 249-281). β-Exotoxin type I was found in the mother liquor of some Bacillus thuringiensis cultures. It has a molecular weight of 701 and is composed

i. adenosinu, __glukosy-a allarové'·kyseliny * (Farkaš^Ja“' spolT,'“i. adenosine, glucose and allaric acids * (Farkas ^J and '' spolT, ''

Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 42:909-929; Lúthy a spol., v Kurstak [editor], Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Okruh jeho hostitelů zahrnuje, ale není omezen na: Musea domestica, Mamestra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus. Má se za to, že toxicitu β-exotoxinu typu I je třeba přičítat inhibici DNA-řízené RNA polymerázy v soutěži s ATP. Bylo prokázáno, že β-exotoxin typu I je kódován cry plasmidem u pěti kmenů Bacillus thuringiensis (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin produkuje Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotyp 9 a Bacillus thuringiensis supsp. darmstadiensis serotyp 10.Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 42: 909-929; Luthy et al., In Kurstak (editor), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp. 35-72). Its host range includes, but is not limited to: Musea domestica, Mamestra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster, and Tetranychus cinnabarinus. The toxicity of β-exotoxin type I is believed to be attributed to the inhibition of DNA-directed RNA polymerase in competition with ATP. Type I β-exotoxin has been shown to be encoded by a cry plasmid in five Bacillus thuringiensis strains (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). It has been found that β-exotoxin produces Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotype 1, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotype 9 and Bacillus thuringiensis supsp. darmstadiensis serotype 10.

Jiný β-exotoxin byl popsán a klasifikován jako β-exotoxin typu II (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu II produkuje Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab, a že je účinný proti Leptinotarsa decemlineata. Struktura β-exotoxinu typu II není zcela známá, ale výrazně se liší od struktury β-exotoxinu typu I, protože na místě adeninu je ---------ps^_eudoufíďinová^-část, ve které je připojení ke kruhu ríbosy • ··· ^.........'v' pozici, jež by měla jinak být obsazena protonem (Levinson, v Hickle a Finch [editoři], Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington D.C., 1990, str. 114-136). Dále je tu pouze jeden signál v protonovém NMR spektru odpovídající basi nucleosidu (při 7,95 ppm) a chybí signál protonu anomerů ribosy (5,78 ppm)íAnother β-exotoxin has been described and classified as type II β-exotoxin (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Type II β-exotoxin has been found to produce Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotype 8ab, and that it is active against Leptinotarsa decemlineata. The structure of β-exotoxin type II is not entirely known, but it differs significantly from that of β-exotoxin type I because adenine is --------- ps ^_ eudoufindicin ^{- the} part in which it is attached to the currant ring • ··· ^.... ..... 'in' position that would otherwise be occupied by a proton (Levinson, in Hickle and Finch [eds], Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington DC, 1990; pp. 114-136). Furthermore, there is only one signal in the proton NMR spectrum corresponding to the nucleoside base (at 7.95 ppm) and the proton signal of the ribose anomers (5.78 ppm) is missing.

«4 4 · · * • · • · ♦· · • ·«4 4 · * · · ·

V 4 4 4 ·’In 4 4 4 ·

Mezi další ve vodě rozpustné látky, které byly isolovány z Bacillus thuringiensis, patří alf a-exotoxin, který je toxický pro larvy Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7); gamma-exotoxiný, což jsou různé enzymy zahrnující lecithinázy, chitinázy-a proteázy, -jejichž— . .Α’φι... □__,+ ·· ' - —Hfc-···^ ·*··· toxické účinky se projevují pouze ve spojení s beta-endotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg a spol., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, který má podobnou strukturu jako beta-exotoxin a je také účinný proti Leptinotarsa decemlineata (Argauer a spol., 1991, J. Entomol.. Sci. 26:206-213); a anhydrothuringiensin (Prystaš a spol..,Other water-soluble substances which have been isolated from Bacillus thuringiensis include alpha-exotoxin, which is toxic to larvae of Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7); gamma-exotoxins, which are various enzymes including lecithinases, chitinases, and proteases, whose. The toxic effects only occur in association with beta-endotoxin or delta-endotoxin (Forsberg et al., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, which has a similar structure to beta-exotoxin and is also active against Leptinotarsa decemlineata (Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213); and anhydrothuringiensin (Prystas et al.,

1975,Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40:1775).1975 Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40: 1775).

2. Zwittermicin2. Zwittermicin

Z Bacillus cereus byla isolována substance, která inhibuje růst rostlinného pathogenu Phyťhophthora medicaginis a omezuje infekci vojtěšky (viz například: U.S. patenty č. 4,877,738 a 4,878,936). Jiná účinnost popsána nebyla. Pro zwittermicin A byla stanovena následuj ící struktura (He a spol., Tet. Lett. 35:2499-2502):A substance that inhibits the growth of the plant pathogen Phytophthora medicaginis and limits the infection of alfalfa has been isolated from Bacillus cereus (see, for example, U.S. Patent Nos. 4,877,738 and 4,878,936). Other efficacy has not been described. For zwittermicin A, the following structure was determined (He et al., Tet. Lett. 35: 2499-2502):

OHOH

H₉NCO-NH-CH₉-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH₉-CH-CH-CH₉-OH conh₂ H ₉ NCO-NH-CH ₉ -CH-NHCO-CH-CH-CH-CH ₉ -CH-CH-CH ₉ -OH conh ₂

OHOH

OHOH

OHOH

Bylo vyvíjeno úsilí dosáhnout u formulací přípravků s Bacillus thuringiensis vyšší mortality. Prostředky pro to zahrnovaly hledání noých kmenů se zvýšenou mortalitou, pokusy o zdokonalení existujících kmenů a pokusy navrhnout efektivnější formulaci kombinací spor Bacillus thuringiensis s novými pesticidními nosiči, chemickými pesticidy anebo zesilovači (viz například U.S. patent č. 5,250,515, inhibitor trypsinu). Z těchto důvodů je. předmětem ^^^..předkládaného—vynálezu— potencovat pesticidní ' účinnost pesticidů.Efforts have been made to achieve higher mortality in formulations of Bacillus thuringiensis. The means for this included the search for new strains with increased mortality, attempts to improve existing strains, and attempts to propose a more effective formulation by combining Bacillus thuringiensis spores with novel pesticidal carriers, chemical pesticides or enhancers (see, e.g., U.S. Patent No. 5,250,515, trypsin inhibitor). For these reasons it is. It is an object of the present invention to potentiate the pesticidal activity of pesticides.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Vynález se vztahuje na způsob získání faktoru, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, zahrnující (a) pěstování kultury kmene Bacillus za vhodných podmínek;The invention relates to a method of obtaining a factor that enhances the pesticidal activity of a Bacillus-related pesticide, comprising (a) culturing a Bacillus strain under suitable conditions;

(b) získání faktoru ze supernatantu kultury ze stupně (a) .(b) recovering the factor from the culture supernatant of step (a).

V typickém provedení je kmen Bacillus volen ze skupiny sestávající z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis a Bacillus thuringiensis. V preferovaném případě je faktor v podstatně čisté formě. Jak se zde definuje, podstatně čistý faktor představuje faktor, který má méně než 10 % kontaminantů, jako je například protein delta-endotoxinu. Tak podstatně čistý faktor lze získat isolací faktoru například pomocí sloupcové chromatografie.Typically, the Bacillus strain is selected from the group consisting of Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis, and Bacillus thuringiensis. In a preferred case, the factor is in substantially pure form. As defined herein, a substantially pure factor is a factor having less than 10% contaminants, such as the delta-endotoxin protein. Such substantially pure factor can be obtained by isolating the factor, for example, by column chromatography.

Získaný faktor je potenciátorem. Jak se zde definuje, potenciátor je substance, která nemá signifikantní pesťicTdní účinnost tak, že by měla například LCg₀ (LC₅q je koncentrace látky nutná k usmrceni 50 % škůdců) více než kolem 3000 pg/g při stanovení bioassayem (viz dále), která zvýšení pesticidní účinnosti pesticidu s druhem Bacillus zhruba alespoň o 50 % zabránění larvárního růstu. Jak bylo zmíněno výše, jiné substance, o nichž je známo, že jsou schopny iThe factor obtained is a potentiator. As defined herein, a potentiator is a substance that does not have significant human activity such that LCg ₀ (LC ₅ q is the concentration of the substance required to kill 50% of pests) is more than about 3000 pg / g as determined by bioassay (see below) which increase the pesticidal activity of a pesticide with Bacillus by at least 50% preventing larval growth. As mentioned above, other substances known to be capable of i

však působí souvisej ícího a nezpůsobuje zvyšovat pesticidní účinnost, jako jsou a exotoxiny, pesticidní účinnost mají.however, it is related and does not increase pesticidal activity, such as and exotoxins, have pesticidal activity.

Ve konkrétním případě je faktor ve inhibitory trypsinu vodě rozpustný. Jak se zde definuje, substance nebo sloučenina je ve vodě rozpustná, pokud se alespoň kolem 1 yng plátky může„rozpustit— ..H*' htUn ^{ř —} v 1 ml vody. Faktor muže také potencovat pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.In a particular case, the factor is water soluble in trypsin inhibitors. As defined herein, a substance or compound is water soluble if at least about 1 YNG slices can "rozpustit- ..h * 'Htun ^{row -} in 1 mL water. The factor may also potentiate the pesticidal activity of a chemical pesticide and / or a virus with pesticidal properties.

Jak se zde definuje, pesticid související s druhem Bacillus je kmen Bacillus (například Bacillus thuringiensis nebo Bacillus subtilis), spora nebo substance, například protein nebo jeho fragment, které jsou účinné proti, nebo které hubí škůdce, anebo mikroorganismus schopný vytvořit gen, v němž je zakódován protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo který hubí škůdce (například delta-endotoxin Bacillu thuringiensis') , a přijatelný nosič (příklady takových nosičů viz níže). Škůdcem může být například hmyz, hlístice, roztoč nebo slimák. Mikroorganismus schopný exprimovat gen kódující protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo hubí škůdce sídlící na povrchu listů rostlin (phylloplane), a/nebo v rhizosféře (půda obklopující kořeny rostlin), a/nebo ve vodném prostředí a je schopný v daném prostředí (úroda a jiné hmyzí lokality) úspěšně soutěžit s divoce se vyskytujícími mikroorgamisny a poskytovat stálé udržování a expresi genu, v němž je zakódován protein druhu Bacillus nebo jeho fragment, který má účinnost proti, anebo zabíjí škůdce. Příklady takových _____ mikroorganismů—předs-t-av-uj-í-r-avšak—nej'sou~cimezeny ná'UakteríěT ' například rodu Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia,As defined herein, a Bacillus-related pesticide is a Bacillus strain (e.g., Bacillus thuringiensis or Bacillus subtilis), a spore or substance, such as a protein or fragment thereof, that is effective or pest control, or a microorganism capable of generating a gene the Bacillus protein or a fragment thereof that is effective against or killing a pest (e.g., Bacillus thuringiensis' delta-endotoxin) is encoded, and an acceptable carrier (see examples below for examples of such carriers). The pest may be, for example, an insect, a nematode, a mite or a slug. A micro-organism capable of expressing a gene encoding a Bacillus protein or fragment thereof which is effective against or kills pests residing on the surface of plant leaves (phylloplane) and / or in rhizosphere (soil surrounding plant roots) and / or in an aqueous environment and is capable of in a given environment (crop and other insect sites) to compete successfully with wild-type microorganisms and provide constant maintenance and expression of a gene that encodes a Bacillus protein or fragment thereof that has activity against or kills pests. Examples of such microorganisms, such as pre-t-av-i-t-but are not limited to, for example, Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia.

Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium,Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium

Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium* Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc,Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc,

Alcaligenes a Clostridium; na řasy, například čeledi Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophycede, Dinophyceae, rAlcaligenes and Clostridium; for algae, for example of the family Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophycede, Dinophyceae, r.

Prymnesiophyceae,Prymnesiophyceae,

Bacíllariophyceae,Bacíllariophyceae,

Euglenophyceae,Euglenophyceae,

·· ·· * * 4 4 «4 4444 4 4444 • • 44 44 4 4 4 4 4 · · 4 · · • ··· • ··· • • 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 o • 4 o β β « 4 «4 4«· » 5 «·» • ♦ • ♦ « « 4 4 4 · 4 · • 44 • 44 «4» «4» 44 * 44 *

Chrysophyceae, Raphidophyceae, Crypt ophyceae,Chrysophyceae, Raphidophyceae, Crypt ophyceae

Xanthophyceae,Xanthophyceae,

Eustigmatophyceae,Eustigmatophyceae,

Prasinophyceae a Chlorophyceae; a na houby, zejména kvasinky, například roduPrasinophyceae and Chlorophyceae; and fungi, especially yeasts, for example of the genus

Saccharomyces'; Cryptócoccus / Klůy veromyces , Sporobolomyces,Saccharomyces'; Cryptococcus / Tusks veromyces, Sporobolomyces,

Rhodotorula a Aureobasidium..Rhodotorula and Aureobasidium ..

Jak se zde definuje, pesticidní účinnost se měří velikostí účinku proti škůdcům při jejich zahubení, nebo při zabránění jejich růstu, anebo při ochraně rostliny před zamořením škůdcem.As defined herein, pesticidal activity is measured by the magnitude of the activity against the pests upon killing or preventing their growth, or protecting the plant from pest infestation.

Získaný faktor může být formulován do kompozice obsahující faktor a pesticidní nosič, právě tak jako faktor a pesticid související s druhem Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Tyto kompozice se mohou užívat k potírání škůdců, snižujíce resistenci škůdce na pesticidy související s druhem Bacillus, což spočívá na vystavení škůdce vůči kompozici, která obsahuje faktor a pesticidně přijatelný nosič, anebo na potenciaci pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Racillus.The obtained factor may be formulated into a composition comprising the factor and the pesticidal carrier, as well as the Bacillus-related factor and pesticide, the chemical pesticide and / or the virus with pesticidal properties. These compositions can be used to control pests, reducing pest resistance to Bacillus-related pesticides, by exposing the pest to a composition comprising a factor and a pesticidally acceptable carrier, or potentiating the pesticidal activity of a Racillus-related pesticide.

Vynález je také zaměřen na způsob identifikace řečeného faktoru zahrnující (a) kultivaci kmene Bacillus·, (b) odebrání supernatantu kultury ze stupně (a) (c) provedení assayů se supernatantem ze stupně (b) pro potenciaci pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus.The invention is also directed to a method for identifying said factor comprising (a) cultivating a Bacillus strain, (b) collecting the culture supernatant of step (a) (c) performing the supernatant assays of step (b) to potentiate a Bacillus-related pesticide.

Přehled obrázků na výkresech _BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS _

-L. +< '· ·' '-L. + <'· ·' '

Obrázek 1 ukazuje schematicky obecný postup použitý pro čistění Ia.Figure 1 shows schematically the general procedure used for purification of Ia.

Obrázek 2 ukazuje NMR spektrum Ia.Figure 2 shows the NMR spectrum of Ia.

Obrázek 3 ukazuje NMR spektrum Ia.Figure 3 shows the NMR spectrum of Ia.

Obrázek 4 ukazuje výsledky NOE experimentů s iFigure 4 shows the results of NOE experiments with i

• · · a* » · • · · and * »· 9 9 *  * • · a · • · a · • · • · • · • · ·· ·· • · • · • • • ·· 9 • ·· 9 • • 9 9 • 4 • 4 * * • 4 9 • 4 9 « « 9 9 • ·♦ · • ♦ · • • a a and a 9 9 9 9 4 4 ··♦ ·· ♦ ··· ··· 9 9

acetylderivátem Ia.acetylderivatem Ia.

Faktor potencuje souvisejícího s. druhem pesticidní aktivitu pesticidu Bacillus a může mít molekulovou hmotnost -od¹ cca “SSO^do' cca 1200 anebo “ν'typickém *přípádě od cca 350 do cca 700.The factor potentiates the related pesticidal activity of the Bacillus pesticide and may have a molecular weight of from about ¹ SSO to about 1200 or "typically" from about 350 to about 700.

Faktor znásobuje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus nejméně zhruba 1,5-krát případně až zhruba 1000-krát, výhodně pak zhruba 100-krát až zhruba 400-krát. V typickém případě znásobuje faktor circa 1,5-krát až circa 1000-krát pesticidní účinnost delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis, včetně, avšak nikoliv pouze Cryl (včetně, avšak nikoliv pouze CrylA, CrylB a CrylC), CrylI, CrylII, CrylV, CryV, nebo CryVI proteinu v jeho původní délce nebo proteolyticky zpracované zkrácené formě. V nejčastějších případech znásobuje faktor delta-endotoxin Bacillu thuringiensis circa 100-krát až circa 400-krát. Faktor může také násobit pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi,The factor multiplies the pesticidal activity of a Bacillus-related pesticide by at least about 1.5-fold or up to about 1000-fold, preferably about 100-fold to about 400-fold. Typically, a factor of circa 1.5 to 1000 times the pesticidal activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin, including but not limited to Cry1 (including but not limited to Cry1A, Cry1B and Cry1C), CryIII, CryIII, CryIV, CryV , or a CryVI protein in its original length or a proteolytically processed truncated form. In the most common cases, the Bacillus thuringiensis delta-endotoxin factor multiplies circa 100 to 400 times. The factor may also multiply the pesticidal activity of a chemical pesticide and / or a virus with pesticidal properties,

Faktor může být také ve vodě rozpustný, stálý ve vodě až circa do 100 C nejméně po dobu asi 5 minut, stálý při vystavení přímému slunečnímu světlu nejméně po dobu asi 10 hodin, a/nebo stálý při přibližně pH 2 asi 10 dní. Faktor může mít 13 uhlíků. K tomu dále může mít faktor v ^H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35,_______________________The factor may also be water soluble, stable in water up to about 100 ° C for at least about 5 minutes, stable when exposed to direct sunlight for at least about 10 hours, and / or stable at about pH 2 for about 10 days. The factor may have 13 carbons. In addition, the factor in the 1 H NMR spectrum may have chemical shifts around δ 1.5; 3.22; 3.29; 3.35; 3.43; 3.58; 3.73; 3.98; 4.07; 4.15; 4.25; 4.35, _______________________

V nejčastějších typických případech má řečený faktor -w-‘ strukturu Ia nebo je jeho solí.In the most common cases, said factor -w- má has the structure Ia or is a salt thereof.

OH NH₀NHOH NH ₀ NH

I III II

H₀NCO-NH-CH₀-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH₀-CH-CH-CH~-OHH ₀ NCO NH CH _{0 -CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-0-CH-CH-CH-OH}

I í I ² 1I í I ² 1

C0NH₂ OH OH OH (Ia) φφ *··· *C0NH ₂ OH OH OH (Ia) φφ * ··· *

• Φ• Φ

Sůl by měla být schopná potencovat s druhem Baciílus.The salt should be able to potentiate with the species Baciílus.

pesticid související •Φ «··· * 9 9pesticide related • Φ «··· * 9 9

Φ Φ ·** »·.** Φ · ** ».

ΦΦ • » * » Φ Φ ·♦ ♦ΦΦΦ »» »» »»

Φ Φ » *Φ Φ »*

1. Získávání faktoru1. Obtaining factor

Faktor může být získán z kmeneThe factor may be obtained from a strain

Baciílus subtilis, Baciílus licheniformis thuringiensis) v třepacích nádobkách nebo V typickém provedení lze získat půdou Bacillu thuringiensis, na Baciílus thuringiensis thuringiensis subsp. aizawai, galleriae, Baciílus Bači HusBaciílus subtilis, Baciílus licheniformis thuringiensis) in shake flasks or, typically, can be obtained with Bacillus thuringiensis soil, on Baciílus thuringiensis thuringiensis subsp. aizawai, galleriae, Bacacius Baci Hus

Baciílus (například a Baciílus ve fermentoru. faktor z kapaliny nad živnou což zahrnuje, ale neomezuje se subsp. kurstaki, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis thuringiensis subsp.Baciílus (for example, and Baciílus in the fermenter. Factor from supernatant fluid including, but not limited to, subsp. Kurstaki, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. Thuringiensis thuringiensis subsp.

thuringiensis subsp. thuringiensis, subsp. alesti, Baciílus thuringiensis Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. dendrolimus, subsp. finitimus, Baciílus thuringiensis subsp. Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. subtoxicus, subsp. toumanoffi a Baciílus israelensis. V subsp. entomocidus, tenebrionis, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. canadiensis, darmstadiensis, Baciílus Baciílus thuringiensis kenyae, morrisoni, Baciílus Baciílus thuringiensis thuringiensis subsp.thuringiensis subsp. thuringiensis, subsp. alesti, Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. dendrolimus subsp. finitimus, Baciillus thuringiensis subsp. Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. subtoxicus subsp. toumanoffi and Baciílus israelensis. In subsp. entomocidus tenebrionis, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. canadiensis, darmstadiensis, Baciillus Baciillus thuringiensis kenyae, morrisoni, Baciillus Baciillus thuringiensis thuringiensis subsp.

preferovaném provedeni se ’ faktor získá z kapaliny nad kulturou Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillu thuringiensis subsp. aizawai, nebo Bacillu thuringiensis subsp. galleriae anebo jejich mutantů, které .maj.í__podsXatně—stejnou—potencřační účinností V typickém 'spo-mutantu BacilluIn a preferred embodiment, the factor is obtained from a culture liquid of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, or Bacillus thuringiensis subsp. galleriae or mutants thereof, which have substantially the same potentiating activity in a typical Bacillus spo-mutant

„.y proveden i se faktor získává z crythuringiensis subsp. kurstaki.The factor is obtained from crythuringiensis subsp. kurstaki.

Baciílus může být kultivován a fermentačních technik, které jsou v a spol., 1969, J.Bacillus can be cultured and the fermentation techniques described in et al., 1969, J.

a spol., za použití medií oboru běžné (viz na příklad Rogoff a spol., 1969, J. Intervertebrate Path. 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, J. Intervertebrate Path. 18:353-358; Dulmage a spol., v Microbial Control of Pests and !et al., using the media of the art (see, for example, Rogoff et al., 1969, J. Intervertebrate Path. 14: 122-129; Dulmage et al., 1971, J. Intervertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage et al., in Microbial Control of Pests and!

«· ·«··«· ·« ··

Plant Ďiseases, H.D. Burges, editor, Academie Press, N.Y. , 1980). Po dokončení fermentačního cyklu může být kapalina nad kulturou získána po oddělení spor Bacillu thuringiensis a krystalů z fermentační živné směsi v oboru dobře známými prostředky, jako je centr .i f ugování a/nebo _ ultraf iltrace ·;· -— Faktor se nalézá v kapalině nad kulturou a může íbýt získán v oboru dobře známými způsoby, například ultrafiltrací, odpařením nebo sušením rozprašováním. Tento postup je podrobněji popsán v následujícím oddílu.Plant Ďeases, H.D. Burges, editor, Academic Press, N.Y. , 1980). Upon completion of the fermentation cycle, the culture liquid may be recovered after separation of Bacillus thuringiensis spores and crystals from the fermentation broth by well-known means in the art, such as centrifugation and / or ultrafiltration. culture and may be obtained by methods well known in the art, for example by ultrafiltration, evaporation or spray drying. This procedure is described in more detail in the following section.

Čistění faktoru může být provedeno různými v oboru známými procedurami, včetně, nikoliv však pouze, chromatografických (například iontoměniče, afinitní a rozdělovači kolonová chromatografie), elektroforetických procedur, diferenční rozpustnosti, extrakce, anebo jakékoliv standardní techniky známé v oboru.Factor purification can be accomplished by various procedures known in the art, including, but not limited to, chromatographic (e.g., ion exchange, affinity and partition column chromatography), electrophoretic procedures, differential solubility, extraction, or any standard techniques known in the art.

Potencující účinnost faktoru pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, s virem majícím pesticidní účinnost nebo s chemickým pesticidem proti různým škůdcům může být stanovena v oboru známými postupy jako je přidávání do umělé hmyzí výživy, překrývání umělé výživy, natírání listu, namáčení listu a postřik. Konkrétní příklady takových zkoušek jsou popsány níže.The potentiating efficacy of a pesticide activity factor related to a Bacillus species, a virus having pesticidal activity or a chemical pesticide against various pests can be determined by methods known in the art such as adding to artificial insect nutrition, feeding overlap, leaf coating, leaf soaking and spraying. Specific examples of such assays are described below.

2. Kompozice obsahující faktor2. A composition comprising a factor

Faktor získaný z mutantu podle tohoto vynálezu se může formulovat samostatně, nebo s pesticidem souvisejícím s_dr.uhem_ Baci-llus-,—k-terý-;—jak—je^—s vr chu-qlefl no váno, j e kmenem Bacillus, sporou, proteinem nebo fragmentem/‘nebo jinou jeho substancí, s účinností proti, nebo která hubí škůdce nebo chrání rostliny proti škůdci, nebo a/nebo s entomopathogenním do pesticidní kompozice/í, roztok, emulse, prachový pesticidem nosičem, suspense, dále virem což pudr, s chemickým a přijatelným je například dispersibilní «· ♦* · · granule, prach ulpívající po zvlhčení, koncentrát pro emulsi, aerosol nebo obalované granule. Příklady takových druhůThe factor obtained from the mutants of the invention may be formulated alone or with related pesticide Bacillus s_dr.uhem_ -, - K-esters -, - as-is ^- VR-chu well qlefl a bath, is a Bacillus strain, spore, protein or a fragment / or other substance thereof, with or against pest control or pest control, and / or entomopathogenic to the pesticidal composition (s), solution, emulsion, powdered pesticide carrier, suspension, powder, for example, dispersible granules, wetting dust, emulsion concentrate, aerosol or coated granules are suitable and chemically acceptable. Examples of such species

Bacillus zahrnují, avšak nejsou omezeny na BacillusBacillus include, but are not limited to, Bacillus

TM thuringiensis subsp. kurstaki (na trhu jako DIPEL od Abbott _Laboratories,·- -lne. , JAVELUN^ od‘'Sandoz ,* ΒΙΟΒΙΤ^ od Novo Nordisk A/S, FORAY^ od Novo Nordisk A/S, BIOCOT™ od Novo Nordisk A/S, MVP^ od Mycogen, BACTOSPEINE^ od Novo Nordisk A/S a THURICIDE^ od Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawaí (na trhu jako FLORBAC^ od Novo Nordisk A/S a XENTARI^M _od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (na trhu jako NOVODOR™ od Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ od Sandoz, M-TRAK™ a M-ONE™ od Mycogen a DTERRA od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus TM thuringiensis subsp. israelensis (na trhu buď jako BACTIMOS ^J nebo SKEETAL^M _od Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ od Sandoz, a VECTOBAC^ od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (na trhu jako FOIL^ od Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawaí (na trhu jako CONDOR od Ecogen a AGREE^^ od Ciba Geigy); Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (na trhu jako CUTLASS^ odTM thuringiensis subsp. kurstaki (in the market as DIPEL by Abbott _Laboratories, · -lne., JAVELUN ^ by''Sandoz, * ΒΙΟΒΙΤ ^ by Novo Nordisk A / S, FORAY ^ by Novo Nordisk A / S, BIOCOT ™ by Novo Nordisk A / S , MVP ® from Mycogen, BACTOSPEINE ® from Novo Nordisk A / S and THURICIDE ® from Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (marketed as FLORBAC ^ from Novo Nordisk A / S, and XENTARI M ^ d _of Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (marketed as NOVODOR ™ from Novo Nordisk A / S, TRIDENT ™ from Sandoz, M-TRAK ™ and M-ONE ™ from Mycogen and DTERRA from Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus TM thuringiensis subsp. israelensis (marketed either as BACTIMOS SKEETAL ^J or M ^ d _by Novo Nordisk A / S, TEKNAR ™ from Sandoz and VectoBac ^ from Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis kurstaki / tenebrionis (marketed as FOIL ® from Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki / aizawai (marketed as CONDOR from Ecogen and AGREE ^^ from Ciba Geiga); Bacillus thuringiensis kurstaki / kurstaki (marketed as CUTLASS ^ from

Ecogen). Protein související vybrán ze skupiny, neomezené CrylII, CrylV, CryV a Cry VI. například regulátor hmyzího karbamát jako thiodicarb a s druhem Bacillus může být však jenom, na Cryl, CrylI, Chemickým pesticidem může být růstu jako diflubenzuron, methomyl, organofosfát jako chlorpyrifos, pyrethroid jako cypermethrin a esfenvalerate. anorganický fluorid jako kryolit a pyrrol^Entomopathogenní virus muže představovat baculovirus, například virus nukleární polyhedrosis (NPV) Autographa californica, NPV Syngrapha falcifera, virus granulosis (GV) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Limantria dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NPV Neodiprion lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brillians ··· ♦ « 44 ···♦ • 4 4 ·* 4* · ♦·Ecogen). Protein related selected from the group of unrestricted CryIII, CryIV, CryV and Cry VI. for example, an insect carbamate regulator such as thiodicarb and with Bacillus can only be on Cry1, CryIII. The chemical pesticide can be growth such as diflubenzuron, methomyl, organophosphate such as chlorpyrifos, pyrethroid such as cypermethrin and esfenvalerate. an inorganic fluoride such as cryolite and pyrrole may be a baculovirus, for example Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (NPV), Syngrapha falcifera NPV, Cydia pomonella virus (GV), Heliothis zea NPV, Limantria dispar NPV, Orgy spp. NPV NPV Neodiprion lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brillians ··· 44 «45 ··· ♦ • 4 4 · * 4 * · ♦ ·

4·4· 9 ·9 9*4 · 4 · 9 · 9 9

4 · 9 4« »«« 9 ά 9. ·· · «··>·«« ··· 444 ·* * a NPV Endopiza viteana Clemens.4 · 9 4 «9» 9 · 9. ·· · 444 · * * and NPV Endopiza viteana Clemens.

Ve směsích, které obsahují substanci a pesticid související s druhem Bacillus, může být substance přítomna v množství nejméně asi 0,1 g/BIU nebo 0,05 g faktoru na g ...delta-endotoxinu nebo spory¹ bacilu,”“volívá sě“ ás*i 300 g/BIÚ nebo 150 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu, nejlépe pak 2 g/BIU nebo 1 g substance na g delta-endotoxinu nebo spory bacilu. Jak se zde definuje, BIU je miliarda mezinárodních jednotek, jak se určuje bioassayem. Při bioassayi je vzorek srovnáván se standardním referenčním materiálem druhu Bacillus, za použití Trichoplusia ni nebo jiného škůdce jako standardního testovacího hmyzu. Potence se určí vydělením referenčního standardu LC^q a pak násobením potencí referenčního standardu.In mixtures containing a substance and a pesticide related to Bacillus, the substance may be present in an amount of at least about 0.1 g / BIU or 0.05 g factor per g ... delta-endotoxin or spore ¹ bacillus, " 300 g / BIU or 150 g of substance per g of delta-endotoxin and bacillus spores, preferably 2 g / BIU or 1 g of substance per g of delta-endotoxin or bacillus spores. As defined here, the BIU is a billion international units, as determined by bioassay. In bioassay, the sample is compared to a Bacillus standard reference material using Trichoplusia ni or another pest as a standard test insect. Potency is determined by dividing the reference standard LC ^ q and then multiplying the potencies of the reference standard.

V dalším provedení může komposice obsahovat faktor v podstatně čisté formě, nebo faktor z kapaliny nad kulturou bacilu ve vysušené, koncentrované nebo kapalné formě a pesticidně přijatelný nosič, jak je níže na příkladech vyloženo. Tato kompozice může být na rostlinu aplikována odděleně, například na transgenní rostliny. Ve specifickém případě lze kompozici aplikovat na rostlinu již před tím obsahující a exprimující gen Bacillus thuringiensis. V jiném případě je možné kompozici aplikovat na rostlinu, která byla kompozici Bacillus thuringiensis vystavena dříve. Při dalším případě lze kompozici aplikovat v jiných prostředíchIn another embodiment, the composition may comprise a factor in substantially pure form, or a factor from a liquid above the bacilli culture in a dried, concentrated or liquid form and a pesticidally acceptable carrier, as exemplified below. The composition may be applied separately to the plant, for example transgenic plants. In a specific case, the composition can be applied to a plant previously containing and expressing the Bacillus thuringiensis gene. Alternatively, the composition may be applied to a plant previously exposed to the Bacillus thuringiensis composition. In another case, the composition can be applied in other environments

I dvojkřídlého škůdce/ů jako například ve vodě nebo v půdě, ~Koncentrace substance v kompozici je asi od 0,001 % do asi % hmotnostních.Even the double leaf pest (s) such as water or soil, the concentration of the substance in the composition is from about 0.001% to about% by weight.

Kompozici obsahující substanci a navíc ještě pesticidně přijatelný nosič ke kontrole škůdce lze používat také ke snížení resistence škůdce na pesticid. Alternativně je možné používat kompozici k potencování pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus. V jednom z provedení se kompozice aplikujeA composition comprising a substance and, in addition, a pesticidally acceptable carrier for controlling the pest can also be used to reduce the resistance of the pest to the pesticide. Alternatively, the composition may be used to potentiate a Bacillus-related pesticide. In one embodiment, the composition is applied

• • ·· ···· ·· ···· » 3 Φ »3 Φ « · · «· · • ··· • ··· ♦ ♦ • • ♦ · · ♦ · · • · · • · · • • ♦ ♦ ♦ ·♦· · ♦ · · · · 15 15 Dec • « • « • • © © * · * · ··· ··· ♦ ·· ♦ ·· ·· · ·· ·

ve stejném čase jako pesticid v množství alespoň kolem 2 g substance/BIU až do případných cca 300 g substance/BIU. V jiném provedení lze kompozici aplikovat do zhruba 24 hodin po pesticidu jako adjuvans pro rozvinutí působivosti residuálniho-pesticidu .* *—— -·=*· -·—'· - “ *“at the same time as the pesticide in an amount of at least about 2 g of substance / BIU, up to a possible about 300 g of substance / BIU. In another embodiment, the composition can be applied within about 24 hours of the pesticide as an adjuvant to develop the efficacy of the residual-pesticide. * * —— - · = * · - · - '· - “*"

Takové, svrchu uváděné kompozice, lze získat po přidání povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, ochranného prostředku, zvlhčovadla, chuťového stimulantu, atraktantu, kapsulačního činidla, plnidla, emulsifikátoru, barviva, ochrany proti UV záření, pufru, zkapalňujícího činidla nebo jiných komponent, které usnadňují manipulaci a aplikaci zaměřenou na určité škůdce.Such compositions may be obtained by the addition of a surfactant, inert carrier, preservative, humectant, flavor enhancer, attractant, capsule, filler, emulsifier, colorant, UV protection, buffer, liquefying agent or other components which facilitates the handling and application of specific pests.

Vhodná povrchově aktivní činidla jsou anionaktivní sloučeniny jako karboxyláty, například kovové soli mastných kyselin o dlouhém řetězci; N-acylsarkosinát; mono- nebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů či soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsíran sodný, oktadecylsíran sodný nebo cetylsíran sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarylsulfonáty jako alkylbenzensulfonáty, nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, například butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondensačních produktů naftalenu a formaldehydu; soli sulfonovaných kondensačních produktů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty například sulfonovaný kondensační produkt olejové kyseliny a N-methyltaurinu nebo dialkyl '' ^{IJ,lu n}sulfosukcináty, například dioktyl sulfosukcinát sodný. Mezi neionogenními činidly se pak používají kondensační produkty ethylenoxidu a esterů mastných alkoholů, amidů mastných kyselin, nebo alkyl- či alkenylfenolů s mastnými alkyly či alkenyly, dále estery polyhydroxylkoholetherů například estery sorbitolu a mastných kyselin, kondensační produkty ·· ···*Suitable surfactants are anionic compounds such as carboxylates, for example, metal salts of long chain fatty acids; N-acyl sarcosinate; mono- or diesters of phosphoric acid with fatty alcohol ethoxylates or salts of such esters; fatty alcohol sulfates such as sodium dodecyl sulfate, sodium octadecyl sulfate or sodium cetyl sulfate; ethoxylated fatty alcohol sulfates; ethoxylated alkylphenol sulfates; lignin sulfonates; petroleum sulfonates; alkylarylsulfonates such as alkylbenzenesulfonates, or lower alkylnaphthalenesulfonates, for example butylnaphthalenesulfonate; salts of sulphonated naphthalene and formaldehyde condensation products; salts of sulfonated phenol and formaldehyde condensation products; or more complex sulfonates such as amidesulfonates, for example, the sulfonated condensation product of oleic acid and N-methyltaurine, or dialkyl 1, 1 ^{, 6-} sulfosuccinates, for example sodium dioctyl sulfosuccinate. The nonionic agents include the condensation products of ethylene oxide and fatty alcohol esters, fatty acid amides, or alkyl- or alkenylphenols with fatty alkyls or alkenyls, as well as polyhydroxyl alcohol ethers such as sorbitol fatty acid esters, condensation products ·· ··· *

·»·· · »·· • • 9'« 9 '« » « ·· »« ·· • • • · · • · · • • • < • < • • ··> ··>

• * • * « « « · «· • • ♦ · ♦ · • • ♦ ♦ ♦ ♦

takových esterů a ethylenoxidu, například estery mastných kyselin a polyoxyethylensorbitolu, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenícké glykoly jako 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, nebo ethoxylované acetylenícké glykoly. Příklady^.kationaktivních«-povrchově“ ,... . - ·· '.....such esters and ethylene oxide, for example fatty acid esters of polyoxyethylene sorbitol, block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, acetylenic glycols such as 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, or ethoxylated acetylenic glycols. Examples of cationic &quot; surface &quot; - ·· '.....

aktivních činidel představuji například alifatické mono-, dinebo polyaminy ve formě acetátů, naftenátů nebo oleátů, dále kyslík obsahující amin jako aminoxid polyoxyethylenalkylaminu, potom amidovými skupinami seřetězený amin, získaný kondensací karboxylové kyseliny s di- či polyaminem anebo kvarterní amoniová sůl.the active agents are, for example, aliphatic mono-, di- or polyamines in the form of acetates, naphthenates or oleate, an oxygen-containing amine such as polyoxyethylenalkylamine amine oxide, then amide-chained amine obtained by condensation of a carboxylic acid with di- or polyamine or quaternary ammonium salt.

Příklady inertních materiály jako kaolin, fylosilikáty, uhličitany, materiálů zahrnuj i anorganické slídu, sádru, umělé hnojivo, sírany nebo fosforečnany, dále i organické materiály jako cukr, škroby anebo botanické materiály jako lesní nebo cyklodextriny, produkty, korek, rozemleté kukuřičné palice, rýžové slupky, slupky burských oříšků a skořápky vlašských ořechů.Examples of inert materials such as kaolin, phyllosilicates, carbonates, materials include inorganic mica, gypsum, fertilizer, sulphates or phosphates, organic materials such as sugar, starches or botanical materials such as forest or cyclodextrins, products, cork, ground corn sticks, rice hulls, peeled hulls and walnut shells.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě vhodné pro přímou aplikaci, nebo jako koncentrát či základní směs, která před aplikací vyžaduje zředění příslušným množstvím vody nebo jiného ředidla. Koncentrace pesticidu se bude měnit v závislosti podle povahy jednotlivé formulace, konkrétně podle toho, zda je to koncentrát, nebo zda je pro přímé použití. Kompozice obsahuje 1 až 98 % pevného nebo kapalného inertního nosiče a 0 až 50 %, nejlépe ______0,-1—až—50—%—povrchově aktivního Činidla. Kompozice se .. L..ri-ΐί-aplikuj i v dávkách určených pro komerční produkt, nejlépe kolem 0,01 až 5,6 kg/ha (0,01 až 5,0 lb/akr), pokud jsou v suchém stavu a kolem 0,0^ až 1/ha (0,01 až 25 pint/akr), pokud jsou kapalné.The compositions of the present invention may be in a form suitable for direct application, or as a concentrate or masterbatch that requires dilution with an appropriate amount of water or other diluent prior to administration. The concentration of the pesticide will vary depending on the nature of the particular formulation, namely whether it is a concentrate or whether it is for direct use. The composition comprises 1 to 98% solid or liquid inert carrier and 0 to 50%, preferably 0.1% to 50% surfactant. The compositions are also applied at dosages intended for a commercial product, preferably about 0.01 to 5.6 kg / ha (0.01 to 5.0 lb / acre) when dry. and about 0.0 to 1 / ha (0.01 to 25 pints / acre) when liquid.

Podle dalšího způsobu provedení může být krystalický delta-endotoxin Bacillu thuringiensis a/nebo faktor předAccording to a further embodiment, the crystalline Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and / or the factor may be before

9» * 9 »* • ♦· • ♦ · 9999 9999 ♦ 9 » »· ♦ 8 »» · ·· · 9 9 • • » ··· « »···« e 99 e 99 • • 9 · 9 · 9 · 9 · 9 9 9 9 '9 '9 • · ·· • · ·· 9 · 9 · 9 9 17 ........... 17 ........... *·· '« 9 * ·· '«9 4 4

formulací ošetřen tak, aby byla prodloužena pesticidní účinnost při jeho aplikaci v prostředí ničeného škůdce, pokud toto předběžné ošetření neničí krystalický delta-endotoxin nebo substanci. Takové ošetření nuže být uskutečněno ^{k t} 'chemickými¹ a/neho fysikálními prostředky, pokud toto ošetření neovliní zhoubně vlastnosti směsi/í. Mezi příklady chemických činidel patří, ale nejsou omezeny na halogenační činidla, aldehydy jako formaldehyd a glutaraldehyd, činidla proti infekci jako zephiran chlorid, alkoholy jako isopropanol a ethanol a histologické fixativy jako Bouin-ův fixativ a Hclly-ho fixativ (viz například Humason, Animal Tissue Techniqes, V.H. Freeman and Co., 1967).If the pretreatment does not destroy the crystalline delta-endotoxin or substance, the formulation is treated so as to prolong the pesticidal activity when applied in a pest control environment. Such treatment can be by ^{kt '1} and chemical / physical means therefrom, if such treatment neovliní deleterious properties of the mixture / s. Examples of chemical agents include, but are not limited to, halogenating agents, aldehydes such as formaldehyde and glutaraldehyde, anti-infection agents such as zephiran chloride, alcohols such as isopropanol and ethanol, and histological fixatives such as Bouin's fixative and Hclly's fixative (see, e.g., Humason, Animal Tissue Techniqes, VH Freeman &amp; Co., 1967).

Kompozice podle vynálezu lze aplikovat přímo na rostlinu například postřikem nebo poprášením v době, kdy se na rostlině začal objevovat škůdce nebo jako ochranné opatření před jeho příchodem. Mezi rostliny, které lze chránit v rozsahu tohoto vynálezu patří, ale nejsou omezeny .jen na ně: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (vojtěška, fazole, čočka, hrách, sója), olejňiny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta) , citrusové ovoce (poměranč,e_._ci.tronv-.zelí a jiné košřáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, trávníkové rostliny, tabák, ořechy, káva, třtina cukrová, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, u18The compositions of the invention can be applied directly to the plant, for example by spraying or dusting, at the time when the plant began to appear on the plant or as a protective measure before it arrives. Plants which can be protected within the scope of this invention include, but are not limited to: cereals (wheat, barley, rye, oats, rice, sorghum and related crops), beet (sugar beet, fodder beet), stone fruit, pips and soft fruits (apples, pears, plums, peaches, almonds, cherries, strawberries, raspberries, blueberries), legumes (alfalfa, beans, lentils, peas, soybeans), oilseeds (rape, mustard, poppy, olives, sunflower, coconut, castor oil, castor oil, cocoa beans, groundnuts), cucumber plants (cucumbers, pumpkins, melons), fibrous plants (cotton, flax, hemp, jute), citrus fruit (orange, e. , carrots, onions, tomatoes, potatoes), laurel plants (avocado, cinnamon, camphor), deciduous deciduous trees and conifers (lime, yew, oak, alder, poplar, birch, fir, larch, pine) or plants such as corn , lawn plants, tobacco, nuts, coffee, cane sugar, grapevine, hops, banana trees, rubber trees equally grapefruit, mandarins), vegetables (spinach, salad, asparagus, u18

«1 l»w· «1 l» w · • « • « «· «··· «·« ··· ♦ · · ♦ · · • e.· • e. · • ··♦ • ·· ♦ • • • • • · · • · · • • • ♦ • ♦ ♦j ♦ j * * v ··· · in ··· · • • « « e E 0 0 ·· · 0 0 ·· ·

tak jako rostliny okrasné. Kompozici lze aplikovat na list, zapravením do země, rozhozem granulí, na poslední chvíli při sklizni nebo nasáknutím do půdy. Zpravidla je důležité získat kontrolu nad škůdcem v raných stadiích vývoje rostliny, „„protože .to-je-doba;— kdy * *může· být ‘poškozena’“ něj vážněji . Pokud se má za to, že je to nutné, může postřik nebo poprašek obsahovat výhodně i jiný pesticid. V preferovaném provedení se kompozice podle vynálezu aplikuje přímo na rostlinu.as well as ornamental plants. The composition can be applied to the leaf, embedded in the ground, throwing granules, at the last minute at harvest or soaking into the soil. As a rule, it is important to gain control of the pest in the early stages of the plant's development, "because" that-is-time; - when * * it can be 'damaged' "more seriously. If considered necessary, the spraying or dusting may advantageously also comprise another pesticide. In a preferred embodiment, the composition of the invention is applied directly to the plant.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány přímo do rybníků, jezer, potoků, řek, stojatých vod a dalších míst vystavených zamoření dvojkřídlými škůdci, zvláště škůdci ohrožujícími obecné zdraví. Kompozice může být* aplikována sprejováním, práškováním, postřikem a tak podobně.The compositions of the present invention may also be applied directly to ponds, lakes, streams, rivers, stagnant waters and other sites exposed to infestation by double-wing pests, particularly pests threatening general health. The composition can be applied by spraying, dusting, spraying and the like.

Kompozice podle předkládaného vynálezu může být účinná proti škůdcům řádu Lepidoptera, například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, ALsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp. , Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Chořístoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia * * -FThe composition of the present invention may be effective against Lepidoptera pests, for example Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatia, Anarsia lineatia gemmatalis, Archips sp. , Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx sea, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Chirstoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericania , Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreum loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia * * -F

.. —> ·.*--· ^T salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis,.. -> ·. * - ^T · salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa Messori, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambucina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis,

Malacosoma sp: , Mamestra brassicae, Mamestra configurata,Malacosoma sp: Mamestra brassicae, Mamestra configurata

Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis,Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis,

• « · · · · • «· · · · ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ··· ♦ ··· 19 19 Dec • · · * ··· • · ♦ « ♦ • · · * ··· • · ♦ «♦ • « o, • «o, • « • « • « • « • ♦ • · 9*0 • • ♦ • ·  9 * 0 • » ♦ »» ♦ ··«. ·· «. ·· · ·· · ·· ·· • •

Melanchra pieta, Operophtera brumata,. Orgyia^sp:., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes,Melanchra pieta, Operophtera brumata ,. Orgyia sp.: Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes,

Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica,Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica

Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae,Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae,

Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sul tana,Platynpena scabra, Platynota flouendana, Platynota sul tana,

Platyptilia xylostella, carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta,Platyptilia xylostella, carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta,

Pseudoplusia includens,Pseudoplusia includens,

Sabulodes aegrotata,Sabulodes aegrotata,

Schizura concinna,Schizura concinna,

Sitotroga cerealella,Sitotroga cerealella,

Spilonota ocellana,Spilonota ocellana,

Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa,Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa,

Tineola bissel Helia,Tineola bissel Helia

Trichoplusia ni, Udea rubigalis,Trichoplusia ni Udea rubigalis

Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; dále řádu Diptera, například Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vidná, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies,Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; of the order Diptera, for example, Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifs

Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina --pa-l-pa-l-i-s—pa-l-pal-isy- Gl-osstna taclTilwHies, Haemagogus equinus,Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina brevipalpis, Glossina muscitans, Glossina morsitans centralis, Glossina mites palpalis gambiensis, Glossina - pa-l-pa-lis-pa-1-pal-isy-Gl-osstna taclTilwHies, Haemagogus equinus,

1.»......... nn^.Haematobia irritans, Hypoderma bovis,‘ Hypoderma lineatum,1. »......... nn ^ .Haematobia irritans, Hypoderma bovis,‘ Hypoderma lineatum,

Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella malí, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis, .Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus,Leucopis ninae, Lucilia lupine, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella small, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis. ,

Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa.Sarcophaga bullata; Scatophaga stercoraria; Stomoxys calcitrans; Toxorhynchites amboinensis; Tripteroides bambusa.

·· ·»«»' ·· · » * * 4 4 • 4 • 4 MM MM • » · • »· • 4 • 4 • 4 • 4 4 4 • ··· • ··· • • • • • 4 • 4 4 4 • 4 4 • 4 4 • • 4 44·' 4,444 · ' 4 4 20 20 May • 4 • 4 0 0 4 4 • • • ♦ · • ♦ · 444 444 44 44 4 4

Avšak kompozice podle vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera, například Leptinotarsa sp., Acanthoscelides,.obtectus ·,* Callosobruchus’ chinénsis'? Epi lachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formocarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; dále řádu Acari, například Oligonyhus pratensis,However, the compositions of the invention may also be effective against insect pests of the order Coleoptera, for example Leptinotarsa sp., Acanthoscelides, obtectus, Callosobruchus 'quinensis'. Epi lava varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formocarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus; Tribolius destructor; Acari, for example, Oligonyhus pratensis,

Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera, například Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; či řáduPanonychus ulmi, Tetranychus urticae; or of the order Hymenoptera, for example Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; or order

Isoptera, například Réti cul i termes hesperus, Réti culitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis,Isoptera, such as Réti cul i termes hesperus, Réti culitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis,

Neotermes connexus,Neotermes connexus,

Incisitermes minor,Incisitermes minor,

Incisitermes immigrans ;Incisitermes immigrans;

gallinae, nebo řádu Siphonaptera, například Ceratophyllusgallinae, or of the order Siphonaptera, for example Ceratophyllus

Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus,Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus,

Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; anebo řáduLeptopsylla segnis; Ctenocephalides canis; Ctenocephalides felis; Echicnophaga gallinacea; Pulex irritans; Xenopsylla cheopis; Xenopsylla vexabilis; Tunga penetrans; or order

Tylenchida, například Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.Tylenchida, for example Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci, nikoliv však aby omezovaly.The following examples are provided to illustrate but not to limit.

Charakterisace IaCharacterization Ia

1. Získání a čistění Ia1. Obtaining and purifying Ia

Kmen Bacillus thuringiensis subsp, kurstaki EMCCOO86 ♦ · *··« (uložený v NRRL jako B-21147) byl fermentován 72 hodin při 30 C v mediu složeném ze zdroje uhlíku jako je škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosa a ze zdroje dusíku jako je protein, proteinový hydrolysát nebo výluh z obilí. Tvorba Ia -»_..byla stanovována -po^L-13'^j hodinách ^— během fěrméntáce7Vrchol ' účinnosti byl nalezen zhruba po 30 hodinách.Bacillus thuringiensis subsp strain kurstaki EMCCOO86 (deposited in NRRL as B-21147) was fermented for 72 hours at 30 ° C in a medium composed of a carbon source such as starch, starch hydrolyzate or glucose and a nitrogen source such as protein , protein hydrolysate or grain leach. Formation of Ia - »_ .. ^L was determined -after -13 'h ^{j -} fěrméntáce7Vrchol during' the efficiency was found after about 30 hours.

Supernatant z fermentace Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki byl odcentrifugován a poté vyčeřen ultrafiltací membránou 30 kDa MV-CO s použitím Rhóne Poulenc UF systému. Ultrafiltrací se odstranily jakékoliv zbytky buněk, krystaly delta-endotoxinu, spory a rozpustný protein s větší hmotností než 30 kDa. Filtrát byl odpařením zahuštěn desetinásobně. Filtrát byl poté centrifugován a filtrován membránou 0,2 pm., k dalšímu odstranění nerozpustných částic z živného roztoku <Supernatant from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki was centrifuged and then clarified by ultrafiltration with a 30 kDa MV-CO membrane using a Rhone Poulenc UF system. Ultrafiltration removed any cell debris, delta-endotoxin crystals, spores, and soluble protein of greater than 30 kDa. The filtrate was concentrated 10-fold by evaporation. The filtrate was then centrifuged and filtered through a 0.2 µm membrane to further remove insoluble particles from the nutrient solution <

a získání čistého roztoku obsahujícího Ia.and obtaining a clear solution containing Ia.

Vyčistění Ia do homogenity se dosáhlo použitím mnohastupňového čistícího pochodu, který je schematicky uveden na obrázku 1. V návaznosti na postup přípravy popsaný shora, pokračoval čistící proces stupněm ultrafiltrace na 5 kDa. Filtrát po 5 kDa ultraf iltrací byl absorbován na kationtoměnič Sulfopropyl (SP) a eluován roztokem octanu amoného. Látka byla pak přibližně 30x zkoncentrována lyofilisací a sůl a ostatní kontaminanty byly odstraněny pomocí dělící kolony BioRad P2. Podíl z P2 kolony poskytl homogenní sloučeninu po projití kolonou s vysokým rozlišením, obsahující SP HPLC kationtoměnič. Kontaminující sůl byla_________ odstraněna opakovanou lyofilisací.Purification of Ia to homogeneity was achieved using a multi-step purification process, which is shown schematically in Figure 1. Following the preparation procedure described above, the purification process continued with an ultrafiltration step of 5 kDa. The 5 kDa filtrate by ultrafiltration was absorbed onto a sulfopropyl (SP) cation exchanger and eluted with ammonium acetate solution. The material was then concentrated approximately 30 times by lyophilization and the salt and other contaminants were removed using a BioRad P2 separation column. A portion of the P2 column gave a homogeneous compound after passing through a high resolution column containing an SP HPLC cation exchanger. The contaminating salt was removed by repeated lyophilization.

......^r ' Účinnost byla monitorována pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua a čistota se určovala kapilární elektroforesou. Vzorek, sestávající z 50 μΐ Ia a 50 μΐ proteinu CrylA(c) (15 pg/nil) , přečištěný z BIOBITu^ FC (100 μΐ), byl přidáván do individuálních nádobek v želatinovém tácku obsahujících 500 μΐ ztužené umělé hmyzí...... ^r 'Efficacy was monitored by a Spodoptera exigua microbioassay, and purity is determined by capillary electrophoresis. A sample consisting of 50 μΐ Ia and 50 μΐ CrylA (c) protein (15 pg / nil), purified from BIOBIT ^ FC (100 μΐ), was added to individual containers in a gelatin tray containing 500 μΐ hardened artificial insects

« · · «· · Φ 9 Φ 9 • · • · • • • *♦· • ♦ · • • • • * « * « 9 9 • · · • · · • • • • • • • · • · • • 9 9 • • 9 9 9 ·  9 · 99 · 99 · ·« · « 9 9

potravy. Tácky obsahující různé vzorky byly vysušeny na vzduchu. Do nádobek obsahujících vysušený vzorek byly přidány dvě až čtyři Spodoptera exigua v druhém nebo časném třetím vývojovém stadiu. Nádobky byly zataveny do plastikového sáčku s dírami a inkubovány při 30 C 2 až 3 dny. Potom byl zaznamenán stupeň zakrnění a úmrtnosti. Pro každý vzorek bylo běžně provedeno 5 replik.food. Trays containing various samples were air dried. Two to four Spodoptera exigua in the second or early third stage of development were added to the containers containing the dried sample. The vials were sealed into a plastic bag with holes and incubated at 30 ° C for 2-3 days. The degree of stunting and mortality was then recorded. Five replicas were routinely performed for each sample.

2. Stanoveni struktury2. Determination of structure

Účinná sloučenina je ve vodě rozpustná a nerozpustná je v organických rozpouštědlech. Má positvní náboj a reaguje s ninhydrinem, jak to bylo prokázáno chromatografií naThe active compound is water-soluble and insoluble in organic solvents. It has a positive charge and reacts with ninhydrin as shown by chromatography on

1 tenké vrstvě, na silikagelu. C a H NMR spektra sloučeniny1 thin layer, on silica gel. C and H NMR spectra of the compound

3 jsou na obrázku 2 respektive 3. C NMR experimenty vyjevily přítomnost 13 uhlíků (vztaženo k 3-[trimethylsilyl]propionové kyselině jako standardu). DEPT experiment určil přítomnost tří kvarterních uhlíků (C), sedmi methinových skupin (CH), tři methylenových (CH₂) a nepřítomnost methylové skupiny (CH^). Pomocí couplingu protonů jako je 1-D decoupling a COSY byl identifikován rozsáhlý spinový systém osmi uhlíků. Vedle toho je přítomen menší spinový Systém dvou uhlíků. Korelační experiment uhlík - proton (HMBC) umožnil přiřazení resonance každého protonu v molekule k uhlíku, na který je vázán.3 are shown in Figures 2 and 3, respectively. C NMR experiments revealed the presence of 13 carbons (relative to 3- [trimethylsilyl] propionic acid as standard). The DEPT experiment determined the presence of three quaternary carbons (C), seven methine groups (CH), three methylene (CH ₂ ), and the absence of a methyl group (CH 2). A proton coupler such as 1-D decoupling and COZY has identified an extensive spin system of eight carbons. In addition, a smaller spin system of two carbons is present. The carbon-proton correlation experiment (HMBC) allowed the resonance of each proton in the molecule to be assigned to the carbon to which it is bound.

Reakce účinné sloučeniny (13 mg) s acetanhydridem v pyridinu poskytla acetylderivát, který je mnohem méně polární. Tento derivát byl čištěn pomocí HLPC a poskytl 3 mg ________čistého—acexylderivátu.—Hmotnos-tn-í—spek-t-roskopie—ukázaTat—že— _t ,. _Γί. rieri vát má 7 acetylových skupin a -molekulární' hmotnost 690, což pro účinnou sloučeninu dává molekulovou hmotnost 396 a indikuje, že je přítomen sudý počet dusíkových atomů. Byly také detegovány fragmenty se 6 a 5 acetyly. Data z vysokého rozlišení pro dceřinné ionty s 5 a 6 acetyly jsou 645,2594 (6 acetylů) a 607,2519 (5 acetylů), což značí, že molekulový • φ »φφφReaction of the active compound (13 mg) with acetic anhydride in pyridine gave the acetylderivative, which is much less polar. This derivative is purified by HPLC to give 3 mg of pure-________-acexylderivátu. from weights-tri-t-Spec-t-roskopie shew-that- _{t. Γί} . The filtrate has 7 acetyl groups and a molecular weight of 690 which gives a molecular weight of 396 for the active compound and indicates that an even number of nitrogen atoms is present. Fragments with 6 and 5 acetyls were also detected. High resolution data for 5 and 6 acetyl daughter ions is 645.2594 (6 acetyls) and 607.2519 (5 acetyls), indicating that the molecular φ »φφφ •

Φ 9 βΦ 9 β

• »44 « · Φ • »44« · Φ 23 23 φ 4 φ 4

« « • • 44 *444 44 * 444 • · 4 • · 4 • • • • 4 4« 4 4 « • • 4 4 • «4· 4 • «4 · 4 • • » 4 »4 *«· * «· ··» ·· » ΦΦ 4 ΦΦ 4

vzorec pro Ia je ^C13^H28^N6°8·the formula for Ia is ^C 13 ^H 28 ^N 6 ° 8 ·

Působení 6 N HC1 na aktivní sloučeninu (13 mg) poskytlo derivát, který je positivní na ninhydrin. Tyto výsledky udávají přítomnost amidových vazeb. Tento derivát má stejnou hodnotu jaká* byla^chromatograf ií, na tenké„vrstvě stanovena ......r* pro 2,3-diaminopropionovou kyselinu. To spolu s NMR daty udává přítomnost 2,3-diaminopropionové kyseliny.Treatment of the active compound with 6 N HCl (13 mg) gave a derivative that is positive for ninhydrin. These results indicate the presence of amide bonds. This derivative has the same value as determined by thin-layer chromatography for 2,3-diaminopropionic acid. This, together with NMR data, indicates the presence of 2,3-diaminopropionic acid.

Další technika, která byla využita pro analýzu Ia, je NOE (Nucleár-ní Overhauser-ův Efekt), který umožňuje určit jak blízko v prostoru má jeden proton ke druhému. NOE byl proveden na acetylovaném Ia. Ve dvojrozměrném NOE experimentu (NOESY) byl NOE pozorován mezi N-H protonem s δ 8,06 ppm a protonem s δ 5,17 (Obrázek 4).Another technique used for Ia analysis is NOE (Nuclear Overhauser Effect), which makes it possible to determine how close in space one proton has to another. NOE was performed on acetylated Ia. In a two-dimensional NOE experiment (NOESY), NOE was observed between an N-H proton with δ 8.06 ppm and a proton with δ 5.17 (Figure 4).

Pro Ia byla stanovena následující struktura:The following structure has been established for Ia:

OH NH₀ NH_O OH NH ₀ NH _O

I I I h₉nco-nh-ch₀-ch-nhco-ch-ch-ch-ch-ch₉-ch-ch-ch₀-oh i IIIIII h ₉ nco-nh-ch ₀ -ch-nhco-ch-ch-ch-ch-ch ₉ -ch-ch-ch ₀ -oh

CONH₂ OH OH OHCONH ₂ OH OH OH

Lze ji označit jako ureidoamid. Jejími konstituenty jsou dvě amidové skupiny, močovina, dvě aminoskupiny a pět hydroxyskupin. Má sedm chirálních center.It can be referred to as ureidoamide. Its constituents are two amide groups, urea, two amino groups and five hydroxy groups. It has seven chiral centers.

3. Vlastnosti Ia3. Properties of Ia

Zjistilo se, že isolovaný Ia znásobuje účinnost pesticidních proteinů krvstalíckého_del-ta^endo-t-QX-i-nu—^qc-í-Z-Z-uthuringiensis subsp. .kurstaki a Bacillu thuringiensis subsp.It has been found that isolated Ia multiplies the efficacy of the pesticidal proteins of the cristalide-end-end-1-CX-1-nu-2-Z-Z-uthuringiensis subsp. .kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp.

W·' aizawai vůči Spodoptera exigua bez ohledu na formu pesticidních proteinů. Pesticidní účinnost se potencuje jak u formulací Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, tak u isolovaných krystalů i u CrylA proteinů nezkrácených (molekulární hmotnost 130 kDa) či zkrácených (molekulární hmotnost cca 65 kDa). Účinnosti inklusí CrylI a CrylC se • · ·W · aizawai to Spodoptera exigua regardless of the form of the pesticide proteins. Pesticidal activity is potentiated by both Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, as well as in isolated crystals and in CryIA proteins not shortened (molecular weight 130 kDa) or shortened (molecular weight about 65 kDa). The efficacy of CrylI and CrylC inclusion is

0 04 * O • o o0 04 * O • o

♦ *♦ *

* ** *

·* ··· * ··

0 rovněž znásobují. Zjistilo se účinnost individuálních zkrácených a (c). Nezjistilo se, že by pro bioaktivitu byla kritická inkubační doba Ia s Cry proteinem. Avšak samotný Ia je inaktivní. Bylo nalezeno, že úroveň potencování je 100 až 200 násobná pro zkrácené CrylA proteiny, CrylI a CrylC inkluse a přibližně 320-ti násobná pro CrylA (c) plné délky (viz Tabulka I respektive II). Konkrétně, jestliže se použije Ia, způsobí 0,75 pg/ml mortalita/zakrnění hmyzu jako 240 pg/ml samotného CrylA (c). V případě zkráceného CrylA v kombinaci s Ia stejné skoré v0 also multiply. The efficacy of the individual truncated a was determined and (c). The incubation period of Ia with the Cry protein was not found to be critical for bioactivity. However, Ia itself is inactive. The potentiating level was found to be 100 to 200 fold for truncated CryIA proteins, CryIII and CryIC inclusion, and approximately 320 fold for full length CryIA (c) (see Table I and II, respectively). Specifically, when Ia is used, 0.75 µg / ml insect mortality / stunting causes 240 µg / ml CryIA (c) alone. In the case of truncated CryIA in combination with Ia the same early in

Cryla (c) testovaný sám s 0,075 0ϋ₂βθ. Inkluse CrylI při koncentraci 0,6 pg/ml daly v kombinaci s Ia stejné skoré v zakrnění a podobnou mortalitu jako 75 pg/ml samotného CrylI proteinu, což je 125ti násobná potenciace. Inkluse CrylC při 0,3 pg/ml s přidáním Ia vykázaly podobnou mortalitu a skoré zakrnění jako 75 pg/ml CrylC protein samotný, což odpovídá 250ti násobné úrovni potenciace. Koncentrace proteinu CrylA, která způsobovala zakrnění, po přidání Ia vykázala mortalitu·.Cryla (c) tested alone with 0,075 0ϋ ₂ βθ. Inclusion of CryIII at a concentration of 0.6 µg / ml, in combination with Ia, gave the same early stunting and a similar mortality as 75 µg / ml CryII protein alone, which is 125-fold potentiation. Cry1C inclusions at 0.3 pg / ml with addition of Ia showed similar mortality and early stunting to 75 pg / ml Cry1C protein alone, corresponding to a 250-fold potency level. The concentration of Cry1A protein that caused stunting showed mortality when Ia was added.

stálý při bioassay po 5 minutovém odstavci 1, ale při autoklávování ztrácí. Dále je stálý, je-li hodin přímému slunečnímu světlu. 2, ale nestálý při pH 12. Bylo ztrácí, je-li vystavenStable on bioassay after 5 minute paragraph 1 but loses when autoclaved. Furthermore, it is stable when the clock is in direct sunlight. 2, but unstable at pH 12. It was losing if exposed

Zjistilo se, že Ia je varu, jak se popisuje v (>190 C) veškerou aktivitu vystaven po dobu nejméně Ia je stálý 3 dny při zjištěno, že veškerou že také, proteinůIt has been found that Ia is boiling as described in (> 190 C) all activity exposed for at least Ia is stable for 3 days when found to have all that also, protein

J^e J ^e

Cryl a potencována (a) , (b)Cryl and potentiated by (a), (b)

CrylA (c) stejný poměr (c) 0,0006 θ^280 poskytly zakrnění jako stejný vzorekCryIA (c) the same ratio (c) of 0.0006 θ ^ 280 gave stunting as the same sample

Inkluse CrylIInclusion of CryII

Ia stejnéIa same

PH aktivitu působení kyseliny_j.odis.té_nebo—koncen-t-rované—k-yseT-i-ny—solnévPH activity of the acid or the concen- trated t-ys-1-ynyl hydrochloric acid

Tabulka ITable I

POTENCIAČNÍ EFEKTY Ia U ČIŠTĚNÉHO ZKRÁCENÉHO PROTEINU B.t.POTENTIONAL EFFECTS Ia FOR CLEANED TRIMPED PROTEIN B.t.

Protein B. Protein B. thuringiensis thuringiensis Spodoptera exigua Spodoptera exigua Typ Type OD 280 OD 280 Ia Ia Mortalita^^- Skoré zakrněníMortality ^ ^- Early stunting Cryla (a) Cryla 0,055 0,055 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 0,040 0.040 - - 0/5 0/5 2,2 2.2

·· ···· · • 4 4 44 • 444 ··· ···· · 4 4 44 444

4 · 4 • · · • 444 444 4444 444 444 444

• • ·· ·»· ·· · » 0« 4 0 « 4 4 4 · ♦ 4 · 4 4 · ♦ 4 · 4 4 • ··· · • ··· · * * 0 « 0 « • 44 • 44 • 4 · • 4 ·

0,020 0.020 - - 0/5 0/5 2,0 2,0 0,020 0.020 + + 2/5 2/5 0,0 0.0 0,010 0.010 + + 0/5 0/5 0,2 0.2 0,005 0.005 + + 0/5 0/5 0,0 0.0 0,0025 0,0025 + + 0/5 0/5 0,4 0.4 0,0012 0,0012 + + 0/5 0/5 1,8 1,8 0,0006 0.0006 + + 0/5 0/5 _______1,6 _______ 1,6

CrylA (c) CrylA (c) 0,075 0,075 0/5 0/5 3,4 3.4 0,040 0.040 - - 0/5 0/5 2,6 2.6 0,020 0.020 - - 0/5 0/5 2,8 2.8 0,020 0.020 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 0,010 0.010 + + 0/5 0/5 0,2 0.2 0,005 0.005 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 0,0025 0,0025 + + 2/5 2/5 2,0 2,0 0,0012 0,0012 0/5 0/5 1,0 1.0 Žádný None 0,0006 0.0006 + + 1/5 1/5 1,0 1.0 NA ON + + 0/5 0/5 4,0 4.0 Žádný None NA ON - - 0/5 0/5 4,0 4.0

^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech >^ Mortality = number of dead insects / number of all insects after 2 days>

Skoré zakrněni je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioassaye: 4,0 = neošetřená kontrola, 3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.Early stunting is defined by the average size of live insect larvae at the end of the bioassay: 4.0 = untreated control, 3.0 = 75% untreated control size, 2.0 = 50% untreated control size, 1.0 = 25% untreated control size, 0.0 = no growth or unchanged size since the beginning of the experiment.

Tabulka IITable II

POTENCIACNí EFEKTY Ia U PROTEINU B. THURINGIENSISPOTENTIATING EFFECTS Ia FOR PROTEIN B. THURINGIENSIS

Protein B. Protein B. thuringiensis thuringiensis Spodoptera Spodoptera exigua exigua Typ Type pg/ml pg / ml Ia Ia 1 Mortalita Skoré zakrnění 1 Mortality Early stunting Cryla (c) Cryla 240 240 - - l/\ .. l / \ .. 0,5 0.5 120 120 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 60 60 - - 0/5 0/5 2,2 2.2 30 30 - - 0/5 0/5 4,0 4.0 60 60 + + 5/5 5/5 — - 30 30 + + 5/5 5/5 — - 15 15 Dec + + 4/5 4/5 0,0 0.0 3 3 + + 4/5 4/5 1,0 1.0 0,8 0.8 + + 2/5 2/5 1,6 1.6

· a 9 o i· A 9 o i

CrylI CrylI 300 300 1/5 1/5 0,8 0.8 150 150 2/5 2/5 0.7 0.7 75 75 1/5 1/5 0,2 0.2 38 38 0/5 0/5 0,8 0.8 19 19 Dec 0/5 0/5 1,6 1.6 9 9 0/5 0/5 1,8 1,8 5 5 * : •ul**· + *: • ul ** + „ . l/5_ 3/5 '. l / 5_ 3/5 4 _? 0 °-· ^h 1,04 _? 0 ° - · ^h 1.0 19 19 Dec + + 2/5 2/5 0,5 0.5 9 9 + + 3/5 3/5 0,0 0.0 5 5 + + 1/5 1/5 0,5 0.5 2,4 2.4 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 1,2 1,2 + + 3/5 3/5 0,5 0.5 0,6 0.6 + + 2/5 2/5 0,3 0.3 CrylI CrylI 300 300 - - 2/5 2/5 0,3 0.3 150 150 - - 2/5 2/5 0,0 0.0 75 75 - - 1/5 1/5 0,8 0.8 38 38 - - 0/5 0/5 3,2 3.2 38 38 + + 5/5 5/5 — - 19 19 Dec + + 5/5 5/5 , --- , --- 9 9 + + 5/5 5/5 — - 5 5 4- 4- 4/5 4/5 0,0 0.0 2,4 2.4 + + 1/5 1/5 0,0 0.0 1,2 1,2 + + 5/5 5/5 — - 0,6 0.6 + + 3/5 3/5 1,5 1.5 0,3 0.3 + + 2/5 2/5 1,3 1.3 Žádný None NA ON 0/5 0/5 4,0 4.0 Žádný None NA ON + + 0/5 0/5 4,0 4.0

^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech ^Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioassaye: 4,0 = neošetřená kontrola, % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti^ Mortality = number of dead insects / number of all insects after 2 days ^ Stunting score is defined by the average size of live insect larvae at the end of the bioassay: 4.0 = untreated control,% untreated control size, 2.0 = 50% untreated control, 1, 0 = 25% size

3,0 = 75 velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.3.0 = 75 untreated control size, 0.0 = no growth or unchanged size since the start of the experiment.

4. Zhodnocení dalších .subspecies Bacillu thuringiensis a dalších species druhu Bacillus4. Evaluation of other Bacillus thuringiensis subspecies and other Bacillus species

Některé Bacillus species byly hodnoceny z hlediska produkce Ia. Kmeny byly fermentovány 72 hodin při 30 C v prostředí, které obsahovalo zdroj uhlíku jako škrob, Škrobový hydrolysát nebo glukosu a zdroj dusíku jako protein, *· ···« hydrolysát proteinu nebo výluh z obilí. Kapaliny nad živnou půdou byly na tvorbu Ia testovány pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua, jak je shora popsáno. Bylo zjištěno, že Bacillus thuringiensis subsp. aizawai druh EMCC0087 uložený v NRRL jako NRRL B-21148) a.^Bacillus^ thuringiensis^,^,. subsp. galleriae (uložený v NRRL), produkují Ia přibližně ve stejné koncentraci jako Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki .Some Bacillus species were evaluated for Ia production. The strains were fermented for 72 hours at 30 ° C in an environment containing a carbon source such as starch, starch hydrolyzate or glucose and a nitrogen source as protein, protein hydrolyzate or grain leach. The supernatants were tested for Ia formation by microbioassay with Spodoptera exigua, as described above. Bacillus thuringiensis subsp. aizawai species EMCC0087 deposited in NRRL as NRRL B-21148) and Bacillus thuringiensis. subsp. galleriae (deposited in NRRL) produce Ia at approximately the same concentration as Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

Ia produkuje také B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. darmstadiensis, B. t. subsp. dendrolimus, B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus·, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis a B. thuringiensis « subsp. kurstaki cr.y- spo- mutant jak bylo stanoveno kapilární elektroforesou.Ia also produces B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. darmstadiensis, B. t. subsp. dendrolimus, B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis and B. thuringiensis subsp. kurstaki cr.y- spo- mutant as determined by capillary electrophoresis.

Pro kvantifikaci hodnot Ia byl použit Beckman P/ACE systém kapilární elektroforesy, opatřený nepotahovanou kapilárou 50 μπι x 57 cm, 0,2 M fosfátový pufr o pH 6,8, pří napětí 15 kV a detekci při 200 nm. Objemy vzorků jsou 20 nl a doba stanovení 25 minut.The Beckman P / ACE capillary electrophoresis system, equipped with an uncoated capillary 50 μπι x 57 cm, 0.2 M phosphate buffer pH 6.8, at a voltage of 15 kV, and detection at 200 nm was used to quantify Ia values. Sample volumes are 20 µl and assay time 25 minutes.

Standardní křivka byla vytvořena za použití čištěného Ia jako standardu při hodnotách 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml a 0,078 mg/ml. Vznikla lineární kalibrační křivka. Výsledkem rovnice y = mx + b se určovala koncentrace __Ia v kaž.dém—vzorku——--—-------—----- ~ _ _ . Před každým stanovením se kapilára - po dobu 3 minut proplachovala proudem pufru (0,2 M fosfát, pH 6,8). Po každém minutovém stanovení se kapilára proplachovala 1 minutuA standard curve was generated using purified Ia as a standard at 1.25 mg / ml, 0.625 mg / ml, 0.3125 mg / ml, 0.156 mg / ml and 0.078 mg / ml. A linear calibration curve was generated. As a result of equation y = mx + b, the concentration Ia in each sample of the sample was determined. Prior to each assay, the capillary was flushed with a buffer stream (0.2 M phosphate, pH 6.8) for 3 minutes. After each minute determination, the capillary was flushed for 1 minute

N NaOH, 1 minutu filtrovanou vodou pro HPLC, 3 minuty 0,5N NaOH, 1 minute with filtered water for HPLC, 3 minutes 0.5

M kyselinou fosforečnou a 1 minutu filtrovanou vodou proM phosphoric acid and filtered water for 1 minute

HLPC. Integrací plochy pod každým peakem byla určena její · ···· « · «· ···· • · · 09 · · ♦ · · velikost a konečná koncentrace byla vypočtena na základě standardní křivky.HLPC. By integrating the area under each peak, its size and final concentration were calculated based on a standard curve.

5. Hodnocení komerčních produktů B. thuringiensis5. Evaluation of commercial products of B. thuringiensis

Množství Ia přítomného v_ různých komerčně.dostupných produktech B. thuringiensis se určovalo kapilární elektroforesou, která je popsána svrchu v odstavci 4. BACTOSPEINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC^ a BIOBIT™ byly získány od Novo Nordisk A/S. XENTARI™ a DIPEL™ byly získány od Abbott Laboratories. AGREE™ pocházel od Ciba-Geigy, MVP™ dodával Mycogen a CUTLASS™ byl získán od firmy Ecogen.The amount of Ia present in the various commercially available B. thuringiensis products was determined by capillary electrophoresis as described in section 4 above. lähde: Novo Nordisk A / S. XENTARI ™ and DIPEL ™ were purchased from Abbott Laboratories. AGREE ™ was from Ciba-Geiga, MVP ™ was supplied by Mycogen, and CUTLASS ™ was purchased from Ecogen.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce III a ukazují, že Ia je přítomen v různém množství v rozmezí od méně než 0,001 g la/BIU až do 0,071 g la/BIU.The results are shown below in Table III and show that Ia is present in varying amounts ranging from less than 0.001 g la / BIU up to 0.071 g la / BIU.

Tabulka III Ia V KOMERČNÍCH PRODUKTECH BACILLUS THURINGIENSIS Table III Ia IN COMMERCIAL PRODUCTS BACILLUS THURINGIENSIS Produkt Product Typ Type Šarže č. Batch no. Potence Potence Ia g/BIU Ia g / BIU JAVELIN™ VG JAVELIN ™ VG Btk Btk 99942281 99942281 32000 IU/mg 32000 IU / mg 0,071 0.071 XENTARI™ XENTARI ™ Bta Bta 58715PG 58715PG 15000 IU/mg 15000 IU / mg 0,06 0.06 AGREE™ AGREE ™ Bta/Btk Bta / Btk RA208004 RA208004 25000 IU/mg 25000 IU / mg 0,033 0,033 BIOBIT™ HPVP BIOBIT ™ HPVP Btk Btk 5012 5012 48950 U/mgPIA 48950 U / mgPIA 0,018 0.018 BIOBIT^Tin FC ^Tin biobit FC Btk Btk AG46669071 AG46669071 8 BIU/1 8 BIU / 1 0,013 0.013 FORAY™ 48B FORAY ™ 48B Btk Btk BBN7018 BBN7018 12,6 BIU/1 12.6 BIU / 1 0,012 0.012 DIPEL™ DIPEL ™ Btk Btk 58739PG 58739PG 32 000 IU/mg 32,000 IU / mg 0,011 0.011 FORAY™ 76B FORAY 76B Btk Btk 20,0 BIU/1 20.0 BIU / 1 0,007 0.007 BACTOSPEINE™ BACTOSPEINE ™ Btk Btk B0B001 B0B001 123653 IU/mg 123653 IU / mg 0,003 0.003 BACTOSPEINE™ BACTOSPEINE ™ Btk Btk KX02A KX02A 100 000 IU/mg 100,000 IU / mg 0,003 0.003

• · 4 4 » ft • · 4 4 ft • • • ·· ···* • ·· ··· « ♦ · «♦ · • 4 • 4 9 4 9 4 4 · * 4 · * ♦ · ·· ♦ · ·· • • • • 4 · 4 4 · 4 • · 4 • · 4 • • • • • 4 4 4 4 • 4 4 4 4 » · »· * * • • • · • · «44 «44 • 4« • 4 « • * 4 • * 4

BACTOSPEINE™ BACTOSPEINE ™ Btk Btk VP IN P 16 000 IU/mg 16,000 IU / mg < 0,001 <0.001 NOVODOR™ NOVODOR ™ Btt Btt 9024 9024 16,3 milionů LTU/qt LTU 16.3 million / qt 9,5 x 10⁹ g/LTU9.5 x 10 ⁹ g / LTU FLORBAC™ FLORBAC ™ Bta Bta 082-31-1 082-31-1 30 000 U/mg E 30,000 U / mg E < 0,001 <0.001 SPHERIMOS™ SPHERIMOS ™ B. sphr B. sphr BSN006 BSN006 žádný none MVP™ MVP ™ Btk Btk 21193542 21193542 žádný none CUTLASS™ CUTLASS ™ Btk/Btk Btk / Btk žádný none BACTIMOS™ BACTIMOS ™ Bti Bti BIB0024 BIB0024 11 700 IU/mg 11,700 IU / mg žádný none

6. Bioassaye s přidávanou výživou6. Bioassay with added nutrition

Účinnost B. t. k. se stanovovala bioassayem s přidáváním umělé výživy pro larvy třetího stadia vývoje Spodoptera exigua, druhého stadia larev Helicoverpa zea, třetího stadia larev Spodoptera frugiperda, druhého stadia larev Heliothis virescens, třetího stadia larev Trichoplusia ni, třetího stadia larev Pseudoplusia includens, třetího stadia larev Plutella xylostella, třetího stadia larev Spodoptera littoralis a třetího stadia larev Mamestra brassicae.The efficacy of B. tk was determined by bioassay adding artificial nutrition to larvae of the third stage of development of Spodoptera exigua, second stage larvae of Helicoverpa zea, third stage larvae of Spodoptera frugiperda, second stage larvae of Heliothis virescens, third stage larvae of Trichoplusia ni, third stage larvae Plutella xylostella larvae, Spodoptera littoralis third larvae, and Mamestra brassicae third larvae.

Bioassaye s přidávánou výživou se prováděly ke zjištění úrovně potenciace po přidání Ia ke komerčním produktům B. thuringiensis a stanovení rozsahu působeni na hmyz. V experimentech s vysokými koncentracemi Ia vůči Spodoptera exigua (7,4 až 23,7 g Ia/BIU), byl k potenciaci BIOBITu^ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) použit čištěný Ia (7_0__%. aktivní složky, 30 % neutralisačního ,acetátového iontu). Získaná, v tabulce IV uvedená, data ukazují potenciaci BIOBITu^ HPVP (HPVP = smáčítelný prach s vysokou účinností) pomocí Ia (0,658 % aktivní složky). S. littoralis a M. brassicae byly testovány FLORBACem^^M HPVP a Ia.Nutrient-added bioassays were performed to determine the level of potency after addition of Ia to commercial B. thuringiensis products and to determine the extent of insect action. In experiments with high concentrations of Ia to Spodoptera exigua (7.4 to 23.7 g Ia / BIU), purified Ia (70%% active ingredient, 30% neutralizing, acetate) was used to potentiate BIOBIT® FC (FC stands for liquid concentrate). ion). The data obtained, shown in Table IV, show the potency of BIOBIT® HPVP (HPVP = high efficiency wettable dust) by Ia (0.658% active ingredient). S. littoralis and M. brassicae were tested with FLORBAC® ^M HPVP and Ia.

Byly navazovány různé komerční produkty B, thuringiensis a byl k nim přidán Ia, aby vzniklo 0,1 až 237 g Ia/BIU, Objem ,Various commercial products of B, thuringiensis were coupled and Ia was added to produce 0.1-237 g Ia / BIU.

<·<·

byl adjustován s 0,1 % Tween¹ . Vzorky byly na 1 minutu vystaveny ultrazvuku a pak zředěny na konečný objem. Byly připraveny také čisté vzorky (bez Ia) a referenční látky. Referenční látky představují B. t. k. HD-1S-1980 (získaný od NRRRL), u něhož se udává síla 16 000 mezinárodních jednotek ” ₄ TM (IU) na miligram a JAVELIN¹ , jemuž se přisuzuje síla 53 000 Spodoptera jednotek/mg (SU).was adjusted with 0.1% Tween ¹ . The samples were sonicated for 1 minute and then diluted to final volume. Pure samples (without Ia) and reference substances were also prepared. The reference substances are B. tk HD-1S-1980 (obtained from NRRRL), which is reported to have a force of 16,000 international units ” ₄ TM (IU) per milligram and JAVELIN ¹ , which is attributed to a force of 53,000 Spodoptera units / mg (SU). ).

Standardní umělá výživa složená z vody, agaru, cukru, kaseinu, pšeničných klíčků, methyl parabenu (= methyl 4-hydroxybenzoát), sorbové kyseliny, lněného oleje, celulosy, solí a vitaminů se připravovala ve 20 1 vyhřívaném kotli. To poskytlo dostatek výživy pro testování 10 až 12 vzorků se sedmi různými koncentracemi pro každou testovanou látku. Roztoky B.t. byly sériově zředěny na alikvotní podíly o 16 ml. Každý alikvot byl přidán ke 184 g roztavené výživy. Následně se směs homogenisovala a nalila na plastikový tác obsahující 40 jednotlivých buněk. Pro každou násadu výživy byly připraveny tři kontrolní tácy. Na to byla potrava ochlazena a ztužena, do každé buňky byl přidán hmyz určitého stáří (druhé až třetí vývojové stadium) a tácy byly pokryty perforovanou folií průhledného plastu. Tácy byly umístěny do polic a čtyři · dny podrobeny inkubaci při 28 C a 65 %-ní relativní vlhkosti.Standard artificial nutrition consisting of water, agar, sugar, casein, wheat germ, methyl paraben (= methyl 4-hydroxybenzoate), sorbic acid, linseed oil, cellulose, salts and vitamins was prepared in a 20 L heated boiler. This provided sufficient nutrition to test 10 to 12 samples at seven different concentrations for each test substance. Solutions B.t. were serially diluted to 16 ml aliquots. Each aliquot was added to 184 g of molten food. Subsequently, the mixture was homogenized and poured onto a plastic tray containing 40 single cells. Three control trays were prepared for each feed batch. For this, the food was cooled and solidified, insects of a certain age (second to third developmental stage) were added to each cell and the trays were covered with a perforated sheet of transparent plastic. The trays were placed in shelves and incubated at 28 ° C and 65% relative humidity for four days.

Po čtyřech dnech byla spočítána mortalita hmyzu. Na vrch každého tácu bylo zamířeno prudké fouknutí a larvy, které se nehýbaly, byly počítány jako mrtvé. Byla vypočtena procenta -mor-tal-i-t-y---a-—data---by-la—ana-lyzována---pomocí paraůnsTních^- .□kontrolních analýz. Byly stanoveny LC^q, LC^q , směrnice regresních přímek, koeficient odchylek a potence. Stanovení vzorků se provádělo nejméně třikrát, nebo dokud tři potence nebyly mezi 20 % kolem vypočteného průměru pro každý vzorek. Pro výpočet vzrůstu aktivity spojené s každou koncentrací Ia, byla provedena korekce LC^q poměru jB.t./Ia ve vzorku tak, aby ¢3 V 0 · 4 • « « « eInsect mortality was calculated after four days. At the top of each tray, a violent blow was aimed, and the larvae that did not move were counted as dead. The percentage was calculated -mor-tal-ity and --- - --- by data-la-ana-through paraůnsTních undergoing in-depth --- ^-. □ control analyzes. LC ^ q, LC ^ q, slope regression lines, coefficient of variation and potency were determined. Sample determination was performed at least three times, or until three potencies were between 20% around the calculated average for each sample. To calculate the increase in activity associated with each concentration Ia, the LC q q correction of the jB.t./Ia ratio in the sample was adjusted to aby 3 V 0 · 4

, čistých a tak se odpovídal množství B.t. ve vzorku. LC^q párových vzorků se vydělily korigovanými LC^q hodnotami ; získal násobek snížení LC^q spojený s la., pure and so corresponded to the amount of B.t. in the sample. LC? Q paired samples were divided by corrected LC? Q values; obtained a fold reduction of LC 40 associated with 1a.

Pro assay na Lobesia bothrana byl použit následující postup. Vinné ^hrozny,., .napadené od - Lobesia - bothrana¹ ‘ byly shromážděny na nepostříkaném poli a odstranily se larvy. Byla připravena serie ředění la ve vodě (250 pg/ml, 500 pg/ml a 1000 pg/ml). Doprostřed petri misky se umístila jedna larva. Jakmile se zpozorovalo, že larva pije, byla přemístěna do petri misky s čerstvě utrženými bobulemi hroznů. Larvy byly uchovávány při 22 C, 3 až 4 dny.The following procedure was used for the Lobesia bothrana assay. Grapes attacked by Lobesia - bothrana ¹ 'were collected in an unsprayed field and the larvae were removed. A dilution series 1a in water (250 pg / ml, 500 pg / ml and 1000 pg / ml) was prepared. One larva was placed in the middle of the petri dish. Once it was observed that the larva was drinking, it was transferred to a petri dish with freshly picked grapes. The larvae were stored at 22 ° C for 3-4 days.

Jak ukazuje tabulka IV, u všech případů bylo zaznamenáno signifikantní snížení LC^qAs shown in Table IV, in all cases, a significant decrease in LC 40 was noted

Tabulka IV BIOESSAYE S PŘIDÁVANOU VÝŽIVOU Table IV BIOESSAYE WITH ADDED NUTRITION Hmyz Insect g la na BIU g la on the BIU Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC^q Increase in efficacy, fold reduction in LC ^ q Spodoptera exigua Spodoptera exigua 0,1 0.1 1.5 1.5 (BIOBIT™ HPVP) (BIOBIT ™ HPVP) 0,2 0.2 1,7 1.7 2,0 2,0 4,3 4.3 4,0 4.0 7,5 7.5 Spodoptera exigua Spodoptera exigua 7,4 7.4 13 13 (BIOBIT™ FC) (BIOBIT ™ FC) 15 15 Dec 26 26 30 30 34 34 118 118 59 59 237 237 79 79 Spodoptera frugiperda Spodoptera frugiperda 0,2 0.2 2,2 2.2 ' (BIOBIT™ HPVP) ’ '(BIOBIT ™ HPVP) ’ 0,8 0.8 3,9 3.9 2,0 2,0 7,2 7.2 4,0 4.0 11,6 11.6 Trichoplusia ni Trichoplusia ni 0,1 0.1 1,1 1.1 (BIOBIT™ HPVP) (BIOBIT ™ HPVP) 0,2 0.2 1,2 1,2 2,0 2,0 2,0 2,0 4,0 4.0 3,1 3.1

« · ♦ · · *«· ♦ · ·

·· ·»·· · • · ♦ II • · 9 ·· · »·· · II • · 9 32 32 9 λ a 9 λ a Pseudoplusia includens (BIOBIT™ HPVP) Pseudoplusia includens (BIOBIT ™ HPVP) 0,1 0,2 0.1 0.2 0 1.2 0 1.2 0,8 0.8 2,1 2.1 2,0 2,0 2,4 2.4 4,0 4.0 3,4 3.4

Plutella xylostella (BIOBIT™ HPVP) Plutella xylostella (BIOBIT ™ HPVP) 0,8 2,0 4,0 0.8 2,0 4.0 .. 1,6-- ^{* * * * v} 1.3 1.4 1,9.. 1.6-- ^{* * * * v} 1.3 1.4 1.9 Helicoveroa zea (BIOBIT™ HPVP) Helicoveroa zea (BIOBIT ™ HPVP) 3,2 3.2 12,6 12.6 Heliothis v irescens (BIOBIT™ HPVP) Heliothis in irescens (BIOBIT ™ HPVP) 3,2 3.2 4,2 4.2 Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPVP) Lobesia bothrana (BIOBIT ™ HPVP) 2,0 2,0 3,0 3.0 Spodoptera littoralis (FLORBAC™ HPVP) Spodoptera littoralis (FLORBAC ™ HPVP) 2,0 2,0 8,6 8.6 Mamestra hrassicae (FLORBAC™ HPVP) Mamestra hrassicae (FLORBAC ™ HPVP) 2,0 2,0 4,9 4.9

Potencíace různých komerčních, produktů na Spodoptera exigua pomocí Ia byla určována, jak popsáno svrchu, bioassayem s přidávanou výživou. Množství přidaného Ia na BIU komerčního produktu jsou uvedena níže v tabulce V. Směs Ia/vzorek produktu B.t. byla přidána do výživy obsahující kasein pšeničných klíčků na agaru. Hmyz byl k výživě umístěn na čtyři dny a udržován při 28 C. Mortalita byla __zaznamenávána a_anal.yzována—průběžně-;—a—potence^- , ₍._jrj ,-.bvlv vypočítávány z paralelních 'vzorků, které Ia neobsahovaly. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce V, • ukazují, že Ia potencuje rozdílné produkty B.t.k. a B.t.a.The potency of various commercial Spodoptera exigua products by Ia was determined, as described above, by nutrient-added bioassay. The amounts of Ia added per BIU of the commercial product are shown in Table V below. The Ia / Bt product sample was added to the nutrient containing wheat germ casein on agar. Insects were placed on the diet for four days and held at 28 C. Mortality was __zaznamenávána a_anal.yzována-continuous -, - and-potency ^- _(. J _jr -. Bvlv calculated from parallel 'samples which did not contain Ia. Results shown in Table V, show that Ia potentiates different Btk and Bta products

pocházející z různých zdrojů. Kmeny B. thuringiensis obsažené v těchto vzorcích, jsou popsány svrchu v oddíle 5.2.coming from different sources. B. thuringiensis strains contained in these samples are described in Section 5.2 above.

«» ««*««» ««

I-----------------------------------------------------------------------------------_n | Tabulka V | | POTENCIACE PRODUKTŮ B. thuringiensis NA Spodoptera exigua ]AND------------------------------------------------- ---------------------------------- _n | Table V | POTENTIATION OF B. thuringiensis products on Spodoptera exigua] Produkt Product g Ia na BIU R lAf.' λ f ·¹ g Ia on BIU R lAf. ' λ f · ¹ Vzrůst účinnosti násobek sníženi LC^q Increase efficiency by fold reduction of LC 40 BACTOSPEINE™ VP BACTOSPEINE ™ VP 0,4 0.4 1,04 1.04 1,7 1.7 2,3 2.3 CONDOR™ CONDOR ™ 0,4 0.4 2,4 2.4 1,7 1.7 5,1 5.1 AGREE™ AGREE ™ 0,4 0.4 1,1 1.1 1,7 1.7 1,6 1.6 CUTLASS™ CUTLASS ™ 0,4 0.4 1,1 1.1 1,7 1.7 2,5 2.5 MVP™ MVP ™ 0,4 0.4 6,0 6.0 1,7 1.7 7,7 7.7 2,0 2,0 12,1 12.1 FLORBAC™ HPVP FLORBAC ™ HPVP 0,2 0.2 1,1 1.1 0,8 0.8 2,0 2,0 DIPEL™ 2X DIPEL ™ 2X 0,2 0.2 1,2 1,2 0,8 0.8 2,3 2.3 2,0 2,0 3,9 3.9 JAVELIN™ VG JAVELIN ™ VG 0,2 0.2 0 0 0,8 0.8 1,08 1.08 2,0 2,0 2,9 2.9 XENTARI™ XENTARI ™ 0,2 0.2 1,2 1,2 0,8 0.8 1,6 1.6 2,0 2,0 2,4 2.4

7. Bioassaye na list7. Bioassay per leaf

Bioassaye na list se prováděly s larvami Spodoptera exigua ve druhém stadiu na brokolicích a použit byl BIOBIT™ FC a Ia. Poměr Ia k BIOBITu™ FC byl 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Brokolice byly ošetřeny pomocí pojízdného ostřikovače a objem s nosičem byl 225 1/ha (20 gal/akr). Když postřik na listechFoliar bioassays were performed with second stage Spodoptera exigua larvae on broccoli and BIOBIT ™ FC and Ia were used. The ratio of Ia to BIOBIT ™ FC was 2 g la / BIU BIOBIT ™ FC. The broccoli were treated with a mobile washer and the carrier volume was 225 L / ha (20 gal / acre). When spraying on leaves

4« ····4 «····

Β uschl, byly listy z rostlin otrhány a zamořeny larvamiΒ withered, the leaves of the plants were ripped and infested with larvae

Spodoptera exigua druhého stadia. Níže, v tabulce VI, jsou uvedeny výsledky. 100 %ní mortalita byla zaznamenána při dávce BIOBITu™ FC + Ia 8,7 BlU/ha, zatímco samotný BIOBIT™Spodoptera exigua second stage. The results are shown in Table VI below. 100% mortality was recorded at a dose of BIOBIT ™ FC + I and 8.7 BlU / ha, while BIOBIT ™ alone

FC usmrtil 92 % larev při 58,8 BlU/ha, a 8„%,při 17,óBIU/ha.-' — · .....* “ ^J'FC killed 92% of larvae at 58.8 BlU / ha, and 8 "% at 17 óBIU / ha. - · ..... *" ^J '

Ošetřené rostliny byly také na osm hodin vystaveny přímému slunečnímu záření a pak byly listy otrhány a zamořeny. Po osmi hodinách na slunečním světle vykázal samotný BIOLIT™ FC při 58,8 BlU/ha mortalitu 27 %, zatímco BIOBTT™ FC + Ia vykázal 100 % mortality při 8,7 BlU/ha.The treated plants were also exposed to direct sunlight for eight hours and then the leaves were ripped and infested. After eight hours in sunlight, BIOLIT ™ FC alone showed a mortality rate of 27.8 at 58.8 BlU / ha, while BIOBTT ™ FC + Ia showed 100% mortality at 8.7 BlU / ha.

Při pokusech na list prováděných s larvami časného TM čtvrtého stadia vykázal samotný- BIOBIT FC 75 % mortality při 52 BlU/ha a BIOBIT™ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) spolu s Ia vykázal 100 % mortality při 13 BlU/ha.In foliar experiments conducted with early stage 4 TM TM larvae, BIOBIT FC alone showed 75% mortality at 52 BlU / ha and BIOBIT ™ FC (FC stands for liquid concentrate) together with Ia showed 100% mortality at 13 BlU / ha.

Tabulka VI BIOASSAYE NA LIST Table VI BIOASSAYE SHEET Ošetření Treatment BlU/ha BlU / ha mortalita % mortality % larvární stadium larvární stage BIOBIT™ FC BIOBIT ™ FC 58,8 58.8 92 92 2 2 BIOBIT™ FC BIOBIT ™ FC 17,6 17.6 8 8 2 2 BIOBIT™ FC + Ia BIOBIT ™ FC + Ia 8,7 8.7 100 100 ALIGN! 2 2 BIOBIT™ FC + sluneční BIOBIT ™ FC + solar záření 8 hodin radiation 8 hours 58,8 58.8 27 27 Mar: 2 2 BIOBIT™ FC + Ia BIOBIT ™ FC + Ia + + sluneční záření sunshine 8 hodin 8,7 8 hours 8.7 100 100 ALIGN! 2 2 ’ΒΤΟΒΊΤ™ FC ’™ FC 52 52 75 75 4 4 BIOBIT™ FC + Ia BIOBIT ™ FC + Ia *13 *13 100 * 100 * 4 4

8. Polní pokusy8. Field experiments

Polní pokusy na cizrně (Spodoptera exigua) ukázaly, že výsledek u samotného BIOBITu™ FC při 70 BlU/ha byl 51 %, zatímco 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 40 BlU/ha vykázaly 89 % « · · · 9 9 (vztaženo na neošetřený případ). JAVELIN™ VG při 45 BIU/ha vykázal 51 %.Field experiments on chickpeas (Spodoptera exigua) showed that the result of BIOBIT ™ FC alone at 70 BlU / ha was 51%, while 2 g Ia / BIU of BIOBIT ™ FC at 40 BlU / ha showed 89% «· · · 9 9 ( based on the untreated case). JAVELIN ™ VG at 45 BIU / ha showed 51%.

Polní pokusy na kukuřici cukrové (Spodoptera frugiperda) ukázaly, že s 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 39,5 BIU/ha je výsledek 84 ’ • 9 ··*« • 9 • 9 · · uskutečněny s koloniemi citlivé a xylostella. Resistentní můry byly z pole Floridy, u nichž se vyvinula resitence exposici na JAVELIN™ VG. Analýzy při bioassay s a XENTARI™ byly průměru šesti cmField trials on sweet corn (Spodoptera frugiperda) have shown that with 2 g Ia / BIU BIOBIT ™ FC at 39.5 BIU / ha, the result 84 'is carried out with colonies sensitive and xylostella . Resistant moths were from the Florida field, which developed resistance to JAVELIN ™ VG. Bioassay s and XENTARI ™ analyzes were six cm in diameter

9. Stupně resistence9. Resistance levels

Bioassaye byly resistentní Plutella sesbírané vzorky z vůči B. t. po intensivni byly prováděny s BIOBITem™ HPVP a Ia namáčením listu. Resistence vůči JAVELIN™ zjišťovány bez Ia. Disk ze zelného listu o byl na 10 sekund ponořen do jedné z osmi různých koncentraci vzorků B. t. nebo formulací B. t./Ia. Rozsah koncentrací byl od 1 ppm do 1000 ppm. Disky listů byly dvě hodiny sušeny na vzduchu a umístěny do plastikových petri misek s larvami (0,2 až 0,4 mg) druhého stadia. Dávka dvacetipěti kusů hmyzu/den byla opakována dvakrát, aby bylo dosaženo dávky 50 kusů. Mortalita se zaznamenávala po 72 hodinách při 27 C. Regrese mortality u dávky se analyzovala průběžně. Stupně resistence byly vypočítány dělením hodnot LC^q a LC^q citlivých můr. Výsledky jsou v tabulce VII a ukazují, že BIOBIT™ HPVP potencuje při 2 g Ia/BIU a 4 g Ia/BIU. Konkrétně při 4 g Ia/BIU je dvojnásobné snížení stupně -resistence—LCrTj a děšěťiňašbbňé snížení stupně resistence -tc₉₀.Bioassays were resistant Plutella collected samples from B. t. After intensive were performed with BIOBIT ™ HPVP and Ia sheet soaking. Resistance to JAVELIN ™ determined without Ia. The green leaf disc was immersed for 10 seconds in one of eight different concentrations of the B.t. samples or the B.t./Ia formulation. The concentration range was from 1 ppm to 1000 ppm. The leaf discs were air dried for two hours and placed in plastic petri dishes with larvae (0.2-0.4 mg) of the second stage. The dose of twenty-five insects / day was repeated twice to achieve a dose of 50 pieces. Mortality was recorded after 72 hours at 27 C. Dose mortality regression was analyzed continuously. The degrees of resistance were calculated by dividing the LC 40 and LC 40 sensitive susceptibility values. The results are shown in Table VII and show that BIOBIT ™ HPVP potentiates at 2 g Ia / BIU and 4 g Ia / BIU. Specifically, at 4 g Ia / BIU, the two-fold reduction in the -resistance-LCrTj ratio and the two-fold decrease in the -tc ₉₀ -resistance degree.

ΛΛ

XX

« 99 9999 99 99999 0 ♦ 0 ♦ • • 99 99 9 9 · 9 9 · • • *·· * ·· • • • • • · 9 • · 9 • ♦ • ♦ « « • • • 0 9 9 *^J • 0 9 9 * ^J 4 4 a and • • 9 9 * 9 * 9 ··· ··· 999 999 ·· * ·· *

Tabulka VII STUPNĚ RESISTENCE Plutella xylostella (B.t.k. resistentní) Table VII Degree of Resistance Plutella xylostella (B.t.k. resistant) Testovaný vzorek Test sample lc₅₀ rrlc ₅₀ yy ^90 RR ^ 90 RR JAVELIN™ VG JAVELIN ™ VG „^302,6 ____ "^ 302.6 ____ .. 3829,7* - .. 3829.7 * - BIOBIT™ HPVP BIOBIT ™ HPVP 20,5 20.5 98,5 98.5 2 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP 2 g Ia / BIU BIOBIT ™ HPVP 23,2 23.2 88,0 88.0 4 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP 4 g Ia / BIU BIOBIT ™ HPVP 10,4 10.4 11,5 11.5 XENTARI™ XENTARI ™ 9,7 9.7 8,2 8.2

Vynález zde popsaný a nárokovaný není ve svém rozsahu omezen na provedení zde uváděná, protože tato provedení jsou zamýšlena jako ilustrace některých aspektů vynálezu. Jakákoliv ekvivalentní provedení je třeba považovat za jsoucí v rozsahu tohoto vynálezu. Ve skutečnosti různé modifikace vynálezu, spolu se zde ukázanými a popsanými, se stanou z předcházejícího popisu zřejmými pro ty, kteří mají zkušenosti v oboru. Takové modifikace jsou také považovány za spadající do rozsahu připojených nároků.The invention described and claimed herein is not limited to the embodiments set forth herein, since these embodiments are intended to illustrate some aspects of the invention. Any equivalent embodiments are intended to be within the scope of this invention. In fact, various modifications of the invention, together with those shown and described herein, will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.

Jsou zde citovány různé reference, jejichž objevy jsou vtěleny odkazem v jejich celistvostech.Various references are cited herein, the disclosures of which are incorporated by reference in their entirety.

Uložení mikroorganismůStorage of microorganisms

Následující kmeny Bacillu thuringiensis byly podle _______^^P£É^á_dohody_3Ho^y_v_A_gr.ic.ult.ura.l__Re.sea-r_eh-Servi-ce .i_l.„_w„^^X^{atent CultUr}F Collection (NRRL), Nothern^ Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.The following strains of Bacillus thuringiensis have been referred _______ £ P ^^ e ^ ^ á_dohody_3Ho y_v_A r.ic.ult.ura.l__Re.sea _g r _e h-.i Servi _{ce-l. "W"} ^^ X F ^{Atentat Culture} Collection (NRRL), Nothern &amp; Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Kmen.Strain.

Přírůstkové čísloIncremental number

Datum uloženíDate saved

EMCC0086EMCC0086

NRRL B-21147NRRL B-21147

6. října 1993October 6, 1993

Druhy byly deponovány za podmínek, které zaručují, žeThe species have been deposited under conditions that guarantee that:

•4 4444 • 4,444 4 4 4· 4444 4 4 4 4444 4 G 4 4 G 4 o a o a 44 44 • · 4 • · 4 4 «·· 4 «·· « « 4 4 • · 4 • · 4 • · * • · * 4 4 • • * 44 4 · * 44 4 · • · • · 4 4 4 4 • 4' • 4 ' ·· 4 ·· 4 • 4« • 4 « • 4 · • 4 ·

přístup ke kultuře bude dosažitelný během řízení o této patentové přihlášce tomu, koho určí Commissioner of Patents and Trademarks (předseda úřadu pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn podle 37 C.F.R. 1.14 a_U.S.C. 122.^Uloženývzorek představuje podstatně, čistou kulturu každého deponovaného druhu. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Avšak je třeba rozumět, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.access to culture will be available during the procedure for this patent application to the person designated by the Commissioner of Patents and Trademarks, who is empowered to do so under 37 C.F.R. 1.14 a_U.S.C. 122. The deposited pattern represents a substantially pure culture of each deposited species. The deposited sample is available as required by foreign patent rights in countries where the subject's counterparts or related applications are registered. However, it should be understood that the availability of the deposited sample does not constitute a freedom to operate the present invention in violation of patent rights granted by a State act.

Claims (12)

« « ·· ···· ·· ···· 9 B 9 9 B 9 B B • B B • B B • B B • • 9 · • 9 · • 9 · • 9 · 38 38 « · · • · «· · • · • • • ·« • • • · « • • 9 9· • • 9 9 · • 999 9 9 9 * * 9 • 999 9 9 9 * * 9 PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Způsob získání faktoru, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) pěstováni kultury kmene Bacillus (b) získání faktoru ze supernatantu kultury ze stupně (a).A method for obtaining a factor that enhances the pesticidal activity of a Bacillus-related pesticide, comprising (a) cultivating a culture of a Bacillus strain (b) obtaining a factor from the culture supernatant of step (a). 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmen podle stupně (a) je pěstován ve fermentačním prostředí,Method according to claim 1, characterized in that the strain according to step (a) is grown in a fermentation medium, 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se ti m, ž e dále zahrnuje isolaci řečeného faktoru zé supernatantu pomocí sloupcové chromatografie.3. The method of claim 1, further comprising isolating said factor supernatant by column chromatography. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor má v ³H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07;The method of claim 1, wherein the factor has chemical shifts of about δ 1.5 in the ³ H NMR spectrum; 3.22; 3.29; 3.35; 3.43; 3.58; 3.73; 3.98; 4.07; 4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny kolem δ 31,6; 37,2;4.15; 4.25; 4.35 and chemical shifts around δ 31.6; 37.2; 51,1; 53,3; 54,0; 54,4; 61,5; 61,6; 64,1; 65,6; 158,3; 170,7 a 171,3.51.1; 53.3; 54.0; 54.4; 61.5; 61.6; 64.1; 65.6; 158.3; 170.7 and 171.3. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor má strukturu I *Method according to claim 1, characterized in that the factor has the structure I * . L.. L. OH NH_O OH NH _O I I II I I H₉NC0-NH-CH₉-CH-NHC0-CH-CH-CH-CH-CH₉-CH-CH-CH^-0HH ₉ NCO-NH-CH ₉ -CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH ₉ -CH-CH-CH 2 -H I III ² I III ² CONH₂ OH OH OHCONH ₂ OH OH OH OH nebo je její solí.OH or a salt thereof. (I) ič(I) • 4 • 4 • 444 · • 444 · 4 4 44 «444 44 «444 • • • • • 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • • 444 444 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 « « • » • » 4 4 • • ♦ 44 4 4 4 45 4 4 9 9 • • 4 4 » 4 »4 »44 »44 444 444 44 4 44 4 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmenem Bacillu je kmen Bacillus thuringiensis.The method of claim 1, wherein the Bacillus strain is a Bacillus thuringiensis strain. Ί. Způsob podle nároku 6, vyznač u j\í_c í ^s e tím, že kmen Bacillus thuringiensis je volen ze skupiny tvořené kmeny Bacillus thuringiensis subsp. aizawa.i, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis _________subsp----s-o-t-t-o-, Bac-i-Tl-u-s----t-huri-ngiensi-s—subsp“ stíbT&xi cus~, .... _t i. m rni·: Bori ΊΊ. The method of claim 6, wherein the Bacillus thuringiensis strain is selected from the group consisting of Bacillus thuringiensis subsp. aizawa.i, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. Ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. Pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp _________ ---- sotto-, Bac-i-tl-t ---- US-Hori-s-ngiensi subsp "stíbT & xi cus ~ .... _t i. m · RNI: Bori Ί 7 c thuringiensis subsp. tenebrionis”; Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis Subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bacillus thuringiensis subsp.7 c thuringiensis subsp. tenebrionis ”; Bacillus thuringiensis subsp. thompsons, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tomkuensis, Bacillus thuringiensis Subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bacillus thuringiensis subsp. *· * · »444 »444 • • 9 ♦· 9 ♦ · 9 4 9 4 9 9 9* 9 * 9 9 9 9 9 9 • • ··· ··· • • 9 9 9 9 9 9 9 9 • • • 9 • 9 • • • 4*4 • 4 * 4 « « • • • • • • 9 9 9 9 • • ·· 4 ·· 4 4 ·· 4 ·· ·· ·· 4 4 yunnanensis,yunnanensis, 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m, ž e kmenem Bacillus thuringiensis je kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.8. The method according to claim 6, wherein the Bacillus thuringiensis strain is a Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. · .h Hta. — J· · .H Hta. - J · UVUV 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že s druhem Bacillus související pesticid zahrnuje delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment.The method of claim 1, wherein the Bacillus-related pesticide comprises a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin or a pesticidally active fragment thereof. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment se volí ze skupiny tvořené Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a CryVI.The method of claim 9, wherein the delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis or a pesticidally active fragment thereof is selected from the group consisting of Cry1, CryIII, CryIII, CryVV, CryV and CryVI. 11. Způsob podle nároku 10,vyznačuj ící se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylA delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.The method of claim 10, wherein the delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis or a pesticidally active fragment thereof is a CryIA delta-endotoxin or a pesticidally active fragment thereof. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačuj ící se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylC delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.12. The method of claim 11 wherein the delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis or a pesticidally active fragment thereof is Cry1C delta-endotoxin or a pesticidally active fragment thereof.