UA65519C2 - Compositions and method for stimulating growth and differentiation of megacaryocytes - Google Patents

Abstract

The factors of growth and differentiation of megacaryocytes and their derivatives combined with water-soluble polymers such as polyethylene glycol are disclosed as well as the methods for their synthesis and the pharmaceutical compositions.

Description

Настоящее изобретение относится к новьім белкам, обозначенньм как Мрі-лигандьь или МОБ, которне стимулируют рост мегакариоцитов и усиливают дифференцировку или созревание мегакариоцитов, что неизбежно ведет к увеличению числа тромбоцитов. Кроме того, изобретение относится к способам получения данньх белков в гомогенной форме из природньх источников и методами генетической инженерии.The present invention relates to new proteins, designated Mri-ligand or MOB, which stimulate the growth of megakaryocytes and enhance the differentiation or maturation of megakaryocytes, which inevitably leads to an increase in the number of platelets. In addition, the invention relates to methods of obtaining these proteins in a homogeneous form from natural sources and methods of genetic engineering.

С другой стороньї, настоящее изобретение тесно связано с новьім классом МООРЕ-производньх, в которьїх молекула МО2ОЕ соединена с водорастворимьм полимером. Описань! также способь! получения подобньїх производньїх. Кроме того, в настоящем изобретении описаньї МЕОЕ-производньсе, в которьїх молекула МООРЕ соединена с одной или более полизтиленгликолевьми("ПЗГ") группами, а также методь их получения.On the other hand, the present invention is closely related to a new class of MOORE-derivatives, in which the МО2ОЕ molecule is connected to a water-soluble polymer. Description! also a way! obtaining similar derivatives. In addition, the present invention describes the MEOE production, in which the MOORE molecule is connected with one or more polysethylene glycol ("PZG") groups, as well as the method of their production.

Уровень техникиTechnical level

Настоящее изобретение затрагивает по меньшей мере две широкие области исследований. Первая из них - развитие мегакариоцитов с последующим образованием тромбоцитов, а вторая - свойства полипептида, входящего в семейство рецепторов факторов роста, обозначенного как Мрі-рецептор, и его лигандов. Каждая из указанньїх областей исследований будет более подробно рассмотрена ниже.The present invention affects at least two broad areas of research. The first of them is the development of megakaryocytes with the subsequent formation of platelets, and the second is the properties of a polypeptide that belongs to the family of receptors for growth factors, designated as the Mri receptor, and its ligands. Each of the specified areas of research will be discussed in more detail below.

А. Образование тромбоцитов из мегакариоцитовA. Formation of platelets from megakaryocytes

Тромбоцить крови - зто циркулирующие клетки, которне играют важную роль в предотвращений кровопотери и свертьшваний крови. Мегакариоцитьї являются клеточньм источником тромбоцитов и происходят из общей костномозговой клетки предшественника, которая дает начало всем росткам кроветворения. Зта общая клетка-предшественник известна как плюрипотентная стволовая клетка илиBlood platelets are circulating cells that play an important role in preventing blood loss and blood clotting. Megakaryocytes are the cellular source of platelets and originate from the common bone marrow cell of the precursor, which gives rise to all hematopoietic germs. This common progenitor cell is known as a pluripotent stem cell or

РРБО.RRBO

Иерархия мегакариоцитарньх клеток-предшественников бьла определена на основе времени появления и размера мегакариоцитарньх(МК) колоний, образующихся в системах культивирования іп міго в ответ на воздействие соответствующих ростовьїх факторов. Бурст-образующая мегакариоцитарная клетка(ВЕО-МК) являєтся найболеє примитивной мегакариоцитарной клеткой-предшественником.The hierarchy of megakaryocytic progenitor cells was determined based on the time of appearance and size of megakaryocytic (MK) colonies formed in migo culture systems in response to the effects of appropriate growth factors. Burst-forming megakaryocytic cell (BEO-MK) is the most primitive megakaryocytic precursor cell.

Считаеєтся, что ВЕО-МК дает начало многочисленньмм колониеобразующим мегакариоцитам(СЕО-МК), представляющим собой более дифференцированнье МК клетки-предшественники.It is believed that VEO-MK gives rise to numerous colony-forming megakaryocytes (CEO-MK), which are more differentiated MK precursor cells.

По мере того, как МК клетки проходят последовательную дифференцировку, они утрачивают способность к митозу, но приобретают способность к зндоредупликации. Зндоредупликация(или зндомитоз) - зто феномен ядерного деления в отсутствие деления клетки. Зндоредупликация нейзбежно приводит к образованию полиплоидньїх МК клеток. Дальнейшее созревание МК приводит к приобретению цитоплазматических органелл и компонентов мембрань, характерньїх для тромбоцитов.As MK cells undergo successive differentiation, they lose the ability to mitosis, but acquire the ability to zondereduplication. Zndoreduplication (or zndomitosis) is the phenomenon of nuclear division in the absence of cell division. Transreduplication inevitably leads to the formation of polyploid MK cells. Further maturation of MK leads to the acquisition of cytoplasmic organelles and membrane components characteristic of platelets.

Тромбоцить!ї образуются из зрельїх МК посредством малоизученного процесса, которьй, как считают, является следствием физической фрагментации МК. Возможнь и другие механизмь. Обнаружение в мегакариоцитах протяженньхх мембранньїх структур привело к формированию модели образования тромбоцитов, согласно которой разделяющая мембранная система отделяет образующиеся тромбоцить! внутри клетки. Другая модель образования тромбоцитов основьіваєтся на том факте, что мегакариоцить образуют длиннье цитоплазматические отростки, примерно соответствующие по диаметру размеру тромбоцита. Предположительно, от зтих отростков и отрьіваются тромбоцить! под действием тока крови в костном мозге и/или в легких. Зти цитоплазматические отростки бьіли названьь Бекером и ДеБрюном протромбоцитами, чтобьй подчеркнуть их предполагаемую роль предшественников в процессе формирования тромбоцитов (см. Вескег апа ОеВгуп, Атетг. 3). Апаї. 145: 183(1976)).Thrombocytes are formed from mature MCs by means of a little-studied process, which is believed to be a consequence of the physical fragmentation of MCs. Other mechanisms are also possible. The discovery of long membrane structures in megakaryocytes led to the formation of a model of platelet formation, according to which the separating membrane system separates forming platelets! inside the cell The second model of formation of platelets is based on the fact that megakaryocytes form long cytoplasmic processes, roughly corresponding in diameter to the size of a platelet. Presumably, platelets are released from these processes! under the influence of blood flow in the bone marrow and/or in the lungs. These cytoplasmic processes were called by Becker and DeBrun proplatelets, to emphasize their supposed role of precursors in the process of platelet formation (see Veskeg apa OeVgup, Atetg. 3). Apai 145: 183(1976)).

На фиг.1 представлень! различнье клетки-предшественники, участвующие в развитии мегакариоцитов и тромбоцитов. Крайняя левая клетка на рисунке - РРОС, правее от нее - ВЕО-МК, за которой следуетOn fig. 1 representations! various precursor cells involved in the development of megakaryocytes and platelets. The far left cell in the figure is PROS, the rightmost cell is VEO-MK, which follows

СЕРО-МК. Клетка, претерпевающая зндоредупликацию и расположенная сразу же справа от РРБС, представляет собой зрелую мегакариоцитарную клетку. В результате зндомитоза зта клетка становится полиплоидной. Далее справа представлена структура с длинньми цитоплазматическими отростками, образующимися из полиплоидного ядра зрелой мегакариоцитарной клетки. В крайней правой части рисунка изображеньй многочисленнье тромбоцитьї, образовавшиеся путем фрагментации цитоплазматических отростков.SERO-MK. A cell undergoing healthy reduplication and located immediately to the right of the RRBS is a mature megakaryocytic cell. As a result of zndomitosis, this cell becomes polyploid. Further on the right is a structure with long cytoplasmic appendages formed from the polyploid nucleus of a mature megakaryocytic cell. In the extreme right part of the picture, there are numerous platelets formed by fragmentation of cytoplasmic processes.

Далее перечисленьі! некоторне важнье публикации, имеющие отношение к изложенному описанию созревания мегакариоцитов и образования тромбоцитов: 1. МЛіїйатв, М апа І еміпе, В. Е., ВийівН уоигпаї! ої Наетайіоду 52: 173 - 180(1982). 2. І еміп, у., Моіесцаг Віоіоду апа бінегепііайоп ої МедаКагуосуїез, риб. УМіеу-Г івв, Іпс.: 1 - 10(1990).Further enumerations! some important publications related to the described description of the maturation of megakaryocytes and the formation of platelets: 1. MLiiyatv, Mapa Imipe, V.E., ViyivN uoigpai! oi Naetaiodu 52: 173 - 180 (1982). 2. And emip, u., Moiessag Vioiodu apa binegepiiayop oi MedaKaguosuiez, rib. UMieu-G ivv, Ips.: 1 - 10 (1990).

З. Семіпя, А. М., Те Віоіоду ої Нетаїйороїевзів, риб. У/іеу-І! ізв, Іпс.: 123 - 132(1990). 4. Нап, 7. С., вї аї., Іпі. У. Нетайо!). 54: З - 14(1991). 5. Мівшуепниів, Н, К. апа 5іхта, 9., Мем Епод. 9. ої Мед. 327: 1812 - 1813(1992). 6. І опо, М., 5ієт СеїІв 11: 33 - 40(1993).Z. Semipya, A. M., Te Vioiodu oi Netaiyoroievziv, rib. U/ieu-I! izv, Ips.: 123 - 132 (1990). 4. Nap, 7. S., vy ai., Ipi. U. Netayo!). 54: Z - 14 (1991). 5. Mivshuepniiv, N, K. apa 5ikhta, 9., Mem Epod. 9. oi Med. 327: 1812 - 1813 (1992). 6. I opo, M., 5iet SeiIv 11: 33 - 40 (1993).

В. Регуляция образования тромбоцитовV. Regulation of platelet formation

Большое количество данньїх, полученньїх в различньїх лабораториях, указьшвает на то, что образование тромбоцитов регулируется гуморальньми факторами. Сложность зтого биологического процесса первоначально недооценивалась, но в настоящее время стало очевидно, что ряд человеческих ростовьїх факторов обладаєт такой способностью.A large amount of data obtained in various laboratories indicates that the formation of platelets is regulated by humoral factors. The complexity of this biological process was initially underestimated, but now it has become obvious that a number of human growth factors possess such an ability.

Регуляция роста мегакариоцитов происходит на нескольких клеточньїх уровнях. Некоторье цитокинь усиливают образование тромбоцитов посредством увеличения пула клеток-предшественников. Другая группа гуморальньх ростовьїх факторов служит факторами созревания, действуя на более дифференцированнье клетки и ускоряя зндоредупликацию. Кроме того, в регуляции зтих процессов имеются две независимье петли обратной связи.Regulation of megakaryocyte growth occurs at several cellular levels. Some cytokines enhance the formation of platelets by increasing the pool of progenitor cells. The second group of humoral growth factors serve as maturation factors, acting on better differentiation of cells and accelerating zondoreduplication. In addition, there are two independent feedback loops in the regulation of these processes.

Несколько групп неспецифических гематопозтических ростовьїх факторов оказьшвают важное воздействие на созревание МК.Several groups of nonspecific hematopoietic growth factors have an important effect on the maturation of MC.

Гранулоцитарно-макрофагальньй колониестимулирующий фактор(саМм-С5Е), интерлейкин-З(ІЇ -3), 1-6,Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (saMm-C5E), interleukin-3 (III-3), 1-6,

І--11, фактор подавления лейкоза( б) и зритропозтин(ЕРО) независимо и индивидуально ускоряют созревание МК іп міо, о чем судят по размеру МК, их числу и плоидности. Воздействие І ІРР, 1-6 и І/-11 на созревание МК частично( ІБ и 1/-6) или полностью(І/-11) дополняет таковое действие 1-3. Даннье приведенньїх ниже публикаций дают основание считать, что для усиления созревания МК іп мімо может бьіть необходимо сочетание цитокинов.I--11, leukemia suppression factor (b) and erythropoietin (EPO) independently and individually accelerate the maturation of MCs and myo, as judged by the size of MCs, their number and ploidy. The effect of IRR, 1-6 and I/-11 on the maturation of MK partially (IB and 1/-6) or completely (I/-11) complements the effect of 1-3. The data of the publications cited below give reason to believe that a combination of cytokines may be necessary to enhance the maturation of MCs.

Далее перечисленьі некоторье основнье публикации, посвященнье регуляции образования мегакариоцитов и тромбоцитов. 7. Ноїттап, В. еї а)ї., Віоса СеїІв 13: 75 - 86(1987). 8. Мигрпу, М. 9., Нетайюіоду/Опсоіоду Сіїпісв ої Мопп Атегіса 3(3): 465 - 478(1988). 9. Ноїтап, В., Віоса 74(4): 1196 - 1212(1989). 10. Магиг, Е. М. апа Сопеп, 9. Г., Сіїп. Рнаптасої. ТНег., 46(3): 250 - 256(1989). 11. Сем/іпая, А. М. апа Саїабгецна, В., Іпі. 9. СеїЇ Сіопіпу 8: 267 - 276(1990). 12. МЛШатв, М., Ргодгев5 іп Сгоумй Расіог Незеагсі 2: 81 - 95(1990). 13. Согдоп, М. 5. апа Нойїтап, В., Віоса 80(2): 302 - 307(1992). 14. Нипі, Р. ес а), Ехр. Нетайо). 21: 372 - 381(1993). 15. Нипі, Р. еї аі., Ехр. Нетайі. 21: 1295 - 1304(1993).Some of the main publications devoted to the regulation of the formation of megakaryocytes and platelets are listed below. 7. Noittap, V. ей а)і., Viosa SeiIv 13: 75 - 86 (1987). 8. Mygrpu, M. 9., Netaiyuiodu/Opsoiodu Siipisvoi Mopp Ategisa 3(3): 465 - 478 (1988). 9. Noitap, V., Viosa 74(4): 1196 - 1212(1989). 10. Magig, E. M. apa Sopep, 9. G., Siip. Rnaptasoi TNeg., 46(3): 250 - 256 (1989). 11. Sem/ipaya, A. M. apa Saiabgetsna, V., Ipi. 9. Seyi Siopipu 8: 267 - 276 (1990). 12. MLShatv, M., Rgodgev5 ip Sgoumy Rasiog Nezeagsi 2: 81 - 95 (1990). 13. Sogdop, M. 5. apa Noyitap, V., Viosa 80(2): 302 - 307(1992). 14. Nipi, R. es a), Ehr. Netayo). 21: 372 - 381 (1993). 15. Nipi, R. ei ai., Ehr. Netaya 21: 1295 - 1304 (1993).

Сообщалось также о том(см. ссьілку 16), что человеческая апластическая сьіворотка содержит мегакариоцитарную колониестимулирующую активность, отличную от 1-3, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и факторов, присутствующих в кондиционированной среде лимфоцитов.It was also reported (see reference 16) that human aplastic serum contains megakaryocytic colony-stimulating activity, different from 1-3, granulocyte colony-stimulating factor and factors present in the conditioned medium of lymphocytes.

Однако обусловливающие зту активность молекуль! не вьіделень! и не охарактеризовань! до настоящего времени. 16. Магиг, БЕ. М., еї аї., Віоса 76:290 - 297(1990).However, the activity of the molecules causing this! don't leave! and don't describe it! to the present time. 16. Magig, BE. M., ei ai., Viosa 76:290 - 297 (1990).

С. Рецептор МріS. Receptor Mri

Миелопролиферативньй лейкозньй вирус(МРІ М) - зто дефектньйй по репликации ретровирус мьішей, вьІЗЬівающий у инфицированньїх им млекопитающих острьїйй лейкоз. Показано, что зкспрессируемьй МРІ М ген состоит из фрагмента гена, кодирующего ретровирусньй поверхностньй белок, соединенного с последовательностью, родственной рецепторам цитокинов, включая рецепторь! СМ-С5Е, (3-С5Е и ЕРО.Myeloproliferative leukemia virus (MRI M) is a replication-defective murine retrovirus that causes acute leukemia in mammals infected with it. It has been shown that the expressed MRI M gene consists of a gene fragment encoding a retroviral surface protein connected to a sequence related to cytokine receptors, including the receptor! SM-S5E, (3-S5E and ERO.

Зкспрессия указанного гена МРІ М в мьішиньїх клетках-предшественниках различньїх типов приводит к бьістрому приобретению независимости от ростовьїх факторов, которнше в норме необходимь! для пролиферации и конечного созревания. Кроме того, тот факт, что в некоторьїх культурах костномозговьх клеток, трансформированньїх МРІ М, обнаруживаются мегакариоцить!ї, указьвает на связь между геномThe expression of the indicated MRI M gene in muscle precursor cells of various types leads to the rapid acquisition of independence from growth factors, which are normally necessary! for proliferation and final maturation. In addition, the fact that megakaryocytes are found in some cultures of bone marrow cells transformed by MRI M indicates a connection between the gene

МРІМ и ростом и дифференцировкой мегакариоцитов.MRI and growth and differentiation of megakaryocytes.

В настоящее время показано, что вирусньій ген МРІ М(обозначенньй как у-Мрі) имеет гомолог в клетках млекопитающих, которьій назван клеточньвмм геном Мрі(или с-Мрі). С использованием проб на основе м-Мрі удалось проклонировать кДНК, соответствующую человеческому с-Мрі гену (см. опубликованную заявку РСТ 92/07074, публ. 30 апреля 1992). Анализ последовательностей показал, что белок, кодируемьй геном с-Мрі, принадлежит к вьісококонсервативному суперсемейству рецепторов цитокинов, такюже как и гомологичньй продукт гена у-Мрі.Currently, it is shown that the viral gene MRI M (designated as y-Mri) has a homologue in mammalian cells, which is called the cellular gene Mri (or c-Mri). Using samples based on m-Mri, it was possible to clone cDNA corresponding to the human c-Mri gene (see published application PCT 92/07074, publ. April 30, 1992). Sequence analysis showed that the protein encoded by the c-Mri gene belongs to the highly conserved superfamily of cytokine receptors, as well as the homologous product of the u-Mri gene.

Вьвод о функциональной роли клеточного гена с-Мрі в гематопоззе основьівается на данньмх о том, что его зкспрессия обнаруживаєтся в костном мозге, селезенке и змбриональной печени нормальньх мьішей, но не в других тканях. В частности, с-Мрі зкспрессируется в мегакариоцитах. Показано также, что человеческий с-Мрі зкспрессируется в СОЗ34-положительньїх клетках, включая очищеннье мегакариоцить! и тромбоцить. СО34 - зто антиген, характерньй для ранних кроветворньїх клеток-предшественников.The conclusion about the functional role of the cellular gene c-Mri in hematopoiesis is based on data that its expression is found in the bone marrow, spleen, and embryonic liver of normal muscles, but not in other tissues. In particular, c-Mri is expressed in megakaryocytes. It is also shown that human s-Mri is expressed in SOC34-positive cells, including purification of megakaryocytes! and platelets. СО34 is an antigen characteristic of early hematopoietic precursor cells.

Кроме того, обработка СОЗ4-положительньйх клеток синтетическими олигонуклеотидами, антисмьсловьми по отношению к с-Мрі мРНК, значительно подавляет колониеобразующую способность СЕРИ-МК мегакариоцитарньїх предшественников, но не оказьшваєт зффекта на зритроидньюе и гранулоцитарно- макрофагальнье предшественники.In addition, treatment of SOZ4-positive cells with synthetic oligonucleotides antisense to c-Mri mRNA significantly suppresses the colony-forming ability of SERI-MK megakaryocytic precursors, but has no effect on erythroid and granulocyte-macrophage precursors.

Приведенньюе результатьь свидетельствуют 0 том, что с-Мрі кодирует молекулу клеточной поверхности, обозначенную как Мрі-рецептор. Связьшваниє лиганда активируєт рецептор и, вероятно, приводит к образованию и/или развитию мегакариоцитов.The above results indicate that c-Mri encodes a cell surface molecule designated as the Mri receptor. Ligand binding activates the receptor and probably leads to the formation and/or development of megakaryocytes.

Опубликованная заявка РСТ 92/07074 относится к последовательности белка, кодируемого геном с-The published application PCT 92/07074 refers to the sequence of the protein encoded by the c-

Мр! как человека, так и мьши. Продукт зтого гена, которьй, как упоминалось, является рецептором, состоит по меньшей мере из трех областей или доменов: внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточногоїили цитоплазматического) домена. Соединеннье вместе, зти домень составляют интактньйй рецептор Мрі. В упомянутой публикаций РСТ также говорится о растворимой форме рецептора, которая в значительной степени соответствует внеклеточному домену зрелого белка с-Mr! both human and mass. The product of that gene, which, as mentioned, is a receptor, consists of at least three regions or domains: an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular (or cytoplasmic) domain. Together, these domains make up the intact Mri receptor. The mentioned PCT publication also mentions the soluble form of the receptor, which largely corresponds to the extracellular domain of the mature protein c-

Мрі. Внутриклеточньй домен содержит гидрофобную область, и при соединениий ее через трансмембранньй домен с внеклеточньм доменом весь белок становится нерастворимьм. С другой стороньі, когда внеклеточньй домен продукта гена с-Мрі отделен от трансмембранного и внутриклеточного доменов, белок становится растворимьм, позтому внеклеточная форма белка обозначена как "растворимая" форма рецептора.Dreams The intracellular domain contains a hydrophobic region, and when it connects through the transmembrane domain with the extracellular domain, the entire protein becomes insoluble. On the other hand, when the extracellular domain of the c-Mri gene product is separated from the transmembrane and intracellular domains, the protein becomes soluble, therefore the extracellular form of the protein is designated as the "soluble" form of the receptor.

Ниже перечислень основнье публикации, посвященнье рецепторам х-Мрі и с-Мрі и их генам. 17. Мепайїїпа, Е., ег а, ГеиКетіа 3(7): 475 - 480(1989)The main publications devoted to x-Mri and c-Mri receptors and their genes are listed below. 17. Mepaiipa, E., et al., GeiKetia 3(7): 475 - 480 (1989)

18. Мепайїїпа, Е., ег аї., Віоса 73(5): 1161 - 1167(1989) 19. Бопцуїї. М., єї аї., Сеї! 63: 1137 - 1147(1990) 20. Мідоп, І., Ргос. Маї). Асай. сі ОБА 89: 5640 - 5644(1992) 21. 5Кода, В. С, ві аі., Те ЕМВО доштпаї 12(7): 2645 - 2653(1993) 22. Одамжа, М., Віоса 81(11): 2844 - 2853(1993) 23. Меїніа. М., єї а!., Віоса 82(5): 1395 - 1401(1993) 24. Мепаїїпа, Е., еї аї., Віоса 80: 246ба(1993)18. Mepaiiipa, E., et al., Viosa 73(5): 1161 - 1167(1989) 19. Boptsuii. M., yei ai., Seii! 63: 1137 - 1147 (1990) 20. Midop, I., Rgos. Mai). Asai. si OBA 89: 5640 - 5644(1992) 21. 5Koda, V. S, vi ai., Te EMVO mahtpai 12(7): 2645 - 2653(1993) 22. Odamzha, M., Viosa 81(11): 2844 - 2853(1993) 23. Meinia. M., Yei a!., Viosa 82(5): 1395 - 1401(1993) 24. Mepaiipa, E., Yei ai., Viosa 80: 246ba(1993)

Р. Потребность в агенте, способном стимулировать образование тромбоцитовR. The need for an agent capable of stimulating the formation of platelets

Имеются сообщения о том, что переливание тромбоцитов производят все в большем числе случаєв в медицинских центрах Северной Америки, Западной Европьї и Японийи (см. Сбогаоп, М. 5. и Нойтап, В.,There are reports that platelet transfusions are producing more and more cases in medical centers in North America, Western Europe, and Japan (see Sbogaop, M. 5. and Neutap, V.,

Вісоса 80(2): 302 - 307(1992). Зто в значительной степени обусловлено усовершенствованием медицинских методов и распространением новьїх технологий в сердечной хирургии, а также пересадок костного мозга, сердца и печени. Увеличение доз химиопрепаратов при терапиий раковьїх больньх и распространение НІМ-1 инфекции также внесли свой вклад в возрастающую потребность в тромбоцитах.Vysosa 80(2): 302 - 307(1992). This is largely due to the improvement of medical methods and the spread of new technologies in cardiac surgery, as well as bone marrow, heart and liver transplants. Increasing doses of chemopreparations in the treatment of cancer patients and the spread of NIM-1 infection also contributed to the increasing need for platelets.

Переливание тромбоцитов несет с собой возможность распространения многих заболеваний, передающихся с кровью, а также возможность аллоиммунизации. Кроме того, получение очищенньх тромбоцитов - процедура дорогостоящая и все более частое ее применение ведет к возрастанию общих медицинских расходов. Позтому существуєт острая необходимость в новьїх усовершенствованньх методах получения тромбоцитов для переливания людям.Transfusion of platelets carries with it the possibility of spreading many blood-borne diseases, as well as the possibility of alloimmunization. In addition, obtaining purified platelets is an expensive procedure, and its increasingly frequent use leads to an increase in overall medical costs. Therefore, there is an urgent need for new and improved methods of obtaining platelets for human transfusion.

Далее приведеньї некоторье примерь зкспериментальньїх подходов к увеличению образования тромбоцитов.Here are some examples of experimental approaches to increase the formation of platelets.

В патенте США Мо5,032,396 описана способность интерлейкина-7(ІЇ.-7) стимулировать образование тромбоцитов. Интерлейкин-7, известньій также как лимфопозтин-1ї1, зтолимфопозтический ростовой фактор, стимулирующий рост предшественников Т- и В-клеток в костном мозге. В опубликованной заявкеUS patent Mo5,032,396 describes the ability of interleukin-7 (II.-7) to stimulate the formation of platelets. Interleukin-7, also known as lymphopoietin-1, is a lymphopoietic growth factor that stimulates the growth of precursors of T- and B-cells in the bone marrow. In the published application

ІРСТ 88/03747, подана 19 октября 1988 и в заявке на Европейский патент 88309977.2, подана 24 октября 1988) описаньії ДНК, векторьї и необходимье способьі для получения ІЇ/-7 млекопитающих методами генетической инженерии. Даннье, представленнье в патента США, свидетельствуют о том, что 1-7 может увеличивать число циркулирующих тромбоцитов у нормальньх и сублетально облученньх мьішей.IRST 88/03747, filed on October 19, 1988 and in the application for European patent 88309977.2, filed on October 24, 1988) describes the DNA, vectors and the necessary methods for obtaining II/-7 mammals by genetic engineering methods. These data, presented in the US patent, indicate that 1-7 can increase the number of circulating platelets in normal and sublethally irradiated muscles.

В патенте США Мо5,087,448 показано, что мегакариоцитьї и тромбоцитьї млекопитающих можно стимулировать к пролиферации при помощи интерлейкина-6(ІІ-6). Рекомбинантньійй человеческий ІІ -6 представляет собой гликопротеин с мол.массой 26,000, обладающий несколькими биологическими активностями. Представленнье в зтом патенте данньюе указьвают на то, что 1/-6 увеличиваєт образование мегакариоцитарньмх колоний в тестах іп міїго.US patent No. 5,087,448 shows that mammalian megakaryocytes and platelets can be stimulated to proliferate with the help of interleukin-6 (II-6). Recombinant human II-6 is a glycoprotein with a molar mass of 26,000, possessing several biological activities. The presentation in this patent indicates that 1/-6 increases the formation of megakaryocytic colonies in myopic tests.

Ни в одном из процитированньїх патентов не упоминаются Мрі-лигандьі, описаннье в настоящем изобретении.None of the cited patents mention Mri-ligands, which are described in the present invention.

Несмотря на упомянутье достижения, потребность в новьїх стимуляторах мегакариоцитов и/или тромбоцитов у млекопитающих остаєтся весьма острой.Despite the mentioned achievements, the need for new stimulators of megakaryocytes and/or platelets in mammals remains very acute.

Е. Предпосьілки получения химически модифицированного МЕАОЕE. Prerequisites for obtaining chemically modified MEAOE

Белки для терапевтического применения в настоящее время доступнь! в значительньїх количествах и приемлемьїх формах в основном благодаря достижениям технологии рекомбинатньїх ДНК. Химические модификации таких белков могут зффективно предотвращать физический контакт протеолитических ферментов с собственно белковьм каркасом, тем самьм препятствуя деградации. При определенньх условиях могут проявиться и такие преимущества, как увеличение стабильности и времени циркуляции терапевтического белка и уменьшение его иммуногенности. Однако, необходимо подчеркнуть, что зффект модификации в отношений каждого конкретного белка трудно предсказать. Френсисом опубликована обзорная статья, посвященная модификации белков, в том числе и слитньх (Босив оп Сгомп Расіогв 3: 4- 10(Мау, 1992)(опубликовано Меаіїзсгірі, Моипіміеж Соц, Епегп Ватеї І апе, Гопдоп М20, ОГО ОК)).Proteins for therapeutic application are currently available! in significant quantities and acceptable forms mainly thanks to the achievements of recombinant DNA technology. Chemical modifications of such proteins can effectively prevent physical contact of proteolytic enzymes with the actual protein framework, thereby preventing degradation. Under certain conditions, such advantages as an increase in the stability and circulation time of the therapeutic protein and a decrease in its immunogenicity may appear. However, it must be emphasized that the effect of modification in the relationship of each specific protein is difficult to predict. Francis published a review article devoted to the modification of proteins, including fusions (Bosiv op Sgomp Rasiogv 3: 4-10 (Mau, 1992) (published by Meaiizsgiri, Moipimiez Sots, Epegp Vatei I ape, Hopdop M20, OGO OK)).

Полизтиленгликоль("ПОГ", "пог" или РЕС)-одно из химических веществ, применяемьмх для приготовления фармакологических форм терапевтических белков. Например, Адаген-Н, препарат пзгированной аденозиндезаминазь, рекомендован для лечения острого комбинированного иммунодефицита; пзогированная супероксидцисмутаза проходит клинические испьтания для лечения повреждений головь; пзгированньй альфа-интерферон прошел фазу | клинических испьтаний для лечения гепатита; погированная глюкоцереброзидаза и погированньійй гемоглобин находятся на стадий доклинических испьтаний. Для некоторьх белков показано, что прикреплениеє полизтиленгликоля защищает от протеолиза (Зада евї а!., У. Реппепіайоп Віоепдіпеегіпод 71: 137:139(1991)), и известнь! методь! присоединения полизтиленгликоля |см. Патент США Мо4,179,337, Юамів еї аї., "Неиммуногеннье полипептидь!", вьіданньій 18 декабря 1979, и Патент США Ме4,002,531, Коуєг "Шодификация ферментов полизтиленгликолем, и продукть! зтого процесса", вьіданньй 11 января 1977). В качестве обзора |см.Polyethylene glycol ("POG", "pog" or RES) is one of the chemicals used for the preparation of pharmacological forms of therapeutic proteins. For example, Adagen-H, a modified adenosine deaminase drug, is recommended for the treatment of acute combined immunodeficiency; pzogirovannaya superoxide cismutase is undergoing clinical trials for the treatment of a damaged head; pzgirovanny alpha-interferon passed the phase | clinical trials for the treatment of hepatitis; Purified glucocerebrosidase and purified hemoglobin are at the stage of preclinical testing. For some proteins, it has been shown that the attachment of polysethyleneglycol protects against proteolysis (Zada evyi a!., U. Reppepiyop Vioepdipeegipod 71: 137:139(1991)), and lime! method! addition of polyethylene glycol | see. U.S. Patent No. 4,179,337, Ai Yuamiv, "Nonimmunogenic Polypeptide!", issued December 18, 1979, and U.S. Patent No. 4,002,531, Kouyeg, "Enzyme Modification with Polyethylene Glycol, and the Product of the Process," issued January 11, 1977). As an overview, see

Ариспомузкі єї а!., іп Епгутев аз ЮОгид»г(у. 5. Ноїісегрега апа .). НКобегів, єв. рр. 367 - 383(1981)).Arispomuzki eyi a!., ip Epgutev az YuOgyd»g (u. 5. Noiisegrega apa .). NKobegiv, ev. 367 - 383 (1981)).

Для модификации белков используют и другие водорастворимье полимерьі, такие как сополимер полизтиленгилколь/лпропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловьй спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, кополимер зтилен/малеиновьй ангидрид и полиаминокислотьк(Ккак гомополимерьї, так и случайнье сополимерь!).Other water-soluble polymers are also used to modify proteins, such as polyethylene glycol/propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, poly-1,3,6-trioxane, ethylene/maleic anhydride copolymer, and polyamino acids. (Like homopolymers, and random copolymers!).

Ряд подходов бьл использован для присоединения молекул полизтиленгликоля к белку. Обьічно молекульь полизтиленгликоля присоединяют к белку посредством одной из активньхх групп белка.A number of approaches have been used to attach polyethylene glycol molecules to protein. Generally, a molecule of polyethylene glycol is attached to a protein by means of one of the active groups of the protein.

Подходящими для такого присоединения являются аминогруппьії, например аминогруппь! остатков лизина или аминогруппьі! М-конца. Например, Ройер (Патент США Ме4,002,531| использовал восстанавливающее алкилирование для присоединения молекул полизтиленгликоля к ферменту. В Европейском патентеAmino groups, for example amino! residues of lysine or amino groups! M-end. For example, Royer (US Pat. No. 4,002,531) used reductive alkylation to attach polyethylene glycol molecules to the enzyme. In European Pat.

Ме0539167 на "Имидатьї ПОГа и их белковье производнье", опубликованном 28 апреля 1993г., Райт описьшвает опептидьі и органические соединения со свободной аминогруппой(группами), модифицированньми имидатньми производньми ПЗГа или другими водорастворимьми органическими полимерами. В Патенте США Ме4,904,584, вьіданном 27 февраля 1990г., Шоу описьівает модификацию остатков лизина в белках для присоединения молекул полизтиленгликоля через реактивнье аминогруппь!.Me0539167 on "Imidates of POG and their protein derivatives", published on April 28, 1993, Wright describes peptide and organic compounds with free amino group(s), modified imidates of POG or other water-soluble organic polymers. In US Patent No. 4,904,584, issued on February 27, 1990, Shaw describes the modification of lysine residues in proteins to attach polysethylene glycol molecules through reactive amino groups.

Один из терапевтических белков, которьій бьіл химически модифицирован, зто - гранулоцитарньй колониестимулирующий фактор, "3-С5Е" см. ЕР Ме0401384, ЕР Ме0473268 и ЕР Ме0335423).One of the therapeutic proteins, which has been chemically modified, is the granulocyte colony-stimulating factor, "3-C5E", see EP Me0401384, EP Me0473268 and EP Me0335423).

Другим примером служит пзгированньй І/-6 (см. Европейский патент Ме0442724, озаглавленньй "Модифицированньй ПІІ -6", а также родственную заявку ШО. 5. 07/632,070, в которой описань! молекуль! полизтиленгликоля, присоединенньюе к І/-6. В Европейском патенте Мо0154316, опубликованном 11 сентября 1985, описано взаймодействиеє лимфокина с альдегидом полизтиленгликоля|.The second example is modified I/-6 (see European patent Me0442724, entitled "Modified PII-6", as well as related application SH. 5. 07/632,070, which describes a molecule of polyethylene glycol attached to I/-6. In the European patent Mo0154316, published on September 11, 1985, the interaction of lymphokine with polysethylene glycol aldehyde is described.

Возможность модификации МОРЕ о неизвестна, поскольку она определяєтся специфическими структурньми параметрами каждого конкретного белка. Кроме того, непредсказуемо воздействие такой модификации на биологические свойства отдельного белка. В силу многочисленньїх клинических применений МООРЕ, описанньїх в настоящей заявке, бьіло бьї желательно получить і производное зтого белка с измененньіми свойствами. Подобнье молекуль! могли бьї иметь увеличенное время полужизни и/или усиленную активность іп мімо, наряду с другими свойствами.The possibility of modification of MOPE is unknown, since it is determined by the specific structural parameters of each specific protein. In addition, the impact of such a modification on the biological properties of an individual protein is unpredictable. Due to the numerous clinical applications of MOORE, described in this application, it is desirable to obtain a derivative of this protein with modified properties. Like molecules! may have an increased half-life and/or increased activity and mimo, along with other properties.

Погирование белка обьічно приводит к образованию смеси молекул химически модифицированного белка. Например, молекуль! белка с пятью остатками лизина и свободной аминогруппой на М-конце при пзгирований по описанному методу могут образовать гетерогенную смесь, в которой некоторне молекуль! белка будут иметь шесть присоединенньїх молекул ПЗГа, некоторье - пять, некоторье - четьіре или три, или две, или одну, или вообще ни одной.Digestion of protein leads to the formation of a mixture of chemically modified protein molecules. For example, a molecule! a protein with five lysine residues and a free amino group at the M-end, when digested according to the described method, can form a heterogeneous mixture in which some molecules! the protein will have six attached PZH molecules, some - five, some - four, or three, or two, or one, or none at all.

При зтом полизтиленгликолевье группь! могут бьіть присоединень! к различньмм молекулам белка в различньїхх участках.At the same time polystylene glycol groups! many connections can be made! to different protein molecules in different areas.

Часто желательно получить гомогенньій продукт, содержащий по существу всего одну или небольшое число(2 - 3) форм модифицированного белка, отличающихся числом и/или локализацией полизтиленгликолевьїх групп. Однако, при некоторьїх терапевтических показаниях могут бьіть желательнь или пригоднь!ї смеси моно-, ди- и/или три-пзгированньїх форм.It is often desirable to obtain a homogeneous product containing essentially only one or a small number (2-3) of modified protein forms differing in the number and/or localization of polysethylene glycol groups. However, for some therapeutic indications, a mixture of mono-, di- and/or tri-forms may be desirable or convenient.

Непостоянство смеси от партии к партий является недостатком при разработке терапевтического пзгированного белка. В зтом случає важна предсказуемость биологической активности. Например, показано, что при неселективной коньюгации супероксиддисмутазьї с полизтиленгликолем отдельнье фракции модифицированного фермента оказьвваются полностью неактивньми |Р. МесСої еї аї., Спет.The inconsistency of the mixture from batch to batch is a disadvantage in the development of therapeutic protein. In this case, the predictability of biological activity is important. For example, it has been shown that during non-selective conjugation of superoxide dismutase with polyethylene glycol, individual fractions of the modified enzyme turn out to be completely inactive |P. MesSoi ei ai., Spet.

РІпапт. Ви. 36:3079 - 3091(1988)). (См. также Нозе еї аї., Віосопішдаїє СПпетівігу 2: 154 - 159(1991)|, которьми показано селективное прикрепление линкерной группь! карбоксигидразида к С-концу карбоксильной группьі белкового субстрата(инсулина). Если терапевтический белок непостоянен по составу от партии к партии, предсказуемость его свойств недостижима. Отдельнье молекуль! полизтиленгликоля в определенньїх участках могут бьіть прикреплень! слабее, чем в других, что может приводить к диссоциации ПОЗГа и белка. Очевидно, если молекуль ПОЗГа случайньм образом присоединеньї к белку и диссоциируют также случайно, фармакокинетику терапевтического белка точно предсказать невозможно.RIPapt. You. 36:3079 - 3091(1988)). (See also Noze ei ai., Viosopishdaiye SPpetiviga 2: 154 - 159(1991) | which shows the selective attachment of linker groups of carboxyhydrazide to the C-terminus of the carboxyl group of the protein substrate (insulin). batch, the predictability of its properties is unattainable. A separate molecule! polyethylene glycol in certain areas can be attached! weaker than in others, which can lead to the dissociation of POZHA and the protein. Obviously, if the POZHA molecule randomly attaches to the protein and dissociates also randomly, the pharmacokinetics of the therapeutic it is impossible to accurately predict protein.

Таюже весьма желательньм бьло бьї получить такое производноеє МООРЕ, в котором бьі отсутствовало соединительноє звено между полимером и белком. Одна из проблем, связанньїх с применением описанньїх вьіше методов, состоит в том, что обьічно требуєтся некое соединительноеє звено между белком и молекулой полизтиленгликоля. Зто соединительное звено может бьіть антигеном, что также является недостатком при разработке терапевтического препарата белка.It would also be highly desirable to obtain such a MOORE derivative in which there was no connecting link between the polymer and the protein. One of the problems associated with the use of the described methods is that a certain connecting link between the protein and the polyethylene glycol molecule is usually required. Therefore, the connecting link can be attacked by an antigen, which is also a disadvantage in the development of a protein therapeutic drug.

Методьі! без участия соединительньїх групп описань! (Егапвіз еї аї.,, в кн. "Стабильность белковьх фармацевтических препаратов: пути деградации іп мімо и стратегия стабилизации белков"(Ейа. АНет.,Т. апа Маппіпод, М. С.) Ріеєпит, Мем могк, 19911. |(См. также Оедадо еї а!., "Соединение ПЗГа с белком путем активации с трезил-хлоридом, применения в иммуноаффинньх клеточньїх препаратах и РізнНег еї аї., ред.,Methods! without the participation of connecting groups of descriptions! (Egapviz ei ai.,, in the book "Stability of protein pharmaceutical preparations: ways of degradation of mimo and strategy of stabilization of proteins" (Eya. ANet., T. apa Mappipod, M. S.) Riepyt, Mem mogk, 19911. |( See also Oedado et al., "Combination of PZGa with protein by activation with tresyl chloride, application in immunoaffinous cell preparations and Miscellaneous et al., ed.,

Разделение с использованием систем с водной фазой, Применение в клеточной биологиий и биотехнологии, Ріепит Ргевгв5, М. МУ., 1989, стр. 211 - 213), где описано использование трезил-хлорида, что приводит к отсутствию соединительньх групп между полизтиленгликолем и белком. Данньій метод трудно применить для получения терапевтических препаратов, поскольку использование трезил-хлорида приводит к образованию токсичньїх побочньїх продуктов.Separation using systems with an aqueous phase, Application in cell biology and biotechnology, Ryepyt Rhevgv5, M. MU., 1989, pp. 211 - 213), where the use of tresyl chloride is described, which leads to the absence of connecting groups between polysethylene glycol and protein. This method is difficult to apply to obtain therapeutic drugs, since the use of tresyl chloride leads to the formation of toxic side products.

Спатом сеї аї., Віосопіндає Спет. 5: 133 - 140(1994)) описали модифицирование СО4- иммуноадгезина альдегидом моно-метокси полизтиленгликоля("МеРЕеС") посредством восстановительного алкилирования. Авторьї сообщают, что 5095 СО4-Ід било модифицировано МеРЕгЕС при селективной реакции по альфа-аминогруппе М-конца Ісм. цит. источник, стр. 137). Авторь! также сообщают, что способность модифицированного СО4-Ід связьіваться іп мімо с белком др120 уменьшалась в зависимости от степени связьівания с МеРЕа.Spatom sei ai., Viosopindae Spet. 5: 133 - 140 (1994)) described the modification of СО4-immunoadhesin with aldehyde mono-methoxy polysethylene glycol ("MeРЕС") by means of reductive alkylation. The authors report that 5095 CO4-Id was modified by MeREgES during a selective reaction on the alpha-amino group of the M-terminus of Ism. quote source, p. 137). The author! they also report that the ability of modified CO4-Id to bind ip mimo to protein dr120 decreased depending on the degree of binding to MeRea.

Таким образом, имеется потребность в производньїх МООЕ, в частности в пзгированном МООБ.Thus, there is a need for MOOE derivatives, in particular, in modified MOOB.

Существуєт также необходимость разработки способов получения подобньїх производньмх.There is also a need to develop methods for obtaining similar derivatives.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В настоящем изобретении заявленьі новьіе полипептидьії, специфически усиливающие рост и/или развитие мегакариоцитов("Мрі-лигандьі" или "МаОЕв5"), которне, по существу, свободньц(т. е. очищеньї) от других белков(т. е. белков млекопитающих в случає Мрі-лигандов, получаемьх из соответствующих источников). Зти белки могут бьіть вьіделень из клеток, продуцирующих факторь!ї естественньім образом или в силу индукции другими факторами. Они могут также бьть полученьї методами генетической инженерии. Кроме того, Мрі-лигандь! могут бьіть синтезированьі химическими методами или получень при комбинирований описанньх подходов.The present invention claims new polypeptides that specifically enhance the growth and/or development of megakaryocytes ("Mri-ligands" or "MaOEv5"), which are essentially free (i.e., purified) from other proteins (i.e., mammalian proteins in the case of Mri-ligands obtained from relevant sources). These proteins can be secreted from cells that produce factors naturally or due to induction by other factors. They can also be obtained by methods of genetic engineering. In addition, Mri-ligand! they can be synthesized by chemical methods or obtained by combining the described approaches.

Заявленнье в настоящем изобретений Мрі-лигандь! могут бьіть полученьї в нативном виде из клеток и тканей млекопитающих. В разделе Примеров настоящей заявки описань! два Мрі-лиганда, виіделенньке из апластической плазмь собак. Однако, как описано в других Примерах настоящей заявки, близко родственнье Мрі-лигандьі присутствуют в апластической плазме человека и свиньи. Примечательно, что активность человеческого, свиного и собачьего Мрі-лиганда специфически подавляєтся растворимой формой мьшиного Мрі-рецептора, что свидетельствует о сильном сходстве зтих Мрі-лигандов как в отношений структурь, так и в отношений функции.Statement in the present invented Mri-ligand! they can be obtained in their native form from mammalian cells and tissues. In the Examples section of this application, descriptions! two Mri-ligands isolated from aplastic plasma of dogs. However, as described in the second Examples of this application, closely related Mri-ligands are present in the aplastic plasma of humans and pigs. It is noteworthy that the activity of human, porcine, and dog Mri-ligand is specifically suppressed by the soluble form of the mouse Mri-receptor, which indicates a strong similarity of these Mri-ligands both in terms of structures and functions.

Мрі-лигандьй человека, свиньи и других млекопитающих могут бьть вьделень из природньх источников методами, описанньми в настоящей заяявке(см. Пример 10). Таким образом, настоящееєе изобретение включаєт в себя Мрі-лигандь! млекопитающих, т. е. собаки, свиньи, человека, мьіши, лошади, овць и кролика. Особенно предпочтительньіми являются Мрі-лигандь! собаки, свиньи и человека.Mri-ligand of humans, pigs and other mammals can be extracted from natural sources by the methods described in this application (see Example 10). Thus, the present invention includes Mri-ligand! mammals, i.e. dogs, pigs, humans, mice, horses, sheep and rabbits. Especially preferred are Mri-ligands! dogs, pigs and humans.

Кроме того, гень, кодирующие Мрі-лигандьй человека, бьли клонированьй из библиотек змбриональньх почки и печени. Зти геньї! просеквенировань, как описано в разделе Примеров настоящей заявки. Показано, что две полипептиднье последовательности человека обладают активностью в клеточньїх тестах(см. Пример 4). Они отличаются по длине, однако идентичнь! в значительной части своих аминокислотньїх последовательностей. Одинаковье участки имеют гомологию с зритропозтином. Мрі- лигандьі обозначаются и как факторь! роста и развития мегакариоцитов(МСОЕ5); все указания на Мрі- лигандь имеют такое же отношение и к МООЕ5, и наоборот. "ЄБПолипептид МОЮЕ" означаєт полипептид, обладающий способностью специфически стимулировать или ингибировать рост и/или развитие мегакариоцитов. Примерь! подобньїх полипептидов приведень в настоящей заявке.In addition, genes encoding human Mri-ligand were cloned from embryonic kidney and liver libraries. You are a genius! screening as described in the Examples section of this application. It is shown that two human polypeptide sequences have activity in cell tests (see Example 4). They differ in length, but they are identical! in a significant part of its amino acid sequences. Identical sites have homology with zritropoztin. Mri-ligands are designated as a factor! growth and development of megakaryocytes (MSOE5); all references to Mriligand have the same relation to MOOE5, and vice versa. "EBPolypeptide MOUE" means a polypeptide that has the ability to specifically stimulate or inhibit the growth and/or development of megakaryocytes. Try it! similar polypeptides are given in this application.

Описаннье в настоящем изобретений Мрі-лигандьь проявляют специфическую активность по отношению к мегакариоцитарному ростку кроветворения, усиливая созревание и/или пролиферацию мегакариоцитов, как зто показано в Примерах 2 и 4 далее. Термин "специфически" означаєет, что биологическая активность полипептидов проявляеєется в значительной степени в отношений мегакариоцитов, нежели в отношений клеток других типов. Те факторь), которне обладают стимулирующим воздействием на мегакариоцить, имеют іп мімо активность, стимулирующую образование тромбоцитов. Происходит зто посредством стимуляции созревания и дифференцировки мегакариоцитов.The Mri-ligand described in the present invention exhibits specific activity in relation to megakaryocytic sprouts of hematopoiesis, enhancing the maturation and/or proliferation of megakaryocytes, as shown in Examples 2 and 4 below. The term "specific" means that the biological activity of polypeptides is manifested to a greater extent in the relations of megakaryocytes than in the relations of cells of other types. That factor), which has a stimulating effect on megakaryocytes, also has activity that stimulates the formation of platelets. This happens by means of stimulation of maturation and differentiation of megakaryocytes.

Два предпочтительньїх Мрі-лиганда собачьего происхождения имеют молекулярнье массь около 25кД и ЗікД, как определено злектрофорезом в полиакрилмидном геле с додецилсульфатом натрия(505-Two preferred Mri-ligands of canine origin have molecular weights of about 25 kD and ZikD, as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (505-

РАСІЕ) в невосстанавливающих условиях. Оба белка бьли очищень по одной и той же методике, приведенной в разделе Примеров.RASIE) in non-restorative conditions. Both proteins were purified according to the same method given in the Examples section.

Два предпочтительньїх лиганда человеческого происхождения, МОЮОЕ-1 и МООБ-2, состояЯт соответственно из 332 и 174 аминокислот и не включают 21 аминокислоту предполагаемого сигнального пептида.Two preferred ligands of human origin, MOYUE-1 and MOOB-2, consist of 332 and 174 amino acids, respectively, and do not include the 21 amino acids of the putative signal peptide.

Другим аспектом настоящего изобретения являются процессь! вбіделения и очистки указанньїх Мрі- лигандов или их фрагментов из природньїх источников, предпочтительно цельной крови, сьіворотки или плазмьї млекопитающих. В качестве исходного материала найболее предпочтительнь! апластические кровь, сьіворотка или плазма. Они могут бьть полученьї с использованием процедурь облучения млекопитающих, например, дозой около 400 - в0брад с помощью кобальта-60 и, что делает данньх животньїх апластичньми. Подобная процедура хорошо известна, как видно из публикаций, процитированньх в Примере 1. В случає человека апластические кровь, сьіворотка или плазма могут бьіть получень от пациентов, проходящих радиотерапию, например, при онкологических заболеваниях.The second aspect of the present invention is the process! bleaching and purification of the specified Mr-ligands or their fragments from natural sources, preferably whole blood, serum or mammalian plasma. As a starting material, it is most preferable! aplastic blood, serum or plasma. They can be obtained using mammalian irradiation procedures, for example, with a dose of about 400 - v0rads with the help of cobalt-60, which makes these animals aplastic. A similar procedure is well known, as can be seen from the publications cited in Example 1. In the case of a human, aplastic blood, serum or plasma can be obtained from patients undergoing radiotherapy, for example, with oncological diseases.

Затем апластические кровь, сьворотка или плазма подвергаются процессу очистки. Заявленньй в настоящем изобретении процесс очистки осостоит из нескольких ключевьх зтапов: аффинной хроматографии с лектином и аффинной хроматографии с Мрі-рецептором. Каждьй из зтих зтапов даєет приблизительно 300 - 500-кратную очистку 25кД и З1кД белков из апластической плазмь! собаки. Другие стандартньюе методьі очистки белков могут бьїть использованьі вместе с указанньми для дальнейшей очистки Мрі-лигандов, как зто описано ниже.Then aplastic blood, serum or plasma undergo a purification process. The purification process described in the present invention consists of several key steps: affinity chromatography with lectin and affinity chromatography with the MRI receptor. Each of these steps gives approximately 300-500-fold purification of 25kD and 31kD proteins from aplastic plasma! dogs. Other standard methods of protein purification can be used together with instructions for further purification of Mri-ligands, as described below.

Другим аспектом настоящего изобретения являются полинуклеотидьі, коюодирующие белок Мрі-лиганда млекопитающих. Такие последовательности ДНК могут включать вьіделенньюе последовательности ДНК, которне направляют зкспрессию белков Мрі-лигандов млекопитающих, как зто описано далее. Зти последовательности ДНК могут также включать 5 и 3 некодирующие последовательности млекопитающих, ланкирующие кодирующие последовательности Мрі-лигандов. Кроме того, последовательности ДНК могут кодировать аминотерминальньй сигнальньй пептид. Подобнье последовательности могут бьіть полученьі любь!м из известньїх методов, включая полньїй или частичньй химический синтез. Кодоньі могут бьть оптимизированьй для зкспрессии в определенном хозяине(например, Е. соїї или клетках СНО).The second aspect of the present invention are polynucleotides co-coordinating the mammalian Mri-ligand protein. Such DNA sequences may include a specific DNA sequence that directs the expression of mammalian Mri-ligand proteins, as described below. These DNA sequences can also include 5 and 3 non-coding sequences of mammals, linking coding sequences of Mri-ligands. In addition, DNA sequences can encode an amino-terminal signal peptide. Similar sequences can be obtained by any of the known methods, including full or partial chemical synthesis. Each can be optimized for expression in a specific host (for example, E. soybean or CHO cells).

В настоящем изобретениий также заявленьі рекомбинантнье молекульй ДНК, каждая из которьх представляет собой векторную ДНК, соединенную с последовательностями ДНК, кодирующими Мрі- лиганд млекопитающих. В зтих рекомбинантньїх молекулах ДНК Мрі-лиганда функционально соединена с регуляторной последовательностью, обеспечивающей репликацию и зкспрессию Мрі-лиганда в определенньїх клетках-хозяевах. Клетки-хозяева(например, бактерий, насекомьх, млекопитающих, дрожжей или растений), трансформированнье такими молекулами ДНК с целью зкспрессии рекомбинатного белка Мрі-лиганда, также являются предметом данного изобретения.The invention also claims recombinant DNA molecules, each of which is a vector DNA connected to DNA sequences encoding mammalian Mrligand. In these recombinant DNA molecules, the Mri-ligand is functionally connected to a regulatory sequence that ensures replication and expression of the Mri-ligand in certain host cells. Host cells (for example, bacteria, insects, mammals, yeasts or plants), transformed by such DNA molecules for the purpose of expressing the recombinant Mri-ligand protein, are also the subject of this invention.

Молекуль! ДНК и трансформированньюое клетки, заявленнье в настоящем изобретенийи, могут бьїть использованьї для получения рекомбинатного белка Мрі-лиганда млекопитающих или его фрагментов.Molecules! DNA and transformed cells, the application of the present invention, can be used to obtain a recombinant mammalian Mri-ligand protein or its fragments.

Клеточную линию, трансформированную последовательностями ДНК, кодирующими Мрі-лиганд или его фрагмент(или упомянутьмми вьіше рекомбинантньми молекулами ДНК) в функциональной ассоциации с подходящими регуляторньми последовательностями, культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих зкспрессию рекомбинантной ДНК. В зтом процессе многие клеточнье линии могут бьіть использованьі в качестве клеток-хозяев для зкспрессии белка. Предпочтительньмми для получения Мрі- лиганда являются клеточнье линии млекопитающих(например, клетки СНО) и бактериальнье клетки(например, Е. соїЇ).A cell line transformed by DNA sequences encoding Mri-ligand or its fragment (or the above-mentioned recombinant DNA molecules) in functional association with suitable regulatory sequences is cultivated under appropriate conditions that ensure the expression of recombinant DNA. In this process, many cell lines can be used as host cells for protein expression. Mammalian cell lines (for example, CHO cells) and bacterial cells (for example, E. soya) are preferred for the production of Mriligand.

Для получения Мрі-лиганда в клетках Е. соїї предпочтительно, чтобьї на М-конце зкспрессируемого белка находились остатки Меї и Гуз, поскольку в зтом случає вьїход продукта зкспрессии обьічно вьіше.To obtain the Mri-ligand in E. soybean cells, it is preferable that the M-terminus of the expressed protein contains Mey and Goose residues, since in this case the output of the expression product is generally higher.

Человеческий МОРЕ насчитьвает 165 аминокислот |т. е. Меї-Їуз, находящийся на М-конце 1-163Human SEA contains 165 amino acids. e. Mei-Yuz, located at the M-end of 1-163

ФРДМІ(ФРДМ-11) аминокислотьі 1-163 последовательности 5ЕО І0ОМо25)|. После очистки продукта, зкспрессированного в таких бактериальньх клетках, как Е.с оїї, терминальнье Меї-Гув остатки могут бьіть удаленьї обработкой какой-либо дипептидазой(например, катепсином С).FRDMI (FRDM-11) amino acid 1-163 sequence 5EO I0OMo25)|. After purification of the product expressed in such bacterial cells as E. c oii, the terminal Mei-Huv residues can be removed by treatment with any dipeptidase (for example, cathepsin C).

Зкспрессированньй белок Мрі-лиганда затем вьіделяют из клеток-хозяев, клеточного лизата или культуральной средь! одним из обьічньїх методов. Кондиционированная среда может бьіть подвергнута тем же зтапам очистки(или их модификациям) Мрі-лиганда, что и апластическая плазма.The expressed Mri-ligand protein is then isolated from host cells, cell lysate or culture medium! one of the common methods. The conditioned medium can be subjected to the same MRI-ligand cleaning processes (or their modifications) as aplastic plasma.

Другим предметом настоящего изобретения являются рекомбинантньюе Мрі-лигандьі. Зти белки, по существу, свободньі от других биологических структур животного происхождения, в особенности белков.The second subject of the present invention are recombinant Mri-ligands. These proteins are, in fact, free from other biological structures of animal origin, especially proteins.

Заявленнье в настоящем изобретениий Мрі-лигандьі характеризуются одной или более физической, биохимической, фармакологической или биологической активностями. Даннье активности описань! в заявке.The application in this invention Mri-ligands are characterized by one or more physical, biochemical, pharmacological or biological activities. Data activity descriptions! in the application.

В настоящем изобретениий также заявлен химически модифицированньй МОЮ, состоящий из собственно белка МООЕ, соединенного по меньшей мере с одним водорастворимь!м полимером, а также методьй получения и применения таких композиций. В частности, заявлен такой химически модифицированньй МОаОЕ, в котором посредством реакции с ополизтиленгликолем к Маг присоединяєется ПОГ. Подобное соединение может бьть достигнуто такими описьмшваємьми ниже реакциями погирования, как ацилирование или алкилированиєе. Ацилированиє или алкилирование сThe present invention also claims a chemically modified MOE, consisting of the MOOE protein itself, connected to at least one water-soluble polymer, as well as methods of obtaining and using such compositions. In particular, such a chemically modified MOaOE is claimed, in which POG is added to Mag by means of a reaction with polyethylene glycol. A similar compound can be achieved by such combustion reactions as described below, such as acylation or alkylation. Acylation or alkylation with

ПОЗГом могут проводиться в таких условиях, при которьїх конечньійй продукт будет монопзгирован или полипогирован. При полипогирований обьічно происходит прикрепление ПЗГа к зпсилонаминогруппам остатков лизина, при зтом также возможно пзгирование М-конца белка. При монопзгирований предпочтительно происходит присоединение ПОЗГа к альфа-аминогруппе М-конца белка. Вьход и гомогенность продукта реакции монопогирования могут бьть увеличеньй посредством такого восстанавливающего алкилирования, при котором селективно модифицируєется альфа-аминогруппа М- конца белка МООБЕ, тем самьм обеспечивая избирательное прикрепление водорастворимого полимера кPOZG can be carried out under such conditions, under which the final product will be mono- or poly-hybridized. When it is polygyrated, the attachment of PZHa to the psilonamino groups of lysine residues takes place, and the M-terminus of the protein may also be gyrated. When monogyrized, POZG is preferentially attached to the alpha-amino group of the M-terminus of the protein. The yield and homogeneity of the product of the monopogyration reaction can be increased by means of such reductive alkylation, in which the alpha-amino group of the M-end of the MOOBE protein is selectively modified, thereby ensuring the selective attachment of a water-soluble polymer to

М-концу белка. Такой подход позволяет получать преимущественно гомогеннье препарать! коньюгата полимер/МООг-белок, так же как и(в случає использования ПЗГа) препарать! погированного белка МСООБЕ, в которьїх полизтиленгликоль непосредственно соединен с белком.M-end of the protein. This approach makes it possible to obtain a predominantly homogeneous preparation! polymer/MOOg-protein conjugate, as well as (in the case of using PZG) the drug! of the protein of MSOOBE, in which polyethylene glycol is directly connected to the protein.

В настоящем изобретениий также заявленьї фармацевтические препарать(композиции), содержащие терапевтически зффективное количество очищенного природного или рекомбинантного Мрі-лиганда, которьій может бьіть модифицирован таким водорастворимьм полимером, как полизтиленгликоль, вместе с фрамацевтически приемлемьм носителем, растворителем или буфером. Даннье фармацевтические препарать могут бьіть использовань! для лечения таких болезненньїх состояний или расстройств, которье характеризуются недостатком мегакариоцитов и/или тромбоцитов, также как и недостатком Мрі-лиганда іп мімо. Они могут также использоваться профилактически для компенсации ожидаемой потери мегакариоцитов или тромбоцитов(например, при хирургических операциях).In the present invention, the application also includes a pharmaceutical preparation (composition) containing a therapeutically effective amount of purified natural or recombinant Mri-ligand, which can be modified with such a water-soluble polymer as polyethylene glycol, together with a pharmaceutically acceptable carrier, solvent or buffer. This pharmaceutical preparation can be used! for the treatment of such painful conditions or disorders characterized by a lack of megakaryocytes and/or platelets, as well as a lack of Mri-ligand and mimo. They can also be used prophylactically to compensate for the expected loss of megakaryocytes or platelets (for example, during surgical operations).

Таким образом, заявленнье в настоящем изобретениий Мрі-лигандь! могут применяться для лечения апластических анемий, например, для усиления образования тромбоцитов у больньіх(скажем, у больньхThus, the application in the present invented Mri-ligand! can be used for the treatment of aplastic anemia, for example, to increase the formation of platelets in patients (for example, in patients

СПИДОм или у больньхх, подвергнутьїх химиотерапии опухолей). Мрі-лиганд может бьіть использован для лечения таких нарушений кроветворения, как тромбоцитопения. Мрі-лиганд может стать частью сочетанной терапии больньїх, перенесших трансплантацию костного мозга. МИми могут бьїть люди или другие млекопитающие. Мрі-лиганд, полученньїй от одного биологического вида, может применяться для больньїх другого биологического вида.AIDS or in patients undergoing tumor chemotherapy). Mri-ligand can be used to treat such disorders of hematopoiesis as thrombocytopenia. Mri-ligand can become part of the combined therapy of patients who have undergone bone marrow transplantation. People or other mammals can beat us. Mri-ligand obtained from one biological type can be used for patients of the second biological type.

Другим предметом настоящего изобретения является способ лечения других патологических состояний, характеризующихся недостатком тромбоцитов, путем введения больному терапевтически зффективного количества описанного вьіше фармацевтического препарата. Подобнье терапевтические методьй могут предусматривать введение одновременно с Мрі-лигандом или последовательно зффективного количества по меньшей мере одного мегакариоцитарного колониестимулирующего фактора, цитокина(например, ЕРО), растворимого Мрі-рецептора, гематопозтина, интерлейкина, ростового фактора или антител.The second subject of the present invention is a method of treating other pathological conditions characterized by a lack of platelets by administering to the patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation described above. Similar therapeutic methods can provide for the introduction simultaneously with Mri-ligand or sequentially effective amount of at least one megakaryocytic colony-stimulating factor, cytokine (for example, EPO), soluble Mri-receptor, hematopoiesin, interleukin, growth factor or antibodies.

В настоящем изобретений заявленьй также антитела(поликлональнье, моноклональньє, гуманизированнье или рекомбинантнье), а также фрагменть! антител, полученнье(т. е. реагирующие) против Мрі-лиганда млекопитающих или его фрагмента. Соответственно, в настоящее изобретение включень клетки, способнье секретировать такие антитела(т. е. гибридомь! в случаеє моноклональньх антител), методьї получения таких антител и их применения в диагностических и терапевтических целях.In the present, the claimed antibody (polyclonal, monoclonal, humanized or recombinant), as well as a fragment, is invented! antibodies obtained (i.e., reactive) against the mammalian Mri-ligand or its fragment. Accordingly, the present invention includes cells capable of secreting such antibodies (i.e., hybrids! in the case of monoclonal antibodies), methods of obtaining such antibodies and their use for diagnostic and therapeutic purposes.

Другим предметом настоящего изобретения является способ определения Мрі-лиганда в жидкостях организма. При зтом могут бьіть использованьї антитела, специфически распознающие Мрі-лиганд, как в "сзндвич"-варианте, так и сами по себе. Подобньйй подход может бьїть использован для определения необходимости введения больному Мрі-лиганда и/или вьіявления у данного больного недостаточности тромбоцитов. Реагентьї для постановки подобньїх тестов могут бьїть собраньії в набор, включающий положительньй и отрицательньй контроли, антитела и другие стандартнье компоненть! таких наборов.The second subject of the present invention is a method for determining Mri-ligand in body fluids. At the same time, the use of antibodies that specifically recognize Mri-ligand, both in the "szndvych" variant and by themselves, can be effective. A similar approach can be used to determine the need for the introduction of Mri-ligand to the patient and/or the detection of thrombocyte deficiency in this patient. Reagents for performing such tests can be assembled into a set that includes positive and negative controls, antibodies and other standard components! such sets.

Другие аспекть и преймущества заявленного изобретения станут очевидньми из последующего подробного описания вариантов его осуществления.Other aspects and advantages of the claimed invention will become apparent from the following detailed description of the variants of its implementation.

Краткое описание рисунковA brief description of the drawings

Многочисленнье прейимущества настоящего изобретения будут более очевиднь! при рассмотрений следующих чертежей: фиг.1 отражаєт развитие и созревание мегакариоцитов и тромбоцитов; фиг.2 показьшвает, что растворимьй мьшиньй Мрі-рецептор практически полностью подавляет способность плазмь! облученньіїх собак(апластическая собачья" или "АРКОУ") индуцировать развитие мегакариоцитов. Тест на развитие мегакариоцитов описан в Примере 2; фиг.3 показьіваєт, что активность АРКУ, обогащенная аффинной хроматографией с лектином и аффинной хроматографией с Мрі-рецептором("Мрі-лиганд"), стимулирует рост клеток 1А6б.1 и что растворимьй мьішиньй Мрі-рецептор блокирует зтот рост; фиг.4 приводит обзор зтапов очистки 25кД и ЗікД форм Мрі-рецептора собаки из апластической плазмь собаки; фиг.5 показьшвает очистку Мрі-лиганда обратно-фазовой хроматографией вьісокого разрешения(АР-Numerous advantages of the present invention will be more obvious! When considering the following drawings: Fig. 1 reflects the development and maturation of megakaryocytes and platelets; Fig. 2 shows that the soluble murine MRI receptor almost completely suppresses the ability of plasma! irradiated dogs (aplastic canine" or "ARKO") to induce the development of megakaryocytes. The test for the development of megakaryocytes is described in Example 2; Fig. 3 shows that the activity of ARKU, enriched by affinity chromatography with lectin and affinity chromatography with Mri-receptor ("Mri-ligand "), stimulates the growth of 1A6b.1 cells and that the soluble muscle Mri-receptor blocks this growth; Fig. 4 provides an overview of the purification steps of the 25kD and ZikD forms of the Mri-receptor of the dog from the aplastic plasma of the dog; Fig. 5 shows the purification of the Mri-ligand inversely by high-resolution phase chromatography (AP-

НРІ С). Во фракции 21 содержится вьісокоочищенньй З1ікД Мрі-лиганд; фракция 22 содержит смесь Зікд и 25КД Мрі-лиганда; фракция 23 содержит внісокоочищенньй 25кКД Мрі-лиганд; фиг.6 показьіваєт сравнение активностей Мрі-лиганда во фракциях, полученньїх ВР-НРІ С(колонка С4) и содержащих 25кД и/или З1кД белки Мрі-лиганда; фиг.7 отражаєт количество мегакариоцитов, образовавшихся в культурах СО34-положительньх клеток периферической крови, стимулированньїх АРКУ, Мрі-лигандом и различньіми другими факторами; фиг.8 отражаеєт общее количество лимфоцитов, образовавшихся в культурах СОЗ4-положительньх клеток периферической крови, стимулированньїх АРКУ, Мрі-лигандом и различньіми другими факторами; фиг.9 отражает процент мегакариоцитов, образовавшихся в культурах СО34-положительньїх клеток периферической крови, стимулированньїх АРКО9, Мрі-лигандом и различньіми другими факторами; фиг. 10 показьюшвает, что І/-3 человека не участвует в индуцированном Мрі-лигандом развитии мегакариоцитов; фиг.11 представляет последовательности кДНК и предсказанньсе аминокислотнье последовательности МООЕ-1 и МООЕ-2 человека; фиг.12 представляет последовательность кДНК и предсказанную аминокислотную последовательность МЕЮЕ-3 человека; фиг.13 демонстрирует сравнение МООБ-1 и МООР5(Мрі-лигандов) собачьего(А) и мьшиного(В) происхождения; фиг.14 показьвает пример ацилирования МООЕ с использованием М-гидроксисукцинимидил(МНО) активньїх зфиров монометокси-полизтиленгликоля для получения полипзгированного продукта; фиг.15 опоказьваеєт пример неспецифического восстановительного алкилирования МОБ с использованием альдегидов монометокси-полизтиленгликоля для получения полипзгированного продукта; фиг. 16 показьівает пример сайт-специфического восстановительного алкилирования МООЕ по альфа- аминогруппе М-терминального остатка с использованием альдегидов моно-метоксиполизтиленгликоля для получения, по существу, монопзгированного продукта; фиг.17 демонстрирует НРІ С анализ на оснований исключения по размерам(5ЕС НРІ С ) коньюгатовNRI C). Fraction 21 contains highly purified Z1ikD Mri-ligand; fraction 22 contains a mixture of Zikd and 25KD Mri-ligand; fraction 23 contains highly purified 25kD Mri-ligand; Fig. 6 shows a comparison of Mri-ligand activities in fractions obtained by BP-NRI C (column C4) and containing 25kD and/or 31kD Mri-ligand proteins; Fig.7 shows the amount of megakaryocytes formed in cultures of CO34-positive cells of peripheral blood, stimulated by ARKU, Mri-ligand and various other factors; Fig. 8 shows the total number of lymphocytes formed in cultures of SOC4-positive cells of peripheral blood, stimulated by ARKU, Mri-ligand and various other factors; fig.9 shows the percentage of megakaryocytes formed in cultures of CO34-positive cells of peripheral blood, stimulated by ARKO9, Mri-ligand and various other factors; fig. 10 shows that human I/-3 is not involved in the development of megakaryocytes induced by Mri-ligand; Fig. 11 represents cDNA sequences and predicted amino acid sequences of human MOOE-1 and MOOE-2; Fig.12 represents the cDNA sequence and the predicted amino acid sequence of human MEUE-3; Fig. 13 shows a comparison of MOOB-1 and MOOR5 (Mri-ligands) of canine (A) and moose (B) origin; Fig. 14 shows an example of acylation of MOOE using M-hydroxysuccinimidyl (MNO) active monomethoxy-polyethylene glycol esters to obtain a polypsylated product; Fig.15 shows an example of non-specific reductive alkylation of MOB using monomethoxy-polyethylene glycol aldehydes to obtain a polypsylated product; fig. 16 shows an example of site-specific reductive alkylation of MOOE on the alpha-amino group of the M-terminal residue using aldehydes of mono-methoxypolyethylene glycol to obtain, essentially, a monopyridated product; Fig. 17 shows NRI C analysis based on size exclusion (5ES NRI C) of conjugates

МеРЕС-МООР, полученньх с применением активированньїх производньїх МеРЕа с мол. весом 20кД:MeRES-MOOR obtained with the use of activated MeRES derivatives with mol. weighing 20kD:

А. поли-МеРЕС-МООЕ-коньюгат, полученньй путем ацилирования МОБ /МН5-зфиромA. poly-MeRES-MOOE-conjugate obtained by acylation of MOB/MH5-Zphyro

МеРЕЧ(РЕСІ11);MeRECH(RESI11);

Б. поли-МеРЕС-МООР-коньюгат, полученньй путем алкилирования МООР МеРЕСї альдегидом(РЕС 20);B. poly-MeRES-MOOR-conjugate obtained by alkylating MOOR MeRES with aldehyde (RES 20);

В. поли-МеРЕС-МООР-коньюгат, полученньійй путем алкилирования МОРЕ альдегидом МеРЕС(РЕС 16). фиг 18 показьіваєт количество тромбоцитов у мьішей, получавших рекомбинантньй МОР человека: незакрашенньюе звездочки - МОБ 22-353, полученньй в клетках СНО; незакрашеннье кружки - непазгированньій МООЕ 22-184, полученньй в Е. соїї(т.е. МООЕ 1-163); закрашеннье кружки - погированньйB. poly-MeRES-MOOR-conjugate obtained by alkylating MORE with MeRES aldehyde (RES 16). Fig. 18 shows the amount of platelets in mice receiving recombinant human MOR: uncolored asterisks - MOB 22-353, obtained in CHO cells; non-coloring of the circle - unadulterated MOOE 22-184, obtained in E. soy (i.e. MOOE 1-163); coloring the mug - pogirovannj

МО 22-184, полученньй в Е. соїї; фиг. 19 демонстрирует схему очистки - НИМООР. фиг.20 на модели мьішей показьваєет влияние І-НИМОЮК(Е. соїї 1-163) на количество тромбоцитов. В день 0 мьішам Ваїр/с интраперитонеально однократно вводили карбоплатин(1,25мг/мьішь). Контрольной группе мьишей вводили растворитель вместо карбоплатина. Через 24 часа животньім, обработанньм карбоплатином, подкожно вводили растворитель или 100 кг/кг -НИМООРЕ. Иньекции проводили ежедневно до конца зксперимента(п - 10 для каждой группьї; в каждой временной точке кровь брали у пяти животньмх) фиг.21 показьшваєт воздействие І-НИМООЕ(Е.соїї 1-1463) на количество тромбоцитов у облученньх мьішей. В день 0 мьіши Ваїр/с получали однократную дозу 500рад гамма-облучения(цезиевьй источник).MO 22-184, obtained in E. soybean; fig. 19 shows the cleaning scheme - NIMOOR. Fig. 20 on the muscle model shows the influence of I-NIMOYUK (E. soy 1-163) on the number of platelets. On day 0, carboplatin (1.25 mg/mice) was administered intraperitoneally to Vair/s mice once. A control group of mice was injected with a solvent instead of carboplatin. After 24 hours, animals treated with carboplatin were subcutaneously injected with a solvent or 100 kg/kg -NIMOORE. Injections were performed daily until the end of the experiment (n - 10 for each group; blood was taken from five animals at each time point). Fig. 21 shows the effect of I-NIMOOE (E.soyii 1-1463) on the number of platelets in irradiated muscles. On day 0, Vair/s mice received a single dose of 500 rad gamma radiation (cesium source).

Контрольная группа мьішей облучению не подвергалась. Через 24 часа облученньім животньїм подкожно вводили растворитель или 100мкг/кг --НИМООЕ, Иньекции проводили ежедневно до конца зксперимента(пThe control group of mice was not exposed to irradiation. After 24 hours of irradiation, the animals were subcutaneously injected with a solvent or 100 μg/kg --NIMOOE. Injections were carried out daily until the end of the experiment (p

Е 8 для каждой группьї; в каждой временной точке кровь брали у пяти животньх) ; фиг.22 показьшваєт воздействие І-НИМОЮОРЕ(Е. соїї 1-163) на количество тромбоцитов у мьшей, подвергавшихся комбинированному воздействию облучения и карбоплатина. В день 0 мьши Ваїр/с получали однократную дозу 5БОбОрад гамма-облучения(цезиеєвьй источник) и ооднократную дозу карбоплатина(1,25мг/мьішь). Через 24 часа обработанньім животньім подкожно вводили растворитель или 1б0Омкг/кг -НиИМООР. Иньекции проводили ежедневно до конца зксперимента(п - 8 для каждой группьї).E 8 for each group; at each time point, blood was taken from five animals); Fig. 22 shows the effect of I-NIMOUORE (E. soy 1-163) on the number of platelets in mice exposed to the combined effect of irradiation and carboplatin. On day 0, Vair/s mice received a single dose of 5 BObOrad gamma radiation (caesium source) and a single dose of carboplatin (1.25 mg/mouse). After 24 hours, treated animals were subcutaneously injected with solvent or 1b0Omkg/kg -NiIMOOR. Injections were performed daily until the end of the experiment (n - 8 for each group).

Большинство животньїх, не получавших г-НИМОЮЕ, не вьїжило. В контрольной группе вьїжило 1 животное из восьми. В опьітной группе вьїжило 8 животньх из 8; фиг.23 показьвваєт воздействие І-НИМОЮК(Е. соїї 1-163) на вьізванную облучением тромбоцитопению у макаков резус. Обезьянь! получали дозу облучения 700ссу, Со-80. В течение 18 дней спустя 24 часа после облучения животньім вводили подкожно г-НИМаЮм (п - 3) или сьівороточньійй альбумин человека(п - 9)каждьй в дозе 25мкг/кг/день). Анализ клеток крови проводили при помощи злектронного анализатора.Most of the animals that did not receive Mr. NIMOUE did not survive. One animal out of eight survived in the control group. 8 out of 8 animals lived in the experimental group; Fig. 23 shows the effect of I-NIMOYUK (E. soy 1-163) on radiation-induced thrombocytopenia in rhesus macaques. Monkeys! received a radiation dose of 700 csu, Co-80. Within 18 days, 24 hours after irradiation, animals were injected subcutaneously with g-NIMAYum (n - 3) or human serum albumin (n - 9) each at a dose of 25 μg/kg/day). Analysis of blood cells was carried out with the help of an electron analyzer.

Каждьй значок представляеєт среднееє значение(-/- среднее отклонение) ; фиг.24 показьваєт зффект опогированного и гликозилированного І-НиИМООЕ на количество тромбоцитов у мьшей, обработанньх карбоплатином и облучением. Мьши бьли подвергнуть комбинированному воздействию карбоплатина и облучения, как зто описано в зксперименте, представленном на фиг.22. Подкожнье введения указанного препарата І/-НимМмОаОР(5Оомкг/кг/день) производили ежедневно в течение всего зксперимента, начиная с 24 часов после исходной обработки.Each icon represents the average (-/- average deviation); Fig. 24 shows the effect of opiginated and glycosylated I-NiIMOOE on the number of platelets in mice treated with carboplatin and radiation. The mice were exposed to the combined effect of carboplatin and irradiation, as described in the experiment presented in Fig.22. Subcutaneous administration of the specified drug I/-NimMmOaOR (5Omkg/kg/day) was performed daily throughout the experiment, starting 24 hours after the initial treatment.

Подсчет клеток крови поводили в указаннье дни с помощью злектронного счетчика клеток(Зуєтех, Вахіеї) фиг.25 демонстрирует последовательность синтетического рекомбинантного Маре человека(аминокислоть 1-163), имеющего кодоньї, оптимизирующие зкспрессию в Е. сої.Counting of blood cells was carried out in the indicated days with the help of an electronic cell counter (Zuyeh, Vakhiei). Fig. 25 shows the sequence of synthetic recombinant human Mare (amino acid 1-163), which has codons that optimize expression in E. soy.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Дополнительньюе аспектьй и преймущества изобретения станут более ясньми для специалистов, работающих в данной области исследований, из приведенного ниже описания, которое раскрьваєт практические возможности использования изобретения.Additional aspects and advantages of the invention will become clearer to specialists working in this field of research from the following description, which reveals the practical possibilities of using the invention.

Новье факторьі, усиливающие рост мегакариоцитов млекопитающих, и/или факторьі, продуцируемьсе тромбоцитами, обозначенньюе как Мрі-лигандьй и полученньюе согласно настоящему изобретению, представляют собой гомогенньюе белки, практически свободнье от других подобньіїх белку соединений.New factors that enhance the growth of mammalian megakaryocytes, and/or factors produced by platelets, designated as Mri-ligand and obtained according to the present invention, are homogeneous proteins, practically free of other similar protein compounds.

Предпочтительно, чтобь целевье белки бьли на 9095 свободньй от других белков, более предпочтительно, чтобь! на 9595 и совсем предпочтительно, чтобь! целевье белки бьіли примерно на 9895 и более свободньі от других белков. Указаннье белки могут бьіть полученьь в большом количестве с помощью рекомбинантной технологии таким образом, что конечньй продукт представляет собой обладающие вьсокой степенью чистотьі активнье Мрі-лигандь), которье успешно могут бьть использованьій в терапиий. Альтернативно, такие белки могут бьїть полученьї в гомогенной форме из апластической крови млекопитающих, плазмь или сьшворотки, а также из клеточньїх линий млекопитающих, секретирующих или зкспрессирующих Мрі-лиганд.It is preferable that the target proteins are 9095 free from other proteins, more preferably that! for 9595 and it is very preferable that! the target proteins were white by approximately 9895 and more free from other proteins. Indications of proteins can be obtained in large quantities with the help of recombinant technology in such a way that the final product is an active Mri-ligand with a high degree of purity, which can be successfully used in therapy. Alternatively, such proteins can be obtained in homogeneous form from aplastic mammalian blood, plasma or serum, as well as from mammalian cell lines that secrete or express Mri-ligands.

Более того, Мрі-лиганд или его активнье фрагменть! могут бить химически синтезированьї. В целом, под термином "Мрі-лигандь!", используемом в настоящем изобретений, подразумеваются как сами Мрі- лигандьї, так и их активнье фрагменть и варианть, которнье более детально описань ниже.Moreover, Mri-ligand or its active fragment! they can be chemically synthesized. In general, the term "Mri-ligand!", used in the present invention, means both the Mri-ligands themselves, and their active fragment and variant, which are described in more detail below.

Два предпочтительньїх Мрі-лиганда собаки имеют молекулярную массу около 25кД и З'ікД, определенную злектрофорезом в полиакриламидном геле в присутствий додецилсульфата натрия(505-Two preferred Mri-ligands of the dog have a molecular mass of about 25kD and ZikD, determined by electrophoresis in a polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (505-

РАСЕ) в невосстанавливающих условиях. Оба белка очищают согласно одной методике, которая более подробно описана в приведенньїх далее примерах. Так, например, оба Мрі-лиганда связьувают лектин зародьшей пшениць и иммобилизуют Мрі-рецептор. Белок размером 25КкД имеет следующую аминокислотную последовательность:RACE) in non-restorative conditions. Both proteins are purified according to the same method, which is described in more detail in the following examples. So, for example, both Mri-ligands bind wheat germ lectin and immobilize the Mri-receptor. The 25 KkD protein has the following amino acid sequence:

АІа-Рго-Рго-АіІа-Хаа-Зар-Рго-Аго-ї ец-І еи-Авп-І уз-Меї-Г еи-AIa-Rgo-Rgo-AiIa-Haa-Zar-Rgo-Ago-y ets-I ey-Avp-I uz-Mei-G ey-

Агу-Авр-зег-Нів-Ма!-І ен-Ніз-Хаа-Аго-І еи-Хаа-СІп-Хаа-Рго-Agu-Avr-zeg-Niv-Ma!-I en-Niz-Haa-Ago-I ey-Haa-SIP-Haa-Rgo-

Авр-Пе-Ту(ЗЕО ІО МО : 1).Avr-Pe-Tu (ZEO IO MO: 1).

Белок размером ЗікД имеет следующую аминокислотную последовательность:A protein the size of ZikD has the following amino acid sequence:

АІа-Рго-Рго-АіІа-Хаа-Авр-Рго-Аго-І ец-І еи-Авп-Ї уз-Меї-Ї еи-AIa-Rgo-Rgo-AiIa-Haa-Avr-Rgo-Ago-I ets-I ei-Avp-Y uz-Mei-Y ey-

Агд-Авр-зеї-Нів-Ма!-І еи-Нів(ЗЕО ІЮ МО : 2).Agd-Avr-zei-Niv-Ma!-I ei-Niv (ZEO IYU MO : 2).

Аминокислотьі "Хаа" в последовательностях 5ЕО ІЮО МО : 1 и 2 точно не определень), однако предположительно являются цистеийном, серином, треонином или(менее вероятно) триптофаном. Из приведенньіїх вьиіше последовательностей видно, что лиганд размером ЗікД содержит по крайней мере часть лиганда размером 25кД. В частности, первая 21 аминокислота белка З1кД точно совпадаєт с первой 21 аминокислотой белка 25кД. Зто обстоятельство и в особенности тот факт, что оба белка проявляют активность в исследованиях свойств Мрі-лигандов, описанньх в настоящем изобретении, позволяют сделать вьівод о том, что оба белка очень тесно связаньь между собой как по структуре, так и по функциям. Вероятно, что белковая форма размером З1кД отличаєтся от белка размером 25кД структуройAmino acids "Haa" in the sequences 5EO IYUO MO: 1 and 2 have not been determined exactly), but they are assumed to be cysteine, serine, threonine or (less likely) tryptophan. From the above sequences, it is clear that the ZikD-sized ligand contains at least part of the 25kD-sized ligand. In particular, the first 21 amino acids of the Z1kD protein exactly coincide with the first 21 amino acids of the 25kD protein. This circumstance and, in particular, the fact that both proteins show activity in the studies of the properties of Mri-ligands, described in the present invention, allow us to conclude that both proteins are very closely related to each other both in terms of structure and functions. It is likely that the 31kD protein form differs from the 25kD protein in structure

С-терминальной последовательности, а также иньм характером гликозилирования и/или другим характером сплайсинга гена, кодирующего белки. В дополненение к описанньм вьше последовательностям в процессе секвенирования 25-кКД полосьії до конечной стадиий очистки(при использований обратнофазовой НРІ С) бьіла определена другая последовательность. Бьло показано, что указанная последовательность ассоциирована с полосой 25кД в невосстанавливающих условиях, но не в восстанавливающих условиях, позволяя предположить, что она является результатом расщепления на два фрагмента(например, с помощью протеазь) 25-кКД белка, причем зти фрагментьї удерживаются вместе дисульфидной связью. Указанная последовательность имеет следующую структуру:C-terminal sequence, as well as another type of glycosylation and/or the second type of protein-coding gene splicing. In addition to the descriptions above, a second sequence was determined in the process of sequencing the 25-kD band before the final stage of purification (when reverse-phase NRI C was used). It was shown that the specified sequence is associated with the 25kD band under non-reducing conditions, but not under reducing conditions, suggesting that it is the result of cleavage into two fragments (for example, with the help of proteases) of the 25-kD protein, and these fragments are held together by a disulfide bond . The specified sequence has the following structure:

Тнг-Сіп-І уз-с1и-с1п-ТНІ-І уз-АІа-СсіІп-Азр-Ма!-Ї еи-Сс1у-Аїа-Tng-Sip-I uz-s1y-s1p-TNI-I uz-AIa-SsiIp-Azr-Ma!-Y ei-Ss1u-Aia-

Ма!-Аіа-І ецщ(5ЕО ІО МО : 3).Ma!-Aia-I etssch(5EO IO MO : 3).

Несмотря на то, что локализация последовательности 5ЕО ІЮО МО : З в пределах последовательности 25-КД белка неизвестна, аналогия с другими цитокинами, такими как зритропозтин, позволяет предположить, что указанная последовательность расположена вблизи 114-й аминокислоть! белка размером 25кД. Следует отметить, что вероятна(однако не доказана) локализация последовательностиDespite the fact that the localization of the sequence 5EO IYUO MO: C within the sequence of 25-KD protein is unknown, the analogy with other cytokines, such as zritropostin, suggests that the specified sequence is located near the 114th amino acid! protein size 25kD. It should be noted that the localization of the sequence is probable (but not proven).

ЗЕО ІО МО : 3 и в пределах белка размером ЗікД, при том, что она опять же начинаєтся вблизи аминокислоть! 114. Информация о данной последовательности более подробно обсуждаеєется в Примере 7.ZEO IO MO: 3 and within the limits of a protein the size of ZikD, despite the fact that it again begins near amino acids! 114. Information about this sequence is discussed in more detail in Example 7.

Благодаря первоначальньм зкспериментам по очистке лигандов собаки, описанньм вьіше, бьл клонирован ген, кодирующий лиганд. В результате бьла определена полная аминокислотная последовательность указанного лиганда собаки, которая приведена на фиг.13А. На оснований данньх о молекулярной массе, предсказано, что лигандь! собаки размером 25кКД и З1Кд являются С-терминальньми процессированньми формами лиганда полной длиньї, чья последовательность приведена на фиг. 13А. В дополнение к зтому получен Мрі-лиганд мьіши, имеющий последовательность, приведенную на фиг.135Б.Thanks to the initial experiments on the purification of dog ligands, as described above, the gene encoding the ligand was cloned. As a result, the complete amino acid sequence of the specified dog ligand was determined, which is shown in Fig.13A. Based on molecular weight data, it is predicted that the ligand! dogs with a size of 25kKD and З1Kd are C-terminally processed forms of the full-length ligand, the sequence of which is shown in fig. 13A. In addition to this, the Mri-ligand of muscle, having the sequence shown in fig.135B, was obtained.

Такие очищенньюое лигандьі также могут бьїть охарактеризованьі согласно специфической активности, проявляемой в исследований мегакариоцитов человека(Пример 2), которая составляет по крайней мере 5,7 миллиардов мегакариоцитарньїх единиц/мл. Мегакариоцитарную единицу определяют как количество материала, из которого можно получить столько мегакариоцитов, сколько из їмкл контрольного АРКО9 стандарта, как зто показано при описаний исследования в Примере 2.Such cleaning ligands can also be characterized according to the specific activity shown in human megakaryocyte studies (Example 2), which is at least 5.7 billion megakaryocyte units/ml. A megakaryocyte unit is defined as the amount of material from which it is possible to obtain as many megakaryocytes as from the control ARKO9 standard, as shown in the study described in Example 2.

Кроме того, такие очищенньюе лигандьі могут бьть охарактеризованьї согласно специфической активности, проявляемой в исследований Мрі-зависимого роста клеток(Пример 4), которая составляет по крайней мере 6,9 миллиардов единиц клеточного роста/мг. Единицу клеточного роста определяют как количество лиганда, необходимого для роста 200 клеток 1А6.1 в исследований, описанном в Примере 4. В приведенной ниже Таблице 1 указаньї дополнительнье специфические показатели активности очищенньхIn addition, such cleaning ligands can be characterized according to the specific activity shown in the studies of Mri-dependent cell growth (Example 4), which is at least 6.9 billion units of cell growth/mg. A unit of cell growth is defined as the amount of ligand required for the growth of 200 1А6.1 cells in the studies described in Example 4. Table 1 below indicates additional specific indicators of the activity of purifications

Мрі-лигандов собаки, полученньїх согласно данному изобретению:Mri-ligands of dogs obtained according to this invention:

Таблица 1 (ед/мг) (ед/мг)Table 1 (units/mg) (units/mg)

Суммируя приведенную вьшше информацию, в качестве примеров могут бьіть охарактеризовань! некоторье Мрі-лигандь! на оснований одного или более биохимических и биологических свойств: (а) такие Мрі-лигандь! вьіделень из апластической плазмь; (б) такие Мрі-лигандьь имеют молекулярную массу около 25кД или ЗікД, как определено методом злектрофореза в полиакриламидном геле в присутствий додецилсульфата натрия(5О5-РАСЕ) в невосстанавливающих условиях; (в) Мрі-лигандьі! содержат следующие аминокислотнье последовательности: 5ЕО ІЮ МО : 1 в случає белка мол. массьі 25кД; или 5ЕО ІО МО : 2 в случає белка мол. массь! Зікд; (г) Мрі-лигандьй дополнительно содержат аминокислотную последовательность 5ЕО ІЮ МО :Summarizing the above information, several characterizations can be used as examples! some Mri-ligand! based on one or more biochemical and biological properties: (a) such Mri-ligands! separation from aplastic plasma; (b) such Mri-ligands have a molecular weight of about 25 kD or ZikD, as determined by electrophoresis in a polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (5O5-RACE) in non-reducing conditions; (c) Dream leagues! contain the following amino acid sequences: 5EO IU MO : 1 in the case of protein mol. mass 25kD; or 5EO IO MO: 2 in the case of protein mol. mass! Ziqd; (d) Mri-ligands additionally contain the amino acid sequence 5EO IU MO:

З(особенно важно в случає белка мол. массь! 25кКД); (д) Мрі-лигандь! связьівают лектин зародьішей пшениць; (е) Мрі-лигандь! связьявают иммобилизованньй растворимьй Мрі-рецептор мьіши; (ж) активность Мрі-лигандов может ингибироваться іп міго растворимьмм Мрі-рецептором; и (з) Мрі-лигандь! связьітваются с анионообменной колонкой при рН около 8-9. Биологическая активность предпочтительньхх Мрі-лигандов, полученньх согласно настоящему изобретению, подтверждена их способностью специфически стимулировать рост и развитие мегакариоцитов в исследований усиления роста клеток, которое описьявается в Примере 2. В указанном зксперименте Мрі-лигандьі! стимулируют дифференцировку СО34- клеток периферической крови человека(то есть СОЗ4-клеток, вьіделяемьх иммуноадсорбцией) на опротяжениий 8 дней культивирования. Мегакариоцитьї идентифицируют окаршиванием с помощью специфических антител к антигену тромбоцитов и подсчитьшвают под микроскопом. Кроме того, Мрі-лиганд стимулирует рост фактор-зависимой клеточной линии 1Аб6.1. В отсутствие Мрі-лиганда клетки погибают. Число клеток в культуре, содержащей Мрі-лиганд, определяют через 2 дня. Мрі-лигандь, описаннье вьше, обладают специфической активностью, приведенной вC (especially important in the case of protein mol. mass! 25 kKD); (e) Mri-ligand! svyazivayut lectin of wheat germs; (e) Mri-ligand! binds the immobilized soluble MRI muscle receptor; (g) the activity of Mri-ligands can be inhibited by a highly soluble Mri-receptor; and (with) Mri-ligand! bind to an anion exchange column at a pH of about 8-9. The biological activity of the preferred Mri-ligands obtained according to the present invention is confirmed by their ability to specifically stimulate the growth and development of megakaryocytes in studies of cell growth enhancement, which is described in Example 2. In the specified experiment, Mri-ligands! stimulate the differentiation of CO34 cells of human peripheral blood (that is, COZ4 cells isolated by immunoadsorption) for a prolonged 8 days of cultivation. Megakaryocytes are identified by staining with the help of specific antibodies to platelet antigen and counted under a microscope. In addition, Mri-ligand stimulates the growth of the factor-dependent cell line 1Ab6.1. In the absence of Mri-ligand, cells die. The number of cells in the culture containing Mri-ligand is determined after 2 days. Mri-ligand, described above, has the specific activity shown in

Таблице 1(см. ранее).Table 1 (see earlier).

Источниками Мрі-лигандов служат апластическая кровь млекопитающих, плазма крови или сьіворотка.Sources of Mri-ligands are aplastic blood of mammals, blood plasma or serum.

Однако, источники таких лигандов не ограничиваются указанньіми и могут включать другие жидкости тела млекопитающих, клетки, полученньюе из таких жидкостей и т. д. Очистка нативньхх Мрі-лигандов при вьіделений из указанньх вьіше источников основана на двух основньїх процедурах: (а) аффинной хроматографии при использований лектина, преимущественно агглютинина зародьшей пшениць; и (б) аффинной хроматографии с иммобилизованньм Мрі-рецептором. Дополнительнье процедурь могут включать дальнейшую очистку белка. К ним относятся, например, ионообменная хроматография, гельфильтрационная хроматография и обратно-фазовая хроматография.However, the sources of such ligands are not limited to the indications and may include other mammalian body fluids, cells obtained from such fluids, etc. Purification of native Mri-ligands when isolated from the indicated several sources is based on two main procedures: (a) affinity chromatography at used lectin, mainly wheat germ agglutinin; and (b) affinity chromatography with immobilized MRI receptor. Additional procedures may include further purification of the protein. These include, for example, ion-exchange chromatography, gel filtration chromatography, and reverse-phase chromatography.

Методика очистки, в действительности используемая для вьіделения Мрі-лиганда из апластической плазмь крови собаки, включаєет следующие стадий(см. Пример 7): (а) лектин-аффинную хроматографию(особенно предпочтительна хроматография при использований агглютинина из зародьишшей пшеницьї); (б) аффинная хроматография при использований растворимого Мрі-рецептора(Мрі-ХХособенно предпочтительно использование иммобилизованного Мрі-Х мьіши); (в) ионообменная хроматография(катион- или анион-обменная хроматография, в особенности при использований колонки Мопо С); (г) гельфильтрационная хроматография в условиях, вьізьівающих диссоциацию(предпочтительно при использований Зирегаєх 200 и 505); и (д) обратно-фазовая хроматография(предпочтительно при использований С4-колонки).The purification technique, actually used to isolate Mri-ligand from aplastic blood plasma of a dog, includes the following stages (see Example 7): (a) lectin-affinity chromatography (especially preferred chromatography when agglutinin from germinal wheat is used); (b) affinity chromatography using a soluble Mri-receptor (Mri-X, especially preferably using immobilized Mri-X muscle); (c) ion-exchange chromatography (cation- or anion-exchange chromatography, especially when Mopo C columns are used); (d) gel filtration chromatography under conditions that cause dissociation (preferably using Zyregaekh 200 and 505); and (d) reverse-phase chromatography (preferably when using a C4 column).

Гомогенньй Мрі-лиганд млекопитающих, в том числе лиганд человека, может бьть получен из апластической крови, сьіворотки, плазмь! или других источников Мрі-лиганда человека, например клеток или тканей при использованний описанной вьіше методики очистки. Необходимьсе зтапь! очистки не обязательно следуют в указанном порядке, однако приведенная последовательность соответствующих зтапов является предпочтительной. Методики культивирования клеток или тканей, которье могут являться источником Мрі-лиганда, хорошо известньі специалистам в данной области исследований и могут бить применень, например, для увеличения количества исходного материала.Homogeneous Mri-ligand of mammals, including human ligand, can be obtained from aplastic blood, serum, plasma! or other sources of Mri-ligand of a person, for example, cells or tissues, using the purification method described above. It is necessary to melt! cleaning is not necessarily followed in the specified order, however, the given sequence of the corresponding taps is preferable. Methods of cultivating cells or tissues, which can be a source of Mri-ligand, are well known to specialists in this field of research and can be used, for example, to increase the amount of starting material.

Мрі-лиганд или же один или более его пептидньїх фрагментов могут бьїть полученьії и с помощью технологии рекомбинантньїх ДНК. Для получения последовательности ДНК определенного Мрі-лиганда лиганд-содержащий материал концентрируют и обьічно обрабатьвают протеазой, такой как трипсин.Mri-ligand or one or more of its peptide fragments can also be obtained with the help of recombinant DNA technology. To obtain the DNA sequence of a certain Mri-ligand, the ligand-containing material is concentrated and lightly treated with a protease such as trypsin.

Образовавшиеся в результате знзиматического расщепления фрагменть! вьіделяют и секвенируют с помощью подходящего метода. Альтернативно, как показано в приведенньїх ниже примерах, интактньй очищенньй белок может бьть секвенирован впрямую в той степени, которая достижима при данном доступном количестве белка, а затем секвенированная область может бьть аналогичньм образом использована для получения триптических фрагментов, согласно следующей методике. Синтезируют олигонуклеотиднье пробь, используя генетический код для предсказания всех возможньх последовательностей генов, кодирующих аминокислотнье последовательности секвенированньх фрагментов(или фрагмента). Предпочтительно, чтобьі в качестве проб использовались некоторье вьтрожденнье последовательности. Ген Мрі-лиганда идентифицируют при использований указанньхх проб для скрининга геномной библиотеки млекопитающих или других источников. В противоположность зтому,The fragment formed as a result of enzymatic cleavage! isolated and sequenced using a suitable method. Alternatively, as shown in the examples below, the intact purified protein can be sequenced directly to the extent achievable with the given amount of protein available, and then the sequenced region can be similarly used to generate tryptic fragments, according to the following technique. Oligonucleotide probes are synthesized using the genetic code to predict all possible sequences of genes encoding amino acid sequences of sequenced fragments (or fragments). Preferably, some original sequences were used as samples. The Mri-ligand gene is identified when the specified samples are used for screening the genomic library of mammals or other sources. In contrast, therefore,

МРНК из клеток, являющихся источником Мрі-лиганда, может использоваться для получения библиотекиmRNA from cells that are the source of Mri-ligand can be used to obtain a library

КДНК, которую скринируют с помощью проб для идентификации кКДНК, кодирующей полипептид Мрі- лиганда. Более того, для наращивания кДНК-последовательности может бьіть использована полимеразная цепная реакция(ПЦР), в которой задействовань! соответствующие праймерь.cDNA, which is screened with the help of probes to identify the cDNA encoding the Mriligand polypeptide. Moreover, polymerase chain reaction (PCR) can be used to amplify the cDNA sequence, which involves! appropriate primers.

Используя соответствующие пробьі для скрининга геномной библиотеки, получают ДНК-клон. Для получения клона, содержащего полноразмерную копию гена Мрі-лиганда, пробьї на основе полученной последовательности ДНК могут бьіть использовань! для повторного скрининга библиотеки и гибридизации с полноразмерной последовательностью Мрі-лиганда.Using appropriate probes for screening the genomic library, a DNA clone is obtained. To obtain a clone containing a full-size copy of the Mri-ligand gene, DNA sequences based on the obtained DNA sequence can be used! for repeated screening of the library and hybridization with the full-length sequence of Mri-ligand.

КДНК Мрі-лиганда человека может бьть также получена путем субклонирования полноразмерного геномного клона человека в векторе зкспрессии, последующего переноса его в СО5-клетки, получения бибилотеки кКДНК из указанньїх трансфицированньх СОб-клеток и скрининга КкКДНК Мрі-лиганда путем гибридизации. После идентификации полной последовательности кКДНК, она сама или какой-либо ее участок, кодирующий активньійй фрагмент Мрі-лиганда, может бьіть встроен в любой из большого числа известньїх векторов зкспрессии для получения системь! зкспрессии Мрі-лиганда или одного или более фрагментов.Human Mri-ligand cDNA can also be obtained by subcloning a full-sized human genomic clone in an expression vector, its subsequent transfer into CO5 cells, obtaining a cDNA library from the specified transfected COb cells and screening for Mri-ligand cDNA by hybridization. After the identification of the full cDNA sequence, it itself or any part of it, encoding the active fragment of Mri-ligand, can be built into any of a large number of known expression vectors to obtain systems! expression of Mri-ligand or one or more fragments.

При таком использований рекомбинантной технологий предпочтительно получают ДНК- последовательности, определяющие синтез полипептидов Мрі-лиганда. Настоящее изобретение также относится ок указанньм последовательностям, которье свободньї от ДНК-последовательностей, кодирующих другие белки(т. е. к изолированньм последовательностям) и обеспечивают зкспрессию полипептидов Мрі-лиганда с активностью Мрі-лиганда(т. е. полипептидов, вьізь'вающих рост и/или развитие мегакариоцитов). Указаннье ДНК-последовательности включают такие последовательности, которье кодируют весь или какой-либо фрагмент Мрі-лиганда, и такие последовательности, которье гибридизуются, предпочтительно в жестких гибридизационньїх условиях, с КДНК-последовательностямиIn this case, recombinant technology is preferably used to obtain DNA sequences that determine the synthesis of Mri-ligand polypeptides. The present invention also relates to specified sequences that are free from DNA sequences encoding other proteins (i.e. to isolated sequences) and provide expression of Mri-ligand polypeptides with Mri-ligand activity (i.e. growth-inducing polypeptides and/or the development of megakaryocytes). The indication of the DNA sequence includes such sequences that encode all or any fragment of Mri-ligand, and such sequences that hybridize, preferably under strict hybridization conditions, with cDNA sequences

ІС. М. Мапіаїйз єї аІ., МоІесшаг Сіопіпд(А І абогаїогу Мапиаї!), Соїд бргіпд Нагтог І арогаюгу(1982), рр.387- 389).IS. M. Mapiaiyz eyi aI., MoIesshag Siopipd (A I abogaiogu Mapiai!), Soid brgipd Nagtog I arogayugu (1982), pp. 387-389.

Обьчно гибридизацию в жестких условиях проводят в 4 х 550 при 62 - 67"С с последующими отмьівками в 0,1 х 550 при 62 - 67"С. Альтернативно, гибридизацию в жестких условиях проводят в 45 -Generally, hybridization in harsh conditions is carried out at 4 x 550 at 62 - 67"C with subsequent washings at 0.1 x 550 at 62 - 67"C. Alternatively, hybridization in harsh conditions is carried out at 45 -

Б5БОс-ном формамиде, 4 х 550 при 40 - 45"С. ДНК-последовательности, которье гибридизуются с последовательностями Мрі-лиганда в мягких условиях и кодируют пептидьі Мрі-лиганда, имеющие биологические свойства Мрі-лиганда, также кодируют нове полипептидь! Мрі-лиганда, заявленнье в настоящем изобретений. Обьічно гибридизацию в мягких условиях проводят в 4 х 550 при 40 - 45"С или в - 40956-ном формамиде при 40 - 45"С. Например, ДНК-последовательность, которая имеет участки существенной гомологиий(скажем, области гликозилирования или дисульфидньїх связей) с последовательностями Мрі-лиганда и кодируєт белок, обладающий одним или более видами биологической активности Мрі-лиганда, явньмм образом кодируєт полипептид Мрі-лиганда, даже если такая ДНК-последовательности и не будет гибридизоваться с последовательностью(последовательностями) Мрі-лиганда в жестких условиях.B5BOs-nom formamide, 4 x 550 at 40 - 45"C. DNA sequences that hybridize with Mri-ligand sequences in mild conditions and encode Mri-ligand peptides, which have the biological properties of Mri-ligand, also encode a new polypeptide! ligand, the application is hereby invented. Conventionally, hybridization in mild conditions is carried out in 4 x 550 at 40 - 45 "C or in - 40956-nom formamide at 40 - 45 "C. For example, a DNA sequence that has areas of significant homology (say , areas of glycosylation or disulfide bonds) with sequences of Mri-ligand and encodes a protein possessing one or more types of biological activity of Mri-ligand, clearly encodes a polypeptide of Mri-ligand, even if such a DNA sequence does not hybridize with the sequence(s) Mri-ligand in harsh conditions.

Аллельнье варианть(симеющие природное происхождениє изменения оснований в генетических структурах организмов, образующих данную популяцию, которье не обязательно приводят к замене аминокислотьі)) ДНК-последовательностей, кодирующих пептиднье последовательности Мрі-лиганда, тоже включень в обьем настоящего изобретения, так же, как и аналоги и производнье зтих последовательностей. Аналогичньм образом, ДНК-последовательности, которне кодируют полипептидь!Allelic variants (variations having a natural origin based on the genetic structures of organisms forming a given population, which do not necessarily lead to amino acid replacement) of DNA sequences encoding peptide sequences of Mri-ligand are also included in the scope of the present invention, as well as analogs and the derivative of those sequences. Similarly, DNA sequences that encode a polypeptide!

Мрі-лиганда, но различаются некоторими кодонами вследствиє вьірожденности генетического кода, а также различнье вариантьі последовательности ДНК Мрі-лиганда, которье обусловленьі точечньми мутациями или индуцированньми модификациями для усиления активности, увеличения времени полужизни или повьшения вьхода полипептида, кодируемого такими модифицированньми последовательностями, также включень в обьем настоящего изобретения.Mri-ligand, but differ in some codons due to genetic code degeneracy, as well as different variants of the DNA sequence of Mri-ligand, which are caused by point mutations or induced modifications to enhance activity, increase half-life or increase the output of the polypeptide encoded by such modified sequences, are also included in scope of the present invention.

В результате процедурьї клонирования, оописанной ниже ов Примере 11, определяют последовательность КДНК и последовательность аминокислот белков человека МОЮОБ-1І, МООБЕ-2 иAs a result of the cloning procedure described below in Example 11, the cDNA sequence and the amino acid sequence of the human proteins МОУБ-1И, МОБЕ-2 and

МООЕ-3, которне приведеньі здесь в материалах заявки. МООБЕ-1 представлен аминокислотами 22-MOOE-3, which is given here in the application materials. MOOBE-1 is represented by amino acids 22-

ЗБЗ(фиг.11) и содержит 332 аминокислотьі. МЕОЕ-2 представляет собой отщепленньій участок МЕООБ-1 и содержит аминокислоть! 22-195, как показано на фиг.11. МОЮОБ-2 соответственно состоит из 174 аминокислот. МЕОБЕ-3 представлен аминокислотами 22-286(фиг.12) и содержит 265 аминокислот. При описаний каждого из МОЮОЕ имеется в виду, что последовательность сигнального пептида(аминокислоть! 1-21 на фиг.11 и 12) также является частью заявленньїх в настоящем изобретений полипептидов, однако для проявления активности, определяющей рост и развитие мегакариоцитов, предпочтительно удаление сигнального пептида. В целом, данньіе о МЕОЕ5 можно суммировать следующим образом: мМаюв-1 аминокислоть 22-353 фиг.11 мМаюв-2 аминокислоть 22-195 фиг.11 мМарв-3 аминокислоть 22-286 фиг.12ZBZ (fig. 11) and contains 332 amino acids. MEOE-2 is a cleavage site of MEOB-1 and contains amino acids! 22-195, as shown in fig.11. MOYUOB-2, respectively, consists of 174 amino acids. MEOBE-3 is represented by amino acids 22-286 (Fig. 12) and contains 265 amino acids. When describing each of the MOJOE, it is understood that the sequence of the signal peptide (amino acids 1-21 in Fig. 11 and 12) is also part of the claims of the polypeptides invented in the present, however, for the manifestation of the activity that determines the growth and development of megakaryocytes, the removal of the signal peptide is preferable . In general, the data on MEOE5 can be summarized as follows: mMajuv-1 amino acid 22-353 fig.11 mMajuv-2 amino acid 22-195 fig.11 mMarv-3 amino acid 22-286 fig.12

В описанньхх зкспериментах МООБ-1 и МОаОБ-2 проявляют активность, в то время как МООБ-3 неактивен.In the described experiments, MOOB-1 and MOaOB-2 are active, while MOOB-3 is inactive.

Основьіваясь на приведенньхх здесь сведениях об активности, можно предположить, что МООЕ человека зкспрессируется іп мімо как практически неактивньй или менее активньй полипептид- предшественник, содержащий различнье С-терминальнье аминокислоть. При отщеплениий (сС- терминальньхх аминокислотітак же как и сигнального пептида) процессированная форма(формьї) полипептида приобретаєт активность или становится болеє активной. Принимая во внимание изложенное вьше предположениє, считаєтся, что для проявления активности МаБ-1 необходим процессинг(например, расщепление протеазой). То обстоятельство, что МООБ-1, от которого отщеплен определенньй участок(т. е. МАОРЕ-2) является активньім, подтверждаєт данное предположение.Based on the activity data presented here, it can be assumed that human MOOE is expressed as an almost inactive or less active precursor polypeptide containing various C-terminal amino acids. When cleaved (C-terminal amino acid as well as signal peptide), the processed form(s) of the polypeptide acquires activity or becomes more active. Taking into account the above assumption, it is believed that processing (for example, protease cleavage) is necessary for the manifestation of MaB-1 activity. The fact that MOOB-1, from which a certain section is cleaved (i.e., MAORE-2) is active, confirms this assumption.

Кондиционированная среда клеток 293 почки человека(Іпмігодеп), трансфицированньїх геном МООБ-1, проявляет соответствующую активность в зкспериментах на клетках, описанньїх ниже в Примере 4. С другой стороньї, в иньїх клеточньїх линиях, например, клетках 320, активность МОЮОБЕ-1 не обнаруживаеєется. Предположительно зто может обьясняться способностью клеток 293 процессировать полипептид МОЮЕ-1, возможно путем отщепления определенного участка, так что молекула, в действительности проявляющая активность, представляет собой такую процессированную форму, в то время как клетки 320 не способнь! к процессингу МЕОБ-1.The conditioned medium of human kidney 293 cells (Ipmigodep), transfected with the MOOB-1 gene, shows the corresponding activity in the experiments on the cells described below in Example 4. On the other hand, in other cell lines, for example, 320 cells, the activity of MOUBOBE-1 is not detected . Presumably, this can be explained by the ability of cells 293 to process the MOUE-1 polypeptide, possibly by cleaving a certain part, so that the molecule, which actually exhibits activity, is such a processed form, while cells 320 are not able to! to MEOB-1 processing.

С точки зрения изложенной вьіше гипотезьі, различньюе активнье молекуль! могут образовьваться в результате отщепления определенньх участков от последовательности, приведенной здесь как последовательность МООБ-1(фиг.11). К консервативньім особенностям, свойственньім цитокинам, таким как зритропозтин(ЕРО), относятся четьіре альфа-спирали и четьіре цистеина. При изучениий расположения молекул цистеина(зволюционно консервативньїх и функционально необходимьїх злементов) оказалось, что Суз 172 в последовательности МООЕ-1 является наийболееє терминальньм по сравнению с молекулами цистеина в других последовательностях. Соответственно, предпочтительньмми вариантамиFrom the point of view of the above hypothesis, different active molecules! they can be formed as a result of splitting off certain sections from the sequence shown here as the MOOB-1 sequence (fig. 11). Conservative features characteristic of cytokines such as erythropoietin (EPO) include four alpha helices and four cysteines. When studying the arrangement of cysteine molecules (evolutionarily conservative and functionally necessary elements), it turned out that Suz 172 in the MOOE-1 sequence is the most terminal compared to cysteine molecules in other sequences. Accordingly, preferred options

Марие-1 являются такие, которние образуются при отщеплений от МООЕ-1 С-терминальньх участков, начиная с аминокислотьї в положении 173 и до аминокислотьі в положении З5З(в сочетаниий с отщеплением сигнального пептида). Предпочтительно, чтобь! в последовательности МООЕ-1 произошло отщепление в районе 50-ая - 185-ая аминокислотьії, особенно предпочтительно, в районе 90-ая - 172-ая аминокислота, начиная с С-конца последовательности. Как отмечалось, длина сигнального пептида составляет 21 аминокислоту, однако, сигнальньй пептид может содержать 23 аминокислоть!, исходя из последовательности МО2ЮРЕ-1. Соответственно, полипептидьї, родственнье заявленньїм, но начинающиеся с 24-й аминокислоть! см. фиг.11 или 12) тоже подлежат рассмотрению.Marie-1 is recognized as those that are formed when the C-terminal sections are cleaved from MOOE-1, starting with the amino acid at position 173 and ending with the amino acid at position C5Z (in combination with cleavage of the signal peptide). It is preferable that! in the sequence of MOOE-1, cleavage occurred in the region of the 50th - 185th amino acid, especially preferably in the region of the 90th - 172nd amino acid, starting from the C-end of the sequence. As noted, the length of the signal peptide is 21 amino acids, however, the signal peptide can contain 23 amino acids!, based on the sequence of MO2YURE-1. Sootvetstvenno, polypeptides, related to the statements, but starting with the 24th amino acid! see Fig. 11 or 12) are also subject to consideration.

Ниже приведень некоторье особенно предпочтительнье вариантьї МООР-1, которне могут проявлять активность(т. е. способность усиливать рост мегакариоцитов и/или тромбоцитов или же ингибировать/стимулировать активность природного рецептора): мав -4 аминокислоть 22-172 фиг.11 мМарег-5 аминокислоть 22-177 фиг.11 маре-6 аминокислоть 22-191 фиг.11 мМаре-7 аминокислоть 22-198 фиг.11 марев-8 аминокислоть 22-265 фиг.11 мМаюв-11 аминокислоть 22-184 фиг.11Below are some particularly preferred variants of MOOR-1, which can show activity (i.e., the ability to enhance the growth of megakaryocytes and/or platelets or inhibit/stimulate the activity of the natural receptor): had -4 amino acids 22-172 fig.11 mAreg-5 amino acid 22-177 fig.11 mare-6 amino acid 22-191 fig.11 mAre-7 amino acid 22-198 fig.11 marev-8 amino acid 22-265 fig.11 mAyuv-11 amino acid 22-184 fig.11

В некоторьїх клонах аминокислоть! 133-136 в последовательности МОЮБЕ-1 отсутствовали, позтому последовательности, соответствующие указанньм вьше, но в которьх указаннье аминокислоть утраченьки номер С-терминальной аминокислоть! уменьшен на 4), таюке могут проявлять активность.In some amino acid clones! 133-136 in the sequence of MOYUBE-1 were missing, because of the sequence corresponding to the instructions above, but in which the amino acid number of the C-terminal amino acid is lost! reduced by 4), tayuke can be active.

В одном клоне, имеющем кодон терминации в положенийи 192, вместо остатка Тиг в положениий 191 обнаружен остаток Аа, как зто отражено на Фиг.11. Таким образом, в обьем изобретения включень варианть! молекул МООРЕ, в которьх вместо ТНиг в положений 191 находится Аа.In one clone, which has a termination codon at position 192, instead of a Tig residue at position 191, an Aa residue was found, as shown in Fig.11. Thus, the scope of the invention includes the option! MOORE molecules, in which Aa is located instead of TNig in the position 191.

МариеЕ-3 образуется при удалении последовательности назьваємой здесь ІМ5-5(Промежуточная последовательность-5), поскольку зта последовательность сплайсируется в пределах пятого зкзона. Так как 5--конец ІМ5-5 входит в состав кодона, удаление зтой последовательности приводит к сдвигу рамки считьявания в оставшейся последовательности МОРЕ, которьй происходит в положнейи 160 в направлений к концу молекульї МЕОРБ-3.MarieE-3 is formed by removing the sequence called here IM5-5 (Intermediate sequence-5), since this sequence is spliced within the fifth zkzone. Since the 5-end of IM5-5 is part of the codon, the removal of this sequence leads to a shift of the reading frame in the remaining sequence of MORE, which occurs in a position of 160 to the end of the MEORB-3 molecule.

Для самого МООБ-3 не обнаружено биологической активности при трансфекции клеток 293 и тестирования соответствующей кондиционированной средь! в зкспериментах на клетках, как зто описано вFor MOOB-3 itself, no biological activity was detected during transfection of 293 cells and testing of the corresponding conditioned medium! in experiments on cells, as described in

Примере 4. Очевидно, что в отличие от МОЮОБ-1, клетки 293 не способньї процессировать МОЮОБ-3 с образованием активной формь. Тем не менееєе, на оснований теории отщепления, описанной вьіше в отношений МОЕЮБ-1, отщепление С-терминальньїх аминокислот(например, в положений 40-102) от МЕАОБ-Example 4. It is obvious that, unlike MOYUOB-1, cells 293 are not able to process MOYUOB-3 with the formation of active forms. Nevertheless, based on the cleavage theory described above in relation to MOEUB-1, the cleavage of C-terminal amino acids (for example, in position 40-102) from MEAOB-

З может обеспечить его активность. Предпочтительно отщепление 50-90 аминокислот. Двумя особенно предпочтительньмми вариантами МЕОЕ-2 являются следующие: мМаре-9 22-179 фиг.12 мМар-10 22-190 фигл12Z can provide ego activity. Preferably cleavage of 50-90 amino acids. Two particularly preferred variants of MEOE-2 are the following: mMar-9 22-179 fig.12 mMar-10 22-190 fig12

Во всех описанньїх Мрі-лигандах, включая указаннье вьше МОЮОЕ5, на М-терминальном участке может находиться остаток метионина, особенно в том случає, когда такие полипептидь! зкспрессируются в бактериальньх клетках-хозяевах. Полипептидьї Мрі-лиганда могут бьіть получень! и с помощью известньх методик химического синтеза. Такие методики хорошо известньї специалистам в данной области исследований. Синтетические полипептидьі Мрі-лиганда имея первичную, вторичную, третичную структуру и конформационнье свойства полипептидов Мрі-лиганда, полученньїх другими способами, могут обладать и сходньіми с ними биологическими свойствами. Так, они могут заменить биологически активнье и иммунологически активнье природнье, очищеннье полипептидь! Мрі-лиганда при терапевтическом и иммунологическом применении.In all of the described Mri-ligands, including the indication of MOYUE5, a methionine residue can be located in the M-terminal part, especially in the case of such a polypeptide! are expressed in bacterial host cells. Polypeptide Mri-ligand can be obtained! and with the help of certain methods of chemical synthesis. Such methods are well known to specialists in this field of research. Synthetic polypeptides of Mri-ligand having the primary, secondary, tertiary structure and conformational properties of polypeptides of Mri-ligand, obtained by other methods, may have biological properties similar to them. Yes, they can replace biologically active and immunologically active natural, purifying polypeptides! Mri-ligand in therapeutic and immunological use.

Модификации пептидов или последовательностей ДНК, кодирующих Мрі-лиганд, могут бьіть получень любьм специалистом в данной области исследований с помощью известньїх методик. Такого рода модификации последовательностей Мрі-лиганда могут включать перестановки, инсерции или делеции вьїіборочньїх аминокислотньїх остатков в кодирующих последовательностях. Методь! осуществления мутагенеза с целью получения таких перестановок, инсерции или делеций хорошо известнь специалистам в данной области исследований. (См., например Патент США Ме4518584)Modifications of peptides or DNA sequences encoding Mri-ligand can be obtained by any specialist in this field of research using known methods. Such modifications of Mri-ligand sequences may include permutations, insertions or deletions of selective amino acid residues in the coding sequences. Method! implementation of mutagenesis in order to obtain such permutations, insertions or deletions is well known to specialists in this field of research. (See, for example, US Patent Me4518584)

Предпочтительнькюе пептидьі могут бьіть полученьї с помощью протеолитических ферментов или путем направленного химического синтеза. Такие варианть! Мрі-лиганда и полинуклеотидов включень! в обьем настоящего изобретения.Preferred peptides can be obtained with the help of proteolytic enzymes or by directed chemical synthesis. Such an option! Mri-ligand and polynucleotide inclusions! within the scope of the present invention.

Специфические о мутации в последовательностях полипептида Мрі-лиганда могут включать модификации в сайте гликозилирования(например, сериновом, треониновом или аспарагиновом).Specific mutations in the sequences of the Mri-ligand polypeptide may include modifications in the glycosylation site (for example, serine, threonine or asparagine).

Отсутствие гликозилирования или только частичное гликозилирование являются результатом замень! или делеции аминокислотьі в аспарагин-связанном сайте гликозилирования или каком-либо другом сайте, модифицированном путем добавления О-связанного углевода. Аспарагин-связанньй сайт гликозилирования содержит последовательность трипептида, которая специфически распознается соответствующим клеточньм ферментом гликозилирования. Такая трипептидная последовательность может бьть последовательностью Авзп-Хаа-Тйг или Авп-Хаа-бег, где Хаа может бьть любой аминокислотой, кроме Рго. Различнье заменьі! или делеции аминокислот в одном или обоих первьїх или третьих положениях аминокислот в распознаваеємом сайте гликозилирования(и/или аминокислотная делеция во втором положении) приводят к отсутствию гликозилирования по модифицированной трипептидной последовательности. Зкспрессия таких измененньїх нуклеотидньїх последовательностей приводит к образованию продуктов, которне не гликозилировань! по данному сайту.Absence of glycosylation or only partial glycosylation are the result of substitutions! or amino acid deletions in the asparagine-linked site of glycosylation or any other site modified by adding an O-linked carbohydrate. The asparagine-binding site of glycosylation contains a tripeptide sequence that is specifically recognized by the corresponding cellular enzyme of glycosylation. Such a tripeptide sequence can be the sequence Avzp-Xaa-Tyg or Avp-Xaa-beg, where Xaa can be any amino acid, except Pgo. Various substitutions! or deletion of amino acids in one or both of the first or third positions of amino acids in the recognized site of glycosylation (and/or amino acid deletion in the second position) lead to the absence of glycosylation of the modified tripeptide sequence. The expression of such changes in nucleotide sequences leads to the formation of products that are not glycosylated! on this site.

Дополнительнье аналоги/производнье МБОAdditional analogues/production of MBO

Другие аналоги или производнье последовательностей МООР(Мрі-лигандь!), которне могут сохранять марг|(Мрі-лиганд)-активность(частично или полностью), могут бить полученьї специалистом в данной области исследований с помощью указанньїх здесь методов. Такие модифицированнье продукть! тоже включеньї в обьем данного изобретения. Болеєе точно, настоящеєе изобретение охватьвваєт и композиции на основе химически модифицированного МОЮРЕ, а также способь! приготовления и использования таких композиций. Настоящее описание показьваєт, что возможна модификация МООЕ с усилением его активности. Один аспект изобретения заключаєется в получений МОЕОЕ-продукта, содержащего МОаЮБ- белок, которьій связан по крайней мере с одним водорастворимьмм полимером. С другой стороньї,, изобретение относится к МЕОР-продукту, при том что указанньй МООЕ-белок связан по крайней мере с одной молекулой полизтиленгликоля. Кроме того, изобретение относится к МЕОЕ-белку, связанному по крайней мере с одной молекулой полизтиленгилколя посредством ацильной или алкильной связи.Other analogues or derivatives of MOOR (Mri-ligand) sequences, which can retain marg|(Mri-ligand) activity (partially or completely), can be obtained by a specialist in this field of research using the methods indicated here. Such a modified product! also included in the scope of this invention. More precisely, the present invention covers compositions based on chemically modified MOYURE, as well as a method! preparation and use of such compositions. This description shows that the modification of MOOE with strengthening of its activity is possible. One aspect of the invention consists in obtaining a MOEOE product containing MOaYUB-protein, which is bound to at least one water-soluble polymer. On the other hand, the invention relates to the MEOR product, while the indicated MOOE protein is linked to at least one molecule of polyethylene glycol. In addition, the invention relates to the MEOE protein linked to at least one molecule of polystylenylcol by means of an acyl or alkyl bond.

Погирование МООЕ может осуществляться с помощью любой реакции, известной из уровня техники.The combustion of MOOE can be carried out using any reaction known from the state of the art.

ІСм., например, Росив оп СсгоУмй ЕРасіогз З(2): 4-10 (1992); ЕР 0154316; ЕР 0401384) и другие цитируемье здесь публикации, относящиеся к пзогированию. Предпочтительно, чтобь! погирование осуществлялось посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой полизтиленгликоля(или же молекулой аналогичного водорастворимого полимера). Предпочтительнье варианть! получения пзгированньїх продуктов подробно описань! ниже.ISm., for example, Rosyv op SsgoUmy ERasiogz Z(2): 4-10 (1992); ER 0154316; EP 0401384) and other publications cited here related to pzogirovaniya. It is preferable that! burning was carried out by means of an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive polysethylene glycol molecule (or a molecule of a similar water-soluble polymer). The preferred option! detailed descriptions of receiving pzgirovannyi products! below

АцилированиеAcylation

Соединение с полизтиленгликолем путем ацилирования в основном заключается в осуществлений реакции между активньм зфиром полизтиленгликоля(РЕС) и МООБЕ-белком. Любую известную или полученную впоследствиий реактивную молекулу РЕС.и можно использовать для погирования МОБ.The connection with polysethylene glycol by acylation mainly consists in the reaction between the active polysethylene glycol (RES) and MOOBE-protein. My favorite known or subsequently obtained reactive molecule RES.y can be used for burning MOB.

Предпочтительньїм активированньім зфиром РЕС является РЕЯ, зтерифицированньй с образованием М- гидроксисукцинимида("МНО"). Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин "ацилирование" считается включающим без ограничений следующие типьі связей МОБ с водорастворимьмм полимером(РЕС): амидную, карбаматную, уретановую и подобньє им. См. ВіосопійдайєThe preferred activating zephyr of RES is REA, terified with the formation of M-hydroxysuccinimide ("MNO"). Thus, in the context of the present invention, the term "acylation" is considered to include, without limitation, the following types of bonds of MOB with a water-soluble polymer (RES): amide, carbamate, urethane, and the like. See Viosopiidaye

Спет. 5: 133-140(1994)). Условия реакции присоединения РЕС могут бьіть вьібрань! из любьх известньх или открьїтьї позднеє, однако в любом случає следует избегать использования таких температур, растворителей или значений рН, которье способньї инактивировать МОЮОЕ-продуктьї, подлежащие модификации. Условия реакции, обьічно применяемьсе для присоединения РЕС: к МООЕ, описаньї ниже.Spent 5: 133-140 (1994)). The conditions of the RES joining reaction can cause vibrations! from any limes or openings, however, in any case, the use of such temperatures, solvents or pH values that are capable of inactivating MOYUE-products subject to modification should be avoided. The reaction conditions commonly used for the addition of RES: to MOOE are described below.

Например, реакция с МН5-зфиром монометокси-РЕС приведена на фиг.14.For example, the reaction with MH5-zephyr monomethoxy-RES is shown in Fig.14.

Присоединение РЕС: путем ацилирования обьчно приводит к образованию МаОБЕ-продукта, связанного с несколькими молекулами РЕС, причем аминогруппь! зпсилон-лизина соединеньї с РЕС посредством ацильной связьявающей группьі. Предпочтительно, чтобь! соединяющая связь бьіла амидной.Addition of RES: by acylation usually leads to the formation of a MaOBE product connected with several molecules of RES, and amino groups! zpsilon-lysine connection with RES by means of an acyl linking group. It is preferable that! the white amide bond.

Таюке предпочтительно, чтобь! получаемьй продукт, по существу, бьіл связан только(29595) с одной, двумя или тремя молекулами РЕ. Однако, некоторье продукть! с болеє вьісокой степенью пзгирования(в реакцию вступило максимальное число аминогрупп зпсилон-лизина и одна альфа-аминогруппа на аминотерминальном участсе МООЕ) в норме могут образоваться, причем их количество зависит от специфических условий реакции. При необходимости из реакционной смеси могут бьїть вьіделень очищеннье позгированньюе продуктьї, а также не вступившиє в реакцию соединения при использований стандартньїх методов очистки, в том числе диализа, вьісаливания, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии, гельфильтрационной хроматографиийи и злектрофореза.It is preferable that! the resulting product was essentially bound only (29595) to one, two or three PE molecules. However, some product! with a high degree of decomposition (the maximum number of amino groups from psilon-lysine and one alpha-amino group on the amino-terminal part of MOOE entered the reaction) can be formed normally, and their amount depends on the specific conditions of the reaction. If necessary, purification of digested products, as well as unreacted compounds can be performed from the reaction mixture using standard purification methods, including dialysis, precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and electrophoresis.

АлкилированиеAlkylation

Соединение с РЕСї путем алкилирования обьчно заключаєтся в осуществлениий реакции между терминальньм альдегидньм производньм РЕС и обелком, таким как МОР, в присутствий восстанавливающего агента. Как и в случає ацилирования, подробнье условия реакции алкилирования описьіваются ниже.Coupling with RES by alkylation usually consists in carrying out a reaction between the terminal aldehyde derivative of RES and a protein, such as MOP, in the presence of a reducing agent. As in the case of acylation, the conditions of the alkylation reaction are described below.

Соединение с РЕС;, путем алкилирования также может приводить к образованию МООР-продукта, связанного с несколькими молекулами РЕСб. Например, реакция оалкилирования МОБ в восстанавливающих условиях, которая приводит к образованию МОЮОР-продукта, связанного с несколькими молекулами РЕСї, приведена на фиг.15. Кроме того, можно изменять условия реакции так, что присоединение РЕС будет происходить только по альфа-аминогруппе М-терминального участка молекул МОЮ (т. е. будут образовьшваться МОЮОР-продуктьї, связаннье с одной молекулой РЕ).Connection with РЕС;, by means of alkylation can also lead to the formation of a MOOR-product associated with several РЕСb molecules. For example, the reaction of the alkylation of MOB in reducing conditions, which leads to the formation of a MOYOR-product associated with several molecules of RES, is shown in Fig.15. In addition, it is possible to change the reaction conditions so that the addition of RES will occur only on the alpha-amino group of the M-terminal part of MOY molecules (ie, MOYOR products will be formed, binding to one PE molecule).

Например, реакция алкилирования МОЮОЕ ов восстанавливающих условиях, которая приводит к образованию МООР-продукта, связанного с одной молекулой РЕС, приведена на фиг.16. При "монопзгировании", так же как и при "полипзгировании" РЕС-группь! предпочтительно соединяются с белком посредством -СН2-МН-группьі. Благодаря наличию группьі -СН2-, такой тип связи назьвают "алкильной" связью.For example, the reaction of alkylation of MOYOE under reducing conditions, which leads to the formation of a MOOR product associated with one molecule of RES, is shown in Fig. 16. During the "mono-sprinkling", as well as during the "poly-sprinkling" of RES-groups! they are preferably connected to the protein by means of the -CH2-MH group. Due to the presence of the -СН2- group, this type of bond is called an "alkyl" bond.

Получение производньїх МОарЕ, соединенньїх с о одной о молекулой РЕС, посредством восстановительного алкилирования основано на неодинаковой реактивности различньїх типов первичньх аминогрупп(ілизин в противоположность М-терминальньм аминогруппам), пригодньїх для получения указанньїх производньїх МООР. Реакцию проводят при таком значений рН(см. ниже), которое позволяет использовать различия рКа между остатками зпсилон-аминогрупп лизина и альфа-аминогруппами М- терминального участка белка. Благодаря такому подходу, контролируєется присоединение к белку водорастворимого полимера, содержащего реакционно-способную группу, такую как альдегидная.The production of MOAPE derivatives, compounds with one molecule of RES, by means of reductive alkylation is based on the unequal reactivity of different types of primary amino groups (lysine as opposed to M-terminal amino groups), suitable for obtaining the specified MOOR derivatives. The reaction is carried out at such a pH value (see below) that allows using the differences in pKa between the residues of zpsilon-amino groups of lysine and alpha-amino groups of the M-terminal part of the protein. Thanks to this approach, the addition of a water-soluble polymer containing a reactive group, such as an aldehyde, to the protein is controlled.

Коньюгация с полимером происходит преимущественно на М-концевьїх участках белка, и значительньх модификаций других реактивньїх групп, таких как боковне группьї! аминогрупп лизина, не происходит. Один важньй аспект настоящего изобретения заключаєтся в получении, по существу, гомогенного препарата коньюгированного с монополимером МООЕ-белка(т. е. МООБ-белка, к которому молекула полимера прикреплена практически только в одном(?9595) определенном месте). Более точно, если используется полизтиленгликоль, настоящее изобретение также относится к пагированному МЕОЕ-белку, утратившему возможньсе антигеннье группьї и содержащему молекулу полизтиленгликоля, непосредственно связанную с МЮЕ-белком.Conjugation with the polymer occurs mainly at the M-terminal parts of the protein, and significant modifications of other reactive groups, such as side groups! amino group of lysine, does not occur. One important aspect of the present invention consists in obtaining, essentially, a homogeneous preparation conjugated with a MOOE-protein monopolymer (i.e., a MOOB-protein to which the polymer molecule is attached practically only in one (?9595) specific place). More precisely, if polyethylene glycol is used, the present invention also relates to paginated MEOE protein, which has lost as much antigenic group as possible and contains a polyethylene glycol molecule directly linked to MUE protein.

Таким образом, предпочтительньй аспект изобретения заключаєтся в получениий пзгированногоThus, a preferred aspect of the invention consists in obtaining the following

Маю, причем РЕС-группь(а) прикрепленьца) к молекуле белка посредством ацильной или алкильной группьі. Как указано вьіше, такие продукть! могут бьіть монопзгированньіми(например, содержащими 2-6, предпочтительно 2-5 РЕС-Групп). РЕС-группьї! прикрепляются к белку в основном посредством альфа- или зпсилон-аминокислотньїх групп, однако не исключаєтся возможность того, что РЕС-группь! могут бьть присоединеньії к любой аминогруппе белка, которая обладаєт достаточной реакционной способностью, чтобь! связьіваться с РЕС в подходящих условиях проведения реакции.I have, and the RES group(s) are attached to the protein molecule by means of an acyl or alkyl group. As indicated above, such a product! they can be monosubstituted (for example, containing 2-6, preferably 2-5 RES-Groups). RES groups! are attached to the protein mainly by means of alpha or zpsilon amino acid groups, however, the possibility of RES groups is not excluded! can be attached to any amino group of a protein that has sufficient reactivity so that! connect with RES under suitable reaction conditions.

Полимернье молекуль, используемье в реакциях ацилирования и алкилирования, могут бьть вьібраньї из водорастворимьїх полимеров или их смесей. В случає водорастворимого полимера белок, к которому он прикреплен, не будет преципитировать в водной среде, такой как физиологическая жидкость.Polymer molecules used in acylation and alkylation reactions can be selected from water-soluble polymers or their mixtures. In the case of a water-soluble polymer, the protein to which it is attached will not precipitate in an aqueous medium such as physiological fluid.

Вьібранньйй полимер следует модифицировать таким образом, чтобьї он содержал одну реакционно- способную группу, такую как активньй зфир в случає ацилирования или альдегид в случає алкилирования. Предпочтительно, чтобьії степень полимеризации могла контролироваться, как зто описано в настоящем изобретенийи. Предпочтительньім реакционно-способньмм РЕС-альдегидом является пропиональдегид полизтиленгликоля, которьйй стабилен в воде, или моно С1-С1-алкокси или арилокси его производнье (см. Патент США Ме5,252, 714). Полимер может бьіть линейньмм или разветвленньім. При использований для терапевтических целей конечного продукта предпочтительно, чтобьї полимер бьл фармацевтически приемлемьм. Водорастворимьй полимер может бьїть вьібран из группьї, содержащей, например, полизтиленгликоль, монометоксиполизтиленгликоль, декстран, поли(М- винилпирролидон)полизтиленгликоль, гомополимерьї пропиленгликоля, сополимер полипропилен оксида/зтилендиоксида, полиоксизтилированнье полиольц(например, глицерин) и поливиниловьй спирт.The selected polymer should be modified in such a way that it contains one reactive group, such as active sulfur in the case of acylation or aldehyde in the case of alkylation. Preferably, the degree of polymerization could be controlled, as described in the present invention. Polyethylene glycol propionaldehyde, which is stable in water, or its mono C1-C1-alkoxy or aryloxy derivative is the preferred reactive RES-aldehyde (see US Patent Me5,252, 714). The polymer can be linear or branched. When the final product is used for therapeutic purposes, it is preferable that the polymer is pharmaceutically acceptable. The water-soluble polymer can be selected from the group consisting of, for example, polyethylene glycol, monomethoxypolyethylene glycol, dextran, poly(M-vinylpyrrolidone)polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide/ethylenedioxide copolymer, polyoxytylated polyols (eg, glycerin) and polyvinyl alcohol.

Для реакции ацилирования, полимер(ь) вьбирают таким образом, чтобьі он(они) имел(и) одну реакционно-способную зфирную группу. Для реакций алкилирования в восстанавливающих условиях полимер(ьї) вьібирают таким образом, чтобьї он(они) имел(и) одну реакционно-способную альдегидную группу. В целом, водорастворимьй полимер не следует вьібирать из природньїх гликозильньх остатков, поскольку зти остатки обьічно более удобно присоединять к белку путем озкспрессии в клетках млекопитающих. Полимер может бьіть любой молекулярной массь.For the acylation reaction, the polymer(s) is selected in such a way that it(they) has one reactive ester group. For alkylation reactions under reducing conditions, the polymer(s) are selected in such a way that they have one reactive aldehyde group. In general, the water-soluble polymer should not be selected from natural glycosyl residues, since these residues are generally more conveniently attached to the protein by expression in mammalian cells. A polymer can have any molecular weight.

Особенно предпочтительно использование в качестве водорастворимого полимера полизтиленгликоля(РЕС, ПОГ). Как отмечаєтся в настоящем описаний, для получения производньх различньїх белков может бьіть использована любая форма РЕС, например моно-(С1-С10)алкокси или арилокси-полизтиленгликоль.It is especially preferable to use polyethylene glycol (RES, POG) as a water-soluble polymer. As noted in the present description, any form of RES, for example, mono-(C1-C10) alkoxy or aryloxy-polyethylene glycol, can be used to obtain derivatives of various proteins.

Как отмечалось ранеє, под МООЕ также понимают любую из его форм, описьіваємьх здесь.As noted earlier, ILO also includes any of its forms described here.

Например, зто могут бьіть гликозилированньюе или негликозилированнье формь МООР, а также белки, имеющие полную длину или же образовавшиеся в результате расщепления исходного продукта. Ниже приведеньі предпочтительнье МОЮОЕ-белки, на оснований которьїх могут бьть полученьі! различнье производнье(в каждом случає номера аминокислот соответствуют таковьм на фиг.11): мМаюв-1 аминокислоть 22-353 фиг.11 мМаюв-2 аминокислоть 22-195 фиг.11 мав -4 аминокислоть 22-172 фиг.11 мМаюв-11 аминокислоть 22-184 фиг.11 мМарв-12 аминокислоть 27-353 фиг.11 мМарв-13 аминокислоть 27-195 фиг.11 мМарв-14 аминокислоть 27-172 фиг.11 мМарв-15 аминокислоть 27-184 фиг.11For example, glycosylated or non-glycosylated forms of MOOR, as well as full-length proteins or proteins formed as a result of cleavage of the original product, can be used. Below are the preferred MYUOE-proteins, on the basis of which they can be obtained! different derivatives (in each case the numbers of amino acids correspond to those in fig. 11): mMayuv-1 amino acid 22-353 fig. 11 mMayuv-2 amino acid 22-195 fig. 11 had -4 amino acid 22-172 fig. 11 mMayuv-11 amino acid 22-184 fig.11 mMarv-12 amino acid 27-353 fig.11 mMarv-13 amino acid 27-195 fig.11 mMarv-14 amino acid 27-172 fig.11 mMarv-15 amino acid 27-184 fig.11

Указаннье МОЮОЕ-белки могут бьть негликозилированьі, дегликозилированьі, предпочтительно, негликозилировань. Они могут бьть полученьй в рекомбинантньїх бактериальньхх(например, Е. сої) системах или в клетках млекопитающих(например, СНО).Indication of MOYUE-proteins can be non-glycosylated, deglycosylated, preferably non-glycosylated. They can be obtained in recombinant bacterial (for example, E. soy) systems or in mammalian cells (for example, CHO).

Ниже приведеньі найболее предпочтительнье производнье МОЮ, полученнье химическим путем(в каждом случає они моно или полипзгировань, т. е. например, содержат 2 - 4 молекульї РЕЯ, присоединенньюе посредством ацильной или алкильной группьї): погированньй МОаЮОЕ-11 пзгированньйBelow are the most preferred derivatives of MOI, obtained by chemical means (in each case, they are mono or polysubstituted, i.e., for example, contain 2-4 molecules of REA, attached by means of an acyl or alkyl group):

Маю -4 пзгированньій МБО Б-2I have -4 modified MBO B-2

В целом, получение производньїх МЕЮЕ химическим путем может происходить в любьїх подходящих условиях для вступления в реакцию биологически активного соединения с активированной молекулой полимера. Методьі получения погированного МООЕ обьічно включают следующие стадии: (а) прохождение реакции между полипептидом МОЮОЕ и полизтиленгликолем(например, реакционно- способньім зфиром или альдегидньмм производньм РЕС) в условиях, когда МаЮЕ соединяется с одной или более РЕС-группами, и (б) вьіделение продукта(продуктов) реакции. В целом, оптимальнье, реакционньюе условия для ацилирования определяются от случая к случаю на основе известньїх параметров и желаемого результата. Например, чем больше соотношение РЕСибелок, тем больше вьход(в процентах) полипзгированного продукта.In general, the production of MEUE derivatives by chemical means can occur in any suitable conditions for the reaction of a biologically active compound with an activated polymer molecule. The methods of obtaining pogerized MOOE generally include the following stages: (a) the passage of the reaction between the polypeptide of MOOE and polyethylene glycol (for example, a reactive sulfur or an aldehyde derivative of RES) under the conditions when MaOE is combined with one or more RES groups, and (b) isolation reaction product(s). In general, the optimal reaction conditions for acylation are determined on a case-by-case basis based on known parameters and the desired result. For example, the greater the ratio of REproteins, the greater the yield (in percent) of the polyphage product.

Восстановительное алкилированиє для получения, по существу, гомогенного коньюгата монополимер/МаргЕ-белок обьічно включает следующие стадии: (а) прохождение реакций между МОаОБ-белком с реакционно-способньм РЕС ов условиях восстановительного алкилирования при рН, обеспечивающим селективную модификацию альфа- аминогруппь! на амино-терминальном участке МЕООРЕ-белка; и (б) виіделение продукта(продуктов) реакции.Reductive alkylation to obtain, essentially, a homogeneous monopolymer/MargE-protein conjugate generally includes the following stages: (a) the passage of reactions between MOaOB-protein with the reactivity of RES under the conditions of reductive alkylation at a pH that provides selective modification of alpha-amino groups! on the amino-terminal part MEOORE-protein; and (b) isolation of the reaction product(s).

Для получения, по существу, гомогенного коньюгата монополимер/МООЕ-белок условия реакции восстановительного алкилирования должньі! обеспечивать избирательное связьівание водорастворимого полимера с М-терминальньм участком МОЮОР. Такие условия обьічно основань! на различиях рКа между аминогруппами лизина и альфа-аминогруппой на М-терминальном участке(рКа представляєт собой значение рН, при котором 5095 аминогрупп протонировань, а 5095 - нет), рН также влияєт на используемое соотношениеєе полимера и белка. В целом, при более низком рН требуется избьток полимера по отношению к белку(т. е., чем меньше реакционно-способньїх М-терминальньїх альфа-аминогрупп, тем большее количество полимера нужно для достижения оптимального результата). Если значение рН более вьісокое, не требуется большого соотношения полимер: белок(ідоступно большеєе количество реакционно- способньїх групп, так что требуется меньше полимерньїх молекул). Для целей настоящего изобретения значение рН обьічно составляет З - 9, предпочтительно З - 6.To obtain, essentially, a homogeneous monopolymer/MOOE-protein conjugate, the conditions of the reductive alkylation reaction are necessary! to ensure selective binding of a water-soluble polymer to the M-terminal part of MOYUR. Such conditions are completely unreasonable! on the differences in pKa between the amino groups of lysine and the alpha-amino group on the M-terminal part (pKa is the pH value at which 5095 amino groups are protonated, and 5095 - not), pH also affects the used ratio of polymer and protein. In general, at a lower pH, an excess of polymer is required in relation to the protein (ie, the less reactive M-terminal alpha-amino groups, the greater the amount of polymer needed to achieve the optimal result). If the pH value is higher, a large ratio of polymer: protein is not required (a larger amount of reactive groups is available, so fewer polymer molecules are required). For the purposes of the present invention, the pH value is generally C - 9, preferably C - 6.

Другой важньй аспект - зто молекулярная масса полимера. В целом, чем больше мол.масса полимера, тем меньшее число его молекул способно соединиться с белком. Для оптимизации данньх параметров следуєт учитьшать степень ветвления полимера. Как правило, при большей мол.массе(большей степени ветвления) вьіше отношение полимер:белок. Для рассматриваемьїх здесь реакций соеєдинения РЕСї с белком мол.масса РЕСї в среднем составляеєт около 2кД - 100кД(понятие "около" соответствует -/-1КД). Предпочтительно, чтобь! средняя мол.масса РЕС: составляла около 5кКД -Another important aspect is the molecular weight of the polymer. In general, the higher the molecular weight of the polymer, the smaller the number of its molecules able to combine with the protein. To optimize these parameters, the degree of branching of the polymer should be studied. As a rule, the higher the molecular weight (higher degree of branching), the higher the polymer:protein ratio. For the reactions of the combination of RES with protein considered here, the molar mass of RES is on average about 2kD - 100kD (the term "about" corresponds to -/-1KD). It is preferable that! average molar mass of RES: was about 5 kKD -

Б5ОКкД, особенно предпочтительно - около 12кД - 25кД. Отношение водорастворимьй полимер : МЕОБ- белок, в основном, составляет 1:11 - 10071, предпочтительно(для полипогирования) 1:11 - 20:1 и(для монопзгирования) 11 - 571.B5OKkD, especially preferably - about 12kD - 25kD. The ratio of water-soluble polymer: MEOB-protein is generally 1:11 - 10071, preferably (for polyhybridization) 1:11 - 20:1 and (for monohybridization) 11 - 571.

При использований указанньх вьіше условий, восстановительное алкилирование будет обеспечивать избирательное присоединение полимера к любому МЕОЕ-белку, имеющему альфа-аминогруппу на амино- терминальном участке, и способствовать получению, по существу, гомогенного препарата монополимера, коньюгированного с МЕОЕ-белком. Понятие "монополимер, коньюгированньій с МЕОЕ-белком", относится к соединению, содержащему молекульй РЕС-белка, связаннье с одной молекулой полимера. Такой коньюгат предпочтительно будет содержать молекулу полимера, расположенную на М-терминальном участке, но не на боковьїх аминогруппах лизина. Полученньій препарат, предпочтительно, более чем на 9095 состоит из монополимера, коньюгированного с МООЕ-белком, и предпочтительнее - более, чем на 9595, при зтом остаются молекульї, не вступившие в реакцию(молекульі белка, на взаймодействие с которьими не хватило полимера). В приведенньїх ниже примерах показано получение препарата, по крайней мере, на 9095 состоящего из коньюгата монополимера и белка и на 1095 состоящего из не вступившего в реакцию белка. Такой коньюгат является биологически активньм.Under the conditions indicated above, reductive alkylation will ensure selective attachment of the polymer to any MEOE protein that has an alpha-amino group at the amino-terminal site, and will facilitate the production of an essentially homogeneous preparation of a monopolymer conjugated with MEOE protein. The term "monopolymer conjugated with MEOE protein" refers to a compound containing a molecule of RES protein linked to one polymer molecule. Such a conjugate will preferably contain a polymer molecule located on the M-terminal part, but not on the side amino groups of lysine. The resulting drug, preferably more than 9095, consists of a monopolymer conjugated with MOOE-protein, and preferably more than 9595, while molecules that did not enter into the reaction remain (protein molecules that did not have enough polymer to interact with). The following examples show the preparation of at least 9095% of the monopolymer-protein conjugate and 1095% of the unreacted protein. Such a conjugate is biologically active.

Для проведения восстановительного алкилирования, восстанавливающий агент должен бьть стабильньмм в водном растворе и предпочтительно обладать способностью к восстановлению толькоTo carry out reductive alkylation, the reducing agent should be stable in aqueous solution and preferably have the ability to reduce only

Шиффовьх оснований, образовавшихся на начальньх озтапах восстановительного алкилирования.Schiff's base, formed at the initial stages of reductive alkylation.

Предпочтительнье восстанавливающие агенть! могут бьіть вьібрань! из группьї, содержащей борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламинборан, триметиламинборан и пиридинборан. Особенно предпочтительньім восстанавливающим агентом является цианоборогидрид.Preferably a restoring agent! can beat the vibes! from the group containing sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, dimethylaminoborane, trimethylaminoborane and pyridineborane. A particularly preferred reducing agent is cyanoborohydride.

Другие прараметрь! осуществления реакции, такие как растворитель, время реакции, температура и т. д., а также степень очистки продуктов могут определяться от случая к случаю на основе опубликованной информации, касающейся получения производньх белков при использованиий водорастворимьх полимеров(см. приведеннье в настоящем описаний ссьлки). Более подробно указаннье реакции изложень! в примерах, приведенньх ниже.Other prarameter! the implementation of the reaction, such as the solvent, reaction time, temperature, etc., as well as the degree of purification of the products can be determined on a case-by-case basis on the basis of published information regarding the production of protein derivatives using water-soluble polymers (see references herein) . A more detailed description of the reaction is given! in the examples below.

Для получения смеси белка, коньюгированного с полимером, может бьіть вьиібран метод ацилирования и/или алкилирования, причем прейимущество описанного здесь подхода заключается в том, что можно приготовить смесь с заданньм относительньмм содержанием монополимер/белок. Таким образом, при необходимости получают смесь различньїх белков, связанньх с различньім числом молекул полимера(ди-, три-, тетра- и т. д.), в сочетаний с коньюгатом монополимер/белок, полученньм при использований изложенньїх здесь методов, причем указанная смесь характеризуется заданньмм содержанием коньюгата монополимер/белок.To obtain a mixture of protein conjugated with a polymer, the method of acylation and/or alkylation can be selected, and the advantage of the approach described here is that it is possible to prepare a mixture with a given relative content of monopolymer/proteins. Thus, if necessary, a mixture of different proteins associated with a different number of polymer molecules (di-, tri-, tetra-, etc.) is obtained in a monopolymer/protein conjugate combined with the methods described here, and the specified mixture characterized by the content of the monopolymer/protein conjugate.

В приведенньїх ниже примерах раскрьівается способ получения химически модифицированного МЕС и МООР, соединенного с РЕС: посредством ацилирования или алкилирования. Соответственно другие аспектьї изобретения связань! сданньіми соединениями.In the following examples, a method of obtaining a chemically modified MES and MOOR, connected with RES is disclosed: by means of acylation or alkylation. Sootvetstvenno other aspects of the invention are connected! by these compounds.

В целом, многие болезненнье состояния могут бьіть скоррегировань! путем применения заявленньх коньюгатов МОБ с полимером. Однако, такие коньюгатьь могут обладать модифицированной активностью, как увеличенной, так и уменьшенной, а также другими свойствами по сравнению с неизмененньіми молекулами.In general, many painful conditions can be corrected! by applying the claimed MOB-polymer conjugates. However, such conjugates can have modified activity, both increased and decreased, as well as other properties compared to unchanged molecules.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям на основе химически модифицированньїх МЕЮОЕ-белков. Такие фармацевтические композиции могут содержать и какой-либо из немодифицированньїх МЕАОЕ-белков.Another aspect of the present invention relates to pharmaceutical compositions based on chemically modified MEYUOE proteins. Such pharmaceutical compositions may also contain any of the unmodified MEAOE proteins.

По мере проведения дополнительньїх исследований появится информация о подходящих дозах указанньїх препаратов для лечения различньїх заболеваний у разньїх больньїх, и средний специалист в данной области исследований, учитьявая медицинские показания, возраст и общее состояние пациента, сможет подобрать соответствующую дозу. В целом, доза может составлять от 0,01мкг/кг веса тела(в расчете на массу белка, не имеющего химических модификаций) до ЗО0Омкг/кг веса тела(рассчитанную аналогичньмм образом). Предпочтительная доза, в целом, может составлять от Б5мкг/кг веса тела до 10Омкг/кг веса тела, особенно предпочтительна доза от 1Омкг/кг веса тела до 75мкг/кг.As additional research is carried out, information about the appropriate doses of indicated drugs for the treatment of various diseases in different patients will appear, and the average specialist in this field of research, studying the medical indications, age and general condition of the patient, will be able to choose the appropriate dose. In general, the dose can range from 0.01 µg/kg of body weight (based on the mass of the protein, which does not have chemical modifications) to 30 µg/kg of body weight (calculated in a similar way). The preferred dose, in general, can be from B5mcg/kg of body weight to 10Omkg/kg of body weight, especially the preferred dose is from 1Omkg/kg of body weight to 75mkg/kg.

Настоящее изобретение относится также к способу получения МаОЕ-полипептидов(полипептидов мМарЕ-лиганда) или их активньїх фрагментов. Один из заявленньїх способов включаєт встрайвание кКДНК, кодирующей полипептид Мрі-лиганда, в вектор зкспрессии для получения системь! зкспрессии Мрі- лиганда. Отобранньюе клетки-хозяева трансфицирует данньм вектором и культивируют. Способ, заявленньй в настоящем изобретений, таким образом, включаєет культивирование подходящих клеток или клеточной линии, трансфицированньїх ДНК-последовательностью, кодирующей или зкспрессирующей полипептид Мрі-лиганда под контролем известньїх регуляторньїх последовательностей. К регуляторньім последовательностям относятся фрагментьі опромотора, терминатора и другие подходящие последовательности, которне направляют/контролируют зкспрессию белка в соответствующих клетках- хозяевах. Затем продукт зкспрессии вьіделяют и очищают от культуральной средьцЦили от клеток в случає внутриклеточной зкспрессии) любьм пригодньм методом, известньм специалисту в данной области исследований. Кроме того, для получения заявленньх полипептидов/полинуклеотидов могут бьть использовань! способьї, описаннье в Патенте США Ме5272071.The present invention also relates to the method of obtaining MaOE polypeptides (mMarE-ligand polypeptides) or their active fragments. One of the claimed methods includes the insertion of cDNA encoding the Mri-ligand polypeptide into the expression vector to obtain systems! Mriligand expression. Selected host cells are transfected with this vector and cultivated. The method claimed in the present invention thus includes the cultivation of suitable cells or cell lines transfected with a DNA sequence encoding or expressing an Mri-ligand polypeptide under the control of known regulatory sequences. Regulatory sequences include promoter fragments, terminators, and other suitable sequences that guide/control protein expression in the respective host cells. Then the zxpression product is isolated and purified from the culture medium or from the cells in the case of intracellular zxpression) by any suitable method known to a specialist in this field of research. In addition, polypeptides/polynucleotides can be used to obtain applications! methods described in US Patent Me5272071.

Подходящие клетки или клеточнье линии могут бьїть клетками млекопитающих, например клетками яичников китайского хомячкасєсснНо) или З3Т3. Методьй вьбора подходящих клеток-хозяев, их трансформации и культивирования, амплификации, скрининга, вьіделения и очистки целевого продукта известнь из уровня техники. См., например, Сешпйіпд апа Затргоок, Майшге 293: 620-625(1981) или Кашїтап еї аї., Мої.СеїІ.Віо!. 5(7): 1750-1759(1985) или Ном/єу єї аІ., Патент США 4419446. К другим подходящим клеточньмм линиям млекопитающих относятся линии клеток обезьяньї СО5-1, СО5-7 и СМ-1. В приведенньїх ниже примерах используются клетки млекопитающих, в том числе линии клеток приматов и грьізунов, в частности, трансформированньюе клеточнье линии. Могут бьть использовань: также нормальньсе диплоидньєе клетки, клеточнье штаммь, полученнньє іп міо при культививрований первичньх тканей, а также первичнье зксплантать. Клетки могут бьіть генетически дефектньми по селективному маркеру или содержать доминантно функционирующий селективньй ген. К другим подходящим клеточньім линиям млекопитающих относятся(но не ограничиваются указанньмми) Неї а, клетки 1-929 мьіши, З3Т3- линии, полученнье от мьішей бм/із5, Ваїр/с или МІН, а также клетки хомячка ВНК или Нак.Suitable cells or cell lines can be derived from mammalian cells, such as Chinese hamster ovary cells or Z3T3. Methods of selection of suitable host cells, their transformation and cultivation, amplification, screening, isolation and purification of the target product are from the state of the art. See, for example, Seshpipd apa Zatrgook, Maishge 293: 620-625(1981) or Kashitap ei ai., Moi.SeiI.Vio!. 5(7): 1750-1759(1985) or Nom/euyi AI., US Patent 4419446. Other suitable mammalian cell lines include monkey cell lines CO5-1, CO5-7 and CM-1. In the following examples, mammalian cells are used, including cell lines of primates and rodents, in particular, transformed cell lines. The following can be used: also normal diploid cells, a cell strain obtained from cultured primary tissues, and also primary explants. Cells can be genetically defective for a selective marker or contain a dominantly functioning selective gene. Other suitable mammalian cell lines include (but are not limited to) Nei a, mouse 1-929 cells, Z3T3 lines derived from bm/iz5, Vair/s, or MIN mice, as well as BNK or Nak hamster cells.

Подходящими клетками-хозяевами для целей настоящего изобретения являются также бактериальнье клетки. Например, специалистам в биотехнологии хорошо известньі! различнье штаммьSuitable host cells for the purposes of the present invention also include bacterial cells. For example, specialists in biotechnology know lime well! different strains

Е.сої(например, НВІ10О1, ОН5б-аМа, ОНІО и МС1061), которье могут использоваться в качестве клеток- хозяев. Кроме того, при осуществленийи заявленного способа могут бьіть примененьі различнье штаммь!E. soybeans (for example, NVI10O1, ОН5б-аМа, ONIO and MC1061), which can be used as host cells. In addition, when implementing the declared method, different strains can be used!

В. зибійв, Рзейдотопаз зрр., Васіиз 5рр., Зігерютусез зрр. и подобньсє им.V. zibiyv, Rzeidotopaz s.r.r., Vasiiz 5r., Zigeryutusez sr.r. and like them.

Для зкспрессии заявленньїх полипептидов в качестве клеток-хозяев можно использовать и различнье штаммь! дрожжей, известнье специалистам в данной области исследований. При необходимости для осуществления заявленного способа в качестве клеток-хозяев возможно использование клеток насекомьх. См., например МіШМег еї аї!., Сепеїйс Епдіпеегпд 8: 277-298(1986) и приведеннье в настоящем описаний ссьілки.Various strains can be used as host cells for the expression of the claimed polypeptides! yeast, known to specialists in this field of research. If necessary, insect cells may be used as host cells for the implementation of the claimed method. See, for example, MiShmeg ei ai!., Sepeiys Epdipeegpd 8: 277-298 (1986) and the references herein described.

Настоящее изобретениеє таюже относится к рекомбинантньм молекулам или векторам для использования в способе зкспрессийи новьїх полипептидов Мрі-лиганда. Указаннье векторьї содержат ДНК- последовательности Мрі-лиганда, которье сами по себе или в сочетаний с о другими последовательностями кодируют полипептидь! Мрі-лиганда(как с сигнальнь!м пептидом, так и без него), заявленнье в настоящем изобретениий, или их активнье фрагменть». Альтернативно, векторь, содержащие модифицированнье последовательности, как описано вьшше, также включень! в обьем изобретения и применяются для получения полипептидов Мрі-лиганда. Вектор, используемьй для осуществления способа, содержит вьбраннье регуляторнье последовательности, функционально связаннье с ДНК-кодирующими последовательностями, полученньіми согласно настоящему изобретению, и способен направлять зкспрессию таких последовательностей в клетках-хозяевах.The present invention also relates to recombinant molecules or vectors for use in the method of expressing new Mri-ligand polypeptides. The indicated vectors contain DNA sequences of Mri-ligand, which by themselves or in combination with other sequences encode a polypeptide! Mri-ligand (both with a signal peptide and without it), the application of the present invention, or their active fragment. Alternatively, the vector containing the modified sequence, as described above, is also included! in the scope of the invention and are used to obtain Mri-ligand polypeptides. The vector used for the implementation of the method contains selected regulatory sequences functionally linked to DNA-coding sequences obtained according to the present invention, and is capable of directing the expression of such sequences in host cells.

Для зкспрессии белков в СО5-клетках особенно предпочтительнь!м является вектор РХМ |М.С.Мапд єї аі.,, 47: 3-10(1986)). Другим вектором, удобньм для зкспрессии белков в клетках млекопитающих, например, клетках СНО, служит вектор РЕМС2В1. Описанньюе здесь векторьї для зкспрессии белков в клетках млекопитающих могут бьіть полученьї известньіми способами. Составляющие векторов, например, репликоньї, селективнье маркерньюе геньі, знхансерь, промоторь и т. д. могут бьть получень! из природньх источников или синтезировань! с помощью известньх подходов. См., например, Каштанп евї аї.,For the expression of proteins in СО5 cells, the vector РХМ is especially preferable. The second vector, useful for protein expression in mammalian cells, for example, CHO cells, is the REMS2B1 vector. The vectors described here for the expression of proteins in mammalian cells can be obtained by known methods. Components of vectors, for example, replicons, selective marker genes, enhancers, promoters, etc., can be obtained! from natural sources or synthesis! with the help of certain approaches. See, for example, Kashtanp evy ai.,

У.Мої.Віої. 159: 511-521(1982); и Каштап, Ргос.Май.Асай.5сі.О5А 82: 689-693(1985). Альтернативно, ДНК - вектор может содержать цельй геном или часть генома бьічьего вируса папилломь! (Г и5Ку еї аї., 36: 391- 401(1984)| и реплицироваться в клеточньїх линиях, например клетках С127 мьши, как стабильньй зписомальньй злемент. Перенос таких векторов в соответствующие клетки-хозяева приводит к зкспрессий в зтих клетках полипептидов Мрі-лиганда.U. Moi. Vioi. 159: 511-521 (1982); and Kashtap, Rgos. Mai. Asai. 5si. O5A 82: 689-693 (1985). Alternatively, the DNA vector may contain the entire genome or part of the genome of the bovine papilloma virus! (G i5Ku eii ai., 36: 391-401 (1984)| and replicated in cell lines, for example C127 moss cells, as a stable transcriptional element. The transfer of such vectors into the appropriate host cells leads to the expression of Mri-ligand polypeptides in those cells .

Для целей настоящего изобретения могут бьть использованьь и другие подходящие векторьї, предназначеннье для зкспрессии белков в клетках млекопитающих, насекомьх, дрожжей, грибов и бактерий.For the purposes of the present invention, other suitable vectors designed for protein expression in mammalian, insect, yeast, fungal, and bacterial cells may be used.

Болезненнье состояния, которне подлежат коррекции с помощью заявленньїх композиций и способов их применения, в целом, являются состояниями с недостаточностью мегакариоцитов/тромбоцитов, или же возникновение такой недостаточности ожидаєтся в будущем(например, при планируемьх хирургических операциях). Указанньюе состояния обьічно развиваются в результате недостаточности(хронической или преходящей) активного Мрі-лиганда іп мімо. Обьічньїім названием недостаточности тромбоцитов является тромбоцитопения, позтому заявленнье композиции и способьї их применения относятся к лечению тромбоцитопении.Painful conditions that are subject to correction with the help of the claimed compositions and methods of their application are, in general, conditions with a deficiency of megakaryocytes/platelets, or the occurrence of such a deficiency is expected in the future (for example, during planned surgical operations). The indicated conditions generally develop as a result of a deficiency (chronic or transient) of the active Mri-ligand and mimo. Thrombocytopenia is the common name for platelet insufficiency, therefore the application of the composition and methods of its use relate to the treatment of thrombocytopenia.

Тромбоцитопения(недостаточность тромбоцитов) может бьїть вьізвана различньіми причинами, в том числе, химиотерапией, лекарственной терапией, радиационой терапией, хирургическими вмешательствами, случайной кровопотерей и другими заболеваниями. Примерами болезненньх состояний, при которьїх наблюдаєтся тромбоцитопения и которье могут бьть корригировань! в соответствии с настоящим изобретениеєм, являются апластическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, метастазирующие опухоли, приводящие к тромбоцитопениий, системная красная волчанка, спленомегалия, синдром Фанкони, недостаточность витамина В12, недостаточность фолиевой кислотьі, аномалия Мзя-Хегглина, синдром Вискотта-Олдрича и пароксизмальная ночная гемоглобинурия.Thrombocytopenia (lack of platelets) can be caused by various causes, including chemotherapy, drug therapy, radiation therapy, surgical interventions, accidental blood loss, and other diseases. Examples of painful conditions in which thrombocytopenia is observed and which can be corrected! according to the present invention, aplastic anemia, idiopathic thrombocytopenia, metastasizing tumors leading to thrombocytopenia, systemic lupus erythematosus, splenomegaly, Fancona syndrome, vitamin B12 deficiency, folic acid deficiency, Mzyah-Hegglin anomaly, Wiskott-Aldrich syndrome and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria are recognized .

Кроме того, к тромбоцитопений приводит лечение СПИДа некоторьми препаратами(например, А2Т).In addition, treatment of AIDS with some drugs (for example, A2T) leads to thrombocytopenia.

Определеннье нарушения в заживлениий ран также могут бьть обусловленьй увеличением числа тромбоцитов.Certain disorders in the healing of wounds can also be caused by an increase in the number of platelets.

При ожидаємой недостаточности тромбоцитов, например в результате будущих хирургических операций, Мрі-лиганд, заявленньій в настоящем изобретении, может бьіть применен в течение периода времени, составляющего от нескольких дней до нескольких часов до возникновения потребности в тромбоцитах. В случає острьїх состояний, например, при внезапньїх и больших кровопотерях, Мрі-лиганд может бьіть введен вместе с заменяющей кровью или очищенньіми тромбоцитами.In the case of an expected lack of platelets, for example, as a result of future surgical operations, Mri-ligand, the application of the present invention, can be applied within a period of time, which is from several days to several hours before the need for platelets. In the case of an acute condition, for example, with sudden and large blood loss, Mri-ligand can be administered together with replacement blood or purified platelets.

Заявленньюе Мрі-лигандь! могут бить использованьї и для стимуляции определенньїх типов клеток, отличньїх от мегакариоцитов, если показано, что такие клетки зкспрессируют Мрі-рецептор. Состояния, ассоциированньюе с клетками, зкспрессирующими Мрі-рецептор, ответственньй за зффект стимуляции посредством Мрі-лиганда, также рассматриваются в обьеме настоящего изобретения. мМареЕ-молекуль,, которье сами по себе не опроявляют оактивности в описьваємьх здесь зкспериментах, могут оказаться полезньми в качестве модуляторов(например, стимуляторов или ингибиторов) Мрі-рецепторов іп міїго.Statement of Mri-ligand! they can also be used to stimulate certain types of cells other than megakaryocytes, if it is shown that such cells express the Mri receptor. Conditions associated with cells expressing the Mri-receptor responsible for the effect of stimulation by means of the Mri-ligand are also considered within the scope of the present invention. mMareE molecules, which by themselves do not show activity in the experiments described here, may be useful as modulators (for example, stimulators or inhibitors) of Mri-receptors and miigo.

Для лечения указанньх вьше заболеваний заявленнье полипептидь могут бьть применень! самостоятельно или в сочетаний с о другими цитокинами, растворимьвм / Мрі-рецептором, гематопозтическими факторами, интерлейкинами, ростовьіми факторами или антителами.For the treatment of several diseases, the claimed polypeptide can be used! alone or in combination with other cytokines, soluble/Mri-receptor, hematopoietic factors, interleukins, growth factors or antibodies.

В соответствии с зтим, еще один аспект настоящего изобретения заключаєется в получений терапевтических композиций для лечения приведенньх заболеваний. Такие композиции содержат терапевтически зффективное количество полипептида Мрі-лиганда или его активного фрагмента в комплексе с фармацевтически приемлемьм носителем. Носитель может представлять собой воду для иньекций, предпочтительно дополненную другими компонентами для получения растворов, которье могут вводиться млекопитающим. При терапевтическом использований Мрі-лиганд может бьіть применен в виде композиции, содержащей очищенньй белок, коньюгированньй с одним или более фзиологически приемлемьми носителями, растворителями или разбавителями. Нейтральньй буферньй раствор или раствор, смешанньй с сьвороточньм альбумином, являются примерами подходящих носителей.Accordingly, another aspect of the present invention is to provide therapeutic compositions for the treatment of the present diseases. Such compositions contain a therapeutically effective amount of the Mri-ligand polypeptide or its active fragment in complex with a pharmaceutically acceptable carrier. The carrier can be water for injections, preferably supplemented with other components to obtain solutions that can be administered to mammals. The therapeutically used Mri-ligand can be used in the form of a composition containing purified protein conjugated with one or more physiologically acceptable carriers, solvents or diluents. A neutral buffer solution or a solution mixed with serum albumin are examples of suitable carriers.

Предпочтительно, продукт приготавливают в лиофилизированной форме при использований соответствующих растворителей(например, сахарозь). Могут бьть использованьій и другие обьічнье носители, разбавители или растворители, например Трис-буфер(рн 8,0) и ацетатньйй буфер(рнН 5,0), которне иногда содержат сорбитол. Заявленнье композиции могут вводиться парентерально.Preferably, the product is prepared in a lyophilized form using appropriate solvents (for example, sucrose). Other common carriers, diluents or solvents can be used, for example, Tris buffer (pH 8.0) and acetate buffer (pH 5.0), which sometimes contain sorbitol. The application of the composition can be administered parenterally.

Альтернативно, композиции могут бьть примененьй внутривенно или подкожно. При системном применений для целей настоящего изобретения терапевтические композиции могут бьіть приготовлень! в апирогенной форме в виде водного раствора, пригодного для парентерального введения. Способь приготовления таких фармацевтически пригодньїх растворов белка в соответствии с необходимьм рн, изотоническими свойствами, стабильностью хорошо известньь специалистам в данной области исследований.Alternatively, the compositions may be administered intravenously or subcutaneously. When the therapeutic compositions used for the purposes of the present invention are systemic, they can beat the preparations! in pyrogenic form in the form of an aqueous solution suitable for parenteral administration. The method of preparing such pharmaceutically suitable protein solutions in accordance with the required pH, isotonic properties, and stability is well known to specialists in this field of research.

Дозировка и режим введения препаратов при осуществлений способа лечения описанньїх вьіше заболеваний подбираются практикующим врачом с учетом различньїх факторов, изменяющих действие лекарств, таких как возраст, состояние больного, характер его питания, вес тела, пол, тяжесть какой-либо инфекции, время применения и другие клинические факторь. В целом, ежедневно следуєет применять около 0,1-1000мкг белка Мрі-лиганда или его фрагмента на кг веса тела.The dosage and mode of administration of the drugs when implementing the method of treatment of the described diseases are selected by the practicing doctor taking into account various factors that change the effect of the drugs, such as the age, the patient's condition, the nature of his diet, body weight, gender, the severity of any infection, the time of application, etc. clinical factor. In general, about 0.1-1000 μg of Mri-ligand protein or ego fragment per kg of body weight should be used daily.

Композиции и полипептидьї, заявленнье в настоящем изобретении, при осуществлении способов лечения могут бьть использованьй как сами по себе, так и в сочетанимй с другими цитокинами, растворимьм Мрі-рецептором, гематопозтическими факторами, интерлейкинами, ростовьіми факторами или антителами при корригирований заболеваний, характеризующихся симптомами, отличньми от тромбоцитарной недостаточности. Ожидается, что Мрі-лиганд будет действительно полезен при лечений некоторьїх форм тромбоцитопений в сочетаниий с такими мощньіми стимуляторами гематопозза, как ІІ -3 или 24М-С5Е. Кроме того, вместе с Мрі-лигандом могут бьіть примененьі и другие факторь! стимуляции мегакариоцитов, например, мег-КСФ(тед-С5Е), фактор стволовьїх клеток(ЗСЕ), лейкоз-ингибирующий фактор(ГІР), онкостатин М(О5М) или инье соединения, обладающие мегакариоцитстимулирующей активностью. Дополнительньмми примерами цитокинов или гематопозтических факторов для указанной сочетанной терапии служат альфа-1І-1, бета-1ІІ -1, 1-2, 1-3, 11/-4, 11-5, 11 -6, 11-11, колониестимулирующий фактор-1(С5Б-1), 2М-С5Е, гранулоцитарньй колониестимулирующий фактор(й-С5Е), ЕРО, альфа- интерферон(альфа-ИФН, ІЕМ), бета-ИФН или гамма-ИФН. Может оказаться целесообразньм одновременное или последовательное введениє совместно с указанньми соединениями растворимогоThe compositions and polypeptides disclosed in the present invention can be used by themselves or in combination with other cytokines, soluble MRI receptors, hematopoietic factors, interleukins, growth factors or antibodies in the treatment of diseases characterized by symptoms, in the implementation of treatment methods. different from platelet insufficiency. It is expected that Mri-ligand will be really useful in the treatment of some forms of thrombocytopenia in combination with such powerful stimulators of hematopoiesis as II-3 or 24M-C5E. In addition, other factors can be used together with Mri-ligand! stimulation of megakaryocytes, for example, meg-CSF (ted-C5E), stem cell factor (SCE), leukemia-inhibiting factor (GIR), oncostatin M (O5M) or other compounds possessing megakaryocyte-stimulating activity. Additional examples of cytokines or hematopoietic factors for the indicated combined therapy are alpha-1I-1, beta-1II -1, 1-2, 1-3, 11/-4, 11-5, 11-6, 11-11, colony-stimulating factor -1 (C5B-1), 2M-C5E, granulocyte colony-stimulating factor (y-C5E), EPO, alpha-interferon (alpha-IFN, IEM), beta-IFN or gamma-IFN. Simultaneous or sequential administration together with the indications of soluble compounds may be appropriate

Мрі-рецептора млекопитающих, которьй, по-видимому, способствует разрушению мегакариоцитов с образованием тромбоцитов, как только мегакариоцитьй созреют. Таким образом, введение Мрі- лиганда(для увеличения количества зрельїх мегакариоцитов) с последующим применением растворимогоMRI-receptor of mammals, which, apparently, contributes to the destruction of megakaryocytes with the formation of platelets, as only megakaryocytes mature. Thus, the introduction of Mriligand (to increase the number of mature megakaryocytes) followed by the use of soluble

Мрі-рецептора(для инактивирования лиганда и разрушения зрельх мегакариоцитов с образованием тромбоцитов), по-видимому, будет действительно зффективньм для стимуляции образования тромбоцитов. Дозь), указаннье вьше, могут бьть скорригированьй в зависимости от того, какие дополнительнье компоненть! входят в состав фармацевтической композиции. Зффективность лечения контролируют соответствующими методами. Кроме того, заявленньюе новье полипептидьі используются для получения антител. Таким образом, в обьем изобретения включень! антитела, взаимодействующие сMRI-receptor (for inactivating the ligand and destroying mature megakaryocytes with the formation of platelets), apparently, will be really effective for stimulating the formation of platelets. Dose), the indication is higher, may be corrected depending on the additional component! are included in the pharmaceutical composition. The effectiveness of treatment is controlled by appropriate methods. In addition, the claimed new polypeptides are used to produce antibodies. Thus, include in the scope of the invention! antibodies interacting with

Мрі-лигандом, полученньім согласно настоящему изобретению, и активнье фрагменть! данньх антител.Mri-ligand, obtained according to the present invention, and the active fragment! these antibodies

Антитела могут бьть поликлональньми, моноклональньми, рекомбинантньми, химерньми, одноцепочечньми и/или биспецифическими и т. д. Фрагментом антитела может бьїть любой фрагмент, взаймодействующий с Мрі-лигандом, такой как Раб, Рар' и т. д. В обьем настоящего изобретения также включень! гибридомь, полученнье при использований Мрі-лиганда или его фрагмента в качестве антигена для иммунизации животньїх, с последующим слиянием клеток животньїх(например, клеток селезенки) с определенной опухолевой клеточной линией. В результате слияния, осуществляемого известньми методами, получают бессмертнье клеточнье линии, продуцирующие антитела. Способь! получения гибридом и антитела, направленнье к целому полипептиду Мрі-лиганда или его отдельньім участкам, также включень! в обьем настоящего изобретения.Antibodies can be polyclonal, monoclonal, recombinant, chimeric, single-chain and/or bispecific, etc. An antibody fragment can be any fragment that interacts with Mri-ligand, such as Rab, Rar, etc. Within the scope of the present invention also turn it on! hybridoma, obtained by using Mri-ligand or its fragment as an antigen for animal immunization, with the subsequent fusion of animal cells (for example, spleen cells) with a certain tumor cell line. As a result of fusion, carried out by certain methods, immortal cell lines producing antibodies are obtained. Ability! production of hybridoma and antibodies, direction to the whole polypeptide of Mri-ligand or its individual parts, also included! within the scope of the present invention.

Антитела могут использоваться в терапии, например для ингибирования связьівания Мрі-лиганда с рецептором. Антитела, связаннье с соответствующей меткой, могут найти применение и в диагностике іп мімо и іп міо, для вніявления Мрі-лиганда в жидкостях организма.Antibodies can be used in therapy, for example, to inhibit the binding of Mri-ligand to the receptor. Antibodies bound to the appropriate label can be used in the diagnosis of ip mimo and ip mio, for the detection of Mri-ligand in body fluids.

Приведеннье ниже Примерь! найболее полно раскрьвают данное изобретение. Кроме того, в них отраженьі предпочтительнье вариантьь осуществления изобретения без ограничения его обьема.Example below! this invention is fully disclosed. In addition, they reflect a preferred embodiment of the invention without limiting its scope.

Стандартнье методики для осуществления зкспериментов, описанньїх в примеденньїх ниже Примерах, а таюке подходящие альтернативнье методики, изложень в широко известньхх руководствах по молекулярной биологии, например, Затьгоок еї аї!., МоІесшаг Сіопіпу, Второе издание, Соїа 5ргіпд НагбогStandard techniques for carrying out the experiments described in the accompanying Examples below, and such suitable alternative techniques, are set forth in well-known textbooks on molecular biology, for example, Zatgook ei ai!., MoIesshag Siopipu, Second Edition, Soia 5rgipd Nagbog

І арогаїогу Ргез5(1987) и А!йзиоеї еї аї..(Едв5), Сигтепі Ргоїосої5 іп МоіІесціаг Віоіоду, Сгеепе аззосіаїез/МівєуI arogaiogu Rgez5(1987) and A!yzioei ei ai..(Edv5), Sigtepi Rgoiosoi5 ip MoiIesciag Vioiodu, Sgeepe azzosiaiez/Miveu

Іп(егвсіеєпсе, Мем ХогКк(1990).Ip(egvsieepse, Mem HogKk (1990).

Пример 1. Апластическая плазма собакиExample 1. Aplastic plasma of a dog

Гепаринизированную апластическую плазму собаки( АРКУ") или нормальную плазму собаки("МКО") получали как описано в приведенньїх ниже публикациях, с той разницей, что доза облучения реципиентов составляла 45Орад: 1. Магиг.Е. апа оцін, К. Ехр.Нетайі. 13:1164-1172(1985). 2. Аттіада, М., Боцій, К., Сопеп, 9.І.., апа Магиг, Е.М. Віоса 69:486-492(1987).Heparinized aplastic dog plasma ("ARKU") or normal dog plasma ("MKO") was obtained as described in the following publications, with the difference that the radiation dose of the recipients was 45 Orad: 1. Magig.E. apa otsen, K. Ehr.Netai 13:1164-1172(1985). 2. Attiada, M., Botsii, K., Sopep, 9.I.., apa Magig, E.M. Viosa 69:486-492(1987).

З. Магиг.Е., Вавіїїсо, О., Мемоп, 9.І., Сопеп, У.Ї, Сапапа, С, 5опі, РА, апа Магепагап, А. Віоса 76:1771- 1782(1990).Z. Magig.E., Vaviiiiso, O., Memop, 9.I., Sopep, U.Yi, Sapapa, S, 5opi, RA, apa Magepagap, A. Viosa 76:1771-1782(1990).

Пример 2. Определение мегакариоцитов человекаExample 2. Determination of human megakaryocytes

АРКО и фракционированная АРКО бьли провереньй на способность стимулировать развитие мегакариоцитов человека из СО34ж- клеток-предшественников. СО34ж- клетки получали из клеток периферической крови как описано(Нокот, М.Н,, Спої,Е., Місної, У.І., НогпкКоПпІА, Агакажа.Т, апа Нипі, Р.ARKO and fractionated ARKO were tested for their ability to stimulate the development of human megakaryocytes from CO34-precursor cells. CO34- cells were obtained from peripheral blood cells as described (Nokot, M.N,, Spoi, E., Misnoi, U.I., NogpkKoPpIA, Agakaja.T, apa Nypi, R.

Моїесшіаг Віоюду ої Наєтаїйороїієвіз 3:15-31,1994) и инкубировали в культуральной среде следующего состава: среда Дальбекко в модификации Исков(МОмМ; СІВСО, (агапа Івіапа, МУ) с 195 смеси глютамин- пеннициллин-стрептомицин(Ігиіпе Зсієпіййс, Запіа Апа, СА), 1095 гепаринизированная, свободная от тромбоцитов человеческая плазма АВ. Также добавляли 2-меркаптозтанол(10-4М), пируват(11Омкг/мл), холестерин(7,8мкг/мл), аденозин, гуанин, цитидин, уридин, тимидин, 2-дезоксицитозин, 2-дезоксиаденозин, 2-дезоксигуанозинікаждьй по 1Омкг/мл, бідта); человеческий рекомбинантньй инсулин(1Омкг/мл); человеческий трансферрин(ЗООмкг/мл), соевье липидьц19», Воепіпдег Мапппеїт, Іпаіапароїїв, ІМ); человеческий рекомбинантньй основной фактор роста фибробластов(2нг/мл, Сепгуте, Сатбгідде, МА); человеческий рекомбинантньй зпидермальнькюи ростовой фактор(15нг/мл), ростовой фактор, полученньй из тромбоцитов(1Онг/мл,Атдеп,Іпс, Тпоизапа Оакзв, СА).Moiesshiag Vioyudu oi Najetaiyoroiieviz 3:15-31, 1994) and incubated in the culture medium of the following composition: Dalbecco's medium in Iskov's modification (MOmM; SIVSO, (Agapa Iviapa, MU) with 195 glutamine-penicillin-streptomycin mixture (Igiipe Zsiepiys, Zapia Apa , CA), 1095 heparinized, platelet-free human plasma AB. 2-mercaptostanol (10-4 M), pyruvate (11 Ωkg/ml), cholesterol (7.8 μg/ml), adenosine, guanine, cytidine, uridine, thymidine were also added , 2-deoxycytosine, 2-deoxyadenosine, 2-deoxyguanosine each at 1 Ωkg/ml, bidta); human recombinant insulin (1 Ωkg/ml); human transferrin (ZOOmkg/ml), soybean lipids19", Voepipdeg Mappeit, Ipaiaparoiiv, IM); human recombinant basic fibroblast growth factor (2ng/ml, Sepgute, Satbgidde, MA); human recombinant epidermal growth factor (15ng/ml), growth factor obtained from platelets (1ng/ml, Atdep, Ips, Tpoizapa Oakzv, SA).

СОз34 клетки засевали в концентрации 200000/мл культуральной средь, в конечном обьеме 15мкл в ячейки планшетов Теразаки(Мапдцага, Іпс., Мершпе, МУ). Клетки инкубировали в течение 8 дней во влажной атмосфере с 595 СО» при 372С, затем фиксировали прямо в планшетах 195 глутаровьм альдегидом и инкубировали со смесью моноклональньх антител(апії-СРІБ, апії СРІІБ, (Віо-девідп) и апіїCOz34 cells were seeded at a concentration of 200,000/ml of culture medium, in a final volume of 15 μl in the cells of Terazaki tablets (Maptsaga, Ips., Mershpe, MU). The cells were incubated for 8 days in a humid atmosphere with 595 СО» at 372С, then fixed directly in the plates with 195 glutaraldehyde and incubated with a mixture of monoclonal antibodies (Api-SRIB, Api SRIIB, (Vio-devidp) and Api

СРІБ(Оако, Сагріпіейа, СА). Иммунную реакцию вьявляли при помощи системь! стрептавидин-бета- галактозидаза(НізіоМа!їк, КіЖКедаагй апа Реїту). Мегакариоцить, вьявляеємье в виде синих колоний, подсчитьівали на инвертированном фазовом микроскопе с увеличением 1000х. Результать! представляли в виде среднего числа мегакариоцитов на лунку -/- стандартная ошибка определения(5ЕМ). В некоторьх случаях даннье представляли в "мегакариоцитарньх единицах/мл", при зтом та степень, в которой данньїйй тестируемьй образец индуцировал развитие мегакариоцитов била нормализована относительно использованного в опьіте положительного контроля - АРКУ. Одну единицу определяли как то количество материала, которое приводило к образованию такого же числа мегакариоцитов, что и 1Імкл стандартаSILVER (Oaco, Sagripieya, SA). The immune reaction was detected with the help of systems! streptavidin-beta-galactosidase (NizioMa!ik, KiZhKedaagy apa Reitu). Megakaryocytes, visible as blue colonies, were counted on an inverted phase microscope with a magnification of 1000x. The result! presented as the average number of megakaryocytes per well -/- standard error of determination (5EM). In some cases, data were presented in "megakaryocyte units/ml", and the degree to which this test sample induced the development of megakaryocytes was normalized relative to the positive control used in the experiment - ARKU. One unit was defined as the amount of material that led to the formation of the same number of megakaryocytes as 1 µl of the standard

АРКУ. Активность приписьшвали Мрі-лиганду если она могла бьть блокирована 5-1Омкл/мл МРІ-ARCH. The activity was attributed to MRI-ligand if it could be blocked by 5-1 Ωcl/ml of MRI-

Х(растворимьм Мрі-рецептором).X (soluble Mri-receptor).

Показано, что АРКУ содержит фактор(ь), которьій стимулирует развитие мегакариоцитов человека в данной системе. СОЗ4ж клетки, инкубированньюе с 1095 МКУ в течение 8 дней показали пренебрежимо малое количество окрашенньїх синим мегакариоцитов, тогда как те же клетки, инкубированньсе 8 дней с 1095 АРКУ, дали очень большое число окрашенньх мегакариоцитов.It is shown that ARKU contains factor(s) that stimulate the development of human megakaryocytes in this system. SOZ4h cells incubated with 1095 MKU for 8 days showed a negligible amount of blue-stained megakaryocytes, while the same cells incubated for 8 days with 1095 ARKU gave a very large number of megakaryocytes.

На фиг.2 видно, что возрастающие концентрации Мрі-Х, добавленного к культуральной системе человеческих мегакриоцитов, в возрастающей степени блокируют развитие мегакариоцитов. При концентрациях Мрі-Х больше 5мкг/мл наступает полное подавлениє. В данном опьіте СОЗ4Аж клетки стимулировали 595 АРКУ. Зто указьшаєт на тот факт, что активность, взаймодействующая с Мрі-Figure 2 shows that increasing concentrations of Mri-X, added to the culture system of human megakaryocytes, increasingly block the development of megakaryocytes. At concentrations of Mri-X greater than 5 μg/ml, complete suppression occurs. In this experiment, SOZ4Azh cells stimulated 595 ARKU. This points to the fact that the activity interacting with Mri-

Х(предположительно Мрі-лиганд), необходима для развития мегакариоцитов человека и в АРК9 присутствует собственно Мрі-лиганд.X (presumably Mri-ligand), which is necessary for the development of human megakaryocytes, and the Mri-ligand itself is present in ARK9.

Бьли полученьї и другие подтверждения того, что в АРКУ присутствует активность Мрі-лиганда, необходимого для развития мегакариоцитов человека. АРКУ(1З5мл) разбавили в б раз средой Исков и нанесли на аффинную колонку Мрі-Х. Несвязавшийся материал бьл собран и сконцентрирован до превоначального обьема перед постановкой теста. Связавшийся материал злюировали 1їОмл 1 М масі, 2095 собранного пула подвергли диафильтрации и затем сконцентрировали в 4 раза. СВЗ4Аж клетки,There were other confirmations that the activity of Mri-ligand, which is necessary for the development of human megakaryocytes, is present in ARKU. ARKA (135 ml) was diluted 1-fold with Iskov's medium and applied to the Mri-X affinity column. The unbound material was collected and concentrated to the initial volume before the test. The bound material was dissolved in 10 ml of 1 M mass, 2095 of the collected pool was subjected to diafiltration and then concentrated 4 times. SVZ4Azh cells,

которне инкубировали в среде без добавок АРКО, не дали начала мегакариоцитам. Клетки, инкубированнье с 595 АРКОУ(того же образца, что наносили на колонку) дали 48 -/- 8 мегакариоцитов на ячейку. Клетки, инкубированнье с несвязавшимся материалом(в концентрации 1095) не образовали мегакариоцитов. Клетки, инкубированнье с 1095 злюата, дали счет 120 -/- 44 мегакариоцитов на ячейку.which were incubated in medium without ARKO additives, did not give rise to megakaryocytes. Cells incubated with 595 ARCOU (the same sample that was applied to the column) gave 48 -/- 8 megakaryocytes per cell. Cells incubated with unbound material (at a concentration of 1095) did not form megakaryocytes. Cells incubated with 1095 ml gave a count of 120 -/- 44 megakaryocytes per cell.

Активность в наносимом на колонку образце и активность в злюате практически полностью подавлялись 5мкг/мл Мрі-Х.The activity in the sample applied to the column and the activity in the supernatant were almost completely suppressed by 5 μg/ml Mri-X.

Пример 3. Трансфекция Мрі-рецептора мьіши или человека в меішиную клеточную линиюExample 3. Transfection of a muscle or human MRI receptor into a muscle cell line

А. Мрі-рецептор мьішиA. MRI-receptor of the muscle

Полноразмерная кКДНК Мрі-рецептора мьіши бьіла субклонирована в вектор зкспрессии, содержащий транскрипционньй промотор, полученньй из І ТА вируса саркомь! моішей Молони. 5мкг данного конструкта и Імкг плазмидьі рууІ Мео, несущей селективньій маркер(5ігагїадепе) бьіли ко-злектропорировань! в клеткиThe full-length cDNA of the Mri-receptor of the white mouse was subcloned into an expression vector containing a transcriptional promoter obtained from the ITA sarcoma virus! Moshey Molony. 5 μg of this construct and 1 μg of plasmid ruI Meo, carrying a selective marker (5igagiadepe) were used for co-electroporation! in cells

І/-3-зависимой мьшиной линийи(320О, клон 23; Стеепрегдег еї аі. РМАБб 80: 2931-2936(1983)). Клетки культивировали в течение пяти дней для восстановления после злектропорации, затем переводили на селективную среду, содержащую 800мкг/мл Генетецина((418, Зідта) и нг/мл І/-3. Затем вьіжившие клетки разделяли на два пула по 200000 клеток в каждом и подращивали для анализа. Шесть популяций клеток бьіли провереньї на поверхностную зкспрессию Мрі-рецептора методом проточной цитофлуориметрийи(РАС5) с использованием поликлональной кроличьей антипептидной сьіворотки. Одна из популяций бьіла отобрана для сортировки в протоке с применением той же сьіворотки. Одноклеточнье клоньї исходной клеточной линии бьіли получень! путем подращивания клеток на среде с 1095 АРКУ иI/-3-dependent cell line (320O, clone 23; Steepregdeg et al. RMABb 80: 2931-2936 (1983)). Cells were cultured for five days to recover after electroporation, then transferred to a selective medium containing 800 μg/ml Genethecin ((418, Zidta) and ng/ml I/-3. Then the surviving cells were divided into two pools of 200,000 cells each and were grown for analysis. Six populations of white cells were tested for surface expression of the MRI receptor by flow cytofluorimetry (PAC5) using polyclonal rabbit antipeptide serum. One of the populations was selected for sorting in the duct using the same serum. Single-cell clones of the original cell line were obtained by growing cells on Wednesday from 1095 ARKU and

Генетецином. После селекции в присутствие АРКО в течение 35 дней клетки поддерживали культивированием в присутствиеи нг/мл мьішиного 1-3. Один из субклонов, 1А6.1, бьіл использован для вьіполнения основной работь!.Genethecinoma. After selection in the presence of ARKO for 35 days, the cells were maintained by cultivation in the presence of ng/ml of mucin 1-3. One of the subclones, 1A6.1, was used to perform the main work.

В. Мрі-рецептор человекаV. Human MR receptor

Полноразмернье последовательности Мрі-рецептора человека(Мідоп.І., еї аі. РМАБ 89: 5640 - 5644(1992)) били субклонировань! в вектор зкспрессии, содержащий транскрипционньій промотор вируса саркомьї мьшей Молони(тот же вектор, что и в случае мьшиного рецептора). Шесть мкг данного конструкта и бмкг амфотропного ретровирусного упаковочного конструкта(Іапаац, М.А., ІП Штап.О.В.,The full-length sequence of the human MRI receptor (Midop.I., ei ai. RMAB 89: 5640 - 5644(1992)) was subcloned! in the expression vector containing the transcriptional promoter of Molony's moose sarcoma virus (the same vector as in the moose receptor). Six μg of this construct and 1 μg of an amphotropic retroviral packaging construct (Iapaats, M.A., IP Shtap.O.V.,

У.Мігоїюду 66: 5110-5113(1992)) бьіли трансфецировань в три миллиона клеток 293 с использованием набора для трансфекции клеток млекопитающих на основе СаРО4(Зігаїадепе). Те же клетки бьли ретрансфецированьії после 2 дней культивирования и еще раз ретрансфецировань! спустя 4 дня. Через день после последней трансфекции клетки 293 кокультивировали с клетками 1І-3-зависимой мьішиной линий(320, клон 23; Сгеепрегдег еї а РМАБЗ 80: 2831-2936(1983)). После 24 часов кокультивации клетки 320 отделяли и фракционировали в градиенте В5А(Раїн-о-суїє; Міієз Іпс.). Затем клетки подращивали в присутствии Інг/мл мьішиного ІЇ-3 и отбирали на способность расти в пристутствие 2095 АРКУ. Клетки сортировали проточной цитофлуориметрией(ЕАС5) на поверхностную зкспрессию рецептора с помощью поликлональной кроличьей антипептидной сьіворотки. Именно зти клетки далее использовали в опиьтах.U. Migoiyudu 66: 5110-5113 (1992)) transfected three million 293 cells using a kit for transfection of mammalian cells based on CaPO4 (Zigaiadepe). The same cells were retransfected after 2 days of cultivation and retransfected again! after 4 days. One day after the last transfection, 293 cells were cocultivated with cells of 1I-3-dependent myshinoi liny (320, clone 23; Sgeepregdeg ei a RMABZ 80: 2831-2936 (1983)). After 24 hours of cocultivation, 320 cells were separated and fractionated in a B5A gradient (Rain-o-Suiet; Mies Ips.). Then the cells were grown in the presence of ng/ml of muscle II-3 and selected for their ability to grow in the presence of 2095 ARKU. Cells were sorted by flow cytofluorimetry (EAS5) for receptor surface expression using polyclonal rabbit antipeptide serum. It was these cells that were further used in the experiments.

Пример 4. Определение Мрі-лиганда при помощи клеток 1Аб.1Example 4. Determination of Mri-ligand using cells 1Ab.1

Клетки 1Аб.1 отмьшвали от присутствующего в среде І/-3 и засевали(1О0Оклеток/15мкл конечного обьема/ячейку) в планшеть Теразаки в среде альфа-МЕМ(Ссірсо) с 1095 змбриональной телячьей сьтіворотки(ЕС5), Генетецином(8О00Омкг/мл), 196 пенициллином-стрептомицином(аірсо) в 17 последовательньх разведениях тестируемьїх образцов. После 48 часов культивирования микроскопически определяли количество жизнеспособньїх клеток на ячейку. За единицу активности принимали такую активность, которая приводила к обнаружению 200 жизнеспособньх клеток на ячейку. Активность приписьівалась Мрі-лиганду, если она полностью подавлялась включением в определение 5-10мкг/мл Мрі-1Ab.1 cells were removed from the I/-3 present in the medium and seeded (1O0Ocells/15μl final volume/cell) in a Terazaki plate in alpha-MEM (Sirso) medium with 1095 embryonic calf serum (ES5), Genethecin (8O00Omkg/ml) , 196 with penicillin-streptomycin (airso) in 17 successive dilutions of the tested samples. After 48 hours of cultivation, the number of viable cells per cell was determined microscopically. The activity that led to the detection of 200 viable cells per cell was taken as a unit of activity. The activity was attributed to the Mri-ligand, if it was completely suppressed by the inclusion in the determination of 5-10 μg/ml of Mri-

Х. Активность Мрі-лиганда в усредненньїх единицах АРКУ составляла 4400 -/- 539 единиц/мл апластической плазмь. Если не указано специально, единицьі активности Мрі-лиганда определяли в опьтах с использованием клеток 1Аб.1.H. The activity of Mri-ligand in average ARKU units was 4400 -/- 539 units/ml of aplastic plasma. If not specifically indicated, the unit activity of Mri-ligand was determined in batches using 1Ab.1 cells.

Определения с клетками, трансфицированньми геном Мрі-рецептора человека(Пример ЗВ), проводили точно также, как и с клетками 1ТАб.1.Determinations with cells transfected with the human Mri receptor gene (Example 3B) were carried out exactly the same as with cells 1TAb.1.

Пример 5. Мрі-лиганд присутствует в апластической плазме или сьіворотке мьіши, собаки, свиньи и человекаExample 5. Mri-ligand is present in aplastic plasma or serum of mice, dogs, pigs, and humans

Мрі-лиганд присутствует в апластической плазме или сьворотке мьши, собаки, свиньи и человека(Таблица 2). Плазму собирали у мьиішей ВОРЕ1 до облучения и спустя 12 дней после облучения дозой 500рад. Плазму проверяли в тесте на клетках 1Аб6.1, и била обнаружена активность 200б0единиц/мл, которая практически полностью ингибировалась Мрі-Х(10мкг/мл). Плазма облученньїх мьішей бьіла также положительна в тесте на мегакариоцитах человека и ее активность составляла 183Зед/мл. У собак плазму собирали до облучения и 10 дней спустя после облучения в дозе 45б0рад. Плазму проверяли в тесте на клетках 1А6.1 и в тесте на мегарикариоцитах человека. В обоих определениях бьла обнаружена активность, которая полностью ингибировалась Мрі-Х(1Омкг/мл). У свиней плазму собирали до облучения и через 10 дней после облучения(б5Орад). Плазму проверяли в тесте на клетках 1Аб.1 и тесте на мегакариоцитах человека. В обоих определениях обнаружена активность лиганда(подавляемая Мрі-Х в концентрации 1Омкг/мл), сравнимая с таковой, обнаруживаемой в апластической плазме собаки. Бьіли также получень! сьіворотки от апластических пациентов. Зтот материал получали от больньїх, перенесших трансплантацию костного мозга. Сьіворотки шести пациентов бьіли провереньї! в тесте на клетках 1А6.1 и обнаружена активность 90Зед/мл, 8895 которой бьіло обусловлено Мрі-лигандом(подавлялась 1Омкг/млMri-ligand is present in aplastic plasma or serum of mice, dogs, pigs, and humans (Table 2). Plasma was collected from VORE1 mice before irradiation and 12 days after irradiation with a dose of 500 rad. Plasma was tested in a test on 1Ab6.1 cells, and an activity of 200 b0 units/ml was detected, which was almost completely inhibited by Mri-X (10 μg/ml). The plasma of the irradiated mice was also positive in the test on human megakaryocytes and its activity was 183Zed/ml. In dogs, plasma was collected before irradiation and 10 days later after irradiation at a dose of 45 b0 rad. Plasma was tested in the test on 1A6.1 cells and in the test on human megakaryocytes. In both determinations, activity was detected, which was completely inhibited by Mri-X (1 Ωkg/ml). In pigs, plasma was collected before irradiation and 10 days after irradiation (b5Orad). Plasma was tested in the test on 1Ab.1 cells and the test on human megakaryocytes. In both determinations, the activity of the ligand (suppressed by Mri-X at a concentration of 1 Ωkg/ml) was found, comparable to that found in the aplastic plasma of a dog. White also received! sera from aplastic patients. This material was obtained from patients who underwent bone marrow transplantation. The sera of six patients passed the tests! in the test on 1A6.1 cells, an activity of 90Zed/ml was detected, 8895 of which was caused by Mri-ligand (it was suppressed by 1Omkg/ml

Мрі-Х). Сьіворотки 14 пластических пациентов бьіли также проверень; в тесте на мегакариоцитах человека.Mri-X). The sera of 14 plastic patients were also tested; in the test on human megakaryocytes.

В целом, они показали существенную активность, 941ед/мл, которая полностью подавлялась 1Омкг/млOverall, they showed significant activity, 941 units/ml, which was completely inhibited by 1 Ωkg/ml

Мрі-Х. Даннье, полученнье с применением мьішиного ІІ/-3, включеньі, чтобьї показать специфичность теста на клетках 1Аб6.1. Хотя зтот рекомбинантньїй цитокин индуцирует рост данной клеточной линии, его активность не блокируется 10мкг/мл Мрі-Х.Mri-H. The data obtained using muscle II/-3 are included to show the specificity of the test on 1Ab6.1 cells. Although this recombinant cytokine induces the growth of this cell line, its activity is not blocked by 10 μg/ml Mri-X.

Таблица 2 единиц/млTable 2 units/ml

Вид | Среда, // | яМріїХ | Среда. | 9 - «МріХ оо Мьшь апласт. | 2000.7..Й.НиКЇ 07 | ..юрюжмрмВ33 | о нетданньхType | Wednesday, // | yaMriiH | Wednesday | 9 - "MriH oo Msh aplast. | 2000.7..Y.NiKY 07 | ..yuryuzhmrmV33 | about net data

Пример 6. Мрі-лиганд стимулирует рост клеток 1А6.1 и развитие мегакариоцитов человекаExample 6. Mri-ligand stimulates the growth of 1А6.1 cells and the development of human megakaryocytes

Мрі-лиганд(обогащенньй по меньшей мере в 100000 раз после хромтографии на лектине и аффинной хроматографии; см.Пример 7) стимулирует рост клеток 1Аб.1 и развитие мегакариоцитов человека из 34-- клеток периферической крови в зависимости от дозьі. Активность обусловлена именно Мрі-лигандом, поскольку, как показано на фиг.2 и 3, зта активность в обоих определениях может бьть полностью блокирована Мрі-Х.Mri-ligand (enriched at least 100,000 times after lectin chromatography and affinity chromatography; see Example 7) stimulates the growth of 1Ab.1 cells and the development of human megakaryocytes from 34 peripheral blood cells, depending on the dose. The activity is caused precisely by the Mri-ligand, since, as shown in Fig. 2 and 3, this activity in both definitions can be completely blocked by Mri-X.

Заявителями бьло таюже показано, что фракционированнье при помощи проточной цитофлуориметрий(ЕАС5) 34- клетки периферической крови при инкубирований с Мрі-лигандом(в данном случає - 100бед/мл в течение 9 дней) развиваются в фенотипически нормальньсе, зрелье мегакариоцить!.The applicants also showed that fractionation using flow cytofluorimetry (EAS5) of 34 peripheral blood cells when incubated with Mri-ligand (in this case - 100bed/ml for 9 days) develop into phenotypically normal, mature megakaryocytes!.

Таким образом показано, что очищенньій Мрі-лиганд оказьіваєет тот же самьійй зффект на мегакариоцить,, что и неочищенная АРКУ. Кроме того, в данном зксперименте использовали очищеннье СО34-- клетки(10095 СОЗ34 5), а не обогащенньє, в которьїх доля СОЗ34-- клеток обьічно составляет 30- 5095.Thus, it is shown that purified Mri-ligand has the same effect on megakaryocytes as unpurified ARKU. In addition, in this experiment, purification of CO34 cells (10095 SOZ34 5) was used, and not enrichment, in which the proportion of SOZ34 cells is generally 30-5095.

Пример 7. Очистка Мрі-лиганда собакиExample 7. Purification of dog Mri-ligand

Ї. РезюмеY. Summary

Бьли очещеньї белки(25кД и З1КкД), которне проявляли активность, приписьваемую лиганду Мрі- рецептора. Белки вьіделенььй из плазмьй облученньїх собак по схеме, включающей аффинную хроматографию на агглютинине зародьшей пшениць(уУУсА), аффинную хроматографию на Мрі- рецепторе, анионобменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и С4 НРІС с обращенной фазой. См. фиг.46 на котором представлена данная схема очистки.There were purified proteins (25kD and 31kD) that showed activity attributed to the Mri receptor ligand. Proteins were isolated from the plasma of irradiated dogs according to a scheme that included affinity chromatography on wheat germ agglutinin (uUUsA), affinity chromatography on the Mri receptor, anion exchange chromatography, gel filtration chromatography and C4 HRIS with the reversed phase. See Fig. 46, which shows this cleaning scheme.

Мрі-лигандьї с молекулярной массой 25кД и ЗІ1кД бьіли очищень по существу до гомогенности и бьло показано, что они состоят из аминокислотньїх последовательностей, описанньїх в настоящем изобретении.Mri-ligands with a molecular weight of 25kD and 31kD were purified to essentially homogeneity and were shown to consist of the amino acid sequences described in the present invention.

ІЇ. Методь!II. Method!

А. Осветлениє плазмь!A. Illuminated plasma!

Замороженную плазму(всего около 20 литров), полученную от облученньїх собак(ісм. Пример 1), оттайвали в течение ночи при 4"С; оттаивание плазмьій в больших бутьлях проводили при комнатной температуре в течение нескольких часов, а затем - в холодной комнате. Нерастворимьй материал удаляли центрифугированием в течение 6 часов при 110009. Плазму разводили фосфатньім буферньм раствором, рН 7,3, содержащим 0,0195 азида натрия(РВ5/азид), и фильтровали через 1,2мкм фильтр.Frozen plasma (about 20 liters in total) obtained from irradiated dogs (see Example 1) was thawed overnight at 4"C; thawing of plasma in large bottles was carried out at room temperature for several hours, and then in a cold room. The insoluble material was removed by centrifugation for 6 hours at 110,009. The plasma was diluted with a phosphate buffer solution, pH 7.3, containing 0.0195 sodium azide (PB5/azide), and filtered through a 1.2 μm filter.

Процедура осветления обьічно приводила к двукратному разведению исходного материала.The clarification procedure casually led to a two-fold dilution of the starting material.

Б. Аффинная хроматография на агглютинине зародьсшей пшениць!B. Affinity chromatography on wheat germ agglutinin!

Все операции проводили при 4"С. Осветленную плазму(две партии) наносили на колонку с иммобилизованньм агглютинином зародьшей пшениць(і литр, 10 хх 12см, ЕМ Іарогаюгієв), уравновешенную РВб/азидом. После нанесения образца несвязавшийся материал смьвали с колонкиAll operations were carried out at 4"C. Illuminated plasma (two batches) was applied to a column immobilized with wheat germ agglutinin (1 liter, 10 x 12 cm, EM Iarogayugiev), equilibrated with RBb/azide. After applying the sample, the unbound material was washed off the column

РВ5Б/азидом и колонку промьівали 0,5 М Масі в 20мм ТіиізНеЇї, рН 8. Активность Мрі-лиганда, связавшуюся с М/СА-колонкой, злюировали 0,35 М М-ацетилглюкозамином(СсісМАс), 0,5 М Масі, 20мм Ттів-НСЇІ, рН 8.РВ5B/azide and the column was washed with 0.5 M M Mass in 20 mm Triazine, pH 8. The activity of the Mri-ligand bound to the M/CA column was eluted with 0.35 M M-acetylglucosamine (ScisMAs), 0.5 M M Mass, 20 mm Ttiv-NSII, pH 8.

Активности Мрі-лиганда не бьіло обнаружено в проточньїх или промьівочньїх фракциях.Mri-ligand activity was not detected in the flow-through or washing fractions.

В. Аффинная хроматография на Мрі-Х рецептореV. Affinity chromatography on the Mri-X receptor

Использованньй растворимьй МЬІШИНЬЙ Мрі-рецептор(Мрі-Х) соответствовал целому зкстраклеточному домену Мрі-рецептора минус Тгр в положенийи 483(СМ.Мідоп, еї а!., 8: 2607-2615(1993)).The soluble MUSCLE Mri-receptor (Mri-X) used corresponded to the entire extracellular domain of the Mri-receptor minus Tgr at position 483 (SM. Midop, ei a!., 8: 2607-2615 (1993)).

Для оптимизации связьявания Мрі-лиганда с Мрі-Х рецептором на аффинной колонке, злюированньй сTo optimize the binding of the Mri-ligand to the Mri-X receptor on an affinity column equipped with

М/СА-колонки материал концентрировали с использованием мембранного ультрафильтра(порог отсечения по молекулярному весу 10000, УМ-10, Атісоп) и концентрацию МасСі доводили до 0,2 М последующим разведением. Концентрированньйй материал с М/сА-колонки наносили на 20-миллилитровую колонку с т-M/CA-column material was concentrated using a membrane ultrafilter (cut-off threshold for molecular weight 10,000, UM-10, Artichoke) and the concentration of MacSi was brought to 0.2 M by subsequent dilution. The concentrated material from the M/sA-column was applied to a 20-milliliter column with t-

Мрі-Х(растворимьй мьішиньй Мрі-Х рецептор)у/уцианбромид-активированная Сефароза(2,6 х 4,2см, 1,5мг т-Мрі-Х на мл смоль) при скорости потока 0,Умл/мин. Колонку промьшали РВб/азидом при скорости потока 1,5мл/мин, а затем вьісокосолевьім буфером(405мл), состоящим из 10мм Ттів-НСЇ, 1 М Масі, 1їммMri-X (soluble muscle Mri-X receptor) in/cyanobromide-activated Sepharose (2.6 x 4.2 cm, 1.5 mg t-Mri-X per ml of resin) at a flow rate of 0.Uml/min. The column was washed with RVb/azide at a flow rate of 1.5 ml/min, and then with a high-salt buffer (405 ml) consisting of 10 mm Ttiv-NSI, 1 M Masi, 1 mm

СНАРБ, рН 8,0. Связавшийся Мрі-лиганд злюировали с колонки буфером следующего состава: 20ммSNARB, pH 8.0. The bound Mri-ligand was eluted from the column with a buffer of the following composition: 20 mm

САРБ, 1 М Масі, 5мм СНАРБ, рН 10,5. Собирали соответствующие фракции. Для нейтрализации рН к каждой фракции добавляли Тіз. 5О5-РАСЕ и поглощение при 280нм показали наличие в профиле злюции с аффинной колонки с Мрі-Х рецептором раннего белкового пика во фракциях 1-4, при том что основная активность Мрі-лиганда злюировала после фракции 5.SARB, 1 M Masi, 5 mm SNARB, pH 10.5. The relevant factions were assembled. To neutralize the pH, Tiz was added to each fraction. 5O5-RACE and absorption at 280 nm showed the presence of an early protein peak in fractions 1-4 in the fusion profile of an affinity column with the Mri-X receptor, while the main activity of the Mri-ligand decreased after fraction 5.

Г. Мопо-О-анионобменная хроматографияH. Mopo-O-anion exchange chromatography

Найиболее очищеннье фракции с нескольких аффинньїх колонок с Мрі-Х рецептором обьединяли, концентрировали и диализовали против 20мм Ттіз-НСІ, Змм СНАРБ, рН 8,7 до конечного обьема 58,5мл.The most purified fraction from several affinity columns with Mri-X receptor was combined, concentrated and dialyzed against 20 mm Ttiz-HCI, Zmm SNARB, pH 8.7 to a final volume of 58.5 ml.

Концентрацию белка в смеси ооценивали по опоглощению при 280нм и она составляла 0, 12мг/мл(приблизительно 7мг общего белка). Смесь наносили при скорости потока 0,5мл/мин на колонкуThe protein concentration in the mixture was estimated by absorbance at 280 nm and it was 0.12 mg/ml (approximately 7 mg of total protein). The mixture was applied to the column at a flow rate of 0.5 ml/min

Мопо-0О НА 5/5(Рнаптасіа), уравновешенную 20мм Ттіз-НСІ, 5мм СНАРБ, рН 8,7. Злюцию проводили линейньмм градентом до 0,36 М МасСі в том же буфере в течение 27 минут. Затем колонку в течение 6 минут промьівали градиентом до 0,54 т Масі и окончательную промьївку проводили 0,9 М Масі. Собирали фракции по ІТмл.Mopo-0O NA 5/5 (Rnaptasia), balanced with 20 mm Ttiz-NSI, 5 mm SNARB, pH 8.7. Elution was carried out with a linear gradient to 0.36 M Massi in the same buffer for 27 minutes. Then the column was washed with a gradient to 0.54 t Massi for 6 minutes and the final washing was carried out with 0.9 M Massi. Collected fractions on ITml.

Профиль злюции с колонки Мопо-О показал, что в проточньїх и промьівочньїх фракциях не содержитсяThe profile of the leachate from the Mopo-O column showed that the flow-through and washout fractions do not contain

Мрі-лиганда и вообще сколько-нибудь значительного количества белка. Значительная активность Мрі- лиганда злюировалась во фракциях 5-7 на начальньх зтапах градиента МасСі. "Плечо" активности наблюдалось во фракциях 8-10, за которьіми следовал главньй пик, представленньій фракциями 11-15. В активньїх фракциях имелась явная полоса 25кД(по 505-РАСЕ в невосстанавливающих условиях).Mri-ligand and generally any significant amount of protein. Significant activity of Mriligand was observed in fractions 5-7 at the initial stages of the MaSi gradient. A "shoulder" of activity was observed in fractions 8-10, which was followed by the main peak represented by fractions 11-15. In the active fractions there was a clear band of 25 kD (according to 505-RACE in non-reducing conditions).

Интенсивность полосьі прямо соответствовала активности Мрі-лиганда во фракциях. Зта полоса отсутствовала во фракциях З и 4(нет активности). Она бьіла вьуражена во фракциях 5 и б(пик активности в тестах на клетках 1А6.1) и аналогично, интенсивно окрашиваємая полоса присутствовала во фракциях 11- 14(пик активности в тестах на клетках 1А6.1). Полоса бьіла слабой в обьединенньїх фракциях 15 и 16, что соответствовало значительно более низкой активности фракции 16.The intensity of the band directly corresponded to the activity of Mri-ligand in the fractions. This band was absent in fractions Z and 4 (no activity). It was whitely affected in fractions 5 and b (peak activity in tests on cells 1A6.1) and similarly, an intensively stained band was present in fractions 11-14 (peak activity in tests on cells 1A6.1). The white band was weak in the combined fractions 15 and 16, which corresponded to the significantly lower activity of fraction 16.

Д. Опьїть! по злюции из геляD. Get drunk! after anger from the gel

Опьїть! по злюции из геля бьіли проведень! с аликвотами фракций Мопо ОО 5 и 6 или 13 и 14. В зтих зкспериментах бьіли приготовлень! смеси фракций 5 и б(по бмкл каждой) или 13 и 14(по 7,5мкл каждой), смешань с буфером для нанесения образцов на 505-РАСЕ и нанесень на 1295 505-гели. По завершений злектрофореза, представляющие интерес полось(імм) вьрезали и разрезали на маленькие кусочки бритвенньм лезвием. Кусочки геля переносили в 1,5мл центрифужньюе пробирки, содержащие 0,5млGet drunk! after slyutsii from the gel, they were beaten! with aliquots of Mopo OO fractions 5 and 6 or 13 and 14. In those experiments, preparations were made! mixtures of fractions 5 and b (bmcl each) or 13 and 14 (7.5 μl each), mixtures with buffer for application of samples to 505-RACE and application to 1295 505-gels. Upon completion of electrophoresis, bands of interest (imm) were incised and cut into small pieces with a razor blade. Pieces of the gel were transferred to a 1.5 ml centrifuge tube containing 0.5 ml

РВБ/5Хмм СНАРБ5 и осторожно перемешивали при 4"С в течение ночи. На следующий день пробь центрифугировали, отбирали аликвотьї, и пробьї подвергали диафильтрации против средь Искова с добавлением В5А в качестве белка-носителя. Диафильтрованнье пробьї служили для дальнейших определений.RVB/5Hmm SNARB5 and gently mixed at 4"C overnight. The next day, the samples were centrifuged, aliquots were taken, and the samples were subjected to diafiltration against Iskov's medium with the addition of B5A as a carrier protein. The diafiltration samples were used for further determinations.

Результать! показьявают наличие двух пиков активности Мрі-лиганда. Один пик соответствует области геля 25КД, а другой пик активности Мрі-лиганда соответствует области ЗікдД.The result! show the presence of two peaks of Mri-ligand activity. One peak corresponds to the region of the 25KD gel, and the second peak of Mri-ligand activity corresponds to the region of ZikdD.

Е. Гель-фФильтрация на Зирегаєх 200E. Gel-fFiltration on Zyregai 200

Фракции 13-16 с анионобменной колонки Мопо 0) и две озквивалентнье фракции второго фракционирования на Мопо 0) ообьединяли и концентрировали с применением мембранного ультрафильтра(Сепійсоп-10, Атісоп). Додецил-сульфат о натрия 505) добавляли до конечной концентрации 0,195 и образец наносили на колонку Бирегдех 200 НА 10/30(Рпаптасіа). Колонку уравновешивали 50мМтТііз, 0,195 505, рН 7,5 при скорости потока 0,Змл/мин и комнатной температуре.Fractions 13-16 from the anion exchange column Mopo 0) and two equivalent fractions of the second fractionation on Mopo 0) were combined and concentrated using a membrane ultrafilter (Sepiysop-10, Artichoke). Sodium dodecyl sulfate 505) was added to a final concentration of 0.195 and the sample was applied to a column Byregdeh 200 NA 10/30 (Rpaptasia). The column was equilibrated with 50 mM Ti3, 0.195 505, pH 7.5 at a flow rate of 0.3 mL/min and room temperature.

Фракции собирали каждую минуту. Большая часть содержащегося в образце белка злюировала во фракциях 32-40, тогда как активность Мрі-лиганда обнаруживалась во фракциях 42-46. Анализ фракций методом 505-РАСЕ показал наличие явной полось 25кД в активньїх фракциях.Fractions were collected every minute. Most of the protein contained in the sample was precipitated in fractions 32-40, while the activity of Mri-ligand was detected in fractions 42-46. The analysis of fractions by the 505-RACE method showed the presence of a clear band of 25 kD in the active fractions.

Ж. С4 хроматография вьсокого разрешения с обращенной фазойZh. C4 high-resolution reversed-phase chromatography

Фракции 43-46 с колонки Зирегдех 200 обьединяли с фракцией 42 и концентрировали с помощью мембранного ультрафильтра(Місгосоп, Атісоп). Концентрированную смесь наносили на 1 х 100мм С4 колонку с обращенной фазой(ЗупСпгораск АР-4). Колонку уравновешивали раствором 0,0495 ТЕА в воде(буфер А); буфер В имел следующий состав: 003595 ТЕА в 8095 ацетонитриле. После нанесения образца проводили линейньйй градиент буфера В до 4595 в течение 4 минут. Затем следовал линеньй градиент до 7595 буфера В в течение 40 минут. Скорость потока устанавливали 75мкл/мин. Результать! очистки фракции 42 представлень на фиг.5. Явнье пики активности Мрі-лиганда наблюдались во фракциях 21-23. Зти фракции анализировали злектрофорезом в 14906-ном геле полиакриламида в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Фракция 21 состояла из единственной полосьFractions 43-46 from the Zyregdeh 200 column were combined with fraction 42 and concentrated using a membrane ultrafilter (Misgosop, Artichoke). The concentrated mixture was applied to a 1 x 100 mm C4 reversed-phase column (ZupSpgorask AR-4). The column was equilibrated with a solution of 0.0495 TEA in water (buffer A); buffer B had the following composition: 003595 TEA in 8095 acetonitrile. After applying the sample, a linear gradient of buffer B up to 4595 was performed for 4 minutes. This was followed by a gradient to 7595 buffer B for 40 minutes. The flow rate was set at 75 μl/min. The result! cleaning fraction 42 is shown in Fig.5. Clear peaks of Mri-ligand activity were observed in fractions 21-23. These fractions were analyzed by electrophoresis in a 14906 polyacrylamide gel under reducing and non-reducing conditions. Faction 21 consisted of a single band

З1кД; фракция 23 состояла из единственной широкой полосьі 25кД; и фракция 22 содержала обе полось - 2Бкд и З1кД. Других значительньх полос видно не бьло. Примечательно, что предварительнье зксперименть! по злюции из геля дали основания ассоциировать активность Мрі-лиганда именно к зтим двум областям молекулярного веса. Единственная вьісокомолекулярная минорная полоса наблюдалась во всех фракциях в невосстанавливающих гелях, но ее не удавалось обнаружить в восстанавливающих гелях. 3. Анализ М-терминальньїх последовательностей 25кД и ЗЇкД Мрі-лигандовZ1kD; fraction 23 consisted of a single broad band of 25 kD; and fraction 22 contained both bands - 2Bkd and Z1kD. No other significant bands were visible. It is noteworthy that this is a preliminary experiment! according to the fusion from the gel, it was possible to associate the activity of Mri-ligand precisely with these two regions of molecular weight. A single high molecular weight minor band was observed in all fractions in nonreducing gels, but it could not be detected in reducing gels. 3. Analysis of the M-terminal sequences of 25 kD and ZYkD Mri-ligands

Анализ М-терминальной последовательности бьіл вьіполнен на содержащих активность фракциях С4Analysis of the M-terminal sequence of the protein was carried out on fractions C4 containing activity

АВАР-НРІ С. Установленнье последовательности данньїх белков приведень!ї вьіше. В дополнение к главной последовательности, соответствующей полосе 25кД(по меньшей мере 9095 используемого образца), секвенирование обнаружило две минорнье последовательности(которье бьли ассоциировань! с минорной дополнительной полосой, описанной ранее в разделе "3". Сравнение с известньми последовательностями показало, что минорнье последовательности представляют собой тяжелую цепь и каппа-цепь иммуноглобулинов собаки. При необходимости зти минорньсе загрязнения могут бьіть удалень дополнительньїм зтапом очистки, предпочтительно, дополнительной гель-фильтрацией.AVAR-NRI S. Establishing the sequence of the above proteins. In addition to the main sequence corresponding to the 25 kD band (at least 9095 of the sample used), sequencing revealed two minor sequences (which were associated with the minor additional band described earlier in section "3". Comparison with known sequences showed that the minor sequences represent heavy chain and kappa chain of dog immunoglobulins.

И. Сравнение активности Мрі-лиганда из очищенньїх фракций С4I. Comparison of Mri-ligand activity from purified C4 fractions

Данньсє, представленньсєе на фиг.б, показьітвают, что активности, присутствующие во фракциях 22 и 23 хроматографии С4 АР-НРІ С, по существую зквивалентнь!. Фракция 22 содержит смесь полос 25кДи ЗікдД, а фракция 23 -только полосу 25кД. Аликвотьї каждой фракции разводили 1:45000. Разведенньюе фракции практически в равной степени стимулировали рост клеток 1Аб.1(фракция 22 - 5400 клеток на ячейку, фракция 23 - 6000 клеток на ячейку). Разведеннье фракции инкубировали с возрастающими концентрациями Мрі-Х. Фракции бьли в равной степени чувствительнь! к ингибированию Мрі-Х, активность обоих фракций полностью блокировалась Мрі-Х в концентрации 7-1 4мкг/мл. Зто служит указанием на то, что активньій белок(белки) каждой фракции - зто разновидности Мрі-лиганда с одинаковой биологической активностью.These, presented in fig.b, show that the activities present in fractions 22 and 23 of C4 AR-NRI C chromatography are essentially equivalent. Fraction 22 contains a mixture of bands of 25 kD ZykD, and fraction 23 contains only the band 25 kD. Aliquots of each fraction were diluted 1:45,000. Diluted fractions stimulated the growth of 1Ab.1 cells almost equally (fraction 22 - 5400 cells per cell, fraction 23 - 6000 cells per cell). Diluted fractions were incubated with increasing concentrations of Mri-X. Fractions were equally sensitive! to the inhibition of Mri-X, the activity of both fractions was completely blocked by Mri-X at a concentration of 7-1 4μg/ml. This serves as an indication that the active protein(s) of each fraction are varieties of Mri-ligand with the same biological activity.

Пример 8. Сравнение действия Мрі-лиганда на развитие мегакариоцитов с действием других факторовExample 8. Comparison of the action of Mri-ligand on the development of megakaryocytes with the action of other factors

Показано, что ряд рекомбинантньїх факторов и органических соединений, таких как форбол-миристил- ацетат(РМА), оказьівают влияние на рост и развитие мегакариоцитов. Изучали воздействие зтих факторов на СОЗ4-положительньюе клетки периферической крови. Рекомбинантньй интерлейкин З человека! -3, 1Тнг/мл), фактор роста стволовьх клеток(5СЕ, 5онг/мл), Интерлейкин 6(ІІ-6, 25нг/мл), зритропозтин(ЕРО,It has been shown that a number of recombinant factors and organic compounds, such as phorbol-myristyl-acetate (PMA), have an effect on the growth and development of megakaryocytes. The effect of these factors on SOC4-positive cells of peripheral blood was studied. Recombinant interleukin From a human! -3, 1Tng/ml), stem cell growth factor (5SE, 5ng/ml), Interleukin 6 (II-6, 25ng/ml), erythropoietin (ERO,

Тед/мл), фактор ингибирования /лейкоза(ПІЕ, 1Т1Онг/мл) и гранолоцитарно-факрофагальньй колониестимулирующий фактор(амМ-С5Е, 25Бнг/ мл, Атодепіпс.); интерлейкин 11(11/-11, 25нг/мл, АЮTed/ml), factor of inhibition / leukemia (PIE, 1T1Ong/ml) and granulocyte-phagophagic colony-stimulating factor (amM-C5E, 25Bng/ml, Atodepips.); interleukin 11(11/-11, 25ng/ml, AYU

Зувіетв5, тіппеароїїз, ММ); форбол-миристил-ацатат(РМА, 1079 М, бідта) добавляли к культурам как указано. Мрі-лиганд использовали в концентрации 275 единиц на мл, АРКУ использовали в концентрацииZuvietv5, tippearoyiz, MM); phorbol-myristyl-acetate (RMA, 1079 M, bidta) was added to the cultures as indicated. Mri-ligand was used at a concentration of 275 units per ml, ARKU was used at a concentration of

Бовб(зквивалент 220единиц/мл). При использованиий факторов в комбинации их концентрация бьіла равна таковой при индивидуальном использованиий. После 8 дней культивирования клетки фиксировали в ячейках и окрашивали на мегакариоцить(п-6б ячеек на каждьй вариант) или подсчитья вали общее число клеток(п-З3 ячеек на каждьй вариант). Даннье представлень! средним числом --/- стандартная ошибка.Beans (equivalent to 220 units/ml). When using the factors in combination, their concentration was equal to that when used individually. After 8 days of cultivation, cells were fixed in cells and stained for megakaryocytes (n-6b cells for each variant) or the total number of cells was counted (n-3 cells for each variant). Data submissions! average number -/- standard error.

На фиг.7 показано, что АРКУ и Мрі-лиганд приводили к образованию наийбольшего числа мегакариоцитов на ячейку. ІЇ-3 также приводил к развитию мегакариоцитов, особенно в сочетании с 5СЕFigure 7 shows that ARKU and Mri-ligand led to the formation of the largest number of megakaryocytes per cell. II-3 also led to the development of megakaryocytes, especially in combination with 5CE

І/-6, 1-11 или ЕРО оказьіввали незначительньійй зффект на количество образовьтувавшихся мегакариоцитов при индивидуальном воздействий или в сочетании с ІІ -3. РМА, ГІЕ и Ї4М-С5Е имели слабое воздействие.I/-6, 1-11 or ERO had a minor effect on the number of megakaryocytes formed when exposed individually or in combination with II-3. RMA, HIE and Y4M-C5E had a weak effect.

На фиг.8 приведеньй даннье того же зксперимента, показьвающие ообщее число клеток в ячейках("клеточность"). АРКО и Мрі-лиганд слабо изменяли зтот показатель, а ІІ-- и 5СЕ проявляли умеренное воздействие. Сочетание 5СЕ и ІІ -3 оказьівало самьй сильньій зффект. Даннье, приведенньєе на фиг.7 и фиг.8, бьіли использовань! для вьічисления процента мегакариоцитов на ячейку, как показано на фиг.9. Очевидно, что фактором, приводящим к образованию самого вьісокого процента мегакариоцитов на ячейку, является Мрі-лиганд, активньій компонент АРКУ. Зто указьввает на специфичность Мрі-лиганда по отношению к мегакариоцитам.Figure 8 shows the data of the same experiment, showing the total number of cells in cells ("cellularity"). ARKO and Mri-ligand slightly changed this indicator, while II and 5CE showed a moderate effect. The combination of 5SE and II-3 had the strongest effect. The data shown in Fig. 7 and Fig. 8 were used! to calculate the percentage of megakaryocytes per cell, as shown in Fig.9. It is obvious that the factor leading to the formation of the highest percentage of megakaryocytes per cell is Mri-ligand, the active component of ARKU. This indicates the specificity of Mri-ligand in relation to megakaryocytes.

Пример 9. Мегакариоцит-стимулирующая активность Мрі-лиганда не зависит от ІІ -3 человекаExample 9. Megakaryocyte-stimulating activity of Mri-ligand does not depend on human II-3

Мрі-лиганд стимулируєт развитие мегакариоцитов человека при его добавлениий в культуральную среду, как зто описано в Примере 2. Хотя ІІ -3 не является компонентом культуральной средь, он может присутствовать в необнаружимо мальх количествах в нормальной человеческой плазме, входящей в состав средьі. Однако, если ІІ -3 и присутствуєт, он не участвует в мегакариопоззе, обусловленном Мрі- лигандом. Зто видно из фиг.10. ІЇ-3 в концентрации 2нг/мл имеет активность в тесте на мегакариоцить! человека, равную 14900 мегакариоцитарньх единиц/мл. Зта активность на 9795 подавляется апії-ІЇ-Mri-ligand stimulates the development of human megakaryocytes when it is added to the culture medium, as described in Example 2. Although II-3 is not a component of the culture medium, it can be present in undetectable small amounts in normal human plasma included in the medium. However, if II-3 is present, it does not participate in megakaryoposis caused by Mriligand. This can be seen from fig.10. II-3 in a concentration of 2ng/ml has activity in the megakaryocyte test! human, equal to 14,900 megakaryocytic units/ml. This activity on 9795 is suppressed by API-II-

З(3,Змкг/мл; Сепгуте, Сатбріідде, МА). Мрі-лиганд в концентрации 8203 мегакариоцитарньїх единиц/мл не подавлялся апії-ІЇ -3.C(3, Zmkg/ml; Sepgute, Satbriidde, MA). Mri-ligand at a concentration of 8203 megakaryocytic units/ml did not suppress Apii-II -3.

Пример 10. Анализ Мрі-лиганда свиньиExample 10. Pig Mri-ligand analysis

І. РезюмеI. Summary

Белки из плазмь! облученной свиньи с активностью Мрі-лиганда бьіли охарактеризовань! с помощьюProteins from plasma! irradiated pig with Mri-ligand activity was characterized! with the help

М/СА-аффинной хроматографии, аффинной хроматографии на Мрі-рецепторе, ионобменной хроматографийи и С4 хроматографии вьісокого давления с обращенной фазой(НРІ С). Активность также характеризовали путем злюции из срезов 5ХО5-полиакриламидного геля.M/CA-affinity chromatography, MRI-receptor affinity chromatography, ion-exchange chromatography and C4 high-pressure reverse-phase chromatography (HRI C). The activity was also characterized by fusion from slices of 5ХО5-polyacrylamide gel.

Хроматография КомментарийChromatography Commentary

М/СА-аффинная нанесено 4.4 миллиона колонка единиц снято 3.4 миллиона единицM/SA-affine applied 4.4 million units column removed 3.4 million units

Колонка с М РІ - нанесено 2.7 миллиона рецептором единиц снято 2.4 миллиона единицColumn with M RI - 2.7 million units were applied by the receptor, 2.4 million units were removed

Мопо 5 нанесено 2.4 миллиона ионобменник, рН единиц 6.0 снято 4.4 миллиона единицMopo 5 applied 2.4 million ion exchanger, pH units 6.0 removed 4.4 million units

С4 НРІС с обращенной активность обнаружена во фазой фракциях 23-25C4 NRIS with reversed activity was detected in phase fractions 23-25

Опьїть по Две явно различимье злюции из геля активности,. одна - приблизительно 18кКД другая - приблизительно 28кДDrink two clearly distinguishable evils from the activity gel. one - approximately 18kD the other - approximately 28kD

Пример 11. Клонирование Мрі-лиганда человека(МСООЕ человека)Example 11. Cloning of human Mri-ligand (human MRI-ligand)

Ниже приведень! два использованньх подхода:List below! two used approaches:

І. Первьй пример клонирования А. Получение пробьї МЕООЕ человекаI. The first example of cloning A. Obtaining samples of human MEOOE

Ряд дегенеративньїх ПЦР-праймеров бьіл сконструирован на основе последовательности амино-конца белка собаки. Для амплификации гена МООЕ из геномной ДНК человека использовали раличнье парь! праймеров. После 40 циклов амплификации с использованием смьісловьїх праймеров 5 ЯСМ ССМ СОМA number of degenerate PCR primers were constructed based on the sequence of the amino-end of the dog protein. For the amplification of the MOOE gene from the human genomic DNA, we used a ralychne pair! primers After 40 cycles of amplification with the use of nonsense primers 5 YSM SCM SOM

НОМ Там СА З'ЇЗЕО 0 МО:4), кодирующих пять первьїх аминокислот белка собаки(5ЕО ІЮ МО) и антисмьслового праймера: 5 С2СА АТО МАА САС ТО МОА АТС З'ЇЗЕО ІЮ МОБ), кодирующего аминокислоть с 16 по 21 последовательности 5ЕО І МО: 1, продукт ПЦР бьл разогнан в геле 2,095-ной агарозьї в буфере ТВЕ. Полоса, соответствующая фрагменту 63 парьї оснований, бьіла внірезана их геля и реамплифицирована с тем же самьм набором праймеров. Продукт ПЦР клонировали в векторе РОСАNOM Tam SA ZYIZEO 0 MO:4), encoding the first five amino acids of the dog protein (5EO IYU MO) and an antisense primer: 5 С2СА ATO MAA САС TO MOA ATS ZYIZEO IYU MOB), encoding amino acids from 16 to 21 of the 5EO sequence I MO: 1, the PCR product was run in a 2.095% agarose gel in TVE buffer. The band corresponding to fragment 63 of the base pair was inserted into their gel and reamplified with the same set of primers. The PCR product was cloned into the ROSA vector

І(Іпмігодеп, Зап Оієдо). Ряд колоний бьл проскринирован при помощи секвенирования ДНК. ПлазмиднуюI (Ipmigodep, Zap Oyedo). A number of colonies were screened using DNA sequencing. Plasmid

ДНК, кодирующую пептид, сходньій с белююом МООЕ собаки, использовали для получения радиоактивной пробьї в последующем скрининге кКДНКовьх библиотек. Аминокислотная последовательность, кодируемая фрагментом гена, бьіла следующей:DNA encoding a peptide similar to the dog's white MOE was used to obtain a radioactive probe in the subsequent screening of cDNA libraries. The amino acid sequence encoded by the gene fragment is as follows:

АІа-Рго-Рго-АІа-Сувз-Авр-І еи-Агд-Ма!-І еи-5ег-І увз-І еи-Геи-Ага-AIa-Rgo-Rgo-AIa-Suvz-Avr-I ei-Agd-Ma!-I ei-5eg-I uvz-I ei-Hey-Aga-

Авр-зеї-Нів-МаІ-Їен-Нів(ЗЕО І МО:6)Avr-zei-Niv-MaI-Yen-Niv (ZEO I MO:6)

Фрагмент агарозного геля, содержащий МОРЕ человека, использовали для получения пробь посредством "горячей" ПЦР. Типичная реакционная смесь ПЦР обьемом 100мкл содержала следующие компоненть!: матричная ДНК 2-ЗмклA fragment of the agarose gel containing human MOPE was used to obtain samples by means of "hot" PCR. A typical PCR reaction mixture with a volume of 100 µl contained the following components: template DNA 2-µl

Б'праймер(5ЕО ІЮ МО:4) Тмкл, 20п1МB'primer (5EO IU MO:4) Tmkl, 20p1M

З'праймер(5ЕО ІЮ МО:5) Тмкл, 20пМ х буфер Т1Омкл аАТР(0О, ТММ) мкл аттР(ИТОММ) 2мМкКл астР(ТОММ) 2мкл астР(О, ММ) 2мкл астР, РЗ2(10 мкКи/мкл) БбБмклZ'primer (5EO IU MO:5) Tmcl, 20pM x buffer T1Omcl aATP(0O, TMM) mcl attR(ITOMM) 2mMcL astR(TOMM) 2mL astR(O, MM) 2mL astR, PZ2 (10 μCy/mL) BbBmcl

АТР, РЗ2(10 мкКи/мкл) БбБмклATP, RZ2 (10 μCy/μl) BbBmcl

Тад ДНК-полимераза О,бмкл, 2,5единиц вода 77мМкКл общий обьем 100мклThen DNA polymerase O, bmcl, 2.5 units water 77mMcl total volume 100mcl

Условия амплификации бьіли следующими: начальньй нагрев 94?С, 2 мин отжиг 53"С, ЗОсек наращивание 72"С, ЗОсек денатурация 94"С, ЗосекAmplification conditions were as follows: initial heating at 94 °C, 2 min annealing at 53 °C, 30 sec extension at 72 °C, 3 sec denaturation at 94 °C, 30 sec

Бьгло вьіполнено 40 циклов амплификации на приборе Регкіп ЕІтег сепеАтр бЗузіет 9600.40 cycles of amplification were completed on the device Regkip EITeg sepAtr bZuziet 9600.

Продукт очищали на колонке(риб5п соЇштп)(Зігаїадепе, Зап Оієдо). В сцинтилляционном счетчике просчитьівали імкл пробьї. Те пробьії, которне содержали 1-3 миллиона импульсов на мл, добавляли к гибридизационной смеси.The product was purified on a column (rib5p soYshtp) (Zigaiadepe, Zap Oyedo). In a scintillation counter, the sample was counted. Those probes that contained 1-3 million pulses per ml were added to the hybridization mixture.

Б. Конструирование библиотеки змбриональной печениB. Construction of the embryonic liver library

У фирмь! Сіопіесп Іарогаюгіез бьіла куплена полидД-- РНК змбриональной печени человека. Около 4мкгIn companies! Siopiesp Iarogayugiez white bought polyd-- RNA of human embryonic liver. About 4 μg

РНК использовали для синтеза кКДНК, в котором для праймирования служил случайньй гексамер, 5 аТАRNA was used for the synthesis of cDNA, in which a random hexamer, 5 aTA, was used for priming

СОС ТТ СТА САМ МММ ММТ 3 (5ЕО ІО МО:7), соединенньій с олигонуклеотидом, содержащим сайт рестрикции Хва І.SOS TT STA SAM MMM MMT 3 (5EO IO MO:7), connected with an oligonucleotide containing the Hva I restriction site.

Для получения двунитчатой кКДНК применяли протокол Сірбсо-ВВГІ.. Адаптор Есо ВІ-Ввіх((Іпийгодеп, ЗапTo obtain double-stranded cDNA, the Sirbso-VVGI protocol was used.

Піедо) лигировали с двунитчатой кДНК и затем рестрицировали ферментом Хва І.Piedo) was ligated with double-stranded cDNA and then restricted with the enzyme Hva I.

Отбор кКДНК по размеру осуществляли на колонке 5500 берпасгу(І Ше Тесппоіодієв, Іпс.). Молекуль!Selection of cDNA according to size was carried out on a 5500 Berpasgu column (I She Tesppoiodiyev, Ips.). Molecules!

КДНК, имеющие размер более 400 пар оснований, лигировали с вектором для зкспрессии в клетках млекопитающих м19.8 |Магііп, Р., Се 63: 203 - 211(1990)) предварительно рестрицированньм ферментами Есо ВІ и Хбра І. Трансформировали компетентньюе клетки 1Е. соїї ООНІО и полученную билиотеку делили на 7 пулов по 100000 клонов кКДНК в каждом.cDNAs with a size of more than 400 base pairs were ligated with a vector for expression in mammalian cells m19.8 (Magiip, R., Se 63: 203 - 211 (1990)) and previously restricted with the enzymes Eso VI and Khbra I. Competent cells were transformed into 1E. UNIO soybeans and the resulting library were divided into 7 pools of 100,000 cDNA clones in each.

В. Скрининг библиотеки в фаге лямбдаV. Screening of the library in lambda phage

Библиотека збриональной печени человека в фаге лямбда ди с титром 650 миллионов бляшкообразующих единиц/мл бьла куплена у фирмь! Сіопіесн. Около 2-х миллионов бляшек бьло проскринировано с пробой, полученной ПЦР(см. вьіше). Гибридизацию проводили в течение 15 часов при 56"С в 6х55С, 5х растворе Денхардта, 0,195 505, 100мкг/мл однонитчатой ДНК спермь! лосося.A library of embryonic human liver in phage lambda di with a titer of 650 million plaque-forming units/ml was purchased from the company! Siopiesn. About 2 million plaques were screened with the sample obtained by PCR (see above). Hybridization was carried out for 15 hours at 56"C in 6x55C, 5x Denhardt's solution, 0.195 505, 100μg/ml single-stranded salmon sperm DNA.

Проводили многочисленнье раундьі! скрининга. ДНК из единичньїх бляшек амплифицировали и для идентификации истинно положительньїх бляшек данную ДНК гибридизовали с внутренним праймером 5'They held numerous rounds! screening DNA from single plaques was amplified, and to identify true positive plaques, this DNA was hybridized with the 5' internal primer

АСТ ТТА Ста дос АСТ боб Ас З'ЗЕО 10 МО : 8), кодирующим аминокислоть! с 7-й по 13-ю последовательности 5ЕО ІЮ МО: 6.AST TTA Sta dos AST bob As Z'ZEO 10 MO : 8), encoding amino acid! from the 7th to the 13th sequence of 5EO IU MO: 6.

Г. 3--праймированная бьістрая амплификация концов КДНК(ВАСЕ)D. 3--primed rapid amplification of cDNA ends (VACE)

Полиаденилированная РНК из человеческой збриональной почки и человеческой зибриональной печени бьла куплена у Сіопеїесн. Один микрограмм РНК подвергали обратной транскрипции с использованием в качестве праймера олигонуклеотида 5 Тто пас боса АТА СОС СТТ ТТ тт тт ттPolyadenylated RNA from human embryonic kidney and human embryonic liver was purchased from Siopeiesn. One microgram of RNA was subjected to reverse transcription using as a primer oligonucleotide 5 Tto pas boss ATA SOS CTT TT tt tt tt

ТТ З'ЇЗЕО ІЮ МО: 9).TT ZYIZEO IU MO: 9).

Набор для синтеза кКДНК Сірсо-ВАЇ | їйе ТесНпоіодієв, Іпс. Саї. й 18267-013| использовали для получения первой нити кКДНК. Общий обьем составлял ЗОмкл.Kit for cDNA synthesis Sirso-VAI | her TesNpoiodiyev, Ips. Sai. and 18267-013| used to obtain the first cDNA strand. The total volume was ZOmkl.

Реакцию останавливали добавлением 500мм ЕДТА до конечной концентрации 1О0мм и смесь замораживали при -2076.The reaction was stopped by adding 500 mm EDTA to a final concentration of 100 mm and the mixture was frozen at -2076.

Для начала ПЦР использовали в качестве матриць 0,бмкл кКДНК. Праймер 5ЕО ІЮО МО : 9 и конкуретньій олигонуклеотид 5 ТТ (оС бОай АТА пас ст тт тт тт т-Рр ЗЇЗЕО ІЮ МО : 10) использовали как антисмьісловье праймерь!, тогда как олигонуклеотид 5 Таб БАС Сто СОаА СТО СтоTo start PCR, 0.bmcl cDNA was used as a matrix. The primer 5EO IYUO MO: 9 and the competing oligonucleotide 5 TT (оС бОай АТА pas st tt tt tt t-Пр ЗИЗЕО ЙХО MO: 10) were used as an antisense primer!, while the oligonucleotide 5 Tab BAS Sto СоаА СТО Sto

АЮ З'ЇЗЕО ІЮ МО : 11), кодирующий аминокислоть с 5-й по 11-ю последовательности ЗЕО ІЮО МО : 6, использовали в качестве смьслового праймера. Сорок циклов амплификации бьло проведено по следующему протоколу: 947С, ЗОсек; 65"С, З0сек; 72"С, ЗбОсек; после начальной 2-х минутной инкубации при 94"С. Для амплификации использовали прибор Регкіп ЕІтег сепеАтр бЗузіет 9600.AYU ZYZEO IJU MO: 11), encoding amino acid from the 5th to the 11th sequence of ZEO IJUO MO: 6, was used as a nonsense primer. Forty cycles of amplification were carried out according to the following protocol: 947C, ZOsec; 65"С, 30sec; 72"С, ZbOsec; after the initial 2-minute incubation at 94"C. For amplification, we used the device Regkip EIteg sepAtr bZuziet 9600.

Закрепление("певіїпд") проводили с применением смьіслового праймера 5 БАС ТоС ТСА СТА ААС та тт ат 3'ЇЗЕО І МО : 12), кодирующего аминокислоть с 8-й по 14-ю последовательности 5ЕО 10 МО : б, при том, что последовательности 5ЕО І МО : 9 и 5ЕО ІО МО : 10 служили антисмьісловьми праймерами. Бьло проведено сорок циклов амплификации с отжигом при 65"С. Продукть ПЦР фракционировали злектрофорезом в 0,895 геле агарозьь и фотографировали в ультрафиолете. Бьіли виднь полось в районе 0,8 - 1,2 килобаз.Binding ("peviipd") was carried out using the mixed-word primer 5 BAS ToS TSA STA AAS and tt at 3'YZEO I MO : 12), encoding amino acids from the 8th to the 14th sequence of 5EO 10 MO : b, while sequences 5EO I MO : 9 and 5EO IO MO : 10 served as antisense primers. Forty cycles of amplification were carried out with annealing at 65°C. The PCR product was fractionated by electrophoresis in a 0.895 agarose gel and photographed in ultraviolet light. White bands were seen in the region of 0.8 - 1.2 kilobases.

Затем продуктьї ПЦР клонировали в вектор РОСА ІЦіІпмігодеп).Отбирали индивидуальнье колонии и вьіделяли плазмидь! с помощью наборов Оіадеп(Саї. 5 12143 и 12145). Двунитчатое секвенирование бьло проведено с использованием векторньїх праймеров. Последовательности анализировали с помощью различньїх типов программного обеспечения Са.Then the PCR products were cloned into the ROSA vector ICiIpmigodep). Individual colonies were selected and the plasmid isolated! with the help of Oiadep sets (Sai. 5 12143 and 12145). Double-stranded sequencing was performed using vector primers. Sequences were analyzed using different types of software.

Д. Наращивание цепи ДНК с помощью 3 и 5 праймеровD. Extension of DNA chains with the help of 3 and 5 primers

Для получения последовательности полноразмерного гена МООЕ бьло проведено наращивание цепиChain amplification was performed to obtain the sequence of the full-length MOOE gene

ДНК с помощью 3 и 5'і--праймеров с использованием в качестве матриц различньїх рулов библиотеки змбриональной печени. Для амплификации 5'-праймера кКДНК использовали в качестве матрицьі около 2Онг кКДНК из каждого пула. Использовали МЕОЕ-специфический антисмьсловой праймер 5 псСА СТОDNA with the help of 3- and 5-primers, using as matrices various lines of the embryonic liver library. For amplification of the cDNA 5'-primer, about 2 µg cDNA from each pool was used as a template. The MEOE-specific antisense primer 5 psSA STO was used

АСОа АС САС ТТ АС З'ЇЗЕО ІЮ МО : 13), кодирующий аминокислоть с 12-й по 17-ю последовательностиАСОа АС САС TT АС ЯЯЗЕО ИЮ МО : 13), encoding amino acid from the 12th to the 17th sequence

ЗЕООІЮО МО : 6, и 5 векторньій М19.8 смьісловой праймер 5 ССТ ТТА СТТ СТА СОС Ста 3"(ЗЕО ІЮ МО: 14). Амплификацию проводили в течение ЗО циклов с отжигом при 53"С, Закрепление проводили в течение 30 циклов с антисмьісловьмм праймером 5 пас; ато АСА ДОС Аса дос А З'ЇЗЕО ІЮ МО : 15) (кодирует амнокислоть с 1-й по 6-ю последовательности 5ЕО ІЮО МО : 6) и векторьінм праймером 5ЕО ІЮZEOOIIUO MO: 6, and 5 vector M19.8 mixed-word primer 5 SST TTA STT STA SOS Sta 3" (ZEO IU MO: 14). Amplification was carried out during 30 cycles with annealing at 53"C, Fixation was carried out during 30 cycles with anti-funny primer 5 passes; ato АСА ДОС Аса дос А ЗИЗЕО ИЙУ МО : 15) (encodes amino acid from the 1st to 6th sequence 5EO ИЙО МО : 6) and the vector primer 5EO ИЙ

МО : 14.MO: 14.

Для наращивания цепи с 3' концов КДНК МООЕ использовали антисмьісловой векторньій праймер 5' вас АТА ТО бос аАС сто а З'ЇЗЕО ІЮ МО : 16) и МЕОБ-специфический праймер 5 ТоС тоСс ТИСTo extend the chain from the 3' ends of the MOE cDNA, we used the antisense vector primer 5' you ATA TO bos aAS sto a ZYIZEO IU MO : 16) and the MEOB-specific primer 5 ToS toSs TYS

ТТО ТОА ССТ С З'ЇЗЕО ІЮ МО : 17), кюодирующий аминокислоть с 1-й по 6-ю последовательности 5ЕО ІЮТТО ТОА ССТ С ЗЯЗЕО ИЙУ МО : 17), quodifying amino acid from the 1st to 6th sequence of 5EO ИЙ

МО : 6. Амплификацию проводили в течение 30 циклов с отжигом при 5870.MO: 6. Amplification was carried out for 30 cycles with annealing at 5870.

Амплификацию закрепления("пезіїпд атрійісайоп") проводили в течение 30 циклов с использованием мМаре-праймера 5ЕО ІЮО МО : 12 и векторного праймера 5ЕО ІО МО : 16. Специфические полось бьли обнаружень! в пулах 1,7 и 8, которне затем клонировали в вектор РОСА ІІ. Плазмидную ДНК из отдельньх колоний очищали и секвенировали.Amplification of the binding ("peziipd atriyisayop") was carried out for 30 cycles using the mMare-primer 5EO IUO MO: 12 and the vector primer 5EO IO MO: 16. Specific bands were detected! in pools 1, 7 and 8, which were then cloned into the ROSA II vector. Plasmid DNA from individual colonies was purified and sequenced.

Е. Вьіделение полноразмерньїх клонов МЕООЕ человекаE. Isolation of full-size clones of human MEOOE

Многие из исходньїх оклонов утрачивали часть оамино-конца МОарЕ, поскольку часть последовательности МООЕ использовалась для праймирования и закрепления. Праймер 5 ССА СО(ЗА дос! АТ САС соб А З'ЇЗЕО ІЮ МО : 18), последовательность которого бьлла получена в опьтах по наращиванию 5'-праймера как описано вьіше, использовали как смьсловой праймер. Векторньйй праймерMany of the original clones lost part of the amino-terminus of MOaE, since part of the sequence of MOAe was used for priming and binding. Primer 5 ССА СО (ЗА дос! AT САС соб А ЗИЗЕО ИЮ МО : 18), the sequence of which was obtained in wholesale by the extension of the 5'-primer as described above, was used as a sense primer. Vector primer

ЗЕО ІО МО: 16 служил антисмьсловьм праймером. Проводили 35 циклов амплификации с отжигом при 5876. МЕАОБ-специфический праймер 5 САА САА ТОаС АС СОС САС ССА БАС АСС Са 3'ЇЗЕО І МО: 19), содержащий сайт рестрикции ЗаІ І и векторньй праймер(ЗЕО ІЮ МО: 15) использовали для закрепления("певіїпд") в течение 35 циклов. Продукт ПЦР клонировали в векторе РСВ ІІ и секвенировали.ZEO IO MO: 16 served as an anti-misleading primer. 35 cycles of amplification were carried out with annealing at 5876. MEAOB-specific primer 5 САА САА TOаС AS СОС САС ССА BАС Са 3'ЯЗЕО I MO: 19), containing the ZaI II restriction site and the vector primer (ZEO IЮ MO: 15) were used for fixations ("peviipd") for 35 cycles. The PCR product was cloned into the RSV II vector and sequenced.

ІІ. Второй пример клонированияII. The second example of cloning

А. Клонирование М-концевой КДНК МООЕ собакиA. Cloning of the M-terminal cDNA of dog MOOE

Дегенерированнье олигонуклеотиднье праймерь! бьіли сконструировань! на основе М-терминальной последовательности аминокислот МООЕ собаки, описанной в предьідущих разделах. Даннье праймерь! использовали в полимеразной цепной реакций(ПЦР) для амплификации последовательностей кДНК, кодирующих МОЮ.Degenerate oligonucleotide primer! white construction! on the basis of the M-terminal amino acid sequence of MOOE of the dog, described in the previous sections. This primer! were used in the polymerase chain reaction (PCR) to amplify cDNA sequences encoding MOI.

Тотальную РНК вьіделяли из образцов почек собаки гуанидин-изотиоцианатньм методом поTotal RNA was isolated from dog kidney samples by the guanidine-isothiocyanate method

Спотлгупекі апа Засспі |Віоспет. 162: 156-159(1987)). Первую нить кКДНК получали со случайньім праймер- адаптором 5 а0С боса АТА спос САС ТОМ МММ ММТ З'Ї5ЕО ІО МО: 20) с использованием обратной транскриптазьь Мо-Ми! М и использовали в качестве матриць в последующих полимеразньїх цепньх реакциях. ПЦР проводили в обьеме 0,5мкл с - 5Онг кКДНК, с использованием праймера А 5 СМ ССМ СОМSpotlgupeki apa Zasspi |Viospet. 162: 156-159 (1987)). The first strand of cDNA was obtained with a random primer-adaptor 5 a0C boss ATA spos SAS TOM MMM MMT Z'YI5EO IO MO: 20) using Mo-My reverse transcriptase! We used them as matrices in subsequent polymerase chain reactions. PCR was performed in a volume of 0.5 μl with 5 ng of cDNA, using primer A 5 CM SCM COM

СМ Там СА З'5ЕО ІЮ МО: 4), праймера смьсловой цепи, кодирующего аминокислоть! 1 - 6 последовательности 5ЕО ІЮ МО: 1, а также праймера В 5 СА Та МАСІ МАС Та МОаА АТО З'Ї5ЕО ІSM Tam SA Z'5EO IJU MO: 4), the primer of the nonsense chain encoding an amino acid! 1 - 6 of the sequence of 5EO IYU MO: 1, as well as the primer B 5 SA and MASI MAS and MOaA ATO ZIYI5EO I

МО: 5) или же праймера С 5 С2ССА ВТО МАА МАС Та Мала АТС З3'ЇЄЕО ІЮО МО: 21), которне являются праймерами антисмьісловой цепи, кодирующими аминокислоть 16 - 21 последовательности 5ЕО ІО МО: 1, с тремя дополнительньіми нуклеотидами на 5'-конце для повьішения стабильности при гибридизации. ПЦР с Тад полимеразой проводили в течение 35 - 45 циклов до тех пор, пока полось! продукта не становились четко различимь! при злектрофорезе в гелях агарозьі. Для первьїх двух циклов ПЦР отжиг проводили при 37"С в течение двух минут, для последующих циклов ПЦР отжиг проводили при 50"С в течение одной минуть. В каждой реакции наблюдали множественньюе полось! продукта. Фрагменть! геля, содержащие полосьї ожидаемого размера(66 пар оснований), извлекали с помощью пастеровской пипетки и проводили реамплификацию с той же самой парой праймеров. ДНК-продукть! клонировали в вектор РОСА ЦЩІпмігодеп) согласно рекомендациям производителя. Три клона бьіли секвенировань и показано, что они кодируют в одной рамке считьявания ожидаеємье последовательности МООЕ собаки, остатки 1 - 21. Таким образом, бьіла получена уникальная КДНК МООЕ собаки, представляющая область от третьего нуклеотида кодона 6 до третьего нукоелтида кодона 15. Один из указанньїх клонов служил матрицей для получения меченой кКДНК-пробьї МСООЕ собаки.MO: 5) or the primer C 5 С2ССА ВТО МАА МАС Ta Mala ATS З3'ЙЕЕЕО ИХО МО: 21), which are primers of the antisense chain, encoding amino acids 16 - 21 of the sequence 5ЕО ИО МО: 1, with three additional nucleotides at 5' -end to increase stability during hybridization. PCR with Tad polymerase was carried out for 35 - 45 cycles until it stopped! the product was not clearly distinguishable! during electrophoresis in agarose gels. For the first two PCR cycles, annealing was carried out at 37"C for two minutes, for subsequent PCR cycles, annealing was carried out at 50"C for one minute. Multiple bands were observed in each reaction! product Fragment! the gel containing bands of the expected size (66 base pairs) was removed using a Pasteur pipette and reamplification was carried out with the same pair of primers. DNA product! cloned into the ROSA vector TsChIPmigodep) according to the manufacturer's recommendations. Three clones were sequenced and it was shown that they encode in one reading frame the expected sequence of MOEE of the dog, residues 1 - 21. Thus, a unique cDNA of the MOEE of the dog was obtained, representing the region from the third nucleotide of codon 6 to the third nucleotide of codon 15. One of the indications clones served as a matrix for obtaining labeled cDNA-probe MSOOE dog.

Б. Конструирование кКДНК-овой библиотеки из змбриональной печени человекаB. Construction of cDNA library from embryonic human liver

РНК вьіделяли из человеческой змбриональной печени(Іпіегпайопа! Іпвійше г Ше Адмапсетепі оїRNA was isolated from human embryonic liver (Ipiegpaiopa!

Меаісіпе, Ехюп, РА) путем лизиса ткани в 5,5М гуанидинизотиоцианате и очистки центрифугированием вMeaisipe, Ekhup, RA) by tissue lysis in 5.5M guanidinium isothiocyanate and purification by centrifugation in

С5ЗТЕА(РПпагтасіа). Полиаденилированную РНК получали с использованием олиго(а1)25 дайнабидс(Бупаї, согласно указаниям производителя). Двунитчатую КДНК получали из указанной РНК с использованием плазмидной системь! Зиреггсгірі для синтеза КДНК( їе Тесппоіодієв, Іпс.,) с единственньім исключением, состявшим в использований отличного адаптера: 5 Та ата та АСТ тат а 3'ЇЗЕО ІЮ МО: 22) и 5 САСC5ZTEA (RPpagtasia). Polyadenylated RNA was obtained using oligo(a1)25 dynabids (Bupai, according to the manufacturer's instructions). Double-stranded cDNA was obtained from the indicated RNA using plasmid systems! Zireggsgiri for the synthesis of cDNA (ie Tesppoiodiev, Ips.,) with the only exception, which consisted in the use of an excellent adapter: 5 Ta ata and AST tat a 3'YZEO IU MO: 22) and 5 САС

АС ТС АСА АСС СС 3'5ЕО ІЮ МО: 23). После отбора по размеру данная к ДНК бьіла направленно встроена по сайтам В5і Хі Мої! в вектор для зкспрессии в клетках млекопитающих рВвСсв(рвсВв получена на основе плазмидьй Нс/СМУМ, Іпуйгодеп, состоящей из скелета рисС19, промотора СММ и сайта полиаденилирования ВОН). Лигированную ДНК вводили злектропорацией в клетки злектрокомпетентного бактериального штамма 108 їїТе ТесНпоіодієв, Іпс.).AS TS ASA ACC SS 3'5EO IYU MO: 23). After the size selection, the given DNA was directionally embedded on the V5 and Hi Moi sites! into a vector for expression in mammalian cells rVvSsv (rvSvv was obtained on the basis of plasmids Hs/SMUM, Ipuygodep, consisting of the risC19 skeleton, the SMM promoter and the polyadenylation site of VON). Ligated DNA was injected by electroporation into the cells of the electrocompetent bacterial strain 108 (TesNpoiodiyev, Ips.).

В. Скрининг на МЕАОЕ кДНК-овой библиотеки змбриональной печени человекаV. Screening for MEAOE cDNA library of human embryonic liver

Библиотеку человеческой змбриональной печени, фиксированную в виде реплик на фильтрах, гибридизовали с радиоактивньм ПЦР-продуктом КкДНК М-конца МООБ(5х 55РЕ, 2х раствор Денхардта, 0,0595 пирофосфат натрия, 0,595 505, 100мкг/мл лизат дрожжевой тРНК и 100мкг/мл денатурированнаяThe library of the human embryonic liver, fixed in the form of replicas on filters, was hybridized with the radioactive PCR product of M-terminal CkDNA MOOB (5x 55RE, 2x Denhardt solution, 0.0595 sodium pyrophosphate, 0.595 505, 100μg/ml yeast tRNA lysate and 100μg/ml denatured

ДНК спермь! лосося) при 64"С в течение 18 часов. фильтрь! отмьівали при 64"С в 5х 55РЕ, 0,595 505 и зкспонировали с рентгеновской пленкой в течениеє ночи. Бьли вьіделеньйї и проанализировань! два различньїх клона, гибридизовавшихся с указанной пробой.Sperm DNA! salmon) at 64"C for 18 hours. The filter was washed at 64"C in 5x 55PE, 0.595 505 and exposed to X-ray film overnight. There was separation and analysis! two different clones that hybridized with the indicated breakdown.

Г. Зкспрессия кКДНК-овьїх клонов МООЕ человекаH. Expression of cDNA clones of human MOOE

Очищенной ДНК кДНКовьїх клонов М2ОЕ трансфицировали клетки линии 293 ЕВМА(Іпмігодеп). 1,5МмкгCells of line 293 EVMA (Ipmigodep) were transfected with the purified DNA of cDNA clones of M2OE. 1.5 Mmkg

ДНК смешивали с 7,5мкл Липофектамина(Г іє Тесппоіодієв, Іпс.) в 100мкл средьї ДМЕМ без сьіворотки.DNA was mixed with 7.5 μl of Lipofectamine (Gie Tesppoiodiev, Ips.) in 100 μl of DMEM medium without serum.

После 20 минут инкубации при комнатной температуре смесь ДНК-липофектамин добавляли к 5 х 105 клеток/лунку(24-луночнье планшеть стгеїпег) в 400мкл ДМЕМ, 195 сьіворотки(Реїа! Сіопе ІІ) и инкубировали при 37"С 6 часов. Затем к клеткам добавляли по 5Х00мкл ДМЕМ с 2095 сьівротки(Реїа! Сіопе ІІ). Через 72 часа собирали кондидиционированную среду и центрифугировали через 0,22-микронньій центрифужньй фильтр. Кондиционированную среду проверяли на биологическую активность МБО.After 20 minutes of incubation at room temperature, the DNA-lipofectamine mixture was added to 5 x 105 cells/well (24-well Stgeipeg plate) in 400 μl of DMEM, 195 serum (Reia! Siope II) and incubated at 37"С for 6 hours. Then to the cells 5X00μl of DMEM with 2095 serum (Reia! Siope II) was added. After 72 hours, the conditioned medium was collected and centrifuged through a 0.22-micron centrifugal filter. The conditioned medium was tested for the biological activity of MBO.

І. Описание и активность клонов МЕОЕ человекаI. Description and activity of human MEOE clones

С применением описанной вьшше стратегиий клонирования бьіли полученьії клоньї кДНК человека, представленнье на фиг.11(МСООР-1 и МООБ-2; 5ЕО ІО МОБ: 24, 25 и 26, 27) и фиг.12(МОаЮБ-3; 5ЕО ІUsing the cloning strategy described above, human cDNA clones were obtained, shown in Fig. 11 (MSOOR-1 and MOOB-2; 5EO IO MOB: 24, 25 and 26, 27) and Fig. 12 (MOaYUB-3; 5EO I

МО5: 28, 29). Каждая из представленньх на чертежах последовательностей содержит сигнальную последовательность аминокислот 1 - 21, так что в каждом случає зрельй белок начинаєтся с аминокислоть! 22.MO5: 28, 29). Each of the representations in the sequence drawings contains a signal sequence of amino acids 1 - 21, so that in each case a mature protein begins with amino acids! 22.

Результать! определения активности с использованием описанньїх в Примере 4А клеточньїх тестов, представлень ниже в Таблицах З и 4. В Таблице З кондиционированную среду клеток 293, трансфицированньїх каждьім из конструктов, собирали после двух дней культивирования и проверяли в тесте на клетках 1А 6.1(320О/тиг-МРІ -) 4/-10мкг/мл ти -МРІ-Х. В Таблице 4 кондиционированную среду клеток 293, трансфицированньх каждьм из конструктов, собирали после четьірех дней культивирования и проверяли в тесте на клетках 320/тиї-МРІ «(Пример ЗА) и клетках 320/пи-МРІ «(Пример 38). Как можно видеть из зтих данньїх, МООБ-1 и МООЕ-2 человека, но не МООБЕ-3, активньі в отношений клеточньх линий, зкспрессирующих Мрі человека и мьши. Клеточная линия, зкспрессирующая рецептор Мрі человека более чувствительна к МООБ-1 и МООЕ-2 человека, чем клеточная линия, зкспрессирующаяThe result! determination of activity using the cell tests described in Example 4A, presented below in Tables C and 4. In Table C, the conditioned medium of 293 cells transfected with each of the constructs was collected after two days of cultivation and tested in the test on cells 1A 6.1 (320O/week MRI -) 4/-10mcg/ml you - MRI-X. In Table 4, the conditioned medium of cells 293, transfected with each of the constructs, was collected after four days of cultivation and tested in the test on cells 320/ti-MRI "(Example 3A) and cells 320/pi-MRI "(Example 38). As can be seen from these data, human MOOB-1 and MOOE-2, but not MOOBE-3, are active in cell lines expressing human and mouse MRI. A cell line expressing the human Mri receptor is more sensitive to human MOOB-1 and MOOE-2 than a cell line expressing

Мрі-рецептор мьіши.MRI muscle receptor.

Таблица З 111111 бреда.//////// | 77777777777777771717011111111111111111 11111110 сошннннни | 51 п тет: ВНЯ ПО С ПОН ПОН ПО 1 МабеЗ(ловтод///// | 7777777777777777117011111111111111111Ї1111111111111011 1111 АРКОконтроль /:././З// | (44004400 | 77777701Table Z 111111 delirium.//////// | 777777777777777717170111111111111111111 11111110 soshnnnnny | 51 p tet: VNYA PO S PON PON PO 1 MabeZ(lovtod///// | 77777777777777777117011111111111111111Ї1111111111111011 1111 ARKOkontrol /:././З// | (44004400 | 77777701

Таблица 4Table 4

Из представленньх в Таблице 5 результатов видно, что активность человеческого МЕООБ-1 и МООБ-2 по отношению к клеткам 320/пи-МРІ «Пример ЗВ) почти полностью подавляеєтся растворимьм человеческим трі-рецептором(пи-МРІ-Х). Ни-МРІ-Х присутствует в кондиционированной среде клетокFrom the results presented in Table 5, it is clear that the activity of human MEOOB-1 and MOOB-2 in relation to cells 320/pi-MRI "Example 3B) is almost completely suppressed by soluble human tri-receptor (pi-MRI-X). Ni-MRI-X is present in the conditioned medium of cells

СНО, продуцирующих зтот белок. Зта кондиционированная среда бьла сконцентрирована в 120 раз и затем добавлена к культурам до концентрации 6,695. Кондиционированная среда контрольньїх клеток СНО в данном определенийи не проявляла никакого зффекта. Определение проводили как описано в Примере 48 с тем исключением, что жизнеспособнье клетки определяли после трех дней культивирования.CHOs that produce protein. This conditioned medium was concentrated 120 times and then added to the cultures to a concentration of 6.695. The conditioned environment of control cells of CHO in this determination did not show any effect. Determination was carried out as described in Example 48 with the exception that viable cells were determined after three days of cultivation.

Таблица 5 1 мМеоТ 7 Ї77777777777115801 17111110 мера | 77777772 11111111Table 5 1 mmeoT 7 Y77777777777115801 17111110 mayor | 77777772 11111111

Определение мегакариоцитов человекаDefinition of human megakaryocytes

МОаОБ-1 и МООБ-2, но не МООБ-3 индуцировали образование мегакариоцитов из СО34- положительньїх клеток периферической крови. Зксперимент, представленньй в Таблице 6, проводили как описано в Примере 2 с тем исключением, что СОЗ34-положительнье клетки периферической крови отбирали без злютриации и культуру использовали после семи дней роста. Кондиционированную среду от каждого 293 ЕВМА МООЕ конструкта использовали в конечной концентрации 2095 -/-ЗОмкг/мл тиг-МРІ -Х.MOaOB-1 and MOOB-2, but not MOOB-3, induced the formation of megakaryocytes from CO34-positive cells of peripheral blood. The experiment presented in Table 6 was carried out as described in Example 2 with the exception that the SOC34-positive cells of the peripheral blood were collected without zlutriation and the culture was used after seven days of growth. The conditioned medium from each 293 EVMA MOOE construct was used at a final concentration of 2095 -/-ZOmkg/ml tig-MRI -X.

Контрольную плазму АРКУ использовали в конечной концентрации 695.ARKU control plasma was used at a final concentration of 695.

Таблица 6 ти -МРІ-Х ячейку(нтиї-МРІ-Х) о контрольнийвектор.// | 77707771 о о контрольАРКОЇГ/З/З/Г/ | 77777777 лоб |Ї777777777771111011111111111111 0 МеОгоповтор,// | о 8бя/МО | 77777770Table 6 ti -MRI-X cell (ntii-MRI-X) o control vector.// | 77707771 o o controlARKOIG/Z/Z/G/ | 77777777 forehead |Y777777777771111011111111111111 0 MeOgopovtor,// | at 8 am/MO | 77777770

Мар | 77777777 |777771717171717171717171717101Mar | 77777777 |777771717171717171717171717101

Пример 12.Example 12.

В данном примере описьіваєтся синтез 12 различньїх пзгированньїх молекул МООРЕ, а именно - ПОГ -This example describes the synthesis of 12 different MOORE molecules, namely - POG -

ПЗг12 и ПЗГ14 - ПЗГ21. В каждом случае молекула МОЮОРЕ, которую соединяли с ПЗГом, представляла собой МОаОБЕ-11, полученную с помощью Е.соїї(аминокислотьї 22-184, пронумерованнье от начала сигнального пептида, или же аминокислотьї 1-63, пронумерованнье от начала зрелого пептида).PZh12 and PZH14 - PZH21. In each case, the MOYORE molecule, which was combined with PZH, was MOaOBE-11, obtained with the help of E. soya (amino acids 22-184, numbering from the beginning of the signal peptide, or amino acids 1-63, numbering from the beginning of the mature peptide).

Подробньсе сведения обо всех позгированньїх соединениях приведень! ниже в таблицах 7 - 10. 12.1. Получение поли-МеРЕС-МООЕ путем ацилирования МОРЕ с активированньми МеРЕа- производньімиDetailed information about all pozgirovannyh connections of ghosts! below in tables 7 - 10. 12.1. Preparation of poly-MeRES-MOOE by acylation of MORE with activated MeRES-derivatives

Получение поли-МеРЕС(2ОкДд) - МЕОБ-коньюгата(«(пОГг11)Obtaining poly-MeRES(2OkDd) - MEOB-conjugate («(pOHg11)

Охлажденньй(4"С) раствор МООР(2,5мг/мл) в 0,1М ВІСІМЕ-буфере, рН 8, добавляют к 10-кратному молярному избьтку твердого сукцинимидилпропионата МеРЕСі(мол.масса 20кД) (Зпеагмаїег Роіутегв,A cooled (4"C) solution of MOOR (2.5 mg/ml) in 0.1 M VISIME-buffer, pH 8, is added to a 10-fold molar excess of solid succinimidyl propionate MeRESi (mol. mass 20 kD) (Zpeagmaig Roiutegv,

Іпс.). Полимер растворяют при осторожном перемешиванийи, и далее реакцию проводят при комнатной температуре.Ips.). The polymer is dissolved with careful stirring, and then the reaction is carried out at room temperature.

Степень модификации белка в процессе реакции контролируют с помощью НРІС, учитьівая размер молекул(взіге ехсіивіоп ЗЕС), при использований колонки бЗирегдех 200 НА 10/30(Рпагтасіа Віоїесп).The degree of modification of the protein during the reaction is controlled with the help of NRIS, studying the size of the molecules (vsige exsiiviop ZES), when using a column bZyregdeh 200 NA 10/30 (Rpagtasia Vioiesp).

Злюцию проводят 0,1М натрий-фосфатньім буфером при рн 6,9 и скорости потока 0,7мл/мин.The solution is carried out with 0.1 M sodium phosphate buffer at a pH of 6.9 and a flow rate of 0.7 ml/min.

Исследование реакционной смеси путем 5ЕС НРІ С через 30 минут показьвваєт, что в ней не остаєется свободного белка. В зтой временной точке концентрацию белка в реакционной смеси уменьшают доExamination of the reaction mixture by 5EC NRI C after 30 minutes shows that there is no free protein left in it. At this point in time, the protein concentration in the reaction mixture is reduced to

І1мг/мл добавлением стерильной водь), а рН смеси доводят до 4 с помощью нескольких капель 0,5М уксусной кислоть!.1mg/ml by adding sterile water), and the pH of the mixture is adjusted to 4 with the help of a few drops of 0.5M acetic acid!.

МеРЕС-МОаОР-коньюгат отделяют от избьтка МООЕ и других побочньїх продуктов реакции путем ионобменной хроматографии при использований 5Р Зерпагозе НР(РНагттасіа Віоїеснй) в качестве ионобменой смольі.MeRES-MOaOR-conjugate is separated from the excess of MOOE and other by-products of the reaction by ion-exchange chromatography using 5P Zerpagose HP (RNaghtasia Vioyesny) as an ion-exchange resin.

Реакционную смесь наносят на колонку(2,5мг/мл ионобменной смоль)) и не вступивший в реакциюThe reaction mixture is applied to the column (2.5 mg/ml ion exchange resin)) and the unreacted

МеРЕС;: злюируют стартовьм буфером А(З обьема колонки, 20мм фосфата натрия, рН 7,2, 1595 глицерина). Затем злюируют МеРЕС-МОаЮБ-коньюгат с помощью линейного градиента(от 095 до 3095) конечного буфера В(10 обьемов колонки) (1М Масі в буфере А). Злюат исследуют при 280нм. Фракции, содержащие полиМеРЕС-МООЕ-коньюгат, обьединяют, концентрируют и стерилизуют фильтрованием.MeRES;: diluted with starting buffer A (C column volume, 20 mm sodium phosphate, pH 7.2, 1595 glycerol). Then, the MeRES-MOaYUB-conjugate is eluted using a linear gradient (from 095 to 3095) of final buffer B (10 column volumes) (1M mass in buffer A). Zluat is examined at 280nm. Fractions containing polyMeRES-MOOE conjugate are combined, concentrated and sterilized by filtration.

Очищенньій поли-МеРЕС-МОаОЕ-коньюгат анализируют с помощью 5ЕС НРІ С при использований гель-фильтрационньхх колонок Т5К-СЕЇ 640005МУХІ и 6200054МУХІ, обьединенньх в серии. Белки вьБявляют по поглощению в ультрафиолете при 280нм. В качестве маркеров молекулярной массь глобулярньїх белков используют гель-фильтрационнье стандарть! ВІО-НАЮ.The purified poly-MeRES-MOaOE-conjugate is analyzed with the help of 5ES NRI C using T5K-SEI gel filtration columns 640005MUHI and 6200054MUHI, combined in series. Proteins are visible by absorption in the ultraviolet at 280 nm. A gel filtration standard is used as a marker of the molecular mass of globular proteins! VIO-NAYU.

Как можно видеть на фиг.17А, с помощью 5ЕС НРІС в препарате вьіявляются два основньх компонента(в примерном соотношении 2 к 1), причем их точки злюции соотносятся с глобулярньіми белками мол.массь! 370.9Кд и 155.0кД соответственно(см.также приведенную ниже Табл.в).As can be seen in fig. 17A, with the help of 5ES NRIS, two main components are revealed in the preparation (in an approximate ratio of 2 to 1), and their fusion points correspond to globular proteins of mol. mass! 370.9Kd and 155.0kD, respectively (see also Table c below).

Коньюгатьї РЕСО9, РЕС10 и РЕС12, полученнье путем ацилирования МО2ЮОЕ с сукцинимидированньми зфирами МеРЕсСз мол.массь 6 - 50кД, исследуют аналогичньім образом. Основнье параметрь реакций, используемьїх для получения соответствующих препаратов, приведень! в Таблице 7.Conjugates РЕСО9, РЕС10 and РЕС12, obtained by acylation of МО2ХОЕ with succinimidated MeРЕСС mol.mass 6 - 50 kD, are studied in a similar manner. The main parameters of the reactions used to obtain the corresponding drugs are shown! in Table 7.

Результать! исследований полученньїх коньюгатов с помощью 5ЕС НРІ С приведень! в Таблице 8. 12.2 Получение поли-МеРЕС-МОаОЕ-коньюгатов путем алкилирования МООЕ с альдегидами МеРЕС в восстановительньїх условияхThe result! studies of the obtained conjugates with the help of 5ES NRI C prevants! in Table 8. 12.2 Preparation of poly-MeRES-MOaOE conjugates by alkylation of MOOE with MeRES aldehydes under reducing conditions

Получение поли-МеРЕС(2ОКА)-МОарЕ-коньюгатає(РЕС20)Preparation of poly-MeRES(2OKA)-MOaRe-conjugates (RES20)

К охлажденному(4"С), перемешанному раствору МОНЕ (2мл, 2,5мг/мл) в 100мм фосфате натрия, рН 5, содержащему 20мм МасмМвнзЗ, добавляют 10-кратньй молярньй избьток монометокси- полизтиленгликолевого альдегида(МеРЕС)(средняя мол.масса 20кД) и перемешивание реакционной смеси продолжают при той же температуре.A 10-fold molar excess of monomethoxy-polyethylene glycol aldehyde (MeRES) (average molar mass) is added to a cooled (4" C), mixed solution of MONE (2 ml, 2.5 mg/ml) in 100 mm sodium phosphate, pH 5, containing 20 mm MasmMvnzZ 20 kD) and stirring of the reaction mixture is continued at the same temperature.

Степень модификации белка в процессе реакции контролируют с помощью 5ЕС НРІС при использований колонки Зирегаєх НА 10/30(Рнаптасіа Віоїесп). Злюцию проводят 0,1М натрий-фосфатньм буфером при рн 6,9 и скорости потока 0,7мл/ мин.The degree of modification of the protein during the reaction is controlled with the help of 5EC NRIS when using a Zyregakh NA 10/30 column (Rnaptasia Vioyesp). The solution is carried out with 0.1 M sodium phosphate buffer at a pH of 6.9 and a flow rate of 0.7 ml/min.

Через 16 часоф исследование реакционной смеси методом 5ЕС НРІ С показьіаєт, что более, чем 9095 первоначального количества белка модифицировано. В зто время концентрация белка в реакционной смеси устанавливают на мг/мл, разбавляя ее стерильной водой, а рН доводят до 4 добавлением 0,5М уксусной кислоть!.After 16 hours, the study of the reaction mixture by the 5ES NRI C method shows that more than 9095 of the original amount of protein has been modified. At the same time, the protein concentration in the reaction mixture is set to mg/ml by diluting it with sterile water, and the pH is adjusted to 4 by adding 0.5M acetic acid!.

МеРЕС-МОаОР-коньюгат отделяют от избьтка МеРЕСї и других побочньїх продуктов реакции путем ионобменной хроматографии при использований 5Р Зерпагозе НР(РНагттасіа Віоїеснй) в качестве ионобменной смольі.The MeRES-MOaOR conjugate is separated from the excess of MeRES and other by-products of the reaction by ion exchange chromatography using 5P Zerpagose HP (RNaghtasia Vioyesny) as an ion exchange resin.

Реакционную смесь наносят на колонку(2,5мг/мл смоль), и не вступивший в реакцию МеРЕгЕС злюируют стартовьм буфером А(З обьема колонки, 20мм фосфата натрия, рН 7,2, 1595 глицерина). ЗатемThe reaction mixture is applied to the column (2.5 mg/ml of resin), and unreacted MeREgES is diluted with starting buffer A (C column volume, 20 mm sodium phosphate, pH 7.2, 1595 glycerol). Then

МеРЕС-МаргвР-коньюгат злюируют с помощью линейного градиента(от 095 до 3095) конечного буфера В(10 обьемов колонки) (1М Мас! в буфере А). Злюат исследуют при 280нм. Фракции, содержащие поли-The MeRES-MargVR conjugate is eluted using a linear gradient (from 095 to 3095) of final buffer B (10 column volumes) (1 M Mass in buffer A). Zluat is examined at 280nm. Fractions containing poly-

МеРЕС-МОаОг-коньюгат, обьединяют, концентрируют и стерилизуют фильтрованием.MeRES-MOaOg-conjugate, combine, concentrate and sterilize by filtration.

Очищенньій поли-МеРЕС-МОаОЕ-коньюгат анализируют с помощью 5ЕС НРІ С при использований гель-фильтрационньх колонок Т5К-С2ЕЇ 640005М/УХІ и 62000 5МУХІ, обьединенньїх в серии. Белки вьБявляют по поглощению в ультрафиолете при 280нм. В качестве маркеров молекулярной массь глобулярньїх белков используют гель-фильтрационнье стандарть! ВІО-НАЮ.The purified poly-MeRES-MOaOE-conjugate is analyzed with the help of 5ES NRI C using gel filtration columns T5K-S2EI 640005M/UKHI and 62000 5MUHI, combined in series. Proteins are visible by absorption in the ultraviolet at 280 nm. A gel filtration standard is used as a marker of the molecular mass of globular proteins! VIO-NAYU.

Как можно видеть на фиг.17В, с помощью 5ЕС НРІС в препарате вьявляется два основньх компонента(б529ю и 4795 от общего количества белка) причем их точки злюции соотносятся с глобулярньми белками мол.массьи 359.4кД и 159.3кД соответственно(см. также приведенную нижеAs can be seen in Fig. 17B, with the help of 5ES NRIS, two main components are detected in the preparation (b529 and 4795 of the total amount of protein), and their fusion points correspond to globular proteins of molecular mass 359.4 kD and 159.3 kD, respectively (see also below

Табл.в8).Table c8).

Коньюгать! РЕС 18, РЕЯ 19 и РЕЯ 21, полученнье путем восстановительного алкилирования МООЕ с альдегидами МеРЕСь мол.массьй б - 25кД, исследуют аналогичньм образом. Основнье параметрь! реакций, используемьх для получения соответствующих препаратов, приведень в Таблице 7.Conjugate! RES 18, REIA 19 and REIA 21, obtained by reductive alkylation of MOOE with aldehydes MeRES mol. mass b - 25 kD, are studied in a similar manner. The main parameter! the reactions used to obtain the corresponding preparations are given in Table 7.

Результать! исследований полученньїх коньюгатов с помощью 5ЕС НРІ С приведень! в Таблице 8. 12.3. Получение коньюгатов МЕОЕ с монометоксиполизтиленгликолем путем его соединения с альфа- аминоостатком на М-терминальном участсе МЕОЕThe result! studies of the obtained conjugates with the help of 5ES NRI C prevants! in Table 8. 12.3. Preparation of MEOE conjugates with monomethoxypolyethylene glycol by connecting it with an alpha-amino residue on the M-terminal part of MEOE

Получение топо-РЕС(20кД)-МООБ-коньюгата(РЕСТ16)Preparation of topo-RES(20kD)-MOOB-conjugate (REST16)

К охлажденному(4"С), перемешанному раствору МОНЕ (2мл, 2,5мг/мл) в 100мм фосфате натрия, рН 5, содержащему 20мм МасмМВНз, добавляют Б5-кратньй молярньй избьток монометокси- полизтиленгликолевого альдегида(МеРЕС) (средняя мол.масса 20кД) и перемешивание реакционной смеси продолжают при той же температуре.To a cooled (4"C), mixed solution of MONE (2 ml, 2.5 mg/ml) in 100 mm sodium phosphate, pH 5, containing 20 mm MassmMVNz, add a B5-fold molar excess of monomethoxy-polyethylene glycol aldehyde (MeRES) (average molar mass 20 kD) and stirring of the reaction mixture is continued at the same temperature.

Степень модификации белка в процессе реакции контролируют с помощью 5ЕС НРІС при использований колонки Зирегдех 200 НА 10/30(РНнаптасіа Віоїесп). Злюцию проводят 0,1М натрий- фосфатньм буфером при рн 6,9 и скорости потока 0,7мл/мин.The degree of protein modification during the reaction is controlled with the help of 5EC NRIS when using the column Zyregdeh 200 NA 10/30 (RNnaptasia Vioyesp). The solution is carried out with 0.1 M sodium phosphate buffer at a pH of 6.9 and a flow rate of 0.7 ml/min.

Через 16 часов исследование реакционной смеси методом 5ЕС НРІ С показьгает, что более, чем 9095 первоначального количества белка модифицировано. В зто время концентрацию белка в реакционной смеси уменьшают на імг/мл, разбавляя ее стерильной водой, а рН доводят до 4 добавлением 0,5М уксусной кислоть!.After 16 hours, the study of the reaction mixture by the 5ES NRI C method shows that more than 9095 of the original amount of protein has been modified. At the same time, the protein concentration in the reaction mixture is reduced by mg/ml by diluting it with sterile water, and the pH is adjusted to 4 by adding 0.5M acetic acid.

Моно-МеРЕС(20кд)-МЕОБ-коньюгат отделяют от избьтка МеРЕсьь и других побочньїх продуктов реакции путем ионобменной хроматографии при использований 5Р Зерпагозе НР(РНаттасіа Віоїесі) в качестве ионобменной смольі.Mono-MeRES(20kd)-MEOB-conjugate is separated from the excess of MeRES and other by-products of the reaction by ion-exchange chromatography using 5R Zerpagose HP (RNattasia vioiesi) as an ion-exchange resin.

Реакционную смесь наносят на колонку(2,5мг/мл смоль/ї) и не вступивший в реакцию МеРЕеСї злюируют стартовьмм буфером А(З обьема колонки, 20мм фосфата натрия, рН 7,2, 1595 глицерина).The reaction mixture is applied to the column (2.5 mg/ml resin/s) and unreacted MeReSi is eluted with starting buffer A (C volume of the column, 20 mm sodium phosphate, pH 7.2, 1595 glycerol).

Затем МеРЕС-МОаЮЕ-коньюгат злюируют с помощью линейного градиента(от 095 до 2595) конечного буфера В(20 обьемов колонки) (1М Масі в буфере А). Злюат исследуют при 280нм. Фракции, содержащие поли-МеРЕС-МООРЕ-коньюгат, обьединяют, концентрируют и стерилизуют фильтрованием.Then MeRES-MOAUE-conjugate is eluted using a linear gradient (from 095 to 2595) of final buffer B (20 column volumes) (1M mass in buffer A). Zluat is examined at 280nm. Fractions containing poly-MeRES-MOORE-conjugate are combined, concentrated and sterilized by filtration.

Гомогенность моно-МеРЕС-МООР-коньюгата подтверждают гельзлектрофорезом в полиакриламидном геле в присутствиий 505 при использованиий 4 - 2095 градиентного геля фирмь! МОМЕХ.The homogeneity of the mono-MeRES-MOOR-conjugate is confirmed by gel electrophoresis in a polyacrylamide gel in the presence of 505 when using 4 - 2095 gradient gel firms! MOMEH.

Вьявляют одну главную полосу, соответствующую белку с мол.массой 46,9кКД.One main band corresponding to a protein with a molar mass of 46.9 kKD is revealed.

Очищенньій поли-МеРЕС-МОаОЕ-коньюгат анализируют с помощью 5ЕС НРІ С при использований гель-фильтрационньх колонок Т5К-С2ЕЇ 640005М/УХІ и 62000 5МУХІ, обьединенньїх в серии. Белки вьБявляют по поглощению в ультрафиолете при 280нм. В качестве маркеров молекулярной массь глобулярньїх белков используют гель-фильтрационнье стандарть! ВІО-НАЮ.The purified poly-MeRES-MOaOE-conjugate is analyzed with the help of 5ES NRI C using gel filtration columns T5K-S2EI 640005M/UKHI and 62000 5MUHI, combined in series. Proteins are visible by absorption in the ultraviolet at 280 nm. A gel filtration standard is used as a marker of the molecular mass of globular proteins! VIO-NAYU.

Как можно видеть на фиг.17С, с помощью 5ЕС НРІС в препарате вьіявляется один основной компонент, причем его точка злюции соответствуєет глобулярному белку мол.массь! 181.1кД(см. такжеAs you can see in Fig. 17C, with the help of 5EC NRIS, one main component is detected in the preparation, and its fusion point corresponds to a globular protein of mol. mass! 181.1 kD (see also

Табл.9).Table 9).

Моно-МеРЕС-МООЕБ-коньюгать РЕС14, РЕС15 и РЕС17, полученнье путем восстановительного алкилирования МООЕ с альдегидами МеРЕСїь мол.массьі б - 25кД, исследуют аналогичньім образом.Mono-MeRES-MOOEB-conjugates РЕС14, РЕС15 and РЕС17, obtained by reductive alkylation of MOOE with MeRES aldehydes of molar mass b - 25 kD, are studied in a similar manner.

Основньсе параметрь! реакций, используемьх для получения соответствующих препаратов, приведень! вThe main parameter! the reactions used to obtain the corresponding drugs, give them! in

Таблице 7.Table 7.

Результать! исследований полученньїх коньюгатов с помощью 5ЕС НРІ С приведень! в Таблице 9.The result! studies of the obtained conjugates with the help of 5ES NRI with the results! in Table 9.

Таблица 7Table 7

Параметрь! реакций модификациий МЕОЕParameter! reactions of MEOE modifications

Реагент МеРЕСMeRES reagent

Конц о МолярноеKonz about Molyarnoye

РЕСО | МНб-зфир | вбкд | 25 | 8 | ком. | 05 | 15RESO | Mnb-zphyr | vbkd | 25 | 8 | com. | 05 | 15

РЕСТО | МНб-зфир | вбкд | 25 | 8 | ком. | 05 | 10RESTAURANT | Mnb-zphyr | vbkd | 25 | 8 | com. | 05 | 10

РЕС1 | мМНб-зфир | год | 25 | 8 | ком. | 05 | 0RES1 | mmNb-zphyr | h | 25 | 8 | com. | 05 | 0

РЕСТ2 | МНб-зфир | Бод | 25 | 8 | ком. | 05 | 5REST2 | Mnb-zphyr | Bod | 25 | 8 | com. | 05 | 5

РЕС14 | альдеид | бід | 25 | 5 | 4 | 16 | 5RES14 | aldehyde | trouble | 25 | 5 | 4 | 16 | 5

РЕС 15RES 15

РЕС 16RES 16

РЕС 17RES 17

РЕС18 | альдеид | бід | 5 | 5 | 4С | 16 | 0RES18 | aldehyde | trouble | 5 | 5 | 4C | 16 | 0

РЕС 19RES 19

РЕС 20RES 20

РЕС 21RES 21

Таблица 8Table 8

Характеристики поли-МеРЕС-МООР, полученнье 5ЕС НРІ СCharacteristics of poly-MeRES-MOOR, obtained by 5EC NRI S

МеРЕС Мол.вес по ЗЕС, кД рве | кнвзаю вдо Г-- «5 « | воля рвето | нене | вдо С 5 ее ЛУ р вв 370,9 7771117117168 ее) МНвафир 155 865,6 бе. | о Мобзфир 68. 777846 | ...ЙЮЙЮюЮюЮюЮюЮюЮбИсс;2 реетв | альт | вдо С а 5 | «0 Я о 218,4MeRES Mol. weight for ZES, kD rve | knvzayu vdo G-- «5 « | the will is torn | nene | wdo C 5 ee LU r vv 370.9 7771117117168 ee) MNwafir 155 865.6 be. | about Mobzfir 68. 777846 | ...YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY alto | widow S a 5 | "0 I at 218.4

ЕВ В тов, 359,4EV V tov, 359.4

Гео по 1593Geo after 1593

РЕС 21 450,5RES 21 450.5

1Г11117Т11111111111мвя |в1G11117T11111111111mvya |v

Таблица 9Table 9

Приблизительнье молекулярньсе веса коньюгатов моно-МеРЕС-МООЕApproximate molecular weight of mono-MeRES-MOOE conjugates

РЕШІ4 | альдемд,ї | бід | 7777/4457 | 77777727 12.4.Получение бімеРЕС(12кД)-МЕОБ-коньюгатов путем алкилирования МОБ с альдегидом метокси-полизтилегликоля(РЕС20) в восстанавливающих условияхREMAINS4 | aldemd,i | trouble | 7777/4457 | 77777727 12.4. Obtaining bimeRES(12kD)-MEOB-conjugates by alkylation of MOB with methoxy-polyethylglycol aldehyde (RES20) in reducing conditions

Описанная ниже методика приводит к получению очищенного соединения, назьяваемого здесь РЕС22.The technique described below leads to the production of a purified compound, called here РЕС22.

Б-кратньй избьток альдегида метоксиполизтиленгликоля(МеРЕс, например, ОНС-(СНг)260-(СНе-B-fold excess of methoxypolyethylene glycol aldehyde (MePEs, for example, ОНС-(CHg)260-(СНе-

СНгО)п-СНз(где п повторяеєется столько раз, чтобьії мол.масса составляла около 12кД) (ЗПпеагмайсегCHgO)p-CHz (where p is repeated so many times that the molar mass was about 12kD) (ZPPeagmaiseg

Роїутегв) добавляют к 2,5мг/мл раствора МЕОК(полученного в Е.соїї, 1-163) в 100мм ацатата натрия, рН 5, охлажденного до 5"С. После 10-минутного перемешивания добавляют соответствующее количество цианоборогидрида натрия(Аїагісі), чтобь его концентрация в реакционной смеси составила 20мМ.Roiutegv) are added to a 2.5 mg/ml solution of MEOK (obtained in E. soya, 1-163) in 100 mm of sodium acetate, pH 5, cooled to 5"C. After 10 minutes of mixing, an appropriate amount of sodium cyanoborohydride (Ayagisi) is added. so that its concentration in the reaction mixture was 20 mM.

Полученную смесь перемешивают в течениє 16 часов при температуре 570. По окончаний указанного периода времени концентрацию МОЮЕ устанавливают на уровне мг/мл путем добавления в достаточной степени очищенной водьї. Затем смесь фильтруют через вакуумньйй фильтр с размером пор 0,2 микрона.The resulting mixture is stirred for 16 hours at a temperature of 570. At the end of the indicated period of time, the concentration of MOYUE is set at the level of mg/ml by adding sufficiently purified water. Then the mixture is filtered through a vacuum filter with a pore size of 0.2 microns.

По указанной методике получают 9Омг реакционного продукта. К смеси, содержащей реакционньй продукт, добавляют небольшие количества растворов 1,0М одноосновного фосфата и 1 М гидроксида натрия, чтобь! получить раствор, содержащий 10мм фосфата при рН 6,8.According to the specified method, 9 Ω of the reaction product is obtained. Small amounts of 1.0 M monobasic phosphate and 1 M sodium hydroxide solutions are added to the mixture containing the reaction product so that! to obtain a solution containing 10 mm of phosphate at a pH of 6.8.

Коньюгат очищают на катионобменной колонке. Готовят 40-мл колонку, заполненную 5Р-Сефарозой для хроматографии вьісокого разрешения, длиною 7,5см. Колонку уравновешивают соответствующим буфером(1Омм фосфат, рН 6,8, 1595 глицерина). Колонку загружают 2,2мг/мл смоль! при скорости потока 0,15 обьемов колонки(СМ) в минуту. Затем колонку промьшвают уравновешивающим буфером до достижения нулевой точки отсчета. Колонку злюируют лтнейньм градиентом от буфера А(10 обьемов колонки, 20мм фосфат, рН 7,2, 1595 глицерина) к буферу В(буфер А и 0,3М Масі). Скорость потока поддерживается на уровне 0,15 СУ. Злюат исследуют при 280нм.The conjugate is purified on a cation exchange column. Prepare a 40-ml column filled with 5P-Sepharose for high-resolution chromatography, 7.5 cm long. The column is equilibrated with the appropriate buffer (1 Ω phosphate, pH 6.8, 1595 glycerol). The column is loaded with 2.2 mg/ml of resin! at a flow rate of 0.15 column volumes (CM) per minute. Then the column is flushed with an equilibrating buffer until the zero reference point is reached. The column is diluted with a gradient from buffer A (10 column volumes, 20 mm phosphate, pH 7.2, 1595 glycerol) to buffer B (buffer A and 0.3 M Mass). The flow rate is maintained at the level of 0.15 SU. Zluat is examined at 280 nm.

Полиакриламиднье гели, содержащие 505, разделяют на фракции и те из них, которне содержат коньюгат СІРЕС, обьединяют и фильтруют через ячейку с размером пор 0,2 микрона.Polyacrylamide gels containing 505 are divided into fractions and those of them containing the SIRES conjugate are combined and filtered through a cell with a pore size of 0.2 microns.

Пример 13. Биологическая активность пзгированньїх молекул МЕООЕExample 13. Biological activity of the modified molecules of MEOOE

А. РЕС-9 - РЕС-12 и РЕС-14 - РЕС-21A. RES-9 - RES-12 and RES-14 - RES-21

Количество тромбоцитов у мьішей, обработанньїх рекомбинантньм МОЮ человека, отражено на фиг.18. Полученньй в клетках СНО МОР (22-353) (открьїтье звездочки), непогированньй МОБ, полученньй в Е.соїї(22-184) (незакрашеннье кружки) и пзгированньій МОЮОРЕ, полученньй в Е.соїї(22-184) (закрашеннье кружки) в концентрациях, указанньїх в описаний рисунков вьіше, вводили подкожно нормальньїм мьішам Ваїр/с раз в день в течение 5 дней. Через 24 часа после последнего введения брали контрольнье образць крови из небольшого бокового разреза хвостовой веньі. Анализь! клеток крови проводили при помощи злектронного анализатора клеток крови Зузтех(Вахіег Оідпозіїсв.Іпс. Ігміпе, СА).The number of platelets in the muscles treated with human recombinant MY is shown in Fig. 18. Obtained in CHO cells of MOR (22-353) (open asterisks), unfermented MOB obtained in E. soybean (22-184) (uncolored circle) and fermented MOYORE obtained in E. soybean (22-184) (filled circle) in the concentrations indicated in the figures described above, Vair/s was injected subcutaneously into normal muscles once a day for 5 days. 24 hours after the last injection, control blood samples were taken from a small lateral incision of the tail vein. Analysis! blood cells were analyzed with the help of an electronic blood cell analyzer Zuztech (Vakhieg Oidposiisv. Ips. Igmipe, SA).

Приведеньі средние данньюе по четььрем животньмм -/-стандартное отклонение. Данная обработка не оказьявала влиянияния на другие параметрь! клеток крови, такие как общее количество красньх и бельх клеток крови.Average data for four animals are shown -/-standard deviation. This treatment did not affect other parameters! blood cells, such as the total number of red and white blood cells.

Другие формь рекомбинантного МООЕ человека тестировали как описано вьше. Количество тромбоцитов у мьшей, получавших БОмкг/кг;/день или іОмкг/кг/день указанной формь пі-НимМаОР, приведено в Таблице 10. Представленнье значения являются средними по четьрем животньм и стандартнье ошибки дань курсивом.Other forms of recombinant human MOOE were tested as described above. The number of platelets in mice that received BOmkg/kg/day or iOmkg/kg/day of the specified form of pi-NimMaOR is shown in Table 10. The values presented are the average of four animals and the standard errors are given in italics.

Таблица 10 77711111 | БОмк/ктдень- значение(п-4 значение(п-4Table 10 77711111 | BOmk/ktday - value (n-4 value (n-4

Форма | 77/11! о сНнога2353 | 4343. | 309 | 2571 | юю всForm | 77/11! about сНнога2353 | 4343. | 309 | 2571 | yuyu all

І пзгл4 | 77773567, | 77.80 24ЮК/| 2 4Бж5фі 2020 | ..ЮюЮюрютєєзAnd pzgl4 | 77773567, | 77.80 24UK/| 2 4Bzh5fi 2020 | ..Yuyuyuyuryuteeez

7 пагті5 | 7774402 | 57 | 2834 | в паб | 73980777 | ...юЮю330 | юю 489 | вого7 pagti5 | 7774402 | 57 | 2834 | to the pub | 73980777 | ...yuyuyu330 | yuyu 489 | of

Точкаотсчета | (939,7... | ....ЮюЮюЙ25 2 щЩДЩщ | ЇЇReference point | (939.7... | ....ХХХХХХ25 2 шЩЩДЩЩ |

Ключ к таблице 10.Key to table 10.

В каждом случає молекулой МООЕ, которую подвергали пзгированию, бьіла полученная в Ес.соїї мМаре-11(амнокислоть! 22-184, при нумерации от сигнального пептида, или аминокислоть! 1-163, при нумерацмм от начала зрелого белка), как зто описано вьіше в Примере 12. пЗгО | полипагирован.7/ | бюд, | МНЗ-фирМеРЕо у пЗгл1о | полипоирован.7/ | вдо | 0 МН офирМеРво пЗгі4 | монопаирован./ | бюд, | альдейдМеРЕй пЗгі8 | полипагирован.// | бюд, | альдейдМеРЕйIn each case, the MOOE molecule that was subjected to fermentation was obtained in E. soya mMare-11 (amino acids! 22-184, when numbering from the signal peptide, or amino acids! 1-163, when numbering from the beginning of the mature protein), as described more in Example 12. pZgO | polypaged.7/ | Bud, | MNZ-firMeREo in pZgl1o | polypoirovan.7/ | widow | 0 МН ofirMeRvo pZgi4 | monopairovan./ | Bud, | aldeidMeREy pZgi8 | polypagirovan.// | Bud, | AldeideMeRei

За точку отсчета принимали значения для нормальньх животньїх без введения какого-либо материала.Values for normal animals without the introduction of any material were taken as the reference point.

Очевидно, что погирование рекомбинантного МОБ человека не уменьшает его активности увеличивать количество тромбоцитов у животньх-реципиентов и может фактически увеличивать активность продукта Е.соїї 22-184 до активности, равной или даже большей активности продукта СНО 22- 353.It is obvious that ingestion of recombinant human MOB does not decrease its activity, increase the number of platelets in recipient animals, and may actually increase the activity of the E. soy 22-184 product to an activity equal to or even greater than the activity of the CHO 22-353 product.

Б. ПаГг-22B. PaHg-22

Результатьї, полученнье с ПЗГ-22, представлень на фиг.24. Примечательно, что нормализация количества тромбоцитов с ПЗГ-22 наступала на несколько дней раньше, чем с полноразмерньім полученньім в СНО МОРЕ ПЗГ-16 или ПОГ-17.The results obtained from PZG-22 are shown in fig.24. It is noteworthy that the normalization of the number of platelets with PZH-22 occurred a few days earlier than with full-scale reception of PZH-16 or POG-17 in SNO MORE.

Пример 14. Зкспрессия рекомбинантного МООЕ человека(1-163) в Е.соїїExample 14. Expression of recombinant human MOEE (1-163) in E. soybean

Для зкспрессии І-НИМОЮОЕ в Е.соїї с использованием оптимальньїх кодонов Е.соїї била химически синтезирована последовательность, кодирующая первье 163 аминокислоть! зрелого белка. Кроме того, последовательности ДНК, кодирующие аминокислоть! Метионин и Лизин, бьіли добавленьї к 5'-концу гена.For the expression of I-NIMOYUOE in E. soybean using the optimal codons of E. soybean, a sequence encoding the first 163 amino acids was chemically synthesized! mature protein. In addition, DNA sequences encoding amino acids! Methionine and Lysine were added to the 5'-end of the gene.

Таким образом, белок -НимМООР, состоящий из 165 аминокислот, начинался с Меїй-Г уз.Thus, the protein -NimMOOR, consisting of 165 amino acids, began with a Mei-H bond.

Последовательность зтого гена приведена на фиг.25.The sequence of that gene is shown in Fig.25.

Синтез гена І-НимМмОарЕ(1-163) проводили в несколько зтапов. Во-первьїх, с использованием оптимальньїх кодонов Е.соїї били химически синтезированьї комплементарнье олигонуклеотидь(длиной 60-70 пар оснований), представляющие фрагменть!, прилегающие к гену. Во время зтого синтеза кодонь для аминокислот Метионина и Лизина бьіли помещень на 5'-конец зрелого гена и стоп-кодон бьл помещен на 3'-конец гена. Кроме того, сайтьь узнавания ферментов рестрикции Хбвраї и Ніпаї! бьли помещень в близости к 5' и 3' концам гена соответственно и синтетический сайт связьівания рибосом бьл помещен на соответствующем расстоянии овьше от начального Метионина. Во-вторьх, бьли сгибридизованьі олигонуклеотидьї, комплементарнье каждому фрагменту гена. В третьих, зти индивидуальньюе синтетические фрагментьій гена бьли амплифицированьй в полимеразной цепной реакции. Вчетвертьїх, амплифицированнье фрагменть! субклонировали в соответствующий вектор. В- пятьїх, верифицировали последовательности субклонированньїх фрагментов. В-шестьїх, индивидуальнье фрагментьі лигировали вместе и субклонировали в соответствующий вектор, восстанавливая полноразмерньй ген -НиМарЕ(1-163). Наконец, верифицировали последовательность восстановленного гена.The synthesis of the I-NimMmOarE(1-163) gene was carried out in several stages. First, with the use of the optimal codons of E. soybean, a complementary oligonucleotide (60-70 base pairs long) representing a fragment adjacent to the gene was chemically synthesized. During this synthesis, codons for the amino acids Methionine and Lysine were placed at the 5'-end of the mature gene and a stop codon was placed at the 3'-end of the gene. In addition, there is a site for recognizing the restriction enzymes Khbvrai and Nipai! were located near the 5' and 3' ends of the gene, respectively, and the synthetic ribosome binding site was located at a corresponding distance above the starting methionine. Secondly, oligonucleotides complementary to each gene fragment were hybridized. Thirdly, these individual synthetic fragments of the gene were amplified in the polymerase chain reaction. Fourth, the amplified fragment! subcloned into the appropriate vector. In five, the sequences of subcloned fragments were verified. Sixth, individual fragments were ligated together and subcloned into the appropriate vector, restoring the full-length gene -NiMarE(1-163). Finally, the sequence of the restored gene was verified.

Синтетический фрагмент І-НИМООЕ гена, фланкированньій сайтами рестрикции Хваї и Ніпашй сб'и З" концов соответственно, содержал сайт связьвания рибосом, инициирующий кодон АТО, последовательность, кодирующую зрельій белок Меї-І уз -НИМООРЕ, и стоп-кодон.The synthetic fragment of the I-NIMOORE gene, flanked by the restriction sites of Khvai and Nipasha at the C ends, respectively, contained a ribosome binding site, the initiation codon of ATO, a sequence encoding the mature Mei-I protein -NIMOORE, and a stop codon.

Указанньй фрагмент бьл клонирован по сайтам Храі и НіпаПй! в лактозоиндуцируемьй вектор зкспрессии рАМО11. Вектор рАМа11 - зто низкокопийная плазмида с началом репликации, полученньм из рА100. Зкспрессирующая плазмида рАМа11 может бьіть получена из плазмидьї РСЕМ1656(депонированаThe indicated fragment was cloned on the sites Khrai and NipaPy! in the lactose-inducible pAMO11 expression vector. The pA11 vector is a low-copy plasmid with an origin of replication derived from pA100. The pAMA11 expressing plasmid can be obtained from the RSEM1656 plasmid (deposited

24 февраля 1994 в Американской коллекции культур клеток, АТС Я 69576) путем ряда направленньмх замен оснований при перекрьіваний олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции. Начиная с сайтаFebruary 24, 1994 in the American collection of cell cultures, ATS I 69576) by a number of directions of substitutions based on cross-linked oligonucleotides in the polymerase chain reaction. Starting with the site

ВаПШ(в плазмиде пара оснований й 180) непосредственно в 5'-нсаправлениий к промотору репликации плазмидь РеорВ и далеє по направлению к репликативнь/м генам плазмидь, замень! пар оснований бьіли таковь!:VaPSh (in the plasmid, the pair is based and 180) directly in the 5'-directed to the replication promoter of the ReorV plasmid and further in the direction of the replicative/m genes of the plasmid, replace! The base of the pair is white!:

Я пабів ВАМО11 пара весСЕМ1655 паразамененняая в вАМО11 2 204 ТА сіб й 428 АЛ сі в 509 се АТI pub VAMO11 para vesSEM1655 parazamennennaya in VAMO11 2 204 TA seb and 428 AL se in 509 se AT

Ж 617 -- вставка двух Ой;F 617 -- insertion of two Ohi;

Я 878 сок ТА я 980 ТА ов ж во4 ос АЛ 1004 Ат сівI 878 sok TA I 980 TA ov z vo4 os AL 1004 At siv

Я-1007 сю ТА 1028 АЙ ТА 104т соб ТА ж м/в ос ТА 1486 сс ТАI-1007 syu TA 1028 AI TA 104t sob TA same m/v os TA 1486 ss TA

Ж 2098 ве делеция парь: 2187 су ТАF 2098 ve deletion of pairs: 2187 su TA

Ж 2480 Ат ТА й 2499-2502 Авто ОТСАZh 2480 At TA and 2499-2502 Auto OTSA

ТСАС САсТ т 2842 тосвАос делеция паврь деостооTSAS САст t 2842 tosvAos deletion pavr deostoo

Кк 3435 ос Ап зав сс Ал ж зва3 АТ "ЧА й 4489-4512 -- вставка пар:Kk 3435 os Ap zav ss Al z zva3 JSC "CHA y 4489-4512 - insertion of pairs:

БАОСТСАСТАОТОТОСАССТОСАОBAOSTSASTAOTOTOSASSTOSAO

СТОВАСТОАТСАСАОСТОСАСОоТо (ВЕО1О МОБ: 30,31) с заменой последовательности ДНК между уникальньми сайтами Аай и Сіаї! следующим олигонуклеотидом: Аац(24358)STOVASTOATSASAOSTOSASOoTo (VEO1O MOB: 30,31) with replacement of the DNA sequence between the unique sites Aai and Siai! with the following oligonucleotide: Aac(24358)

СТСАТААТТТТТАААДААТТСАТТТОАСАААТОСТААААТТСТТ- 3 ТОСАСАСТАТТАААААТТТТТТААСТАААСТОТТТАСОАТТТТААСАА- -САТТААТАТТСТСААТТОТОАОСТСАСААТІТАТ З -СТААТТАТААСАСТТААСАСТООАСТОТТАААТАСвО 5STSATAATTTTTTAAADAATTSATTTOASAAATOSTAAAATTSTT- 3 TOSASASTATTAAAAAAATTTTTTAAASTAAASTOTTTASOATTTTTAASAA- -SATTAATATTSTSAATTOTOAOSTSASAATITAT WITH -STAATTATAASASTTAAAASTOOASTOTTAAATASvO 5

Сіа! (44438) (ЗЕО ІЮ МОБ: 32,33)Sia! (44438) (ZEO IU MOB: 32.33)

Зкспрессия /-НиМОаЮЕ, клонированного в рАМ(О11, направляеєтся синтетическим лактозо- индуцируемьм промотором, подобньїм Ре4, которьій имеет следующую последовательность: 5 БАСОТСТСАТААТТТТТААААААТТСАТТ ТОАСАААТОСТАА- "-АТТСТТОАТТААТАТТСТСААТТОТОАССТСАСААТТТАТСОАТ 3! (ЗЕО ІЮ МО: 34).The expression of /-NiMOaYUE, cloned in pAM(O11), is directed by a synthetic lactose-inducible promoter similar to Re4, which has the following sequence: 5 BASOTSTSATAATTTTTTTAAAAAAATTSATT TOASAAATOSTAA- "-ATTSTTOATTAATATTSTSAATTOTOASSTSSASAATTTATSOAT 3! (ZEO IU MO: 34).

Промотор Рз4 подавляется лактозньім репрессороміі ад), продуком гена ас Е.соїї.The Pz4 promoter is repressed by the lactose repressor and the product of the as gene of E. soybeans.

Затем плазмидой рАМа11---НІМООЕ трансформировали клетки Е.соїї штамма К-12, имеющие Іасід- аллель. Аллель Іасід представляет собой такую мутацию промотора Іасі, которая усиливает зкспрессиюThen, cells of E. soy strain K-12, having the Iacid allele, were transformed with the plasmid pAMA11---NIMOOE. The Iasid allele is a mutation of the Iasi promoter that enhances expression

І асі, что приводит к более строгому контролю зкспресии белка со строньі! промотора Ре4. Таким образом в клетках данного штамма в отсутствие лактозьї зкспрессия І-НИМООРЕ подавлена Гасі. При добавлений лактозьі связьуваниє І асі-белка с операционньм сайтом на промоторе Р5е4 снижается и начинаєтся транскрипция І-НиИМОаЮЕ с Ре4. Вспользованнье в данном примере клеткки-хозяева Е.соїї депонировань! под номером АМІМС Ж 69717 30 ноября 1994г.And asi, which leads to more strict control of protein expression from the outside! of the Re4 promoter. Thus, in the cells of this strain, in the absence of lactose, the expression of I-NIMOORE is suppressed by Gasi. When lactose is added, the binding of the I asi protein to the operational site on the P5e4 promoter decreases, and the transcription of I-NiIMOaUE with Re4 begins. The use in this example of the host cell of E. soybean deposits! under number AMIMS Zh 69717 on November 30, 1994.

Клетки Е.сої АТСС й 69717 трансформировали плазмидой рАМО11--НиМООЕ и вьращивали согласно следующему протоколу. Штамм Е.соїї инокулировали в бульон Лурии и инкубировали при 307 приблизительно 12 часов. Затем клетки асептически переносили в ферментор, которьій содержал среду следующего состава: 20г/л дрожжевого зкстракта; 3.4г/л лимонной кислоть!; 15г/л К"НнРО»Х; 15мл омE. soybean ATCC and 69717 cells were transformed with the plasmid rAMO11--NiMOEE and grown according to the following protocol. The E. soy strain was inoculated into Luria broth and incubated at 307 for approximately 12 hours. Then the cells were transferred aseptically to the fermentor, which contained a medium with the following composition: 20 g/l of yeast extract; 3.4 g/l citric acid!; 15 g/l K"HnRO"X; 15 ml om

Р2О00; бБг/л глюкозь; г/л Маоа5О2 х 7Н2О. Первая фаза процесса культивирования(раїсп-рпазе) продолжалась до тех пор, пока культура не достигала оптической плотности 5.0 -/- 1.0 при бО0Онм. Затем начиналась фаза подпитки(Тей-раїст) с подачи первой подпитьвающей средь(7ООг/л глюкозь!; 6,75г/ЛлР2О00; bBg/l glucose; g/l Maoa5O2 x 7H2O. The first phase of the cultivation process (raisp-rpase) continued until the culture reached an optical density of 5.0 -/- 1.0 at bO0Onm. Then the rehydration phase (Tey-raist) began with the introduction of the first rehydration medium (7OOg/L glucose!; 6.75g/L

МБО» х 7НгО). Скорость подпитки регулировали каждье два часа согласно установленному графику.MBO" x 7NhO). The rate of top-up was adjusted every two hours according to the established schedule.

Подача второй подпитьвающей средь(129г/л триптиказного пептина; 258г/л дрожжевого зкстракта) начиналась при достижении культурой оптической плотности 20-25 при бООнм. Подачу второй подпитьвающей средьі! поддерживали на постоянном уровне, тогда как подача первой подпитьвающей средьї продожала меняться. Температуру во время всего процесса ферментации поддерживали около 30"С. Значение рН в культуре поддерживали около 7 добавлениеєм кислотьї или щелочи. Желаемьй уровень растворенного кислорода поддерживали, изменяя скорость перемешивания и скорости подачи воздуха и кислорода в ферментор. Когда оптическая плотность культурьі достигала 57-63 при бООнм, начинали подачу третьей подпитьівающей средьі. Третью подпитьвающую среду(ЗООг/л лактозьї) вводили в ферментор с постояной скоростью тока; добавлениеє первой подпитьвающей средь! в зтот момент прекращали, а скорость подачи второй подпитьвающей средь! устанавливали на другом постоянном уровне. Ферментацию продолжали приблизительно десять часов с начала добавления третьей подпитьявающей средьі. По окончанию ферментации культуру охлаждали до 15 -/- 5"С. Клетки собирали центрифугированием. Полученную пасту фасовали и хранили при температуре ниже -6070.The supply of the second drinking medium (129 g/l trypticase peptin; 258 g/l yeast extract) began when the culture reached an optical density of 20-25 at bOOnm. Serving the second drinking Wednesday! was maintained at a constant level, while the supply of the first feeding medium continued to change. The temperature during the entire fermentation process was maintained at about 30°C. The pH value in the culture was maintained at about 7 by the addition of acid or alkali. The desired level of dissolved oxygen was maintained by changing the mixing speed and the air and oxygen supply rates into the fermenter. When the optical density of the culture reached 57-63 at bOOnm, the supply of the third feeding medium was started. The third feeding medium (ZOOg/l of lactose) was introduced into the fermenter at a constant flow rate; the addition of the first feeding medium was stopped at that moment, and the feeding rate of the second feeding medium was set at the second constant level. Fermentation continued for approximately ten hours from the beginning of the addition of the third drinking medium. At the end of the fermentation, the culture was cooled to 15 -/- 5"C. Cells were collected by centrifugation. The resulting paste was packaged and stored at a temperature below -6070.

Очистку рекомбинантного МОЮ, полученного в Е.соїї как описано вьіше, проводили следующим образом. 1800г клеточной пастьї суспендировали приблизительно в 18 литрах 10мм раствора ЗДТА и пропускали через гомогенизатор вьсокого давления при 15000 рвзі. Суспензию разрушенньїх клеток центрифугировали и осадок ресуспендировали в 10 литрах 1ї10мм ЗДТА. Суспензию центрифугировали и полученньій при 200д осадок солюбилизировали в 2 литрах буфера следующего состава: 10мм Тіз, 8М гуанидин гидрохлорид; 10мм дитиотрейтол, рН 8,7. Обьем данного раствора медленно доводили до 200 литров добавлением следующего раствора: 10мм САРБ; ЗМ мочевина; 3095 глицерин; Змм цистамин; 1мм цистейин, рН 10,5. Разбавленньй раствор медленно перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и рН доводили до 6,8. Затем раствор с доведенньім рН осветляли и наносили на 2-х литровую колонку СМ Зерпагозе, уравновешенную 10мм фосфат натрия, 1,5 М мочевина, 1595 глицерин, рН 6,8.Purification of recombinant MOI, obtained in E. soybean as described above, was carried out as follows. 1800 g of cell pulp was suspended in approximately 18 liters of 10 mm ZDTA solution and passed through a high-pressure homogenizer at 15,000 rpm. The suspension of destroyed cells was centrifuged and the sediment was resuspended in 10 liters of 1-10 mm ZDTA. The suspension was centrifuged and the precipitate obtained at 200 d was solubilized in 2 liters of buffer of the following composition: 10 mm Tiz, 8 M guanidine hydrochloride; 10 mm dithiothreitol, pH 8.7. The volume of this solution was slowly brought up to 200 liters by adding the following solution: 10 mm SARB; ZM urea; 3095 glycerin; Zmm cystamine; 1 mm cysteine, pH 10.5. The diluted solution was slowly stirred at room temperature for 16 hours and the pH was adjusted to 6.8. Then the solution with pH adjustment was clarified and applied to a 2-liter column of CM Zerpagose, balanced with 10 mm sodium phosphate, 1.5 M urea, 1595 glycerin, pH 6.8.

После загрузки колонку промьивали 10мм фосфат натрия, 1595 глицерин, рН 7,2. МООЕ злюировали градиентом хлорида натрия от 0 до 0,5 М, 10мм фосфат натрия, рн 7,2.After loading, the column was washed with 10 mm sodium phosphate, 1595 glycerol, pH 7.2. MOOE was diluted with a gradient of sodium chloride from 0 to 0.5 M, 10 mm sodium phosphate, pH 7.2.

Злюат концентрировали и заменяли буфер на 10мм фосфат натрия, рН 6,5 при помощи мембрань! с порогом оотсечения по молекулярному весу 10000. Концентрированньй раствор(около 2гмг/мл) обрабатьвали катепсином С(молярное соотношение 500 к 1) в течение 90 минут при подходящей температуре. Затем раствор наносили на 1,2-литровую колонку 5Р Нідп Репогтапсе ЗерпНагозе, уравновешенную 10мм фосфат натрия, 1595 глицерин, рН 7,2. МООЕ злюировали градиентом хлорида натрия от 0,1 до 0,25 М, 10мм фосфат натрия, рн 7,2.The slurry was concentrated and the buffer was replaced with 10 mm sodium phosphate, pH 6.5 with the help of membranes! with a molecular weight cut-off threshold of 10,000. The concentrated solution (about 2 mg/ml) was treated with cathepsin C (molar ratio 500 to 1) for 90 minutes at a suitable temperature. Then the solution was applied to a 1.2-liter column of 5R Nidp Repogtapse ZerpNagose, equilibrated with 10 mm sodium phosphate, 1595 glycerin, pH 7.2. MOOE was eluted with a gradient of sodium chloride from 0.1 to 0.25 M, 10 mm sodium phosphate, pH 7.2.

К злюату с колонки 5Р Нідп Репоптапсе Зерпагозе добавляли сульфат амммония до концентрации 0,6 М. Затем злюат наносили на 1,6-литровую колонку с Рпепуї! Тоуореаї!, уравновешенную 10мм фосфат натрия, 0,6 М сульфат аммония, рН 7,2. Пик МООЕ злюировали градиентом сульфата аммония от Об до 0Ammonium sulfate was added to the zluate from the 5P Nidp Repoptapse Zerpagose column to a concentration of 0.6 M. Then the zluate was applied to a 1.6-liter column with Rpepui! Touoreai!, balanced with 10 mm sodium phosphate, 0.6 M ammonium sulfate, pH 7.2. The MOOE peak was diluted with an ammonium sulfate gradient from Ob to 0

М, ТОмм фосфат натрия, рН 7,2.M, TOmm sodium phosphate, pH 7.2.

Злюат с Ріепу! Тоуореа!! концентрировали и заменяли буфер на 10мм Ті, 595 сорбитол, рН 7,5 при помощи мембрань с порогом отсечения по молекулярному весу 10000.Get angry with Riepu! Tauorea!! concentrated and replaced the buffer with 10 mm Ti, 595 sorbitol, pH 7.5 using membranes with a molecular weight cut-off of 10,000.

Пример 15. Биологические свойства І-НИМОаОН|(Е.соїї 1-163) іп мімоExample 15. Biological properties of I-NIMOaOH|(E. soii 1-163) ip mimo

Биологическую зффективность І-НИМОаЮК(Е.соїї 1-163), полученного как описано вьіше в Примере 14, оценивали на грьзунах. Нормальньм самкам мьшей ВаїЇр/с в течениє пяти последовательньїх дней вводили подкожно возрастающие дозьї --НИМООР. Дозьі варьировали от 15мкг/кг/день до 150Омкг/кг/ день.The biological effectiveness of I-NIMOaYUK (E.soyii 1-163), obtained as described above in Example 14, was evaluated on rodents. Normal female VaiYr/s mice were injected subcutaneously with increasing doses of --NIMOOR during five consecutive days. Doses varied from 15 μg/kg/day to 150 μg/kg/day.

Спустя 24 часа после последнего введения проводили подсчет клеток крови с использованием злектронного счетчика клеток(бузтех, Вахіеї). Наблюдалось линейное возрастание количества тромбоцитов, паралллельное логарифмическому возрастанию концентрации цитокина. В данной системе при дозе 1500мкг/кг/день количество тромбоцитов возрастало до 30095 по отношению к исходному. Другие показатели клеток крови, такие как количество красньїх и бельїх клеток или гематокрит, не менялись в ходе данной обработки.24 hours after the last administration, blood cells were counted using an electronic cell counter (Buztech, Vahiei). A linear increase in the number of platelets parallel to a logarithmic increase in cytokine concentration was observed. In this system, at a dose of 1,500 μg/kg/day, the number of platelets increased to 30,095 compared to the initial level. Other indicators of blood cells, such as the number of red and white cells or hematocrit, did not change during this treatment.

Крьісам вводили подкожно /-НИМаЮР(Е.соїї 1-163) в дозах Зб0Омкг/кг/день в течение 6 дней, затем у них брали тромбоцить! и определяли способность последних агрегировать в ответ на АЮР. Показано, что тромбоцить! обработанньїх животньїх практически неотличимь! от тромбоцитов контрольньїх животньх по чувствительности к агонисту тромбоцитов, АОР.Rats were injected subcutaneously with /-NIMAYUR (E. soyii 1-163) in doses of Zb0Omkg/kg/day for 6 days, then platelets were taken from them! and determined the ability of the latter to aggregate in response to AYUR. It is shown that thrombocyte! processed animals are practically indistinguishable! of platelets of control animals in terms of sensitivity to platelet agonist, AOR.

Оценивали также способность І-НиИМООЕ коррегировать тромбоцитопению, обусловленную химиотерапией и/или облучением. В данньїх опьїтах использовали карбоплатин, химиотерапевтический агент, способньй вьізьшшать у человека глубокую тромбоцитопению. В начале опьта мьшам Ваїр/с вводили подкожно по 1,25мг карбоплатина. Спустя 24 часа начинали ежедневнье иньекции 10Омкг/кг/деньThe ability of I-NiIMOOE to correct thrombocytopenia caused by chemotherapy and/or radiation was also evaluated. Carboplatin, a chemotherapeutic agent capable of causing profound thrombocytopenia in humans, was used in these opiates. At the beginning of the week, 1.25 mg of carboplatin was administered subcutaneously to Vair/s mice. After 24 hours, daily injections of 10 Ωkg/kg/day were started

І-НиМаОг(Е.соїї 1-163) или, в контроле, растворителя. К девятому дню количество тромбоцитов падало до 1595 от нормального у мьішей, получавших один растворитель, но оставалось в пределах нормь! у мьішей, получавших І-НИиИМаЮгЕ(см. фиг.20). В опьітах с облучением мьіши получали однократную дозу в 50брад гамма-облучения(цезиевьй источник). Зта сублетальная доза приводила к снижению числа тромбоцитов на 90925 к 11-му дню. Количество тромбоцитов не возвращалось к нормальному до 21-го дня. При введений облученньім мьішам с 1-го по 20-й день ежедневно по 100мкг/кг/день г-НИМОаОК(Е.соїї 1-163) уменьшение числа тромбоцитов бьіло менее резким и возвращение к их нормальному числу более бьістрьім, нежели у мьшей, получавших один растворитель(фиг.21). Для проверки І-НИМООЕ на модели острой и пролонгированной тромбоцитопениий, бьіла применена комбинация карбоплатина и облучения(фиг.22). В зтом случає количество тромбоцитов снижалось до крайне низких уровней(3-59о от нормьї) и большинство животнь!х(7/8) не переживали такой обработки. Однако, когда животньмм подкожно ежедневно вводили по 10Омкг/кг/день І-НИМООЕ в течение всего зксперимента, тромбоцитопения в значительной степени коррегировалась, возврат к исходному числу тромбоцитов происходил бьістрее и все получавшие г-I-NiMaOg (E. soii 1-163) or, in the control, solvent. By the ninth day, the number of platelets fell to 1,595 from normal in mice receiving one solvent, but remained within normal limits! in mice receiving I-NIyIMAYugE (see Fig. 20). In experiments with irradiation, mice received a single dose of 50 brads of gamma radiation (cesium source). This sublethal dose led to a decrease in the number of platelets by 90,925 by the 11th day. The number of platelets did not return to normal until the 21st day. When 100 μg/kg/day g-NIMOaOK (E.soyii 1-163) was administered to irradiated mice daily from the 1st to the 20th day, the decrease in the number of white platelets was less sharp and the return to their normal number was faster than in mice, receiving one solvent (Fig. 21). To check I-NIMOOE on models of acute and prolonged thrombocytopenia, a combination of carboplatin and irradiation was used (Fig. 22). In this case, the number of platelets decreased to extremely low levels (3-59% above normal), and most of the animals (7/8) did not undergo such treatment. However, when the animals were injected subcutaneously with 10 µg/kg/day of I-NIMOOE daily during the entire experiment, thrombocytopenia was corrected to a large extent, the return to the initial number of platelets occurred faster, and all those receiving g-

НимаоЕ животнье (8/8) вьіживали.All animals (8/8) survived.

І-НиМаОЕ проверяли также на макаках резус. Нормальньм макакам резус вводили подкожно препарат І-НИМООЕ в дозах 2,5 или 25мкг/кг/день в течение десяти дней(дни 0-9). В группе, получавшей низкую дозу, количество тромбоцитов возросло до 40095 от нормь! к 12-му дню, а в группе, получавшей вьісокую дозу, увеличениє составило 70095 также к 12-му дню. По окончаний иньекций количество тромбоцитов возвращалось к норме к 25-30-му дню. Данная обработка не влияла на количество бельх и красньїх клеток крови.I-NiMaOE was also tested on rhesus macaques. Normal rhesus macaques were injected subcutaneously with the drug I-NIMOOE in doses of 2.5 or 25 μg/kg/day for ten days (days 0-9). In the group that received a low dose, the number of platelets increased to 40,095, which is normal! by the 12th day, and in the group receiving a high dose, the increase was 70,095 also by the 12th day. After the injections, the number of platelets returned to normal by the 25th-30th day. This treatment did not affect the number of white blood cells and red blood cells.

І-НимМОбЕ бьл также проверен на модели приматов с острой тромбоцитопенией(фиг.23). Облучение животньіх(70Орад, цезиевьй источник) приводило к снижению числа тромбоцитов до 1-295 от нормь! к 15- му дню. На 35-40-й день число тромбоцитов возвращалось к норме. У облученньїх животньх, которьім вводили І-НИМарЕ(25мкг/кг/день), количество тромбоцитов снижалось только до 1095 от нормь и в среднем не опускалось ниже 20000/мл, значения, при котором начинают трансфузию тромбоцитов людям, страдающим тромбоцитопенией. Возврат к нормальному числу тромбоцитов также происходил более бьістро у животньїх, получавших І-НИМООРЕ, и наступал на 20-й день.I-NimMObE was also tested on primate models with acute thrombocytopenia (Fig. 23). Irradiation of animals (70 Orad, cesium source) led to a decrease in the number of platelets to 1-295 of the norm! by the 15th day. On the 35th-40th day, the number of platelets returned to normal. In irradiated animals, which were injected with I-NIMarE (25μg/kg/day), the number of platelets decreased only to 1095 of the norm and on average did not fall below 20000/ml, the value at which platelet transfusions are started for people suffering from thrombocytopenia. The return to the normal number of platelets also occurred more quickly in animals receiving I-NIMOORE and occurred on the 20th day.

Приведенньюе данньюе зкспериментов іп мімо на грьзунах и приматах полностью поддерживают концепцию о том, что І-НИМООЕ(Е.соїї 1-163) является мощньім терапевтическим агентом, способньм значительно влиять на встречающиеся в клинике тромбоцитопении.The following experiments with mice and primates fully support the concept that I-NIMOOE (E.soyii 1-163) is a powerful therapeutic agent capable of significantly influencing thrombocytopenia encountered in the clinic.

Пример 16. Метод получения /-НИМООР(1-332) в культуре клеток СНОExample 16. Method of obtaining /-NIMOOR(1-332) in CHO cell culture

Гликозилированньй І-НиМООЕ 1-332 продуцируєтся трансфицированньми клетками СНО, зкспрессирующими кКДНК МО 1-332 под регуляцией подходящего промотора и соединенньй с геном, кодирующим амплифицируемьй селективньйй маркер, ОНЕАВ. Подходящим промотором для зкспрессийGlycosylated I-NiMOOE 1-332 is produced by transfected CHO cells, which express cDNA of MO 1-332 under the regulation of a suitable promoter and connections with the gene encoding the amplifiable selective marker, ONEAV. A suitable promoter for zxpressy

МОБ в клетках СНО являєтся промотор 5НА-аМа. См.Мо!.СеПІ.Віої. 8: 466- 472(1988) и патент МО 91/13160(1991). Подходящим вектором для зкспрессиий МООЕ в клетках является рОо5А-ана2. См. УМО 90/14363(1990). Клеточнье линии СНО могут продуцировать секретируемьій МОЮЕ в количестве 10-20мг/л в стандартной культуральной среде, но уровень продукции может бьіть повьішен от 25 до 100мг/л. При продукции МОЮЕ в типичной клеточной линии культура может бьіть "разогнана" пассажами в суспензиийи или на культуральньїх флаконах(в случає субстрат-зависимого роста) с использованием культуральной средьі, состоящей из равньхх количеств средьь Игла в модификации Дальбекко(їОМЕМ) и средьі! ХзмаThe promoter of 5НА-аМа appears in MOB cells. See. Mo!. SePI. Vioi. 8: 466-472 (1988) and patent MO 91/13160 (1991). A suitable vector for the expression of MOOE in cells is pO5A-ana2. See UMO 90/14363(1990). CHO cell lines can produce secreted MOUE in the amount of 10-20 mg/l in a standard culture medium, but the production level can be increased from 25 to 100 mg/l. During the production of MOUE in a typical cell line, the culture can be "dispersed" by passages in suspensions or on culture vials (in the case of substrate-dependent growth) using a culture medium consisting of equal amounts of Dulbecco's Needle medium (iOMEM) and medium! Khzma

Е12(ОМЕМ/Е12, (3ірсо) с добавлением от 5 до 1095 змбриональной телячьей сьіворотки(ЕВ5) или диализованной змбриональной телячьей сьіворотки и метотрексата(МТХ)(при необходимости; обьічная концентрация МТХ составляет 200-600нНМ) для поддержания селективного давления. В среду дожнь! бьть дополнительно добавленьі не-необходимье аминокислоть(МЕАА 5) и глутамин. Суспензионнье культурь! могут бьть наращень в пределах концентраций 1-4 х 10'клеток/мл(посевная концентрация) до приблизительно 1 миллион клеток/мл. При достижениий максимальной концентрации клеток производят пассаж культурь! путем разбавления до больших обьемов и достижения посевной концентрации.E12 (OMEM/E12, (3irso) with the addition of 5 to 1095 fetal calf serum (EB5) or dialyzed fetal calf serum and methotrexate (MTX) (if necessary; the usual concentration of MTX is 200-600 nM) to maintain selective pressure. On Wednesday after additional addition of a non-essential amino acid (MEAA 5) and glutamine. Suspension culture can be grown in the range of concentrations of 1-4 x 10 cells/ml (seed concentration) up to approximately 1 million cells/ml. When the maximum concentration is reached cells produce passage cultures by diluting to large volumes and achieving seed concentration.

При получений МООЕ в роллерньїх флаконах, подходящий обьем и плотность клеток в суспензионной культуре должньі! бьїть подобраньії с использованием спиннерньїх флаконов с магнитньми мешалками, помещенньїх в термостатированнье условия(37-ж/-1"С), или же с использованием автоматической контролируемой системь! с биореактором. Роллернье флаконь(например, флаконьї фирмь! Раїсоп площадью 850см?) должнь! засеваться клетками с посевньїми дозами от 1,5 до З х 107 клеток на флакон в таком количестве ростовой средь(ОМЕМ/Е12 с 5-1095 ЕВС, ІТХхМЕАА и 1х глутамин), которое обеспечивало бьї образование слитого монослоя на 3-4-й день культивирования(150-300мл). Ростовая среда должна бьть забуферена бикарбонатом натрия до рН 6,9-7,2 и уравновешена двуокисью углерода до парциального давления 60-90мм ртутного столба. Флаконь! должнь! бьіть заполненьі смесью 1095 СО»52 в воздухе и культурьї инкубируют при 37ч4/-1"С на роллерньїх аппаратах при скорости вращения около одного оборота в минуту в течение 3-4 дней. При достижений монослоя коллернье культурь! должнь! бьть переведень на бессьівороточную производственную среду. При зтом старую ростовую среду сливают или отсасьввают, культурьї промьітвают изотоническим буфером, например фосфатньім буферньім растворомWhen receiving MOOE in roller bottles, the appropriate volume and density of cells in the suspension culture must be! choose using spinner flasks with magnetic stirrers, placed in thermostatic conditions (37-Х/-1"С), or using an automatic controlled system! with a bioreactor. A roller flask (for example, a firm flask! Raisop with an area of 850 cm?) should sow cells with seeding doses from 1.5 to 3 x 107 cells per vial in such an amount of growth medium (OMEM/E12 with 5-1095 EVS, ITXxMEAA and 1x glutamine) that ensured the formation of a fused monolayer on the 3-4th day of cultivation (150-300 ml). The growth medium should be buffered with sodium bicarbonate to a pH of 6.9-7.2 and balanced with carbon dioxide to a partial pressure of 60-90 mm Hg. The bottle must be filled with a mixture of 1095 CO»52 in air and cultures are incubated at 37h4/-1"C on roller machines at a rotation speed of about one revolution per minute for 3-4 days. When a monolayer of culture is achieved! duty! of transfers to a whey-free production environment. At the same time, the old growth medium is drained or aspirated, the cultures are washed with an isotonic buffer, for example, a phosphate buffer solution

Дальбекко(0-РВ5), 50-100мл на флакон, затем добавляют соответствующий обьем забуференной бикарбонатом бессьвороточной средьї ОМЕМ/Е12(1:1)(Х200-300мл на флакон) с добавлением МЕАА, глутамина и сульфата меди(1-20мМкМ) для минимизации ковалентной агрегации. Флаконь! заполняют газовой смесью(1095 СО» в воздухе) и инкубируют б -/- 1 дней при 37"С на роллерньх аппаратах(-1об/мин) или же до такого момента, когда в результате метаболизма клеток уровень глюкозь в среде опустится ниже 0,5г/л и/или значение рН опустится ниже 6,6. Кондиционированную среду сливают или отсасьшвают из флаконов и заменяют свежей бессьівороточной производственной средой указанного вьіше состава для получения дополнительньх сборов. Так может продолжаться до тех пор, пока клетки не смогут более переносить бессьівороточньсе уксловия и не начнут сползать с роллерньїх флаконов.Dulbecco (0-РВ5), 50-100 ml per vial, then add the corresponding volume of serum-free buffered bicarbonate medium OMEM/E12 (1:1) (X200-300 ml per vial) with the addition of MEAA, glutamine and copper sulfate (1-20 mM) for minimization of covalent aggregation. Bottle! fill with a gas mixture (1095 СО" in air) and incubate for -/- 1 day at 37"С on roller devices (-1 rpm) or until such a moment when, as a result of cell metabolism, the level of glucose in the medium drops below 0, 5 g/L and/or the pH value drops below 6.6. The conditioned medium is drained or aspirated from the vials and replaced with fresh serum-free production medium of the above composition to obtain additional collections. This may continue until the cells can no longer tolerate serum-free conditions and they won't start sliding off the roller bottles.

Собранную кондиционированную среду очищают микрофильтрацией через фильтрь! с размером пор 0,45 или 0О0,2мкм(Запопив Запобгап рН или раї).The collected conditioned medium is purified by microfiltration through a filter! with a pore size of 0.45 or 0О0.2μm (Zapopyv Zapobgap pH or Paradise).

Профильтрованную кондиционированную среду охлаждают до 4"С и хранят непродолжительное время при зтой температуре или немедленно концентрируют и диализуют против буфера с низкой ионной силой с использованием тангенциальной ультрафильтрационной системь(например, Бійоп МУМ-50).The filtered conditioned medium is cooled to 4"C and stored for a short time at this temperature or immediately concentrated and dialyzed against a buffer with low ionic strength using tangential ultrafiltration systems (for example, Biop MUM-50).

Ультрафильтрацию и диафильтрацию необходимо проводить при 4"С, чтобьї минимизировать деградацию белка. До хроматографической очистки кондиционированная среда должна бьть диализована против буферного раствора(например, 10мм фосфат калия, рН 6,8).Ultrafiltration and diafiltration must be carried out at 4"C to minimize protein degradation. Before chromatographic purification, the conditioned medium must be dialyzed against a buffer solution (for example, 10 mm potassium phosphate, pH 6.8).

Качество продукта, содержащегося в кондиционированной среде лучше всего контролировать при помощи 505-РАСЕ в невосстанавливающих условиях с последующим Вестерн-блоттингом, которьй может вьіявить количества агрегированного, мономерного и протеолитически деградированного МООЕ в образцах.The quality of the product contained in the conditioned medium is best controlled with the help of 505-RACE in non-reducing conditions followed by Western blotting, which can reveal the amount of aggregated, monomeric and proteolytically degraded MOOE in the samples.

Другой метод получения МОЮ в клетках СНО состоит в оадаптации клеточной линии, зкспрессирующей МОЮ, к бессьмвороточной среде, такой как Сірсо 5-5ЕМ ІІ. Клетки могут бьть адаптированьї серийньми пассажами на среде, содержащей минимум сьіворотки или не содержащей ее совсем. Если клеточная линия будет устойчиво расти на такой среде и продуцировать адекватнье количества секретируемого МООЕ, культивирование может продолжаться путем серийньїх пассажей, в возрастающих обьемах, затем клетки переносят в подходящий производственньій сосуд(автоматический контролируемьй биореактор) и культуре дают пролиферировать до достижения максимальной плотности, при которой клетки еще жизнеспособнь, при оптимальньх ростовьїх условиях(рнН, питательнье вещества, температура, кислород, разрушение клеток) В точке оптимальной продукции(которую определяют зкспериментально, замеряя количество и качество продукта) культуру собирают из биореактора, клетки удаляют из кондиционированной средьь микронной глубинной фильтрацией или субмикронной тангенциальной микрофильтрацией. В случаеє глубинной микронной фильтрации среда должна бьть впоследующем осветлена субмикронной конечной фильтрацией для концентрации и диализа, как зто описано вьіше.Another method of obtaining MOI in CHO cells consists in adapting a cell line that expresses MOI to a non-vertical medium, such as Sirso 5-5EM II. Cells can be adapted by serial passages in a medium containing a minimum of serum or not containing it at all. If the cell line will grow stably in such an environment and produce an adequate amount of secreted MOOE, cultivation can be continued by means of serial passages, in increasing volumes, then the cells are transferred to a suitable production vessel (automatically controlled bioreactor) and the culture is allowed to proliferate until reaching the maximum density at which cells are still viable, under optimal growth conditions (pH, nutrients, temperature, oxygen, cell destruction) At the point of optimal production (which is determined experimentally by measuring the quantity and quality of the product), the culture is collected from the bioreactor, the cells are removed from the conditioned medium by micron depth filtration or submicron tangential microfiltration. In the case of deep micron filtration, the medium should be subsequently clarified by submicron final filtration for concentration and dialysis, as described above.

Несмотря на то, что заявленное изобретениє описано вьше как в целом, так и в отношений конкретньїх вариантов осуществления, следуєт понимать, что модификации изобретения на основе приведенного оописания могут бьть воспроизведеньї любьм специалистом в данной области исследований. Таким образом, заявленнье пунктьі формульй в действительности охватьшвают все варианть! изобретения, входящие в его обьем.Despite the fact that the claimed invention is described above both in general and in relation to specific implementation options, it should be understood that modifications of the invention based on the above description can be reproduced by any specialist in this field of research. Thus, the statement of clauses and formulas actually covers all options! inventions included in the ego volume.

Кроме того, публикациий и другие информационньое источники, приведеннье для оценки уровня техники и лучшего понимания описания изобретения, в особенности для болеє подробного освещения практических вопросов, включень в материаль! заявки в качестве ссьлок.In addition, publications and other informational sources, provided for the assessment of the level of technology and better understanding of the description of the invention, especially for more detailed coverage of practical issues, inclusions in the material! applications as links.

Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (д ЗАЯВИТЕЛЬ: Вагіеу, Тітоїну 0.Sequence List (1) GENERAL INFORMATION: (d APPLICANT: Wagieu, Titoinu 0.

Водепбфегдег, Закор М.Vodeppfegdeg, Zakor M.

Воззеїтап, Кобегі А.Vozzeitap, Kobegi A.

Нип, РатеїаNap, Ratheia

Кілзйег, Сіаї В.Kilzieg, Siai W.

Затаї, Вабги В. (й) НАЗВАНИЄ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Способь и препарать для стимули- рования роста и дирференцировки мегакариоцитов. (й) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 34 (м) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ: (А) АДРЕСАТ: Атдеп Іпс. (В) УЛИЦА: 1840 Оепаміапа Огіме (С) ГОРОД: Тпоизапа Оаке (0)ШТтТАТ: Саїшйотіа (Е)СТРАНА: ШбА (Є) ПОЧТОВЬЙ КОД: 91320-1789 (м) ФОРМА ДЛЯ РАБОТЬ! С КОМПЬЮТЕРОМ: (А) НОСИТЕЛЬ ИНФОРМАЦИИ: Дискета (В) КОМПЬЮТЕР: ІВМ-совместимьй (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РО-О0О5/МЗ-0О5 (Б) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Раїепііп Кеівазе 91.0Zatai, Vabgy V. (y) TITLE OF THE INVENTION: Method and preparation for stimulating growth and differentiation of megakaryocytes. (j) NUMBER OF SEQUENCES: 34 (m) ADDRESS FOR CORRESPONDENCE: (А) ADDRESSEE: Atdep Ips. (B) STREET: 1840 Oepamiapa Ogime (C) CITY: Tpoizapa Oake (0) STATE: Saishyotia (E) COUNTRY: ShbA (E) ZIP CODE: 91320-1789 (m) FORM FOR WORK! WITH COMPUTER: (A) MEDIA: Floppy disk (B) COMPUTER: IVM-compatible (C) OPERATING SYSTEM: РО-О0О5/МЗ-0О5 (Б) SOFTWARE: Raiepiip Keivaze 91.0

Мегзіоп й 1.25 (мі) ТЕКУЩИЕ ДАННЬЕ ПО ЗАЯВКЕ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: (В) ДАТА ПОДАЧИ: (С) КЛАССИФИКАЦИЯ: (мії)йИнНФОРМАЦИЯ О ПРЕДСТАВИТЕЛЕ: (А) ИМЯ: Ссок, Кобеп В. (С) РЕФЕРЕНС/ДОКЕТ НОМЕР: А-290-С (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ ІЮ МО: 1: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 31 аминокислота (В) ТИП: аминокислота о (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: белокMegsiop and 1.25 (mi) CURRENT DATA ON THE APPLICATION: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (my)y INFORMATION ABOUT THE REPRESENTATIVE: (A) NAME: Ssok, Kobep V. (C) REFERENCE/ DOCKET NUMBER: A-290-C (2) SEQUENCE INFORMATION WITH IU MO: 1: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid o (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY : linear (y) MOLECULAR TYPE: protein

(хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ИО МО:1:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: 5EO IO MO:1:

Ага Рго Рго Аа Хаа Азр Рго Агд Ге (еч Авп Гуз Меї Геи Аго Азр 1 5 10 15Aha Rgo Rgo Aa Haa Azr Rgo Agd Ge (ech Avp Guz Mei Gei Ago Azr 1 5 10 15

Зег Ні Ма! Гец Ніз Хаа Агу Геч Хаа Сіп Хаа Рго Азр Ме Туг (2) ИНФОРМАЦИЯ ОО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕС ІЮ МО:2: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 аминокислота (В) ТИП: аминокислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ЇМОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: белок (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО І МО: 2:Zeg Ni Ma! Getz Niz Haa Agu Getz Haa Sip Haa Rgo Azr Me Tug (2) SEQUENCE INFORMATION OF ZES IU MO:2: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) NUMBER OF CHAINS: one ( 0) TOPOLOGY: linear (MOLECULAR TYPE: protein (xy) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE OF 5EO AND MO: 2:

Аа Рго Рго Аа Хаа Азр Рго Ага І ец Геу Азп Гуз Меї Геи Агу Азр 1 5 10 15Aa Rgo Rgo Aa Haa Azr Rgo Aga I ets Geu Azp Guz Mei Gei Agu Azr 1 5 10 15

Зег Ніз Ма! Ген Ніз 20 (4) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО: З; () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА; 17 аминосиклот (8) ТИП:аминокислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ; одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: белок (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 3:Zeg Niz Ma! Gen Niz 20 (4) INFORMATION ON THE SEQUENCE OF ZEO IO MO: Z; () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 17 aminocyclote (8) TYPE: amino acid (C) NUMBER OF CHAINS; one (0) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO IO MO: 3:

Тиг біп Гуз Сім Сіп Тпг Гуз Аа Сіп Азр Маї Ге Су Аа ма! діа 1 5 10 15 (5) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО І МО:4: (й ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 17 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕЯ ІО МО:4: ссМосМссМо СМТОУсА (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО: 5: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 парА оснований (В) ТИП: нуклеинованя кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (60) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮ МО:5:Tig beep Guz Sim Sip Tpg Guz Aa Sip Azr Mai Ge Su Aa ma! dia 1 5 10 15 (5) ZEO AND MO SEQUENCE INFORMATION:4: (and SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EIA IO MO:4: ssMosMssMo SMTOUsA (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO: 5: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 bp base (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (60) TOPOLOGY: linear (y) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: 5EO IU MO:5:

ОСАКТОУААС АСКТОМОАКТ СOSAKTOUAAS ASKTOMOAKT S

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО Ір МО:6: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 аминокислота (В)ТИП:аминокислота. (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: белок (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ : ЕС 10 МО: 6(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO Ir MO:6: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid. (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: EC 10 MO: 6

Аа Рго Рго Аа Суз Азр Ге Агу Ма! Ге Зег Гуз Геч Кей Ага 1 5 10 15Aa Rgo Rgo Aa Suz Azr Ge Agu Ma! Ge Zeg Guz Gech Kei Aga 1 5 10 15

Азр Зег Ніз Ма! І еи Ні 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ І МО:7: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 пара оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО І МО:7:Azr Zeg Niz Ma! И ей No 20 (2) INFORMATION ABOUT THE SEQUENCE OF ZE AND MO:7: () CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear ( xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: ZEO AND MO:7:

СТАСОССТТО ТАСАММММММ ТSTASOSTTO TASAMMMMMM T

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО І МО:8: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 пара оснований(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO AND MO:8: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs

(В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО І0 МО:8:(B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION ZEO I0 MO:8:

АСТТТАСТОА СОАСТовоАо (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ГО МО:9: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДПИНА: 30 пар оснований (Б) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОлЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: «ДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО:9; тІсвосСсСосА ТАсосо тт (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕСИО МО:10: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА; 29 пар оснований (8) ТИП; нуклеинованя кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК їх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІЮ МО:10: ттевоссСовА ТАсСсСсТттт ТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:11: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:ASTTTASTOA SOASTovoAo (2) INFORMATION ON THE SEQUENCE OF ZEO GO MO:9: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (y) MOLECULAR TYPE: "DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION ZEO IO MO:9; (2) SEQUENCE INFORMATION 5ESIO MO:10: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 29 pairs based (8) TYPE; nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE: cDNA their) SEQUENCE DESCRIPTION ZEO IU MO:10: ttevossovA TAССсСсТтттт TT (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO IO MO:11: () CHARACTERISTICS SEQUENCES:

ІА) ДЛИНА: 20 пар оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:11: тосоАСстТоС сАотТоСтсАо (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО: 12: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 23 парьі оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 12:IA) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (y) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO: 12: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear(s) MOLECULAR TYPE: cDNA ( xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE 5EO IO MO: 12:

САСТОСТСАС ТАДАСТОСТТ СОТSASTOSTSAS TADASTOSTT SOT

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІЮ МО: 13: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 20 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО І МО: 13:(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO IU MO: 13: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE : cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO AND MO: 13:

ССАСТСАСОА АОСАСТТТАСSSASTSASOA AOSASTTTAS

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:14; ()д ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 18 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:14:(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO:14; ()d SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO IO MO: 14:

ССТТТАСТТС ТАСоСсСстТо (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ І МО:15; () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 19 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (р) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК іїхі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:15:ССТТТАСТТС TAСоСсСстТО (2) INFORMATION ABOUT THE SEQUENCE OF ZE AND MO:15; () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (p) TOPOLOGY: linear (y) MOLECULAR TYPE: cDNA iihi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO 0 MO:15:

САООСТСАСАА аСАоСдоссА (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 10 МО: 16: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 19 пар оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОлЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО І МО: 16:SAOOSTSASAA aSAoSdossA (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 10 MO: 16: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (6) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE: cDNA(s) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO AND MO: 16:

СССАТАСТОС СобАССТСо (2) ИНФОРМАЦИЯ ОО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:17: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 19 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Об) ТОпПОлОгИиЯ: пинейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: ХДНК (хї) ОПИСАНИЕ ЛОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:17: тестостост тотТАоссте (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕС 0 МО:18: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 19 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧНСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Її) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО І МО:18:(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO:17: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (Ob) TOPOLOGY: pineal (y) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO 0 MO:17: testostost totTAosste (2) SEQUENCE INFORMATION 5ES 0 MO:18: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ( C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (His) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE OF ZEO AND MO:18:

ССАСОСААСОА ТТСАОбОбА (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ ІО МО:19: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 30 пар оснований (В) ТИП: нуклейиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (р) ТоОпоОлоОгиИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕД ІО МО:19:ССАСОСААСОА ТТСАОбОбА (2) INFORMATION ABOUT THE SEQUENCE FROM IO MO:19: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (p) ToOpoOloOgyIIA: linear (y) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE OF ZED IO MO:19:

СААСААсСТСОо АССОССАССС АСАСАСССссо (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:20: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 24 парьі оснований (В) ТИП: нуклейиновая кислота (С) КОЛИЧНСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО І МО:20СААСААсСТСОо АССОССАССС АСАСАССssso (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO IO MO:20: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear (i ) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO AND MO:20

ОСС бАТАС СССАСТОМММ МММТ (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:21; () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 пара оснований (8) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Б) ТОПОолЛОгИЯ: линейная (їй) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:21:ОСС бАТАС СССАСТОМMM МММТ (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO:21; () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (8) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (B) TOPOLOGY: linear (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5EO IO MO:21 :

ССАКТОХУААМ АСЕТОМСАКТ СSSAKTOHUAAM ACETOMSAKT S

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:22: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 16 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧНСТВО ЦЕПЕЙ: одна (р) ТОПОЛлОГИЯ: линейная(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO:22: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS: one (p) TOPOLOGY: linear

(б) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ 0 МО:22: ттестотТосА сто (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ І МО:23: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 20 пар оснований (В) ТИП: нуклеминовая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ії) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: ДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕС 0 МО:23:(b) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION OF ZE 0 MO:22: ttestotTosA sto (2) SEQUENCE INFORMATION OF ZE AND MO:23: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION 5ES 0 MO:23:

САСААСТОСА САССААССССSASAASTOSA SASSAAASSSS

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕС 10 МО:24: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 1342 парьі оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іх) ХАРАКТЕРИСТИКА: (д) имЯяЖжлюч: СОо5 (8) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 99..1094 (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕД Ю МО:24:(2) SEQUENCE INFORMATION 5EC 10 MO:24: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1342 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS: one (0) TOPOLOGY: linear(s) CHARACTERISTICS: (e) name: Соо5 (8) LOCALIZATION: 99..1094 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE OF ZED Y MO:24:

САСОБАСССА СОССАСССДА САСАССССОО ССАСДАТОСА ССТОАСТОАА тпоестостоо 60SASOBASSSA СОССАССДА САСАСССОО ССАСДАТОСА ССТОАСТОАА tpoestostoo 60

ТОСТСАТОСТ ТСТОСТААСТ ЗСААСОСТАА СОСТОТоС АОС ССО ост осСТосСтТ 113TOSSATOST TSTOSTAAST ZSAASOSTAA SOSTOTOS AOS SSO ost osSTosStT 113

Зег Рго Аа Рго Рго 1 5Zeg Rgo Aa Rgo Rgo 1 5

ОСТ ТОТ САС СТО СА СТО СТО АСТ ААА СТО СТ СОТ САС ТоС САТ СтоOST TOT SAS STO SA STO STO AST AAAA STO ST SOT SAS ToS SAT Sto

Аа Суз Азр Ге Ага Маї Ге Зег Гуз Геи Ге Агу Азр Зег Ні Ма!Aa Suz Azr Ge Aha Mai Ge Zeg Guz Gei Ge Agu Azr Zeg No Ma!

СТТ САС АОС АСА СТО ДОС СО ТОС ССА СдО ТТ САС ССТ ТО ССТ АСАSTT SAS AOS ASA STO DOS SO TOS SSA SdO TT SAS SST TO SST ASA

І еи Ні Зег Аг Геи Зег Сіп Суз Рго Сім Ма! Ні Рго (ем Рго Тис зо 35And hey Ni Zeg Ag Gey Zeg Sip Suz Rgo Sim Ma! No Rgo (em Rgo Tys zo 35

САСОСАОССА СОССАОССАД САСАСОССОВО ССАСААТОСА СТОАСТОАА ттостостоо 60SASOSAOSSA SOSSAOSSAD SASASOSSOVO SSASAATOSA STOASTOAA ttostotoo 60

ТОБТСАТОСТ ТСТОСТААСТ ССААооСтТАА СостотосАвсссо ост оссТосТ 113TOBTSATOST TSTOSTAAST SSAAooStTAA SostotosAvssso ost ossTosT 113

Зег Рго Ага Рго Рго 1 ЗZeg Rgo Aga Rgo Rgo 1 Z

ОСТ тот АС СТО СА ТС СТО АСТ АдА Сто СТ СОТ БАС ТОС САТ СТОOST tot AS STO SA TS STO AST AdA Sto ST SOT BAS TOS SAT STO

Аа Суз Авр і ей Агу Ма! Геи Зег І уз Те І ец Ага Азр 5ег Ніз Ма! 10 15 20Aa Suz Avr and hey Agu Ma! Hey Zeg I uz Te I ets Aga Azr 5eg Niz Ma! 10 15 20

СТТ САС ДОС АСА СТО АОС САС ТОС ССА до СТ САС ОСТ ТО ОСТ АСАSTT SAS DOS ASA STO AOS SAS TOS SSA to ST SAS OST TO OST ASA

ІГеч Ніз Зег Аг Геи Зег Сіп Суз Рго Сіц Ма! Нів Рго Гец Рго Тиг 25 30 35 сстптпстостооотзст ото сас тА ТО ОоВА Са ААА АСIGech Niz Zeg Ag Gey Zeg Sip Suz Rgo Sitz Ma! Niv Rgo Gets Rgo Tyg 25 30 35 sstptpstostoootzst oto sas tA TO OoVA Sa AAAA AS

Ето Ма сн ви Біо із УагАвр лік бее ха С3у М Тероує Тік о 25 5Eto Ma sn vi Bio iz UagAvr lik bee ha S3u M Terouye Tik o 25 5

СА АТЗ АСЬСАС АСО АВО ОВ ОА АС АТ СТО ОСА САТ АСИСТ сп Мас сми Пи ув Аха сви Аяр Це ви іх да уві і 16 б 55 тест цес осзАОТОАНаЇЗСАОПА СОВА ОАСТЗОЗОАСОПАТ ТО во еп сно СМ У Ме Аа А лез пу сла сво СМУ Бго Пи пух то в 8 35 стІтОАтТосотсТа поса вас СОС ст іди Би бесівніви Спу сіріли бе у ма магма іп іевіви по 95 КІНSA ATZ ASSASS ASO AVO OV OA AS AT STO OSA SAT ASSIST sp Mass smy Py uv Akha svi Ayar This you ih da uv i 16 b 55 test ces osszAOTOANAIZSAOPA SOVA OASTZOZOASOPAT TO vo ep sno SM U Me Aa A lez pu sla svo SMU Bho Pi puh to at 8 35 stItOAtTosotsTa posa vas SOS st idi Be besivniv Spu sirily be in ma magma ip ievivy for 95 KIN

СО Зо СТ САС АБО СТО СТ ОСА ДОЮ САО СТ ОСТ ССА АВ ОС Аа «Му віз цем Са Зет ви Мва Ку ТЕ па це то Бр З Му Вій 105 то 115SO Zo ST SAS OR STO ST OSA DOI SAO ST OST SSA AV OS Aa "Mu viz cem Sa Zet vi Mva Ku TE pa ce to Br Z Mu Vij 105 to 115

ВИС АСА СТ ОВС АД ССС ААТ ОКА ТТО СТО АЗОТ СА САСVIS ASA ST OVS AD SSS JSC OKA TTO STO AZOT SA SAS

Тл ПХ А НЯ Кув дар Біо бо АВ Пе Бре яо Вег Рпв ба Не 175 125 130Tl PH A NYA Kuv dar Bio bo AV Pe Bre yao Veg Rpv ba Ne 175 125 130

ОТ СТО СОА ОСАД СОТ ОСТО АТ СТ ТАЗА ЛІВО ТОЮ ОС ізу шо Ага Му був МА: йта Рв ву Мем орео маг слу Фу Зв ті 33 ї40 145 ство Оостаоз да ро сскссК АСОВСА СТ ОС СО АВК АСА АОСOT STO SOA OSAD SOT OSTO AT ST ST TAZA LEFT THAT OS izu sho Aga Mu was MA: yta Rv vu Mem oreo mag slu Fu Zv ti 33 i40 145 stvo Oostaoz da ro sskssK ASOVSA ST OS SO AVK ASA AOS

Бви ху Ма и вд АВ БО Ра ТУ ТРУ Аз Ма! бу ше ху ТМ ко 15Е тва 155Bvy hu Ma and vd AV BO Ra TU TRU Az Ma! bu she hu TM ko 15E tva 155

ТСТ ТА СОТ СТО АСА СТ АС ЗАВ СТІ ССА АС АС АС ТИП САТ ек во Умі гос Пк ів А оми гео Ето Аби Ак Тх Зегбо3у ее і? 175 ївоTST TA SOT STO ASA ST AS ZAV STI SSA AS AS AS TYPE SAT ek vo Umi gos Pk iv A omi geo Eto Aby Ak Th Zegbo3u ee i? 175 ivo

ТО пАЗАСААА ТІ АСТ ОО ТОВ СИС АЗААСТАСТ ОВО ТТ ЗОTO PAZASAAA TI AST OO LLC SYS AZAASTAST OVO TT ZO

Бен сю ТА Рі Те Аю Зек Аза Дед Тк СИМ сих Зеб Су реч 185 а 5Ben syu TA Ri Te Ayu Zek Aza Ded Tk SIM sih Zeb Su rech 185 a 5

СТ АМТС ОМ ПАЮ ОСА ТТ АБА ЗВО АС АТ СОТ ОТ ОТ СТО Аде їди ув тто п ій у Блю Алу йа цув бе Рос му мем во доп а г ізST AMTS OM PAYU OSA TT ABA ZVO AS AT SOT OT OT STO Ade eat u tto p iy u Blue Alu ya tsuv be Ros mu mem vo dop a giz

САДА ТОПАСО ТО ТО БАС САА АТО ОПО ЗА ТАС ОТО ВАС АСОАТА со трі зе Аго Зег ун Дер Зі Це Ріо Сіу Ту уеу 5 Аг Це х5 ФР 22УSADA TOPASO TO TO BAS SAA ATO OPO ZA TAS OTO VAS ASOATA so tri ze Ago Zeg un Der Zi Ce Rio Siu Tu ueu 5 Ag Ce x5 FR 22U

САС ОАА СТО ТО ААТ БА АСТ СОУ ЗА СТО ОТ ОБА СС ТСА СОСSAS OAA STO TO AAT BA AST SOU ZA STO OT OBA SS TSA SOS

Нів сла дви цем Доп слу Те Аку ОуХ ем а Бгто у го Заг Ате о мук а 245Niv sla dvy cem Dop slu Te Aku OuH em a Bgto u ho Zag Ate o muk a 245

АОоаАсСпІВ ОВ СО со АС АТ ТИТА ЗОАСАТОВ ЗАС АСА ОО ба Тнгіжч сте Дія Юто дер Ме Заг Зяг (МУ Тх бе Алр ТЕХ Оу 255 250AOOaaAsSPIV OV SO so AS AT TITA ZOASATOV ZAS ASA OO ba Tngizhch ste Diya Yuto der Me Zag Zyag (MU Th be Alr TEH Ou 255 250

ТС СТО СА СС ААС СТО САС СОТ ОА ТАТ СТ ОСТ ТО ССА ДСО САТTS STO SA SS AAS STO SAS SOT OA TAT ST OST TO SSA DSO SAT

Ваг йеи Рго Рео Авп без Ся го опу Туг Зег Рго ЗегоРго Тг Нів 265 2 275Vag yei Rgo Reo Avp without Sya go opu Tug Zeg Rgo ZegoRgo Tg Niv 265 2 275

ОБ ОСтТАСТОбАСАС ТАТ Або СТО То ССТ СТ обАСсСАССтТТо СОСOB OStTASTObASAS TAT Or STO To SST ST obASsSASStTTo SOS

Вго Рго тв сл Тут Пк ем Рве Рго ви Рго Рго Трглецу Рго. 280. 285 290Vgo Rgo tv sl Tut Pk em Rve Rgo you Rgo Rgo Trgletsu Rgo. 280. 285 290

АсоссотоатоотосАоотосАбвСосСсТО Ст сот АБ ОСТ ТТ ОСТ ОСАAsossotoatootosAootosAbvSosSsTO St sot AB OST TT OST OSA

Те Рго ува сій без Ніз Ріо ї ен Цей Ро Авр.-Рго ех Дів Ето 295 300 305Te Rgo uva siy bez Niz Rio i en This Ro Avr.-Rgo ech Div Eto 295 300 305

АСО СОС: АСОС ОСТ АССЛАОС ОСТ СТ СТА ДАЄ АСА ТОС ТАС АСС САС тобASO SOS: ASOS OST ASSLAOS OST ST STA GIVES ASA TOS TAS ASS SAC tob

Тег Рго Тег го Тл бегРго без тен Ап Тл Зег туї ТАг Нів Зег з 315 329 28Tag Rgo Tag go Tl begRgo without ten Ap Tl Zeg tui TAg Niv Zeg with 315 329 28

САБ ААТ СТО СТ САВ ОАА СО ТААОСТІСТО АБАСАСТОСЄ САСАТСАВСА ло іп Ап Сеу Засл Ін ОХ 330SAB AAT STO ST SAV OAA SO TAAOSTISTO ABASASTOSE SASATSAVSA lo ip Ap Seu Zasl In OH 330

ТТатстосто ТАСАСТОССтТТоСсСтОсСАО ОБО СоСТо ОСАСАСААСТTTatstosto TASASTOSStTToSsStOsSAO OR SoSTo OSASASAAST

ВОАСААСАТТVOASASAT

ТОСТАСТТТО ТОСТОДААСС САААЯСОСТО СТАДДАБОЗСА ТАСАСДОСАС ТОААЛАВЗОАTOSTASTTTO TOSTODAAASS SAAAYASOSTO STADDABOZZA TASASDOSAS TOAALAVZOA

АТСАТТТТТО АСТОТАСАТТ АТАААССТТО АОААССТАТТ ТТТТТААОСТ АТСАОСААТАATSATTTTTO ASTOTASATT ATAAASSTTTO AOAASSTATT TTTTTAAOST ATSAOSAATA

СТСАТСАБАЄ САБСТАССТО ТТТаСтТОТАТ ТТТСТОСА 12 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО:25: (І) Характеристика последовательности: (А) Длина: 332 аминокислоть! (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная (ІІ) Молекулярньй тип: белок (ХІ) Описание последовательности 5ЕО ІЮ МО:25;STSATSABAYE SABSTASTO TTTaStTOTAT TTTSTOSA 12 (2) Information about the sequence of 5EO IYU MO:25: (I) Characteristics of the sequence: (A) Length: 332 amino acids! (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (ІІ) Molecular type: protein (ХІ) Sequence description 5ЕО ЙЮ МО:25;

Бег Рго дів Рго Рго Аа Сує Авр Цец Аг Ма! беу Зег ув бен во 1 5 то 15Beg Rgo girls Rgo Rgo Aa Suye Avr Tets Ag Ma! beu Zeg uv ben vo 1 5 to 15

Ага Азр Зег Нів Уві Геч. Нів Бег Агу Се Зег ій Сув Ріо бі ма! 20 25 30Aha Azr Zeg Niv Uvi Gech. Niv Beg Agu Se Zeg iy Suv Rio bi ma! 20 25 30

Нів.Рго без Рг Тих Рго Уві їео Кес Рібю Аа Маї Авр РНе бегіви 35 Ай 45 сік сію Тер був Тнг бів Ме сій ою Тит Гуз Аа Сіл Аво Пе беNiv.Rgo without Rg Those Rgo Uvi ieo Kes Ribyu Aa Mai Avr RNe begivy 35 Ai 45 sik siyu Ter was Tng biv Me sii oyu Tit Guz Aa Sil Avo Pe be

БоFor

Зіу Ма ма! ТВ Бей ей бе іш су Уа Меї Аа Аа Ага Сп 65 70 та 80 іаи о Рто тп був во ех цегіснісео у Сіл во Пебоу Оу аз щ 85 маг Ато бео їом ем Ну Ай Сем (МО ох кю з; у ТНЕ ОК Са "92 102 таZiu Ma Ma! TV Bey ey be ish su Ua Mei Aa Aa Aga Sp 65 70 and 80 iai o Rto tp was in eh cegisniseo in Sil in Pebow Ou az sh 85 mag Ato beo iom em Nu Ai Sem (MO oh kyu z; in TNE OK Sa "92 102 and

Ріо вто сій бу Аг ТВ ТВі Аа МІ Гу бр бло Авло діа Це бпа 115 32 125 цез бе сне схо Ніаченіви вто у ух Ма Аг бле Ми магів то 5 тоRio tu siy bu Ag TV TVi Aa MI Gu br blo Avlo dia Tse bpa 115 32 125 cez be sne sho Niachenivy tu u uh Ma Ag ble We magiv to 5 to

У ОУ Су бек Твгівн був Мі Ага Алі Аа рт та тик Та АЮ 1 и 155 150 мето Бе Агі ти ОВ Бен уві ца дво Аеп у меробтю Ав 155 о ТК еді ті Веб СДХ Мер ню 0 Те до Рома Три Аза Зег дів гу Те 185 ї85 іIn OU Su bek Tvgivn was Mi Aga Ali Aa rt ta tik Ta AYU 1 i 155 150 meto Be Agi ti OV Ben in tsa dvo Aep u merobtyu Av 155 o TK edi ti Web SDH Mer nyu 0 Te to Roma Tri Aza Zeg div gu That 185 and 85 and

ТЕО Ве ому ем во ув ттв сп с СК Ре мо Аа ув Де 135 2 5705TEO Ve omu em vo uv ttv sp s SK Remo Aa uv De 135 2 5705

Ро су ес ву доп й тіж ЗегАга Ве цви Авр Си йе Ето Су 2 5 ха туге Ах Агу бе міх діви сви два Су Торг ага Су вв Вп 255. 2 255 243Ro su es vu dop y tyzh ZegAga Ve tsvi Avr Sy ye Eto Su 2 5 ha tuge Ah Agu be mih divy svi dva Su Torg aga Su vv Vp 255. 2 255 243

Би бі ра Зв Агро Тпгісь у Хі Різ Ар бе Зв Бек Сіу 245 я ЯBi bi ra Zv Agro Tpgis u Hi Riz Ar be Zv Bek Siu 245 i Ya

Тнг бе? Аве Тім у Зв цвю Бо бго Ат Бе сл Рко Ву Тує вет 250 285 га бо Беєріш тім нів Ро Бо пт обу СЯ Ти кі хо Ре про ве 275 280 288Tng? Ave Tim u Zv tsvyu Bo bgo At Be sl Rko Wu Tuye vet 250 285 ha bo Beyerish tim niv Ro Bo pt obu SYA Ty ki ho Re pro ve 275 280 288

Біб о Твбіва рто м Ро Ма Уві Сі тео Не бо бе ем Ро 2 2755 З дей Ріс Ве Аз Ра ТК Ро тк Рга Тв Зоб бо фе Бей ка Тв 305 3 5 дей ет Тік міх Зве бп Аби ау бек Суп ЗІ ЗІуBib o Tvbiva rto m Ro Ma Uvi Si teo Ne bo be em Ro 2 2755 Z dey Ris Ve Az Ra TK Ro tk Rga Tv Zob bo fe Bey ka Tv 305 3 5 dey et Tik mih Zve bp Abi au bek Sup ZI ZIu

Б 330 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО:26: (І) Характеристика последовательности: (А) Длина: 1342 аминокислоть (В) Тип: аминокислота (С) Количестко цепей: одна (С) Топология: линейная (ІІ) Молекулярньй тип: белок (ІХ) Характеристика (А) Имя/ключ: СОБ (В) Локализация: 99..621 (ХІ) Описание последовательности 5ЕО ІЮ МО:26;B 330 (2) Information on the sequence of 5EO IYU MO:26: (I) Characteristics of the sequence: (A) Length: 1342 amino acids (B) Type: amino acid (C) Number of chains: one (C) Topology: linear (II) Molecular type: protein (ХХ) Characteristic (А) Name/key: СОБ (В) Localization: 99..621 (ХХ) Sequence description 5EO IЮ MO:26;

САСОСАСССА СОССАСССАА САСАССССОО ССАСААТОСА ОСТСАСТОАА 050САСОСАСССА СОССАСССАА САСАСССОО ССАСААТОСА ОСТСАСТОАА 050

ТТОоСстТоСстТоб ТОСТСАТОСТ ТСТОСТААСТ ССААСОСТАА СоСсТеТоо досTTOoSstToSstTob TOSTSATOST TSTOSTAAST SSAASOSTAA SoSsTeToo dos

Зег 1 ссосстестестZeg 1 ssostestest

Рго Аа Рго РгоRgo Aa Rgo Rgo

ОСТ тот БАС СТО СОА СТО СТО АСТ ААА СТО СТТ СОТ САС ТО САТ стеOST tot BAS STO SOA STO STO AST AAA STO STT SOT SAS TO SAT ste

Аа Суз Азр Гец Аго Маї Геи Зег (Гуз І ец Геи Агуд Азр Зег Ніз МаїAa Suz Azr Getz Ago Mai Gei Zeg (Guz I ets Gei Agud Azr Zeg Niz Mai

СТТ САС АСС АБА СТО АОС САС тоб СбА САС СТ САС ССТ ТО ССТ АСАSTT SAS ASS ABA STO AOS SAS tob SbA SAS ST SAS SST TO SST ASA

Ге Ніз Зег Агд Геиц Зег Сіп Суз Рго Сіц Маї Ніз Рго Геи Рго Тнг зо 35 сстотосто сто сстТ ост ото САС ТТ АОС ТО ОА САА То Аа десGe Niz Zeg Agd Geits Zeg Sip Suz Rgo Sits Mai Niz Rgo Gey Rgo Tng zo 35 sstotosto sto sstT ost oto САС TT AOS TO OA SAA To Aa des

Рго Ма Гец І еи Рго Аіа Ма) Ар Рне Зег Геу су іш Тр Гуз ТігRgo Ma Gets I ey Rgo Aia Ma) Ar Rne Zeg Geu su ish Tr Guz Tig

САС АТО БА дО АСО АдО ОСА САС САС АТТ СТО ОА ОСА ото СС СТSAS ATO BA to ASO AdO OSA SAS SAS ATT STO OA OSA oto SS ST

Сіп Ме! Сін Сн Тніг Гуз Аа Сіп Азр Пе Геи Су Аіа Ма! Тиг Геч бо 65Sip Me! Sin Sn Tnig Guz Aa Sip Azr Pe Gei Su Aia Ma! Tig Getch is 65

Сто ста АС ОСА СТО АТО ОСА ОСА боб ОСА САА СТО СА ССС АСТ ТОСHundred hundred AS OSA HUNDRED ATO OSA OSA bob OSA SAA STO SA SSS AST TOS

Іец еи Сн Су Ма! Меї Аа Аа Агу Сіу Сіп І еи Су Рго Тит Суз 70 75 80 85Iets ey Sn Su Ma! Mei Aa Aa Agu Siu Sip I ei Su Rgo Tit Suz 70 75 80 85

СТО ТСА ТС Сто Сто бо Сдо СТ ТСТ ОА САС Сто сот сто сто стSTO TSA TS Sto Sto bo Sdo ST TST OA SAS Hundred sot hundred hundred art

Ге Зег Бег Г еи Ге Сіу Сіп І.еу Зег Су Сіп Ма! Аго Гец Се Ге 90 85 100 осо сс сто САС дос СТО СТ ОСА СС Со СТ ССТ ССА СА ос добGe Zeg Beg Ge ey Ge Siu Sip I.eu Zeg Su Sip Ma! Ago Gets Se Ge 90 85 100 oso ss hundred CAS dos STO ST ST OSA SS So ST SST SSA SA os dob

Су Аа Гец Сп бег Гец .ец Су Тиг сп Се Рго Рго сіп Су Аго 105 110 115Su Aa Gets Sp beg Gets .ets Su Tig sp Se Rgo Rgo sip Su Ago 105 110 115

АСС АСА ОСТ САС ДО САТ ССС ААТ ОСС АТС ТТ СТО ДОС То САД САСАСС АСА OST САС ДО САТ ССС AАТ ОСС АТС ТТ STO ДОС To SAD САС

Тит Тіт Ада Ніз Кув Ар Рго Ав Аа Ме Ріе Геи Зег РнНе Сіп Ніб 120 125 130Tit Tit Ada Niz Kuv Ar Rgo Av Aa Me Rie Gey Zeg RnNe Sip Nib 120 125 130

ТО СТО СА ОА ААо СТО ССТ То СТО АТО СТ ОТА ОСА осо То ссTO STO SA OA AAo STO SST To STO ATO ST OTA OSA oso To ss

Т ец ви Агд Сіу Гуз Ма! Агд Рпе Геч Мес Ге Ма! Су Су Зег ТАг 135 140 145 отого осо асо ссАСоСАСО ВА ВСТАВ ВОДА АС їх бух Ма! го Ану дій Ра Рів тм Тр Аа мо со бе ба те 156 155 150 НоT ec you Agd Siu Guz Ma! Agd Rpe Gech Mes Ge Ma! Su Su Zeg TAg 135 140 145 otogo oso aso ssASoSASO VA INSERT WATER AS their booh Ma! Go Anu do Ra Riv tm Tr Aa mo so be ba te 156 155 150 But

ТЕРОТА ЗТ СТИ АСА СТО АС ЗАВ ИТО ПОЛААСАВОАЮ ПІСТОВАТТВ ВДTEROTA ZT STI ASA STO AS ZAV ITO POLAASAVOAYU PISTOVATTV VD

Зегіюа Маг ісм Тбіву вп З теZegiua Mag ism Tbivu vp Z te

МоMo

ТТОСЛЕАСАА АПТТОВСТОО СТСАТОСАСА АСТАСТОВОСТ СТО ОСТІСТTTOSLEASAA APTTOVSTOO STSATOSASA ASTASTOVOST STO OSTIST

ЗАВ ТЦВСЛХZAV TCVSLH

САВОЗАТТОА ЗАШССААВАТ ТОСТОСТОТО СТ ОАДССЯДА ССТОПАВОТО ссТОбАСоАSAVOZATTOA ZASHSSSAAVAT TOSTOSTOTO ST OADSSYADA SSTOPAVOTO sSTOBASoA

АТШОССООСАТ АССТОЗДАСАС ШАТАСАСОАА СТОТТОДАТО ЗАВШТОВТЗО АСТОТТТОСТATSHOSSOOSAT ASSTOZDASAS SHATASASOAA STOTTODATO ZAVSHTOVTZO ASTOTTTOST

АКА САС СПАСА ЗІСАЦССС ЗАСАТТТОС САЗСАМАТОAKA SAS SPASA ZISATSSSS ZASATTTOS SAZSAMATO

АСАСАСМУЗОASASASMUZO

ТеПСТаССАС ССААССТОГСА ЗОСТОЗАТАТ ТОТОСТТОСО СААСОСАТОС ТОСТОСТОСА.ТеПСТАССАС ССААССТОГСА ZOSTOZATAT TOTOSTTOSO SAАСОSATOS TOSTOSTOSA.

СазтАТАсОС ТТ ИТОоТ ТИКАСОСВСО ТТОСОСАКОС стат атТогА, сстесАососSaztATAsOS TT ITOoT TIKASOSVSO TTOSOSAKOS stat atToA, sstesAosos

ШТЕСТТОСТО АСОССТІСТОЄ ТОПААСОСОО АСОСОТАЄСА ВСССТОТТСТ ААСАСАТОСSHESTTOSTO ASOSSSTISTOE TOPAASOSOO ASOSOTAYESA VSSSTOTTST AASASATOS

ТАПАСОПАСТ ЕССАОААТОТ ЕТОТОСАВОАА ЗО ТААЗИТ СТОАСАСАЄТ ВОСОАСАТСАTAPASOPAST ESSAOAATOT ETOTOSAVOAA ZO TAAZIT STOASASAYET VOSOASATSA

ОеАТТОТОТОо ВТОтАСАВСТ СоСТТОСоТа см ВИКО СТОЛА НАСАOeATTOTOTOO VTOtASAVST SoSTTOSoTa cm VIKO STOLA NASA

АПТООАСААХAPTOOASAAH

АТТТОСТАЄТ ТТИТОСТЯАА АСОСЗАМЗОЮ СТУЗТААВАЄ ЗИАТАСОКАЄ ЗАСТЕААВАВATTTOSTAYET TTITOSTYAAAA ASSOZZAMZAYE STUZTAAAYE ZIATASOKAYE ZASTEAAVAV

ЗОЗВАТОАТІХ ТТСАСТОТАЮ АТТАТАААСО ТТСАВАВОСТ АТ ТТ ТАА ЗСТАТОАЄСАZOZVATOATIH TTSASTOTAYU ATTATAAASO TTSAVAVOST JSC TT TAA ZSTATOAYESA

АТАСТОВТСА ПАВСАВСТАВ СТСТТТЗОТС ТАГРЕТСТОСА 42 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО:27: (І) Характеристика последовательности: (А) Длина: 174 аминокислоть! (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная (ІІ) Молекулярньй тип: белок (ХІ) Описание последовательности 5ЕО ІЮ МО:27; баг Ргб Дід Рго Ріо Дів Су Авр Кец Аг Маї дез Зег уз Сей це 1 5 1 15ATASTOVTSA PAVSAVSTAV STSTTTZOTS TAGRETSTOSA 42 (2) Information on the sequence of 5EO IYU MO:27: (I) Characteristics of the sequence: (A) Length: 174 amino acids! (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (ІІ) Molecular type: protein (ХІ) Description of the sequence 5ЕО ИЮ МО:27; bag Rgb Did Rgo Rio Div Su Avr Kets Ag Mai des Zeg uz Sei ce 1 5 1 15

Аг дер Зег Ні Маг Меу Нів Зег Агу Цен Заг сно Сув Рго Сі Ма 20 25 0Ag der Zeg Ni Mag Meu Niv Zeg Agu Tsen Zag sno Suv Rgo Si Ma 20 25 0

Нів Ро Тец Ріо Ті Ріо Ма ес їей Ріо Дів УаіА5р Ре Загіви 35 20) 5Niv Ro Tets Rio Ti Rio Ma es iey Rio Div UaiA5r Re Zagivy 35 20) 5

Оу біш Тер Був Таг об Мессі сів ти: ку Аів Сів Ар Че Бей 50 53 50Oh bish Ter Buv Tag ob Messi siv ti: ku Aiv Siv Ar Che Bei 50 53 50

Су Ав Маг ТА ле це їв 8 Су Маї Меї діа Аа Ао Зіу СА 55 70 73 80Su Av Mag TA le ce ate 8 Su Mai Mei dia Aa Ao Ziu SA 55 70 73 80

Тем Су Рго Тог Суб Гей Зег Зег вою ви пу СІЙ беу Зег Сіу Зп 85 50 95Tem Su Rgo Tog Sub Gay Zeg Zeg voi pu SIY beu Zeg Siu Zp 85 50 95

Уа Ага веиїТец ген су Ав ем сій Єву еу Сви СПУ ТВг З ей тоб 105 щи!Ua Aga veiiTets gen su Av em sii Yevu eu Svy SPU TVg Z ey tob 105 shchi!

Во Рго б Зх Ага ТІМ ТАг Аа Ніз ув Або Рто двлодіа Пе ре 115 1720 125Vo Rgo b Zh Aga TIM TAG Aa Niz uv Or Rto dvlodia Per re 115 1720 125

Тен Зег Ре (Зо Ні Сем Геу Аа С1у (ув Ма! Аго Рае еу Ме! ей 130 135 76-оTen Zeg Re (Zo Ni Sam Geu Aa S1u (uv Ma! Ago Rae eu Me! ey 130 135 76-o

Уа! сіу сту Зег Тр Ееи Суз Уа! Аго Ага Аа Рго Рго. тіж Ті Аа 145 150 155 169Wow! Siu Stu Zeg Tr Eey Suz Ua! Aha Aha Aa Rgo Rgo. also Ti Aa 145 150 155 169

МагрРго Бег Ага Тиг Бех ви Май ео Пи Ге Ап ви 1855 179 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО:28: (І) Характеристика последовательности: (А) Длина: 1164 аминокислоть (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная (ІІ) Молекулярньй тип: кКДНК (ХІ) Описание последовательности 5ЕО ІЮ МО:28;MagrRho Beg Aga Tig Beh vi Mai eo Pi Ge Ap vi 1855 179 (2) Information about the sequence of 5EO IYU MO:28: (I) Sequence characteristics: (A) Length: 1164 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (ІІ) Molecular type: cDNA (ХІ) Sequence description 5ЕО ІЮ МО:28;

АСОСАСССАС БССАСССАВА САССССОБСС АБААТОСАСС ТОДАСТОСААТТ остостовтаАСОСАСССАС БССАСССАВА САССССОБСС ABAATOSASS TODASTOSAATT ostostovta

СТОАТОСТТО ТОСТААСТОС ЛАБОСТААСо СТоТоС АОС ССО ост ост сстостТSTOATOSTTO TOSTAASTOS LABOSTAASo SToToS AOS SSO ost ost sstostT

Бег Рго Авіа Рго Рго Дій 1 5Run Rgo Air Rgo Rgo Action 1 5

ТОТ БАС СТО СбА СТО Сто ОТ АДА СТО СТТ СОТ БАС ТОС САТ сте СТTOT BAS STO SbA STO Sto OT ADA STO STT SOT BAS TOS SAT ste ST

Суз Ар Ге Ага маї Гец Зег Туз І ви ви Аго Азр Бег Ніз Ма! БецSuz Ar Ge Aga mai Getz Zeg Tuz And you you Ago Azr Beg Niz Ma! Betz

САС АОС АСА СТО АОС САС ТС ССА БАС СТ САС ССТ ТО ССТ СА ОСТSAC AOS ASA STO AOS SAC TS SSA BAS ST SAC SST TO SST SA OST

Ніз Бег Аго Ге Зег Сіп Суз Рго СІЧ Маї Ніз Рго Геу Рго Тпг Рто вІСстО ста ссТосСт оте ОАЄ ТА ТТ ОА САА ТО ААА АС САС чагуви Гей Рго А Ма! Авр.ВНе ВЗег Ге М Си Ттр ув УВОNiz Beg Ago Ge Zeg Sip Suz Rgo SIC May Niz Rgo Geu Rgo Tpg Rto VISstO sta ssTosSt ote OAE TA TT OA SAA TO AAAA AS SAS chaguvy Hey Rgo A Ma! Avr.VNe VZeg Ge M Sy Ttr at UVO

АТО БАЗ БАС АСС АД СА СА САС АТ СТО ЗА СА То АСоСТІ СТОATO BAZ BAS ASS AD SA SA SAS AT STO ZA SA To ASoSTI STO

Мессі іш Піх Гуз Аів Сій Авр Де їех Сіу Ага маг т ей ейMessi ish Pih Guz Aiv Siy Avr De yeh Siu Aga mag t ey ey

Б во 55 г)B in 55 g)

СТО ОАШ ООАСТО АТО СА ЗСА Сов са САД сто поса сс АС ТО СтоSTO OASH OOASTO ATO SA ZSA Sov sa SAD sto posa ss AS TO Sto

Тем бю у Уа! Ме А Аа Ако Зіу п се Су Рез Те був гео т5 о 85 тТеАтессте ств са СА СТІ ТсТ оба САС сто от сте ст опаTem byu in Ua! Me A Aa Ako Ziu p se Su Rez Te was geo t5 o 85 tTeAtesste stv sa SA STI TsT oba SAS sto ot ste st opa

БегБегіеи (ен іх Сіл ви Бег Су іп 8 Ага бе без без Су 90 85 тоBegBegiei (en ih Sil vy Beg Su ip 8 Aga be bez bez Su 90 85 to

БО СТОБАвАОСОТо СТ оба АС СА СТ ССТ ОСА СА ОО АС АСBO STOBavAOSOTO ST oba AS SA ST SST OSA SA OO AS AS

Ав меч сій Зег ів їеу Сім ТК іп Кеу Рг го зі віу Аг ог 105 о 115Av mech siy Zeg iv ieu Sim TK ip Keu Rg go zi viu Ag og 105 o 115

АСАОСТ САС ААС ЗАТ СОС ААТ ОСС АТС ТТОСТО ас Ттто бАА САС СТОASAOST SAS AAS CJSC SOS JSC OSS ATS TTOSTO as Ttto bAA SAS STO

ТНг Ав Ні Му Або Ріо Авп Ада Це. Ре без Зек Єнеосія Ні Гео 120 125 а сто СбА СА А САСТТО ТО АТ ОТ ИбА БАС АДА СТ САС ТОС СТО еп А С ув Авр не Тр Ле Уа) Сіу Авр Туз тен Ні Суз їеи 135 140 145 150TNg Av Ni Mu Or Rio Avp Ada Tse. Re bez Zek Yeneosia Ni Geo 120 125 a sto SbA SA A SASTTO TO AT OT IBA BAS ADA ST SAS TOS STO ep A S uv Avr ne Tr Le Ua) Siu Avr Tuz ten Ni Suz iey 135 140 145 150

АВС САВ ААС ТАС ТОВ СТО ТОБ ОСТ ОТ ЗААСТО СА ОСА ОО АТ САВAVS SAV AAS TAS TOV STO TOB OST OT ZAASTO SA OSA OO JSC SAV

Зегоіп Авп Туг Ттр бен Троя Зег ів Ма! Ага Ата Су Пе сіл 155 150 165Zegoip Avp Tug Ttr ben Troy Zeg iv Ma! Aga Ata Su Pe sat 155 150 165

ДОС САД ОА ТОЮ ТО ГТОТ ОСТЗАА ССА ДАЄ СТО СА ОТО СТ ЗА ССАDOS SAD OA TOYU TO HTOT OSTZAA SSA GIVES STO SA OTO ST FOR SSA

Зег ій Авр. Заг Тіто Зег Аа ій Рго Ав ви іп Уа бо Су Рго 170 75 180Zeg and Avr. Zag Tito Zeg Aa iy Rgo Av vi ip Ua bo Su Rgo 170 75 180

ААТ СО СБ АТА ССТ БАХ СА АТ АСА ОА АСТ СТ БАА ТО ДАО ТоAAT SO SB ATA SST BAH SA AT ASA OA AST ST BAA TO DAO To

Авп Рео Аг Цесбта 3 а АвБр Тв Аеу ТАг сей Сію Ттр Авп Бех їде 190 135 тоб АСтТ ст тТостОоб АБС оте АС САС ОАЄ ОСТ АС АОС СОС ОА САТAvp Reo Ag Cesbta 3 a AvBr Tv Aeu TAg sei Siyu Ttr Avp Beh ide 190 135 tob AStT st tTostOob ABS ote AS SAS OAE OST AS AOS SOS OA SAT

Тр г тебе Пр ле ей Такій Авр Рго Аг Зег Ро БУ Ні 29 295 25Tr g te Pr le ey Such Avr Rgo Ag Zeg Ro BU No 29 295 25

ТО СТО АВО ДАС АТС АЗАСАСАаО СТО ССТ С АС СААССТ ОСА ЗО не уви Ага Ап Ме Аго Ніз Аг їеи Рго Аа Ти Рго Ро Ага рак 224 725 230TO STO AVO DAS ATS AZASASAaO STO SST S AS SAASST OSA ZO ne uvy Aga Ap Me Ago Niz Ag iey Rgo Aa Ty Rgo Ro Aga rak 224 725 230

ТО АТА ТО ТО ТТ Сб ААС ССА ТО ТО ТАТО АСА СТА ТАС ОСТTO ATA TO TO TT Sat AAS SSA TO TO TATO ASA STA TAS OST

Тер бе Ре баг Ре Ро Ап Ріо бет Зе Ту Ти тп ма! Туг Дів 2535 280 245 сттссс тт тосАсоссАСсТІ ос САС соСтОоТ вот ос Ост сс цес Рго Зег Зег Ти Нів І ен Дів Нів Ро Суб Су Рго Аа Рг Ріо 250 255 250Ter be Re bag Re Ro Ap Rio bet Ze Tu Ti tp ma! Tug Div 2535 280 245 sttsss tt tosAsossASsTI os САС soStOoT vot os Ost ss ces Rgo Zeg Zeg Ti Niv I en Div Niv Ro Sub Su Rgo Aa Rg Rio 250 255 250

ССТОСтТ тоб ТОАСОСТТОТ ОСТОоСААОСС ССАССССТАС САОсоСТоТЬ ВССТОСТТ tob TOАСОСТТОТ ОСТОоСААОСС ССАССССТАС САОсоСОСТОТ В

Рго Ав Зег . 265Rgo Av Zeg. 265

СТАААСАСАТ ССТАСАСССА СТОССАСААТ СТОТСТСАВО АДОССТААВО ТТСТСАСАСАSTAAASASAT СSTASASSSA STOSSASAAT STOTSTSAVO ADOSSTAAVO TTSTSASASA

СТОССОАСАТ СДОСАТТОТО ТОВТОТАСАО СТоССТТоСС ТаСАосВОово боотоасАсАSTOSSOASAT SDOSATTOTO TOVTOTASAO SToSSTToSS TaSAosVOovo bootoasAsA

СААСТОСАСА АВАТТТОССТА СТТТСТОСТО АААСССАААВ СССТОЗТАДА АВБОЗАТАСАСSAASTOSASA AVATTTOSSTA STTTSTOSTO AAASSSSAAAV SSSTOSTADA AVBOZATASAS

АБОАСТОААА АСОААТОСАТ ТТТТСАСТОТ АСАТТАТААА ОСТТСАСАДО СТА. 1164 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО:29: (І) Характеристика последовательности: (А) Длина: 265 аминокислоть! (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная (ІІ) Молекулярньй тип: белок (ХІ) Описание последовательности 5ЕО ІЮ МО:29;ABOASTOAAA ASOAATOSAT TTTTSASTOT ASATTATAAA OSTTSASADO STA. 1164 (2) Information about the sequence of 5EO IYU MO:29: (I) Characteristics of the sequence: (А) Length: 265 amino acids! (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (ІІ) Molecular type: protein (ХІ) Description of the sequence 5ЕО ИЮ МО:29;

Зег Рго Аа Рго Рго Аа Суз Авр І ги Аго Ма! І еи Зег Гуз Ге Геи 1 5 10 15Zeg Rgo Aa Rgo Rgo Aa Suz Avr I gy Ago Ma! I ey Zeg Guz Ge Gey 1 5 10 15

Ага Азр З5ег Ніз Ма! Ге Ніз Бег Аго Геу Бег Сіп Суз Рго Сіи Ма!Aha Azr Z5eg Niz Ma! Ge Niz Beg Ago Geu Beg Sip Suz Rgo Siy Ma!

Нів Рго Геи Рго Тнг Рго Маї Гец І. еи Рго Аіа Ма! Авр Рпе Зег Ге су Сі Тгр Гуз Тнг СіІп Ме! Сі Сі Те Гуз Аа СіІп Азвр Це І еи 60Niv Rgo Gey Rgo Tng Rgo Mai Gets I. ey Rgo Aia Ma! Avr Rpe Zeg Ge su Si Tgr Guz Tng SiIp Me! Si Si Te Guz Aa SiIp Azvr Tse I ey 60

Су Аа Ма! Тнг Гец Геи Ге сін Сіу Ма! Меї Аа Аа Аго СІу Сіп 65 70 75 80Su Ah Ma! Tng Het Gei Ge Hsin Siu Ma! Mei Aa Aa Ago SIu Sip 65 70 75 80

Ге Суу Рго Тіт Суз Геи Зег Зег Ге Теи Су Сіп І еи Зег Сіу Сіп 85 90 95 маї Ага Гец Ге І ву су Аа Геу Сп Зег Геи Г.еи сіу Тиг Сіп бе 100 105 110Ge Suu Rgo Tit Suz Gey Zeg Zeg Ge Tey Su Sip I ey Zeg Siu Sip 85 90 95 mai Aga Gec Ge I wu su Aa Geu Sp Zeg Gey G.ei siu Tig Sip be 100 105 110

Рго Рго сіп су Аго ТНг ТНг Аа Ні Гуз Дер Рго Авп Аа Це Ріє 115 120 125 і еи Зег Ре Сіп Ніз Ге Геи Агу Су Гуз Азр Рре Тгр Пе Ма! Су 130 135 140Rgo Rgo sip su Ago TNg TNg Aa Ni Guz Der Rgo Avp Aa Ce Rie 115 120 125 and ey Zeg Re Sip Niz Ge Gei Agu Su Guz Azr Rre Tgr Pe Ma! Su 130 135 140

Азр Гуз Геи Ніз Суз Г.еу Зег Сіп Азп Туг Тгр Геи Тгр Аа Зег СіШ 145 150 155 160Azr Guz Gays Niz Suz G.eu Zeg Sip Azp Tug Tgr Gays Tgr Aa Zeg SiSh 145 150 155 160

Уа! Аза Ага Су Пе Сіп Зег СіІп Азр Зег Тгр Бег Аіа Сім Рго Авп 165 170 175Wow! Aza Aga Su Pe Sip Zeg SiIp Azr Zeg Tgr Beg Aia Sim Rgo Avp 165 170 175

Г.еи Сп Маї Рго Сіу Рго Азп Рго Ага Ме Рго Сію Сіп Азр ТНг Аго 180 185 180G.ei Sp Mai Rgo Siu Rgo Azp Rgo Aga Me Rgo Siyu Sip Azr TNg Ago 180 185 180

ТЕг Геи біс Тгр Азп Зег Тгр Тиг Геи Зег Тр Тнг Геч Тнг Сіп Авзр 195 200 205Teg Gay bis Tgr Azp Zeg Tgr Tig Gay Zeg Tr Tng Gech Tng Sip Avzr 195 200 205

Рго Агд Зег Рго Су Ніз Ре Гей Агд Азп Ме Ага Ні Агуд Геч Рго 21 215 220Rgo Agd Zeg Rgo Su Niz Re Gay Agd Azp Me Aga Ni Agud Getch Rgo 21 215 220

Аа Тнг Сіп Рго Рго Аїа Тгр Пе Ре Зег РНе Рго Азп Рго Зег Зег 225 230 235 240Aa Tng Sip Rgo Rgo Aia Tgr Pe Re Zeg RNe Rgo Azp Rgo Zeg Zeg 225 230 235 240

Туг Тгр Тнг Ма! Туг Аіа І еи Рго Зег БЗег Тнг Ніз Ге Аа Ніз Рго 245 250 255Tug Tgr Tng Ma! Tug Aia I ey Rgo Zeg BZeg Tng Niz Ge Aa Niz Rgo 245 250 255

Суз сіу Рго Аа Рго Рго Рго Аіа Зег 250 2655 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:30: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 24 парь оснований (В) ТИП: нуклейиновая кислота (С) КОЛИЧНСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хї) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО:30:Suz siu Rgo Aa Rgo Rgo Rgo Aia Zeg 250 2655 (2) SEQUENCE INFORMATION OO 0 MO:30: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (6) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE: cDNA (s) SEQUENCES DESCRIBED 5EO IO MO:30:

САССТСАСТА сТоТоАССТ САС (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІС МО:31: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 24 парьі оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: пинейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО:31:САССТСАСТА сТоТоАССТ САС (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO IS MO:31: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: pineal (i ) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION ZEO IO MO:31:

СТОСАССТОС АСАСТАСТОА ОСТSTOSASSSTOS ASASTASTOA OST

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІЮ МО:32: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 80 пар оснований (В) ТИП: нуклейновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: кКДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЗЕО ІО МО:32:(2) SEQUENCE INFORMATION 5EO IU MO:32: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 80 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULAR TYPE : kKDNAK (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE 5ZEO IO MO:32:

СТСАТААТТТ ТТАДААААТТ САТТТОАСАА АТОСТААААТ ТСТТОАТТАдД 50STSATAATTT TTADAAAATT SATTTOASAAA ATOSTAAAAT TSTTOATTADD 50

ТАТТСТСААТ ТСТОАССОСТ САСААТТАТ 80 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 33; () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 86 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: пинейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО:33:TATTSTSAAT TSTOASSOST SASAATTAT 80 (2) INFORMATION ON THE SEQUENCE OF 5EO IO MO: 33; () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 86 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (0) TOPOLOGY: pineal (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION ZEO IO MO:33 :

ССАТАААТТО ТОДОСОСТСА СААТТОАДОАА ТАТТААТСАА СААТТТТАСС 50SSATAAATTO TODOSOSTSA SAATTOADOAA TATTAATSAA SAATTTTASS 50

АТТТОТСАДА ТОДАТТТТТТ АААААТТАТО АСАСОТ 86 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО 0 МО:34: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 89 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) МОЛЕКУЛЯРНЬЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО І МО:34:ATTTOTSADA TODATTTTTT AAAAAATTATO ASASOT 86 (2) SEQUENCE INFORMATION 5EO 0 MO:34: () SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 89 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: one (0) TOPOLOGY: linear (i) MOLECULAR TYPE: cDNA (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE OF ZEO AND MO:34:

САССТСТСАТ ААТТТТТААА ДААТТСАТТТ САСАДАТОСТ ДАДАТТСТТО 50SASSTSTSAT AATTTTTAAA DAATTSATTT SASADATOST DADATTSTTO 50

АТТААТАТТСО ТСААТТСОТОА ССОСТСАСАА ТТТАТССАТ 89 яка отаке мегачартумитя и током мис бари с ФДУБЮМАННО ТИКИ фронтит фе фр в фот тетнентеттнтннтнття реATTAATATTSO TSAATTSOTOA SSOSTSASAA TTTATSSAT 89 what kind of megachartumytya and current of mys bari with FDUBYUMANNO TIKI frontit fe fr in fot tetnentettntnntnttya re

МІК ж чої сну фа? ишкосовх -- ст ну ве «нен ща рн (ОТУТ в-во аВЕMIK, whose dream is it? ishkosovh -- st nu ve "nen shcha rn (HERE in the aVE

ЗО я о, А ак ов зни вокн в з ел ра їх ва 2 . и шк 5. р; и вок и ї . К «ж ї --й Я сукня Послиєюте ик. любе! пупок кв ухилZO i o, A ak ov zni window v z el ra ih va 2 . and shk 5. r; and wok and eat. K «zh i --y I dress Poslyyuute ik. dear! navel square slope

ИВІМНИ мержкерепияе ре з і ку НIVIMNY merzhkerepiae re z i ku N

250 : . і й - ще 200 щі250 : . and 200 more

ІAND

КУKU

ЕIS

Б 150 йB 150th

Гея щGaya

Ж 400 о .Yes, 400 o.

В бIn b

КЕ 50 Й - Ї 0 -7 гKE 50 Y - Y 0 -7 g

Количество рецептора: МОЇ. А. легмлиNumber of receptor: MY. A. lay down

ЗИГоє й 1000) стен нт ттттпсттнтоптня нт такт стенBlinks and 1000) sten nt ttttpsttnttoptnya nt takt sten

Е і еен-поутухивне АХ і х і - У А І х зу не З првутонни МЕЖ и кеE i een-pouthyvne AH i x i - U A I x zu ne Z prvutonny МЖХ i ke

З оо Локони / - і 5 ! я Б і ї і Й у Н рі Й х х НWith oo Curls / - and 5 ! i B i i i Y u N ri Y x x N

В пи і чі х 5 водо Я / жIn pi and chi x 5 water I / w

З гя Н Н Н в я !With gya N N N in I!

Б щ 5004 ! що" НB sh 5004 ! that" N

БУ НBU N

Вот ї ім і о |! 7 2 Н - жо во Я й Н - т ; / Н ! Ч 7 і ї Ж й -К вай 5 «фрески рт 13 що 1005 Хо 100000That's it! 7 2 N - left I and N - t; / N ! Ch 7 and Х y -K wai 5 "frescoes rt 13 that 1005 Kho 100000

ЖЕ МИгяци ву У крос щиг.йZHE MYGYATSI vu In the cross country.y

ОМИСІКА МОБАЛЯСАМИВ,OMYSIK MOBALYASAMYV,

Пназма рови спкученний лобаPnasma of the moat is swollen forehead

Зіенняя хоомотоговрам при копдкросуваний аггяУРИВИНа ЗМоОДЬеЙ пОБИЦи МХОРНЯЇZiennya homomotovoram with copdcrossed aggyaURIVYNA ZMOODYE OBYTSI MKHORNYA

АцанНнал хроматегремяя реле МАХ малAtsanNnal chromategremaya relay MAX fig

Анисрюмоннай тиAnisryumonnai you

Генкрильтра юна ш 3, 1х иGenkryltra young w 3, 1x i

Кл КоувА Хроматотуеюа ваобкого риаопуючюинмя о сер сртой мн суджений МО -хипани пЗе - ВапОопОвО - НО : і ШЕ й оїKl KouvA Chromatotueyua vaobkogo riaopuyuchuinmya o ser srtoy mn judged MO -hypany pZe - VapOopOvO - NO : and SHE and oi

Я і ; ек ВИД У пд Конт ЕНН і Н пр і адпалнни де! й п - ї золи 7 во І. ї Но ІН х п ій Н Кр ІН : шо М щ | Кай НЯ : х г й | НІ ї І і ї іоеюродиє гу ихI and ; ek VIEW U pd Cont ENN and N pr and adpalnny de! y p - i zola 7 vo I. y No IN x p iy N Kr IN : sho M sh | Kai Nya : x g y | NO и и и иоеуродие гу их

АН ПН ЩІ. вон ШЕ т т, Б НІ ї то ш рі КІ рі : і ЗШНЕ ши Й іAN PN SHI. вно ШЕ t t, B NI і to sh ri KI ri : i ZSHNE shi Y i

Я НЕЇ БК як З НХИКМННІО он 73 ши ши шинаI HER BC as Z NHIKMNNIO on 73 shi shi shina

З ог ях й : подані ще Манн щеZ ogyah y: submitted more Mann more

Мік Мем ув дикою хм ія кекси! щеMick Mem in the wild hmm and cupcakes! more

НЯ Мк 42 ще рема лк 18388021 р2 З 24852527 28 сх ШИН Ще аЗка бе. и В. ОКХ,NYA Mk 42 still rema lk 18388021 р2 Z 24852527 28 сх ШYN Still aZka be. and V. OKH,

ЗОКЯ вн с ІНН витZOKYA vn with TIN vyt

МеХЖ ЖМ що якійMeKhZh ZhM what to whom

ТКА неTKA is not

Пилки м ав с Ко сх шлектоороюев В З4й-том полпакоктеМидноМ пеле в попоететвня де /нервпуписуюдив условияиPlyki mavs Kosh shlektooroyuev In the 3rd-th volume of polpakokteMidnoM pele in popoeetvnya de /nervpupisuyudyv conditions

ТЯГTRACTION

Де во | сала 00 ; -Ь-ш Ой іравимя 29 е ПА травний 23 5БОдоWhere in | lard 00; -b-sh Oh iravymya 29 e PA May 23 5BOdo

ЕЕ й 4000 щ Б 8 8 я З000 їх ша а З 2090. У 1090 В : : : кох 4 1 КІ; 100EE and 4000 sh B 8 8 i Z000 their sha a Z 2090. In 1090 B : : : koh 4 1 KI; 100

МРІ-Х ЛкглЛи ший учи пе нн плетення тт іі ківі пін апетит тт 100 т 1 ї- | Ї Число меганариситов -- 80MRI-X LkgLy shiy learn pe nn weaving tt ii kiwi pin appetite tt 100 t 1 i- | The number of meganarists is 80

А в - ЇВ 2 60 їйAnd in - YIV 2 60 to her

В І о З ща їх 40 Є : і Не 5 : а - кеThere are 40 Yes and No 5: a - ke

ФО ; : -FO; : -

В ик я 0. я І ; " щш що нич що що ря - -щ о - - па - ЗкV ik i 0. i I ; " shsh what nich what what rya - -sh o - - pa - Zk

ЕН Б Є8ВВ З су я 5 т г З 5EN B E8VV Z su i 5 t g Z 5

Е ійEh

ГеGe

ЗИ. во піти дтітнн одднттнтн тт і «7 В- пиву Млятух І нею : х : 5 го : г т- т Я я...ZY. to go dtitnn oddnttntn tt and "7 V- pivu Mlyatukh And her : x : 5 go : g t- t I I...

ЗХ з Шо. й я ши ж Б СІМ тож БЕ роя х З а с ЕZH with Sho. y I shi same B SIM so BE roya x Z a s E

У ші шо т - щ-- Я о 25 - :U shi sho t - sh-- I at 25 - :

Процект мегакариснитовMegacarysnitov project

ЕЕ т 15 8 ! 8 10 ; та; іEE t 15 8 ! 8 10; and; and

Бе Й я 5 з ї о ШИ ш т Ф ше оо шк ї- хвоя оО в: шо що - шо щі В б йо Е ш 5 іо ш - а.Be Y i 5 z i o SHY sh t F she oo shk yhoya oO v: sho what - sho shchi V b yo E sh 5 io sh - a.

Го. ше т 3-х -х - що щ (5Go. what t 3-x -x - what sh (5

Гай -- щ-Guy -- sh-

ТЕ нан нииининии 150003 ро а - н Е в х дн шTE nan niiininii 150003 ro a - n E v x dn sh

Іс о сеї «аIs about sei "a

Е КЗ т т ті, й ХЕ ЕЙ с: х же я ж ій.E KZ t t ti, y ХЕ ЕЙ s: х же ж ж ий.

ЕIS

БУ і САСБОСАБССАСООССАСССААСАСВОССССОСГАСААТССАССТСАСТОААТТОСТОСТС 59 1 Мексічьес тв: сісбенгеньси 8 0 0 ОТОСТОАТОСТТСТОСТАВСТОСААСОСТААСОСТОТССАСССобостТоСтТостТостст 1BU and SASBOSABSSASOOSSSASSSAASASVOSSSSOSGASAATSSASSSTSASTOAATTOSTOSTS 59 1 Mexican TV: sisbengensi 8 0 0 OTOSTOATOSTTTSTOSTAVSTOSAASOSTAASOSTOTSSASSSSSobostToStTostTostst 1

З МаїуаїМесьеч езрецтигАїадхЧьецтпиренсегсетртодіагттсргойіасуй 28 120 САСОТОССАСТОСТСАСТАААСТОСТТСОТОАСТСССАТОТССТТСАСАЗСАСАСТОАСС 175 23 ВврієчАтоуа1ценоетгбувренреИАгсоАВроеІНівуаіїеонівбекагорецбєт 48 180 сСАПВТОСССАСАССТТСАСССТТТОССРАСАССТОТОСТОСТОССТОСТоТосАСТЕТАс 0239 49 біпСсудртостіауа1НізРтОоГечртотвгрРгоуаіецьечетовіауаїАлвренесех ЄВЗ МаїуаїМесьеч езрецтигАїадхЧьецтпиренсегсетртодіагттсргойіасуй 28 120 САСОТОССАСТОСТСАСТАААСТОСТТСОТОАСТСССАТОТССТТСАСАЗСАСАСТОАСС 175 23 ВврієчАтоуа1ценоетгбувренреИАгсоАВроеІНівуаіїеонівбекагорецбєт 48 180 сСАПВТОСССАСАССТТСАСССТТТОССРАСАССТОТОСТОСТОССТОСТоТосАСТЕТАс 0239 49 біпСсудртостіауа1НізРтОоГечртотвгрРгоуаіецьечетовіауаїАлвренесех ЄВ

ВА РТОССАСААТОСАЛААСОСАВАТОСАСВАСАССААОССАСАССАСАТТСТОВОАССАСТО 0293 53 резсіусіютурьуєтнусіпмессірсічтпгрувдіасіпАаврІ1іегречс1іуйіауа1 88 300 АеССтТІСТОСТОСАСОСАСТОАТОСАОСАСОСОСАСААСТОССАСССАСТТОССТСТСА 0359 89 Троречпречрецосівіуча МесАіайіалусІусіпренцо уро нІсСувзрейбек 18 360 тесСтоСРОСООСАССТТТСТОСАСАССТОСОТСТОСТОСТТОоСооСССТоСАСАССТо 41 1095 БегпечреноїусіпрерзегоіусіпуаіїАтареньеценсі"АІацеіпсекрево 0128 430 СтТТОСААСССАОСТТОСТИСАСАОООСАОСАССХСАССТСАСААОСАТСССААТОССАТО 873 129 БеротутикоїорезбтортодціпоіуйготпетниАзанівіуєАврргоАепліатІіє 145 480 ТТОСТОАОСТТССААСАССТОСТОССВСОЛАДОСТОСОТТТОСТОАТОСТТоТАСоАСоС 0539 149 РрепенсбегрпесіпнНіІзрезцечАкопріусува1їАковрелецМесьечнуаїс1усіу 1658 548 ТОСАСССТОТОССТСАОПСОБОССССАСССАССАСАВСТОТОСССАССАСААССТСТСТА 0595 159 БегтапгівисСуєуа!дтоакодіарторготистнтАзіауа1ркобегакутлрбетівм 185 500. СТОСТСАСАСТОААССАССТОССААЛАСАССАСТТСТОСАТІСТТОСАСАСАВАСТТСАСТ 659 189 Узірентву т ечАзайісьеоркоАвпАтотпусехсіувецьецсіптвтАвпРИетТЬк 208 560 беСТСАВССАОААСТАСТОССТОТОВОСТТСТОААОТОССАНСАСССАТТСАСАВССААЄ ЗІЗ 209 дтасега1адуотастптоіубеко1уреніезьуєтТьрсіпсіпсіурпеаколіацув 255 720 АТТЕСТОСТСТОСТОДАССАААССТОСАССТОССТООАССААКТОСССССАТАССТОААЄ 773 229 т1ерРтобіуренреназЗпоіптвгЗегаговбехрецавроіпІі1іерКосіутуютеиави 245 180 АССАТАСАСОАМТСТТОДАТООВАСТОСТОВАСТСТЕТОСТОБАСОСТОАСВСВСВАСО 813 249 Акот1енівстйеціенавос1іутатАкооіусеирдертосіуртовегАгоАтотТВх 258 840 СТАБСАСССССОСАСАТТТССТСАССААСАТСАСАСАСАСССТОССТОССАСССААССТО 8595 289 рембіудіартолеоіів5ековусіутвхубекАЗотпусіузекресРусрРтозВПОвВи 286ВА РТОССАСААТОСАЛААСОСАВАТОСАСВАСАССААОССАСАССАСАТТСТОВОАССАСТО 0293 53 резсіусіютурьуєтнусіпмессірсічтпгрувдіасіпАаврІ1іегречс1іуйіауа1 88 300 АеССтТІСТОСТОСАСОСАСТОАТОСАОСАСОСОСАСААСТОССАСССАСТТОССТСТСА 0359 89 Троречпречрецосівіуча МесАіайіалусІусіпренцо уро нІсСувзрейбек 18 360 тесСтоСРОСООСАССТТТСТОСАСАССТОСОТСТОСТОСТТОоСооСССТоСАСАССТо 41 1095 БегпечреноїусіпрерзегоіусіпуаіїАтареньеценсі"АІацеіпсекрево 0128 430 СтТТОСААСССАОСТТОСТИСАСАОООСАОСАССХСАССТСАСААОСАТСССААТОССАТО 873 129 БеротутикоїорезбтортодціпоіуйготпетниАзанівіуєАврргоАепліатІіє 145 480 ТТОСТОАОСТТССААСАССТОСТОССВСОЛАДОСТОСОТТТОСТОАТОСТТоТАСоАСоС 0539 149 РрепенсбегрпесіпнНіІзрезцечАкопріусува1їАковрелецМесьечнуаїс1усіу 1658 548 ТОСАСССТОТОССТСАОПСОБОССССАСССАССАСАВСТОТОСССАССАСААССТСТСТА 0595 159 БегтапгівисСуєуа!дтоакодіарторготистнтАзіауа1ркобегакутлрбетівм 185 500. СТОСТСАСАСТОААССАССТОССААЛАСАССАСТТСТОСАТІСТТОСАСАСАВАСТТСАСТ 659 189 Узірентву т echAzayisyeorkoAvpAtotpusehsiuvecetssiptvtAvpRIetTKk 208 560 beSTSAVS САОААСТАСТОССТОТОВОСТТСТОААОТОССАНСАСССАТТСАСАВССААЄ ЗІЗ 209 дтасега1адуотастптоіубеко1уреніезьуєтТьрсіпсіпсіурпеаколіацув 255 720 АТТЕСТОСТСТОСТОДАССАААССТОСАССТОССТООАССААКТОСССССАТАССТОААЄ 773 229 т1ерРтобіуренреназЗпоіптвгЗегаговбехрецавроіпІі1іерКосіутуютеиави 245 180 АССАТАСАСОАМТСТТОДАТООВАСТОСТОВАСТСТЕТОСТОБАСОСТОАСВСВСВАСО 813 249 Акот1енівстйеціенавос1іутатАкооіусеирдертосіуртовегАгоАтотТВх 258 840 СТАБСАСССССОСАСАТТТССТСАССААСАТСАСАСАСАСССТОССТОССАСССААССТО 8595 289 рембіудіартолеоіів5ековусіутвхубекАЗотпусіузекресРусрРтозВПОвВи 286

ВИР АVIR A

8500 САОССТОСАТАТТСТОСТТООССААСССКТОСТОСТАСТОСАСАСТАТАСОСТСТТСССТ 53 285 сійРгРОСІТукетРГОбегРЕОТНЕНІВРІОРКОТИхОоіусіпТугтлІрейрдерРКс 308 360 СТТОСАСССАССТТОСССАССССТОТОВТОСАБСТОСАСОССОСТОСТТОСтТодСССтТСт Са то0а БепРЕОРгОоТВЕПенРТОТНКРКОоМаїмаїсіплейнібртогренресртозвретовеє 395 1020 ОСТОСААСОСССАССССТАССАССССТСТТСТАААСАСАТОСТАСАСССАСТОССАСАКАТ 1079 32 АзТаРЕОТПЕРтотТпЕРХОтТрІсекРЕоресіечАвлтпгоагтухтВенивБегсоівАнИи 8 080 СТОТСТСАССААОССТААОСТТСТСАСАСАСТОССОАСАТСВОСАТТСТОТОСТОТАСАЄ 1139 345 Генбегп1псо1о01увай 153 11460 СтТОоССТТОССТОСАСООСССССТОССАВАСААСТОВАСААСАТТТССТАСТТТСТОСТ 01199 1206 КААСССААДОСССТОСТАДАДСССАТАСАСАССАСТОААААСССААТСАТІТТТСВСТОТ 1259 12590 АСАТТАТАААССТІСАСАКЛОСТАТТТТТТТАЛОСТАТСАССААРТАСТСАТСАСАССАССТ 1319 1320 АБСТСТТТОСТСТАТЕТТСТОСА 13428500 САОССТОСАТАТТСТОСТТООССААСССКТОСТОСТАСТОСАСАСТАТАСОСТСТТСССТ 53 285 сійРгРОСІТукетРГОбегРЕОТНЕНІВРІОРКОТИхОоіусіпТугтлІрейрдерРКс 308 360 СТТОСАСССАССТТОСССАССССТОТОВТОСАБСТОСАСОССОСТОСТТОСтТодСССтТСт Са то0а БепРЕОРгОоТВЕПенРТОТНКРКОоМаїмаїсіплейнібртогренресртозвретовеє 395 1020 ОСТОСААСОСССАССССТАССАССССТСТТСТАААСАСАТОСТАСАСССАСТОССАСАКАТ 1079 32 АзТаРЕОТПЕРтотТпЕРХОтТрІсекРЕоресіечАвлтпгоагтухтВенивБегсоівАнИи 8 080 СТОТСТСАССААОССТААОСТТСТСАСАСАСТОССОАСАТСВОСАТТСТОТОСТОТАСАЄ 1139 345 Генбегп1псо1о01увай 153 11460 СтТОоССТТОССТОСАСООСССССТОССАВАСААСТОВАСААСАТТТССТАСТТТСТОСТ 01199 1206 КААСССААДОСССТОСТАДАДСССАТАСАСАССАСТОААААСССААТСАТІТТТСВСТОТ 1259 12590 АСАТТАТАААССТІСАСАКЛОСТАТТТТТТТАЛОСТАТСАССААРТАСТСАТСАСАССАССТ 1319 1320 АБСТСТТТОСТСТАТЕТТСТОСА 1342

ЗИ. ІВZY. IV

ВО АБОБАБСТАСОССАВОСАСАСАСОССОСССАСЛКТОСАССТОАСТОААТТОСТОСТОСТО 60IN ABOBABSTASOSSAVOSASASASASOSSSOSSSASLKTOSASSTOASTOAATTOSTOSTOSTOSTO 60

Масбінпбеотвкоісьечтенієауві 9 61 штТСаТОСтТІСТОСТААЄТОСАДСОСтТАВСОСТО ОСА СТОСТОСТоСТТсТоАС 12) 18 УзімеєсеріечбертІВІаАтореутрт с ерсегБакрьоМіатоРІовІіасСувАвро о 29 121 СТОССАСТОСТСАСТАААСТОСТТССТОАСТОССАТОТССТТСАСАССКСАСТОДОССАЄ 180 рейдтауа!тенвекцувренгецакоавроекніяуаітечнівозетакуьецоекоій 4Масбінпбеотвкоісьечтенієауві 9 61 штТСаТОСтТІСТОСТААЄТОСАДСОСтТАВСОСТО ОСА СТОСТОСТоСТТсТоАС 12) 18 УзімеєсеріечбертІВІаАтореутрт с ерсегБакрьоМіатоРІовІіасСувАвро о 29 121 СТОССАСТОСТСАСТАААСТОСТТССТОАСТОССАТОТССТТСАСАССКСАСТОДОССАЄ 180 рейдтауа!тенвекцувренгецакоавроекніяуаітечнівозетакуьецоекоій 4

ІЗ ТОСССАСАССТТСАСОСТТРОССТАСАСЄСТОТОСТОСТОССТОСТСТОСАСТТТАССТІЄ 240FROM ТОСССАСАСТТСАСОСТТРОССТАСАСЕСТОТОСТОСТОССТОСТСТОСАСТТАСТСТСТСТИЕ 240

СувРІОбС1сУаіНіяРгосенртотлтргоуа!ечзрацруодіаувіАвронесбехьеси 69 841 ООАБКАТОСААДАСССАСАТОЬАОСАСАССАЛООСАСАСВАСАТТСТООСАССАСТОАОС 300 794 с1устотЕрТувтпгв1ілмесотооіутьхвувА1асіпАЗрІ1ебенсіуд!лаувітях 89SuvRIObS1sUaiNiyaRgosenrtotltrgoua!echzracruodiauviAvronesbehyesy 69 841 OOABKATOSAADASSSASATOJAAOSASASALOOSASASVASATTSTOOSASSASTOAOS 300 794 s1ustotErTuvtpgv1ilmesotooiiutkhvuvA1asipAZrI1ebensiud!lauvityah 89

З0Е сСтТТСтТосСтосАсИбАСТСАТОВСАССАСОСССАСААСТОССАСССАСТТОССТОТСАТСС 36 90 Тесбешйбецо іт 0б1ууазМенАтаА1айтобіує1іпьезсіурустнгсувьеновибет 109 361 СТОСТОСООСАОСТТТСТОСАСАОСТОСОТСТОСТОСтТТоСоооССтТоСАСАСОСТОСТТ 420 119 Бепбеисіусіврезбато1у1пуа1АгобачлевсеобіуАзіаглецоійбетієццен 129 431 ССААСССАССТТССТОСАСАСООСАССАССАСАССТСАСААОСАТСССААТОССАТСТІС 485 130 біутнусіврейруоргосіпс1іувтатохтнкАз1анізьувАБрртоАзпАіатіврня 149 481 СТОАОСТІССВАСАССТОСТОССАОВАКАСОАСТІСТОСАТ ТТ ОСА АСАААСТІСАС 540 150 БенбекепесійніврецпейдлтссіурувазрРиеттріїеуаїс1уаврьувреинів 359 541 ТОССТСАСССАСААСТАСТООСТИТОСОСТЕСТОААВТОССАССАСОВАТИТАСАСОСАА, 500 170 СучпеобегоіпАвптутттрьеиттразабетоіпуа1А1аАзасіутівсіпбекоїя 185З0Е сСтТТСтТосСтосАсИбАСТСАТОВСАССАСОСССАСААСТОССАСССАСТТОССТОТСАТСС 36 90 Тесбешйбецо іт 0б1ууазМенАтаА1айтобіує1іпьезсіурустнгсувьеновибет 109 361 СТОСТОСООСАОСТТТСТОСАСАОСТОСОТСТОСТОСтТТоСоооССтТоСАСАСОСТОСТТ 420 119 Бепбеисіусіврезбато1у1пуа1АгобачлевсеобіуАзіаглецоійбетієццен 129 431 ССААСССАССТТССТОСАСАСООСАССАССАСАССТСАСААОСАТСССААТОССАТСТІС 485 130 біутнусіврейруоргосіпс1іувтатохтнкАз1анізьувАБрртоАзпАіатіврня 149 481 СТОАОСТІССВАСАССТОСТОССАОВАКАСОАСТІСТОСАТ ТТ ОСА АСАААСТІСАС 540 150 БенбекепесійніврецпейдлтссіурувазрРиеттріїеуаїс1уаврьувреинів 359 541 ТОССТСАСССАСААСТАСТООСТИТОСОСТЕСТОААВТОССАССАСОВАТИТАСАСОСАА, 500 170 СучпеобегоіпАвптутттрьеиттразабетоіпуа1А1аАзасіутівсіпбекоїя 185

Е0ОЇ бАТТОСТОСТСТОСТОААССВААССТОСАССТОССТОСАССАААТССССССАТАССТоАА 560 1950 Аербекттроекатасіуеуоаепренсіпуг1РуобіургоАепрРЕОАКЧІ1іертосій 205Е0ОЙ бАТТОСТОСТСТОСТОААССВААССТОСССТОССТОСАССААААТСССССССТАССТОАА 560 1950 Aerbekttroekatasiueuoaeprensipug1RuobiurgoAeprREOAKCHI1iertosii 205

БІ СМООАТАСАССААСТСТТОЛАТОСААСТСТОСАСТСТТТОСТОСАСОСТСАСоСАссаС 0730 210 стпабртнидтатиереооіітеразасетттртнгьейзестертйгоентвусіпаєр 225 721 ССТАСОАОССССОСАСАТТТССТСАСОЛАСАТОАСАСАСАСОСТОССТОССАСССААОСТ 789 230 рходуссегтетостіунівВперенакоавптівАтонізАхоречРхоАіатнувіпртс 2495 781 ССАСССТОСАТАТТОТОСТТОСССААСОСАТОСТОСТАСТОСАСАСТАТАСОСТОТТССС 840 250 РкодіатгрІ1ерребетРпеРтойвпРуобегоестТуєттрінеуаїтТусаіапеорто 263 гаБІ СМООАТАСАССААСТСТТОЛАТОСААСТСТОСАСТСТТТОСТОСАСОСТСАСоСАссаС 0730 210 стпабртнидтатиереооіітеразасетттртнгьейзестертйгоентвусіпаєр 225 721 ССТАСОАОССССОСАСАТТТССТСАСОЛАСАТОАСАСАСАСОСТОССТОССАСССААОСТ 789 230 рходуссегтетостіунівВперенакоавптівАтонізАхоречРхоАіатнувіпртс 2495 781 ССАСССТОСАТАТТОТОСТТОСССААСОСАТОСТОСТАСТОСАСАСТАТАСОСТОТТССС 840 250 РкодіатгрІ1ерребетРпеРтойвпРуобегоестТуєттрінеуаїтТусаіапеорто 263 га

841 ТСТТССАСССАССТТОСОСАССОСТОТОСТОСАСС ТАС СТО 0900 270 БехзествуНівренаіанівртосСуво1урКОА1аргоркорКовіаветЕпй 286 901 ТОСТОСААССОССАССССТАССАССССТОТІСТАЛАСАСАТССТАСАСССАСТСССАСАА 960 961 "ТСТОТСТСАССААСОСТААОСТТСТСАСАСАРТОССОАСАТСАССАТТСТСТОСТОТАСА 1020 1027 ОСТООСТТСОСТОСАВСОСОССССТООСАСАСААСТОСАСААСАТТТОСТАСТТТСТОСТ 1080 1081 "САХАСССАААССССТОЗТАВАЛОССАТАСАСАСОАСТОЛАААСОСАА ТАТ ТАС 1140 1141 ТАСАТТАТАЛАССТТСАСАДОСТА 1154841 ТСТТССАСССАССТТОСОСАССОСТОТОСТОСАСС ТАС СТО 0900 270 БехзествуНівренаіанівртосСуво1урКОА1аргоркорКовіаветЕпй 286 901 ТОСТОСААССОССАССССТАССАССССТОТІСТАЛАСАСАТССТАСАСССАСТСССАСАА 960 961 "ТСТОТСТСАССААСОСТААОСТТСТСАСАСАРТОССОАСАТСАССАТТСТСТОСТОТАСА 1020 1027 ОСТООСТТСОСТОСАВСОСОССССТООСАСАСААСТОСАСААСАТТТОСТАСТТТСТОСТ 1080 1081 "САХАСССАААССССТОЗТАВАЛОССАТАСАСАСОАСТОЛАААСОСАА ТАТ ТАС 1140 1141 ТАСАТТАТАЛАССТТСАСАДОСТА 1154

ВИС. побзка 1 МЕПТЕТІЛАЛМЕСЕТАКЕОРСТРАВРАСВРВЕ І Емі ВОВиУЬНОВОВОС 5ОHIGH pobzka 1 MEPTETYLALMESETAKEORSTRAVRASVRVE AND Amy VOVyUUNOVOVOS 5О

РЕ І. с ЕЕ БО ЕІ цалувені МЕПТЕЦСІБУУЧЬСОТАВОТЬЯЯРАРРАСОЮОВУСЗКОСНОЗКУЬНІАСОС 50 5і ВБІУРЬЯТВИУОСРАЧЮТВІСЕИ КТОСКЕОТКАСТАМОКУ, АІІФСААКО 100 аа ме НА НН НИ Я НН АННА АНА 1 ЕК УНН КЛІ ДАЖЕ АД ЯК ЯКЕ ТЕІТКИ 51 РЕУНРІЕТЕУЬЬРАУЮЕБІОКИКТОМЕЕТКАОВТ ОЛУТИ ОС ЕсУМААВО 100 їм ОСЬОРЕСЬ ЗБЕ ЕСО УВС ОВАСОСТІ СТОР РООВ ТТ ТКА 152РЕ І. с ЕЕ БО ЕІ цалувені МЕПТЕЦСІБУУЧЬСОТАВОТЬЯЯРАРРАСОЮОВУСЗКОСНОЗКУЬНІАСОС 50 5і ВБІУРЬЯТВИУОСРАЧЮТВІСЕИ КТОСКЕОТКАСТАМОКУ, АІІФСААКО 100 аа ме НА НН НИ Я НН АННА АНА 1 ЕК УНН КЛІ ДАЖЕ АД ЯК ЯКЕ ТЕІТКИ 51 РЕУНРІЕТЕУЬЬРАУЮЕБІОКИКТОМЕЕТКАОВТ ОЛУТИ ОС ЕсУМААВО 100 їм ОСЬОРЕСЬ ЗБЕ ЕСО УВС ОВАСОСТІ СТОР РООВ ТТ ТКА 152

ПУБ НИ ІТТ ЕТ ІТPUB NI ITT ET ETC

ІІ оБсРІСЬВВОЬСОПеСОМВОБАКОБІСТОСВ РОСТ ТАНКОРМАТТ, 150 і51 БЕ СОБКО КВ ЬЕУАОР ТЕС КовОР ТТ АУЕ ТК ВОР Сто АКЬеКВто 200 шо АН Ви Ви ан АНА Н КННННН 151 БРОМОБВСОКУКЕВМИЛЮСОТЬСУВНАРРТТАУРОВТЗБУЄТЬМЕВОМАТВ 300 201 СПОЕТНЕВІЗВВТТОЗОСОКВІОЧЕ НАХ РО КОТ ОВ МО ТеонояВт ї50II Obsopisopesopesomvobistos Rost Tancormatt, 150 I51 Bebko KVAAOR TPP TT TT AUE AUE WOR WOR Hundred Aquaekvto 200

Р. ЕЕ НЕО. 201 ПСВООЕТМЕТАБАВТІОВОССКИЦОСТВАКІВ ОТО ОО1РОУІ МІ 7250 251 НОРІМСТНСЬКРОЬЗІТАІЗАРОТРРСТООМОВЬРРМІМОВІВРБРІНЕ? 300R. EE NEO. 201 PSVOOETMETABAVTIOVOSSKITSOSTVAKIV OTO OO1ROUI MI 7250 251 NORIMSTNSKROJZITAIZAROTRRSTOOMOVRRMIMOVIVRBRINE? 300

НУ ЕЕWell, EE

251 НЕЛСТЕСЬКООРЕНИТІЗАРСІСОСТООТОСЬРРМСОРОТВОБЕтТНр? 300 зі РООХХПЕЗРНРІБРТРОМРІЮРЕЕРОВЗА, ТАКУТОРІОТАКНРНЕСВИВ 349 ее м ме п и п В ЕН ОП М НИ 301 ТСОУТБЕРБРРТБРІРУУОЬНРЬБРОР АРТ ТРІЕРІМТІУТНООМОВ 350 358 ох 352 за ОБО 353251 300 with ROOKHPEZRNRIBRTROMRIYUREEROVZA, TAKUTORIOTAKNRNESVIV ee m me p y p V EN OP M NY 301 TSOUTBERBRRTBRRIRUUOONBRBROR ART TRIERIMTIUTNOOMOV 350 358 oh 352 for OBO 353

Тнг.13А вжи 1 МЕТО КОСААМИДАУ АКТ БРУАРАСОВ ВІК ОВЛЕВІЬНВНЕВОС ЕйТнг.13А жы 1 METO KOSAAMIDAU ACT BRUARASOV AGE OVLEVI'NVNEVOS Hey

І НЦД ЗЕ Н НЦЕНИ саковею МЕБТЕЦСУУМОСТМОТЬОВРАРРАСОБВМОЗКІТВОЗНУДНЯВЬНЮ 5 53 РОУОВООІРУТПРАМОКО СЕН ТОТЕОВК Ар У ЖІ ьксуМАвеО 106I NCD ZE N NCSENY SAKOVEYA MEBTETSSUUMOSTMOTYOVRARRRASOBVMOZKITVOZDNYAVNYU 5 53 ROUOVOOIRUTPRAMOKO SEN TOTEOVK Ar U ZHI iksuMAveO 106

ДНЯ рр ЕІ РІDAYS of EI RI

АТ ТЕН ТУ НАУJSC TEN TU NAU

ВИУКРОРТВУІВАУЮК ВЕК МКК ОТП ОАУ ТЛ ЕОММААНО 100 121 ОБЕРЕСЬЯХЬКОСЬ СОУ ВИ сАТОСТІСТОБРІОСНтТТАНКОРКАрЕї 156 кр. БЕР: :1фТРТ:І3 ІРР; рЕріЕ:рфЕрі.їVYUKRORTVUIVAUYUK VEK MKK OTP OAU TL EOMMAANO 100 121 OBERESYAHKOS SOU YOU SATOSTISTOBRIOSNTTTANKORKArei 156 kr. BER: :1fTRT:I3 IRR; rEriE:rfEri.i

АТ ОО ЕТ РІ, 121 ОбБаКтТогЕВІ ОО аОСУВЕ ЗМИВ ТТАНКЛВМАІРЬ 150 154 БІДОБЦВОЙМАТІІА ЕОР СТВЕТЬрт ту ЕТ іти 200AT OO ET RI, 121 OBBAKtTOGEVI OO aOSUVE ZMYV TTANKLVMAIR' 150 154 BIDOBCVOYMATIIA EOR STVET'rt tu ET ity 200

ОН ДЯ ТАНON DIA TAN

ПИ ИН рр їх ії ї 13, 151 ББОВОРАОКУВЕІМІАЮОЄТЬСУВНАВЕТТАСРЕНТВОЛЬТЬВЕСРМАТВ 200 201 ОБОЕТМЕЕУТАНТАЮРО ОВ ВСОСТ ВУ КІ ТРОС МОТО РУСІВОМІМА 250 1 НИ ї Й Н ії Її ее У ІННО ТТН, 201 СББЕТКЕТАБААТТОВ ТИ ІКУОЮСЕВАХІ. ВИНО ВСМ ТЕМА 343 251 ані пий вини ав о ВТМ за й ЕНН НННЕННННН ПИ НННИНИНИ ННИ ЯН. я 250 ІНЕЛЯЮСТЕСІУ РОВЕКИТЬОВРОХЗВОТВІТІВОРРМІОРСТУЄРЕРТИ? 399 33) ВООН.ТРРРЕЗВАСРТ ТВО ОНР СЕВОРЕТІМеНЕтТАРНРУТУИеНЕ 359PI IN rr ih ii ih 13, 151 BBOVORAOKUVEIMIAYUOETSUVNAVETTASRENTVOLTVESRMATV 200 201 OBOETMEEUTANTAYURO OV VSOST VU KI TROS MOTO RUSIVOMIMA 250 1 NI ih Y N ii Her ee U INNO TTN, 201 SBBETKETABAATTUOVA TY IKUO. WINE VSM TOPIC 343 251 ani drink wine av o VTM for and ENN NNNNENNNNN PY NNNNININY NNY JAN. 250 399 33) VOON.TRRRESVASRT TVO ONR SEVORETIMENETTARNRUTUIENE 359

БЕРЛІН. Я,BERLIN. I,

ЗО РІЄПУТІВРОВЕТОКТ. ПЛАНЕТ РОРЯАРТРТРТЕРЬКМТУТИУ 345 350 яньсовтТ ЗБЕZO RIEPUTIVROVETOKT. PLANET RORYAARTRTRTERKMTUTIU 345 350 yansovtT ZBE

НК, зт днідоха 353NK, zt Dnidokha 353

І оAnd about

Ся вит . діло В у 1 к СНЗОСЕНоСНе Од СНоб М у ще с і У з Й ІякSya vit. case V in 1 k SNZOSENoSNe Od SNob M u still s and U z Y Iyak

Д т. г и 7 р Н Й ян ше БО НоМІмМаСЕ 7D t. g i 7 r N Y yan she BO NoMImMaSE 7

ГеGe

З їWith her

ІСнаОіСснасноюттчнес мні МООЕчНномькИСнаОиСснасноютчнес мни МООЕчНномк

Жито и полдлолехк БИ ШИК, шляRye and poldlolehk WOULD BE CHIC, shlya

К снзд(іЄнеснебівєнасна он як (НомілеМаОЕ масивна сна сно тісна сно сно НМ Магнат,K snzd (iYenesnebivyenasna on as (NomileMaOE massive sleep sleep tight sleep sleep NM Magnate,

Кк й КОДежЕЄтТОЮ сркоюія ПЕ, ПФЕЗЛИПУЮЮВИХ С малактлой Ме п 7 Оле: ЕНь «ллимелутеюА Є, МОпоЛьЗучМОгО 8 ШИ пледи НОПЛиМер, Пе М дея цю Мопегесм р КХ, пай ЛІ ЛОЮ молиеєсою Я КЕ т - Помее ммоло песничких ЯМИВОгСНУтт па МОЗуКк и КОДЕЖЕТТОХ srkouiya PE, ПФЕЗЛИПУЮЮЮХ Малактлой Me p 7 Ole: EN "llimeluteuA Е, MOполЗучМОгО 8 Ш плед НОПЛимер, Pe M deya this Mopegesm r КХ, pay LI LOYU molieesoi I KE t - Pomee mmolo songs of YAMIVOgSNUtt pa MOZu

ЗЛУZLU

Мн р о й кни дж 3-«К Не - НАСЕ днMn r o and kny j 3-"K Ne - NASE dn

МасМВн. рнз-вMasMVn rnz-v

МН винен ч Во мн вх 00 3АнеонУвЕВ я--е- ізооХ щихMN guilty h Vo mn kh 00 3AneonUvEV I--e- isooH shchyh

ВИС. ТАHIGH AND

Е и. 0.003 | А вAnd 0.003 | And in

Е і щ г: й 0.002 1 і і я / х 7 0001 Е ши п иE i sh g: y 0.002 1 i i i / x 7 0001 E shi p i

Я 0000 Ян вин ун фр 000 19:00 259.00 30.00Me 0000 Jan vin un fr 000 19:00 259.00 30.00

МицУтУ виг. 16 5 З Ж 5 од003 і В КН щ- гу А . - І КАMysUtU ed. 16 5 Z Zh 5 od003 and V KN sh- gu A . - And KA

Е 00027 цей іш в 3 / ве У щі е Ф.001 3 ОтE 00027 this ish in 3 / ve U shchi e F.001 3 Ot

Ки / Я 0000 зтілльння : ; 0.00 юра 2000 0.00Ki / I 0000 filling: ; 0.00 jura 2000 0.00

МинутиPass

ЗИГ.В ве, я с Ї 8 0.006 щ ШІ гі І я 0004 й. - 02 | хZIG.V ve, i s І 8 0.006 sh І gi І і 0004 і. - 02 | h

Ехо 3 чи 0,000 зе тсрттрні рент 0.00 10,00 2000 30,00Echo 3 or 0.000 ze tsrttrni rent 0.00 10.00 2000 30.00

МаНнути воов-їMaNnuti voov-y

БОВО- « - НBOVO- « - N

Ж яов- в т -х і і що жюОВ- до ВО х - "Zh yaov- in t -h i and that zhyuOV- to VO x - "

З 1060-4 1 й Я ерегттортптяртттлер тя о і це ща оооFrom 1060-4 1 y I eregttorpttjarttler tya o and this shcha ooo

МЕСуЕСАВЬMESUESAV

И.ВI.V

Тесте зененемекених ( полювання і ( Хперсвьемиюм «еОМОТОГОКОМИ у уTeste zenenemekenih (hunting and ( Khpersvyemiyum "eOMOTOGOKOMY in u

Очдарнний зилитюваунем пух рехеиавитнаго Человек п в п ї | ї й шк в о рись ну я ї й ча ї хм - -я ої ія Н х х ІЗ 85 - - 7 і ї - ми воОо0 Е І - оди робеаоритетьOchdarny zilityuvaunem puh reheiavytnago Человек p v p i | и и шк в о рис ну и и ча и хм - -я ои ия Н х х ИЗ 85 - - 7 и и - мы воОо0 Е И - оди робеаоритет

Е я ЯК пдезвна не ук!And I'm not uk as my surname!

ГЕ дестеогитель ЇGE desteogitel Y

Е У пазух вх упавE In the sinuses of the ear fell

Н ІN. I

18 яри 0 5 10 15 20 вк. - М і о 10009 ех диса пх І їх я яд г Мо 4 раз і с 4 чі з | щи ї 0199-9 ге і18 gaps 0 5 10 15 20 inc. - M i o 10009 ek disa ph I ikh i yad g Mo 4 times and s 4 chi with | Shchi i 0199-9 ge i

М, п Н я ЩО я--н- ПК потвори і х Які :M, n N i WHAT i--n- PC monsters and x Which:

Б: роя соблуцинив я растрнхаемь га 49 Я ЮДИ р СОХОУЮИВЕВ НИМ Мои ЛОВеХа х 9 тт т ОНИ 0 5 7 9 11131517 19 21 24 леньB: roy soblucyniv I rastrnkhaem ha 49 I YUDI r SOKHOUYUIVEV HIM My LOVeHa x 9 tt t THEY 0 5 7 9 11131517 19 21 24 laziness

І слнврен темпи МОГ солодке і - і 5 в я дув і х 1003-35 щі БИУКЕЛЬ Я 5 х у / р !And slnvren tempos COULD sweet and - and 5 in I blew and x 1003-35 shchi BYUKEL I 5 x in / r !

Е Я ' вк в о Н ї І Кк. фони и 5 ню в-шщ- с х Х !E I ' vk v o N i I Kk. backgrounds and 5 nu in-shsh-s x X !

Її ; В ті ш - ша х ! 57 в ОЗ 15 4У 13 21 24Her ; In those sh - sha h! 57 in OZ 15 4U 13 21 24

МВ»MV"

ЖИ х вна: . щи В т -а ;ЖХ x vna: . shchi V t -a ;

Е. тій : 14 Дт ТоE. that: 14 Dt To

Е. шк в во | КЕ ятіE. shk v vo | KE yati

ШЕ ШЕ НИ Шяпе ї | і - З сей ПежрнбонвнтєТSHE SHE NI Shyape i | and - From this PezhrnbonvntyeT

Кло 5 | Ш х : ває шує ОДОКАКИОТАЙ,Clo 5 | Sh x: waye shue ODOKAKIOTAI,

Е й 7 здЕйумич педстааAnd 7 zdEyumich pedstaa

ОО фрртрргттертетрттутттттти тт рити а 08 15 15 25 25 30 35 «0 45ОО frrtrrgttertetrttutttttti tt ryti a 08 15 15 25 25 30 35 «0 45

ЩНГ.НеSHNG.No

ГУ перннннтнтнннннтннтятнннтннннятттнтGU pernnnntntnnnnntnntyatnnntnnnntttnt

КЗ 1 ! 7 ДОВ б як З ШИ хх 1 7 Н ' ще шеShort circuit 1! 7 DOV b as Z SHY xx 1 7 N ' still she

І З Кит В ї Й іI Z Kit V i Y i

М | 4 Сх і 00- К р. І ! є 1 СM | 4 Sh and 00- K r. I ! there is 1 C

Е і ся ! ше г іє 5 10 15 50 55 ян пе 1-18 12Ка дірест (РЕ ле - - С0нО 1-33 шовк ПОВ 163 (25КО попореві РЕ 17 шко ФО 1163 (ОКО пюпоред)і (РЕС8) чення ОВ кг ояOh and here! she gie 5 10 15 50 55 jan fri 1-18 12Ka direst (RE le - - С0нО 1-33 silk POV 163 (25KO poporevi RE 17 shko FO 1163 (OKO pyupored)i (RES8) chenie OV kg oya

АТО ААА АСТ ССТ ОСА ССА ОСТ СА ТОТ САТ о ТтТА соо сто стоATO AAA AST SST OSA SSA OST SA TOT SAT o TtTA soo hundred hundred

МЕТ СХ БЕБ РКО ДБА РЕО РО АБА су ДЕР БЕ АВО УдІ. ПЕОMET SH BEB RKO DBA REO RO ABA su DER BE AVO UdI. PEO

ТСТ ААА СТО СТО СОС САС ТОтТ САС СТО Ста САС отТоТ СстТ стеTST AAA STO STO SOS SAC TOtT SAC STO Sta SAC otToT SstT ste

ЕК ЦЖЯ БЕ БЕО АКСОАБР ОБЕВ НІЯ УА, СЕУ НІЗ БЕВ АБС БЕОEK CZHYA BE BEO AKSOABR OBEV NIA UA, SEU NIZ BEV ABS BEO

ТСС САС ТОС ССО САА стр ОСво сс сто СС АСС СОС стТтТ стоTSS САС TOS ССО САА str OSvo ss hundred SS ACC СОС stTtT hundred

БЕ СОМ СУЯ РО СО МА НІЄ РЕО БЕ ОВДО ТНК РВО УА БЕBE SOM SUYA RO SO MA NIE REO BE OVDO TNK RVO UA BE

Сстт ССО Ост СТ САС ОТТО ТОС СТО ОСТ ОДА ТОоС ДА АСС САССстт ССО Ost ST САС OTTO TOS STO OST ODA TOoS DA ASS САС

БЕ РО АВІА УАЬ АБР ОРЕ БЕВ ОББОО Сож сіро тар ря ТНЕ СІЯBE RO AVIA UAH ABR ORE BEV OBBOO Sozh siro tar rya TNE SIYA

АТО САА САС АСО ААА ОСТ САС САС АТС СТО ОТ ОСА СТА АСстТATO SAA SAS ASO AAA OST SAS SAS ATS ATS STO OT OSA STA ASstT

МЕТ сіб ЄЦО ТнВ о БуУб АГА СОМ ОАБРОІБЕ ЦКУ СОУ АПА УА ОТНА ста Стр сто сАК бос стТт АТ ост оса сот оосС САС о стТт соMET sib ETO TnV o BuUb AGA SOM OABROIBE CKU SOU APA UA OTNA sta Str sto saAK boss stTt AT ost osa sot ooS САС o stTt so

СЕО ББО БЕ ср бИЖ УАД, МЕТ АГА АБА АВО сЬЖ СІМ БЕ) СІЯ се дос отос сте тТст тес сто стр ОС САС сто тот о оос САСSEO BBO BE sr bIZH UAD, MET AGA ABA AVO sЖ SIM BE) SIYA se dos otos ste tTst tes sto str OS SAS sto tot o oos SAS

РО ТНЕ СЖ5 МЕЗО БЕ БЕ ЕЙ ПЕЖО ОБУ СІМ ПЕО ЕВ СОЖ ОСІВ сттосат сто сто сте бос ост остТо САС тот Сто ст оС АСRO TNE SZH5 MESO BE BE EY PEJO BO SYM PEO EV SOJ OSIV sttosat sto sto ste bos ost ostTo САС tot Sto st оС АС

УА АВ ПЕ БЕ ОБЕО ОБУ АПА БЕО СОМ ОЗЕВ ОБЕЄС ПО СПУ ТНЕUA AV PE BE OBEO OBU APA BEO SOM OZEV OBEYES PO SPU TNE

САо сто ССО сСсСА САС СОС СОТ АСо ДСтТ ОСТ САС АЛЛО САТ ССОSAo hundred SSO sSsSA SAS SOS SOT ASo DStT OST SAS ALLO SAT SSO

СІМ ПЕШ РВО РЕФ ОСІМ СХ АЕС ТЕ ТНА АБА НІБ ПУБ АБ РЕОSIM PESH RVO REF OSIM SH NPP TE TNA ABA NIB PUB AB REO

АС ОСТ АТС ТТС СТО ТСТ ТТ САБО САС СТО СТО ССтТ Об АЛАAS OST ATS TTS STO TST TT SABO SAS STO STO SStT Ob ALA

АБМ АБА ІЩЕ РНЕ БЕО БЕВ РНЕ СЬМ НІ ПЕ ОББЦ АВС сп БЖ стт бот тт Сто АТО сто стт бос ост ТСтТ АСо сто ТоС отABM ABA STILL RNE BEO BEV RNE SM NO PE OBBC АВС sp BЖ stt bot tt Sto ATO sto stt bos ost TStT ASo sto ToS ot

УА АВС ВНЕ БЕ МЕТ ББО МАВ ОСП СЖ бЕБ ТНЕ ПРИ Ст УА ст соб со Со СС АССоАСТ сСтТ СТЕ ССО ТСстТ ТААUA AVS VNE BE MET BBO MAV OSP SZH bEB TNE PRI St UA st sob so So SS ASSoAST sStT STE SSO TSstT TAA

АВС АВС АдА ОРНО РРО ТНА ТНЕ АБА МА ОРКО 5ЕВ ЗОВAVS AVS AdA ORNO RRO TNA TNE ABA MA ORKO 5EV ZOV

ЗИГ,25ZYG, 25

Claims (24)

1. Монопогированньй полипептид фактора роста и дифференцировки мегакариоцитов (ФРМД), включающий аминокислоть! 22-184, фиг. 11, в котором полизтиленгликолевая группа прикреплена к М-концу полипептида.1. Megakaryocyte growth and differentiation factor monopogyropolypeptide (MFMD), including amino acid! 22-184, fig. 11, in which the polysethylene glycol group is attached to the M-terminus of the polypeptide. 2. Монопзгированньій полипептид ФРМД по п. 1, отличающийся тем, что полизтиленгликолевая группа имеет среднюю молекулярную массу от 2 до 100 кД.2. Monopolypeptide FRMD according to claim 1, characterized by the fact that the polyethylene glycol group has an average molecular weight of 2 to 100 kD. 3. Монопогированньй полипептид ФРМД по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полипептид ФРМД получают в клетке Е. Соїї.3. The monopomylated FMD polypeptide according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the FMD polypeptide is produced in a cell of E. Soyii. 4. Способ крепления водорастворимого полизтиленгликоля к полипептиду ФРМД, включающему аминокислоть! 22-184, фиг. 11, заключающийся в том, что контактируют полипептид ФРМД с полизтиленгликолем в таких условиях, чтобьі ополипептид ФРМД соединился с полизтиленгликолем для получения /М-конца монопзгированного полипептида ФРМД.4. The method of attaching water-soluble polyethylene glycol to the FMD polypeptide, which includes an amino acid! 22-184, fig. 11, which consists in the fact that the FMD polypeptide is contacted with polysethylene glycol under such conditions that the FMD polypeptide combines with polysethylene glycol to obtain the /M-end of the monopzgirovanie FMD polypeptide. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что полизтиленгликоль прикрепляеєтся к полипептиду ФРМД в условиях восстановительного алкилирования при достаточно кислом значений рН, чтобьї альфа-аминогруппа на М-конце полипептида ФРМД бьіла реакционноспособной.5. The method according to claim 4, characterized by the fact that polyethylene glycol is attached to the FMD polypeptide under the conditions of reductive alkylation at sufficiently acidic pH values, so that the alpha-amino group at the M-end of the FMD polypeptide is reactive. б. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что полипептид ФРМД является монопзгированньм с полизтиленгликолем, имеющим среднюю молекулярную массу от 2 до 100 кД.b. The method according to claim 4 or 5, characterized by the fact that the FMD polypeptide is monosubstituted with polyethylene glycol having an average molecular weight of 2 to 100 kD. 7. Способ по любому из пп. 4-6, отличающийся тем, что полипептид ФРМД получают отщеплением Ме" ув! от полипептида, полученного путем зкспрессии в клетке Е. Соїї последовательности ДНК, кодирующей полипептид, содержащий аминокислоть 22-184, фиг. 11, и последовательность Меї-І уз на М-конце ее.7. The method according to any one of claims 4-6, characterized by the fact that the FMD polypeptide is obtained by cleavage of the polypeptide obtained by expression in E. Soy cells of the DNA sequence encoding the polypeptide containing amino acids 22-184, Fig. 11, and a sequence of Mei-I bonds at the M-end of ee. 8. Способ по любому из пп. 4-6, отличающийся тем, что полипептид ФРМД получают: а) путем зкспрессии в клетке Е. СоїЇї последовательности ДНК, кодирующей полипептид, содержащий аминокислоть! 22-184, фиг. 11 и последовательность Меї-І уз на М-конце ее; б) вьіделения зкспрессированного полипептида, и в) отщепления Меї"Г ув от виіделенного полипептида.8. The method according to any of claims 4-6, characterized by the fact that the FMD polypeptide is obtained: a) by expressing a DNA sequence encoding a polypeptide containing an amino acid in an E. soybean cell! 22-184, fig. 11 and the sequence of Mei-I bonds at the M-end of ee; b) secretion of the expressed polypeptide, and c) cleavage of the secreted polypeptide. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая монопогированньй полипептид ФРМД по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемьйй разбавитель, адьювант или носитель.9. A pharmaceutical composition containing the monopogyrized polypeptide FMD according to any one of claims 1-3 and a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or carrier. 10. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитарньх осложнений.10. Pharmaceutical composition according to claim 9, characterized by the fact that it is used for the treatment of platelet complications. 11. фФармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитопении.11. Pharmaceutical composition according to claim 9, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia. 12. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитопении, вьізванной химиотерапией, радиационной терапией или трансплантацией костного мозга.12. Pharmaceutical composition according to claim 9, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia, induced chemotherapy, radiation therapy or bone marrow transplantation. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая монопзгированньй полипептид ФРМД, изготовленньй по способу по любому из пп. 4-8, и фармацевтически приемлемьїй разбавитель, адьювант или носитель.13. A pharmaceutical composition containing a monohydrolyzed FMD polypeptide produced by the method of any one of claims 4-8, and a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or carrier. 14. Фармацевтическая композиция по п. 13, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитарньх осложнений.14. Pharmaceutical composition according to claim 13, characterized by the fact that it is used for the treatment of platelet complications. 15. Фармацевтическая композиция опо п. 13, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитопении.15. Pharmaceutical composition according to claim 13, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia. 16. Фармацевтическая композиция по п. 13, отличающаяся тем, что используется для лечения тромбоцитопении, вьізванной химиотерапией, радиационной терапией или трансплантацией костного мозга.16. Pharmaceutical composition according to claim 13, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia induced by chemotherapy, radiation therapy or bone marrow transplantation. 17. Монопогированньй полипептид ФРМД по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что используется как медикамент.17. Monopogyrized polypeptide FMD according to any one of claims 1-3, characterized by the fact that it is used as a medicine. 18. Монопзгированньй полипептид ФРМД, изготовленньїй по способу по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что используется как медикамент.18. Monopolypeptide FMD, produced by the method according to any one of claims 4-8, characterized by the fact that it is used as a medicine. 19. Монопзгированньйй полипептид ФРМД по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что используется в производстве медикаментов для лечения тромбоцитарньїх осложнений.19. Monopolypeptide FRMD according to any of claims 1-3, characterized by the fact that it is used in the production of medicines for the treatment of platelet complications. 20. Монопзгированньій полипептид ФРМД, изготовленньїй по способу по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что используется в производстве медикаментов для лечения тромбоцитарньїх осложнений.20. Monopolypeptide FMD, produced by the method according to any one of claims 4-8, characterized by the fact that it is used in the production of medicines for the treatment of platelet complications. 21. Монопогированньйй полипептид ФРМД по любому из пп. 1-3, отгличающийся тем, что используется для лечения тромбоцитопении.21. Monopogyrized polypeptide FRMD according to any of claims 1-3, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia. 22. Монопзгированньій полипептид ФРМД, изготовленньїй по способу по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что используется для лечения тромбоцитопении.22. Monopolypeptide FMD, produced by the method according to any one of claims 4-8, characterized by the fact that it is used for the treatment of thrombocytopenia. 23. Монопзгированньйй полипептид ФРМД по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что используется в производстве медикаментов для лечения тромбоцитопении, вьїізванной химиотерапией, радиационной терапией или трансплантацией костного мозга.23. Monopolypeptide FRMD according to any one of claims 1-3, characterized by the fact that it is used in the production of medicines for the treatment of thrombocytopenia, induced chemotherapy, radiation therapy or bone marrow transplantation. 24. Монопзгированньій полипептид ФРМД, изготовленньїй по способу по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что используется в производстве медикаментов для лечения тромбоцитопении, вьізванной химиотерапией, радиационной терапией или трансплантацией костного мозга.24. Monopolypeptide FMD, produced by the method according to any of claims 4-8, characterized by the fact that it is used in the production of medicines for the treatment of thrombocytopenia induced by chemotherapy, radiation therapy or bone marrow transplantation.