PL180639B1 - Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL180639B1 PL180639B1 PL95317874A PL31787495A PL180639B1 PL 180639 B1 PL180639 B1 PL 180639B1 PL 95317874 A PL95317874 A PL 95317874A PL 31787495 A PL31787495 A PL 31787495A PL 180639 B1 PL180639 B1 PL 180639B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- hpv
- crpv
- vector
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków, znamienna tym, ze zawiera wektor zawierajacy: a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujacy bialko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmujacej L 1 i L1+L2 jednego lub wiecej typów HPV wybranych sposród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18, b) promotor CMV, c) terminator transkrypcji z genu bydlecego hormonu wzrostu i d) gen markerowy opornosci na neomycyne, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze. PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka polinukleotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków.
Wynalazek dotyczy nowego produktu farmaceutycznego: kwasu nukleinowego, który po wprowadzeniu bezpośrednio do tkanki żywego kręgowca wywołuje odpowiedź odpornościową swoiście rozpoznającą wirusa brodawczaków.
Zakażenia wirusem brodawczaków (PV) mają miejsce u wielu zwierząt, w tym ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i cieląt. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonkowe, wywołując łagodne nowotwory nabłonkowe i włóknisto-nabłonkowe w miejscu zakażenia. Wirusy brodawczaków są czynnikiem zakaźnym swoistym dla gatunku tzn. ludzkie wirusy brodawczaków generalnie nie zakażają innych zwierząt.
Wirusy brodawczaków mogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakażaj ą. Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) sądalej dzielone na ponad 60 rodzaj ów, w oparciu o homologię sekwencj i DNA (patrz, praca przeglądowa: Papillomaviruses and Human Cancers, H. Pfister (ed.) CRC Press Inc., 1990). Zakażenia wirusem brodawczaków wydają się wywoływać odpowiedź odpornościową swoistą dla rodzaju, tak że odpowiedź neutralizująca na jeden z rodzajów wirusa nie zapewnia odporności wobec innego typu wirusa brodawczaków.
U ludzi, różne rodzaje HPV powodująróżne choroby, HPV typów 1,2,3,4, 7,10 i 26-29 powodują łagodne brodawki u osobników zarówno normalnych jak i poddanych immunosupresji. HPV typów 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 i 46-50 powodują płytkie owrzodzenia u osobników poddanych immunosupresji. HPV typów 6, 11, 34, 39, 41-44 i 51-55 powodują niezłośliwe kłykciny na śluzówce narządów płciowych. HPV typów 16 i 18 powodu iądysplazję nabłonkową na śluzówce narządów płciowych i są związane z większością raków in situ i inwazyjnych szyjki macicy, pochwy, sromu i kanału odbytu.
Badania immunologiczne na zwierzętach wykazały, że wytwarzanie przeciwciał neutralizujących przeciwko antygenom wirusa brodawczaków zapobiega zakażeniu przez wirus homologiczny. Opracowanie efektywnych szczepionek przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków zostało spowolnione przez trudności związane z hodowlą wirusów brodawczaków in vitro. Opracowanie efektywnej szczepionki przeciwko HPV zostało szczególnie spowolnione przez brak odpowiedniego modelu zwierzęcego.
Neutralizacja wirusów brodawczaków przez przeciwciała wydaje się być swoista dla rodzaju i zależy od epitopów konformacyjnych na powierzchni wirusa.
180 639
Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozaedralnymi wirusami DNA, kodującymi geny wczesne i późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od E1 doE7iL1 i L2, gdzie “E” oznacza wczesny, zaś “L” oznacza późny. L1 i L2 kodują białka kapsydu wirusa. E1 do E3 i E5 do E7 związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa.
Białko L1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym 55-60 kDa. Białko L2 jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym około 55-60 kDa i pozornym ciężarze cząsteczkowym 75-100 kDa, co stwierdzono przez elektroforezę na żelupoliakrylamidowym. Dane immunologiczne i dane uzyskane z mikroskopu elektronowego sugerują, że większość białka L2 stanowi wnętrze białka L1. Białka L2 są silnie zakonserwowane wśród różnych wirusów brodawczaków, zwłaszcza dziesięć zasadowych aminokwasów końca C. ORF L1jest silnie zakonserwowana wśród różnych wirusów brodawczaków.
Geny L1 i L2 stosowano do wytworzenia rekombinowanych białek do potencjalnego użycia do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusami brodawczaków. Zhou i in., (1991,1992) wklonowali geny L 1i L2 HPV typu 16, do wektora wirusa krowianki i zakazili komórki ssaków CV -1 wektorem rekombinowanym w celu wytworzenia cząstek wiroidalnych (VLP). Badania te interpretuje się jako stwierdzające, że ekspresja białek zarówno L1 jak i L2 HPV typu 16 w komórkach nabłonkowych jest niezbędna i wystarczająca do umożliwienia tworzenia VLP. Ekspresja samego białka L1 albo samego L2 albo podwójne zakażenie pojedynczymi rekombinowanymi wektorami wirusowymi krowianki zawierającymi geny L1 i L2 nie powodowała wytwarzania cząstek.
Wytworzono uzyskane z bakterii rekombinowane L1 i L2 bydlęcych wirusów brodawczaków. Surowice neutralizujące w stosunku do białek z rekombinowanych bakterii w małym stopniu reagowały krzyżowo z wirusem natywnym, prawdopodobnie z powodu różnic konformacyjnych białek natywnych i uzyskanych z bakterii.
Rekombinowane bakulowirusy ekspresjonujące otwarte ramki odczytu L1 HPV 6 lub L2 HPV 16, zastosowano do zakażenia owadzich komórek SF9 i wytworzenia białek L1 i L2. Analiza metodą Western blot wykazała, że uzyskane z bakulowirusa białka L 1i L2 oddziaływały z przeciwciałem przeciwko HPV 16. Pokazano również wytwarzanie białek L1 HPV 16 i L2 HPV 16 przez rekombinowany szczep Saccharomyces cerevisiae.
Ponieważ cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zarówno u myszy jak i u ludzi są zdolne do rozpoznawania epitopów pochodzących z zakonserwowanych wewnętrznych białek wirusa i uważane są za kluczowe w odpowiedzi układu odpornościowego na wirusy, czyni się wysiłki aby opracować szczepionki CTL zdolne do zapewnienia ochrony heterologicznej przeciwko różnym szczepom wirusa.
Wiadomo, że CTL CD8+ niszczą zakażone wirusem komórki, gdy ich receptory limfocytów T rozpoznają wirusowe peptydy związane z cząsteczkami MHC klasy I. Peptydy te pochodzą z wytwarzanych endogennie białek wirusowych niezależnie od umiejscowienia białka albo funkcji jaką pełni w wirusie. Tak więc, przez rozpoznanie epitopów z zakonserwowanych białek wirusowych, CTL mogą zapewnić ochronę międzyszczepową. Peptydy zdolne do wiązania się z cząsteczkami MHC klasy I w celu rozpoznania przez CTL pochodzą z białek obecnych lub przechodzących przez cytoplazmę albo siateczkę endoplazmatyczną. Stąd, białka egzogenne, wchodzące do szlaku obróbki endosomalnej (jak ma to miejsce w przypadku antygenów prezentowanych przez cząsteczki MHC klasy II) nie są efektywne w wywoływaniu odpowiedzi CTL CD8+.
Wysiłki mające na celu wywołanie odpowiedzi CTL obejmujązastosowanie wektorów replikujących w celu wytwarzania antygenu białkowego w komórce albo skupiają się na wprowadzaniu peptydów do cytozolu. Oba te podejścia mają ograniczenia, mogące zmniejszyć ich przydatność jako szczepionki. Wektory retrowirusowe mają ograniczenia co do wielkości i budowy polipeptydów, które mogąpowstawać w wyniku ekspresji jako białka fuzyjne, przy zachowaniu zdolności rekombinowanego wirusa do replikacji zaś skuteczność wektorów takich jak krowianka w immunizacji może być zaburzona odpowiedziąodpornościowąprzeciwko samemu
180 639 wektorowi. Również, wektory wirusowe i zmodyfikowane patogeny niosą ze sobą ryzyko, które może wpływać na ich zastosowanie u ludzi. Ponadto, wybór epitopów peptydowych, które mają być prezentowane zależy od budowy antygenów MHC osobnika, tak więc szczepionki peptydowe mogąmieć ograniczoną skuteczność z powodu różnorodności haplotypów MHC w populacji niewsobnej.
Wykazano, że szczepienie domięśniowe konstruktami polinukleotydowymi, tj. plazmidowym DNA kodującym białka, powoduje wytwarzaniem białka in situ w komórkach mięśniowych. Przez zastosowanie plazmidów cDNA kodujących białka wirusowe, można wywołać odpowiedź odpornościową, która zapewnia ochronę homologiczną po następującej później ekspozycji. Zastosowanie szczepionek polinukleotydowych (PNV) w celu wywołania przeciwciał może powodować przedłużoną trwałość odpowiedzi przeciwciał, jak również dostarczenie antygenu, który może ulegać odpowiedniej modyfikacji potranslacyjnej i mieć konformacj ę białka natywnego (w przeciwieństwie do białka rekombinowanego). B iałka wirusowe wytworzone in vivo po immunizacji PNV mogą zachowywać swoją natywną konformację wywołując w ten sposób wytwarzanie przeciwciał neutralizujących wirusa. Wywołanie odpowiedzi CTL w ten sposób daje korzyść ochrony międzyszczepowej bez stosowania żywego, potencjalnie patogennego wektora albo wirusa atenuowanego.
Benvenisty i in., donoszą, że DNA precypitowany CaCĘ wprowadzony myszy dootrzewnowo, dożylnie albo domięśniowo może ulegać ekspresji. Ostatnio, wstrzyknięcie domięśniowe (i. m.) wektorów ekspresyjnych DNA myszom powodowało, jak opisano, wychwyt DNA przez komórki mięśniowe i ekspresję białka kodowanego przez DNA (Wolff J. A. i in., 1990; Ascadi G. i in., 1991). Wstrzyknięte plazmidy, jak wykazano, utrzymywały się pozachromosomalnie i nie replikowały. Następnie, doniesiono o utrzymującej się ekspresji po wstrzyknięciu i. m. do mięśni szkieletowych szczurów, ryb i naczelnych oraz mięśnia serca szczurów. W WO 90/11092 (4 października 1990) opisana została technika zastosowania kwasów nukleinowych jako czynników immunogennych, w której nagie polinukleotydy zastosowano do szczepienia kręgowców.
Sposób nie jest ograniczony do wstrzyknięcia domięśniowego. Przykładowo, wprowadzenie złotych mikropocisków opłaszczonych DNA, kodującym bydlęcy hormon wzrostu (BGH) do skóry myszy, powodowało wytwarzanie przez myszy przeciwciał przeciwko BGH. Do transfekcji skóry, mięśni, tkanki tłuszczowej i tkanek sutka żywych zwierząt zastosowano urządzenie “jet injector’. Różne sposoby wprowadzania kwasu nukleinowego zostały przedyskutowane przez Donnelly, Ulmer i Liu (The Immunologist, 2:20, 1994).
Wynalazek dopuszcza wiele sposobów wprowadzania kwasu nukleinowego do żywych tkanek w celu wywołania ekspresji białek. Wynalazek dostarcza sposobów wprowadzania białek wirusowych do szlaku obróbki antygenu w celu wywołania CTL i przeciwciał swoistych wobec wirusa. Stąd, potrzeba swoistego czynnika leczniczego, zdolnego do wywołania pożądanej profilaktycznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko patogenom wirusowym w przypadku wirusów brodawczaków została zaspokojona dzięki wynalazkowi. Tak więc, wynalazek dostarcza konstruktów DNA kodujących białka wirusowe ludzkiego wirusa brodawczaków, które wywołują swoiste CTL i przeciwciała.
Skuteczność ochronna szczepienia DNA przeciwko następującej później ekspozycji na wirusa została wykazana przez immunizację niereplikującym plazmidowym DNA kodującym jeden lub wiele wyżej wspomnianych białek wirusowych. Jest to korzystne ponieważ nie używa się czynnika zakaźnego, nie jest konieczna budowa cząstek wirusa i możliwa jest selekcja epitopów. Ponadto, ponieważ sekwencja niektórych produktów genowych jest zakonserwowana wśród wielu rodzajów wirusów brodawczaków, możliwa jest ochrona przed ekspozycją na różne rodzaje wirusa homologicznego bądź heterologicznego wobec szczepu, z którego pochodził sklonowany gen.
Konstrukty DNA kodujące produkty genowe wirusa brodawczaków', zdolne do ulegania ekspresji po bezpośrednim wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych są nowym środkiem profilaktycznym i leczniczym, zdolnym zapewnić ochronę odpornościową przeciwko wirusowi brodawczaków
180 639
Figura 1 pokazuje odpowiedź przeciwciał neutralizujących wirusa, wywołanych u królików, którym wstrzyknięto DNA CRPV L1, albo mieszaninę DNA L1 i L2 (oś y) oraz odpowiadające miana ELISA wywołane przez nie.
Figura 2. Odpowiedź przeciwciał królików, którym wstrzyknięto DNA L1. Pokazano miana ELISA przeciwko L1 VLP królików, którym podano pojedyncząimmunizację w dobranej arbitralnie dawce 1 mg DNA L1. Króliki, którym wstrzyknięto DNA kontrolny nie wytwarzały wykrywalnych mian przeciwciał przeciwko L1 VLP.
Figura 3. Wpływ absorbcji L1 VLP na surowicę odpornościową, po immunizacji DNA L1. A, surowica normalna i surowica odpornościowa absorbowana na natywnych i/lub zdenaturowanych VLP jak w (15), badane były na aktywność neutralizującą wirusa. Pokazano średnie pole powierzchni kłykcin w trzech miejscach ekspozycji po 7 tygodniach od ekspozycji. B, surowica odpornościowa od królików, którym wstrzyknięto podskórnie DNA L1 była kolejno absorbowana trzykrotnie na natywnych (kółka) i/lub zdenaturowanych (kwadraty) L1VLP, poddanych ekspresji w rekombinowanym szczepie drożdży (Sacharomyces cerevisiae). Po każdej kolejnej absorpcji, porcje surowicy badano w teście ELISA, na aktywność przeciwciał przeciwko uzyskanym z bakulowirusa L1 VLP Miano ELISA absorbowanego materiału wykreślano jako procent początkowego miana ELISA surowicy nie absorbowanej.
Figura 4. Odpowiedź, mierzona ELISA, w teście na przeciwciała przeciwko CRPV E2 (A) i CRPV E7 (b). Pokazano całkowite tempo reakcji (dla surowicy po 4 dawce minus surowica przed immunizacją w tym samym rozcieńczeniu) w mOD/min, dla poszczególnych królików.
Szczepionka według wynalazku zawiera wektor zawierający:
a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujący białko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmującej L1 i L1+L2 jednego lub więcej typów HPV wybranych spośród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18,
b) promotor CMV,
c) terminator transkrypcji z genu bydlęcego hormonu wzrostu i
d) gen markerowy oporności na neomycynę, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze.
Korzystnie jako wektor szczepionka zawiera VIJeo lub VIJns.
Wynalazek dostarcza polinukleotydów, które po bezpośrednim wprowadzeniu do organizmu kręgowca, takiego jak króliki amerykańskie i ludzie, wywołują ekspresję kodowanych peptydów w tkankach zwierzęcia. Gdy peptyd, taki jak białko związane z wirusem brodawczaków (PV), nie występuje w organizmie zwierzęcia z wyjątkiem zakażenia, układ odpornościowy zwierzęcia ulega pobudzeniu w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej. Ponieważ te egzogenne białka wytwarzane są przez komórki gospodarza, ulegają obróbce i prezentacji przez główny układ zgodności tkankowej (MHC). Rozpoznanie to jest analogiczne do zachodzącego po zakażeniu organizmem pokrewnym. Wynikiem jest, jak to wykazano, wywołanie odpowiedzi odpornościowej, która może chronić przed powtórnym zakażeniem.
W znaczeniu tu użytym, “polinukleotyd” oznacza kwas nukleinowy, zawierający niezbędne elementy regulatorowe, taki, że po wprowadzeniu do komórki żywego kręgowca, jest zdolny do kierowania mechanizmem komórkowym w celu wytwarzania produktu translacji kodowanego przez geny wchodzące w skład polinukleotydu.
Wynalazek dostarcza kwasów nukleinowych, które po wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych in vivo wywołują ekspresję produktów genowych wirusa brodawczaków. Tak więc, przykładowo, wstrzyknięcie konstruktów DNA według wynalazku, do mięśni królika wywołuje ekspresję kodowanych produktów genowych i wywołuje przeciwciała neutralizujące wirusa. Po ekspozycji na wirusa brodawczaków królików amerykańskich (CRPV), w dawkach wywołujących zmiany u wszystkich królików kontrolnych, zwierzęta, którym wstrzyknięto szczepionkę polinukleotydowąwykazujązmiany znacznie mniejsze. Tak więc, wynalazek ujawnia szczepionkę przydatną do zapobiegania zakażeniom wirusem brodawczaków u ludzi.
Konstrukty DNA kodujące białka wirusa brodawczaków wywołują ochronną odpowiedź odpornościową u zwierząt. Jak to będzie opisane szczegółowo dalej, odpowiedź odpornościowa
180 639 u zwierząt obejmuje przeciwciała neutralizujące wirusa i ochronę przed ekspozycją królików na wirusa homologicznego z wirusem brodawczaków.
Oczekiwane zalety w stosunku do innych szczepionek obejmują, choć nie tylko, rozszerzenie ochrony z powodu odpowiedzi CTL, poszerzenie zakresu przeciwciał i przedłużoną trwałość ochrony.
Wynalazek zapewnia środki do wywołania krzyżowej odporności bez potrzeby użycia czynników samoreplikujących. Dodatkowo, immunizacja DNA oferuje liczne inne korzyści. Po pierwsze, to podej ście do szczepienia powinno być możliwe do zastosowania w nowotworach jak również w przypadku czynników zakaźnych, ponieważ odpowiedź CTL CD8+jest kluczowa w interwencji immunologicznej w obu procesach patofizjologicznych. Stąd, wywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko białkom istotnym w procesach transformacji może być skutecznym środkiem ochrony przed nowotworem albo immunoterapią. Po drugie, wywołanie przeciwciał przeciwko białkom ekspresjonowanym po wstrzyknięciu DNA kodującego białka wirusowe sugeruje, że ta technologia dostarcza wygodnego i wydajnego sposobu wytwarzania szczepionek wywołujących przeciwciała.
Łatwość wytwarzania i oczyszczania konstruktów DNA wypada korzystnie na tle tradycyjnego oczyszczania białek, co ułatwia wytwarzanie szczepionek skojarzonych. Tak więc, liczne konstrukty, przykładowo konstrukty kodujące białka L1 i L2 jednego lub wielu typów HPV mogą być przygotowywane, mieszane i wspólnie podawane. Na koniec, ponieważ ekspresja białka może być utrzymywana przez długi okres czasu po wstrzyknięciu DNA, trwałość pamięci limfocytów B i T może być wydłużona, powodując długotrwałą odporność humoralną i komórkową.
Ograniczenia proponowanych szczepionek HPV podkreślają potrzebę opracowania bardziej efektywnych sposobów zapobiegania zakażeniu i łagodzenia choroby. Wytworzenie ulepszonej odpowiedzi CTL przeciwko zakonserwowanemu białku może zapewnić długotrwałą odporność międzyszczepową.
Wykazano ekspresj ę białka z konstruktów PNV u królików przez wykrycie odpowiedzi odpornościowej gospodarza skierowanej przeciwko antygenom CRPV. Wyniki tych doświadczeń na zwierzętach wskazują, że bezpośrednie wstrzyknięcie DNA może dostarczyć sposobu ochrony ludzi przed zakażeniem HPV i chorobą.
W celu optymalizacji stosowanego stężenia porównano zakres dawek pod względem immunogenności. Można przewidzieć, że dawki rzędu 10, 50, 100 i 200 pg DNA są skuteczne u ludzi.
Skuteczność u ludzi została wykazana na ochotnikach, którzy otrzymali szczepionkę DNA HPV. Kompozycj a, dawkowanie i schemat podawania szczepionki oparte sąna uprzednich badaniach. Skuteczność kliniczna została wykazana odsetkiem zakażeń, oceną choroby i długością choroby. Te parametry kliniczne porównano z badaniem laboratoryjnym odpowiedzi odpornościowej gospodarza i wykrywaniem wirusa, w celu określenia markerów zastępczych korelujących z ochroną.
Biologia molekularna przygotowywania i oczyszczania konstruktów DNA umożliwia wytwarzanie środka farmaceutycznego DNA według wynalazku. Standardowe techniki biologii molekularnej są wystarczające do wytwarzania produktów według wynalazku, stanowiących nowe środki lecznicze, które mogą wytworzyć międzyszczepową ochronę krzyżową.
Ilość zdolnego do ekspresji DNA, która ma być wprowadzona biorcy szczepionki zależy od siły promotorów transkrypcyjnych i translacyjnych zastosowanych w konstrukcie DNA oraz od immunogenności produktu genu ulegającego ekspresji. Ogólnie, immunologicznie albo immunoprofilaktycznie skutecznądawkę rzędu od około 1 pg do 1 mg, korzystnie od około 10 pg do 300 pg, podaje się bezpośrednio do tkanki mięśniowej. Możliwe jest również wstrzyknięcie podskórne, wprowadzanie śródskórne, wciskanie przez skórę i inne metody podawania takie jak podawanie dootrzewnowe, dożylne albo wziewne. Podawanie szczepień przypominających również jest brane pod uwagę.
180 639
Polinukleotydy mogą być nagie, co oznacza, że są niezwiązane z żadnym białkiem, adiuwantem albo innym czynnikiem wpływającym na układ odpornościowy biorcy. W tym przypadku, jest pożądane aby polinukleotyd znajdował się w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie, takim jak, choć nie ograniczonym do sterylnego roztworu soli albo sterylnego zbuforowanego roztworu soli. Alternatywnie, polinukleotydy mogą być związane z liposomami, takimi jak liposomy lecytynowe albo inne liposomy znane w technice, jako mieszanina DNA-liposomy, albo DNA może być związany z adiuwantem znanym w technice ze wspomagania odpowiedzi odpornościowej, takim jak białko albo inny nośnik. Czynniki ułatwiające komórkowy wychwyt DNA, takie jak, choć nie wyłącznie jony wapnia, białka wirusowe albo inne czynniki wspomagające transfekcję, mogąbyć również zastosowane z korzyścią. Czynniki te określane sąogólnie jako czynniki ułatwiające transfekcję oraz jako nośniki dopuszczalne farmaceutycznie.
Istnieje kilka zalet immunizacji genem zamiast produktem genu. Jedną z zalet jest względna łatwość z jaką antygen natywny lub prawie natywny może ulegać prezentacji układowi odpornościowemu. Inną zaletą immunizacji polinukleotydem jest możliwość wejścia immunogenu w szlak MHC klasy I i wywołania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych. Ponieważ immunizacja polinukleotydem może wywołać zarówno odpowiedź humoralnąjak i komórkową, inną zaletą może być to, że zapewnia względnie prostą metodę zbadania przydatności jako szczepionek olbrzymiej liczby genów wirusowych i rodzajów wirusa. Immunizacja przez wstrzyknięcie polinukleotydów umożliwia tworzenie szczepionek multiwalentnych przez zmieszanie poj edynczych składników.
W znaczeniu tu użytym, określenie “gen” oznacza segment kwasu nukleinowego, który koduje osobny polipeptyd. Określenia “środek farmaceutyczny” i “szczepionka” są stosowane zamiennie, w celu wskazania kompozycji przydatnej do wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Określenia “konstrukt” i “plazmid” są stosowane zamiennie. Określenie “wektor” jest stosowane w celu wskazania DNA, do którego mogąbyć klonowane geny, do stosowania zgodnie z wynalazkiem.
Kompozycje przydatne farmaceutycznie zawierające DNA mogą być przygotowywane według znanych sposobów takich jak domieszanie dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika. Przykłady takich nośników i sposobów przygotowywania można znaleźć w Remington’s Pharmaceutical Sciences. Kompozycja dopuszczalna farmaceutycznie odpowiednia do skutecznego podawania, powinna zawierać skuteczną ilość DNA HPV.
Kompozycje terapeutyczne i diagnostyczne według wynalazku są podawane osobnikowi w ilościach odpowiednich do leczenia albo diagnozowania zakażenia PV. Skuteczna ilość może wahać się w zależności od wielu czynników jak stan osobnika, ciężar, płeć i wiek. Inne czynniki obejmują sposób podawania. Ogólnie, kompozycje mogą być podawane w dawkach zawierających się od około 1 mikrograma do około 1 miligrama.
Kompozycje farmaceutyczne mogąbyć podawane osobnikowi różnymi drogami takimi jak podskórna, miejscowa, doustna i domięśniowa.
Szczepionki według wynalazku zawierają DNA HPV, który koduje białka rekombinowane HPV obejmujące determinanty antygenowe wywołujące tworzenie przeciwciał neutralizujących w organizmie ludzkiego biorcy. Szczepionki takie są również wystarczająco bezpieczne aby mogły być podawane bez zagrożenia infekcją kliniczną; nie wykazują objawów toksycznych; mogą być podawane skuteczną drogą; są stabilne i kompatybilne z nośnikami szczepionek.
Szczepionki mogąbyć podawane różnymi drogami, takimijak doustna, pozajelitowa, podskórna albo domięśniowa. Podawana dawka może wahać się w zależności od wielu czynników jak stan osobnika, ciężar, płeć i wiek osobnika; drogi podania oraz rodzaju szczepionego PV. Szczepionki mogąbyć stosowane w różnych postaciach dawkowania takichjak kapsułki, zawiesiny, eliksiry albo roztwory wodne. Szczepionki mogąbyć wytwarzane z nośnikiem dopuszczalnym immunologicznie.
Szczepionki sąpodawane w ilościach skutecznych profilaktycznie albo leczniczo, tzn. ilościach wystarczających do wywołania chroniącej odpowiedzi odpornościowej. Ilość skuteczna
180 639 może być różna w zależności od rodzaju HPV. Szczepionki mogą być podawane w dawce pojedynczej albo w licznych dawkach.
Szczepionki według wynalazku do zapobiegania zakażeniom PV mogąbyć monowalentne i multiwalentne. Przykładowo, monowalentna szczepionka przeciwko HPV typu 16 może' być wytworzona przez włączenie DNA kodującego białko L1 HPV 16 albo L2 albo L1+L2. Alternatywnie, szczepionka multiwalentna przeciwko HPV może być wytworzona przez mieszanie DNA kodujących białka L1 albo L2 albo L1+L2 z różnych typów HPV. DNA może być zastosowane do wywołania przeciwciał. Określenie “przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje zarówno przeciwciała monoklonalne jak i poliklonalne, jak również ich fragmenty takie jak Fv, Fab, F(ab)2, zdolne do wiązania antygenu albo haptenu.
DNA PV oraz przeciwciała mogąbyć zastosowane do typowania-serologicznego zakażeń HPV albo CRPV oraz do badań przesiewowych w kierunku HPV. DNA HPV i CRPV oraz przeciwciała nadają się same do wytwarzania zestawów przydatnych do wykrywania i typowania serologicznego HPV albo CRPV. Zestawy takie obejmują podzielony nośnik odpowiedni do ścisłego utrzymywania co najmniej jednego zasobnika. Nośnik powinien zawierać jeszcze reagenty takie jak DNA HPV albo przeciwciała przeciwko HPV odpowiednie do wykrywania różnych rodzajów HPV. Nośnik może również zawierać środki do wykrywania takie jak znakowany antygen albo substraty enzymów itp.
Poniższe przykłady dostarczono w celu lepszego określenia wynalazku, jednakże, bez ograniczania go do szczegółów przykładów
Przykład 1. Wektory do wytwarzania szczepionek
A) VI: Wektor ekspresyjny VI skonstruowano z pCMVIE-AKI-DHFR (Y. Whang i in., J. Virol. 61,1796 (1987)). Geny AKI i DHFR usunięto z wektora przez cięcie wektora EcoRI i samoligację. Wektor ten nie zawierał intronu A w promotorze CMV, a więc dodano go jako fragment PCR z usuniętym wewnętrznym miejscem SacI (w pozycji 1855 według numeracji B. S. Chapmana i in., Nuci. Acids Res., 19, 3979 (1991)). Jako matrycę do reakcji PCR zastosowano pCMVintA-Lux, wytworzony przez ligację fragmentu HindIII i NheI z pCMV6al20 (patrz, Chapman B. S. i in., wyżej) zawierającego promotor/wzmacniacz hCMV-IEl oraz intron A, w miejsce HindIII i XbaI pBL3 tworząc pCMVIntBL. Fragment genu lucyferazy wielkości 1881 bp (HindIII-SmaI wypełniony fragmentem Klenowa) z RSV-Lux (J. R. de Wet i in., Mol. Cell Biol., 7, 725, 1987) wklonowano w miejsce SalI pCMVIntBL, wypełnionym fragmentem Klenowa i traktowanym fosfatazą
Startery obejmujące Intron A miały sekwencje: starter 5':
5'-CTATAWkCGAGGGCCTGTTTAA-3'; (Identyfikator Sekw. Nr 1) starter 3':
5'-GTGGCAAAGATCT?GGGCGAGCGCGAGCAA-3'; (Identyfikator Sekw.Nr 2).
Startery zastosowane w celu usunięcia miejsca SacI miały sekwencje:
Starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 3:
'-GTATGTGTCTGAGGGTGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3';
Starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 4:
'-GTGCGGGCCAGGTATCCGAGCTCGTTTTAGGACACATGA-3'.
Fragment PCR cięto SacI i BglII i wprowadzono do wektora ciętego tymi samymi enzymami.
B) Wektor ekspresyjny V1J, Identyfikator Sekw. Nr 5
Celem tworzenia V1J było usunięcie elementów promotora i terminatora transkrypcji z wektora V1, w celu umieszczenia ich w bardziej określonym kontekście, tworząc wektor bardziej spójny i poprawiając efekty oczyszczania plazmidu.
V1J jest uzyskany z wektorów V1 i pUC 19, plazmidu dostępnego w handlu. V1 trawiono enzymami restrykcyjnymi Sspl i EcoRI tworząc dwa fragmenty DNA. Mniejszy z nich, zawierający promotor CMYIntA i terminator transkrypcyjny bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), które sterują ekspresją genów heterologicznych, oczyszczono przez elektroforezę na żelu aga180 639 rozowym. Końce tego fragmentu DNA “stępiono” przy użyciu polimerazy DNA T4 w celu polepszenia ligacji z innym “tępym” fragmentem DNA.
pUC 19 wybrano aby stanowił “szkielet” wektora ekspresyjnego. Jest on znany z dużej wydajności uzyskiwanego plazmidu, jest dobrze scharakteryzowany co do sekwencji i funkcji i ma minimalne wymiary. Przez trawienie enzymem restrykcyjnym Haell, z wektora usunięto cały operon lac, ponieważ był on niepotrzebny z punktu widzenia wynalazku, mógł natomiast ujemnie wpływać na ilość uzyskiwanego plazmidu i ekspresję genów heterologicznych. Pozostały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polimeraząDNA T4, traktowano cielęcąjelitowąfosfatazą alkaliczną i poddano ligacji z elementem CMVIntA/BGH, opisanym wyżej. Uzyskano plazmidy wykazujące obie możliwe orientacje elementu promotora w szkielecie pUC. Jeden z tych plazmidów dawał znacznie większe ilości DNA w E. Coli, i został oznaczony V1J. Struktura tego wektora została potwierdzona przez analizę sekwencji regionów połączeń, a następnie wykazano jego zdolność do ekspresji genów heterologicznych na poziomie równym bądź wyższym w porównaniu z V1.
C) Wektor ekspresyjny V1Jneo, Identyfikator Sekw. Nr 6
Okazało się konieczne usunięcie genu amp', stosowanego do selekcji na antybiotyku bakterii niosących V1J, ponieważ ampicylina nie może być stosowana w fermentatorach wielkiej skali przy produkcji ludzkich produktów klinicznych. Gen amp' usunięto ze szkieletu pUC V1J przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Sspl i Eam1105I. Powstały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polimeraząDNA T4 i traktowano cielęcąjelitową fosfatazą alkaliczną. Dostępny w handlu gen kan', uzyskany z transpozonu 903 i zawarty w plazmidzie pUC4K, wycięto stosując enzym restrykcyjny PstI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i stępiono końce polimeraząDNA T4. Fragment ten poddano ligacji ze szkieletem V1J i uzyskano plazmidy z genem kan' w obu możliwych orientacjach, które nazwano V1Jneo# 1 i #3. Każdy z tych potwierdzono analizą restrykcyjną, sekwencjonowaniem DNA regionów połączeń i jak wykazano powodowały one powstanie podobnych ilości plazmidu co V1J. Ekspresj a produktów genów heterologicznych była również dla tych wektorów VIJneo porównywalna z V1J. Jako konstrukt ekspresyjny, arbitralnie wybrano V1Jneo#3, określany dalej jako V1Jneo, zawierający gen kan' w tej samej orientacji co gen amp'.
D) Wektor ekspresyjny VIJns
Do V1Jneo dodano miejsce SfiI w celu ułatwienia badań nad integracją. W miejscu KpnI w sekwencji BGH wektora, dodano dostępny w handlu łącznik SfiI o długości 13 par zasad (New England BioLabs). V1 Jneo linearyz.owano przy użyciu KpnI, oczyszczono na żelu, stępiono polimeraząDNA T4 i poddano ligacji z tępymi końcami łącznika SfiI. Wybrano izolaty klonalne stosując mapowanie restrykcyjne i potwierzdzono je sekwencjonując przez łącznik. Nowy wektor nazwano V1Jns. Ekspresja genów heterologicznych w V1Jns (z SfiI) była porównywalna z ekspresją tego samego genu w V1Jneo (z KpnI).
Przykład 2. Wytwarzanie konstruktów DNA kodujących białka wirusa brodawczaków królika amerykańskiego
Źródłem DNA CRPV dla wszystkich klonowanych genów jest CRPV-pLAII. Jest to kompletny genom CRPV wklonowany do pBR322 w miejscu SalI (Nasseri, M., Meyers, C. i Wettstein, F. O. (1989)). Analiza genetyczna patogenezy CRPV: otwarta ramka odczytu L1 nie jest niezbędna do transformacji komórkowej ale jest niezbędna do tworzenia brodawczaków (Virology 170, 321-325).
1. VI Jns-Ll: Sekwencję kodującąFu wydwowotio orzez PCR, stosując DNA CPNA-pLAK jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BamHI do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu.
Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego L1 startery PCR, miały sekwencje:
Starter sensowny:
5' -GGTACAGGATPCACCATGGPAGTGTGGPTGTPTACGCAG-3' (Identyfikator SoCw. Nr 7) BamHI
180 639
Starter antysensowny:
'-CCA^CATGGATCCTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATl^-^' (Identyfikator Sekw; Nr 8) BamHI
Fragment PCR oczyszczono na żelu, cięto BamHI i poddano ligacji z V1Jns przeciętym
BglII.
2. V1Jns-L2: Region kodujący L2 wytworzono przez PCR. Wektor CRPV-pLAII zawierał gen L2, zniszczony miejscem SalI zastosowanym do wprowadzenia CRPV do pBR322. Stąd, matrycę do PCR wytworzono przez cięcie CRPV-pLAII przy użyciu SalI i ligację DNA CRPV w postaci kolistej w miejscu SalI. Ligowany DNA CRPV zastosowano jako matrycę do PCR. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BamHI do cięcia fragmentu PCR po oczyszczeniu na żelu.
Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego L2 startery PCR, miały sekwencje:
Starter sensowny:
5'-GGTACAGGATCCACCATGGTT<^<^.^^<^GT<^.^^<^.^.AA^^<GC-3' (Identyfikator Sekw; Nr 9) BamHI
Starter antysensowny:
5' -CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT- 3' (Identyfikator Sekw. Nr 10 BamHI
3. V1Jns-E2: Sekwencję kodującąE2 wytworzono przez PCR, stosując DNA CRPV-pLAII jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu.
Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E2 startery PCR, miały sekwencje:
Starter sensowny:
'-GGTACAAGATCTACX:ATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 11) BgIII
Starter antysensowny:
'-CCACATAGAICTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAACAC-3' (Identyfikator Sekw; Nr 12) BgIII
4. V1Jns-E4: Sekwencję kodującąE4 wytworzono przez PCR, stosując DNA CRPV-pLAII jako matrycę. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu.
Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E4 startery PCR, miały sekwencje:
Starter sensowny:
5' -GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 13) BgIII
Starter antysensowny:
5'-CCACATAGATCITTATAA<rcTCGCGAAGCCGTCTATTCC-3' (Identyfikator Sekw; Nr 14) BgIII
5. V1Jns-E7: Sekwencję kodującąE7 wytworzono przez PCR, stosując jako matrycę DNA CRPV-pLAII w jednym przypadku, zaś w innym oczyszczony DNA CRPV szczepu Kreidera. W obu przypadkach zastosowano te same startery PCR. Startery PCR zaprojektowano tak, by zawierały miejsca BgIII do cięcia po oczyszczeniu fragmentu PCR na żelu.
Zastosowane do wytworzenia regionu kodującego E7 startery PCR, miały sekwencje:
Starter sensowny:
5' -GGIACAAGAICTACCATGATAG<GCAGAACICCIAAGC'ΠΆG-3' BgIII
Starter antysensowny:
'-CCACATAGATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC-3E
6. pGEX-2T-E2: Region kodujący E2 wytworzono przez PCR jak to opisano dla V1Jns-E2. Fragment klonowano do pGEX-2T w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten zastosowano do wytworzenia białka w E. coli.
180 639
7. pGEX-2T-E4: Region kodujący E4 wytworzono przez PCR jako to opisano dla VI Jns-E4. Fragment klonowano do pGEX-2T w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten źastosowano do wytworzenia białka w E. coli.
8. pGEX-2T-E7: Region kodujący E7 wytworzono przez PCR jak to opisano dla V1Jns-E7. Fragment klonowano do pGEX-2T w miejscu BamHI, tworząc fuzję w jednej ramce z transferazą S glutationu (GST). Konstrukt ten zastosowano do wytworzenia białka w E. coli.
Przykład 3. Oczyszczanie plazmidu z E. coli
Konstrukty V1J hodowano przez noc do osiągnięcia nasycenia. Komórki zebrano i poddano lizie w zmodyfikowanej procedurze alkalicznego SDS (Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y., wyd. 2 (1989). Modyfikacja polegała na trzykrotnym zwiększeniu objętości do lizy komórek i ekstrakcji DNA. DNA oczyszczono przez dwukrotne wirowanie na gradiencie CsCl-EtBr. Bromek etydyny usunięto przez ekstrakcję 1-butanolem. Powstały DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i precypitowano etanolem. DNA zawieszono w TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), pH 8 do transfekcji i w 0,9% NaCl do wstrzyknięcia myszom. Stężenie i czystość każdego z preparatów DNA oznaczono przez odczyt OD260/280. Stosunki 260/280 wynosiły > 1,8.
Przykład 4. Wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec CRPV in vivo
Grupy po pięć królików skrwawiono i nastrzykiwano po 1,2 ml soli fizjologicznej zawierającej 1 mg V1Jns-L1, V1Jns-L2, V1Jns-L1 zmieszany z V1Jns-L2 (w sumie 2 mg) albo sam V1Jns (wektor kontrolny nie kodujący białka). Inokulum podzielono na równo między sześć miejsc domięśniowych w obie łapy tylne, łapy przednie i dół grzbietu. Trzy tygodnie po początkowym wstrzyknięciu DNA, króliki skrwawiono i podawano drugie wstrzyknięcie DNA w podobny sposób. Cztery tygodnie po drugim wstrzyknięciu zwierzęta ponownie skrwawiano.
Surowice badano w kierunku przeciwciał neutralizujących wirusa, przez zmieszanie dziesięciokrotnych kolejnych rozcieńczeń surowic odpornościowych z rozcieńczeniem 1:3 zawiesiny wyjściowej wirusa (szczep Kreidera). Rozcieńczenia wykonano w pożywce Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Zawiesinę wyjściową CRPV (uzyskaną od dr J. Kreidera, Hershey, PA) wytworzono z fragmentów skóry uzyskanej od dzikich królików amerykańskich, które były zakażone CRPV i wszczepionej pod torebkę nerki myszy bezgrasiczych. Powstałe kłykciny homogenizowano i sklarowano przez odwirowanie, uzyskując preparat zawiesiny wyjściowej wirusa. Mieszaniny surowic odpornościowych i zawiesiny wyjściowej wirusa inkubowano na lodzie przez co najmniej 60 minut, następnie 50 pl każdej z mieszanin nałożono na 1 cm2 ogolonej, skaryfikowanej skóry na grzbiecie 3 królików nowozelandzkich. Zwierzęta obserwowano po 7 tygodniach w kierunku obecności brodawek i mierzono elipsoidalne brodawki w wymiarach przednioty lnym i bocznym (w mm). Miana końcowe oznaczano z częstości występowania brodawek w różnych rozcieńczeniach przez zastosowanie interpolacji Reed-Muench’a. Miana neutralizujące przeciwciał królików, którym wstrzyknięto DNA L1 albo DNA L1+L2 wykreślono na osi y na figurze 1.
Surowice królików, którym wstrzyknięto DNA L1 były również badane w kierunku przeciwciał w teście ELISA. Polistyrenowe płytki ELISA opłaszczano przez noc w 4°C przy użyciu 1 pg/studzienkę częściowo oczyszczonego, rekombinowanego białka L1 CRPV, uzyskanego z drożdży. Rekombinowane L1 wytworzono w S. cerevisiae i oczyszczono jak to opisali Kimbauer i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12180-4, 1992) z małymi modyfikacjami. Dodano rozcieńczonych surowic i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem na wytrząsarce poziomej). Płytki płukano, po czym dodawano kozich przeciwciał przeciw króliczym IgG (swoistych wobec Fc) sprzęgniętych z peroksydazą chrzanową. Po godzinie inkubacji z wytrząsaniem płytek, płytki płukano i dodawano substratu. Płytki odczytywano przy długości fali 450 nm, stosując kinetyczny czytnik ELISA (Molecular Devices Corp.), zaś uzyskane wartości były korygowane pod względem tła przez odejmowanie wartości szybkości reakcji surowic przed immunizacją od surowic po immunizacji w tym samym rozcieńczeniu. Miana oznaczano przez interpolację powstałej krzywej skorygowanych wartości szybkości reakcji
180 639 w stosunku do rozcieńczenia do wartości szybkości 10 mOD/min. Miana ELISA królików, którym wstrzyknięto DNA L1 albo DNA L1+L2 wykreślono na osi x na figurze 1. Figura 1 pokazuje, że 12/13 surowic było pozytywnych pod względem aktywności neutralizującej (log miana > 1, tzn. pozytywne bez rozcieńczania) jak również pod względem przeciwciał w ELISA (miano ELISA > 100). Cztery spośród czterech surowic, które były negatywne pod względem przeciwciał neutralizujących wykazywało miana ELISA > 350. Wszystkie surowice od królików, które otrzymały albo DNA L2 sam albo wektor kontrolny V1J wykazywały miana poniżej 100. Podsumowując, dane wskazują, że przeciwciała swoiste wobec CRPV oraz zdolne do neutralizacji uzyskano po wstrzyknięciu DNA L1. Miana ELISA u królików pozostawały nie zmienione przez co najmniej 32 tygodnie po immunizacji (figura 2).
Przykład 5. Ochrona królików po ekspozycji na zjadliwy CRPV
Pięciu królikom na grupę wstrzyknięto domięśniowo po 1 mg V1Jns-L1, V1Jns-L2,
V1Jns-L1 zmieszany z V1Jns-L2 (w sumie 2 mg) albo sam V1Jns (wektor kontrolny nie kodujący białka) jak opisano wyżej. Trzy tygodnie po początkowym wstrzyknięciu DNA, podawano drugie wstrzyknięcie tego samego DNA. Cztery tygodnie po drugim wstrzyknięciu zwierzęta eksponowano na CRPV. Ekspozycję na CRPV przeprowadzano przez nałożenie 50 pl każdego z dwóch rozcieńczeń zawiesiny wyj ściowej wirusa (1:2 albo 1:12 w DMEM+1 % BSA) na trzy miejsca po 1 cm2 ogolonej, skaryfikowanej skóry na grzbiecie każdego z królików. Surowice pobrane w momencie ekspozycj i od zwierząt, którym wstrzyknięto DNA L1 albo DNA L1+L2 zawierały przeciwciała w stosunku do L1 badane ELISA, i przeciwciała neutralizujące wirusa, jak to opisano wyżej. Zwierzęta obserwowano w kierunku tworzenia się brodawek w 3,6 i 10 tygodni po ekspozycji. Wśród królików, które nie otrzymały DNA L1, w 51 spośród 54 miejsc eksponowanych na CRPV, rozwinęły się brodawczaki, podczas gdy u zwierząt, które otrzymały DNA L1 brodawczaki rozwinęły się w 2 spośród 60 miejsc. Jedna z dwóch brodawek obserwowanych u królików immunizowanych DNA L1, zanikła po 3 tygodniach po pojawieniu się. W tabeli 1 przedstawiono rozkład brodawek u królików po ekspozycji na CRPV. Profilaktyczna immunizacja DNA L1 chroniła króliki przed rozwinięciem się brodawek po ekspozycji na zjadliwy CRPV.
Przykład 6. Swoistość konformacyjna przeciwciał wywołanych DNA L1 W celu wykazania, że ochronne, neutralizujące przeciwciała rozpoznają epitopy konformacyjne na VLP, przeprowadzono doświadczenia z absorbcją. Absorbcja surowic odpornościowych za pomocą VLP L1 (15) usuwała wszystkie przeciwciała neutralizujące i aktywność ELISA (figura 3 A, B). Nałożenie na skaryfikowaną skórę CRPV zmieszanego z króliczą surowicą sprzed immunizacji powodowała powstanie kłykcin we wszystkich eksponowanych miejscach, podczas gdy cRpV mieszano z surowicami odpornościowymi i nakładano podobnie, nie obserwowano kłykcin z powodu neutralizującej aktywności przeciwciał. Gdy CRPV mieszano z surowicą odpornościową, którą uprzednio absorbowano VLP L1, które powinny usuwać przeciwciała neutralizujące, wszystkie (3/3) miejsca ekspozycji były pozytywne pod względem kłykcin. W przeciwieństwie, gdy surowicę odpornościową absorbowano denaturowanym białkiem L1, nie tworzącym cząstek, (denaturowanym przez redukcję i alkilację 8 M mocznikiem), surowice były wciąż zdolne do neutralizacji CRPV (figura 3A) i zachowywały aktywność w ELISA (figura 3B). Tak więc, przeciwciała neutralizujące wirusa, wywołane przez immunizację DNA L1 mogą być usunięte tylko przez VLP Ll w konformacji natywnej nie zaś przez zdenaturowane L1. Wydaje się, że test ELISA rozpoznaje przeciwciała swoiste wobec konformacji pierwotnej reagujące z kompletnymi VLP L1, ponieważ zniesienie aktywności ELISA przez absorbcję odpowiadała usunięciu przeciwciał neutralizujących (figura 3B).
180 639
180 639
FIG.1
180 639
GEOMETRIO ΜΕΆΝ ELISA TITER + SEM
ŚREDNIA GEOMETRYCZNA MIANA ELISA+ SEK
FIG.2
180 639
WIRUS ZMIESZANY Z
VIRUS ΜΙΧΕ0 WITH:
surowica NORMAL
NORMALNA nnSn* ,MMUNE ODPORNO- crDl IM SCIOWA OŁKUM
SUROWICA ODPORNOŚCIOWA ABSORBOWANA IMMUNE SERUM naty-ABSORBED WITH ^YM NATIVE LI
IMMUNE SERUM ABSORBED WITH DENATURED LI
SUROWICA ODPORNOŚCIOWA ABSORBOWANA ZDENA- 0 TUROWANYH L1 '
—I-Γ | —i—i—j—i—i—r | —I—I-1- | —1-1-1-1-1-1-1- i i i | ||
1 | ! | ||||
- | ........................................... | 1 | I | - | |
- | ! | i | i t | - | |
- | i | i | - | ||
- | i | i | - | ||
Ϊ | 1 | ......................i....... | |||
O? | - | ||||
....................i....................... | I | ||||
- | I | i i | ......................f....... | - | |
- | t i | - | |||
- | I i | i 1 | - | ||
1_L | l l i 1 l l | i i_i— | i t 1_1 i | L | l 1 |
100
150
200
MEAN AREA 0F CONDYLOMAS (sq mm) ,
Średnia powierzchnia kłykciny («/)
FIG.3A
180 639
CK
FIG.3B
180 639
FIG.4A
NET mOD/min (POST-PRE)
CAŁKOWITE mOD/min. (PO-PRZED)
180 639
RECIP. DILUTION ROZCIEŃCZENIE
FIG.4B
NET mOD/min (POST-PRE)
CAŁKOWITE raOD/min. (PO-PRZED)
180 639
H O O >-< NI O d. | n | |
LU ω | z | |
co | o« | cna |
o | z ω | ^:o |
Q_ | LU | LU U |
_IO | LU>< | |
LU | —1 ω | |
t— | o <ę NI o | O |
to υχ
UJ —. w ο MO >< to W02 χη <
u- ?ζε 3= o Η o —j< SS
OT <r ® O LU NI d m 7*50 ω
Xg JsS
-—> J U o o I-O to co o w
O X UJ w o
I Ł—I r-1 o t E s ry; %><C pffl h m O-n
S ON HO 1-3 dl co «Λ
Μ
S
Q
Ο
Ο
Εη
r. r*. CM CM
Γ- MCM CM
LxJ
O co
ΣΟ oz
I o d. ca ω w te s w Z w ONO ^O O
--< ω <ę = HC0H oo o o N) CC O O w >-< OC 3= N
CM 2»
CM
CM
O
CQ «a:
O Oce
O
2ig§
OQ
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Szczepionka polinukleotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający:a) co najmniej jeden polinukleotyd kodujący białko ludzkiego wirusa brodawczaków (HPV) wybrane z grupy obejmującej L1 i L1+L2jednego lub więcej typów HPV wybranych spośród HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 i HPV 18,b) promotor CMV,c) terminator transkrypcji z genu bydlęcego hormonu wzrostu id) gen markerowy oporności na neomycynę, w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze.
- 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jako wektor zawiera VIJneo lub VIJns.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26842494A | 1994-06-30 | 1994-06-30 | |
PCT/US1995/006915 WO1996000583A1 (en) | 1994-06-30 | 1995-06-01 | Polynucleotide vaccine for papillomavirus |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL317874A1 PL317874A1 (en) | 1997-04-28 |
PL180639B1 true PL180639B1 (pl) | 2001-03-30 |
Family
ID=23022939
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL95317874A PL180639B1 (pl) | 1994-06-30 | 1996-12-18 | Szczepionka polinukieotydowa dla ludzi przeciwko wirusowi brodawczaków PL PL PL PL PL PL |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5866553A (pl) |
EP (1) | EP0768893B1 (pl) |
JP (1) | JPH10501987A (pl) |
CN (1) | CN1156966A (pl) |
AT (1) | ATE233101T1 (pl) |
AU (1) | AU701973B2 (pl) |
CA (1) | CA2193365C (pl) |
CZ (1) | CZ375296A3 (pl) |
DE (1) | DE69529748T2 (pl) |
ES (1) | ES2191052T3 (pl) |
FI (1) | FI965224A (pl) |
HU (1) | HU220747B1 (pl) |
IL (1) | IL113817A (pl) |
MX (1) | MX9700229A (pl) |
NO (1) | NO965590L (pl) |
NZ (1) | NZ288045A (pl) |
PL (1) | PL180639B1 (pl) |
SK (1) | SK164196A3 (pl) |
WO (1) | WO1996000583A1 (pl) |
ZA (1) | ZA954641B (pl) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6995008B1 (en) * | 1994-03-07 | 2006-02-07 | Merck & Co., Inc. | Coordinate in vivo gene expression |
US5736524A (en) * | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
US7118754B1 (en) | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
FR2751879B1 (fr) * | 1996-07-30 | 1998-10-30 | Transgene Sa | Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus |
DE19631357A1 (de) * | 1996-08-02 | 1998-02-05 | Deutsches Krebsforsch | Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen |
US20060002949A1 (en) * | 1996-11-14 | 2006-01-05 | Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. | Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant |
US5980898A (en) * | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
US20060002959A1 (en) * | 1996-11-14 | 2006-01-05 | Government Of The United States | Skin-sctive adjuvants for transcutaneous immuization |
US6797276B1 (en) * | 1996-11-14 | 2004-09-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response |
EP1017283B1 (en) * | 1997-02-14 | 2004-12-15 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
US6013258A (en) * | 1997-10-09 | 2000-01-11 | Zycos Inc. | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein |
US6183746B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-02-06 | Zycos Inc. | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein |
US20040258703A1 (en) * | 1997-11-14 | 2004-12-23 | The Government Of The Us, As Represented By The Secretary Of The Army | Skin-active adjuvants for transcutaneous immunization |
US7182947B2 (en) | 1998-02-20 | 2007-02-27 | Medigene Ag | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
US7494658B2 (en) | 1998-02-20 | 2009-02-24 | Medigene Ag | Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
US20020039584A1 (en) | 1998-02-20 | 2002-04-04 | Medigene Ag | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
CA2229955C (en) | 1998-02-20 | 2003-12-09 | Medigene Gmbh | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
US6926897B1 (en) | 1998-03-24 | 2005-08-09 | Medigene Aktiengesellschaft | Medicament for the avoidance or treatment of papillomavirus-specific tumour |
AU3489499A (en) * | 1998-04-14 | 1999-11-01 | Merck & Co., Inc. | Needleless administration of polynucleotide formulations |
PT1108035E (pt) * | 1998-09-04 | 2007-11-20 | Sanofi Pasteur Ltd | Tratamento de cancro cervical |
US20040258763A1 (en) * | 1999-02-03 | 2004-12-23 | Bell Steve J.D. | Methods of manufacture and use of calcium phosphate particles containing allergens |
CA2361421A1 (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use |
US20020054914A1 (en) * | 1999-02-03 | 2002-05-09 | Tulin Morcol | Compositions and methods for therapuetic agents complexed with calcium phosphate and encased by casein |
ES2308069T3 (es) * | 1999-03-26 | 2008-12-01 | Vical Incorporated | Composiciones adyuvantes para realzar inmunorespuestas a las vacunas polinucleotido-basadas. |
AU4188100A (en) * | 1999-04-08 | 2000-11-14 | Gregory M. Glenn | Dry formulation for transcutaneous immunization |
US7001995B1 (en) | 1999-08-25 | 2006-02-21 | Merck & Co., Inc. | Synthetic human papillomavirus genes |
AU772611B2 (en) * | 1999-08-25 | 2004-05-06 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Synthetic human papillomavirus genes |
KR100366608B1 (ko) * | 2000-02-15 | 2003-01-09 | 마스터진(주) | 형질전환 식물체로부터 생산된 재조합 인간 파필로마바이러스 백신 |
US20020044948A1 (en) * | 2000-03-15 | 2002-04-18 | Samir Khleif | Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens |
SE0002498D0 (sv) * | 2000-07-03 | 2000-07-03 | Stefan Schwartz | Papillomavirus vaccine |
KR20020005332A (ko) * | 2000-07-10 | 2002-01-17 | 정상훈 | 탈모증 치료용 키트 |
AU2002250071B2 (en) * | 2001-02-13 | 2008-02-14 | Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army | Vaccine for transcutaneous immunization |
WO2003000283A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein |
DE10137102A1 (de) * | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
US20030185892A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-10-02 | Bell Steve J. D. | Intraocular delivery compositions and methods |
US20030228327A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-12-11 | Lasher Alfred W. | DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same |
EP1585812B1 (en) * | 2002-12-13 | 2017-01-18 | Alphavax, Inc. | Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods |
KR20070002014A (ko) * | 2004-02-13 | 2007-01-04 | 노드 파마수티칼스, 인코포레이티드 | 치료용 인산칼슘 입자, 그 제조 방법 및 그 이용 방법 |
EP1811941A4 (en) * | 2004-11-01 | 2008-09-10 | Biosante Pharmaceuticals Inc | CALCIUM PHOSPHATE THERAPEUTIC PARTICLES FOR AESTHETIC OR COSMETIC MEDICINE, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME |
WO2006083984A1 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-10 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Papillomavirus l2 n-terminal peptides for the induction of broadly cross-neutralizing antibodies |
CN101293918B (zh) * | 2007-04-29 | 2013-03-27 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 截短的人***瘤病毒16型l1蛋白 |
US9364529B2 (en) | 2007-04-29 | 2016-06-14 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 |
EP2154149B1 (en) * | 2007-05-29 | 2019-07-10 | Xiamen University | A truncated l1 protein of human papillomavirus 6 |
KR20150128900A (ko) * | 2013-03-15 | 2015-11-18 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 항원 및 어쥬번트로서 인터류킨-23을 갖는 백신 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4497796A (en) * | 1980-03-26 | 1985-02-05 | The Regents Of The University Of California | Gene transfer in intact mammals |
JP2648303B2 (ja) * | 1985-04-04 | 1997-08-27 | ジョージタウン・ユニバーシティ | 型特異的乳頭腫ウイルスdna配列およびペプチド |
US4777239A (en) * | 1986-07-10 | 1988-10-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnostic peptides of human papilloma virus |
ES2200016T3 (es) * | 1989-03-21 | 2004-03-01 | Vical Incorporated | Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado. |
DE122007000019I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffen gegen Papillomavirus |
US5376542A (en) * | 1992-04-27 | 1994-12-27 | Georgetown University | Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes |
ZA935355B (en) * | 1992-08-07 | 1995-01-23 | American Home Prod | Recombinant andenovirus vaccines |
US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
US5593972A (en) * | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
-
1995
- 1995-05-22 IL IL11381795A patent/IL113817A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-06-01 AT AT95922160T patent/ATE233101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-06-01 CA CA002193365A patent/CA2193365C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-01 SK SK1641-96A patent/SK164196A3/sk unknown
- 1995-06-01 CN CN95194672A patent/CN1156966A/zh active Pending
- 1995-06-01 DE DE69529748T patent/DE69529748T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-01 US US08/750,810 patent/US5866553A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-01 MX MX9700229A patent/MX9700229A/es unknown
- 1995-06-01 AU AU26945/95A patent/AU701973B2/en not_active Ceased
- 1995-06-01 JP JP8503166A patent/JPH10501987A/ja active Pending
- 1995-06-01 EP EP95922160A patent/EP0768893B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 WO PCT/US1995/006915 patent/WO1996000583A1/en active IP Right Grant
- 1995-06-01 HU HU9603562A patent/HU220747B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-01 CZ CZ963752A patent/CZ375296A3/cs unknown
- 1995-06-01 ES ES95922160T patent/ES2191052T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-06 ZA ZA954641A patent/ZA954641B/xx unknown
-
1996
- 1996-12-18 NZ NZ288045A patent/NZ288045A/en unknown
- 1996-12-18 PL PL95317874A patent/PL180639B1/pl unknown
- 1996-12-27 NO NO965590A patent/NO965590L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-12-27 FI FI965224A patent/FI965224A/fi unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1996000583A1 (en) | 1996-01-11 |
HU9603562D0 (en) | 1997-02-28 |
AU2694595A (en) | 1996-01-25 |
IL113817A (en) | 2001-03-19 |
PL317874A1 (en) | 1997-04-28 |
FI965224A0 (fi) | 1996-12-27 |
FI965224A (fi) | 1996-12-27 |
HUT76446A (en) | 1997-09-29 |
JPH10501987A (ja) | 1998-02-24 |
CA2193365A1 (en) | 1996-01-11 |
MX9700229A (es) | 1997-04-30 |
DE69529748D1 (de) | 2003-04-03 |
NZ288045A (en) | 1998-08-26 |
CZ375296A3 (en) | 1997-08-13 |
DE69529748T2 (de) | 2003-10-16 |
US5866553A (en) | 1999-02-02 |
CA2193365C (en) | 2007-04-03 |
ZA954641B (en) | 1996-01-26 |
SK164196A3 (en) | 1997-08-06 |
ATE233101T1 (de) | 2003-03-15 |
NO965590D0 (no) | 1996-12-27 |
IL113817A0 (en) | 1995-08-31 |
EP0768893A1 (en) | 1997-04-23 |
EP0768893B1 (en) | 2003-02-26 |
ES2191052T3 (es) | 2003-09-01 |
NO965590L (no) | 1997-02-28 |
HU220747B1 (hu) | 2002-05-28 |
AU701973B2 (en) | 1999-02-11 |
CN1156966A (zh) | 1997-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU701973B2 (en) | Polynucleotide vaccine for papillomavirus | |
Peng et al. | Papillomavirus virus-like particles can deliver defined CTL epitopes to the MHC class I pathway | |
CA2342289C (en) | Treatment of cervical cancer | |
WO2020063370A2 (zh) | 免疫组合物及其制备方法与应用 | |
ES2301551T3 (es) | Moleculas l1 de papilomavirus humano (hpv) quimericas y usos de las mismas. | |
WO1998023635A1 (en) | Novel promiscuous t helper cell epitopes | |
JP2004121263A6 (ja) | 子宮頸がんの治療 | |
WO2022003119A1 (en) | Cross-reactive coronavirus vaccine | |
JP2002516291A (ja) | パピローマウイルス・ウイルス様粒子による経口免疫感作 | |
Liu et al. | Route of administration of chimeric BPV1 VLP determines the character of the induced immune responses | |
JPH10503649A (ja) | ポリヌクレオチド・ヘルペスウイルス・ワクチン | |
CN113278634B (zh) | 一种预防和治疗默克尔细胞癌的新型疫苗 | |
Hu et al. | Protective cell-mediated immunity by DNA vaccination against papillomavirus L1 capsid protein in the cottontail rabbit papillomavirus model | |
JPS59118097A (ja) | 単純ヘルペスウイルスタンパク質をコードするdna配列 | |
Srinivasan et al. | Targeting vaccinia virus-expressed secretory beta subunit of human chorionic gonadotropin to the cell surface induces antibodies | |
Yi et al. | Recombinant bivalent vaccine against foot-and-mouth disease virus serotype O/A infection in guinea pig | |
RU2173170C2 (ru) | Полинуклеотидная вакцина для вируса папилломы | |
MXPA05003558A (es) | Vacuna de adn que codifica al menos dos proteinas tempranas no estructurales de papilomavirus. | |
US7238672B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
Cao et al. | Expression and immunogenicity of hepatitis E virus-like particles based on recombinant truncated ORF2 capsid protein | |
JP2006503860A (ja) | 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫 | |
Moore | Canine papillomavirus–a mucosal model of human disease | |
MXPA00001706A (en) | Fusion proteins comprising carriers that can induce a dual immune response |