PL170156B1 - Sposób wytwarzania zabezpieczonego przed wirusami preparatu trombiny PL PL PL - Google Patents

Abstract

1.Sposób wytwarzania zabezpieczonego przed wirusami preparatu trombiny, znamien- ny tym, ze trombine wytwarza sie z dezaktywowanej przeciwwirusowo frakcji osocza, zawierajacej protrombine, droga wylacznej aktywacji za pomoca soli aktywujacych krze- pniecie. ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL ( 1 1 ) 170156 RZECZPOSPOLITA POLSKA PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zabezpieczonego przed wirusami preparatu trombiny.

Podczas krzepnięcia krwi zachodzi cały szereg przebiegających kolejno reakcji, w ramach których zostają aktywowane czynniki krzepnięcia krwi i na końcu tworzy się fibryna w wyniku działania aktywowanej protrombiny (trombiny) na fibrynogen. Przekształcanie protrombiny w trombinę przez sam czynnik Xa i wapń przebiega bardzo wolno. Natomiast optymalnie przebiega ono dopiero wtedy, gdy występuje kompleks kilku czynników (kompleks protrombinazowy). Do tego kompleksu oprócz czynnika Xa należą: czynnik V, fosfolipidy i wapń. Czynnik Xa rozszczepia cząsteczkę protrombiny (ciężar cząsteczkowy 68 kD) proteolitycznie wytwarzając równocześnie aktywny enzym trombinę (ciężar cząsteczkowy 30 kD).

Proteaza osocza trombina jest wielofunkcyjnym enzymem, który działa koagulująco nie tylko przez rozszczepianie fibrynogenu do fibryny, lecz także aktywuje czynniki krzepnięcia V, VIII i XIII i rozszczepia swój własny proenzym (protrombinę).

W lecznictwie stosuje się samą trombinę lub razem z fibrynogenem do tamowania krwawień lub w chirurgii do sklejania tkanek.

Aktywacja protrombiny via kompleks protrombinazowy jest ex situ trudna do naśladowania, nie brakuje więc prób wytwarzania trombiny przez działanie proteazami pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Należy jednak pamiętać, że niezbędne jest unikanie wszelkiego kontaktu produktu z materiałem ludzkim lub zwierzęcym ze względu na niebezpieczeństwo skażenia czynnikami zakaźnymi.

Próby działania na kompleks protrombinowy, wyodrębniony z osocza, jonami wapniowymi jak również jonami wapniowymi i zawiesiną zawierającą tromboplastynę wołową pokazały, że działanie samymi jonami wapniowymi umożliwia wytwarzanie trombiny o

170 156 znacznie mniejszej czystości i ze znacznie mniejszą wydajnością niż działanie jonami wapniowymi i tromboplastyną (Cryobiology 21, 661-663 (1984).

Z DE-A-38 43 126 wiadomo, że z osocza, które zostało zaadsorbowane na macierzy i poddane działaniu aktywatora protrombiny, można otrzymać trombinę. Jako aktywatory wymienia się np. jony wapniowe, jony wapniowe i tromboplastynę lub czynnik Xa. Podczas aktywacji są obecne wszystkie współistniejące czynniki biologiczne, które również wiążą się na macierzy.

W przypadku stosowania protrombiny z osocza do otrzymywania trombiny istnieje niebezpieczeństwo skażenia czynnikami zakaźnymi (np. wirusami żółtaczki zakaźnej; HTV). Dochodzi jeszcze do tego także to, że we wszystkich znanych metodach aktywacji zaleca się stosowanie oprócz jonów wapnia ²⁺ dodatkowo współistniejących czynników biologicznych, co stanowi dalsze źródło skażenia.

Obecnie wiadomo, że czynniki zakaźne w preparatach biologicznych można w sposób niezawodny dezaktywować przez działanie podwyższonej temperatury, zwłaszcza w połączeniu z działaniem pary (AT-B-385.657). Okazało się jednak, że ze względu na nietrwałość cieplną trombiny należy ją ogrzewać w obecności stabilizatorów (DE-A-38 09 991), aby nie obniżyć jej aktywności. Stosowanie stabilizatorów jest jednak sporne, gdyż podczas ogrzewania chroniona jest nie tylko aktywność trombiny, lecz także stabilizowane są wirusy.

Zadaniem wynalazkujest zaproponowanie zabezpieczonej przed wirusami trombiny.

Zabezpieczona przed wirusami trombina jest otrzymywalna z dezaktywowanej przeciwwirusowo frakqi osocza zawierającej protrombinę przez aktywację wyłącznie za pomocą soli aktywujących krzepnięcie, np. za pomocą jonów wapniowych, strontowych lub cynkowych. Takie sole powodują wytwarzanie trombiny z odpowiednich czynników krzepnięcia.

Wynalazek jest oparty na stwierdzeniu, że czynniki zakaźne, które są zawarte w protrombinie z osocza, mogą być unieszkodliwione przez wywieranie na protrombinę działania mającego na celu dezaktywację przeciwwirusową, bez znaczniejszej szkody dla aktywności biologicznej trombiny otrzymywalnej z protrombiny.

Niespodziewanie okazało się, że aktywacja dezaktywowanej przeciwwirusowo frakcji zawierającej protrombinę wyłącznie przez dodanie soli aktywujących krzepnięcie powoduje zwiększenie wydajności oraz czystości produktu bez konieczności stosowania dodatku współistniejących czynników biologicznych, jak czynników krzepnięcia V, Xa lub fosfolipidów. Unika się więc skażenia podczas aktywacji i dlatego otrzymana trombina tak jak materiał wyjściowy jest zabezpieczona przed wirusami.

Okazało się, że korzystne jest wytwarzanie zabezpieczonej przed wirusami trombiny z dezaktywowanego przeciwwirusowo kompleksu protrombinowego, zwłaszcza zdezaktywowanego przeciwwirusowo aktywowanego kompleksu protrombinowego. Aktywacja aktywowanego kompleksu protrombinowego przez dodanie soli aktywujących krzepnięcie przebiega przy niespodziewanie dużej szybkości reakcji. Tak samo ulega optymalizacji wydajność trombiny.

Szczególnie korzystne jest wytwarzanie zabezpieczonej przed wirusami trombiny z FEIBA. Aktywowany kompleks protrombinowy względnie FEIBA można otrzymywać za pomocą znanych już sposobów (AT-B-350.726, AT-B-368.883, EP-B-O 041 173) z kompleksu protrombinowego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zabezpieczonej przed wirusami trombiny, polegający na tym, że

- wytwarza się aktywowany kompleks protrombinowy z frakcji osocza zawierającej protrombinę,

-aktywowany kompleks protrombinowy poddaje się obróbce w celu dezaktywacji czynników zakaźnych oraz

- do poddanego obróbce aktywowanego kompleksu protrombinowego dodaje się sole aktywujące krzepnięcie, w celu wytworzenia trombiny.

Następnie oczyszcza się trombinę korzystnie za pomocą chromatografii jonowymiennej i/lub chromatografii afinacyjnej.

170 156

Zabezpieczona przed wirusami trombina według powyższego opisu nadaje się szczególnie do wytwarzania preparatów farmaceutycznych i do wywarzania środków diagnostycznych.

Wynalazek objaśniają bliżej poniższe przykłady, przy czym przykłady III i IV dotyczą oczyszczania trombiny otrzymanej według przykładu I.

Przykład I. Z 151 osocza krwi z małej zawartości krioosadu została wyodrębniona przez związanie na wymieniaczu anionowym (DEAE - Sephadex) protrombina (czynnik II) wraz z czynnikami krzepnięcia VII, IX i X. Po elucji za pomocą 0,5-molowego roztworu NaCl frakcji zawierającej czynnik II zostało zmniejszone w otrzymanym roztworze stężenie soli do 0,15 mola/litr przez diafUtrację, a następnie wysuszono go sublimacyjnie.

W celu dezaktywacji ewentualnie zawartych zarazków frakcja ta została według AT-B-385.657 ogrzana w ciągu 10h w temperaturze 60°C i w ciągu 1h w temperaturze 80°C. Aktywność protrombiny wynosiła 5 250jednostek. Protrombina została następnie rozpuszczona w roztworze do stężenia 2,5 jednostek/ml i wymieszana powoli z roztworem zawierającym 2,5 mmola/litr CaCh w temperaturze +30°C i przy wartości pH 7,0; po upływie 80 minut została oznaczona aktywność trombiny (za pomocą chromogenicznego substratu Th-1 (fabryka Immuno)) z 48 jednostkami na 1 jednostkę czynnika II.

Przez ochłodzenie do temperatury +4°C i przez dodanie kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (EDTA) zostało zatrzymane wytwarzanie trombiny. Za pomocą ultrafiltracji/diafiltracji z zastosowaniem membrany ultrafiltracyjnej (wielkość porów: 10000) został usunięty kompleks Ca. Następnie z koncentratu został wykonany preparat farmaceutyczny.

Przykład II. 20 ml roztworu zawierającego FEIBA (IMMUNO AG, Wiedeń) z aktywności FEEB 996 jednostek i 992 jednostek czynnika II zostało rozcieńczone 0,9% roztworem NaCl do 330 ml i wymieszane powoli z 2,75 mmola/litr CaCh w temperaturze +30°C. Po upływie 90 minut aktywność trombiny osiągnęła maksimum o wielkości 51 jednostek na jednostkę czynnika II. Aktywacja została zatrzymana przez ochłodzenie roztworu do temperatury +4°C i dodanie cytrynianu sodowego.

Przykład III. 20000 jednostek trombiny, otrzymanych według przykładu I, zostało zaadsorbowane w słupku 20 ml S-sefarozy przy przewodności 10,5 m S/cm i wartości pH 6,0. Następnie przemyto 140 ml 150 mmolowego roztworu NaCl, w celu usunięcia nie związanych protein.

Frakcja zawierająca trombinę została eluowana za pomocą 100 ml 750 mmolowego roztworu NaCl, zatężona, poddana diafiltracji i na koniec przerobiona na preparat farmaceutyczny.

Wydajność liczona jako aktywność trombiny była większa od 90%.

Przykład IV. 10000jednostek trombiny, otrzymanych według przykładu I, zostało naniesionych na słupek 10 ml lizyny-sefarozy, zrównoważonej za pomocą 150 mmolowego roztworu octanu sodowego, pH 6,7. Słupek z załadunkiem został przemyty tym samym buforem a frakcja zawierająca trombinę została eluowana za pomocą 300 mmolowego roztworu lizyny; aktywność trombiny wynosiła 9400jednostek ajej aktywność właściwa 1850 jednostek/mg proteiny.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 2,00 zł

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   l.Sposób wytwarzania zabezpieczonego przed wirusami preparatu trombiny, znamienny tym, że trombinę wytwarza się z dezaktywowanej przeciwwirusowo frakcji osocza, zawierającej protrombinę, drogą wyłącznej aktywacji za pomocą soli aktywujących krzepnięcie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się frakcję osocza, która zawiera kompleks protrombinowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się frakcję osocza, która zawiera aktywowany kompleks protrombinowy.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że stosuje się frakcję osocza,zawierającą FEIBA.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że trombinę wytwarza się z dezaktywowanej przeciwwirusowo frakcji osocza, zawierającej protrombinę, drogą wyłącznej aktywacji za pomocą soli aktywujących krzepnięcie i ten otrzymany preparat, zawierający trombinę, poddaje się następnie obróbce znanymi metodami do postaci preparatu farmaceutycznego.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się aktywowany kompleks protrombinowy z frakcji osocza zawierającej protrombinę, aktywowany kompleks protrombinowy poddaje się obróbce w celu dezaktywacji czynników zakaźnych i do poddanego obróbce aktywowanego kompleksu protrombinowego dodaje się sole aktywujące krzepnięcie.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że trombinę dalej oczyszcza się za pomocą chromatografii jonowymiennej i/lub chromatografii afinacyjnej.