Przedmiotem wynalazku jest sposób radiotimmu- nologicznego oznaczania hormonów i leków.Przy oznaczaniu hormonów i leków metoda ra- dioimmunoiogiczna, hormony i leki reaguja z prze¬ ciwcialem. Specyficznosc reakcji zalezy od immu¬ nologicznej komplementarnosci tzn. moze wystepo¬ wac krzyzowa reaktywnosc z substancjami, które wykazuja podobna konfiguracje chemiczna. W po¬ laczeniu estriol-wegiel Ce, estriol wystepuje w kon¬ figuracji immunodeterminantowej, w której prawie wszystkie grupy funkcyjne estrolu sa umiejscowio¬ ne w zasiegu wiazacego je przeciwciala.Pomimo to, polaczenia estrolu z reszta siarcza¬ nowa lub glukuronidowa zajmujace pozycje przy fenolowym weglu C3, sa zwiazane w znacznym stopniu przez przeciwcialo. Jest to niekorzystne przy oznaczaniu wolnych sterydów, zwlaszcza gdy stezenie zwiazanego sterydu w próbce przewyzsza stezenie sterydu o dziesiate potegi, co ma miejsce w estrogenach surowicy ciezarnych.Z powyzszych powodów byly dotychczas glów¬ nie stosowane takie metody, w których specyficz¬ nosc byla zapewniona przez ekstrakcje rozpusz- czaiLniikiem przeprowadzona przed próba radioim- munologiczna. Ekstrakcje rozpuszczalnikami stoja jednakze na przeszkodzie do seryjnego i zautomaty¬ zowanego prowadzenia badan.W badaniach prowadzonych w celu ulatwienia metod immunologicznych w technikach fazy sta¬ lej, przeciwciala zostaja zwiazane kowalencyjnie 10 15 20 25 30 2 do róznych nosników takich jak np. agar, celuloza, czasteczki szkla, poliamidy i podiaikryioamidy. Ko¬ rzysci z zamkniecia przeciwciala w nosniku pole¬ gaja na wykluczeniu zaklócen spowodowanych czasteczkami o duzym ciezarze czasteczkowym, oraz usunieciu etapu pipetowania, odwirowywania i dlugotrwalej stabilizacji przeciwcial w temperatu¬ rze pokojowej.Okazalo sie, ze specyficznosc wiazania przeciw¬ ciala, gdy zostalo ono unieruchomione w nosniku w znany sposób; nie spelnia stawianych wyma¬ gan.Celem wynalazku bylo opracowanie sposobu ra¬ dioimmunologicznego oznaczania hormonów i le¬ ków przez immobilizowanie przeciwciala na nos¬ niku z polimeru o podwyzszonej specyficznosci wia¬ zania zamknietego przeciwciala i unikniecia zda¬ rzajacej sie uprzednio krzyzowej reaktywnosci.Nieoczekiwanie okazalo sie, ze kopolimery akry- ioamidu stanowia odmiane nosnika, dzieki której uzyskuje sie podwyzszenie specyficznosci wiazania przeciwciala przez nosnik z polimeru.Przedmioten^ wynalazku jest wiec sposób ozna¬ czania hormonów i leków metoda radioimmunalo- giczna polegajaca na unieruchamianiu przeciwcial na nosniku z kopolimeru akryloamidu.Kopolimery te sa uzyskiwane przez polimeryza¬ cje akryloamidu z jednym lub wiecej zwiazkami takimi jak kwas akrylowy, metakryiowy, metakry- 121 9503 121 950 4 loamid, ich pochodnymi i solami kwasu akrylowego lub metakrylowego.Przez kopoiimeryzacje akryloamidu ze zwiazka¬ mi dajacymi sie kopolimeryzowac mozna wplywac na miikrosirodowisko nosnika z polimeru. Dzialanie polega glównie na efektach hydrofilowych, hydro¬ fobowych i elektrostatycznych wewnatrz nosnika z polimeru.Przez zmiane nosnika z polimeru za pomoca ko- polimeryzacji mozliwe, jest znaczne podwyzszenie specyficznosci wiazania przeciwciala i powstrzy¬ manie niepozadanej krzyzowej reaktywnosci. Nos¬ nik z polimeru za pomoca odpowiedniej kopalinie- ryzacjij £W$kfe*zJZn*mopy tak, aby z jednej strony zapjfewnic specyficzna reakcje haptenu z unierucho¬ mionym przeciwcialem, a z drugiej strony aby powstrzymac • niepozadana reaktywnosc krzyzowa haptenu.Dzieki zastosowaniu specyficznego nosnika w sposobie wedlug wynalazku, mozliwe sa pomiary bezposrednio w nieekstrahowanej surowicy.Ze wzgledu na podwyzszona specyficznosc nosni¬ ka z polimeru wedlug wynalazku mozliwe jest ra- dioimmunologiczne oznaczanie hormonów i leków z bardzo duza dokladnoscia, poniewaz wahania oznaczanych wartosci na podstawie niespecyficznych wiazan pomiedzy czasteczkami sterydów, a nosni¬ kiem dzieki kopolimeryzacji sa sprowadzone do minimum.Przy róznych oznaczeniach, takich jak np. hor¬ monów tarczycy, tyroksyny i trojjodotyroniny sto¬ suje sie substancje kompetycyjne (wspólzawodni¬ czace) jak kwas anilinonaftalenosulfonowy, mer- tiolan lub salicylan w celu przemieszczenia hormo¬ nu z jego wiazania z róznymi zwiazanymi w suro¬ wicy proteinami.Jednakze wiadomo, ze w przypadku duzego ste¬ zenia substancji kompetylcyjnych nastepuje naru¬ szenie wiazania pomiedzy hormonem i przeciwcia¬ lem. Przy zastosowaniu nosnika z polimeru w spo¬ sobie, wedlug wynalazku mozliwe jest na podstawie wzajemnego oddzialywania elektrostatycznego, zna¬ czne podniesienie stezenia substancji kompetycyj- nych tj. o wspólczynnik 100 bez oslabienia wiaza¬ nia hormon—przeciwcialo.Zawiarfosc akii^oamidu w kopolimerze moze wy¬ nosic 1—99°/o molowych, korzystnie 5—9t3°/o molo¬ wych, a zwlaszcza 20—80°/o molowych.Szczególnie odpowiednimi sa kopolimery akry¬ loamidu z kwasem metakrylowym, zwlaszcza takie w których zawartosc kwasu metakrylowego wy¬ nosi 20—60tyo molowych. Kwas metakrylowy z jed¬ nej strony hydrofobuje nosnik, a z drugiej strony prowadzi do efektu naladowania, przez co wyklu¬ cza mozliwosc niespecyficznego wiazania w sub¬ stancjach badanych.W sposobie wedlug wynalazku dzieki zastosowa¬ niu kopolimerów zawierajacych kwas akrylowy lub metakrylowy lub ich sole mozna uzyskac efekt zobojetniania lub dzialanie buforowe dla roztworów kwasnych lub alkalicznych. Jest to znaczna zaleta przy wielu oznaczeniach.Jako korzystne sole kwasu akrylowego lub me¬ takrylowego stosuje sie sole metali alkalicznych i/lub ziem alkalicznych. Szczególnie korzystne sa sole sodowe lub potasowe.Jako pochodne kwasu akrylowego i metakrylo¬ wego stosuje sie zwlaszcza estry, np. ester mety- 5 Iowy i etylowy.Odpowiednimi pochodnymi metakryloamidów sa np. zwiazki podstawione przy azocie, jak N-hydro- ksymetylometakryloamid.Przykladami innych odpowiednich zwiazków ko- polimeryzacyjnych z akryloamidem sa zwlaszcza zwiazki podstawione przy azocie jak N-hydroksy- metydoakryloaimid.Przykladem innych zwiazków kopoMmeryzuja- cych z akryloamidem jest N,N-dwualkilotartaro- dwuamid.Uinienuiohiaimiianie przeciwciala nastepuje poraez zamkniecie w nosniku polimeru Mlub kowalencyjne utrwalenie.Dokladny opis badan radioimmunologicznych po¬ dany jest np. w Glinical Chemistry, t. 19, nr 2, 1973, str. 145; ibid. t. 19 nr 12, 1973 str. 1339, i ibid. t. 21, nr 7,. 1975, str. 829, opisane sa techniki radioimmunoiogiczne, w których stosuje sie unie¬ ruchomienie przeciwcial.Sposób wedlug wynalazku przy zastosowaniu nosnika z polimeru nadaje sie do oznaczania róz¬ nych hormonów i leków, które znajduja sie w su¬ rowicy lub plazmie, zwiazane czesciowo do specy¬ ficznych lub niespecyficznych wiazan proteino¬ wych.Hormony moga byc hormonami tarczycy, zwla¬ szcza tyroksyma i trójjodotyiroinina, hormonami steroidowymi jak kortizon, testosteron, progeste¬ ron, estron, estradiol i estriol i glikozydami naser- cowymi, jak digitoksyna i digoksyna.Ponadto mozna równiez oznaczac witaminy, zwla¬ szcza witamine Bi2 i kwas foliowy, jak tez srodki lecznicze silnie wiazace bialko jak np. srodki an- tykoagulacyjne dwukumarol, analgetiika (srodki usmierzajace ból) i salicylany.Synteza antygenu, otrzymywanie antyserum np. przez uodpornianie królików i izolowanie jak rów¬ niez unieruchamianie przeciwcial sa znane (por. np. dinical Chemistry t. 19, nr 2, 1973r str. 146).Sposób wedlug wynalazku unieruchamiania prze¬ ciwciala pmzeprowadiza sie w ten sposób, ze roz¬ twór przeciwciala dodaje sie do mieszaniny mo¬ nomerów. Poczatkowa mieszanine poddaje sie poli¬ meryzacji np. wolnorodniikowej, a otrzymany po¬ limer rozdrabnia sie, przemywa i suszy.Wybór i stosunek ilosciowy kopolimeru dodane¬ go do akryloamidu okreslaja wlasciwosci nosnika jakie pragnie sie uzyskac w odniesieniu do swoi¬ stosci. Na swoistosc mozna wplywac w szerokich granicach poprzez zmiane hydrofobowosci i ladun¬ ku nosnika. Dodatek inetakryloamidu podwyzsza wlasnosci hydrofobowe nosnika. Dodatek kwasu aikrylowego lub metbakiryiliowego albo ich soli zmie¬ nia ladunek nosnika.Istnieje równiez mozliwosc dodania bezposred¬ nio do mieszaniny monomerów soli kwasu akry¬ lowego lub metakrylowego lub alternatywnie mo¬ zna spolimeryzowac kwasy i nastepnie utworzyc sole w nosniku za pomoca wymieniaczy jonowych. 15 20 29 30 29 40 45 50 55 605 121990 6 W celu uzyskania w nosnilku por o odpowiedniej wielkosci zmienia sie stezenia monomerów. Ste¬ zenie monomerów w zakresie od okolo 20*/* pro¬ wadzi do uzyskania por o wielkosci 7—'10 A.Korzystny kopolimer zawiera np. afcryloamid i 20—60% molowych kwasu akrylowego i/lub me¬ takrylowego, otrzymany z okolo 20%-owego roz¬ tworu monomeru, przy czym co najmniej czesc gnap kwasowych przeprowadza sie w odpowiednie sole metali alkalicznych lub ziem alkalicznych.Bardziej szczególowo objasniaja wynalazek na¬ stepujace przyklady.Przyklad I. Wplyw nosnika z polimeru na reaktywnosc krzyzowa estriol-3-glukuronid i estrioi- -3-siarczan.Reaktywnosc krzyzowa K jest obliczona na pod¬ stawie setnych-(krotnosci masy odpowiedniego hap- tenu dla y = 50 podzielonej przez zuzyta mase reaktywnego krzyzowo hapitenu dla y = 50. War¬ tosci obliczone sa na podstawie JD50.Wybrane przeciwcialo antyestriolu wykazywalo wysoka reaktywnosc krzyzowa wiazania 3-gluku- ronidu wzglednie 3-siarczanu.Dla kazdej mieszaniny polimeru, tak dobiera sie stezenie zeby calkowite stezenie monomeru wynosilo 2,9 m/l. Dla jednej mieszaniny rozpu¬ szcza sie np. 5 g akryloamidu i 1,25 g N,N'-mety- leriobisafkryloamidu w naczyniu Bechera w 24 ml buforu fosforanowego o wartosci pH 7,2. Po do¬ daniu przeciwcial w 1 ml buforu fosforanowego, reakcje zapoczatkowuje sie przez dodanie 0,15 g ryboflawiny i 0,10 ml N,N,N',N'-czterometyloetyle- nodwuaminy i naswietla swiatlem ultrafioletowym.Zótly blok nastepnie rozdrabnia sie, przemywa woda destylowana i suszy. 22 mg suchego zelu przeciwciala antyestriolu odwaza sie do malych kolumienek i miesza z 0,150 ml plynu inkubacyjnego. Roztwór inkubacyj- ny zawiera 3H-estriol i nieoznaczony hapten (est- riol, estriol-3-glukuronid lub estrioi-3-siarczan).Utrzymuje sie stala temperature reakcji 0°C. Po 30 min. inkubacji nastepuje rozdzielenie wolnych od zwiazanych przeciwcial hapitenu przez elucje buforem fosforanowym zawierajacym albuminy.Eluat zbiera sie w szkielkach scyntylacyjnych, za¬ daje 15 ml cieczy scyntylacyjnej i mierzy radioak¬ tywnosc w plynie scyntylatora. Stezenie wolnego 3H-estriolu (wskaznik hapten) wyliczano z impul¬ sów.Wyniki oznaczenia w ukladzie wodnym i przy zastosowaniu nosnika z polimeru akryloamidu i kopolimeru akryloamidu sa przedstawione w poniz- 25 szej tablicy. Podane wartosci sa wartosciami reak¬ tywnosci krzyzowej uprzednio okreslonej.Wyniki wskazuja, ze sposobem wedlug wynalaz¬ ku przy zastosowaniu kopolimeru uzyskuje sie 5 znaczny wzrost specyficznosci wiazania w porów¬ naniu do ukladu wodnego i homopolimerów akry¬ loamidu stosowanych w dotychczasowych meto¬ dach.Bnzez odpowiedni dobór kopolimeru mozna uzy- 10 skac podwyzszenie specyficznosci o wskaznik 15 w stosunku do ukladu wodnego i o wskaznik 7 w stosunku do homopolimerów akryloamidu. Wska¬ zuje na to porównanie wartosci ukladu wodnego i homopolimerów akryloamidu z 40/60 kopolimerem 15 kwasu metakrylowego i akryloamidu.Przyklad II. Oznaczanie calkowitej zawarto¬ sci tyroksyny na drodze enzymatycznej hydrolizy pepsyna przy zastosowaniu nosnika z polimeru.Nosnik z polimeru zawierajacy zel przeciwcia- 20 la stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molo¬ wych soli sodowej kwasu metakrylowego otrzyma¬ ny z 20%-owego roztworu monomeru. 10 1 surowicy zawierajacej 18 |mg/100 ml tyro¬ ksyny rozciencza sie 160|d roztworu enzymu za¬ wierajacego 2 mg/ml pepsyny rozpuszczonej w 0,1 n kwasie solnym.Reakcje z enzymem przeprowadza sie w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 30 minut. Do tych 170 jml dodaje sie nastepnie 150 \nl roztworu wskaz¬ nika izotopowego zawierajacego 5,2 mg/ml ozna¬ czonej izotopowo tyroksyny.Otrzymany roztwór nastepnie umieszcza sie na 60 mg zelu przeciwciala. Okres inkubacji wynosi 35 30 minut, temperatura 22°C.Ocena wykazuje nadzwyczaj wysoki procent od¬ zyskiwania wynoszacy 98%.Przyklad III. Oznaczanie calkowitej zawar¬ tosci kortizonu. 40 Nosnik z polimeru zawierajacy zel przeciwciala stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molowych mieszaniny soli sodowej i wapniowej kwasu meta¬ krylowego otrzymany z 20%-owego roztworu mo¬ nomeru. 45 Przygotowuje sie 10 ul surowicy lub plazmy za¬ wierajacej 15 fig kortizonu na 100 ml. Do tego dodaje sie 500 |jlL roztworu wskaznika izotopowego zawierajacego ^J-kortizon w wodnym buforze cy¬ trynianowyim o pH 3,5.Otrzymany roztwór nastepnie umieszcza sie na 100 mg zelu przeciwciala. Okres inkubacji wyno¬ si 20 minut, temperatura 25°C. 50 Estriol-3-glukuronid Estriol-3-siarczan Uklad wodny 61 47 Ta Akrylo¬ amid 100 29 33 blica Sól sodowa kwasu akry- lowego/akryioamidu 10:90 19 30 30 : 70 10 12 50:50 14 24 Sól sodowa kwasu meta- krylowego/akryloamidu 2t):80 14 27 40:60 4 6 60:40 21 23121 950 Ocena wykazuje nadzwyczaj wysoki 98% wyno¬ szacy procent odzyskiwania.Przyklad IV. Oznaczanie tyroksyny przy uzyciu substancji kompetycyjnych.Nosnik z polimeru zawierajacy zel przeciwciala stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molowych soli mieszanej wapniowo sodowej kwasu metakry¬ lowego otrzymany z 20%-owego roztworu monome¬ ru. 500 [ii roztworu wskaznika izotopowego zawie¬ rajacego ^J-tyroksyne w buforze fosforanowym o pH 9,6 umieszcza sie na 80 mg zelu przeciwcia¬ la.Nastepnie 500 \»1 takiego samego roztworu wskaz¬ nika izotopowego zawierajacego 6 mg/ml kwasu anilinonaftalenosulfonowego umieszcza sie na 80 mg zelu przeciwciala.Obie próby byly inkuibowane w temperaturze 22°C w ciagu 20 minut.Ocena nie wykazuje zadnego nakladania sie wia¬ zan tyroksyny z przeciwcialem mimo wysokiego stezenia substancji kompetycyjnych, takich jak kwas andlinonaftolenósulfonowy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób radioiimmunologicznego oznaczania hor¬ monów i leków, znamienny tym, ze przeciwciala 5 immobilizuje sie na nosniku stanowiacym kopo¬ limer akryloamidu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeciwciala immobilizuje sie na nosniku z ko¬ polimeru akryloamidu i kwasu akrylowego, albo io metakrylowego lub metakryloamidu, ich pochod¬ nych, soli kwasu akrylowego lub metakrylowego i ich mieszanin. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeciwciala immobilizuje sie na nosniku z ko- is polimeru akryloamidu i 30—60% kwasu metakry¬ lowego. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeciwciala immobilizuje sie na nosniku z ko¬ polimeru akryloamidu i soli metali alkalicznych 20 lub ziem alkalicznych kwasu akrylowego lub me¬ takrylowego.Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, Cena 100 zl PL