Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pro¬ duktów cukrowych zawierajacych wiecej niz 50% wago¬ wych fruktozy, na drodze enzymatycznej przemiany sa¬ charozy.Produkty zawierajace fruktoze maja zastosowanie w wielu dziedzinach, zwlaszcza w przemysle srodków farmaceutycz¬ nych i w przemysle spozywczym, przy czym pozadane jest mozliwie wysokie stezenie fruktozy w tych produktach.Syropy o duzej zawartosci fruktozy, zawierajace zwykle okolo 46% wagowych fruktozy i okolo 54% wagowych glikozy, wytwarza sie znanym sposobem przez izomeryzacje dekstrozy, otrzymywanej zazwyczaj przez hydrolize skrobi.Izomeryzacja ta jest katalizowana przez enzym izomerazy.Znany sposób inwersji sacharozy droga hydrolizy w obec¬ nosci kwasu lub enzymu inwertazy umozliwia wytwarzanie mieszanin zawierajacych 50% wagowych fruktozy i 50% wagowych glikozy, przyczymnie ma praktycznie mozliwosci zwiekszenia zawartosci fruktozy w tym produkcie.Wynalazek umozliwia wytwarzanie z sacharozy pro¬ duktów zawierajacych wiecej niz 50 % wagowych fruktozy.Sposób ten polega na poddawaniu sacharozy przeróbce na mieszanine zawierajaca fruktoze, dekstroze i polisacharydy, a nastepnie izomeryzacji dekstrozy zawartej w tej miesza¬ ninie w fruktoze przez dzialanie enzymem izomerazy oraz na hydrolizie polisacharydów w nieobecnosci enzymu izo¬ merazy.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze w pierwszym etapie procesu sacharoze poddaje sie dzialaniu nie znanego dotychczas enzymu transferazy fruktozylowej w tempera¬ turze 25—65°C i przy wartosci pH 4,5—6,5, po czym dek- 10 IB 20 JO troze zawarta w otrzymanym nowym produkcie, stanowia¬ cym mieszanine fruktozy, dekstrozy i polisacharydów zawierajacych co najmniej 66% wagowych grup fruktozy- lowych polaczonych wiazaniami (2-1)-/?, przeprowadza sie w fruktoze dzialajac enzymem izomerazy, a polisacharydy zawarte w tej mieszaninie poddaje sie hydrolizie w nie¬ obecnosci enzymu izomerazy.Sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac syropy zawierajace nawet wiecej niz 90% wagowych fruktozy.Produkty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku maja wlasciwosci zwyklych cukrów i syropów, totez moga byc stosowane np. jako srodki slodzace albo jako produkty wyjsciowe przy wytwarzaniu srodków farmaceutycznych.Mozna je tez stosowac do wytwarzania klejów, srodków pochlaniajacych wilgoc, papierów szklanych, srodków garbarskich, izolatorów elektrycznych, a takze jako srodki wiazace przy wytwarzaniu rdzeni odlewniczych, do wyrobu srodków owadobójczych, srodków zmiekczajacych i za* geszczaczy.Wspomniany wyzej nowy produkt, wytwarzany w pierw¬ szym etapie procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku, zawiera okolo 70—82% wagowych suchej substancji, mianowicie frakcje monosacharydów, skladajaca sie glównie z dekstrozy oraz frakcje polimerów polisacha¬ rydów wyzszych od DP2, skladajaca sie glównie z DP»* Zawartosc DP4 i wyzszych polimerów wynosi najwyzej 4,1 % wagowych. Ma on konsystencje trwalego nie krysta¬ lizujacego syropu, jest odporny na dzialanie mikroorga-, nizmów i nie wytwarzaja sie w nim substancje barwne.; Moze on byc transportowany i/albo magazynowany jako 121 700121 700 3 produkt zawierajacy cukier w stezeniach dotychczas nie¬ osiagalnych przy opisanych wyzej wlasciwosciach, a pod¬ dawany izomeryzacji i hydrolizie zgodnie z wynalazkiem daje produkty o zawartosci fruktozy nieosiagalnej przy stosowaniu znanych sposobów.W dalszym opisie i zastrzezeniach patentowych stosuje sie okreslenia, które maja nizej podane znaczenie.Okreslenie „glikoza" czyli „dekstroza" oznacza ten cukier prosty w kazdej postaci, w roztworze lub w stanie suchym.Okreslenie „sacharoza" oznacza ten dwusacharyd ra¬ finowany lub surowy, w roztworze albo w stanie suchym, pochodzacy z dowolnego surowca, np. cukier trzcinowy lub buraczany. Przy stosowaniu sposobu wedlug wynalazku sach^z^uKa^ przewaznie stosuje sie w sriodowisku wddnym.3 / Okreslenie „fruktoza" czyli „lewuloza" oznacza izomer delastrozy-bedacy od niej bardziej slodkim. Oba te okresle¬ nia!ofcftaozaja ten.cukier forosty w roztworze lub w stanie suchym. " ' —~J Okreslenie „preparat enzymowy" oznacza kazdy pre¬ parat o zadanym dzialaniu enzymatycznym, np. cale zywe komórki, komórki suche, wyciagi z komórek, preparaty rafinowane i stezone, wytworzone z komórek albo z cieczy hodowlanych. Preparaty enzymowe mozna stosowac w po¬ staci roztworów lub osadzone na nosnikach.Okreslenie „enzym izomerazy" czyli „izomeraza" ozna¬ cza dowolne preparaty enzymowe powodujace izomeryza¬ cje dekstrozy w lewuloze. Enzymy takie sa znane pod na¬ zwami izomerazy dekstrozowej, izomerazy ksylozowej i izomerazy glikozowej i wytwarza sieje z róznego rodzaju mikroorganizmów, np. z rodzajów Stieptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplares i Curtobacterium.Zgodnie z wynalazkiem korzystanie stosuje sie izomeraze pochodzaca z Streptomyces olivochromogenes ATCC nr 21713, ATCC nr 21714 lub ATCC nr 21715 (pojedyncza kolonia wyizolowana ze szczepu ATCCnr 21713), znana np.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3813318, a zwlaszcza izomeraze wytworzona sposobami podanymi w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3770589 i 3813318.Wiadomo równiez, ze enzym izomerazy mozna osadzac na obojetnych, nierozpuszczalnych w wodzie nosnikach i w tej postaci stosowac do prowadzonej systemem ciaglym przemiany glikozy w syrop o wysokiej zawartosci fruktozy.Sposoby takie sa znane np. z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3708397, 3788945, 3850751 i 3868304 oraz z belgijskich opisów patentowych nr nr 819859 i 810480.Okreslenie „jednostka izomerazy" oznacza taka ilosc tego enzymu, która jest niezbedna do wytworzenia w ciagu 1 minuty 1 mikromola fruktozy w warunkach podanych nizej przy omawianiu oznaczania aktywnosci izomerazy.Okreslenie „oznaczenie aktywnosci izomerazy" oznacza proces polegajacy na spektrofotometrycznej oznaczaniu ketozy wytworzonej z roztworu glikozy w nizej podanych, ustalonych warunkach. Roztwór podstawowy do tego oznaczania przygotowuje sie z nastepujacych skladników: Skladnik Ilosc roztwór 0,1 m MgSO<,7H20 1 ml roztwór 0,001 m CaCh 6H2O 1 ml roztwór 1 m fosforanowego buforu o wartosci pH7,5 0,5 ml bezwodnaD-glikoza 1,44 g woda destylowana do calkowitej objetosci 7,5 ml 4 Enzym poddawany badaniu rozciencza sie najpierw tak aby otrzymac preparat zawierajacy 1—6jednostek izomerazy w 1 ml. Proces enzymatycznej izomeryzacji prowadzi sie dodajac 1 ml preparatu do 3 ml podstawowego roztworu 5 i poddaje hodowli w temperaturze 60°C w ciagu 30 minut, po czym bierze sie po 1 ml roztworu, traktuje 9 ml 0,5 n kwasu nadchlorowego, a nastepnie rozciencza do objetosci 250 ml.W celach porównawczych wykonuje sie analogiczne 10 próby z glikoza, poddajac hodowli podstawowy roztwór, do którego zamiast 1 ml preparatu enzymowego dodano 1 ml wody. Nastepnie oznacza sie ketoze metoda cysteina — kwas siarkowy.Dla potrzeb opisywanego badania za jednostke izomerazy 15 uwaza sie taka ilosc enzymu, która w opisanych wyzej warunkach procesu izomeryzacji jest niezbedna dla wy¬ tworzenia w ciagu 1 minuty 1 mola lewulozy.Okreslenie „transfruktozylacja" oznacza przenoszenie grupy fruktozylowej z donora, np. z sacharozy, do akcep- 20 tora, np. polisacharydu.Okreslenie „enzym transferazy fruktozylowej" oznacza kazdy enzym, który katalizuje proces transfruktozylacji.Okreslenie to obejmuje stosowany zgodnie z wynalazkiem preparat enzymowy pochodzacy od Pullularia pullulans 25 ATCC 9348 (nazwa synonimowa Aureobasidium pullu¬ lans).Okreslenie „jednostka transferazy fruktozylowej" ozna¬ cza taka ilosc enzymu, która jest niezbedna do wytworzenia w ciagu 1 minuty 1 mikromola redukujacego cukru w pree- 30 liczeniu na glikoze przy wartosci pH 5,5, w temperaturze 55°C, przy zawartosci jadalnej sacharozy w produkcie wyjsciowym wynoszacej 60 g/100 ml wcdnej mieszaniny.Ilosc zredukowanego cukru w przeliczeniu na glikoze oznacza sie za pcmoca przyrzadu „TechnicumAutoanaly- 35 zer II" produkcji firmy Techniccn, Inc., Tarrytcwn, N. Y.Stany Zjednoczone Ameryki. Analize prowadzi sie znana metoda za pomoca alkalicznego zelazicyjanku, opisana w Analytical Biochemistry 45, nr 2, str. 517—524 (1972), przystosowana do stosowania wyzej podanego przyrzadu 40 analizujacego. O ile nie zaznaczono inaczej, podanej nizej oznaczanie aktywnosci enzymatycznej prowadzi sie w spo¬ sób ciagly, rejestrujac zmiany w mieszaninie reakcyjnej 0 nastepujacym skladzie: 7,5 ml wodnego roztworujadalnej sacharozy o stezeniu 80% wagowo/objetosciowych, 2,3 ml 45 cytrynianowego roztworu buforowego o stezeniu 0,1 m i wartosci pH 5t5 0,2 ml próbki enzymcwej zawierajacej taka ilosc enzymu transferazy fruktozylowej, która w ciagu 1 minuty powoduje wytwarzanie 5—25 mikrogramów redukujacego cukru (w przeliczeniu na glikoze) w 1 ml 50 mieszaniny reakcyjnej.Okreslenie „produkt wyjsciowy" oznacza sacharydy w postaci takiej, która umozliwia im branie udzialu w pro¬ cesie transfruktozylacji i zawierajace grupy fruktozylowe, korzystnie wodne roztwory sacharozy. 55 Okreslenie „produkt wtórny" oznacza produkt wytwa¬ rzany w wyniku dzialania preparatu enzymu transferazy fruktozylowej na produkt wyjsciowy.W dalszym opisie, jezeli nie zaznaczono inaczej, czesci oznaczaja czesci wagowe, a procenty oznaczaja procenty 60 wagowo/objetosciowe.Okreslenie „analiza metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem", w skrócie HPLC, oznacza metode po¬ legajaca na tym, ze skladniki chrcmatcgrafuje sie przez' eluowanie pod zwiekszonym cisnieniem woda z kationowego (5 wymieniacza zywicznego w postaci wapniowej. ^121 700 5 Eluowane skladniki identyfikuje sie za pomoca róznico¬ wego refraktometru. Za pomoca elektronicznego integra¬ tora okresla sie ilosc weglowodanów nie-dekstrozowych i ilosc dekstrozy oblicza z róznicy. Metoda ta jest opisana ogólnie w Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography, Am. Soc. Brew. Chem. Proc, 1973, strony 43—46. Jako zywice stosuje sie preparat o nazwie ,,Aminex Q" 15—5 w postaci wapniowej, produkowany przez Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki.Zgodnie z wynalazkiem, produkt wyjsciowy, korzystnie zawierajacy co najmniej 20 % wagowych sacharoze, poddaje sie dzialaniu preparatu enzymu, transferazy fruktozylowej, majacego zdolnpsc powodowania przemiany sacharozy w produkt skladajacy sie z frakcji monosacharydowej, za¬ wierajacej glówna czesc glikozy i mala ilosc fruktozy oraz z polisacharydów, zawierajacych co najmniej 66% wago¬ wych grup fruktozylowych. Wytwarzany w ten sposób produkt zawiera nie znany dotychczas produkt polisacha- rydowy.Polisacharydy zawarte w produkcie wtórnym obejmuja wszystkie polimery zawierajace fruktoze (oprócz sacharozy) i majace co najmniej dwie grupy monosacharydowe. Poli¬ mery te mozna tez okreslic jako polisacharydy zawierajace grupy fruktozylowe polaczone wiazaniami (2 ? 1)-/?.Jak opisano nizej, w zaleznosci od warunków procesu transfruktozylacji mozna wytwarzac polisacharydy znaj¬ dujace sie glównie w zakresie z góry okreslonym. Tak na przyklad, mozna wytwarzac produkt wtórny, w którym glówna czesc (np. co najmniej 60 % molowych) polisacha¬ rydu stanowi oligomery o 2—10 (to jest DP2-10), a prze¬ waznie o 3—6 (to jest DP 3—6) grupach monosacharydo- wych. Nastepnie, glikoze zawarta w otrzymanym pro¬ dukcie reakcji izomeryzuje sie do fruktozy przez dzialanie enzymem izomerazy w obecnosci tych plisacharydów, po czym polisacharydy te poddaje sie hydrolizie w nieobec¬ nosci aktywnego enzymu izomerazy. Hydrolize te mozna prowadzic znanymi sposobami, to jest enzymatycznie, stosujac inwertaze, albo za pomoca kwasu w lagodnych warunkach.Zgodnie z wynalazkiem, polisacharydy mozna tez od¬ dzielac od glikozy i fruktozy i poddawac opisanej wyzej hydrolizie, wytwarzajac syrop o bardzo wysokiej zawartosci fruktozy, wynoszacej powyzej 66%, a nawet powyzej 90% wagowych. Proces oddzielania mozna prowadzic bezpo¬ srednio, bez koniecznosci izomeryzacji glikozy zawartej w produkcie reakcji, przy czym proces ten mozna korzyst¬ nie prowadzic na drodze zwyklego oddzielania metodami fizycznymi, opartymi na róznicy wielkosci czasteczek, np. stosujac przepony, tak jak w metodach ultrafiltracji i dia¬ lizy, albo za pomoca wytracania rozpuszczalnikowego czy absorpcji weglem.Metody rozdzielania przy uzyciu przepon sa znane np. z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3173867, Re 26097, 3541006 i 3691068.Proces wytwarzania syropów o duzej zawartosci fruktozy zgodnie z wynalazkiem korzystnie prowadzi sie podddajac sacharoze dzialaniu preparatu enzymu transferazy frakto- zylowej pochodzacego od szczepów Pullularia pullulans, takich jak ATCC 9348, ATCG 12538, NRRL 1673, NRRL Y231, NRRL YB3892 i NRRL YB3861. Wytworzony produkt drugorzedowy poddaje sie dalej dzialaniu enzymu izomerazy, po czym zizomeryzowany produkt hydrolizuje sie w nieobecnosci aktywnego enzymu i izomerazy. 6 Wtórny produkt, wytwarzany w pierwszym etapie procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku, jest produktem nowym, nadajacym sie szczególnie dobrze do izomeryzacji i nastepnie hydrolizy, przy czym stosujac jako 5 wyjsciowy produkt sacharoze i dzialajac enzymem trans¬ ferazy fruktozowej otrzymuje sie syropy o zawartosci fruktozy powyzej 55% wagowych. Produkty nadajace sie do enzymatycznej izomeryzacji i nastepnie dajace w wyniku hydrolizy syropy o zawartosci fruktozy powyzej 55% wa- io gowych, zawieraja okolo 20% — 60% wagowych mono- sacharydów, glównie glikczy i o malej zawartosci fruktozy oraz odokolo 70 % do okolo 40 % wagowych polisacharydów zawierajacych wiecej niz 66% wagowych grup fruktozy¬ lowych. 15 Szczególnie cenne produkty wtórne wytwarza sie zgodnie z wynalazkiem z sacharozy droga transfruktozylacji w obec¬ nosci dostatecznej ilosci preparatu enzymu transferazy fruktozylowej pochodzacego od szczepu Pullularia pullu¬ lans ATCC 9348, przy prowadzeniu procesu w tempera- 20 turze okolo 25°C — 65 °C, a zwlaszcza 50—60 °C, przy wartosci pH okolo 4,5—6,5, korzy, tnie 5,4—5,6. W tych warunkach stezenie sacharozy w wyjsciowym produkcie moze byc male i wynosic 10 g na 100 ml wody, ale korzyst¬ niej jest stosowac roztwory o mozliwie najwyzszym steze- 25 niu, to jest okolo 30—60 g na 100 ml wody, a nawet na¬ sycone roztwory sacharozy, gdyz wówczas predkosc reakcji jest wyzsza, jak to opisano nizej szczególowo.Przy prowadzeniu procesu sposobem wedlug wynalazku najmniejsza ilosc transferazy fruktozylowej wynosi 0,5 50 jednostki na 1 g sacharozy, przy czym ze wzgledów ekono¬ micznych nie stosuje sie wiecej niz 50 jednostek transferazy na 1 g sacharozy.Nowy preparat transferazy fruktozylowej stosowany zgodnie z wynalazkiem mozna wytwarzac znanymi sposo- 35 bami, podanymi np. w opisach patentowych Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr nr 3565756, 3806419, 3535123 i w publikacji S, Ueda i wspólpracowników w Applied Microbiology, II, 211-215 (1963). W tych znanych sposobach korzystnie wprowadza sie jednak pewne nowe 40 zabiewi oddzielania i oczyszczania, opisane ponizej.Wytwarzanie preparatu enzymu transferazy fruktozylo¬ wej z Pullularia pullulans ATCC 9348 na nosniku celito- wym.A. Proces fermentacji w celu wytwarzania enzymu. 45 Srodowisko dla rozwoju szczepionki i procesu fermentacji w celu wytworzenia enzymu zawiera nastepujace skladniki: 0,5% dwzasadowego fosforanu potasowego, 0,1% chlorku sodowego, 0,02% MgS04.7H20, 0,06% siarczanu dwu- amonowego, 0,3 % wyciagu z drozdzy (Difco Laboratories), 53 7,5% sacharozy nadajacej sie do celów spozywczych wartosc pH doprowadza sie do 6,8.W stozkowych kolbach hodowlanych o pojemnosci 500 ml umieszcza sie po 100 ml wyjalowionego srodowiska i zaszczepia skosna kultura czarnych drozdzy Pullularia 55 pullulans ATCC 9348^ po czym wytrzasa w temperaturze 32 °C w ciagu 48 godzin. Zawartosc kazdej z kolb stosuje sie do zaszczepienia 200 ml podanej wyztj pozywki w stoz¬ kowych kolbach o pojemnosci 1 litra. Stosuje sie szczepionke o stezeniu 0,5% wagowo/objetosciowych i fermentacje 10 prowadzi wytrzasajac kolby w temperaturze 32°C w ciagu 7 dni.B. Wyosobnianie enzymu z brzeczki fermentacyjnej.Brzeczkez 40 kolb zlewa sie razem i kolby poplukuje woda, dolewajac popluczyny do brzeczki. Objetosc samej brzeczki 65 wynosi okolo 8 litrów, a po rozcienczeniu popluczynami121700 Wzrasta do okolo 12 litrów. Rozcienczona brzeczke odwiro¬ wuje sie w wirówce Sharples o ciaglym dzialaniu, w celu usuniecia komórek drozdzy ! resztek komórek. Ciecz w po¬ staci lepkiego roztworu o barwie czarnej traktuje sie chlor¬ kiem wapnia az do uzyskania stezenia 0,5 % wagowo/obje¬ tosciowych i zobojetnia wodorotlenkiem sodowym do wartosci pH 7,0. Nastepnie otrzymana ciecz przepuszcza sie ponownie przez wirówke, otrzymujac lepki cdciek o niklym zabarwieniu. Odciek ten zakwasza sie kwasem solnym do wartosci pH 5,5 i dodaje 1000 jednostek pullu- lanazy (okreslenie stosoware w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3806419). W celu zakonserwo¬ wania do brzeczki dodaje sie toluen w ilosci niezbednej do nasycenia i pozostawia na noc w temperaturze pokojo¬ wej. Nastepnie do brzeczki dodaje sie celitu (preparat Grefco nr 503 Celite produkcji Johns-Manville Products Corporation, Lompoe, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki) w takiej ilosci, aby jego stezenie wynosilo 1 %.Celit dodaje sie w postaci zawiesiny w 24 litrach acetonu i miesza, po czym odsacza osad, przemywa go acetonem i suszy w powietrzu o temperaturze pokojowej. Osad ten zawiera enzym transferazy fruktozylowej osadzony na celi- cie jako nosniku.Stosowany w tym procesie dodatek chlorku wapnia oraz regulowaniu wartosci pH ma na celu usuniecie pigmentu o czarnej barwie oraz kwasnych polisacharydów. [Omówie¬ nie tych kwasnych polisacharydów patrz Acta Chem. Scand 16, 615—622 (1962)]. Otrzymany produkt jest preparatem stosunkowo czystym, bezbarwnym i opisany wyzej zabieg rafinowania, polegajacy na zwyklym odwirowywaniu lub odsaczaniu osadu, umozliwia wytwarzanie preparatu enzy- mowego nie zawierajacego niepozadanego pigmentu i kwas¬ nych plisacharydów, bedacych ubocznymi produktami w procesie fermentacji prowadzonej przy uzyciu Pullu- laria pullulans.Pozadane jest równiez usuwanie polisacharydu pul lu¬ lanowego, który równiez wytraca sie razem z enzymem tran¬ sferazy fruktozylowej po dodaniu rozpuszczalnika do brzecz¬ ki. W tym celu, odciek otrzymany po traktowaniu chlorkiem wapnia i po uregulowaniu wartosci pH mozna zgodnie z wynalazkiem poddawac dzialaniu enzymu znanego pod nazwa pullulanazy. Pullulanaza hydrolizuje pullulan bez wzgledu na jego charakter, rozkladajac go na polimer o mniejszych czasteczkach, który nie wytraca sie i tym samym nie zanieczyszcza preparatu enzymowego podczas dodawania rozpuszczalnika, np. acetonu lub alkoholu.Ten dodatkowy zabieg oczyszczania równiez jest zabiegiem nowym, stosowanym w procesie wedlug wynalazku. 8 Enzymowe preparaty transferyzy fruktozylowej stoso¬ wane w procesie wedlug wynalazku mozna tez stosowac bez oddzielania pullulanu, to jest bez hydrolizowania pullulanu za pomoca pullulanazy i wówczas pullulan sta- 5 nowi nosnik dla enzymu transferazy fruktozylowej, jak to opisano nizej.Wytwarzanie produktu wtórnego przy uzyciu enzymu transferazy fruktozylowej na nosniku pullulanowym. Do 20% roztwcru sacharozy, którego wartosc pH doprowa- io dzono do 5,5 za pomoca 0,05 m buforowego roztworu cytrynianowego, dodaje sie 1% bezwodnego pullulanu, wytworzonego w sposób wyzej opisany, ale nie poddawane¬ go hydrolizie za pomoca pullulanazy. Pullulan stanowi tu nosnik i celitujako nosnika nie stosuje sie. Na 1 g pullulanu 15 stosuje sie 677 jednostek transferazy fruktozylowej i reakcje prowadzi sie az do zmetnienia mieszaniny. Próbke tej mieszaniny analizuje sie metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem, otrzymujac nastepujace wyniki: Fruktoza Dekstroza DP2 DP3 DP4+ 20 6,9 40,6 6,2 11,1 35,2 W próbach 1, 2 i 3 omówiono dalsze cechy enzymu wy¬ tworzonego sposobem opisanym powyzej.Próba 1. Produkty enzymatycznego dzialania i odpornosc enzymu na dzialanie ciepla. 25 W kolbach wyposazonych w nakretki umieszcza sie po 60 g sacharozy jadalnej oraz preparat enzymu transferazy fruktozylowej, wytworzony z produktu otrzymanego w spo¬ sób opisany wyzej przez zdyspergowanie odpowiednich ilosci enzymu osadzonego na celicit w odmierzonych ilos- so ciach wody tak, aby otrzymac odpowiednio rózne stezenia roztworu enzymu. Nastepnie odsacza sie celit i przesacz dodaje do mieszaniny reakcyjnej w ilosciach 10, 20 i 30 jednostek enzymu na 1 g sacharozy, stanowiacej produkt wyjsciowy. Kazda z tych mieszanin rozciencza sie nastepnie 35 woda do objetosci 100 ml i prowadzi reakcje przy wartosci pH 5,5 w ciagu 66 godzin w temperaturze 55°C i oddziel¬ nie w temperaturze 60°C. Po uplywie 24, 43 i 66 godzin pobiera sie próbki i oznacza w nich zawartosc redukujacego cukru, swiadczaca o wystepowaniu aktywnosci enzymatycz- 40 nej. Po wykonaniu tych analiz mieszaniny reakcyjne za¬ mraza sie w celu zatrzymania enzymatycznego dzialania i metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem okresla sie w próbkach mieszanin sklad weglowodanów. Wyniki podano w tablicach 1 i 2. 45 Wyniki podane w tablicy 1 uzyskano metoda opisana wyzej przy omawianiu oznaczania aktywnosci izomerazy, a liczba jednostek enzymu podana w rubryce 2 tablicy 1 oznacza liczbe tych jednostek na 1 g sacharozy.Tablica 1 Oznaczanie redukujacego cukru Temperatura 55°C 60°C Liczba jednostek enzymu 0 10 20 30 0 10 20 30 Zawartosc redukujacego cukru mg/ml po 24 go¬ dzinach 191 192 246 0,7 200 219 282 PH 5,80 5,40 5,40 5,35 5,75 5,10 5,15 5,20 Zawartosc redukujacego cukru mg/ml po 43 go¬ dzinach 231 270 334 1,5 243 288 360 PH 5,80 5,25 5,25 5,15 5,80 470 1 4,90 4,95 Zawartosc redukujacego cukru mg ml po 66 go¬ dzinach 268 301 390 2,1 270 346 420121 700 10 Tablica 2 Analiza zawartosci weglowodanów Proces w temperaturze 55 °C Dawka enzymu jednostek'1 g | ^acra^ozy 1 10 20 30 Czas trwania reakcji 1 godziny 2 24 43 66 24 43 66 24 43 66 Zawartosc dekstrozy % 1 3 31,7 34,5 36,7 33,9 37,4 40,5 37,4 41,8 46,1 Zawartosc lewulozy % 4 2,3 1 3,2 3,9 2,8 4,2 4,9 4,0 5,9 7,5 Zawartosc DP2 % | 5 10,0 9,4 8,6 8,8 7,9 7,4 7,1 6,8 7,0 Zawartosc DP3 % 6 25,0 17,9 15,0 19,7 12,1 10,8 12,5 11,4 11,5 DP4+ i wyzszych % 1 7 1 31,0 35,0 35,8 | 34,8 38,4 96,4 39,0 34,1 27,9 1 1 Proces w temperaturze 60°C 1 10 20 30 24 43 66 24 43 66 24 43 66 32,2 35,0 36,7 35,5 38,4 41,3 39,0 43,7 47,8 2,8 4,0 5,4 3,8 5,0 1 6,0 5,5 7,1 9,2 | 6,1 1 9,8 9,4 8,4 8,0 7,9 7,1 7,3 7,4 24,3 18,2 16,0 17,1 12,3 11,1 12,1 11,0 11,1 30,6 1 33,0 32,5 1 35,2 36,3 33,1 | 36,3 30,9 24,5 | Wyniki podane w tablicach 1 i 2 swiadcza o tym, ze enzym jest w obecnosci produktu wyjsciowego i przy wartosci pH 5,5 w temperaturze 55 °C i 60°C trwaly w ciagu 66 godzin, co dowodzi, ze jest on przydatny w pro¬ cesach na skaletechniczna. 30 Próba 1 wykazuje takze, ze wtórny produkt wytworzony zgodnie z wynalazkiem przez przemiane sacharozy za pomoca nowego pieparatu transferazy fruktozylowej sta¬ nowi cenne zródlo, nadajace sie do wytwarzania z sacharozy syropów o duzej zawartosci fruktozy. Dowodza tego wy- 35 niki podane w tablicy 2, zgodnie z którymi glównymi skladnikami produktu reakcji sa dekstroza i polimery, które po hydrolizie daja jako glówny produkt fruktoze.Swiadczy to równiez o tym, ze enzym wytwarzany sposobem wyzej opLanym dziala skutecznie przy stezeniu sacharozy 4° wynoszacym 60% wagowo/objetosciowych, jak równiez przy wysokich stezeniach glikozy.Próba 2. Wplyw temperatury na aktywnosc enzymu.Wplyw temperatury na predkosc reakcji z udzialem 4$ enzymu transferazy fruktozylowej oznacza sie za pomoca analizatora Technicon Autoanalyzer II w nastepujacy sposób. Mieszanina reakcyjna zawiera 7,5 ml roztworu sacharozy o stezeniu 80% wagowo/objetosciowych, 2,3 ml 0,1 m roztworu buforowego cytrynianu o wartosci pH 5,5 50 i 0,2 ml roztworu enzymu pullulanowego o stezeniu 2% wagowo/objetosciowych (preparat enzymowy wytwarzany sposobem opisanym wyzej). Koncowe stezenie sacharozy wynosi 60% wagowo/objetosciowych. Próbki utrzymuje sie w temperaturze 30 °C, 40°C, 50 °C i 60 °C i bada w ciagu 55 10 minut za pomoca analizatora. Wyniki swiadcza o tym, ze predkosc enzymatycznej reakcji w temperaturze 40°C jest 1,89 raza wieksza niz w temperaturze 30CC, w tempera¬ turze 50°C 1,29 raza wieksza niz w temperaturze 40°C, a w temperaturze 60°C 1,48 raza wieksza niz w tempera- 65 turze 50°C. Swiadczy to o wzroscie predkosci reakcji ze wzrostem temperatury.Próba 3. Oznaczanie wartosci Km Michaelis-Menten dla enzymu transferazy fruktozylowej.Wartosc Km oznacza stezenie produktu wyjsciowego, przy którym predkosc enzymatycznej reakcji wynosi po¬ lowe predkosci maksymalnej Vmaks. Wartosc te dla enzymu transferazy fruktozylowej oblicza sie w nastepujacy sposób.Podstawowy roztwór sacharozy o stezeniu 90% wagowo/ /objetosciowych doprowadza sie za pomoca buforowego roztworu cytrynianu o stezeniu 0,1 m do wartosci pH 5,5 i przygotowuje próbki po 9,8 ml, w których stezenie sa¬ charozy po uzupelnieniu do 10 ml wynosi 5%, 10%, 30%, 40%, 50%, 60% i 70%. Do próbek tych dodaje sie w tem¬ peraturze 55 CC po 0,2 ml roztworu zawierajacego 1,1 jednostki enzymu transferazy fruktozylowej i niezwlocznie analizuje, jak opisano wyzej za pomoca analizatora Techni¬ con Autoanalyzer II. Jako próby porównawcze stosuje sie typowe roztwory glikozy, wycechowane w mikrogra- mach/ml.W tablicy 3 podano predkosc wytwarzania glikozy w mikrogramach/ml/minute przy róznych stezeniach sacharozy, stosujac stala dawke 1,1 jednostki preparatu enzymowego transferazy fruktozylowej, opisanego wyzej.W trzeciej kolumnie tej tablicy podano predkosc procesu prowadzonego ponownie w ciagu nastepnego dnia dla roz¬ tworu o zawartosci 60% sacharozy, wytworzonego z roz¬ tworu podstawowego.Wartosc Km wynosi 0,27 molowego stezenia sacharozy, a najwyzsza predkosc reakcji jest przy stezeniu sacharozy wynoszacym 1,374 m, przy wartosci pH 5,5 i w tempera¬ turze 55 °C, Wynalazek zilustrowano ponizej w przykladach.* Pro¬ centy podane w przykladach, o ile nie zaznaczono inaczej, oznaczaja procenty wagowe.121 700 11 Tablica 3 Zawartosc 1 sacharozy w % 5 10 20 30 40 . 50 60 70 Predkosc reakcji ^g/ml/minute 8,0 11,8 15,7 18,0 18,6 19,2 17,8 15,6 Predkosc reakcji //g/ml/minute 8,0 11,6 15,2 17,6 18,2 17,2 18,2 — Przyklad I. A. Wytwarzanie wtórnego produktu- 600 g jadalnej sacharozy rozpuszcza sie w wodzie tak, aby otrzymac 800 ml roztworu, który nastepnie zakwasza sie rozcienczonym kwasem solnym do wartosci pH 5,5.Oddzielnie przygotowuje sie zawiesine w 100 ml wody lig bezwodnego preparatu enzymu osadzonego na celicie, wytworzonego w sposób opisany wyzej i zawierajacego 550 jednostek enzymu na 1 g. Zawiesine odsacza sie na lejku Btichnera przez bibule filtracyjna Whatman nr 1, po czym osad przemywa sie 100 ml wody. Przesacz o objetosci 200 ml dodaje sie do roztworu sacharozy w kolbie o po¬ jemnosci 2 litry, wyposazonej w zamkniecie. Kolbe umiesz¬ cza sie w kapieli wodnej o temperaturze i prowadzi reakcje w ciagu 20 godzin, po czym pobiera próbke i oznacza w niej zawartosc weglowodanów metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem. Wyniki podano w tablicy 4^ Tablica 4 | Weglowodan 1 Fruktoza Dekstroza DPa DP, | DP4 i wyzsze Zawartosc w % 2,4 32,8 10,6 22,9 31,3 Do otrzymanego produktu reakcji dodaje sie taka ilosc Chlorku magnezu, aby otrzymac jego stezenie wynoszace 5 inm, po czym roztwór alkalizuje sie rozcienczonym roz¬ tworem wodorotlenku sodowego do wartosci pH 8,4.B. Izomeryzacja wtórnego produktu metoda ciagla.Izomeraze glikozy otrzymana z Streptomyces elivo- chromogenes ATCC 21715 (patrz opis patentowy Stanów ^jednoczonych Ameryki nr Re 29152) osadza sie na po¬ rowatym tlenku glinowym (nosnik o regulowanych porach wytwarzany przez Corning Glass Co., Corning, N. Y., Stany Zjednoczone Ameryki, patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3992329) stosujac nastepujace zabiegi. Nosnik przemywa Sie dwukrotnie woda, dodaje do niego 0,1 m roztworu cytrynianu sodowego i miesza w ciagu 1 godziny, po czym wymywa sie cytrynian sodowy z nos¬ nika az do chwili, gdy przewodnictwo popluczyn wyniesie 1000 mikroomów. Nastepnie nosnik traktuje sie w ciapu 1 godziny 0,05 m roztworem chlorku magnezu, po czym dekantuje sie roztwór chlorku magnezu i dodaje tyle 0,05 m roztworu chlorku magnezu, aby otrzymac ostatecznie stezenie enzymu wynoszace 400 jednostek na 1 ml. Do nosnika dodaje sie nastepnie koncentrat enzymu izomerazy W takiej ilosci, aby uzyskac stezenie 495000 jednostek na 1 litr, po czym enzym kontaktuje sie z nosnikiem w ciagu 22—24 godzin i nastepnie splukuje sie zwiazany enzym z nosnika woda destylowana. 12 W szklanej kolumnie 3 cm x 18 cm, wyposazonej w plaszcz i polaczonej przewodem z pompa ze zbiornikiem zawierajacym produkt wyjsciowy, umieszcza sie enzym osadzony na nosniku tak, aby objetosc zloza wynosila 45 ml. 5 We wszystkich próbach izomeryzacji temperatura w kolum¬ nie wynosi 60°C. Do kolumny doprowadza sie syrop dek- strozy o stezeniu 50 % wagowo/objetosciowych, zawierajacy roztwór chlorku magnezu o stezeniu 5 mm zalkalizowany do wartosci pH 8,4. Po wypróbowaniu dzialania kolumny 10 reguluje sie przeplyw przez nia do 292 ml/godzine i odpro¬ wadza z kolumny ciecz do poziomu zloza. Nastepnie roz¬ poczyna sie doprowadzanie wtórnego produktu A o skla¬ dzie podanym w tablicy 5, przy czym poczatkowo reguluje sie recznie przeplyw i odebraniu 20 ml cieczy nastawia sie 15 przeplyw 292 ml/godzine. Pierwsze 100 ml otrzymanego syropu odrzuca sie jako produkt niejednolity i nastepnie prowadzi przez kolumne reszte wtórnego produktu, to jest okolo 850 ml. Po uplywie 1 godziny predkosc prze¬ plywu wzrasta do 570 ml/godzine i wówczas reguluje sie 20 ja tak, aby do konca próby wynosila 300 ml/godzine. Po wprowadzeniu calej ilosci wtórnego produktu na kolumne kieruje sie ponownie roztwór dekstrozy, w celu wykazania, ze izomeraza nadal dziala. W tablicy 5 podano sklad pro¬ duktu wtórnego poddawanego reakcji oraz sklad ostatecz- 25 nego produktu B. Analize prowadzono metoda chromato¬ grafii cieczowej pod cisnieniem.Tablica 5 Skladnik Fruktoza Dekstroza DP2 DP3 | DP4 i wyzsze Sklad produktu wtórnego A % 2,4 32,8 10,6 22,9 31,3 Sklad produktu koncowego B % 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 | Wyniki podane w tablicy 5 swiadcza o tym, ze 42,38 % 40 wolnej dekstrozy zawartej w produkcie wtórnym ulega przy przejsciu przez kolumne izomeryzacji, dajac fruktoze.Polimery fruktozy zawarte w produkcie wtórnym nie ulegaja w tym czasie przeksztalceniu ani tez nie maja wplywu na proces izomeryzacji dekstrozy. Nalezy pod- 45 kreslic, ze w koncowym produkcie 45 % monosacharydów stanowi fruktoza i 55 % dekstroza.C. Hydroliza enzymatyczna.Do 100 ml produktu otrzymanego w sposób opisany w ustepie B dodaje sie 10 mg oczyszczonej inwertazy 50 otrzymanej z Candida utilis. Mieszanine zabezpieczona toluenem pozostawia sie na noc w temperaturze pokojowej, po czym pobiera sie próbke otrzymanej mieszaniny i ana¬ lizuje metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej. Na¬ stepnie kontynuuje sie reakcje w ciagu 6 dni, po uplywie 55 których ponownie pobiera sie próbke mieszaniny i anali¬ zuje. Wyniki analiz podano w tablicy 6. Swiadcza one 0 tym, ze wzrasta przede wszystkim zawartosc fruktozy i w mniejszym stopniu zawartosc glikozy, a zawartosc innych cukrów maleje. 10 W próbach tych stosowano preparat inwertazy produkcji firmy Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokio,Japonia, o aktyw¬ nosci 123 jednostek/mg. Aktywnosc te okresla sie w ten sposób, ze 1 jednostka inwertazy katalizuje rozszczepianie 1 mikromola glikozy dajac 1 mikromol fruktozy w ciagu 65 1 minuty i w okreslonych warunkach.121 700 13 14 W przykladach I i II stosowano produkt wyjsciowy, w którym stezenie sacharozy nie bylo wyzsze od stezenia odpowiadajacego stanowi nasycenia. W przykladzie III opisano natomiast proces, w którym stezenie sacharozy 5 w produkcie wyjsciowym, poddawanym dzialaniu trans- ferazy fruktozylowej jest wyzsze od stezenia w stanie na¬ syconym. Próby te wykazuja, ze w takich warunkach otrzy¬ muje sie produkt o zwiekszonej zawartosci DPa (to jest fruktozylosacharoze), a mniej produktu DP4 i wyzszych 10 polimerów. W tych warunkach otrzymuje sie tez wtórny produkt o zawartosci suchej substancji wyzszej niz w przy¬ padku prowadzenia procesu bez udzialu enzymu trans- ferazy fruktozylowej. Poza tym, przyklad ten wykazuje, ze w miare wzrostu zawartosci suchej substancji w wyjscio- 15 wym produkcie maleje stopien polimeryzacji polimeru fruktozy we wtórnym produkcie, totez polimer DP4 i poli¬ mery wyzsze wystepuja tylko w malych ilosciach. Wyniki te róznia sie wiec od wyników uzyskiwanych przy stosowa¬ niu wyjsciowych produktów o stezeniu sacharozy mniej- 20 szym od stezenia odpowiadajacego stanowi nasycenia, gdyz w przypadku tych nizszych stezen glównym sklad¬ nikiem jest DP4 i wyzsze polimery.Przyklad III. Po 200 g jadalnej sacharozy umieszcza sie w slojach o pojemnosci po 0,5 litra, wyposazonych 25 w zamkniecia. Do jednego ze slojów dodaje sie 50 ml wody i traktuje te próbe jako kontrolna. Do pozostalych slojów dodaje preparat enzymu transferazy fruktozylowej na celicie taki,jak stosowany w przykladach I i II, ale stosujac ilosci preparatu podane w tablicy 8. Sloje zamyka si? 30 i umieszcza w wytrzasanej kapieli wodnej o temperaturze 54—55 °C. Wytrzasa sie w ciagu 24 godzin, poruszaja^ sloje co pewien czas reka. Nastepnie z kazdego sloja po biera sie próbke do zamykanej probówki i umieszcza w e wrzacej wodzie w celu zdezaktywowania enzymu, po czym 35 analizuje sie metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej i oznacza metoda K. Fischera zawartosc substancji sta¬ lych w roztworze. Wyniki podano w tablicy 8, przy czym w kolumnie 3 tablicy podano calkowita liczbe jednostek enzymu transferazy fruktozylowej, a skrót NW oznacza, 40 ze danego skladnika nie wykryto.Nalezy podkreslic, ze w przykladzie tym ciecz w próbie kontrolnej krystalizowala po ochlodzeniu jej do tempera¬ tury pokojowej, podczas gdy wytworzone enzymatyczne roztwory wtórnego produktu pozostawaly ciekle i nie 45 krystalizowaly podczas magnezowania. Otrzymany w wy¬ niku dzialania enzymu transferazy fruktozylowej produkt Tablica 8 Numer próby 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kontrolna Zawartosc sacharozy (g) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Liczba jednostek enzymu 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Zawartosc suchej substancji w roztworze (%) 1 74,5 75,6 76,3 77,1 77,1 78,1 78,1 80,0 79,0 79,6 72,7 Zawartosc weglowodanów w roztworze oznaczona chromatograficznie (%) | fruktoza | dekstroza 0,6 0,7 1,0 1 0,9 1,1 1,3 1,1 1,0 1,3 1,3 0,3 0,6 12,7 14,5 15,7 17,3 18,0 18,8 19,3 19,9 20,6 NW dp2 |dp3 |dp4+ 1 80,9 72,2 66,8 62,6 58,5 56,0 53,9 52,2 50,0 48,6 99,7 8,9 13,7 16,6 19,0 21,0 21,9 23,1 24,1 25,0 25,4 NW NW I 0,7 1,1 1,8 2,1 2,8 3,0 3,4 3,7 4,1 NW | Tablica 6 Skladnik 1 Fruktoza Dekstroza DP2 DPs DP4 i wyz- 1 sze Produkt wyjsciowy (produkt B) % 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 Sklad mie¬ szaniny po dzialaniu inwertazy w ciagu 1 dnia (%) 41,9 29,4 1,9 12,9 13,9 Sklad mie- szaniny po dzialaniu inwertazy w ciagu 7dni(%) 62,4 36,2 0 0,5 0,9 Przyklad II. Z jadalnej sacharozy wytwarza sie produkt wtórny w sposób identyczny z opisanym w przy¬ kladzie I A, po czym otrzymany produkt o skladzie takim, jak podany w tablicy 4 poddaje sie procesowi izomeryzacji sposobem opisanym w przykladzieI B, otrzymujac produkt o skladzie podanym w tablicy 5 (produkt B). Otrzymany produkt poddaje sie hydrolizie dzialajac kwasem siarkowym 0 stezeniu 0,05 n w temperaturze 75—80°C. Po uplywie 1 i 2 godzin pobiera sie próbki mieszaniny reakcyjnej i ana¬ lizuje je metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej.Wyniki podano w tablicy 7. Swiadcza one o tym, ze przy stosowaniu hydrolizy za pomoca kwasu, tak jak i w przy¬ padku hydrolizy enzymatycznej opisanej w przykladzie I, wzrasta glównie zawartosc fruktozy, a zawartosc glikozy wzrasta w mniejszym stopniu i równoczesnie maleje za¬ wartosc polimerów DP2, DP3 i DP4 oraz wyzszych, co wskazuje na to, ze polimery te zawieraja fruktoze.Tablica 7 Skladnik 1 Fruktoza Dektroza DP2 DPs DP4 i wyz- | sze Sklad produktu wyjsciowego (produkt B) % 1 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 Sklad otrzymanego produktu po uplywie 1 godziny (%) 60,3 38,7 1,9 0,4 0 2 godzin (%) 59,1 i 37,9 2,6 0,3 0,2121 700 15 wtórny poddaje sie nastepnie procesowi izomeryzacji i hy¬ drolizy, jak opisano w przykladach I lub II.W przykladzie III stosowano 200 g sacharozy na 50 ml wody, czyli produkt wyjsciowy o zawartosci suchej sub¬ stancji wynoszacej 80%, ale mozna równiez stosowac pro¬ dukty wyjsciowe o jeszcze wyzszej zawartosci suchej sub¬ stancji.W przykladach opisano zabieg transfruktozylacji pro¬ wadzony sposobem nieciaglym, ale zabieg ten mozna zgod¬ nie z wynalazkiem prowadzic równiez systemem ciaglym, korzystnie stosujac enzym transferazy fruktozylowej osa¬ dzony na nosniku sposobami wyzej opisanymi.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania produktów cukrowych zawieraja¬ cych wiecej niz 50 % wagowych fruktozy, polegajacy na pod¬ dawaniu sacharozy przeróbce na mieszanine zawierajaca dekstroze, fruktoze i polisacharydy oraz na izomeryzacji dekstrozy zawartej w tej mieszaninie w fruktoze przez dzialanie enzymem izomerazy, a nastepnie na hydrolizie polisacharydów w nieobecnosci enzymu izomerazy, zna¬ mienny tym, ze w pierwszym etapie procesu sacharoze poddaje sie dzialaniu nowego enzymu transferazy frukto¬ zylowej w temperaturze 25—65°C i przy wartosci pH 16 4,5—6,5, po czym dekstroze, zawarta w otrzymanym no¬ wym produkcie, stanowiacym mieszanine dekstrozy, fruk¬ tozy i polisacharydów zawierajacych co najmniej 66 % wa- gowch grup fruktozylowych polaczonych wiazaniami 5 (2 ? l)-fi9 przeprowadza sie w fruktoze dzialajac enzymem izomerazy, a polisacharydy zawarte w tej mie¬ szaninie poddaje sie hydrolizie w nieobecnosci enzymu izomerazy. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze dziala- 0 niu enzymu transferazy fruktozylowej poddaje sie produkt wyjsciowy zawierajacy co najmniej 20% wagowych sacha¬ rozy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie enzym transferazy fruktozylowej pochodzacy od Pullu- laria pullulans. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze izome¬ ryzacje dekstrozy prowadzi sie stosujac enzym izomerazy glikozy osadzony na nosniku. 0 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze polisa¬ charydy poddaje sie hydrolizie po oddzieleniu ich od deks¬ trozy metodami fizycznymi. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze poli¬ sacharydy oddziela sie od dekstrozy droga ultrafiltracji.LDD Z-d 2, z. 713/1400/83, n. 80+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL The subject of the invention is a method for producing sugar products containing more than 50% by weight of fructose, by enzymatic conversion of sucrose. Products containing fructose are used in many areas, especially in the pharmaceutical industry and the food industry, with the desired it is possible to have a high concentration of fructose in these products. High-fructose syrups, usually containing about 46% by weight of fructose and about 54% by weight of glucose, are prepared in a known manner by isomerization of dextrose, usually obtained by hydrolysis of starch. This isomerization is catalyzed by the enzyme isomerase The known method of sucrose inversion by hydrolysis in the presence of acid or the enzyme invertase allows the production of mixtures containing 50% by weight of fructose and 50% by weight of glucose, while it is practically possible to increase the fructose content in this product. The invention makes it possible to produce products from sucrose containing more than 50% by weight of fructose. This method involves processing sucrose into a mixture containing fructose, dextrose and polysaccharides, and then isomerizing the dextrose contained in this mixture into fructose by the action of the isomerase enzyme and hydrolyzing the polysaccharides in the absence of the isomerase enzyme. Feature method according to the invention is that in the first stage of the process sucrose is subjected to the action of a hitherto unknown enzyme, fructosyl transferase, at a temperature of 25-65°C and a pH value of 4.5-6.5, and then dec- 10 IB 20 JO Trose contained in the obtained new product, which is a mixture of fructose, dextrose and polysaccharides containing at least 66% by weight of fructosyl groups connected by (2-1)-/? bonds, is converted into fructose by the action of the isomerase enzyme, and the polysaccharides contained in this the mixture is hydrolyzed in the absence of the isomerase enzyme. The method according to the invention can produce syrups containing even more than 90% by weight of fructose. The products manufactured according to the invention have the properties of ordinary sugars and syrups, so they can be used, for example, as sweeteners or as products starting materials in the production of pharmaceuticals. They can also be used for the production of adhesives, moisture absorbents, glass papers, tanning agents, electrical insulators, and also as binding agents in the production of foundry cores, for the production of insecticides, softeners and thickeners. Mentioned the above new product, produced in the first stage of the process according to the invention, contains about 70-82% by weight of dry substance, namely a monosaccharide fraction, consisting mainly of dextrose, and a polymer fraction of polysaccharides higher than DP2, consisting mainly of DP »* The content of DP4 and higher polymers is at most 4.1% by weight. It has the consistency of a stable, non-crystallizing syrup, is resistant to the action of microorganisms and does not produce any colored substances. ; It can be transported and/or stored as a product containing sugar in concentrations previously unattainable with the properties described above, and when subjected to isomerization and hydrolysis in accordance with the invention, it gives products with a fructose content unattainable using known methods. Further In the description and claims, the terms used have the following meanings. The term "glycose" or "dextrose" means this simple sugar in any form, in solution or in the dry state. The term "sucrose" means this refined or crude disaccharide, in solution or in a dry state, derived from any raw material, e.g. cane or beet sugar. When using the method according to the invention, the sugar is usually used in an aquatic environment.3 / The term "fructose" or "levulose" means the isomer of delastrose -being sweeter than it. Both of these terms refer to this sugar in solution or in a dry state. " ' —~J The term "enzyme preparation" means any preparation with a given enzymatic action, e.g. whole living cells , dry cells, cell extracts, refined and concentrated preparations prepared from cells or culture liquids. The enzyme preparations may be used in the form of solutions or mounted on carriers. The term "isomerase enzyme" or "isomerase" means any enzyme preparation that causes the isomerization of dextrose into levulose. Such enzymes are known as dextrose isomerase, xylose isomerase and glucose isomerase and are produced from various types of microorganisms, e.g. from the genera Stieptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplares and Curtobacterium. According to the invention, an isomerase derived from Streptomyces olivochromogenes ATCC is used. No. 21713, ATCC No. 21714 or ATCC No. 21715 (single colony isolated from strain ATCC No. 21713), known e.g. from United States Patent No. 3,813,318, and especially isomerases prepared by the methods described in United States Patent Nos. 3,770,589 and 3,813,318. It is also known that the isomerase enzyme can be deposited on neutral, water-insoluble carriers and used in this form for the continuous transformation of glucose into syrup with a high fructose content. Such methods are known, for example, from United States patents no. 3708397, 3788945, 3850751 and 3868304 and from Belgian patents Nos. 819859 and 810480. The term "isomerase unit" means the amount of this enzyme that is necessary to produce 1 micromole of fructose in 1 minute under the conditions given below when discussing the determination of isomerase activity. The term "assignment "isomerase activity" means a process consisting in the spectrophotometric determination of ketose produced from a glucose solution under the established conditions specified below. The stock solution for this determination is prepared from the following ingredients: Ingredient Quantity 0.1 m MgSO<.7H20 solution 1 ml 0.001 m CaCh 6H2O solution 1 ml 1 m phosphate buffer solution with a pH of 7.5 0.5 ml anhydrous D-glucose 1, 44 g distilled water to a total volume of 7.5 ml 4 The enzyme being tested is first diluted to obtain a preparation containing 1-6 isomerase units in 1 ml. The enzymatic isomerization process is carried out by adding 1 ml of the preparation to 3 ml of the basic solution 5 and cultured at 60°C for 30 minutes, then 1 ml of the solution is taken, treated with 9 ml of 0.5 N perchloric acid, and then diluted to a volume of 250 ml. For comparative purposes, analogous tests with glucose are performed by cultivating a basic solution to which 1 ml of water was added instead of 1 ml of the enzyme preparation. Next, ketosis is determined using the cysteine-sulfuric acid method. For the purposes of the described study, an isomerase unit is considered to be the amount of enzyme which, under the conditions of the isomerization process described above, is necessary to produce 1 mole of levulose in 1 minute. The term "transfructosylation" means transfer of a fructosyl group from a donor, e.g. sucrose, to an acceptor, e.g. a polysaccharide. The term "fructosyl transferase enzyme" means any enzyme that catalyzes the transfructosylation process. The term includes the enzyme preparation derived from Pullularia pullulans used according to the invention. ATCC 9348 (synonym Aureobasidium pullulans). The term "unit of fructosyl transferase" means that amount of enzyme which is necessary to produce in 1 minute 1 micromole of reducing sugar calculated as glucose at a pH value of 5.5, at a temperature of 55°C, with a content of edible sucrose. in the starting product of 60 g/100 ml of water mixture. The amount of reduced sugar expressed as glucose is determined using the "TechnicumAutoanaly-35 zero II" device manufactured by Techniccn, Inc., Tarrytcwn, N. Y. United States of America. The analysis is carried out by the known method using alkali ferricyanide, described in Analytical Biochemistry 45, No. 2, pp. 517-524 (1972), adapted to use the above-mentioned analysis apparatus. Unless otherwise indicated, the determination of enzymatic activity given below is carried out continuously, recording changes in the reaction mixture with the following composition: 7.5 ml of an aqueous solution of edible sucrose at a concentration of 80% w/v, 2.3 ml of a citrate solution buffer with a concentration of 0.1 m and a pH value of 5t5 0.2 ml of enzyme sample containing an amount of fructosyl transferase enzyme that produces 5-25 micrograms of reducing sugar (calculated as glucose) in 1 ml of the reaction mixture in 1 minute. Determination "initial product" means saccharides in a form which enables them to take part in the transfructosylation process and containing fructosyl groups, preferably aqueous solutions of sucrose. The term "secondary product" means the product produced by the action of a preparation of the fructosyl transferase enzyme on the product starting material. In the following description, unless otherwise indicated, parts mean parts by weight and percentages mean 60% by weight/volume. The term "pressure liquid chromatography analysis", abbreviated HPLC, means a method in which ingredients are chromatographed by elution under increased pressure with water from a cationic (5) resin exchanger in calcium form. ^121 700 5 The eluted components are identified using a differential refractometer. Using an electronic integrator, the amount of non-dextrose carbohydrates is determined and the amount of dextrose is calculated from the difference. This method is described generally in Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography, Am. Soc. Eyebrow. Chem. Proc, 1973, pages 43—46. The resin used is a preparation called "Aminex Q" 15-5 in calcium form, produced by Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, United States of America. According to the invention, the starting product, preferably containing at least 20% by weight of sucrose, is subjected to the action of an enzyme preparation, fructosyl transferase, capable of causing the transformation of sucrose into a product consisting of a monosaccharide fraction containing the main part of glucose and a small amount of fructose and polysaccharides containing at least 66% by weight of fructosyl groups. Produced in this way method, the product contains a previously unknown polysaccharide product. The polysaccharides contained in the secondary product include all polymers containing fructose (except sucrose) and having at least two monosaccharide groups. These polymers can also be defined as polysaccharides containing fructosyl groups connected by bonds (2 - 1)-/? As described below, depending on the conditions of the transfructosylation process, polysaccharides can be produced mainly in a predetermined range. For example, a secondary product may be produced in which a major portion (e.g., at least 60 mole percent) of the polysaccharide consists of oligomers of 2-10 (i.e. DP2-10) and mostly 3-6 (i.e. DP 3—6) monosaccharide groups. Then, the glucose contained in the obtained reaction product is isomerized to fructose by the action of the isomerase enzyme in the presence of these plisaccharides, and then these polysaccharides are hydrolyzed in the absence of the active isomerase enzyme. These hydrolysis can be carried out using known methods, i.e. enzymatically, using invertase, or with an acid under mild conditions. According to the invention, polysaccharides can also be separated from glucose and fructose and subjected to the hydrolysis described above, producing a syrup with a very high fructose content. of more than 66% and even more than 90% by weight. The separation process can be carried out directly, without the need to isomerize the glucose contained in the reaction product, and this process can be advantageously carried out by ordinary physical separation methods based on the difference in particle size, e.g. using diaphragms, as in ultrafiltration and dialysis, or by solvent precipitation or carbon absorption. Separation methods using diaphragms are known, for example, from United States Patent Nos. 3,173,867, Re 26097, 3541006 and 3691068. The process for producing high-fructose syrups according to the invention is preferably is carried out by treating sucrose with a preparation of the fractoyl transferase enzyme derived from Pullularia pullulans strains such as ATCC 9348, ATCG 12538, NRRL 1673, NRRL Y231, NRRL YB3892 and NRRL YB3861. The produced secondary product is further subjected to the action of the isomerase enzyme, after which the isomerized product is hydrolyzed in the absence of the active enzyme and isomerase. 6 The secondary product produced in the first stage of the process according to the invention is a new product, particularly suitable for isomerization and subsequent hydrolysis, while using sucrose as the starting product and acting with the fructose transfer enzyme, syrups with a fructose content above 55% by weight. Products suitable for enzymatic isomerization and subsequent hydrolysis resulting in syrups with a fructose content exceeding 55% by weight, contain about 20% - 60% by weight of monosaccharides, mainly glycosides and with a low fructose content, and from about 70% to about 40% polysaccharides by weight containing more than 66% by weight of fructosyl groups. 15 Particularly valuable secondary products are produced according to the invention from sucrose by transfructosylation in the presence of a sufficient amount of the fructosyl transferase enzyme preparation derived from the Pullularia pullulans ATCC 9348 strain, with the process carried out at a temperature of approximately 25°C - 65°C. , especially 50-60 °C, at a pH value of about 4.5-6.5, benefits, cuts 5.4-5.6. Under these conditions, the concentration of sucrose in the initial product may be low and amount to 10 g per 100 ml of water, but it is more preferable to use solutions with the highest possible concentration, i.e. about 30-60 g per 100 ml of water, or even ¬ saturated sucrose solutions, because then the reaction speed is higher, as described in detail below. When carrying out the process according to the invention, the minimum amount of fructosyl transferase is 0.5-50 units per 1 g of sucrose, however, for economic reasons, no more is used than 50 units of transferase per 1 g of sucrose. The new preparation of fructosyl transferase used according to the invention can be prepared by known methods, given, for example, in US patents No. 3565756, 3806419, 3535123 and in the publication of S, Ueda et al. in Applied Microbiology, II, 211-215 (1963). These known methods, however, advantageously introduce some new separation and purification procedures, described below. Preparation of the fructosyl transferase enzyme preparation from Pullularia pullulans ATCC 9348 on a celite support. A. The process of fermentation to produce an enzyme. 45 The medium for vaccine development and the fermentation process to produce the enzyme contains the following ingredients: 0.5% dibasic potassium phosphate, 0.1% sodium chloride, 0.02% MgS04.7H20, 0.06% dia-ammonium sulfate, 0, 3% yeast extract (Difco Laboratories), 53 7.5% food-grade sucrose, the pH is adjusted to 6.8. 100 ml of sterilized medium are placed in 500 ml conical culture flasks and inoculated with a slanted culture of the black yeast Pullularia 55 pullulans ATCC 9348^ and then shaken at 32 °C for 48 hours. The contents of each flask are used to inoculate 200 ml of the above-mentioned medium in 1-liter conical flasks. An inoculation of 0.5% w/v is used and fermentation is carried out by shaking the flasks at a temperature of 32°C for 7 days.B. Isolation of the enzyme from the fermentation broth. 40 flasks of the wort are poured together and the flasks are rinsed with water, adding the rinsings to the wort. The volume of wort 65 itself is about 8 liters, and after dilution with washings 121700 it increases to about 12 liters. The diluted broth is centrifuged in a Sharples continuous centrifuge to remove yeast cells! cell debris. The liquid, in the form of a black, viscous solution, is treated with calcium chloride to a concentration of 0.5% by weight/volume and neutralized with sodium hydroxide to a pH of 7.0. The resulting liquid is then passed through the centrifuge again, obtaining a viscous, faintly colored liquid. This effluent is acidified with hydrochloric acid to a pH of 5.5 and 1000 units of pullulanase (term used in US patent no. 3,806,419) are added. For preservation, toluene is added to the wort in the amount necessary to saturate it and left overnight at room temperature. Then celite (Grefco no. 503 Celite manufactured by Johns-Manville Products Corporation, Lompoe, California, United States of America) is added to the wort in such an amount that its concentration is 1%. Celite is added as a suspension in 24 liters of acetone and stirred, then the precipitate is filtered off, washed with acetone and dried in air at room temperature. This precipitate contains the enzyme fructosyl transferase mounted on celite as a carrier. The addition of calcium chloride used in this process and adjusting the pH value is intended to remove the black pigment and acidic polysaccharides. [For a discussion of these acidic polysaccharides, see Acta Chem. Scand 16, 615—622 (1962)]. The obtained product is a relatively pure, colorless preparation and the refining procedure described above, consisting in simple centrifugation or filtering of the precipitate, enables the production of an enzyme preparation that does not contain undesirable pigment and acidic plisaccharides, which are by-products in the fermentation process carried out using Pulllaria. pullulans. It is also desirable to remove the lulan pool polysaccharide, which also precipitates together with the fructosyl transferase enzyme when the solvent is added to the wort. For this purpose, the effluent obtained after treatment with calcium chloride and after adjusting the pH value can according to the invention be treated with an enzyme known as pullulanase. Pullulanase hydrolyzes pullulan regardless of its nature, breaking it down into a polymer with smaller molecules that does not precipitate and therefore does not contaminate the enzyme preparation when adding a solvent, e.g. acetone or alcohol. This additional purification procedure is also a new procedure used in the process according to the invention. The fructosyl transferase enzyme preparations used in the process of the invention can also be used without separating pullulan, that is, without hydrolyzing pullulan with pullulanase, and then pullulan serves as a carrier for the fructosyl transferase enzyme, as described below. Preparation of a secondary product using fructosyl transferase enzyme on a pullulan carrier. To a 20% sucrose solution, the pH of which was adjusted to 5.5 with 0.05 M citrate buffer solution, 1% of anhydrous pullulan, prepared as above, but not hydrolyzed with pullulanase, is added. Pullulan is a carrier here and celite is not used as a carrier. 677 units of fructosyl transferase are used per 1 g of pullulan 15 and the reaction is carried out until the mixture turns turbid. A sample of this mixture is analyzed by pressure liquid chromatography, giving the following results: Fructose Dextrose DP2 DP3 DP4+ 20 6.9 40.6 6.2 11.1 35.2 Trials 1, 2 and 3 discuss further characteristics of the enzyme produced method described above. Test 1. Products of enzymatic action and enzyme resistance to heat. 25 In flasks equipped with caps, 60 g of edible sucrose and a preparation of the fructosyl transferase enzyme are placed, prepared from the product obtained in the manner described above by dispersing appropriate amounts of the enzyme deposited on the celicit in measured amounts of water so as to obtain appropriately different concentration of the enzyme solution. Then the celite is filtered off and the filtrate is added to the reaction mixture in amounts of 10, 20 and 30 enzyme units per 1 g of sucrose, which is the starting product. Each of these mixtures is then diluted with water to a volume of 100 ml and reacted at pH 5.5 for 66 hours at 55°C and separately at 60°C. After 24, 43 and 66 hours, samples are taken and their reducing sugar content is determined, indicating the presence of enzymatic activity. After performing these analyses, the reaction mixtures are frozen to stop the enzymatic action and the carbohydrate composition of the mixture samples is determined using pressure liquid chromatography. The results are given in tables 1 and 2. 45 The results given in table 1 were obtained using the method described above when discussing the determination of isomerase activity, and the number of enzyme units given in box 2 of table 1 means the number of these units per 1 g of sucrose. Table 1 Determination of reducing sugar Temperature 55 °C 60°C Number of enzyme units 0 10 20 30 0 10 20 30 Reducing sugar content mg/ml after 24 hours 191 192 246 0.7 200 219 282 PH 5.80 5.40 5.40 5.35 5 .75 5.10 5.15 5.20 Reducing sugar content mg/ml after 43 hours 231 270 334 1.5 243 288 360 PH 5.80 5.25 5.25 5.15 5.80 470 1 4 .90 4.95 Content of reducing sugar mg ml after 66 hours 268 301 390 2.1 270 346 420121 700 10 Table 2 Analysis of carbohydrate content Process at 55 °C Enzyme dose units' 1 g | ^acra^ose 1 10 20 30 Reaction time 1 hour 2 24 43 66 24 43 66 24 43 66 Dextrose content % 1 3 31.7 34.5 36.7 33.9 37.4 40.5 37.4 41 .8 46.1 Levulose content % 4 2.3 1 3.2 3.9 2.8 4.2 4.9 4.0 5.9 7.5 DP2 content % | 5 10.0 9.4 8.6 8.8 7.9 7.4 7.1 6.8 7.0 DP3 content % 6 25.0 17.9 15.0 19.7 12.1 10.8 12.5 11.4 11.5 DP4+ and higher % 1 7 1 31.0 35.0 35.8 | 34.8 38.4 96.4 39.0 34.1 27.9 1 1 Process at 60°C 1 10 20 30 24 43 66 24 43 66 24 43 66 32.2 35.0 36.7 35, 5 38.4 41.3 39.0 43.7 47.8 2.8 4.0 5.4 3.8 5.0 1 6.0 5.5 7.1 9.2 | 6.1 1 9.8 9.4 8.4 8.0 7.9 7.1 7.3 7.4 24.3 18.2 16.0 17.1 12.3 11.1 12.1 11 ,0 11.1 30.6 1 33.0 32.5 1 35.2 36.3 33.1 | 36.3 30.9 24.5 | The results given in Tables 1 and 2 show that the enzyme is in the presence of the starting product and is stable for 66 hours at a pH of 5.5 at 55 °C and 60 °C, which proves that it is useful in the test. processes on a technical scale. Trial 1 also shows that the secondary product prepared according to the invention by converting sucrose with the new fructosyl transferase preparation constitutes a valuable source suitable for the preparation of high-fructose syrups from sucrose. This is proven by the results given in Table 2, according to which the main components of the reaction product are dextrose and polymers, which after hydrolysis give fructose as the main product. This also proves that the enzyme produced by the above-mentioned method works effectively at a sucrose concentration of 4 ° of 60% w/v, as well as at high glucose concentrations. Trial 2. Effect of temperature on enzyme activity. The effect of temperature on the rate of the reaction involving the enzyme fructosyl transferase 4 is determined using the Technicon Autoanalyzer II analyzer in the following manner. The reaction mixture contains 7.5 ml of 80% w/v sucrose solution, 2.3 ml of 0.1 M citrate buffer solution at pH 5.5 50 and 0.2 ml of 2% w/v pullulan enzyme solution (enzyme preparation produced by the method described above). The final sucrose concentration is 60% w/v. The samples are maintained at temperatures of 30°C, 40°C, 50°C and 60°C and analyzed within 55-10 minutes using the analyzer. The results show that the speed of the enzymatic reaction at a temperature of 40°C is 1.89 times higher than at a temperature of 30°C, at a temperature of 50°C it is 1.29 times higher than at a temperature of 40°C, and at a temperature of 60°C it is 1 .48 times higher than at a temperature of 50°C. This proves that the reaction speed increases with an increase in temperature. Sample 3. Determination of the Michaelis-Menten Km value for the fructosyl transferase enzyme. The Km value means the concentration of the starting product at which the enzymatic reaction speed is half the maximum speed Vmax. This value for the fructosyl transferase enzyme is calculated as follows. A 90% w/v stock sucrose solution is adjusted to a pH of 5.5 with a 0.1 m citrate buffer solution and 9.8 ml samples are prepared , in which the concentration of sucrose after refilling to 10 ml is 5%, 10%, 30%, 40%, 50%, 60% and 70%. To these samples, 0.2 ml of a solution containing 1.1 units of the fructosyl transferase enzyme are added at a temperature of 55°C and immediately analyzed as described above using the Technicon Autoanalyzer II. Typical glucose solutions, measured in micrograms/ml, are used as comparative tests. Table 3 shows the rate of glucose production in micrograms/ml/minute at various sucrose concentrations, using a constant dose of 1.1 units of the fructosyl transferase enzyme preparation described above. The third column of this table gives the speed of the process carried out again during the next day for a solution with a 60% sucrose content prepared from the stock solution. The Km value is 0.27 molar sucrose concentration, and the highest reaction speed is at a sucrose concentration of 1.374 m, at a pH value of 5.5 and a temperature of 55°C. The invention is illustrated in the examples below. * The percentages given in the examples, unless otherwise stated, are percentages by weight.121 700 11 Table 3 Content of 1 sucrose in % 5 10 20 30 40 . 50 60 70 Reaction rate ^g/ml/minute 8.0 11.8 15.7 18.0 18.6 19.2 17.8 15.6 Reaction rate //g/ml/minute 8.0 11.6 15.2 17.6 18.2 17.2 18.2 - Example I. A. Preparation of a secondary product - 600 g of edible sucrose is dissolved in water to obtain 800 ml of solution, which is then acidified with dilute hydrochloric acid to a pH of 5, 5. Separately, a suspension is prepared in 100 ml of water of an anhydrous enzyme preparation supported on celite, prepared as described above and containing 550 enzyme units per 1 g. The suspension is filtered on a Btichner funnel through Whatman No. 1 filter paper, and then the precipitate is washed with 100 ml water. The filtrate with a volume of 200 ml is added to the sucrose solution in a 2-liter flask equipped with a stopper. The flask is placed in a water bath at high temperature and the reaction is carried out for 20 hours, after which a sample is taken and the carbohydrate content is determined using the pressure liquid chromatography method. The results are given in Table 4^ Table 4 | Carbohydrate 1 Fructose Dextrose DPa DP, | DP4 and higher Content in % 2.4 32.8 10.6 22.9 31.3 An amount of magnesium chloride is added to the obtained reaction product to obtain its concentration of 5 μm, and then the solution is alkalinized with a dilute hydroxide solution sodium to a pH value of 8.4. B. Continuous isomerization of the secondary product. Glycose isomerase obtained from Streptomyces elivochromogenes ATCC 21715 (see US Pat. No. Re 29152) is deposited on porous alumina (adjustable pore carrier manufactured by Corning Glass Co., Corning, N. Y., United States of America, see U.S. Patent No. 3,992,329) using the following procedures. The carrier is washed twice with water, 0.1 m of sodium citrate solution is added to it and stirred for 1 hour, then the sodium citrate is washed from the carrier until the conductivity of the washings is 1000 microohms. Then, the support is treated with 0.05 M magnesium chloride solution for 1 hour, then the magnesium chloride solution is decanted and enough 0.05 M magnesium chloride solution is added to obtain a final enzyme concentration of 400 units per 1 ml. The isomerase enzyme concentrate is then added to the carrier in such an amount to obtain a concentration of 495,000 units per liter, then the enzyme is contacted with the carrier for 22-24 hours and then the bound enzyme is rinsed from the carrier with distilled water. 12 In a 3 cm x 18 cm glass column, equipped with a jacket and connected by a pipe with a pump to the tank containing the initial product, the enzyme mounted on the support is placed so that the volume of the bed is 45 ml. 5 In all isomerization tests the temperature in the column is 60°C. Dextrose syrup with a concentration of 50% by weight/volume, containing a 5 mm magnesium chloride solution alkalinized to a pH of 8.4, is fed to the column. After testing the operation of column 10, the flow through it is adjusted to 292 ml/hour and the liquid is drained from the column to the bed level. Then, the supply of secondary product A with the composition given in table 5 begins, and the flow is initially adjusted manually and, after removing 20 ml of liquid, the flow is set to 292 ml/hour. The first 100 ml of the obtained syrup is discarded as a heterogeneous product and then the rest of the secondary product, i.e. approximately 850 ml, is passed through the column. After 1 hour, the flow rate increases to 570 ml/hour and is then adjusted so that it remains at 300 ml/hour until the end of the test. Once all of the secondary product has been added, the dextrose solution is again directed to the column to demonstrate that the isomerase is still functional. Table 5 shows the composition of the secondary product subjected to the reaction and the composition of the final product B. The analysis was carried out using the method of liquid chromatography under pressure. Table 5 Component Fructose Dextrose DP2 DP3 | DP4 and higher Secondary product composition A % 2.4 32.8 10.6 22.9 31.3 Final product composition B % 15.7 18.9 11.0 22.9 31.5 | The results given in Table 5 show that 42.38% of the free dextrose contained in the secondary product undergoes isomerization while passing through the column, giving fructose. The fructose polymers contained in the secondary product are not transformed during this time and do not affect the process dextrose isomerization. It should be emphasized that in the final product 45% of monosaccharides are fructose and 55% dextrose.C. Enzymatic hydrolysis. To 100 ml of the product obtained as described in section B, 10 mg of purified invertase 50 obtained from Candida utilis is added. The toluene-protected mixture is left overnight at room temperature, after which a sample of the resulting mixture is taken and analyzed by pressure liquid chromatography. The reaction is then continued for 6 days, after which a sample of the mixture is taken again and analyzed. The results of the analyzes are given in Table 6. They indicate that the content of fructose increases primarily and, to a lesser extent, the content of glucose, and the content of other sugars decreases. 10 In these tests, an invertase preparation produced by Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, with an activity of 123 units/mg was used. These activities are determined by the fact that 1 unit of invertase catalyzes the cleavage of 1 micromole of glucose to give 1 micromole of fructose in 65 1 minute and under specified conditions.121 700 13 14 In Examples I and II, the starting product was used in which the concentration of sucrose was not higher from the concentration corresponding to the saturation state. Example III describes a process in which the concentration of sucrose in the initial product treated with fructosyl transferase is higher than the concentration in the saturated state. These tests show that under such conditions a product with an increased DPa content (ie fructosyl sucrose) is obtained, and less DP4 and higher polymers are obtained. Under these conditions, a secondary product with a dry matter content higher than in the case of the process without the participation of the fructosyl transfer enzyme is also obtained. Moreover, this example shows that as the dry matter content of the initial product increases, the degree of polymerization of the fructose polymer in the secondary product decreases, so that the DP4 polymer and higher polymers are present only in small amounts. These results therefore differ from those obtained when using starting products with a sucrose concentration lower than the concentration corresponding to the saturation state, because in the case of these lower concentrations the main component is DP4 and higher polymers. Example III. 200 g of edible sucrose are placed in jars with a capacity of 0.5 liters each, equipped with closures. 50 ml of water is added to one of the jars and this sample is treated as a control. To the remaining jars, add the fructosyl transferase enzyme preparation on Celite as used in Examples I and II, but using the amounts of preparation given in Table 8. The jars are closed. 30 and placed in a shaken water bath at a temperature of 54-55 °C. Shake for 24 hours, move the jars with your hand from time to time. Then, a sample is taken from each jar and placed in a closed test tube in boiling water to deactivate the enzyme. The sample is then analyzed by pressure liquid chromatography and the content of solids in the solution is determined using the K. Fischer method. The results are given in Table 8, where the total number of units of the fructosyl transferase enzyme is given in column 3, and the abbreviation NW means that the given component was not detected. It should be emphasized that in this example, the liquid in the control sample crystallized after cooling it to room temperature, while the produced enzymatic secondary product solutions remained liquid and did not crystallize during magnesization. The product obtained as a result of the action of the fructosyl transferase enzyme. Table 8. Sample number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 control Sucrose content (g) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Number of enzyme units 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Content of dry substance in the solution (%) 1 74.5 75.6 76.3 77.1 77.1 78.1 78.1 80.0 79.0 79.6 72.7 Content of carbohydrates in the solution determined chromatographically (%) | fructose | dextrose 0.6 0.7 1.0 1 0.9 1.1 1.3 1.1 1.0 1.3 1.3 0.3 0.6 12.7 14.5 15.7 17.3 18.0 18.8 19.3 19.9 20.6 NW dp2 |dp3 |dp4+ 1 80.9 72.2 66.8 62.6 58.5 56.0 53.9 52.2 50.0 48 ,6 99.7 8.9 13.7 16.6 19.0 21.0 21.9 23.1 24.1 25.0 25.4 NW NW I 0.7 1.1 1.8 2.1 2.8 3.0 3.4 3.7 4.1 NW | Table 6 Component 1 Fructose Dextrose DP2 DPs DP4 and higher Initial product (product B) % 15.7 18.9 11.0 22.9 31.5 Composition of the mixture after invertase action within 1 day (%) 41.9 29.4 1.9 12.9 13.9 Composition of the mixture after the action of invertase within 7 days (%) 62.4 36.2 0 0.5 0.9 Example II. A secondary product is produced from edible sucrose in a manner identical to that described in Example I A, and then the obtained product with the composition given in Table 4 is subjected to the isomerization process as described in Example I B, obtaining a product with the composition given in Table 5 ( product B). The obtained product is hydrolyzed using sulfuric acid at a concentration of 0.05 N at a temperature of 75-80°C. After 1 and 2 hours, samples of the reaction mixture are taken and analyzed by pressure liquid chromatography. The results are given in Table 7. They prove that when hydrolysis with acid is used, as well as in the case of enzymatic hydrolysis described in example I, the fructose content increases mainly, and the glucose content increases to a lesser extent, and at the same time the content of DP2, DP3 and DP4 and higher polymers decreases, which indicates that these polymers contain fructose. Table 7 Component 1 Fructose Dectrose DP2 DPs DP4 and ex- | sze Composition of the starting product (product B) % 1 15.7 18.9 11.0 22.9 31.5 Composition of the product obtained after 1 hour (%) 60.3 38.7 1.9 0.4 0 2 hours (%) 59.1 and 37.9 2.6 0.3 0.2121 700 15 is then subjected to the isomerization and hydrolysis process as described in Examples I or II. In Example III, 200 g of sucrose was used per 50 ml water, i.e. an initial product with a dry substance content of 80%, but initial products with an even higher dry substance content can also be used. The examples describe the transfructosylation procedure carried out in a discontinuous manner, but this procedure can be performed according to the invention can also be carried out in a continuous system, preferably using the fructosyl transferase enzyme mounted on a support in the methods described above. Patent claims 1. A method of producing sugar products containing more than 50% by weight of fructose, consisting in processing sucrose into a mixture containing dextrose , fructose and polysaccharides and on the isomerization of dextrose contained in this mixture into fructose by the action of the isomerase enzyme, and then on the hydrolysis of polysaccharides in the absence of the isomerase enzyme, characterized in that in the first stage of the process sucrose is subjected to the action of a new fructosyl transferase enzyme in at a temperature of 25-65°C and a pH value of 16 4.5-6.5, and then dextrose, contained in the obtained new product, which is a mixture of dextrose, fructose and polysaccharides containing at least 66% by weight of fructosyl groups connected by 5 bonds (2 ? l)-fi9 is converted into fructose by the action of the isomerase enzyme, and the polysaccharides contained in this mixture are hydrolyzed in the absence of the isomerase enzyme. 2. The method according to claim 1, characterized in that the initial product containing at least 20% by weight of sucrose is subjected to the action of the fructosyl transferase enzyme. 3. The method according to claim The method of claim 1, characterized in that the fructosyl transferase enzyme derived from Pullularia pullulans is used. 4. The method according to claim 1, characterized in that dextrose isomerization is carried out using the enzyme glucose isomerase mounted on a support. 0 5. The method according to claim 1, characterized in that the polysaccharides are hydrolyzed after separating them from dextrose by physical methods. 6. The method according to claim 5, characterized in that the polysaccharides are separated from the dextrose by ultrafiltration.LDD Z-d 2, no. 713/1400/83, no. 80+20 copies. Price PLN 100 PL PL PL PL PL