CH648059A5 - METHOD FOR PRODUCING SIRUPS WITH FRUCTOSE CONTENT FROM SACCHAROSE. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Sirups durch enzymatische Transfructo-sylierung von Saccharose. Dieses Verfahren liefert einen neuen enzymatischen Zugang für die Herstellung von Sirups mit hohem Fructosegehalt, welche einen beträchtlich höheren Fructosegehalt aufweisen, als bisher durch Glucoseisomeri-sierung von Stärkehydrolysaten erhältlich war, ohne die Notwendigkeit der physikalischen Trennung des resultierenden Fructoseendproduktes. Das Verfahren ist besonders geeignet für die Erzeugung von Fructosesirups, welche mehr als 55% Fructose enthalten. Es bedient sich bevorzugt eines neuen Transfructosylaseenzyms aus Kulturen der Hefe Pullularia pullulans, welches sich für diese Herstellung als nützlich erwies. The present invention relates to a method for producing a syrup by enzymatic transfructylation of sucrose. This process provides a new enzymatic approach for the production of high fructose syrups which have a significantly higher fructose content than has been previously available by glucose isomerization of starch hydrolysates without the need for physical separation of the resulting fructose end product. The process is particularly suitable for the production of fructose syrups which contain more than 55% fructose. It preferably uses a new transfructosylase enzyme from cultures of the yeast Pullularia pullulans, which has been found useful for this preparation.

Der erfindungsgemäss erhaltene Sirup lässt sich mit oder ohne Abtrennung einzelner Komponenten zu Fructose oder fructosehaltigem Sirup verarbeiten. The syrup obtained according to the invention can be processed with or without the separation of individual components to form fructose or fructose-containing syrup.

Jedes dieser Produkte weist Eigenschaften von üblichen Zuckern und Sirup auf und kann in deren üblichen Anwendungen eingesetzt werden. Diese umfassen zum Beispiel die Verwendung als Süssmittel für Nahrungsmittel und als Rohmaterialien für die Herstellung von Pharmazeutika. Ausserdem können diese Produkte in den üblichen industriellen Anwendungen von Zuckern und Sirups eingesetzt werden. So können sie in der Herstellung von Klebstoffen, Anfeuch-tungsmitteln, Pergamentpapier, Gerbstoffen, elektrischen Isolatoren, Bindemitteln für Giessereikerne, Insektiziden, Farbstoffen und dergleichen oder allgemeiner als Weichmacher, Verdickungsmittel usw. verwendet werden. Kurz gesagt sind sie nützlich in dem ganzen breiten Anwendungsspektrum, in welchem analoge Produkte bereits verwendet wurden. Each of these products has properties of common sugars and syrups and can be used in their usual applications. These include, for example, use as a sweetener for food and as raw materials for the manufacture of pharmaceuticals. In addition, these products can be used in the usual industrial applications of sugars and syrups. For example, they can be used in the manufacture of adhesives, humectants, parchment paper, tanning agents, electrical insulators, binders for foundry cores, insecticides, dyes and the like, or more generally as plasticizers, thickeners, etc. In short, they are useful in the wide range of applications in which analog products have been used.

Da zahlreiche Bezeichnungen in Fachkreisen verwendet werden, dienen die folgenden Definitionen zur Festlegung der Bedeutung dieser Ausdrücke, wie sie hier verwendet werden: Since numerous terms are used in specialist circles, the following definitions serve to define the meaning of these terms as used here:

Glucose und Dextrose: Glucose and dextrose:

Die Bezeichnungen «Glucose» und «Dextrose» werden in dieser Beschreibung austauschbar verwendet, um dieses Monosaccharid in jeder Form in Lösung oder trocken zu umfassen. The terms "glucose" and "dextrose" are used interchangeably throughout this specification to encompass this monosaccharide in any form in solution or dry.

Saccharose: Sucrose:

Der Ausdruck «Saccharose» bezieht sich auf dieses Di-saccharid in raffinierter oder roher Form, in Lösung oder trocken, aus jeder Rohmaterialquelle für Saccharose, zum Beispiel Zuckerrohr oder Zuckerrüben. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird das Saccharose-Aus-gangsmaterial typischerweise in wässerigem Medium verwendet. The term "sucrose" refers to this disaccharide in refined or raw form, in solution or dry, from any raw material source for sucrose, for example sugar cane or sugar beet. In the practice of the present invention, the sucrose starting material is typically used in an aqueous medium.

Fructose und Lävulose: Fructose and levulose:

Die Ausdrücke «Fructose» und «Lävulose» werden allgemein in Fachkreisen austauschbar verwendet, und beziehen sich auf das Isomer von Dextrose, welches süsser ist als Dextrose selbst. Fructose wird in Honig und in Invertzucker gefunden, zusammen mit Dextrose, und ist wertvoll infolge seiner Süssigkeit. Die Bezeichnungen Lävulose und Fructose werden im folgenden austauschbar verwendet, und beziehen sich auf dieses Monosaccharid in jeder Form, in Lösung oder trocken. The terms "fructose" and "levulose" are used interchangeably in the art and refer to the isomer of dextrose, which is sweeter than dextrose itself. Fructose is found in honey and invert sugar, along with dextrose, and is valuable as a result of it Sweetness. The terms levulose and fructose are used interchangeably below and refer to this monosaccharide in any form, in solution or dry.

Enzympräparat: Enzyme preparation:

Der Ausdruck «Enzympräparat» wird hier verwendet, um jede Zusammensetzung zu bezeichnen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität aufweist. Der Ausdruck bezieht sich zum Beispiel auf lebende ganze Zellen, trockene Zellen, Zellextrakte, raffinierte und konzentrierte Präparate, welche aus den Zellen und aus Kulturflüssigkeiten gewonnen werden. Die Enzympräparate können entweder als Lösung oder in einer immobilisierten Form bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. The term "enzyme preparation" is used here to refer to any composition that has the desired enzymatic activity. The term refers, for example, to whole whole cells, dry cells, cell extracts, refined and concentrated preparations which are obtained from the cells and from culture fluids. The enzyme preparations can be used either as a solution or in an immobilized form in the practice of the present invention.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

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3 3rd

648 059 648 059

Isomerase-Enzym : Isomerase enzyme:

Jedes Enzympräparat, welches Dextrose zu Lävulose iso-merisiert, wird im folgenden als ein «Isomeraseenzym» bezeichnet. Diese Enzyme sind in Fachkreisen bekannt und wurden als Dextroseisomerase, Xyloseisomerase und Gluco-seisomerase bezeichnet. Derartige Enzyme können aus einer Vielzahl von geeigneten Mikroorganismen gewonnen werden. Beispiele solcher Mikroorganismen sind solche der Gattungen Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Cur-tobacterium und andere. Each enzyme preparation that isomerizes dextrose to levulose is referred to below as an “isomerase enzyme”. These enzymes are known in the art and have been referred to as dextrose isomerase, xylose isomerase and glucose isomerase. Such enzymes can be obtained from a variety of suitable microorganisms. Examples of such microorganisms are those of the genera Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Cur-tobacterium and others.

Ein bevorzugtes Isomeraseenzym, welches sich für die Durchführung der vorliegenden Erfindung eignet, wird von Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 713, ATCC Nr. 21714 oder ATCC Nr. 21715 gewonnen, wobei das letztere ein Einzelkolonie-Isolat von ATCC Nr. 21713 ist, wie im US-PS 3 813 318 und im US-PS 3 957 587 beschrieben, insbesondere wenn es nach dem Verfahren hergestellt wird, welches im US-PS 3 770 589 oder 3 813 318 hergestellt ist. A preferred isomerase enzyme useful in the practice of the present invention is obtained from Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21 713, ATCC No. 21714 or ATCC No. 21715, the latter being a single colony isolate of ATCC No. 21713, such as in U.S. Patent 3,813,318 and U.S. Patent 3,957,587, particularly when made by the process prepared in U.S. Patent 3,770,589 or 3,813,318.

Kürzlich wurden Verfahren bekannt, in welchen das Isomeraseenzym auf einem wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert wird. Das immobilisierte Enzym ist dann geeignet für die Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose zu einem Sirup mit hohem Fructosegehalt. Beispiele derartiger Verfahren sind in den US-PS 3 708 397, 3 788 945,3 850 751, 3 868 304, der BE-PS 819 859 und in der US-PS 3 960 663 (gleich BE-PS 810 480) beschrieben. Methods have recently become known in which the isomerase enzyme is immobilized on a water-soluble inert carrier. The immobilized enzyme is then suitable for use in the continuous conversion of glucose to a high fructose syrup. Examples of such processes are described in US Pat. Nos. 3,708,397, 3,788,945,3,850,751, 3,868,304, BE-PS 819,859 and US Pat. No. 3,960,663 (same as BE-PS 810,480).

Isomerase-Einheit: Isomerase unit:

Eine «Isomerase-Einheit» ist definiert als diejenige Menge an Enzymaktivität, welche erforderlich ist, um ein Mikromol Lävulose pro Minute unter den im folgenden unter «Bestimmung der Isomerase-Aktivität» beschriebenen Isome-risierungsbedingungen zu erzeugen. An “isomerase unit” is defined as the amount of enzyme activity required to produce one micromole of levulose per minute under the isomerization conditions described below under “Determination of the isomerase activity”.

Bestimmung der Isomerase-Aktivität: Determination of the isomerase activity:

Dieser Ausdruck bezieht sich hier auf das Bestimmungsverfahren, welches eine spektrophotometrische Bestimmung der aus einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugten Ketose umfasst. This expression here refers to the determination method, which comprises a spectrophotometric determination of the ketosis produced from a glucose solution under standardized conditions.

Eine Vorratslösung wird auf folgende Weise zubereitet: A stock solution is prepared in the following way:

Vorratslösung für Bestimmung Stock solution for determination

Bestandteil component

Menge amount

0,1 M MgS04-7Hi0 0.1 M MgS04-7Hi0

1 ml 1 ml

0,001 M CoCb-óHzO 0.001 M CoCb-óHzO

1 ml 1 ml

1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5

0,5 ml wasserfreie D-Glucose 0.5 ml of anhydrous D-glucose

1,44 g 1.44 g

Destilliertes Wasser wird zugesetzt bis zu einem Totalvolumen von 7,5 ml. Distilled water is added up to a total volume of 7.5 ml.

Das zu bestimmende Enzympräparat wird zunächst derart verdünnt, dass es 1 bis 6 Isomerase-Einheiten pro Milliliter enthält. The enzyme preparation to be determined is first diluted in such a way that it contains 1 to 6 isomerase units per milliliter.

Eine enzymatische Isomerisierung wird durchgeführt durch Zusatz von 1 ml des Enzympräparates zu 3 ml der Vorratslösung und Inkubieren während 30 Minuten bei 60 °C. Am Ende der Inkubationszeit wird ein aliquoter Teil von 1 ml entnommen und in 9 ml 0,5 N Perchlorsäure gelöst. Der gelöste aliquote Teil wird sodann auf ein Totalvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle zu Vergleichszwecken wird ein Glucose-Blindversuch durchgeführt, in welchem 1 ml Wasser anstelle von 1 ml Enzympräparat in Lösung zu Beginn der Inkubationszeit zugesetzt wird. An enzymatic isomerization is carried out by adding 1 ml of the enzyme preparation to 3 ml of the stock solution and incubating at 60 ° C. for 30 minutes. At the end of the incubation period, an aliquot of 1 ml is removed and dissolved in 9 ml of 0.5 N perchloric acid. The dissolved aliquot is then diluted to a total volume of 250 ml. As a control for comparison purposes, a glucose test is carried out in which 1 ml of water instead of 1 ml of enzyme preparation in solution is added at the beginning of the incubation period.

Die Ketose wird sodann bestimmt durch eine Cystein-Schwefelsäure-Methode. Für die Zwecke dieser Bestimmung wird eine Isomerase-Einheit als diejenige Menge an Enzymaktivität definiert, welche erforderlich ist, um ein Mikromol Lävulose pro Minute unter den beschriebenen Isomerisie-rungsbedingungen zu bilden. The ketosis is then determined by a cysteine-sulfuric acid method. For the purposes of this determination, an isomerase unit is defined as the amount of enzyme activity required to form one micromole of levulose per minute under the isomerization conditions described.

Transfructosylierung : Transfructosylation:

Diese Bezeichnung bedeutet hier den Übergang eines Fructosylrestes von einem Donator, z.B. Saccharose, zu einem Akzeptor, z.B. Polysaccharid. This term here means the transition of a fructosyl residue from a donor, e.g. Sucrose to an acceptor e.g. Polysaccharide.

Fructosyl-Transferase-Enzym : Fructosyl transferase enzyme:

Dieser Ausdruck bezieht sich hier auf jedes Enzym, welches die Transfructosylierung katalysiert und umfasst das Enzympräparat, welches aus Pullularia pullans ATCC 9348 (Synonym mit Aureobasidium pullulans) gewonnen wird. This expression refers here to any enzyme that catalyzes the transfructosylation and encompasses the enzyme preparation which is obtained from Pullularia pullans ATCC 9348 (synonym with Aureobasidium pullulans).

Fructosyl-Transferase-Einheit: Fructosyl transferase unit:

Eine Fructosyl-Transferase-Einheit bedeutet hier diejenige Menge an Enzymaktivität, welche erforderlich ist, um ein Mikromol reduzierenden Zuckers, berechnet als Glucose, pro Minute unter den folgenden Bedingungen zu bilden: (a) p-H 5,5, (b) Temperatur 55 °C, und (c) Substratkonzentration von 60 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität pro 100 ml eines wässerigen Reaktionsgemisches. A fructosyl transferase unit here means the amount of enzyme activity which is required to form a micromole of reducing sugar, calculated as glucose, per minute under the following conditions: (a) pH 5.5, (b) temperature 55 ° C, and (c) substrate concentration of 60 g food grade sucrose per 100 ml of an aqueous reaction mixture.

Die Bestimmungen des reduzierenden Zuckers (berechnet als Glucose) werden durchgeführt unter Verwendung eines «Technicon Autoanalyzer II» (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). Die Analyse wird nach einer üblichen Alkaliferri-cyanid-Methode durchgeführt, wie sie in Analytical Bioche-mistry, 45, Nr. 2, Seiten 517 bis 524 (1972) beschrieben ist und für die die Verwendung im «Autoanalyzer II» angepasst ist. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden die Enzymaktivitätsbestimmungen durch kontinuierliche Überwachung eines Reaktionsgemisches durchgeführt, welches folgende Zusammensetzung aufweist: The determinations of the reducing sugar (calculated as glucose) are carried out using a "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). The analysis is carried out according to a conventional alkali ferric cyanide method, as described in Analytical Biochemistry, 45, No. 2, pages 517 to 524 (1972) and for which the use in “Autoanalyzer II” is adapted. Unless otherwise stated, the enzyme activity determinations are carried out by continuously monitoring a reaction mixture which has the following composition:

7,5 ml 80%ige (Gewicht/Volumen) wässerige Lösung von 7.5 ml 80% (weight / volume) aqueous solution of

Saccharose von Nahrungsmittelqualität 2,3 ml 0,1 M Citratpuffer pH 5,5 0,2 ml Enzymprobe, welche jene Menge an Food grade sucrose 2.3 ml 0.1 M citrate buffer pH 5.5 0.2 ml enzyme sample containing that amount

Fructosyl-Transferase-Enzym enthält, welche 5 bis 25 Mikrogramm reduzierenden Zucker (berechnet als Glucose) pro Minute pro Milliliter Reaktionsgemisch erzeugt. Contains fructosyl transferase enzyme which produces 5 to 25 micrograms of reducing sugar (calculated as glucose) per minute per milliliter of reaction mixture.

Primäres Substrat: Primary substrate:

Der Ausdruck «primäres Substrat» bedeutet hier jene Saccharide in geeigneter Form, welche einen für die Beteiligung bei der Transfructosylierung verfügbaren Fructosylrest besitzen, wie z.B. wässerige Lösungen von Saccharose. The term "primary substrate" here means those saccharides in suitable form which have a fructosyl residue available for participation in transfructosylation, such as e.g. aqueous solutions of sucrose.

Sekundäres Substrat: Secondary substrate:

Die Bezeichnung «sekundäres Substrat» bedeutet hier das Reaktionsprodukt, welches entsteht, wenn das primäre Substrat der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzymprä-parates, wie hier definiert, unterworfen wird. The term “secondary substrate” here means the reaction product which arises when the primary substrate is subjected to the action of a fructosyl transferase enzyme preparation, as defined here.

Teile und Prozentangaben: Parts and percentages:

In der vorliegenden Beschreibung sind alle Teile Gewichtsteile und alle Prozentangaben Gewicht/Volumen, In the present description, all parts are parts by weight and all percentages are weight / volume,

sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist. unless expressly stated otherwise.

Hochdruckflüssigkeitschromatographische Bestimmung : High pressure liquid chromatographic determination:

Diese Bezeichnung bedeutet hier das Verfahren, in welchem Sirups gemäss der Erfindung analysiert werden unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemäss der folgenden Technik. Die Komponenten werden durch Eluierung mit Wasser aus einem Kationenaustauscherharz in Calciumform chromatographiert. Die eluierten Komponenten werden mit Hilfe eines Differential-Refraktometers festgestellt. Andere Kohlehydrate als Dextrose werden unter Verwendung eines elektronischen Integrators quantitativ bestimmt und Dextrose wird durch Bildung der Differenz erhalten. Das allgemeine Verfahren ist in «Analysis of Car-bohydrate Mixtures by Liquid Chromatography», in Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, Seiten 43 bis 46 beschrieben. Das verwendete Harz ist «Aminex Q» 15-5 in der Calciumform, von Bio-Rad Laboratories, Richmond, California. This designation here means the method in which syrups according to the invention are analyzed using high-pressure liquid chromatography according to the following technique. The components are chromatographed by elution with water from a cation exchange resin in calcium form. The eluted components are determined using a differential refractometer. Carbohydrates other than dextrose are quantitated using an electronic integrator, and dextrose is obtained by making the difference. The general procedure is described in "Analysis of Car-bohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", in Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, pages 43 to 46. The resin used is “Aminex Q” 15-5 in the calcium form, from Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Sirups, wie in Patentanspruch 1 definiert. The present invention relates to a method for producing syrups as defined in claim 1.

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10 10th

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25 25th

30 30th

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4 4th

Hierbei wird im wesentlichen Saccharose, der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzym-Präparates unterworfen, welches fähig ist, die Saccharose in ein Produkt umzuwandeln, welches eine Monosaccharidfraktion, welche im allgemeinen einen Hauptanteil an Glucose und einen geringeren Anteil an Fructose enthält, und Polysaccharide, welche im allgemeinen mindestens 66 Gewichtsprozent Fructosyl-Reste enthalten, umfasst. Diese Polysaccharide umfassen alle fruc-tosehaltigen Polymere, welche von Saccharose verschieden sind, mit zwei oder mehr Monosaccharidresten. Diese Polymere können ferner dadurch charakterisiert werden, dass sie Polysaccharide umfassen, welche Fructosylreste enthalten, die durch (2—>-l)-ß-Bindungen gebunden sind. Wie im folgenden beschrieben, können die Polysaccharide, welche aus gegebenen Bedingungen der Transfructosylierung entstehen, vorwiegend innerhalb eines vorbestimmbaren Bereiches liegt. So kann z.B. ein Substrat erzeugt werden, in welchem die meisten (z.B. mindestens 60% bezogen auf das Molverhältnis) des Polysaccharides Oligomere mit 2 bis 10 (d.h. DP 2-10), üblicherweise 3 bis 6 (d.h. DP 3-6) Monosaccharid-Resten sind. Die Glucose wird sodann durch die Einwirkung des Iso-meraseenzyms zu Fructose in Gegenwart der Polysaccharide isomerisiert, worauf die Hydrolyse der Polysaccharide in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym erfolgen kann. Die Hydrolyse kann enzymatisch durchgeführt werden unter Verwendung von Invertase oder durch saure Hydrolyse unter milden Bedingungen. Essentially sucrose is subjected to the action of a fructosyl transferase enzyme preparation which is capable of converting the sucrose into a product containing a monosaccharide fraction, which generally contains a major proportion of glucose and a minor proportion of fructose, and polysaccharides which generally contain at least 66% by weight of fructosyl residues. These polysaccharides include all fructose-containing polymers other than sucrose with two or more monosaccharide residues. These polymers can also be characterized by comprising polysaccharides that contain fructosyl residues bound by (2 -> - l) -ß bonds. As described below, the polysaccharides which result from given conditions of transfructosylation can predominantly lie within a predeterminable range. For example, producing a substrate in which most (e.g., at least 60% by molar ratio) of the polysaccharide is oligomers of 2 to 10 (i.e. DP 2-10), usually 3 to 6 (i.e. DP 3-6) monosaccharide residues. The glucose is then isomerized to fructose by the action of the isomerase enzyme in the presence of the polysaccharides, whereupon the hydrolysis of the polysaccharides can take place in the absence of active isomerase enzyme. The hydrolysis can be carried out enzymatically using invertase or by acid hydrolysis under mild conditions.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Polysaccharide im erhaltenen Produkt von der Glucose und der Fructose getrennt und anschliessend hydrolysiert werden, wie oben beschrieben, um einen Sirup mit besonders hohem Fructosegehalt zu erzeugen, z.B. mit einem Fructosegehalt von über 66 Gewichsprozent und vorzugsweise über 90 Gewichtsprozent, ohne die Notwendigkeit der Isomerisierung der Dextrose. Eine derartige Trennung kann mit Vorteil durchgeführt werden durch übliche physikalische Trennmethoden, basierend auf der Molekulargrösse, z.B. durch übliche Membrantechnologie, wie Ultrafiltration, Dialyse, Lösungsmittelausfällung, Absorption an Kohlenstoff und dergleichen. Beispiele solcher Membrantechnologien sind in den US-PS 3 173 867, Re 26097, 3 541 006 und 3 691 068 beschrieben. In a further embodiment of the present invention, the polysaccharides in the product obtained can be separated from the glucose and fructose and then hydrolyzed, as described above, to produce a syrup with a particularly high fructose content, e.g. with a fructose content of over 66% by weight and preferably over 90% by weight, without the need to isomerize the dextrose. Such separation can advantageously be carried out by conventional physical separation methods based on the molecular size, e.g. by conventional membrane technology such as ultrafiltration, dialysis, solvent precipitation, absorption on carbon and the like. Examples of such membrane technologies are described in U.S. Patent Nos. 3,173,867, Re 26097, 3,541,006 and 3,691,068.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren für die Herstellung von Sirups mit hohem Fructosegehalt, bei welchem Saccharose der Einwirkung eines Fructosyl-Transfe-rase-Enzympräparates unterworfen wird, wie es z.B. von Pullularia pullulans, wie ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 und ATCC 15 223 gewonnen wird. Das resultierende Produkt oder sekundäre Substrat kann der Einwirkung von Isomeraseenzym unterworfen werden. Anschliessend kann das isome-risierte Produkt in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden. A preferred embodiment is a process for the production of high fructose syrups in which sucrose is subjected to the action of a fructosyltransferase enzyme preparation, e.g. from Pullularia pullulans, such as ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 and ATCC 15 223. The resulting product or secondary substrate can be exposed to isomerase enzyme. The isomerized product can then be hydrolyzed in the absence of active isomerase enzyme.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugte Substrat wird als neu betrachtet. Dieses Substrat ist hervorragend geeignet für die Isomerisierung und die Hydrolyse zur Erzeugung eines Sirups, welcher mehr als 55% Fructose enthält, und wird hergestellt, indem Saccharose der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzympräparates unterworfen wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher erfindungsgemäss erhaltene Substrate, welche geeignet sind für die enzymatische Isomerisierung und anschliessende Hydrolyse zu Sirups, welche mehr als 55% Fructosesirup enthalten, welche Substrate (1) etwa 20 bis 60 Gewichsprozent Monosaccharide, die einen Hauptanteil an Glucose und einen geringeren Anteil an Fructose enthalten, und (2) etwa 70 bis 40% Polysaccharide, welche mehr als 55 Gewichtsprozent Fructosylreste enthalten, umfassen. The substrate produced by the method according to the invention is considered to be new. This substrate is excellent for isomerization and hydrolysis to produce a syrup containing more than 55% fructose and is made by subjecting sucrose to the action of a fructosyl transferase enzyme preparation. The present invention therefore furthermore relates to substrates obtained according to the invention which are suitable for the enzymatic isomerization and subsequent hydrolysis to give syrups which contain more than 55% fructose syrup, which substrates (1) contain about 20 to 60% by weight of monosaccharides which contain a major proportion of glucose and contain a lower proportion of fructose, and (2) comprise about 70 to 40% polysaccharides containing more than 55% by weight fructosyl residues.

Besonders bevorzugt sind sekundäre Substrate, welche durch Transfructosylierung von Saccharose in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Fructosyl-Transferase-Enzym-präparates erhalten wurden, welches aus einem Stamm von Pullularia pullulans ATCC 9348 bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25 bis 65 °C und vorzugsweise von etwa 50 bis 60 °C, und bei einem pH von etwa 4,5 bis 6,5 und vorzugsweise etwa 5,4 bis 5,6 gewonnen wurde. Die Konzentrationen der verwendeten Ausgangssaccharose können bis hinunter auf 10 g pro 100 ml Wasser betragen. Vorzugsweise wird jedoch eine möglichst hohe Trockensubstanzkonzentration verwendet, vorzugsweise zwischen etwa 30 g bis etwa 60 g pro 100 ml (für maximale Reaktionsgeschwindigkeit) bis zum Sättigungspunkt der Saccharose (und höher, wie im folgenden beschrieben). Secondary substrates which are obtained by transfructosylating sucrose in the presence of an effective amount of a fructosyl transferase enzyme preparation, which is obtained from a strain of Pullularia pullulans ATCC 9348 at a temperature in the range from about 25 to 65 ° C. and preferably, are particularly preferred from about 50 to 60 ° C, and at a pH of about 4.5 to 6.5 and preferably about 5.4 to 5.6. The concentrations of the starting sucrose used can be down to 10 g per 100 ml of water. Preferably, however, the highest possible dry matter concentration is used, preferably between about 30 g to about 60 g per 100 ml (for maximum reaction rate) up to the saturation point of the sucrose (and higher, as described below).

Ein Minimum von 0,5 Einheiten Fructosyl-Transferase pro Gramm Saccharose kann verwendet werden, um das neue erfindungsgemässe Substrat zu erzeugen. Im allgemeinen beträgt die Menge an verwendetem Enzym nicht mehr als 50 Einheiten pro Gramm Saccharose aus ökonomischen Überlegungen. Besonders bevorzugt zur Erzielung des gewünschten sekundären Substrates in wirtschaftlich annehmbarer Zeit und innerhalb der oben beschriebenen Verfahrensparameter ist im Bereich von etwa 2 bis etwa 30 Einheiten pro Gramm Saccharose. A minimum of 0.5 units of fructosyl transferase per gram of sucrose can be used to produce the new substrate of the invention. In general, the amount of enzyme used is not more than 50 units per gram of sucrose for economic reasons. Particularly preferred for achieving the desired secondary substrate in an economically acceptable time and within the process parameters described above is in the range from about 2 to about 30 units per gram of sucrose.

Das Verfahren zur Herstellung der neuen Fructosyl-Transferase kann bekannte Fermentationstechniken verwenden, z.B. diejenigen, welche in den US-PS 3 565 756, 3 806 419,3 535 123, sowie im Artikel von S. Ueda et al., im «Applied microbiology», 11,211-215 (1963) beschrieben sind. Vorzugsweise werden gewisse neue Trenn- oder Reinigungsschritte, welche im folgenden näher beschrieben werden, angewandt. Die folgenden Präparation beschreibt ein typisches Fermentationsverfahren für die Erzeugung des Enzyms aus Pullularia pullulans ATCC 9348. The process for producing the new fructosyl transferase can use known fermentation techniques, e.g. those described in U.S. Patent Nos. 3,565,756, 3,806,419.3,535,123 and the article by S. Ueda et al. in Applied Microbiology, 11,211-215 (1963). Certain new separation or purification steps, which are described in more detail below, are preferably used. The following preparation describes a typical fermentation process for the production of the enzyme from Pullularia pullulans ATCC 9348.

Präparation preparation

Erzeugung von Fructoxyl-Transferase-Enzym Herstellung Celit-Träger Generation of Fructoxyl Transferase Enzyme Production of Celite Carrier

A) Das zur Erzeugung des Enzyms verwendete Fermentationsverfahren A) The fermentation process used to produce the enzyme

Das Medium, welches zur Entwicklung des Inoculums und zur Fermentation zwecks Erzeugung des Enzyms verwendet wurde, ist das folgende: The medium used to develop the inoculum and fermentation to produce the enzyme is as follows:

0,5% Dibasisches Kaliumphosphat 0,1% Natriumchlorid 0,02% Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,06% Diammoniumsulfat 0,3% Hefeextrakt (Difco Laboratories) 7,5% Saccharose (Nahrungsmittelqualität) 0.5% dibasic potassium phosphate 0.1% sodium chloride 0.02% magnesium sulfate heptahydrate 0.06% diammonium sulfate 0.3% yeast extract (Difco Laboratories) 7.5% sucrose (food grade)

pH des Mediums eingestellt auf 6,8. pH of the medium adjusted to 6.8.

Die Impfflaschen, 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, welche 100 ml sterilisiertes Medium enthielten, wurden mit Pullularia pullulans aus einer Schrägkultur beimpft. Der besondere Stamm der Hefe, welche verwendet wurde, ist im Katalog der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) als ATCC 9348 bezeichnet. Die Impfflaschen-Inhalte werden nach der Entwicklung auf einer Schüttelmaschine während 48 Stunden bei 32 ° C verwendet, um einlitrige Erlenmeyer-Fer-mentationskolben zu impfen, welche je 200 ml des oben genannten Mediums enthalten. Die verwendete Konzentration an Inoculum beträgt 0,5% (Gewicht/Volumen). Die Fermentation wird auf einer Schüttelmaschine bei 32 °C während 7 Tagen durchgeführt. The inoculation bottles, 500 ml Erlenmeyer flasks, which contained 100 ml of sterilized medium, were inoculated with Pullularia pullulans from a slant culture. The particular strain of yeast that was used is designated ATCC 9348 in the American Type Culture Collection catalog (Rockville, Maryland). The contents of the vaccination bottle are used after development on a shaker for 48 hours at 32 ° C. to inoculate single-liter Erlenmeyer fermentation flasks, each containing 200 ml of the above-mentioned medium. The concentration of inoculum used is 0.5% (weight / volume). The fermentation is carried out on a shaker at 32 ° C for 7 days.

B) Gewinnung des Enzyms aus der Fermentierbrühe B) Obtaining the enzyme from the fermentation broth

Die Fermentierbrühen aus 40 Einliter-Schüttelkolben wurden vereint und die Kolben mit Wasser gespült, welches The fermentation broths from 40 one-liter shake flasks were combined and the flasks were rinsed with water, which

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

648 059 648 059

ebenfalls zu den vereinten Brühen zugesetzt wird. Das Endvolumen der Brühe nach der Verdünnung beträgt 12 Liter. Das ursprüngliche Volumen der Brühe beträgt etwa 8 Liter. Die 12 Liter Fermentationsbrühe werden durch eine kontinuierliche Sharples-Zentrifuge geleitet, um die Hefezellen und die Zellbruchstücke zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit, welche eine schwarze viskose Lösung darstellt, wird sodann mit Calciumchlorid auf eine Konzentration von 0,5% Gewicht/ Volumen dosiert, und das pH der erhaltenen Lösung mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Ein zweiter Durchgang durch die Sharples-Zentrifuge wird sodann durchgeführt, um eine viskose überstehende Flüssigkeit zu erzeugen, welche nicht stark gefärbt ist. Das pH der entfärbten überstehenden Lösung wird mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf 1000 Einheiten (wie in der US-PS 3 806 419 definiert) Pullulanase zugesetzt wird. Die erhaltene Brühe wird mit Toluol, welches bis zur Sättigung zugesetzt wird, konserviert, und die Pullulanase bei Zimmertemperatur über Nacht reagieren gelassen. Nach der Digestion mit Pullulanase über Nacht wurde eine l%ige Konzentration an Grefco Nr. 503 Celite (Johns-Man-ville Products Corporation, Lompoc, California) in der Brühe aufgeschlämmt, gefolgt vom Zusatz von 2 Volumen (24 Liter) Aceton. Es bildet sich ein Niederschlag, weicher durch Filtration gewonnen wird, und der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der gesammelte Filterkuchen enthält das insolubilisierte Fructosyl-Transferase-Enzym. is also added to the combined broths. The final volume of the broth after dilution is 12 liters. The original volume of the broth is about 8 liters. The 12 liter fermentation broth is passed through a continuous Sharples centrifuge to remove the yeast cells and cell debris. The supernatant liquid, which is a black viscous solution, is then dosed with calcium chloride to a concentration of 0.5% weight / volume, and the pH of the solution obtained is adjusted to 7.0 with sodium hydroxide. A second pass through the Sharples centrifuge is then performed to produce a viscous supernatant which is not strongly colored. The pH of the decolorized supernatant solution is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid, after which 1000 units (as defined in US Pat. No. 3,806,419) are added to pullulanase. The broth obtained is preserved with toluene, which is added until it is saturated, and the pullulanase is left to react at room temperature overnight. After overnight pullulanase digestion, a 1% concentration of Grefco No. 503 Celite (Johns-Manville Products Corporation, Lompoc, California) was slurried in the broth, followed by the addition of 2 volumes (24 liters) of acetone. A precipitate forms, which is obtained by filtration, and the filter cake is washed with acetone and dried at room temperature. The collected filter cake contains the insolubilized fructosyl transferase enzyme.

In Beispiel 1 ist zu beachten, dass der Zusatz von Calciumchlorid zur Fermentationsbrühe unter Einstellung des pH der Brühe zur Entfernung des schwarzen Pigmentes und der vorhandenen sauren Polysaccharide führt. Für nähere Einzelheiten über diese sauren Polysaccharide wird auf Acta. Chem. Scand. 16, 615-622 (1962) verwiesen. Das Enzym-Endprodukt wird dadurch zu einem verhältnismässig reinen, farblosen Präparat. Dieses Raffinierverfahren stellt eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Methode dar und ermöglicht es, mit einfachen Raffinierungsoperationen, d.h. Zentrifugie-ren, Filtrieren oder Ausfällen, das Endprodukt zu erhalten. Gemäss dieser Ausführungsform wird daher ein Verfahren zum Abtrennen von sauren Polysacchariden und schwarzen Pigment-Nebenprodukten aus den Endfermentationsbrühen der Hefe Pullularia pullulans geliefert. Dieses Verfahren macht ein Endenzympräparat frei von unerwünschtem Pigment- und sauren Polysaccharid-Nebenprodukten, welche während der Fermentation gebildet werden. Diese Nebenprodukte werden zusammen mit dem Enzym bei dem Zusatz des Lösungsmittels zur Fermentationsbrühe ausgefällt, wenn sie nicht entfernt werden. In Example 1 it should be noted that the addition of calcium chloride to the fermentation broth while adjusting the pH of the broth leads to the removal of the black pigment and the acidic polysaccharides present. For more details on these acidic polysaccharides, see Acta. Chem. Scand. 16, 615-622 (1962). The end product of the enzyme thus becomes a relatively pure, colorless preparation. This refining process is a preferred embodiment of the present method and enables simple refining operations, i.e. Centrifuge, filter or precipitate to get the final product. According to this embodiment, therefore, a method for separating acidic polysaccharides and black pigment by-products from the final fermentation broths of the yeast Pullularia pullulans is provided. This process renders an end enzyme preparation free from undesirable pigment and acidic polysaccharide by-products that are formed during fermentation. These by-products are precipitated together with the enzyme when the solvent is added to the fermentation broth if they are not removed.

Als weiterer Raffinierungsschritt zur Gewinnung gereinigter Enzympräparate gemäss der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, das Pullulan-Polysaccharid, welches inherent in der Fermentationsbrühe zugegen ist, zu entfernen, weil auch dieses Produkt beim Zusatz von Lösungsmittel zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Fructosyl-Transferase-Enzym ausfällt. Die aus der Calciumchloridbehandlung und der pH-Einstellung erhaltene überstehende Flüssigkeit kann daher weiter mit dem bekannten hydrolysierenden Enzym Pullulanase behandelt werden. Pullulanase-Enzym hydrolysiert das Pullulan unter Bildung eines Polymers mit niederem Molekulargewicht, wodurch die Kopräzipitation und entsprechende Verunreinigung des Fructosyl-Transferase-Enzymprä-parates während der Lösungsmittelbehandlung (z.B. Aceton, Alkohol und dergleichen) verhindert wird. Die Reinigung des gewünschten Fructosyl-Transferase-Enzyms auf diese Weise ist ebenfalls neu. As a further refining step for obtaining purified enzyme preparations according to the present invention, it is desirable to remove the pullulan polysaccharide, which is inherently present in the fermentation broth, because this product also precipitates together with the fructosyl transferase enzyme when solvent is added to the fermentation broth . The supernatant liquid obtained from the calcium chloride treatment and the pH adjustment can therefore be further treated with the known hydrolyzing enzyme pullulanase. Pullulanase enzyme hydrolyzes the pullulan to form a low molecular weight polymer, thereby preventing coprecipitation and corresponding contamination of the fructosyl transferase enzyme preparation during solvent treatment (e.g. acetone, alcohol, and the like). The purification of the desired fructosyl transferase enzyme in this way is also new.

Die erhaltenen Fructosyl-Transferase-Enzympräparate können ohne Entfernung des Pullulans verwendet werden. Das vorliegende Herstellungsverfahren kann daher durchgeführt werden ohne Hydrolyse des Pullulans mittels Pullulanase, in welchem Fall Pullulan als Träger für das Fructosyl-Transferase-Enzym dient. The fructosyl transferase enzyme preparations obtained can be used without removing the pullulan. The present production process can therefore be carried out without hydrolysis of the pullulan by means of pullulanase, in which case pullulan serves as a carrier for the fructosyl transferase enzyme.

Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung von Pullulan als Träger. The following example shows the use of Pullulan as a carrier.

Beispiel 1 example 1

Herstellung von sekundärem Substrat unter Verwendung von Fructosyl-Transferase-Enzym auf Pullulan-Träger Production of secondary substrate using fructosyl transferase enzyme on pullulan carrier

Eine 20%ige Saccharose-Lösung, welche mit 0,05 M Citrat-Puffer vom pH 5,5 gepuffert ist, wird mit einer l%igen Konzentration an trockenem Pullulan versehen, welches gemäss dem Verfahren der Präparation hergestellt wurde, wobei jedoch das Pullulan nicht mit Pullulanase hydrolysiert wurde und daher als Träger dient und kein «Celit» verwendet wurde. Die Fructosyl-Transferase-Aktivität beträgt 677 Einheiten/Gramm Pullulan. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt, bis das Gemisch trüb wird. Eine Probe dieses Materials wird durch Hochdruckflüssigkeits-Chroma-tographie analysiert und ergibt folgende Resultate: A 20% sucrose solution, which is buffered with 0.05 M citrate buffer of pH 5.5, is provided with a 1% concentration of dry pullulan, which was prepared according to the method of preparation, but with the pullulan was not hydrolyzed with pullulanase and therefore serves as a carrier and no «Celit» was used. The fructosyl transferase activity is 677 units / gram pullulan. The reaction is carried out at room temperature until the mixture becomes cloudy. A sample of this material is analyzed by high pressure liquid chromatography and gives the following results:

Saccharid-Verteilung durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie-Analyse Saccharide distribution by high pressure liquid chromatography analysis

Fructose Fructose

Dextrose dpz Dextrose dpz

DP3 dp4+ DP3 dp4 +

6,9 6.9

40,6 40.6

6,2 6.2

11,1 35,2 11.1 35.2

Die folgenden Beispiele liefern weitere Einzelheiten über das in der Präparation erzeugte Enzym. The following examples provide further details about the enzyme produced in the preparation.

Beispiel 2 Example 2

Produkte mit enzymatischer Wirkung und Wärmestabilität des Enzyms Products with an enzymatic effect and heat stability of the enzyme

In Reaktionsflaschen, welche mit Schraubenverschlüssen ausgerüstet sind, werden 60 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität und ein Fructosyl-Transferase-Enzympräparat zugesetzt. Das Enzympräparat wird aus dem in der Präparation hergestellten Enzymprodukt durch Dispergieren geeigneter aliquoter Teile des festen Celit-Enzymproduktes in abgemessenen Mengen Wasser unter Bildung einer Enzymlösung von geeigneter Konzentration erhalten. Das Celit wird sodann durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird verwendet, um das Reaktionsgemisch mit 10, 20 bzw. 30 Einheiten Enzym pro Gramm Saccharosesubstrat zu versehen. Diese Gemische werden sodann jedes bis zu einem Endvolumen von 100 ml mit Wasser verdünnt. Die Umwandlungen erfolgen während 66 Stunden bei pH 5,5 und einer Temperatur von 55 bzw. 60 °C. Proben werden nach 24, 43 und 66 Stunden entnommen, um den reduzierenden Zucker zu bestimmen und die Gegenwart der enzymatischen Aktivität zu bestätigen. Nach der Durchführung der Bestimmung des reduzierenden Zuckers in den Proben werden die verbleibenden Reaktionsgemische gefroren, um die enzymatische Wirkung zu unterbrechen und die Proben der Bestimmung der Kohlehydratzusammensetzung durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatogra-phie unterworfen. Die folgenden Resultate wurden erhalten: In reaction bottles equipped with screw caps, 60 g of food grade sucrose and a fructosyl transferase enzyme preparation are added. The enzyme preparation is obtained from the enzyme product prepared in the preparation by dispersing suitable aliquots of the solid celite enzyme product in measured amounts of water to form an enzyme solution of a suitable concentration. The celite is then removed by filtration. The filtrate is used to provide the reaction mixture with 10, 20 and 30 units of enzyme per gram of sucrose substrate. These mixtures are then each diluted to a final volume of 100 ml with water. The conversions take place at pH 5.5 and a temperature of 55 or 60 ° C. for 66 hours. Samples are taken after 24, 43 and 66 hours to determine the reducing sugar and to confirm the presence of the enzymatic activity. After the determination of the reducing sugar in the samples has been carried out, the remaining reaction mixtures are frozen in order to interrupt the enzymatic action and the samples are subjected to the determination of the carbohydrate composition by high pressure liquid chromatography. The following results were obtained:

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

648 059 6 648 059 6

Bestimmung des reduzierenden Zuckers1 Determination of reducing sugar 1

Temperatur Einheiten reduzierender Zucker pH reduzierender Zucker pH reduzierender Zucker Temperature units reducing sugar pH reducing sugar pH reducing sugar

°C Enzym2 mg/ml 24 Stunden (mg/ml 43 Stunden mg/ml 66 Stunden ° C Enzyme 2 mg / ml 24 hours (mg / ml 43 hours mg / ml 66 hours

0 0

- -

5,80 5.80

- -

5,80 5.80

- -

10 10th

191 191

5,40 5.40

231 231

5,25 5.25

268 268

20 20th

192 192

5,40 5.40

270 270

5,25 5.25

301 301

30 30th

246 246

5,35 5.35

334 334

5,15 5.15

390 390

0 0

0,7 0.7

5,75 5.75

1,5 1.5

5,80 5.80

2,1 2.1

10 10th

200 200

5,10 5.10

243 243

4,70 4.70

270 270

20 20th

219 219

5,15 5.15

288 288

4,90 4.90

346 346

30 30th

282 282

5,20 5.20

360 360

4,95 4.95

420 420

1 Verwendete Methode ist unter der Definition der Fructosyl-Transferase-Einheit beschrieben. 1 The method used is described under the definition of the fructosyl transferase unit.

2 Einheiten Enzym pro Gramm Saccharose. 2 units of enzyme per gram of sucrose.

Kohlehydrat-Zusammensetzung bestimmt durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie-Analyse Carbohydrate composition determined by high pressure liquid chromatography analysis

Reaktionstemperatur 55 °C Reaction temperature 55 ° C

Enzym-Dosis Enzyme dose

Reaktionszeit reaction time

Dextrose Dextrose

Lävulose dp: Levulose dp:

dpi dp4+ dpi dp4 +

Einheit g Saccharose Unit g of sucrose

Stunden Hours

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

10 10th

24 24th

31,7 31.7

2,3 2.3

10,0 10.0

25,0 25.0

31,0 31.0

43 43

34,5 34.5

3,2 3.2

9,4 9.4

17,9 17.9

35,0 35.0

66 66

36,7 36.7

3,9 3.9

8,6 8.6

15,0 15.0

35,8 35.8

20 20th

24 24th

33,9 33.9

2,8 2.8

8,8 8.8

19,7 19.7

34,8 34.8

43 43

37,4 37.4

4,2 4.2

7,9 7.9

12,1 12.1

38,4 38.4

66 66

40,5 40.5

4,9 4.9

7,4 7.4

10,8 10.8

36,4 36.4

30 30th

24 24th

37,4 37.4

4,0 4.0

7,1 7.1

12,5 12.5

39,0 39.0

43 43

41,8 41.8

5,9 5.9

6,8 6.8

11,4 11.4

34,1 34.1

66 66

46,1 46.1

7,5 7.5

7,0 7.0

11,5 11.5

27,9 27.9

Reaktionstemperatur 60 °C Reaction temperature 60 ° C

Enzym-Dosis Enzyme dose

Reaktionszeit reaction time

Dextrose Dextrose

Lävulose dp2 Levulose dp2

dpa dp4+ dpa dp4 +

Einheit/g Saccharose Unit / g sucrose

Stunden Hours

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

(%) (%)

10 10th

24 24th

32,2 32.2

2,8 2.8

6,1 6.1

24,3 24.3

30,6 30.6

43 43

35,0 35.0

4,0 4.0

9,8 9.8

18,2 18.2

33,0 33.0

66 66

36,7 36.7

5,4 5.4

9,4 9.4

16,0 16.0

32,5 32.5

20 20th

24 24th

35,5 35.5

3,8 3.8

8,4 8.4

17,1 17.1

35,2 35.2

43 43

38,4 38.4

5,0 5.0

8,0 8.0

12,3 12.3

36,3 36.3

66 66

41,3 41.3

6,6 6.6

7,9 7.9

11,1 11.1

33,1 33.1

30 30th

24 24th

39,0 39.0

5,5 5.5

7,1 7.1

12,1 12.1

36,3 36.3

43 43

43,7 43.7

7,1 7.1

7,3 7.3

11,0 11.0

30,9 30.9

66 66

47,8 47.8

9,2 9.2

7,4 7.4

11,1 11.1

34,5 34.5

Funktionalität des Enzyms in Gegenwart von hohen Glucose-55 konzentrationen. Functionality of the enzyme in the presence of high glucose 55 concentrations.

Versuch 1 Trial 1

Wirkung der Temperatur auf die Enzym-Aktivität Effect of temperature on enzyme activity

Die Wirkung der Temperatur auf die Reaktionsgeschwin-60 digkeit von Fructosyl-Transferase-Enzym wird bestimmt unter Anwendung des «Technicon Autoanalyzer II» wie folgt: The effect of temperature on the reaction rate of fructosyl transferase enzyme is determined using the "Technicon Autoanalyzer II" as follows:

Das Reaktionsgemisch besteht aus 7,5 ml 80%iger (Gewicht/Volumen) Saccharoselösung, 2,3 ml eines 0,1 M 65 Citratpuffers mit einem pH von 5,5 und 0,2 ml einer 2%igen (Gewicht/Volumen) Pullulan-Enzym-Lösung (Enzympräparat aus Beispiel 1). Die Endsaccharosekonzentration beträgt 60% (Gewicht/Volumen). Die Proben werden bei den folgenDie folgenden Versuche zeigen die Wärmestabilität in Gegenwart von Substrat des Enzyms bei 55 und 60 °C über eine Periode von 66 Stunden bei einem pH von 5,5, wodurch das wirtschaftliche Potential des Enzyms dargelegt wird. Ausserdem wird das sekundäre Substrat, welches durch die enzymatische Umwandlung von Saccharose mit dem neuen Fruc-tosyl-Transferase-Präparat durch die Kohlehydrat-Analyse als potentiell wertvolles Produkt bestätigt, welches für die Herstellung von Sirups mit vollem Fructose-Gehalt aus Saccharose geeignet ist, weil nachgewiesen wird, dass die vorherrschenden Bestandteile Dextrose und Polymere sind, welche bei einer folgenden Hydrolyse Fructose als vorherrschendes Monosaccharid ergeben. Diese Versuche zeigen auch, dass das neue Enzym in einer Saccharose-Konzentration von 60% (Gewicht/Volumen) wirksam ist. Sie zeigen ferner die The reaction mixture consists of 7.5 ml 80% (weight / volume) sucrose solution, 2.3 ml of a 0.1 M 65 citrate buffer with a pH of 5.5 and 0.2 ml of a 2% (weight / volume) Pullulan enzyme solution (enzyme preparation from Example 1). The final sucrose concentration is 60% (weight / volume). The following experiments show the thermal stability in the presence of the substrate of the enzyme at 55 and 60 ° C over a period of 66 hours at a pH of 5.5, thereby demonstrating the economic potential of the enzyme. In addition, the secondary substrate, which is confirmed by the enzymatic conversion of sucrose with the new fructosyl transferase preparation by the carbohydrate analysis as a potentially valuable product, which is suitable for the production of syrups with full fructose content from sucrose, because it is demonstrated that the predominant constituents are dextrose and polymers, which give fructose as the predominant monosaccharide in a subsequent hydrolysis. These experiments also show that the new enzyme is effective in a sucrose concentration of 60% (weight / volume). They also show the

7 7

648 059 648 059

den Temperaturen gehalten und während 10 Minuten auf dem «Technicon Autoanalyzer II» untersucht. Die Resultate zeigen, dass die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit bei 40 °C, 1,89 mal so gross ist wie bei 30 °C; bei 50 °C 1,29 mal grösser als bei 40 °C und bei 60 °C 1,48 mal grösser als bei 50 °C. Dies beweist eine zunehmende Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Temperatur. kept at temperatures and examined on the «Technicon Autoanalyzer II» for 10 minutes. The results show that the enzymatic reaction rate at 40 ° C is 1.89 times that at 30 ° C; at 50 ° C 1.29 times larger than at 40 ° C and at 60 ° C 1.48 times larger than at 50 ° C. This proves an increasing reaction rate with increasing temperature.

Versuch 2 Trial 2

Nachweis der Michaelis-Menten-Kontante (Km) des Fructo-syl-Transferase-Enzyms Detection of the Michaelis-Menten constant (Km) of the fructosyl transferase enzyme

Die Km eines Enzyms gibt die Substratkonzentration an, bei welcher die Geschwindigkeit der Bildung des Produktes die Hälfte von Vraax beträgt. Das folgende Verfahren wurde verwendet, um die Km des Fructosyl-Transferase-Enzyms zu erhalten. The Km of an enzyme indicates the substrate concentration at which the rate of product formation is half of Vraax. The following procedure was used to obtain the Km of the fructosyl transferase enzyme.

Unter Verwendung einer 90%igen (Gewicht/Volumen) Saccharose-Stammlösung, welche mit 0,1 Citratpuffer auf pH 5,5 eingestellt war, wurden die richtigen Konzentrationen an Saccharose in 9,8 ml aliquoten Teilen zubereitet, um zu ergeben: 5, 10,30,40, 50, 60 und 70%ige Konzentrationen an Saccharose bei einem Endvolumen von 10 ml. Eine Enzymlösung von 0,2 ml, welche 1,1 Einheit Fructosyl-Transferase-Enzym enthielt, wird zu den Proben zugesetzt. Dann werden die Proben sofort bei 55 °C auf dem «Technicon Autoanalyzer II» wie zuvor beschrieben (siehe Fructosyl-Transferase-Einheit) untersucht. Ein Glucose-Standard (calibriert in ug/ml) ist als Kontrolle eingeschlossen. Using a 90% (w / v) sucrose stock solution adjusted to pH 5.5 with 0.1 citrate buffer, the correct concentrations of sucrose in 9.8 ml aliquots were prepared to give: 5, 10.30, 40, 50, 60 and 70% concentrations of sucrose at a final volume of 10 ml. A 0.2 ml enzyme solution containing 1.1 units of fructosyl transferase enzyme is added to the samples. Then the samples are examined immediately at 55 ° C on the "Technicon Autoanalyzer II" as described above (see Fructosyl Transferase Unit). A glucose standard (calibrated in µg / ml) is included as a control.

Im folgenden ist die Geschwindigkeit der Glucosebil-dung, ausgedrückt als ug/ml pro Minute bei verschiedenen Substrat-Konzentrationen unter Verwendung einer konstanten Dosis (1,1 Einheit) des Fructosyl-Transferase-Enzym-Prä-parates aus der Präparation zusammengestellt. The following is the rate of glucose formation, expressed as µg / ml per minute at various substrate concentrations using a constant dose (1.1 unit) of the fructosyl transferase enzyme preparation from the preparation.

»0 Substrat »0 substrate

[ig/ml Minuten [ig / ml minutes

Ug/ml Minuten1 Ug / ml minutes 1

5 5

8,0 8.0

8,0 8.0

10 10th

11,8 11.8

11,6 11.6

20 20th

15,7 15.7

15,2 15.2

30 30th

18,0 18.0

17,6 17.6

40 40

18,6 18.6

18,2 18.2

50 50

19,2 19.2

17,2 17.2

60 60

17,8 17.8

18,2 18.2

70 70

15,6 15.6

- -

1 Am nächsten Tag wiederholt aus einer 60%igen Saccharose-Stammlösung. 1 Repeat the next day from a 60% sucrose stock solution.

Die Km beträgt 0,27 molare Saccharose-Konzentration. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erfolgte bei einer Substrat-Konzentration von 1,374 molarer Saccharose bei pH 5,5 und bei 55 °C. The km is 0.27 molar sucrose concentration. The maximum reaction rate was at a substrate concentration of 1.374 molar sucrose at pH 5.5 and at 55 ° C.

Beispiel 3 Example 3

Herstellung und Isomerisierung von sekundärem Substrat aus Saccharose Production and isomerization of secondary substrate from sucrose

A) Herstellung des sekundären Substrates A) Preparation of the secondary substrate

Saccharose von Nahrungsmittelqualität, 600 g, wird in Wasser bis zu einem Volumen von 800 ml gelöst. Das pH dieser Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Ein trockenes Celit-Enzym-Präparat, 11 g, mit einer Aktivität von 550 Einheiten pro Gramm, hergestellt wie in der Präparation beschrieben, wird in 100 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird unter Vakuum auf einem Whatman-Fil-terpapier Nr. 1 in einem Büchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die 200 ml Filtrat werden sodann zur Saccharoselösung zugesetzt, Food grade sucrose, 600 g, is dissolved in water to a volume of 800 ml. The pH of this solution is adjusted to 5.5 with dilute hydrochloric acid. A dry Celite enzyme preparation, 11 g, with an activity of 550 units per gram, prepared as described in the preparation, is slurried in 100 ml of water. The slurry is filtered under vacuum on Whatman # 1 filter paper in a Buchner funnel. The filter cake is washed with another 100 ml of water. The 200 ml of filtrate are then added to the sucrose solution,

welche sich in einer 0,5 Gallon Flasche befindet, die mit einem Schraubverschluss versehen ist. Die Flasche wird sodann in ein Wasserbad von 58 °C gestellt und die Reaktion während 20 Stunden fortschreiten gelassen, worauf eine Probe des Reaktionsproduktes durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie untersucht wird, um die Kohlehydratzusammensetzung zu bestimmen, wobei folgende Resultate erhalten werden: which is in a 0.5 gallon bottle with a screw cap. The bottle is then placed in a 58 ° C water bath and the reaction allowed to proceed for 20 hours, after which a sample of the reaction product is examined by high pressure liquid chromatography to determine the carbohydrate composition, giving the following results:

Kohlehydrat-Zusammensetzung Fructose 2,4% Carbohydrate composition fructose 2.4%

Dextrose 32,8% Dextrose 32.8%

DPi 10,6% DPi 10.6%

DPj 22,9% DPj 22.9%

DP4+ 31,3% DP4 + 31.3%

Magnesiumchlorid wird zum verbleibenden Reaktionsprodukt (d.h. dem sekundären Substrat) bis zu einer 5 milli-molaren Konzentration zugesetzt und das pH mit verdünntem Natriumyhdroxid auf 8,4 gebracht. Magnesium chloride is added to the remaining reaction product (i.e. the secondary substrate) up to a 5 millimolar concentration and the pH is brought to 8.4 with dilute sodium hydroxide.

B) Kontinuierliche Isomerisierung des sekundären Substrates B) Continuous isomerization of the secondary substrate

Glucoseisomerase, gewonnen aus Streptomyces olivo-chromogenes ATCC 21 715 (siehe US-PS Re 29152) wird auf porösem Aluminiumoxid (ein kontrollierter Porenträger hergestellt von Corning Glass Co., Corning, New York, siehe z.B. US-PS 3 992 329) wie folgt immobilisiert: Glucose isomerase derived from Streptomyces olivo-chromogenic ATCC 21 715 (see U.S. Patent Re 29152) is on porous alumina (a controlled pore carrier manufactured by Corning Glass Co., Corning, New York, see e.g. U.S. Patent 3,992,329) as follows immobilized:

1) Der Träger wird zweimal mit Wasser gewaschen; 1) The carrier is washed twice with water;

2) der Träger wird mit 0,1 M Natriumeitrat während 1 Stunde unter Bewegung inkubiert: 2) the carrier is incubated with 0.1 M sodium citrate for 1 hour with agitation:

3) das Natriumeitrat wird vom Träger abgewaschen, bis die Leitfähigkeit der Waschlösung 1000 Mikroohms beträgt; 3) the sodium citrate is washed off the support until the conductivity of the wash solution is 1000 microohms;

4) der Träger wird mit 0,05 M Magnesiumchlorid während 1 Stunde inkubiert und die Magnesiumchloridlösung dekantiert; 4) the carrier is incubated with 0.05 M magnesium chloride for 1 hour and the magnesium chloride solution decanted;

5) ein Volumen von 0,05 M Magnesiumchlorid wird sodann zugesetzt, um eine Endenzymkonzentration von 400 Einheiten/ml zu ergeben; 5) a volume of 0.05 M magnesium chloride is then added to give a final enzyme concentration of 400 units / ml;

6) das Isomerase-Enzym-Konzentrat wird zu dem Träger in einer Menge von 14 Millionen Einheiten pro Kubikfuss zugesetzt; 6) the isomerase enzyme concentrate is added to the carrier in an amount of 14 million units per cubic foot;

7) der Träger und das Enzym werden während 22 bis 24 Stunden in Berührung gelassen und dann das ungebundene Enzym mit destilliertem Wasser vom Träger abgespült. 7) the carrier and the enzyme are left in contact for 22 to 24 hours and then the unbound enzyme is rinsed off the carrier with distilled water.

Eine mit Mantel versehene Glassäule (3x18 cm), ausgerüstet mit einer Pumpe, welche an einen Vorratsbehälter angeschlossen ist, wird sodann mit dem derart zubereiteten immobilisierten Enzym beschickt. Das Bettvolumen der Säule nach der Beschickung beträgt 45 ml. Die Säule wird bei 60 °C für alle Isomerisierungen betrieben. Die beschickte Säule wird mit einem Dextrosesirup (50% Gewicht/Gewicht Konzentration) mit 5 Millimol Magnesiumchlorid und auf pH 8,4 eingestellt, in Betrieb genommen, um zu zeigen, dass die Säule aktiv ist. Die Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule wird auf 292 ml/Stunde eingestellt. Die Säule wird sodann bis auf die Betthöhe ablaufen gelassen. Die Einführung des sekundären Substrates erfolgt von Hand bis 20 ml ausfliessende Flüssigkeit gesammelt sind, worauf die Durchflussgeschwindigkeit für das sekundäre Substrat auf 292 ml/ Stunde eingestellt wird. Die ersten 100 ml gesammelten Sirup werden verworfen, um die Änderung des Substrates zu berücksichtigen. Das verbleibende sekundäre Substrat (etwa 850 ml) wird sodann durch die Säule geführt. Nach 1 Stunde steigt die Durchflussgeschwindigkeit auf 570 ml/Stunde. Die Durchflussgeschwindigkeit wird auf 300 ml/Stunde eingestellt und bis zum Ende der Operation auf dieser Höhe gehalten. Nach vollendetem Durchfluss wird die Säule wieder mit Dextrose beschickt, um nachzuweisen, dass die Isomerase-Aktvität noch vorhanden ist. Die folgende Tabelle vergleicht die Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie-Analysen des A coated glass column (3x18 cm), equipped with a pump, which is connected to a storage container, is then charged with the immobilized enzyme prepared in this way. The bed volume of the column after loading is 45 ml. The column is operated at 60 ° C for all isomerizations. The charged column is operated with a dextrose syrup (50% w / w concentration) with 5 millimoles of magnesium chloride and adjusted to pH 8.4 to show that the column is active. The flow rate through the column is set at 292 ml / hour. The column is then allowed to drain to bed height. The secondary substrate is introduced by hand until 20 ml of outflowing liquid have been collected, whereupon the flow rate for the secondary substrate is set to 292 ml / hour. The first 100 ml of syrup collected are discarded to take account of the change in the substrate. The remaining secondary substrate (about 850 ml) is then passed through the column. After 1 hour the flow rate increases to 570 ml / hour. The flow rate is set at 300 ml / hour and maintained at this level until the end of the operation. After the flow has been completed, the column is charged with dextrose again to prove that the isomerase activity is still present. The following table compares the high pressure liquid chromatography analysis of the

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

648 059 648 059

8 8th

ausgangssekundären Substrates mit denjenigen des Endprodukes aus der Isomerisiersäule: secondary substrate with that of the end product from the isomerization column:

Sekundäres Substrat (a) Endprodukt (B) Secondary substrate (a) final product (B)

Fructose Fructose

2,4 2.4

15,7 15.7

Dextrose Dextrose

32,8 32.8

18,9 18.9

DPz DPz

10,6 10.6

11,0 11.0

DPs DPs

22,9 22.9

22,9 22.9

dp4+ dp4 +

■ 31,3 ■ 31.3

31,5 31.5

Diese Resultate zeigen, dass 42,38% der freien Dextrose im sekundären Substrat in der Säule zu Fructose isomerisiert wurde. Auch die im sekundären Substrat vorhandenen Fruc-tosepolymeren scheinen nicht betroffen zu sein oder ihrerseits die Isomerisierung von Dextrose zu Fructose zu beeinträchtigen. Es ist bemerkenswert, dass die totale Monosaccharid-Teilung aus etwa 45% Fructose und 55% Dextrose besteht. These results show that 42.38% of the free dextrose in the secondary substrate in the column was isomerized to fructose. The fructose polymers present in the secondary substrate also do not appear to be affected or in turn to impair the isomerization of dextrose to fructose. It is noteworthy that the total monosaccharide division consists of approximately 45% fructose and 55% dextrose.

Im folgenden Beispiel wurden zwei Versuche unternommen, um die im sekundären Substrat vorhandenen Polysaccharide zu spalten und auch das Isomerisationsprodukt daraus. Der eine Versuch ist enzymatischer Natur während der andere eine milde saure Hydrolyse anwendet. In the following example, two attempts were made to cleave the polysaccharides present in the secondary substrate and also the isomerization product thereof. One attempt is enzymatic in nature while the other uses mild acid hydrolysis.

Beispiel 4 Example 4

Herstellung von Sirup mit hohem Fructosegehalt durch Hydrolyse Production of high fructose syrup by hydrolysis

A) Enzymatische Hydrolyse A) Enzymatic hydrolysis

100 ml Produkt B aus Beispiel 3 werden mit 10 mg einer gereinigten Invertase, welche aus Candida utilis gewonnen wurde, vermischt. Dieses Gemisch (mit Toluol konserviert) wird über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren gelassen, worauf eine Probe entnommen und mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert wird. Das verbleibende Produkt B wird während weiteren 6 Tagen reagieren gelassen und alsdann eine zweite Probe nach demselben Verfahren untersucht, wobei die folgenden Resultate erhalten werden: 100 ml of product B from Example 3 are mixed with 10 mg of a purified invertase, which was obtained from Candida utilis. This mixture (preserved with toluene) is allowed to react overnight at room temperature, after which a sample is taken and analyzed by high pressure liquid chromatography. The remaining product B is allowed to react for an additional 6 days and then a second sample is tested using the same procedure to give the following results:

Ausgangs Output

Nach Einwir After Einwir

Nach weite To far

material kung der ren material kung the ren

(Produkt B) (Product B)

Invertase Invertase

6 Tagen 6 days

Fructose Fructose

15,7% 15.7%

41,9% 41.9%

62,4% 62.4%

Dextrose Dextrose

18,9% 18.9%

29,4% 29.4%

36,2% 36.2%

DP2 DP2

11,0% 11.0%

1,9% 1.9%

0 0

DPj DPj

22,9% 22.9%

12,9% 12.9%

0,5% 0.5%

dp4+ dp4 +

31,5% 31.5%

13,9% 13.9%

0,9% 0.9%

Die verwendete Invertase ist ein Enzympräparat, welches von der Firma Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, hergestellt wird und eine Aktivität von 123 Einheiten/mg aufweist, wobei 1 Einheit Invertase die Spaltung von Saccharose unter Bildung von 1 Mikromol Glucose und 1 Mikromol Fructose pro Minute unter den spezifizierten Bedingungen katalysiert. The invertase used is an enzyme preparation, which is manufactured by Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, and has an activity of 123 units / mg, where 1 unit invertase cleaves sucrose to form 1 micromol glucose and 1 micromole of fructose catalyzed per minute under the specified conditions.

B) Saure Hydrolyse von Produkt B B) Acid hydrolysis of product B

Die saure Hydrolyse einer Probe vom Produkt B aus Beispiel 3 wurde durch Zusatz von Schwefelsäure bis zu einer Konzentration von 0,05 N und Erhitzen auf 75 bis 80 °C durchgeführt. Proben wurden nach einer und nach zwei Stunden Hydrolyse entnommen und durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die Resultate sind die folgenden: The acid hydrolysis of a sample of product B from example 3 was carried out by adding sulfuric acid to a concentration of 0.05 N and heating to 75 to 80 ° C. Samples were taken after one and two hours of hydrolysis and analyzed by high pressure liquid chromatography. The results are as follows:

Ausgangsmaterial (Produkt B) Starting material (product B)

I Stunde I hour

2 Stunden 2 hours

Fructose Fructose

15,7 15.7

60,3 60.3

59,1 59.1

Dextrose Dextrose

18,9 18.9

38,7 38.7

37,9 37.9

DP2 DP2

11,0 11.0

1,9 1.9

2,6 2.6

DP3 DP3

22,9 22.9

0,4 0.4

0,3 0.3

dp4+ dp4 +

31,5 31.5

0 0

0,2 0.2

Die obigen Resultate in Stufe A zeigen eine vorherrschende Zunahme der Fructose und eine geringere Zunahme der Glucose-Ausbeute mit einem entsprechenden Abfall der DPa-, DP3- und DP4+-Fraktionen, wodurch die Gegenwart eines Fructosepolymers bewiesen ist. The above results in Step A show a predominant increase in fructose and a smaller increase in glucose yield with a corresponding decrease in the DPa, DP3 and DP4 + fractions, thus proving the presence of a fructose polymer.

Die Resultate aus der Säurehydrolyse in Stufe B sind in Übereinstimmung mit denjenigen aus Stufe A, so dass ebenfalls die Spaltung der Fructosepolymere nachgewiesen ist. The results from the acid hydrolysis in stage B are in agreement with those from stage A, so that the cleavage of the fructose polymers is also demonstrated.

Die obige Diskussion richtet sich auf die Transfructosylierung unter Verwendung eines primären Substrates, in welchem der Trockensubstanzgehalt der Ausgangssaccharose den Sättigungspunkt unter den gegebenen Reaktionsbedingungen nicht übersteigt. Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung eines primären Substrates mit einer anfänglichen Saccharosekonzentration oberhalb der Sättigung und welches, wenn es der Einwirkung des Fructosyl-Transferase-Enzyms unterworfen wird, zu einem Produkt führt, welches erhöhte Mengen an DP3-Material (d.h. Fructosyl-Saccharose) und eine verminderte Konzentration an DP4+-Produkten aufweist. Ferner zeigt sich eine Zunahme der Trockensubstanzkonzentration (Gewicht/Gewicht) des sekundären Substrates über die Trok-kensubstanzkonzentration, welche in Abwesenheit der Wirkung des Fructosyl-Transferase-Enzyms erhalten wird. Ausserdem wird gezeigt, dass wenn die Trockensubstanzkonzentration des primären Substrates zunimmt, der Grad an Polymerisation des Fructosepolymers im sekundären Substrat abnimmt und das DP4+-Material in kleineren Mengen vorhanden ist. The above discussion focuses on transfructosylation using a primary substrate in which the dry matter content of the starting sucrose does not exceed the saturation point under the given reaction conditions. The following example shows the use of a primary substrate with an initial sucrose concentration above saturation and which, when subjected to the action of the fructosyl transferase enzyme, results in a product which has increased amounts of DP3 material (ie fructosyl sucrose). and has a reduced concentration of DP4 + products. Furthermore, there is an increase in the dry matter concentration (weight / weight) of the secondary substrate over the dry matter concentration, which is obtained in the absence of the action of the fructosyl transferase enzyme. It is also shown that as the dry matter concentration of the primary substrate increases, the degree of polymerization of the fructose polymer in the secondary substrate decreases and the DP4 + material is present in smaller amounts.

Dies steht in deutlichem Widerspruch zu den Resultaten, welche in den früheren Beispielen unter Erwendung von Saccharosesubstraten unterhalb der Sättigung erhalten wurde. In jenen Beispielen ist das DP4+-Material das primäre Produkt. This is in marked contradiction to the results obtained in the previous examples using sucrose substrates below saturation. In those examples, the DP4 + material is the primary product.

Beispiel 5 Example 5

Herstellung von sekundärem Substrat aus Saccharose-Auf-schlämmungen, die mehr als gesättigt sind Manufacture of secondary substrate from sucrose slurries that are more than saturated

200-g-Portionen Saccharose von Nahrungsmittelqualität werden in 1-Pint-Gläser mit Schraubdeckeln verbracht. Als Kontrolle werden 50 ml Wasser in ein Glas eingefüllt, während alle anderen je 50 ml Wasser erhalten, welches zunehmende Mengen Fructosyl-Transferase-Enzym-Celit-Präparat (hergestellt gemäss Präparation), wie in der folgenden Tabelle angeführt, enthält. Jedes Glas wird mit dem Deckel verschlossen und in ein Schüttel-Wasserbad von 54 bis 55 °C gestellt. Die Gläser werden während 24 Stunden geschüttelt unter gelegentlichem Vermischen von Hand. Eine Probe der überstehenden Flüssigkeit wird aus jedem Glas entnommen und in ein Reagensrohr mit Schraubverschluss in ein siedendes Wasserbad gestellt, um das Enzym zu inaktivieren. Diese Proben werden sodann durch Hochdruckflüssigkeits-Chromato-graphie analysiert und die Trockensubstanzbestimmungen der überstehenden Flüssigkeit nach der Methode von K. Fischer durchgeführt, wobei folgende Resultate erhalten werden: 200 g servings of food grade sucrose are placed in 1 pint jars with screw tops. As a control, 50 ml of water are poured into a glass, while everyone else receives 50 ml of water, which contains increasing amounts of fructosyl transferase enzyme celite preparation (prepared according to the preparation), as shown in the table below. Each jar is closed with the lid and placed in a shaking water bath at 54 to 55 ° C. The jars are shaken for 24 hours with occasional hand mixing. A sample of the supernatant liquid is taken from each glass and placed in a screw-top test tube in a boiling water bath to inactivate the enzyme. These samples are then analyzed by high pressure liquid chromatography and the dry matter determination of the supernatant liquid is carried out according to the method of K. Fischer, the following results being obtained:

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

648 059 648 059

Flasche Nr. Bottle no.

Saccharose (g) Sucrose (g)

Einzym-einheiten1 Unit Units 1

Trockensubstanz in Dry matter in

Überstehendem Protruding

(Gew./Gew.) (W / w)

Zusammensetzung der Kohlehydrate in Lösung gemäss Hochdruckfliissigkeits-Chromatographie (%) Composition of carbohydrates in solution according to high pressure liquid chromatography (%)

Fructose Dextrose Fructose dextrose

DP2 DP2

DP3 DP3

DP, DP,

4+ 4+

1 1

200 200

100 100

74,5 74.5

0,6 0.6

9,6 9.6

80,9 80.9

8,9 8.9

ND2 ND2

2 2nd

200 200

200 200

75,6 75.6

0,7 0.7

12,7 12.7

72,2 72.2

13,7 13.7

0,7 0.7

3 3rd

200 200

300 300

76,3 76.3

1,0 1.0

14,5 14.5

66,8 66.8

16,6 16.6

1,1 1.1

4 4th

200 200

400 400

77,1 77.1

0,9 0.9

15,7 15.7

62,6 62.6

19,0 19.0

1,8 1.8

5 5

200 200

500 500

77,7 77.7

1,1 1.1

17,3 17.3

58,5 58.5

21,0 21.0

2,1 2.1

6 6

200 200

600 600

78,1 78.1

1,3 1.3

18,0 18.0

56,0 56.0

21,9 21.9

2,8 2.8

7 7

200 200

700 700

78,1 78.1

1,1 1.1

18,8 18.8

53,9 53.9

23,1 23.1

3,0 3.0

8 8th

200 200

800 800

80,0 80.0

1,0 1.0

19,3 19.3

52,2 52.2

24,1 24.1

3,4 3.4

9 9

200 200

900 900

79,0 79.0

1,3 1.3

19,9 19.9

50,0 50.0

25,0 25.0

3,7 3.7

10 10th

200 200

1000 1000

79,6 79.6

1,3 1.3

20,6 20.6

48,6 48.6

25,4 25.4

4,1 4.1

Kontr. Control

200 200

keine no

72,7 72.7

0,3 0.3

ND2 ND2

99,7 99.7

ND2 ND2

ND2 ND2

1 = Totale Einheiten an Fructosyl-Transferase-Enzym in 50 ml Wasser 1 = Total units of fructosyl transferase enzyme in 50 ml of water

2 «none detected» — keines festgestellt 2 «none detected» - none detected

Es ist bemerkenswert, dass im obigen Beispiel die Kontrolle kristallisierte, wenn sie auf Zimmertemperatur (etwa 25 °C) gekühlt wurde, während die enzymatisch erzeugten sekundären Substrate in Lösung verblieben und ausgezeich- 25 nete Lagerstabilität ohne Kristallisation aufwiesen. It is noteworthy that in the above example, the control crystallized when cooled to room temperature (about 25 ° C), while the enzymatically generated secondary substrates remained in solution and had excellent storage stability without crystallization.

Obwohl Beispiel 5 200 g Saccharose pro 50 ml Wasser, d.h. 80% Gewicht/Gewicht, verwendet, kann die Trockensubstanzkonzentration des Saccharose-Ausgangsmaterials erhöht werden. 30 Although Example 5 contains 200 g sucrose per 50 ml water, i.e. 80% w / w, the dry matter concentration of the sucrose starting material can be increased. 30th

Das neue sekundäre Substrat gemäss dieser Ausführungsform kann als hochstabiler, nicht-kristallisierender Sirup für Nahrungsmittelanwendungen verwendet werden. Es ergibt ferner eine Zusammensetzung mit einmalig hohem Trockensubstanzgehalt, welche beständig ist gegen Mikrobenbefall 35 und Farbkörperbildung, welche verwendet werden kann, um den Zucker in bisher nicht-erzielbaren Konzentrationen in einer Form, welche die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, zu transportieren und/oder zu lagern. Dieses neue sekundäre Substrat mit hohem Trockensubstanzgehalt kann 40 ausserdem der Hydrolyse unterworfen werden, wie in Beispiel 4 gezeigt, um ein Invertzuckergemisch zu erzielen, welches eine wünschenswerte Süssigkeit aufweist. Das neue sekundäre Substrat gemäss der vorliegenden Erfindung weist einen Trockensubstanzgehalt (Gewicht/Gewicht) im Bereich 45 von etwa 70% bis etwa 82% auf und enthält eine Monosaccha-ridfraktion, welche im wesentlichen aus Dextrose und Poly- The new secondary substrate according to this embodiment can be used as a highly stable, non-crystallizing syrup for food applications. It also results in a composition with a uniquely high dry matter content, which is resistant to microbial attack and color formation, which can be used to transport and / or to transport the sugar in previously unattainable concentrations in a form which has the properties described above to store. This new high solids secondary substrate can also be subjected to hydrolysis, as shown in Example 4, to obtain an invert sugar mixture which has a desirable sweetness. The new secondary substrate according to the present invention has a dry matter content (weight / weight) in the range 45 of about 70% to about 82% and contains a monosaccharide fraction which consists essentially of dextrose and poly-

saccharidpolymeren besteht, im Überschuss aus dp2, bestehend vorwiegend aus DPî-Produkten. Eine kleine Menge (4,1% und weniger) DP4+-Polymere ist ebenfalls vorhanden. saccharide polymer consists, in excess, of dp2, consisting mainly of DPî products. A small amount (4.1% and less) of DP4 + polymers is also present.

Obwohl die Transfructosylierungsstufe des vorliegenden Verfahrens anhand von chargenweisen Ansätzen dargelegt wurde, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass kontinuierliche Operationen ebenfalls verwendet werden können. Bei der Durchführung solcher kontinuierlicher Transfructosy-lierungen wird das Transfructosylase-Enzym mit Vorteil immobilisiert, unter Anwendung der oben unter der Definition des immobilisierten Enzyms beschriebenen Techniken, und der darin beschriebenen kontinuierlichen Verarbeitungsmethoden. Although the transfructosylation step of the present method has been set forth in batch approaches, it will be understood by those skilled in the art that continuous operations can also be used. In carrying out such continuous transfructosylations, the transfructosylase enzyme is advantageously immobilized using the techniques described above under the definition of the immobilized enzyme and the continuous processing methods described therein.

Alle in der vorstehenden Beschreibung und in den Patentansprüchen erwähnten Mikroorganismen sind bekannt und unter der angeführten Hinterlegungs-Nummer oder im Handel erhältlich. All of the microorganisms mentioned in the above description and in the patent claims are known and are available under the deposited number or commercially.

NRRL= Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratory (ARS = NRRL), Peoria, Illinois 61604, USA. NRRL = Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratory (ARS = NRRL), Peoria, Illinois 61604, USA.

ATCC = American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. ATCC = American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

G G

Claims (15)

648 059 648 059 2 2nd PATENTANSPRÜCHE PATENT CLAIMS 1. Verfahren zur Herstellung eines Sirups, dadurch gekennzeichnet, dass Saccharose der Einwirkung einer wirksamen Menge eines Fructosyl-Transferase-Enzympräparates ausgesetzt wird, um ein Reaktionsprodukt zu bilden, welches Fructosepolysaccharid und Dextrose enthält. 1. A method of making a syrup, characterized in that sucrose is exposed to an effective amount of a fructosyl transferase enzyme preparation to form a reaction product containing fructose polysaccharide and dextrose. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose, welche der Wirkung des Enzyms ausgesetzt wird, in einer Konzentration von mindestens 20% vorliegt. 2. The method according to claim 1, characterized in that the sucrose, which is exposed to the action of the enzyme, is present in a concentration of at least 20%. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fructosyl-Transferase-Enzympräparat von Pullularia pullulans abgeleitet ist. 3. The method according to claim 1, characterized in that the fructosyl transferase enzyme preparation is derived from Pullularia pullulans. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose der Einwirkung von Fructosyl-Transferase-Enzym bei einer Temperatur von 25 bis 65 °C, einem pH von 4,6 bis 6,5 und einer anfänglichen Saccharosekonzentration von mindestens 10% (Gewicht/Volumen) ausgesetzt wird. 4. The method according to claim 1, characterized in that the sucrose from exposure to fructosyl transferase enzyme at a temperature of 25 to 65 ° C, a pH of 4.6 to 6.5 and an initial sucrose concentration of at least 10% ( Weight / volume) is exposed. 5. Verwendung des nach Patentanspruch 1 erhaltenen Sirups zur Herstellung von Fructosesirup, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose des Reaktionsproduktes isomeri-siert wird. 5. Use of the syrup obtained according to claim 1 for the production of fructose syrup, characterized in that the dextrose of the reaction product is isomerized. 6. Verwendung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung unter Verwendung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzyms durchgeführt wird. 6. Use according to claim 5, characterized in that the isomerization is carried out using an immobilized glucose isomerase enzyme. 7. Verwendung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose in Gegenwart des Polysaccharides zu Fructose isomerisiert wird. 7. Use according to claim 5, characterized in that the dextrose is isomerized to fructose in the presence of the polysaccharide. 8. Verwendung nach Patentanspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose vor der Isomerisierung physikalisch vom Polysaccharid getrennt wird. 8. Use according to claim 5 or 6, characterized in that the dextrose is physically separated from the polysaccharide before the isomerization. 9. Verwendung nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung durch Ultrafiltration erfolgt. 9. Use according to claim 8, characterized in that the separation is carried out by ultrafiltration. 10. Verwendung nach einem der Patentansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem das Polysaccharid des Reaktionsproduktes hydrolysiert wird, um Fructose zu bilden. 10. Use according to one of the claims 5 to 9, characterized in that the polysaccharide of the reaction product is also hydrolyzed to form fructose. 11. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert wird. 11. Use according to claim 10, characterized in that the polysaccharide is hydrolyzed in the absence of active isomerase enzyme. 12. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid, nach physikalischer Trennung von der Dextrose, hydrolysiert wird. 12. Use according to claim 10, characterized in that the polysaccharide, after physical separation from the dextrose, is hydrolyzed. 13. Substrat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 4, und geeignet für die enzy-matische Dextrose-Isomerisierung und Hydrolyse zu Fruc-tose-Sirups, welche mehr als 55% Fructose enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass es (1) 20 bis 60% Monosaccharid, bestehend vorwiegend aus Dextrose und Fructose, und (2) 70 bis 40% Polysaccharide, bestehend vorwiegend aus Fructosylre-sten, enthält, wobei diese Prozentangaben sich auf das Gewicht des Substrates beziehen. 13. Substrate, produced by the process according to one of claims 1 to 4, and suitable for the enzymatic dextrose isomerization and hydrolysis to fructose syrups which contain more than 55% fructose, characterized in that it (1 ) Contains 20 to 60% monosaccharide, mainly consisting of dextrose and fructose, and (2) 70 to 40% polysaccharides, mainly consisting of fructosyl residues, these percentages refer to the weight of the substrate. 14. Substrat nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid mindestens 66 Gewichtsprozent Fructosylreste enthält. 14. Substrate according to claim 13, characterized in that the polysaccharide contains at least 66 percent by weight of fructosyl residues. 15. Substrat nach Patentanspruch 13, welches einen Trok-kensubstanzgehalt (Gewicht/Gewicht) von 70 bis 82% aufweist und eine Monosaccharidfraktion enthält, welche vorwiegend aus Dextrose besteht, und eine Polysaccharidfrak-tion, welche verschieden von Saccharose ist, und vorwiegend aus einem Polysaccharid, welches ein Oligomer mit drei Monosacchariden enthält. 15. The substrate according to claim 13, which has a dry substance content (weight / weight) of 70 to 82% and contains a monosaccharide fraction, which mainly consists of dextrose, and a polysaccharide fraction, which is different from sucrose, and predominantly from one Polysaccharide, which contains an oligomer with three monosaccharides.