NO875477L - Rekombinant alveolaert overflateaktivt protein. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører feltet rekombinant protein-produksjon. Nærmere bestemt vedrører den produksjonen av forskjellige former av alveolært overflateaktivt protein (ASP) som er nyttig ved behandlingen av visse åndedrettssyk-dommer.

Den menneskelige lungen består av et stort antall små poser eller alveoler hvori gasser utveksles mellom blodet og luftrommene i lungen. Hos friske individer formidles denne utvekslingen ved hjelp av nærværet av et protein som inneholder overflateaktivt kompleks som syntetiseres i de mikrosomale membranene av type II alveolærceller. I fravær av egnede nivåer av dette komplekset kan en lunge ikke fungere riktig, dvs. alveoliene faller sammen under utånding og kan ikke deretter gjenfylles ved inhalering. Følgelig kan den manglende ubehandlede evnen til å syntetisere dette komplekset resultere i død eller i alvorlig fysisk skade.

Det best dokumenterte tilfellet av utilstrekkelige nivåer av overflateaktivt kompleks finnes i premature barn og barn født etter kompliserte svangerskap, og er velkjent som åndenøds-syndrom (EDS - respiratory distress syndrome). En velpubli-sert form for dette syndromet er betegnet hyalin-membran-sykdom eller idiopatisk RDS. RDS er i dag den viktigste årsaken til spedbarnsdødelighet og sykelighet i USA og i andre utviklede land, og betydelig innsats har vært rettet mot diagnose og behandling. Den nåværende behandlingen har vært fokusert på mekanisk (trykk) ventilasjon som i beste fall er en øyeblikkelig forholdsregel som ofte resulterer i skade på lungen og andre nedbrytende bivirkninger, innbefattende komplikasjoner så som bronkopulmonær dysplasi, intersti-tiell emfysem og pneumotorax. Mentalt tilbakeståendehet har også oppnådd I visse tilfeller når denne behandlingen har vært benyttet (Hallman, M. , et al, Pediatrlc Clinics of North America (1982) 2^:1057-1075).

Begrensede forsøk har vært gjort på å behandle syndromet ved hjelp av annet overflateaktivt middel. Dette ville være en foretrukket behandlingsfremgangsmåte i det generelt bare en administrering er påkrevet, og faren for skade er redusert. F.eks. anvendte Fujiwara, et al, Lancet (1980) 1:55, et proteinutarmet overflateaktivt preparat avledet fra bovine lunger; preparatet er effektivt, men immunogent. Hallman, M., et al, Pediatrics (1983) 71=473-482 benyttet et overflateaktivt middel • isolert fra menneskelig fostervæske for å behandle et begrenset antall spedbarn med et visst hell. US-patent nr. 4.312.860, Clements, beskriver et kunstig overflateaktivt middel som ikke inneholder protein og som angis å være nyttig ved denne fremgangsmåten selv om ingen data er angitt. Substitusjon av overflateaktivt middel har ikke vært mye anvendt klinisk.

Det foretrukne substituttet for overflateaktivt middel ville være det lungeoverflateaktive komplekset selv. Dette komplekset består av apoprotein, to fosfolipider (dipalmitoyl-fosfokolin (DPPC) og fosfatidyl-glycerol (PG)) som er tilstede i hovedmengder, flere lipidkomponenter som bare er tilstede i meget små mengder, og kalsiumioner. Apoproteinet inneholder proteiner som har molekylvekter av størrelsesorden 32 000 dalton og meget hydrofobe proteiner av størrelsesorden ca. 10 000 dalton (King, R. J. et al, Am J Phvsiol (1973) 224:788-795). Proteinet på 32 000 dalton er glykosylert og inneholder hydroksyprolin.

En hovedårsak til den begrensede fremgangen ved behandling med erstatning av det overflateaktive midlet har vært mangelen på tilgjengelighet av proteindelen av komplekset. Erstatningsbehandlinger har vært rettet mot forsøk på å anvende lipidkomponentene alene, og det synes som om virkningen av slik béhandling kan forbedres i markert grad ved tilsats av apoproteinet (Hallman, M., et al, Pediatric Clinics of North America (1982) (supra)). I dag er imidlertid flere av disse proteinene bare tilgjengelige fra normal voksen lunge, og fra fostervæske. Selv effektive isolerings-fremgangsmåter vil ikke tilveiebringe et tilstrekkelig forråd. Følgelig er det ønskelig å ha tilgjengelig en fremgangsmåte for fremstilling av praktiske mengder apoprotein for anvendelse alene eller i forbindelse med den mettede fosfolipiddelen av komplekset.

PCT-patentsøknad W086/03408, forløperen for foreliggende søknad, beskriver den rekombinante fremstillingen av det humane ASP-proteinet på ca. 32 kd, gjenvinningen av DNA-sekvenser som koder forskjellige hunde ASP-proteiner og gjenvinningen av en enkelt representant for den humane ASP-proteingruppen på ca. 10 kd molekylvekt. Det er nå klart at effektiv produksjon av "10K" -gruppen er påkrevet for anvendelse innen effektiv behandling.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå ytterligere elementer av apoproteindelen av det overflateaktive lungekomplekset i mengder og under betingelser som tillater optimalisering av dens trekk. De gjenværende komponentene av komplekset, dipalmitoylfosfatidylkolin og fosfatidylglycerol, sammen med kalsiumioner, er allerede lett tilgjengelige, på samme måte som visse elementer av ASP-gruppen beskrevet i W086/03408 (supra). Tilgjengeligheten av påkrevde mengder av de ytterligere formene av apoprotein muliggjør forskningsinnsats for å optimalisere formen av kompleks som kan anvendes ved behandling, og åpner muligheten for rutinemessig erstatningsterapi ved åndenødssyndromet.

Følgelig vedrører et trekk ved oppfinnelsen rekombinant fremstilt pattedyralveolært overflateaktivt protein (ASP) av 10K-gruppen. De relativt vannoppløselige proteinene av relativt høy molekylvekt på ca. 32 kd (32K ASP) er angitt som beskrevet ovenfor. De hydrofobe proteinene av lav molekylvekt på ca. 5-20 kd (10K ASP) er beskrevet her. Begge grupper av proteiner fremmer dannelse av overflatespennings-nedsettende filmer når de kompleksdannes med fosfolipid i nærvær av kalsiumion. Imidlertid viser in vivo-undersøkelsser at 10K-gruppen og individuelle elementer derav er dramatisk mer effektive enn 32K ASP for å oppnå og opprettholde fylling av lungene og at kombinasjonen av 10K og 32K-proteiner er synergistisk. Oppfinnelsen vedrører videre DNA-sekvenser som koder ytterligere pattedyr ASP-proteiner, ekspresjonsvektorer som er egnede for fremstilling av disse proteinene, rekombinante vertsceller transformert med disse vektorene, og fremgangsmåter for fremstilling av de rekombinante ASP'ene og deres forstadier. Ifølge andre trekk vedrører oppfinnelsen farmasøytiske preparater inneholdende humant ASP og fremgangsmåter for behandling av RDS ved anvendelse av disse.

Ifølge ytterligere trekk vedrører oppfinnelsen forbedrede fremgangsmåter for isolering av 32K ASP-proteinene og rensede bovin lOK-former. Fig. 1 viser DNA-sekvensen (sammen med den avledede aminosyresekvensen) bestemt for cDNA som koder et hunde 18 kd ASP-protein fra overlappende cDNA-kloner, som viser de overlappende pD10k-l og pD10k-4-klonene som er Identifisert. Fig. 2 viser cDNA-sekvens og avledet aminosyresekvens for

"cDNA #3" som koder humant 18 kd ASP-protein.

Fig. 3 viser DNA-sekvensen og avledet aminosyresekvens for eksondelene av den genomiske DNA som koder humant 18 kd protein. Fig. 4 viser sekvensen av oligonukleotidprober som benyttes for å isolere cDNA som koder humant 5 kd/8 kd protein. Fig. 5 viser DNA og avledet aminosyresekvens for "cDNA #18"

som koder humant 5 kd protein.

Fig. 6 viser en analog cDNA "#19" som koder humant 5 kd

protein.

Fig. 7a og 7b er resultater fra SDS PAGE uten og med endo F

enzymbehandling av ^^S-merkede proteiner produsert i

CHO-celler transfisert med vektorer som koder humant 18 kd protein. Fig. 8 viser en SDS-gel oppnådd fra bakterier transfisert med ekspresjonsvektorer for humant 18 kd protein (og kontroller) merket med<35>S-metionin. Fig. 9 viser et Western blot av bakterielle ekstrakter

svarende til de i fig. 8.

Fig. 10 viser resultatene av en in vitro-bestemmelse av evnen av forskjellige ASP-proteiner til å øke overflatespennings-nedsettelsen forårsaket av fosfolipider. Fig. 11 viser resultatene av en ytterligere in vitro-bestemmelse av evnen av humane 18 kd og 5 kd proteiner til å øke overflatespennings-nedsettelsen forårsaket av fosfolipider. Fig. 12 viser resultatene svarende til de i fig. 11 for hundeproteiner, med og uten tilsats av 32 kd protein. Fig. 13 viser nukleotidsekvensen av et hunde SP-5 cDNA-klon. Fig. 14 viser en sammenligning av aminosyresekvensene kodet ved to cDNA-kloner oppnådd fra et humant lungebiblio-tek i XgtlO, så vel som den kodet av det genomiske klonet beskrevet som gHS-15 i W086/03408. Angitt er også sekvensene kodet av to cDNA'er utvunnet ved hjelp av andre. Fig. 15 viser nukleotidsekvensen av en syntetisk trp-poro-motor benyttet for bakteriell ekspresjon av de overflateaktive proteinene.

A. Definisjoner

Slik betegnelsen her benyttes viser "alveolært overflateaktivt protein (ASP)" til apoprotein forbundet med det lungeoverflateaktive komplekset og har ASP-aktivitet som definert nedenfor. ASP for alle undersøkte spesies synes å Innbefatte en eller flere komponenter av relativt høy molekylvekt (av størrelsesorden 32 kd) her betegnet "32K ASP" og en eller flere relativt hydrofobe komponenter av relativt lav molekylvekt (av størrelsesorden 5-20 kd) her betegnet "10K ASP". (King, R.J., et al, J Appl Phvsiol (1977 42:731-736. ) 32 K-proteinene for alle spesies synes å være avledet fra en eller flere høyt homologe prototyp aminosyresekvenser i hvert spesies. Det finnes tegn på at 32K-proteinet kodes av multiple gener med mindre variasjoner i sekvens. Tre varianter av human 32K-sekvens er her vist. De multiple komponentene, som finnes under visse betingelser av klart forskjellige molekylvekter, skyldes imidlertid variasjoner i glykosileringsmønsterne. Utgangssøknaden, W086/03408, beskriver den fullstendige aminosyresekvensen for de humane og hunde 32K ASP-proteinene som viser en høy grad av homologi. Denne serien av relativt hydrofile proteiner av høy molekylvekt utgjør gjenstanden for nevnte utgangssøknad, og 32K ASP avledet fra alternative pattedyrspesies, ventes å vise en høy grad av homologi med de angitte hunde- og humane sekvensene. Spesielt er imidlertid to ytterligere varianter av det humane proteinet her beskrevet. "10K"-proteinene av lav molekylvekt er relativt hydrofobe og synes også å være blanding av flere proteiner av varierende molekylvekt. Både de humane proteinene og hundeproteinene viser ureduserte molekylvekter på 18 kd, 8 kd og 5 kd. 8 kd og 5 kd proteinene synes å være identiske i N-terminalsekvens og er antagelig avledet fra den samme meddeleren, men inneholder variasjoner i C-terminalbearbeidelse. 18 kd-proteinet, som viser en molekylvekt på 10 kd under reduserende betingelser, har på den annen side en klart forskjellig aminosyresekvens. Imidlertid synes 18 kd, 8 kd og 5 kd proteinene fra pattedyrspesies som her behandles, alle å fungere ekvivalent in vivo. Oppfinnelsen vedrører hovedsakelig denne 10K-gruppen. Utgangssøknaden, W086/03408, anga den fullstendige cDNA og den avledede aminosyresekvensen for 18 kd-hundeproteinet, men bare en delvis DNA-sekvens for den humane motparten. Bare en kort N-terminalaminosyresekvens for 8 kd/5 kd-hundeproteinet ble beskrevet; det egnede cDNA er nå utvunnet for det humane proteinet, og den fullstendige sekvensen for hegge de representative 10K-proteinene er blitt en del av kjent teknikk. Fordi 10K-blandingen synes å vise produkter av bare to DNA-sekvenser, selv om variasjoner i posttranslasjonal bearbeidelse kan resultere i multiple molekylvekter, er betegnelsene SP-18 og SP-5 adoptert for disse to typene av proteiner og gener.

Fig. 1 tilvarer fig. 2 i W086/03408 og viser den fullstendige cDNA-sekvensen for det modne hunde-SP-18-proteinet som begynner ved leucin vist ved posisjon 1 og ender ved fenyl-alanin ved posisjon 183. Den tilsvarende sekvensen for det humane SP-18-proteinet er vist i fig. 2 og 3, sekvenser som bare adskiller seg lite i aminosyresekvens som beskrevet nedenfor. Starten av det modne proteinet er fenylalaninresten ved posisjon 201 av fig. 2 som ender ved leucin ved posisjon 381. cDNA'en koder følgelig antagelig et 181 aminosyreprotein for det humane. Både det humane proteinet og hundeproteinet antas imidlertid å være bearbeidet til kortere sekvenser ved utelatelse av en del av den karboksy-terminale sekvensen. For det humane proteinet antas dette å finne sted på en slik måte at det utskilte proteinet termineres med argininet vist ved posisjon 286 i fig. 2. Slik bearbeidelse vil resultere i et protein av molekylvekt ca. 10K, observert i reduserte elektroforesegeler av isolert modent protein.

cDNA'en og avledede aminosyresekvenser for to analoge former av humant SP-5-protein er vist i fig. 5 og 6. Selv om cDNA, som starter ved den foreslåtte N-terminalen av det modne proteinet koder 173 eller 174 aminosyrer, resulterer variasjoner i C-terminal bearbeidelse i isolerte proteiner på 5 kd eller 8 kd.

Sammenfattet synes 10K-gruppen av proteiner av lavere molekylvekt å være avledet fra DNA'er som koder to forskjellige spesies, her betegnet SP18 og SP5. De SP18-kodede spesiene er betegnet på denne måten fordi de koder et modent protein som migrerer som et protein av ca. 18 kd under ikke-reduserte betingelser; dette proteinet er tilsynelatende en dimer av en mindre, ca. 10 kd monomerenheter. Monomerenhetene dannes ved post-translasjonal bearbeidelse innbefattende spaltning ved karboksyterminalen av det kodede proteinet, som, som angitt nedenfor, ellers ville omfatte 181 aminosyrer. Tilsvarende koder SP5 et protein av antatt molekylvekt på ca. 19 kd. Imidlertid gjelder igjen at denne molekylvekten ikke finnes i ekstrakter, og den kodede aminosyresekvensen er åpenbart bearbeidet til det oppnådde 5 kd og 8 kd proteinene.

De rekombinante ASP-proteinene Ifølge oppfinnelsen har aminosyresekvenser svarende til de som her er vist. Det skal understrekes at begrensede modifikasjoner kan utføres uten at aktiviteten ødelegges. F.eks. viser fig. 14 fem varianter av 32K-proteinet. Videre kan bare en del av hele den primære strukturen være påkrevet. F.eks. har det humane SP18 rekombinante proteinet Ifølge oppfinnelsen en aminosyresekvens som i det vesentlige tilsvarer den som er vist i fig. 2, men mindre modifikasjoner av denne sekvensen som ikke ødelegger aktiviteten faller også innenfor definisjonen av SP18 humant ASP, og innenfor definisjonen av det patentsøkte proteinet som sådant, som nærmere angitt nedenfor.

Innbefattet innenfor definisjonen er også fragmenter av den fullstendige sekvensen av fig. 2 som bevarer aktivitet, spesielt de som oppstår ved post-translasjonal bearbeidelse.

Som tilfellet er for alle proteiner, kan ASP-proteinene finnes i naturlig form eller i form av base- eller syreaddisjonssalter avhengig av fremstil1ingsfremgangsmåten, eller, dersom de foreligger i oppløsning, av omgivelsen. Det er velkjent at proteiner generelt, og derfor enhver ASP spesielt, kan finnes i form av dens syreaddisjonssalter innbefattende de frie aminogruppene, eller basiske salter dannet med frie karboksyler. Farmasøytisk akseptable salter kan øke funksjonaliteten av proteinet. Egnede farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter innbefatter de som er dannet fra uorganiske syrer som f.eks. saltsyre eller svovelsyrer, eller fra organiske syrer som eddiksyre eller glykolsyre. Farmasøytisk akseptable baser innbefatter alkalihydroksydene, så som kalium- eller natriumhydroksyder, eller slike organiske baser som piperidin, glukosamin, trimetylamin, kolin eller kaffein. I tillegg kan proteinet være modifisert ved kombinasjon med andre biologiske materialer så som lipider og sakkarider, eller ved sidekjedemodifikasjon, så som acetylering av aminogrupper, fosforylering av hydroksyl-sidekjeder, eller oksydasjon av sulfhydrylgrupper eller annen modifikasjon av den kodede primære sekvensen. I deres native form er ASP-proteriner glycosylerte, og visse av de kodede prolinrestene er omvandlet til hydroksyprolin. Proteinene finnes også i forbindelse med fosfolipidene i spesielt DPPC og PG. Innbefattet innenfor definisjonen av en hver ASP-proteinform er glykosilerte og uglykosilerte former, hydroksylerte og ikke-hydroksylerte former, apoproteinet alene eller i forbindelse med lipider, og, kort uttrykt, en hver sammensetning av en aminosyresekvens som i det vesentlige tilsvarer den av de native sekvensene som bevarer dets evne til å lette utviklingen av gasser mellom blodet og luftrommene i lungen og å tillate gjenfylling av alveoler.

Det skal videre understrekes at mindre modifikasjoner av primær aminosyresekvens kan oppstå i proteiner som har i det vesentlige ekvivalent eller forbedret aktivitet sammenlignet med en hvilken som helst spesiell illustrert sekvens. Disse modifikasjonene kan være frivillige, som ved sete-rettet mutagenese, eller kan være tilfeldige, så som ved mutasjon av verter som er ASP-produserende organismer. Alle disse modifikasjonene er innbefattet så lenge som ASP-aktiviteten bevares.

"ASP-aktivitet" for et protein er definert som evnen, sammen med lipider enten alene eller i kombinasjon med andre proteiner, til å vise aktivitet i in vivo-analysen ifølge

Robertson, B. Lung (1980) 158:57-68, som beskrevet nedenfor. I denne analysen administreres prøven som skal vurderes gjennom et endotrakealrør til futale kaniner eller lam som er født for tidlig ved keisersnitt. (Disse "for tidlig fødte" mangler sitt eget ASP, og understøttes ved hjelp av en ventilator.) Målinger av lungefunksjon, blodgasser og ventilatortrykk gir indisier på aktivitet. Innledende vurderinger av aktivitet kan også utføres ved en in vitro-analyse, f.eks. den ifølge King, R.J., et al, Am J Ph<y>slol

(1972) 223:715-726. eller den som er vist nedenfor ifølge Hawgood, et al, som anvender en enkel måling av overflate-spenning ved en luft-vanngrenseflate når proteinet blandes med et fosfolipidvesikkelpreparat. 10K og 32K ASP-proteinene som her er beskrevet viser ASP-aktivitet i kombinasjon, så vel som uavhengig av hverandre. Selv om det tidligere var antatt at 10K-proteinet viste ASP-aktivitet bare når det virket sammen med 32K-familien, er det nå demonstrert at 10K-proteinet alene viser betydelig ASP-aktivitet, og at suppler-ing med 32K-proteinene virker synergistisk for å øke aktiviteten av 10K-proteinene.

"Operabelt forbundet" refererer til en sidestilling hvori komponentene har en slik konfigurasjon at de utfører sin vanlige funksjon. Følgelig er kontrollsekvenser som er operabelt forbundet til kodende sekvenser i stand til å bevirke ekspresjon av den kodende sekvensen.

"Kontrollsekvens" refererer til en DNA-sekvens eller sekvenser som, når de er hensiktsmessig legert til en ønsket kodende sekvens, er i stand til å bevirke dens ekspresjon i verter som er kompatible med slike sekvenser. Slike kontrollsekvenser innbefatter promotorer i både prokariotiske og eukariotiske verter, og innbefatter i prokariotiske organismer også rlbosombindingssetesekvenser og, i eukarioter, termineringssignaler. Ytterligere faktorer som er nødvendige eller nyttige for å bevirke ekspresjon, kan identifiseres senere. Slik betegnelsen har benyttes viser "kontroll-

sekvenser" ganske enkelt til en hvilken som helst DNA-sekvens som kan være påkrevet for å bevirke ekspresjon i den spesi-elle verten som benyttes.

"Celler" eller "rekombinante vertsceller" eller "vertsceller" benyttes ofte om hverandre, hvilket vil fremgå av sammenheng-en. Disse betegnelsene innbefatter de aktuelle cellene og naturligvis deres avkom. Det skal understrekes at Ikke alt avkom er nøyaktig identisk med utgangscellen, på grunn av tilfeldige mutasjoner eller forskjeller i omgivelsen. Imidlertid er slikt endret avkom innbefattet når betegnelsen ovenfor benyttes.

B. Generell beskrivelse

Fremgangsmåtene som er vist nedenfor for å oppnå DNA-sekvenser som koder ASP er utelukkende angitt som illustrasjon og er typiske for de som kan anvendes. Imidlertid kan andre fremgangsmåter også anvendes som kjent Innen teknikken.

B.1. Naturen av det overflateaktive komplekset Alveolaroverflaten av lungen er omfattende undersøkt ved en rekke teknikker og av en rekke forskningsgrupper. Det synes som membranen av alveolen består av type I og type II alveolarceller, hvorav type 11-celler utgjør ca. 3% av overflaten. Type Il-celler er ansvarlige for den eksokrine sekresjonen av materialer inn i et f6rende fluidlag som dekker basismembranen, disse materialene reduserer overflatespenningen mellom væsken i forlaget og gassfasen av det inneholdte volumet. Fluidlaget består av vann avledet fra blodplasma av alveolarkapillarene, og sekresjonene av overflateaktivt middel av type Il-celler.

Type II-cellene selv inneholder 60-100 pg av protein og ca. 1 pg lipidfosfor pr. celle, hvor forholdet mellom type Il-celler DPPC og PG fosfor er ca. 8 til 1. Studier av apo-proteinkomponentene har vært basert på lungeutskylling fra forskjellige spesies, og er vist å Innbefatte to hovedtyper av protein, som diskutert ovenfor, av tilnærmede molekylvekter 10-20 kd og 32 kd (Kikkawa, Y. , et al, Laboratory Investigatlon (1983) 49:122-139). Det er ikke klart om apoproteinene er bundet til fosfolipidkomponenten (King, R. J., et al, Am Rev Respir Dis (1974 ) 110:273) eller ikke (Shelly, S. A., et al, J Lipid Res (1975) 16:224).

Det er vist at proteinet av høyere molekylvekt som oppnås ved lungeutskylling av hunder, og som separeres ved gelelektroforese består av 3 ho9vedkomponenter av molekylvekt 29 000, 32 000 og 36 000 dalton. Proteinet på 32 000 dalton ble benyttet for å oppnås sekvensdata, som angitt nedenfor; imidlertid har alle disse 3 proteinene identiske N-terminale sekvenser, og det finnes tegn på at de adskiller seg fra hverandre bare når det gjelder graden av glykosylering. Nedbrytning av 36 kd- og 32 kd-båndene med endoglykosidase F, som fjerner karbohydratsidekjeder, resulterer i produkter som komigrerer med komponenten på 29 kd. Mobiliteten av 29 kd-komponenten er upåvirket av denne behandlingen. Det er også vist at 32 kd-fraksjonen aggregeres til dimerer og trimerer.

Proteinene av lavere molekylvekt ekstraheres med større vanskelighet, men disse synes også å være blandinger (Phizackerley et al., supra; beskrivelse nedenfor). For både hundeproteiner og humane proteiner, som er undersøkt med hensyn på deres kodende DNA, og med hensyn på bovinutskyl-linger, undersøkt på proteinnivået, synes proteinblandingene av lavere molekylvekt å inneholde to typer aminosyresekvens, her betegnet SP-18 og SP-5. SP-18-sekvensene er kodet av cDNA'er svarende til en primærsekvens av molekylvekt ca. 18 kd; ca. 180 aminosyrer. Imidlertid synes produktene å bearbeides in vivo til kortere proteiner. SP-5 DNA koder et modent protein på ca. 173 aminosyrer, men dette proteinet er også bearbeidet til vesentlig mindre proteiner, tilsynelatende på ca. 5 kd og 8 kd. Bearbeidelsen angitt ovenfor synes å innbefatte utelatelse av sekvenser fra C-terminalen av de fremstilte proteinene.

B. 2. Kloning av kodende sekvenser for hunde og humane ASP-proteiner

Hele de hunde- og humane ASP 32K-proteinkodende sekvensene er blitt klonet og uttrykket som angitt i W086/03408. Heri har DNA-sekvenser som koder flere av proteinene med lavere molekylvekt fra både humane og hundekilder også blitt oppnådd og uttrykket. Alternative former for det humane 32K-proteinet er også beskrevet.

Hunde-lunge-cDNA-biblioteket ble undersøkt med to syntetiske oligomerblandinger utformet for å tilsvare til den N-terminale aminosyresekvensen av et 18 kd (på ureduserte geler) hundeprotein, og kloner som er hybridiserende for begge prober, ble utvunnet og sekvensert; dette ga informasjonen angitt i fig. 1 i foreliggende søknad. Ett av disse klonene, som inneholdt hunde-ASP-kodende sekvens, ble benyttet for å undersøke et lite cDNA-bibliotek fremstilt i bakteriofag XgtlO fra mRNA isolert fra voksen human lunge for å oppnå en human SP-18; som i sin tur ble benyttet for å undersøke et humant genomisk bibliotek. Den fullstendige sekvensen for humant SP-18 kodet ved hjelp av cDNA'en og ved hjelp av det genomiske klonet er beskrevet. Prober utformet tilsvarende den N-terminale aminosyresekvensen av et 5 kd hundeprotein ble deretter benyttet for å oppnå SP-5 cDNA fra XgtlO lungebiblioteket. Varianter av denne sekvensen er også beskrevet.

B.3. Ekspresjon av ASP

Ettersom nukleotidsekvensene som koder de ytterligere humane og hunde ASP-proteinene når er tilgjengelige, kan disse uttrykkes i en rekke systemer. Dersom prokaryotiske systemer benyttes, bør en intronløskodende sekvens anvendes, sammen med egnede kontrollsekvenser. cDNA-klonene for et hvilket som helst av ASP-proteinene ovenfor kan utskjæres med egnede restriksjonsenzymer og ligeres inn i prokariotiske vektorer for slik ekspresjon. For prokariotisk ekspresjon av ASP genomisk DNA, bør DNA være modifisert for å fjerne intronene, enten ved sete-rettet mutagenese, eller ved å gjenvinne tilsvarende deler av cDNA og substituere disse for de intron-holdige genomiske sekvensene. Det intronløsekodende DNA legeres deretter inn i ekspresjonsvektorer for prokariotisk ekspresjon. Flere illustrerende ekspresjonssystemer er angitt nedenfor.

Som eksemplifisert nedenfor kan ASP-kodende sekvenser også anvendes direkte i et ekspresjonssystem som er i stand til å bearbeide intronene, vanligvis en pattedyrvertscellekultur. For å bevirke slik ekspresjon, kan de genomiske sekvensene ligeres nedstrøm fra en kontrollerbar pattedyrpromotor som regulerer ekspresjonen av disse sekvensene i egnede pattedyrceller .

I tillegg til rekombinantproduksjon kan proteiner ifølge oppfinnelsen av tilstrekkelig kort lengde, så som proteinet på 5 kd, fremstilles ved proteinsyntesefremgangsmåter.

B.4. Proteinutvinning

ASP-proteinet kan fremstilles enten som et modent protein eller et fusjonsprotein, eller kan fremstilles sammen med en signalsekvens i celler som er i stand til å bearbeide denne sekvensen for sekresjon. Det er fordelaktig å oppnå sekresjon av proteinet, ettersom dette minimaliserer vanskelighetene ved rensing; følgelig er det foretrukket å uttrykke det humane ASP-genet som innbefatter kodonene for nativ signalsekvens i celler som er i stand til egnet bearbeidelse. Det har vært vist at dyrkede pattedyrceller er i stand til å spalte og bearbeide heterologe pattedyrproteiner inneholdende signalsekvenser, og å utskille disse i mediet (McCormick, F., et al, Mol Cell Biol (1984) 4:166).

Når det er utskilt i mediet, utvinnes ASP-proteinet ved anvendelse av standard proteinrenseteknikker. Renseprosessen er enkel, fordi relativt få proteiner utskilles i mediet, og hoveddelen av de utskilte proteinene vil derfor være ASP. Selv om fremgangsmåtene er mer arbeidskrevende, ligger det imidlertid innenfor kjente fremgangsmåter å rense dette proteinet fra ultralydbehandlede eller lyserte celler hvori det fremstilles intracellulært i sammensmeltet eller moden form.

B.5. Forbedret fremgangsmåte for 32K ASP- rensing

Det er her beskrevet en spesielt fordelaktig prosess for rensing av 32K-proteinene fremstilt enten nativt eller rekombinant som drar fordel av likheten av visse domener av den primære sekvensen med karbohydratbindende enheter for lecitiner.

Følgelig er et trekk ved oppfinnelsen en fremgangsmåte for rensing av 32K ASP-proteinene som innbefatter at en blanding inneholdende slike proteiner underkastes affinitetskromato-grafi hvori enheten som er ansvarlig for affiniteten er en karbohydrat, spesielt mannose eller et karbohydrat-bundet protein. Som vist nedenfor anvendes f.eks. mannose selv direkte koblet til en egnet bærer så som agarose eller Sepharose, eller en vanlig benyttet kromatografisk fast bærer, eller glykoproteiner inneholdende høye nivåer av mannose, kan anvendes. Selv om mannose er mest foretrukket kan andre funksjonelle affinitetspartnerkarbohydrater innbefatte fukose og N-acetylglukosamin. Variasjonen av utførelsen av kromatografisk bærer for en spesiell affini-tetsgruppe er velkjent innen teknikken, og en hver konfigurasjon som tilveiebringer karbohydratet som den tilgjengelige adsorbenten er egnet.

Bindingen finner fordelaktig sted i nærvær av lave konsentrasjoner av kalsiumion, og eluering gjennomføres fordelaktig ved fjernelse av kalsiumion ved anvendelse av f.eks. EDTA. Imidlertid kan eluering også bevirkes ved hjelp av et stoff i elueringsoppløsningsmidlet som konkurrerer med affinitets-kolonnen for binding til ASP, så som økende konsentrasjoner av mannose eller galaktose. Eluering kan også utføres ved å tilføre reduserende midler, idet reduksjon av disulfidbindinger frigir bindingen, på samme måte som høy og lav pH. Mens lav pH kan forårsake denaturering, er eluering i boratbuffer ved ca. pH 10 effektiv.

B.6. Analyse for ASP- aktivitet

In vitro-fremgangsmåter har vært angitt for å fastslå evnen av ASP-proteinet til å fungere ved reduksjon av overflate-spenning, (synonymt med økende overflatetrykk) for å generere en film på en vann/luftgrenseflate. Studier ved anvendelse av disse fremgangsmåtene har vært utført på det isolerte, native 32K-hunde-ASP. (Benson, B.J., et al Prog Resp Res (1984) 18:83-92; Hagwood, S., et al, Biochemlstrv (1985) 24:184-190. )

Tanaka, Y, et al, Chem Pharm Bull (1983) 31:4100-4109 beskriver at et 35 kd-protein oppnådd fra bovinlunge forbedret overflatespenningen av DPPC; Suzuki, Y. , J Lipid Res

(1982) 23:62-69; Suzuki, Y., et al, Prog Resp Res (1984 ) 18:93-100 viste at et 15 kd-protein fra svinelunge forbedret overflatespredningen av lipid-proteinkomplekset fra den samme kilden.

Idet funksjonen av komplekset av det overflateaktive midlet in vivo er å skape en film ved luft/vanngrenseflaten for å redusere overflatespenningen, er evnen av ASP-proteiner forøkning av dannelsen av filmen som skapes ved spredning av lipid eller lipoprotein ved en slik overflate i en in vitro-modell klart relevant for deres anvendelighet.

En in vivo-modell, beskrevet i eksemplene, kan også anvendes.

B.7. Administrering og anvendelse

De rensede proteinene kan benyttes alene og i kombinasjon i farmasøytiske preparater som er egnet for administrering for behandling av åndenødssyndrom hos barn eller voksne. Prepa ratene og proteinproduktene ifølge oppfinnelsen er også nyttige ved behandling av beslektede sykdommer i åndedretts-organene, så som lungebetennelse og bronkitt. Komplekset inneholder ca. 50$ til nesten 100$ (vekt/vekt) lipid og 50% til mindre enn 1# ASP; fortrinnsvis utgjør ASP 5%- 20% av komplekset. Lipiddelen er fortrinnsvis 80#-90# (vekt-/vekt) DPPC og resten umettet fosfatidylkolIn, fosfatidylglycerol, triacylglyceroler, palmitinsyre eller blandinger derav. Komplekset fremstilles ved å blande en oppløsning av ASP med en suspensjon av lipidliposomer, eller ved å blande lipid-proteinoppløsningene direkte i nærvær av rensemiddel eller et organisk oppløsningsmiddel. Rensemidlet eller oppløsnings-midlet kan deretter fjernes ved dialyse.

Selv om det er mulig anvende den naturlige lipidkomponenten fra lungeskylling for rekonstruering av komplekset, og å supplere den med egnede mengder av ASP-proteiner, er anvend-elsen av syntetiske lipider klart foretrukket. For det første er det snakk om tilsstrekkelig tilførsel, hvilket er selvinn-lysende. For det andre sikres renhet av preparatet og frihet for forurensning ved fremmede proteiner, innbefattende infektiøse proteiner, som kan befinne seg i lungene hvorfra de naturlige lipidene isoleres, bare i de syntetiske preparatene. Naturligvis er rekonstitusjon av et effektivt kompleks vanskeligere når syntetiske komponenter benyttes.

Som angitt ovenfor har det tidligere vært antatt at 10K ASP-blandingen hovedsakelig tjente til å øke aktiviteten av 32K-blandingen; imidlertid er det nå fastslått i forbindelse med foreliggende oppfinnelse at en foretrukket sammensetning innbefatter enten et kompleks med 10K-proteinet alene, SP-5 eller SP-18-proteinet alene, et kompleks av 10K og 32K-blandinger, eller et kompleks av et SP-18 eller SP-5-protein og 32K-blandingen. I de sistnevnte to tilfellene er et foretrukket proteinforhold - dvs. 32K:10K eller 32K:SP-18 eller 32K:SP-5 - typisk i området fra 3:1 til 200:1, fortrinnsvis ca. 10:1 til 5:1. 32K-proteinet kan tilsettes direkte til en vandig suspensjon av fosfolipidvesikler i en vandig oppløsning. Fordi den er så hydrofob kan 10K-blandingen (eller SP-5- eller SP-18-proteinene) tilsettes til lipidene i et organisk oppløsningsmiddel, så som kloroform, oppløsningsmidlene avdampes, og vesiklene gjendannes ved hydratisering.

Tilsatsen av 32K-proteinet til 10K-typen for administrering av komplekset av overflateaktivt middel synes å ha en synergistisk effekt - dvs. kombinasjonen av 32K og 10K-typen proteiner utøver den ønskede aktiviteten ved proteinkonsen-tras joner som er lavere enn de som er påkrevet for 10K-proteinet alene. Følgelig vil, ved en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, komplekset av overflateaktivt middel som administreres inneholde en effektiv mengde av 10K-blandingen, eller av de individuelle SP-5- eller SP-18-proteinene i blanding med 32K ASP. Spesielt foretrukne sammensetninger inneholder forholdene mellom 32K:10K-type protein som angitt ovenfor sammen med en egnet mengde lipidkomponent, typisk i området fra 50 - tilnærmet 100$ av sammensetningen.

Preparatene inneholdende komplekset er fortrinnsvis de som er egnede for endotrakeal admministrering, dvs. generelt som en flytende suspensjon, som et tørt pulver "støv" eller som en aerosol. For direkte endotrakeal administrering suspenderes komplekset i en væske med egnede eksipienser så som f.eks. vann, saltvann, dekstrose eller glycerol og lignende. Preparatene kan også inneholde små mengder ikke-toksiske hjelpestoffer, så som pH-bufrende midler, f.eks. natrium-acetat eller fosfat. For å fremstille "støvet" lyofiliseres komplekset, eventuelt blandet som ovenfor, og utvinnes som et tørt pulver.

Dersom det skal benyttes i aerosol administrering, tilføres komplekset i finfordelt form sammen med et ytterligere overflateaktivt middel og drivmiddel. Typiske overflateaktive midler som kan administreres er fettsyrer og estere, imidlertid er det i foreliggende tillfellet foretrukket å anvende de andre komponentene av komplekset av overflateaktivt middel, DPPC og PG. Nyttige drivmidler er typisk gasser ved værelses-betingelser, og er kondenserte under trykk. Lavere alkaner og fluorerte alkaner, så som freon, kan benyttes. Aerosolen forpakkes i en beholder utstyrt med en egnet ventil slik at bestanddelene kan holdes under trykk inntil de frigis.

Komplekset av overflateaktivt middel administreres, om egnet for doseringsformen, i endotrakealrøret, ved aerosol administrering, eller ved forstøvning av suspensjonen eller støv i den innåndede gassen. Mengder av kompleks mellom ca. 0,1 mg og 200 mg, fortrinnsvis 50-60 mg/kg kroppsvekt, administreres i en dose. For anvendelse på nyfødte spedbarn er en administrering generelt tilstrekkelig. For voksne administreres tilstrekkelig rekonstituert kompleks til å erstatte de demonstrerte underskuddsnivåene (Hallman, M. , et al, J Cllnical Investlgation (1982) 70:673-682).

C. Standard fremgangsmåter

De fleste av teknikkene som benyttes for å transformere celler, konstruere vektorer, ekstrahere meddeler RNA, fremstille cDNA-biblioteker og lignende, er velkjent innen teknikken, og de fleste fagfolk er kjente med standard kildematerialene som beskriver spesifikke betingelser og fremgangsmåter. Disse fremgangsmåtene er spesielt angitt i W086/03408.

Som angitt i denne forløpersøknaden kan ekspresjon oppnås i en rekke vertssystemer innbefattende spesielt, pattedyr og bakterielle systemer, så vel som gjærbaserte systemer. I tillegg har andre systemer blitt tilgjengelige innen teknikken, så som baculovirus-vektorene benyttet for å uttrykke proteinkodende gener i insektceller. Ekspresjonssystemene angitt nedenfor er illustrerende, og det vil være kjent for fagmannen at en rekke ekspresjonssystemer kan anvendes.

D. Eksempler

D.1. Isolering av pattedyr ASP- proteiner

Hunde, humane og bovine ASP-proteiner ble oppnådd i renset form.

D.l.a. Isolering av komplekset av overflateaktivt middel fra

hund

Lungekomplekset av overflateaktivt middel ble fremstilt fra hundelunger oppnådd fra hunder som blodet var fjernet fra. Alle fremgangsmåtene, innbefattende utskyllingen, ble utført ved 4"C, og det isolerte materialet ble lagret ved -15°C.

Lungene ble avgassede og utspylt 3 ganger, hver gang med en liter 5 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, buffer, pH 7,4. Ca<+2->konsentrasjonen av denne bufferen var lavere enn 5 x 10"^ M (radiometer F2112 Ca; Radiometer A/S København, Danmark). De oppsamlede lungevaskevannene ble sentrifugert ved 150 x gav i 15 minutter ("Sorval RC2-B") for å fjerne cellulært materi-ale. Supernatanten ble deretter sentrifugert ved 20 000 x gav i 15 timer ("Beckman L3-40") ved anvendelse av en type 15 rotor (Beckman Instruments), og den resulterende pelleten ble dispergert i buffer inneholdende 1,64 M natriumbromid. Etter likevektsinnstilling i 1 time, ble suspensjonen sentrifugert ved 100 000 x gav i 4 timer ("Beckman L5-50B") i en "SW28"-rotor (Beckman Instruments). Hinnen ble resuspendert i buffer og sentrifugert ved 100 000 x gav i 1 time ("Beckman L5-50B"). Denne pelleten som inneholdt komplekset ble resuspendert i dobbelt destillert vann.

Pelleten resuspendert i vann ved en konsentrasjon på 10-15 mg fosfolipid/ml ble injisert i et 50-gangers volumoverskudd av n-butanol (SIgrist, H. , et al, Blochem Biophys Res Commun

(1977) 74:178-184) og ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Etter sentrifugering ved 10 000 x gav I 20 minutter ("Sorval RC2-B") utvinnes pelleten som inneholder 32K ASP for ytterligere rensing som beskrevet nedenfor. Supernatanten, som er en enkeltfase, inneholder lipidene og proteinene av lavere molekylvekt. For å oppnå lipidene ble supernatanten tørket under vakuum ved 40°C, og lipidene ble ekstrahert (Folch, J., et al, J Biol Chem (1957) 226:497-509).

For å oppnå det hydrofobe proteinet ble supernatanten underkastet Rotovap for å fjerne butanolen, og ytterligere tørket ved tilsats av etanol etterfulgt av Rotovap. Den tørkede resten ble suspendert i redestillert kloroform inneholdende 0,1 N HC1, og det uoppløselige materialet ble fjernet ved sentrifugering.

Den resulterende oppløsningen ble kromatografert over en "LH-20"-kolonne (Pharmacia) og utviklet i kloroform. ("LH-20" er hydroksypropylderivatet av "Sephadex G-50"; det er en hydrofob gel som er inert overfor organiske oppløsnings-midler.) Proteinene utelukkes; lipider/fosfolipider elueres fra det innbefattede volumet.

Protein ble utvunnet fra tomvolumfraksjonene ved fordampning av kloroform under nitrogen, og deretter underkastet størr-elsessortering på polyakrylamidgeler. Ved gjennomføring under ikke-reduserende betingelser ble bånd på ca. 18 kd (identifisert i W086/03408 som 16,5 kd), 8 kd (identifisert i V086/03408 som 12 kd) og 5 kd (identifisert i W086/03408 som 6 kd) oppnådd; under reduserende betingelser ble et enkelt bredt bånd på 5-12 kd funnet. 18 kd-, 8 kd- og 5 kd-båndene fra de ikke-reduserte gelene ble underkastet N-terminal analyse ved Edman nedbrytning, slik at man oppnådde følgende sekvenser: For 18 kd: ?-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Cys-Arg-Thr-Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-Val-Leu-Ala-Val-Thr- ? -Gly-Gln-

For 8 kd: Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Ile-Ile-Val-Trp-

For 5 kd: Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Ile-Ile-Val-Trp-

5-12 kd-båndet representerer også en blanding av 18 kd, 8 kd og 5 kd-proteinene, her betegnet som "10K"-blandingen av proteiner.

Utfellingen fra n-butanol-ekstraksjonen ovenfor ble benyttet for å oppnå det rensede 32K apoproteinet som beskrevet i V7086/03408 (supra).

D.l.b. Isolering av humant ASP

Humant 32K og ASP av lavere molekylvekt ble fremstilt ved å følge fremgangsmåten beskrevet i den publiserte V/086/03408.

De isolerte hydrofobe proteinene av lav molekylvekt viser bånd svarende til 18 kd, 8 kd og 5 kd når de underkastes polyakrylamidgelelektroforese under ikke-reduserende betingelser. Under reduserende betingelser oppnås et enkelt bredt bånd svarende til 5-12 kd. Molekylvektene av disse båndene er noe forskjellige fra de som er angitt i den publiserte søknaden.

D.l.c. Isolering av bovint ASP

Det 10K bovine ASP inneholdende 5 kd- og 18 kd-proteiner ble isolert fra utskyllingsvaesken fra bovine lunger, ved en fremgangsmåte tilsvarende den som ble benyttet for hunde-ASP.

Utskårende bovinlunger ble fylt med tris-bufret saltvann, og fluidet ble fjernet fra lungene ved hjelp av vakuum. Utskyllingen ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter, og supernatanten ble utvunnet og sentrifugert ved 8-9000 x g i 20 minutter. Pelleten (det overflateaktive midlet) ble deretter suspendert i 0,8M sukrose, som har en tetthet større enn flytetettheten for det overflateaktive midlet, og sentrifugert ved ca. 100 000 x g i 3 timer. Det flytende overflateaktive midlet ble deretter suspendert i vann og sedimentert ved ca. 9-10 000 x g i 20 minutter for å fjerne sukrosen.

Det fosfolipid-rike overflateaktive midlet ble først ekstrahert med 98$ n-butanol, hvori det var tilsatt opptil 2% vandig overf lateaktivt middel (volum-56). Denne en-fase ekstraksjonen tillater oppløseliggjørelse av 5 kd og 18 kd-proteinene og lipidene, samtidig som den forårsaker utfelling av de andre proteinene, som ble fjernet ved sentrifugering ved 9-10 000 x g. Butanoloppløsningen ble deretter kromato-graf ert over en "LH-20" gelgjennomtrengningskolonne (Pharmacia) for å separere lipidene fra 5 kd og 18 kd-proteinene. Den ønskede proteintoppen ble deretter rekromatografert over "LH-60" som separerer 18 kd- fra 5 kd-proteinene. Begge kolonnene benyttes ved anvendelse av kloroformtmetanol (2:1, volum:volum) inneholdende 0,5$ 0,1N HC1.

De rensede 5 kd- og/eller 18 kd-proteinene ble, enten alene eller i kombinasjon (1:1), blandet i forskjellige vektforhold med syntetiske fosfolipider for å oppnå et effektivt overflateaktivt middel.

D.2. cDNA som koder hunde 10K ASP- proteiner

Meddeler RNA ekstrahert fra voksent kaninlungevev ble benyttet for å fremstille et DNA-bibliotek ved anvendelse av GC-haledannelse i pBR322 som beskrevet i W086/03408 (supra).

SP- 18- proteinet: To oligomere prober ble syntetisert svarende til den N-terminale sekvensen av 18 kd-proteinet ved anvendelse av pattedyrkodonpreferenstabeller for valg av kodon. Probe 1198 var en 36-mer av sekvensen 5'-GGTCACAGCCAG-GCCCTTGGGGATCATGGCCTGGAT-3'; probe 1199 var en 45-mer av sekvensen 5'-CTTGATCAGGGTTCTGCACAGCAGCAGTAGGGCAGGGGGATGGG-3'. Begge ble merket med<32>p ve(} kinasering.

For hybridisering ble filterne varmebehandlet ved 80° C i 2 timer under vakuum og deretter vasket i 4 timer ved 68°C med risting i et stort volum av 3 x SSC inneholdende 0, 1% SDS. Filterne ble prehybridisert i flere timer ved 42°C I 6 x SSC, 5 x Denhardt's, 20% formamid, 0, 1% SDS og 100 pg/ml skjærbe-lastet, denaturert laksesperma DNA. To filtere ble hybridi-sert i bufferen ovenfor inneholdende enten 13 ng/ml probe 1198 eller 16 ng/ml probe 1199 ved en innledende temperatur på 68° C, og deretter ved 42° C over natten. Filterne ble vasket to ganger i 15 minutter ved romtemperatur i 6 x SSC, 0,1$ SDS, 0,05$ natriumpyrofosfat, deretter i 5 minutter ved 65°C i den samme bufferen, og deretter tørket og autoradiografert.

Av 40 000 undersøkte kloner hybridiserte 8 til begge probene, og ble underkastet restriksjonsanalyse. To overlappende kloner som til sammen spente over 1520 nukleotider ble sekvensert, med resultatene angitt i fig. 1. Disse to klonene betegnes pD10k-l og pD10k-4 og er angitt i fig. 1. Pilen angir begynnelsen av det modne 18 kd-proteinet.

cDNA som koder SP- 5- protelnene: En oligomer probe ble syntetisert som tilsvarte den foreslåtte sekvensen av humant 5 kd lungeoverflateaktivt protein. Et hundelunge cDNA-bibliotek konstruert som beskrevet ovenfor og undersøkt. Det isolerte cDNA var ca. 800 bp. Dette var ikke et cDNA av full lengde, ettersom Northern-analyse viste at klonet av full lengde skulle være ca. 1,1 kb. cDNA-klonet startet ca. 30 aminosyrerester oppstrøm for N-terminalen av det modne hunde 5- eller 8 kd-proteinet. Et mulig klippesete (Gln-Gln) som ville gi et protein på ca. 5 kd.

D.3. Humane ASP DNA' er

Et humant genomisk bibliotek klonet inn i bakteriofag Charon 28 (Rimm, D-L., et al, Gene (1980) 12:301-310) ble oppnådd fra Dr. T. Maniatis, Hrvard University. Ca. 1,5 x IO<6>phag ble dyrket på E. coil K803, og plaque-lysater ble overført til nitrocellulosefiltere som beskrevet av Benton, W.D., et al, Science (1977) 196:180-182. Isolering av det genomiske klonet gHS-15 som koder det 32 kd humane proteinet og ekspresjon av dette genet er allerede beskrevet.

I tillegg ble cDNA-bibilioteker fra human lunge fremstilt som beskrevet tidligere, enten ved GC-haledannelse eller i XgtlO. Utvinningen av cDNA som koder det 32 kd humane ASP-proteinet er også beskrevet i W086/03408.

Angitt I fig. 14 er aminosyresekvenser kodet ved cDNA-kloner oppnådd fra det humane lungebiblioteket i XgtlO og betegnet pHS10-5 og pHS-10-4. Disse proteinene adskiller seg med henholdsvis en og syv aminosyrer fra proteinet kodet av det utvunnede genomiske klonet beskrevet i W086/03408, denne proteinsekvensen er også vist i fig. 14. De gjenværende sekvensene av fig. 14, merket 6A og IA, er ytterligere varianter kodet av cDNA oppnådd av andre. Det antas at det 32K humane ASP-proteinet kan kodes ved hjelp av multiple gener.

Utvinning av SP- 18: Som beskrevet i den publiserte søknaden ble cDNA-biblioteket i XgtlO undersøkt på nitrocellulosefiltere ved anvendelse av 1 x 10^ cpm av hundeklon pD10k-l beskrevet ovenfor (og angitt i fig. 1) i 40$ formamid, 5 x SSC, 0, 05% SDS, 5 x Denhardfs, 50 jjg/ml gjær tRNA og 50 jjg/ml laksesperma DNA i 16 timer ved 37° C. (pD10k-4-segmentet eller den fullstendige lengdekombinasjonen av pD10k-l- og pD10k-4-klonene kan også benyttes.) Filterne ble vasket to ganger ved 50°C i 30 minutter i 2 x SSC, 0, 1% SDS, tørket og autoradiografert. Av 40 000 plaquer var to positive, og en betegnet cDNA #3 inneholdende et 1,5 kb-innskudd ble valgt for sekvensering. Det fullstendige nukleotidet og den avledede aminosyresekvensen for SP18-proteinet og dets forstadium er vist i fig. 2. Det modne SP18-proteinet begynner, som vist i figueren, ved nukleotid 614 med Phe ved 201. Det antas at karboksyterminalen for det bearbeidede proteinet er arginin ved posisjon 286. Innskuddet på 1,5 kb ble utskåret og underklonet i EcoRl-skåret pUC8; dette plasmidet, betegnet phl8K-3, ble deponert i E. coli K-12 stamme MC1061 ved American Type Culture Collection under ATCC aksesjonsnr. 67276.

phl8K-3 cDNA-innskuddet ble benyttet til å undersøke det humane genomiske biblioteket (supra) med henblikk på genet som koder Spl8-proteinet og dets forstadier. Sekvensene for de kodende eksonene av det utvunnede genet er vist i fig. 3. Den modne aminoterminalen ved Phe-201 befinner seg ved nukleotid 3866; nummereringen av den genomiske nukleotidsekvensen begynner med en første resten av 7332 bp som ble sekvensert fra lambda-klonet.

De genomiske- og cDNA-kodende sekvensene adskiller seg ved et enkelt nukleotid, hvilket resulterer i aminosyresekvenser for forstadiet som adskiller seg ved en enkelt rest; Ile-131 av cDNA kommer til syne som Thr-131 i det genomiske klonet. Følgelig inneholder det genomiske klone-kodede forstadiet to konsensusseter for N-forbundet glykosylering (Asn-129:Thr-131 og Asn-311:Ser-313), den cDNA-kodede sekvensen inneholder bare sistnevnte glykosyleringssete. Det er ventet at cDNA-kloner som koder den genomiske sekvensen også er tilstede i biblioteket.

Utvinning av SP- 5: For SP5-proteinene ble en nukleotid-blanding av 6 oligonukleotider samlet (fig. 4), disse nukleotidene ble fremstilt til den N-terminale aminosyresekvensen av hunde 8 kd og 5 kd protein. Det humane lunge-cDNA-biblloteket i XgtlO, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble undersøkt og 8 cDNA'er som koder for SP5-proteinet ble oppnådd. Et cDNA-klon som starter ca. 19 rester oppstrøm for den antatte N-terminalen av det modne SP-5-proteinet inneholder 820 bp og ble innført I lambda-phag, betegnet Xh6K-3, og deponert ved American Type Culture Collection under ATCC aksesjonsnr. 40294.

To representative cDNA-kloner, nr. 18 og 19, er vist i fig. 5 og 6. cDNA #18 inneholder det lengste innskuddet, på 862 hp, innbefattende 12 rester av poly(A); imidlertid er, bestemt ved Northern-blot-analyse, mRNA'en som koder SP-5-proteinet 1-1,1 kb i lengde. cDNA'er #18 og 19 adskiller seg ved 4 nukleotider, understreket i cDNA #19-sekvensen, hvilket resulterer i to aminosyreforskjeller: Asn-138 i # 18 er Thr-138 i # 19, og Asn-186 i # er Ser-186 i # 19.

Det observeres to N-terminale aminosyrerester i de humane 5 kd- og 8 kd-proteinene, svarende til Phe-24 og Gly-25 i fig. 5 og 6. Karboksyterminalene for 5 kd- og 8 kd-proteinene er ikke nøyaktig bestemt; det er postulert at 8 kd-proteinet ender ved Gln-108, mens 5 kd-proteinet ender ved Glu-80 eller ved Thr-65.

(Et hundelungebibliotek i pBR322 ble fremstilt i det vesentlige som beskrevet ovenfor og undersøkt med det humane 820 bp-klonet. Det isolerte cDNA - betegnet pD6k-ll - var ca. 800 bp (se fig. 13), ikke et cDNA av full lengde. Klonet startet ca. 30 aminosyrerrester oppstrøm for N-terminalen av det modne hunde SP-5-proteinet, og inneholdt et mulig Gln-Gln-klippsete. )

D. 4 . Konstruksjon av pattedyrekspres. lonsvektorer

Vektorer egnede for ekspresjon av de forskjellige ASP-kodende sekvensene i pattedyrceller, som også er i stand til å bearbeide intron-holdig DNA ble konstruert. Ekspresjon kontrolleres ved hjelp av metallothioenin II (hMTII) kontrollsekvenser, som beskrevet av Karin, M. , et al, Nature

(1982) 299:797-802.

En mellomliggende vertvektor, pMT ble oppnådd ved å ligere promotoren inn i pUC8 på følgende måte: Plasmid 84H (Karin, M., et al (supra)) som bærer hMTII-genet ble nedbrutt fullstendig med BamHI, behandlet med ekso-nuklease Bal-31 for å fjerne terminale nukleotider, og deretter nedbrutt med Hindlll for å frigjøre et 840 bp-fragment inneholdende nikleotider -765 til +70 av hMTII-genet (nukleotid +1 er det første transkriberte nukleotidet). 840 bp-fragmentet ble isolert og ligert med Hindlll/HincII nedbrutt pUC8 (Vieira, J., et al, Gene (1982) 19:259-268) og ligeringsblandingen ble transformert i E. coil MC1061. Den korrekte konstruksjonen av pMT ble bekreftet ved dideoksy-nukleotidsekvensering.

I tillegg ble et derivat av pMT, pMT-Apo, inneholdende C-terminale regulatoriske signaler også fremstil. pMT-Apo inneholder en del av det humane lverproteinet apOAI-genet (Shoulders, C. C, et al, Nuclelc Acids Res (1983) 11:2827-2837) som inneholder de 3'-terminale regulatoriske signalene. Et Pstl/Pstl 2,2 kb-fragment av apoAI-genet (buttendet) ble klonet inn i Smal-setet av pMT-polylinkerområdet, og hoveddelen av apoAI-genet ble fjernet ved nedbrytning med BamHI, gjort buttendet med Klenow nedbrytning med Stul, og reli-gering. Den resulterende vektoren inneholder ca. 500 bp av apoAI-genet fra 3'-terminalen som bekreftet ved dideoksy-sekvensanalyse.

Ytterligere ekspresjonsvektorer inneholdende den SV40 virale forsterkeren ble også konstruert ved innføring av et 1100 bp SV40 DNA-fragment i Hindlll-setet skåret med Hindlll, og 1100 bp SV40 DNA-fragmentet ble isolert ved gelelektroforese og ligert Inn i det Hindlll-nedbrutte, CIP-behandlede pMT. De resulterende vektorene, betegnet pMT-SV(9) og pMT-SV(lO), inneholder fragmentet i motsatte orienteringer foran ST-II-promotoren. I pMT-SV(9) er forsterkeren ca. 1600 bp fra 5' mRNA-startsetet; i den motsatte orienteringen SV(10) er den ca. 980 bp fra 5' mRNA-startsetet. Begge orienteringer er operable, men orienteringen hvori forsterkersekvensene er nabostilte til startsetet tilveiebringer høyere ekspresjons-nivåer.

500 bp apoAI-fragmentet ble innført i pMT-SV(lO) ved isolering av dette fragmentet, oppnådd ved nedbrytning av pMT-Apo (beskrevet ovenfor) og ligering av isoaltet i EcoRI/BamHI nedbrutt pMT-SV(lO) for å oppnå den ønskede vertvektoren: pMTApolO.

Denne vertvektoren ble nedbrutt med BamHI, gjort buttendet og ligert til cDNA-sekvensene oppnådd fra klonet I 3 av 1275 bp-kodende SP-18-forstadium, vist i fig. 2 som et buttendet fragment. Dette ble utført ved å isolere et EcoRI/BamHI (partielt) fragment fra cDNA # 3 (fig. 2) ved unngåelse av BamHI-setet ved nukleotid 663, og underkloning i EcoTI/BamHI pUC9, det ønskede fragmentet ble utskåret med EcoRI og Hindlll, gjort buttendet med Klenow, og deretter Innført i pMTApolO. Den resulterende vektoren, pMT(E):SP18-40k, ble transformert i CHO-celler som beskrevet nedenfor.

På en tilsvarende måte ble det buttendede EcoRI innskuddet av SP-5-klonene i fig. 5 og 6 plassert i BamHI nedbrutt pMTApolO for å oppnå pMT(E):SP-5-vektorer, og transformert i CHO-celler .

D.5. Ekspresjon i pattedyrceller

Ovarieceller fra kinesisk hamster, (CHO)-Kl-celler, ble dyrket på medium bestående av en l:l-blanding av Coon's F12-medium og DME21-medium med 10$ futalt kalveserum. De kompe-tente cellene ble kotransformert med vektoren av interesse og pSV2:NE0 (Southern, P., et al, J Mol Appl Genet (1982) 1:327-341). pSV2:NE0 inneholder et funsjonelt gen som gir resistens overfor neomycinanalogen G418. I en typisk transformasjon ble 0,5 pg av pSV2-NE0 og 5 pg eller mer av ekspresjonsvektor DNA påført på en 100 mm skål av celler. Kalsiumf osf at-DNA-samutfelling ved fremgangsmåten ifølge Vigler, M. , et al, Cell (1979) 16:777-785, ble benyttet med innbefatning av et to minutters "sjokk" med 15$ glycerol i PBS etter fire timers eksponering mot DNA.

Kort uttrykt podes cellene ved 1/10 sammenflytning, dyrkes over natten, vaskes 2 ganger med PBS, og plasseres i 0,5 ml Hepes-bufret saltvann inneholdende CaPO^DNA samutfellingen i 15 min. og fores deretter med 10 ml medium. Mediet fjernet ved avsugning og erstattes med 15$ glycerol i PBS i 1,5-3 min. De sjokkbehandlede cellene vaskes og fores med kultur-medium. Inntil induksjon av MT-II-kontrollert ekspresjon, inneholder mediet F12/DMEM21 1:1 med 10% FBS. En dag senere utsettes cellene for 1 mg G418 for å tilveiebringe en samling av G418-resistente kolonier. Vellykkede transformanter, som også har en stabil arv av det ønskede plasmidet, belegges deretter ved lav tetthet for rensing av kloneisolater.

Transformantene analyseres vedrørende produksjon av det ønskede proteinet, først som samlinger, og deretter som isolerte kloner i flerbrønnsplater. Plateanalysenivåene er noe avhengig av brønnstørrelsen - f.eks. resultater fra 24 brønnsplater ikke direkte sammenlignbare med de fra 96 brønnsplater. Kloner som ved plateanalyse finnes å produsere proteinet i et tilfredsstillende nivå, kan deretter dyrkes i produksjonsforsøk i rulleflasker. Typisk er produksjonsnivå-ene høyere når oppskalering utføres. Imidlertid finnes det ingen absolutt korrelasjon mellom virkningen i plateanalyse og i rulleflasker - dvs. kulturene som er de beste produsent-ene i plateanalysen er ikke nødvendigvis de beste etter oppskalering. Av denne grunnen analyseres typisk 100-200 eller flere individuelle kloner ved forskjellige undersøk-elsesfremgangsmåter på plater og 5-10 av de beste produsent-ene analyseres under produksjonsbetingelser (rulleflaske).

Samlinger av transformerte celler ble dyrket i flerbrønns-plater og deretter eksponert mot 5 x IO"<5>til 1 x IO"<4>sinkion-konsentrasjon for å indusere produksjon av ASP. Halvsammenflytende monolag av individuelle cellelinjer som dyrkes i McCoy's 5A medium med 10% FBS ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og igjen foret med McCoy's inneholdende 10% FBS, 1 x 10~<4>sinkklorid og 0,25 mM natrium-ascorbat. (Ascorbat kan være nyttig for å formidle hydroksy-leringen av prolinrester.) 24 timer etter induksjon ble cellene vasket med PBS og igjen foret med serumfritt McCoy's inneholdende sinkklorid og ascorbat. Etter 12 timer ble det kondisjonerte mediet høstet.

En samling av transformerte celler ble indusert med ZnCl2som beskrevet ovenfor, og merket med<35>S-metionin. Etter en 12 timers merkeperiode, ble kulturmediet høstet som beskrevet og lmmunoutfelt med antisera opprettet mot det humane SP-18 ASP. Prøver ble deretter underkastet SDS PAGE i en 15% gel, med resultatene vist i fig. 7a og 7b.

I fig. 7a representerer felt M molekylvektstandarder, felt A representerer immunoutfelte proteiner fra utransformerte CHO-celler, og felt B representerer lmmunoutfelt protein fra den pMT(E):SP18-40k-transformerte samlingen. I fig. 7b ble det immunoutfelte proteinet fra transformert samling nedbrutt med endoglykosidase Fil time, deretter elektroforert som i fig. 7a. Felt A er ubehandlet kontroll, felt B er den nedbrutte prøven.

Som vist i fig. 7a, fremstilles 43 kd- og 25 kd-forstadie-proteiner av de transformerte cellene; proteiner av lavere molekylvekt vist i fig. 7a er ikke reproduserbare. Resultatene fra fig. 7b viser at 43 kd-forstadiet er glykosylert. Størrelsen av det uglykosylerte, immunoutfelte proteinet er den som forutsies for forstadiet av full størrelse.

Kaldt protein fremstilt ved hjelp av den ovenfor nevnte induserte samlingen ble underkastet Western blot ved anvendelse av antisera opprettet mot et peptid omfattende restene 336-353 av forstadiet. Det er antatt at 25 kd-produktet representerer en 181 aminosyresekvens som omfatter Phe 201-Leu-381, inneholdende et N-forbundet glykosyleringssete.

D.6. Ytterligere vektorer

Analoge vektorer ble konstruert ved anvendelse av standard sete-spesifikke mutageneseteknikker for å tilveiebringe seter for in vitro-spaltning av forstadieproteinet som tilsynelatende var fremstilt i CHO-celler fra sekvensen av full lengde. I en slik konstruksjon ble 381 aminosyreforstadiet modifisert slik at det erstattet hvert av Gln-199:Gln-200 og Arg-286:Ser-287 med Asn:Gly, slik at det ble tilveiebrakt seter som var spaltbare ved hjelp av hydroksylamin (som spalter mellom Asn og Gly). Spaltning av forstadiet som derved var produsert med hydroksylamin genererer den antatt modne formen, med en ytterligere Gly-rest ved aminoterminalen, og med den antatte karboksy-terminalen Arg-286 endret til en Asn-rest.

I en annen konstruksjon endres Phe-201 og Ser-287 til Asp-rester. Spaltning med syre (mellom Asp og Pro) gir en moden form av SP-18-proteinet som mangler den N-terminale Phe-201, og med en ytterligere karboksyterminal Asp-rest.

Ved en ytterligere konstruksjon tillater in vitro-bearbeidelse av forstadiet med en mer forsiktig, enzymatisk fremgangsmåte, ved anvendelse av Staph V8-peptidase, som spalter etter Glu-rester. Det dras fordel av naturlige Glu-rester ved Glu-198 og Gly-291 ved omvandling av Glu-251 til Asp. 43 kd-forstadiet spaltes med Staph V8 for å gi det antatte modne SP-18-proteinet med en ytterligere Gln-Gln ved aminoterminalen, og Pro-Thr-Gly-Glu ved karboksyterminalen. I en ytterligere konstruksjon kan Glu-rester plasseres i posisjon 200 og/eller 287.

D.7. Ekspresjon i bakterier

Den uglykosylerte formen av SP-18-protelnet kan fremstilles i bakterier som et 181 aminosyreforstadium som representerer met-forutgåtte rester 201-381 eller som et hydroksylamin-spaltbart fusjonsproteinforstadium med en 15 rest p-galakto-sidasehoveddel. En modifisert cDNA som koder aminosyrer 201-381 av cDNA, forutgått av ATG innføres i den Trp-kontrollerte vektoren, pTrp-233 (pTrp vertsvektor) mellom EcoRI-setet og Hindlll-setet slik at det oppnås pTrp-20. Denne konstruksjonen gir et protein av molekylvekt 20 kd. En analog konstruksjon i pBGal-vertsvektor, pBGal-20 inneholder de samme sekvensene av SP18 cDNA # 3 sammensmeltet til en 15 rest p<->galaktosidasehoveddel gjennom en hydroksylamin-følsom Asn-Gly-dublett, og gir et fusjonsprotein av molekylvekt 22 kd. Detaljer vedrørende konstruksjonen er angitt i D.ll. nedenfor.

pTrp-20k- og pBGal-20k-plasmidene ble benyttet til å transformere E. coli W3110 til ampicillinresistens. Rasktvoksende kulturer av pTrp-20/W3110 eller pBgal-20/W3110 i M9-medium (1 x M9 salter, 0,4$ glukose, 2 mg/ml tiamin, 200 pg/ml MgS04-7H20, 0, 5% kasaminosyrer, 100 pg/ml IAA (3-p indol-akrylat, 1-1625) for å indusere trp-promotoren.

De induserte cellene fikk gro i 2 timer før merking med<35>S-metionin (100 uCi/ml celler) i 10 minutter. Merkingen ble stoppet ved tilsats av 350 pl kald 20% TCA pr. ml celler; TCA-pelletene ble vasket med aceton, og deretter resuspendert ved koking i SDS PAGE-prøvebuf f er, og underkastet PAGE i en 15% gel.

Fig. 8 viser resultatene fra denne fremgangsmåten: Felt M er størrelsesstandarder; felt A er pBgal vertvektor/W3110, felt B er Bgal-20/W3110, felt C er pTrp vertsvektor/W3110 og felt D er pTrp-20/W3110. FeltB og D viser hovedmerkede proteiner på henholdsvis 22 kd og 20 kd, som ikke er tilstede i felter A og C.

Kalde ekstrakter av de induserte cellene ble fremstilt på samme måte, underkastet PAGE, ble deretter Western blot behandlet på nitrocellulose, ved anvendelse av antisera opprettet mot et peptid svarende til aminosyrer 336-353, og deretter med<125>I-protein A. I fig. 9 er felt A Bgal-20/V/3110, felt B er pTrp vertsvektor/W3110, og felt C er pTrp-20/W3110. Det er klart at både pTrp-20 og Bgal-20 viser immunospesifikke proteiner av den forutsatte molekylvekten.

Vektorer som koder modifiserte SP-18 proteinsekvenser som tilveiebringer spaltningsseter som angitt ovenfor for ekspresjon i bakterier ble også fremstilt på følgende måte. I pTrp-20 ble kodoner som koder Arg-286 Ser-287 endret til å kode Asn-Gly; innføring av det hydroksylamin-følsomme spaltningssetet, eller kodonen for Ser-287 ble erstattet med et kodon for Asp, hvilket resulterer i det syrefølsomme Asp-Pro-spaltningssetet; eller kodonen for Glu-251 ble erstattet med en kodon for Asp, hvilket tillater spaltning med Staph V8 ved Glu-291 uten spaltning av det ønskede proteinet. Videre ble, i både pTrp-20 og pBGal-20, sekvensene 3' til den antatte karboksyterminalen Arg-286 utelatt og erstattet med en stoppkodon. Ingen av konstruksjonene resulterte i merket protein av egnet størrelse etter induksjon.

Analogt pTrp-20 ble det ønskede fragmentet av cDNA # 18 (fig. 5) med utstrekning fra Gly-25 forutgått av ATG til karboksy-terminalen Ile-197 av SP-5 "forstadiet" innført i EcoRI/Hind-III-nedbrutt pTrp-233 slik at det oppsto pTrp-5 og i pBGal-vertsvektor slik at man fikk pBGal-5 hvori SP-5-sekvensen er smeltet sammen til en p<->galaktosidasehoveddel gjennom en hydroksylamin-følsom Asn-Gly.

Videre gir spaltning med Staph V8 av proteinet ventet fra denne konstruksjonen ved Glu som går foran Phe-24 og ved Glu-66 modent 5 kd-protein dersom den antatte C-terminalen er korrekt.

Disse konstruksjonene transformeres i E. coli V/3110 og uttrykkes som beskrevet ovenfor.

D.8. Rensing av 32K- protelnene

32K-proteinene har en slående aminosyrehomologi med sirku-lerende mannose-bindende proteiner, og inneholder også rester felles med de karbohydrat-bindende domenene av andre lecitiner. Det antas at karbohydratgjenkjennelse kan være en viktig egenskap for 36 kd ASP-proteinet, så vel som de andre 32K-proteinene ved reguleringen av metabolismen av overflateaktivt middel, eller når det gjelder andre funksjoner så som alveolær immunitet. Det er mulig å utnytte mannoseaffiniteten av proteinene slik de at renses ved anvendelse av karbo-hydrataffinitetskromatografi. Den kromatografiske rensingen kan utføres enten på et immobilisert glykoprotein inneholdende en høy andel av mannoserester (f.eks. gjærmannan eller invertase) eller på kolonner konstruerte direkte med mannose koblet til agarose. 36 kd-proteinet isolert fra lungeutskylling ble funnet å bindes til immobiliserte monosakkarider med en bred spesifi-sitet i nærvær av 1 mM Ca<2+>. En rensefremgangsmåte ifølge denne foretrukne utførelsen ble utført som følger. Cellekul-turmedier (typisk 8-16 liter) inneholdende 2,5 mM CaClg ble belagt direkte på en 60 ml mannose-agarosekolonne ("Selectin-10", Pierce Chemical) ved en hastighet på ca. 240 ml/time. Kolonnen vaskes, fortrinnsvis med 10 kolonnevolumer av en oppløsning inneholdende 5 mM tris, 1 mM CaCl2og 25 mM NaCl, pH 7,5. Det bundne proteinet kan utvinnes kvantitativt ved eluering med 2 mM EDTA eller haptensukker i nærvær av kalsiumioner. En foretrukket fremgangsmåte er eluering med 2-3 kolonnevolumer av en oppløsning inneholdende 100 mM natriumborat, pH 10,0. Etter fire gjennomkjøringer kan kolonnen splittes med 4M urea og bringes til fornyet likevekt i PBS eller 2% benzylalkohol.

Dataene angitt I den følgende tabellen angir prosentandelen av utvunnet protein bundet i nærvær av kalsiumioner. Verdiene representerer gjennomsnittet av fra to til syv forsøk. Terskel Ca<2+->konsentrasjonen for binding var 0,6 mM og maksimal binding fant sted med 1 mM Ca<2+>.Ba<2+>,Sr<2+>ogMn<2+>kan anvendes i steden for Ca<2+>. 36 kd-proteinet ble funnet å bindes til karbohydrat ved en pH på 5,0, selv om bindings-aktiviteten ble tapt ved varmebehandling eller reduksjon av disulfidbindinger.

Alternative kolonner egnede for rensing av 32K-proteinene innbefatter: (1) mannose-Sepharose, fremstilt ved kobling av mannose til "Sepharose 6B" (Pharmacia) med divinylsulfon (se f.eks. Fornstedt, N. og Porath, J. (1975) FEBS Lett. 57. 187-191); (2) invertase-Sepharose, fremstilt ved kobling av invertase til "Sepharose 6B" ved anvendelse av CNBr-fremgangsmåten (se f.eks. Porath, J. (1974 ) Methods Enzvmol. 34. 13-30); (3) galaktose-Sepharose; og (4) kombinasjoner av de foregående. Disse kolonnene kan, som angitt, innbefatte forskjellige kombinasjoner av karbohydrater og harpiks og kan benyttes trinnvis for å sikre i det vesentlige fullstendig fjernelse av forurensninger.

D.9. Aktivitet av ASP- komponentene

Evnen av de isolerte ASP-komponentene til å øke dannelsen av llpidfilm ved en luft/vann-grenseflate ble vurdert in vitro ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av Hagwood, S., et al, Biochemistrv (1985) 24:184-190. Kort uttrykt tilsettes et preparat av fosfolipidvesikler med det egnede forholdet av forsøksproteiner forsiktig i et lite volum til bunnen av en teflonskål inneholdende vandig buffer, en magnetisk rører og en platinaplate opphengt ved overflaten av bufferen og knyttet til en belastningsmåler. Endringer i overflate-spenning registrert på belastningsmåleren registreres som funksjon av tiden etter starting av røreren.

10K-proteiner ble tilsatt til fosfolipidet ved blanding av en kloroformoppløsning inneholdende disse med en 2:1 volum/volum kloroform:metanoloppløsning av lipidet. Oppløsningsmidlene ble avdampet, og de faste stoffene ble hydratisert i buffer slik at det oppnådd vesikler. 32K-proteiner kan tilsettes i vandig oppløsning direkte til en suspensjon av vesiklene, og tilknytning til og aggregering av vesiklene kan detekteres ved hjelp av turbiditetsmålinger.

Som angitt av Hawgood, et al (supra), var 32K-hunde ASP i stand til å aggregere fosfolipidvesikler og å øke dannelsen av film ved innbefatning i fosfolipidvesiklene, når fosfolipidene var de som var oppnådd fra hundelungekomplekset av overflateaktivt middel. Aktiviteten av proteinene ifølge oppfinnelsen vurderes ved anvendelse av de samme fremgangsmåtene for måling av aggregering og økning av filmdannelsen som angitt i Hawgood.

Både fosfolipidpreparatet fra hundelunge fremstilt som beskrevet ovenfor (300 pg) og en syntetisk blanding av fosfolipider ble benyttet. Det syntetiske fosfolipidet inneholdt 240 pg av kommersielt tilgjengelig DPPC og 60 pg egge-PG, og danner langt vanskeligere filmer enn det naturlige lipidet. Imidlertid ble forsøksfosfolipidet valgt slik at aktiviteten av proteinene skulle fremheves på mest mulig dramatisk måte.

32K-proteinet og blandingen av 10K ASP ble isolert fra hundelunge som beskrevet ovenfor. Mens tilsatsen av 60 pg av 32K-proteinet var i stand til å forbedre filmdannelsen forårsaket av det "naturlige" fosfolipidet oppnådd fra lungen tilnærmet til det nivået som ble forårsaket av komplekset per

se, forbedret det bare i moderat grad f ilmdannelsen ved anvendelse av syntetisk lipid. Tilsvarende resultater ble oppnådd for tilsats av 13 pg av 10K-proteinet alene. Når imidlertid 13 pg av 10K-preparatet ble inkubert med de syntetiske fosfolipidvesiklene før tilsatsen av 60 pg av 32K-proteinet, fant filmdannelse sted ved en hastighet og i en grad som kunne sammenlignes med den for det naturlige komplekset per se. Disse resultatene er vist i fig. 10.

Resultatene for individuelle humane og hunde 5 kd- og 18kd-proteiner er vist i fig. 11 og 12 ved avsetning av overflatetrykk etter 3 minutter (y-akse) som funksjon av proteinkon-sentrasjon (x-akse). Som vist i fig. 11 er det maksimale trykket som oppnås 40-45 mN/m, og både 5 kd og 18 kd forårsaket utredning av lipidene ved ca. 10 pgs. Dette tilsvarer et fosfolipid-til-proteinforhold på 10:1 idet 100 pg av lipid ble benyttet i alle tilfellene; lipidblandingen var DPPC:PG (7:3), men forhold på 8:2 og 9:1 ga ingen signifikant forskjell i resultatene.

For hundeproteinene vist i fig. 12 er redultatene identiske med de for det humane proteinet. Fig. 12 viser også resultatene av forsøk hvori rekombinant fremstilt 32K ble tilsatt til 18 kd- eller 5 kd-proteinet. Synergien mellom proteinene er vist ved de innsirklede punktene. 10 pg 32 kd-protein ble tilført til 5 pg og 7,5 pg for 18 kd, og 7,5 og 11 pg for 5 kd-protein.

Bovinet 18 kd- og 5 kd-proteiner ga identiske resultater med hunde- og humane proteiner.

D.10. In vivo- forsøk

Det overflateaktive materialet (SAM) som ble benyttet for kontroll for in vivo-undersøkelse ble fremstilt på følgende måte. Lunger fra unge voksne kaniner utspyles med saltvann. Friske kaniner bedøves gjennom ørevenen med 3 cm<3>natrium-pentobarbital. Luftrøres eksponeres og en 3-veis ventil med et rør tilknyttet innføres i luftrøret og festes. Brystet åpnes, brystveggene fjernes og lungearterien kateteriseres med et tilførselsrør av størrelse 8 fra hjertet. Sirkula-sjonen spyles med 50 ml normalt saltvann, mens lungene utluftes gjennom luftrøret med en 60 ml's sprøyte, og lungene fjernes deretter forsiktig med luftrøret intakt. 60 ml normalt saltvann innføres i lungene gjennom luftrøret, lungene masseres deretter forsiktig i 1 minutt og saltvannet fjernes. Utskylling gjentas 4 ganger og vaskevannene samles. Celleavfall fjernes fra vaskevannet ved romtemperatur ved sentrifugering ved 1000 x g i 2 timer. Pelleten suspenderes i 0,1 N saltvann pluss 2 M CaCl2ved en endelig konsentrasjon på 10 mg/ml fosfolipid. Konsentrasjonen reguleres ved ekstrahering av lipidene med kloroform og metanol og måling av lipidfosfor. I bobletensitometeret gir dette materialet rask adsorpsjon (tidskonstant 0,3 sekunder eller mindre) og minimale overflatespenninger på 0 til 3 mN/m ved 50$ reduksjon av arealet. Maksimal spenning ved ekspansjon var 32 til 35 mN/m.

Objektet og apparaturen som ble benyttet for in vivo-under-søkelse er som følger. Friske, unge, gravide hunnkaniner med fastsatt termin oppnås fra White Hare Eabbitory of Missouri. Ved 21 eller 22 dagers svangerskap luftforsendes hunnkaninene og undersøkes ved ankomst for å sikre at de er svangre og friske. Hunnkaniner huses i kaninbur av standardstørrelse i kaninanlegget (1492-S) og undersøkes på nytt dagen før anvendelse.

Fire plethysmografer ble konstruert med lengder på 203,2 cm av akrylsylinder med diameter 5,1 cm hvortil det er festet en 7,62 cm lang kanal av 1,27 cm akrylrør (id, 1,27 cm). Kanalene fylt med tilstrekkelig bomullsgass til å skape en lav motstand mot luftstrøm i og ut av plethysmografen. Strøm inn og ut av kammeret bestemmes ved å måle differensialtrykk-endringen mellom Innsiden av plethysmografen og rommet.

(Tidskonstant <0,1 sekunder.) Ledninger trekkes fra enden av

hovedsylinderen til en trykktransducer ("Validyne DP45", Validyne engineering Company, Northridge, CA) og til en kalibreringssprøyte. Ved gjennomføring av forsøkene ble det elektrisk integrerte strømnings (volum)-signalet ofte kalibrert med sprøyten. Den andre enden av hovedsylinderen er forseglet med en 5,1 cm gummikork hvorigjennom det er trukket to metallstaver på 10,2 cm hvorigjennom tre ECG-ledninger ble trukket. Bomullslag plasseres mellom de to metallstavene slik at det dannes en slynge hvorpå forsøksdyret plasseres. Bajonett-type elektroder knyttet til ECG-trådene. En adapter er plassert gjennom korken slik at midtpunktet i luftrørs-angiokateteret kan forbindes til et gjennomstrømningsforgren-ingsrør som i sin tur er knyttet til røret fra en respirator ("Mark VIII", Bird Respirator Company, Palm Springs, CA). Det ytre dødrommet av luftveien er 0,05 til 0,07 ml. Luftvels-trykk måles i forgreningsrøret med en "Alltech MSDICE/1" transducer (Alltech, City of Industry, CA). Plethysmograf-kalibreringen er lineær ved volumer på 0,01 til 1 ml og ved frekvenser på 10 til 100 oscillasjoner pr. minutt. De fire plethysmografene monteres I et enkelt vannbad oppvarmet til 37°C. Hvert dyr har sin egen ventilator. Koblingsinnretninger gjør det mulig å registrere strøm, volum, luftveistrykk og ECG fra hver kanin trinnvis på en Brush-skriver. Vanligvis benyttes tre dyr i ett minutt hvert femte minutt, hvorfra det gjøres opptak.

Fremgangsmåten som ble benyttet var som følger. Kaninunger ble benyttet etter 27 dager ± 4 timers svangerskap. Etter at det er gitt en dose spinalbedøvelse (1 ml pontokaln), åpnes buken og uterus eksponeres. To minutter før åpning av uterus, får hvert foster 15 mg/kg pentobarbital og 0,1 mg/kg pancu-ronium intraperitonealt. Når fosterbevegelsen stopper, bedøves fostrene og fødes raskt. Etter veiing, veies tre unger av tilnærmet samme vekt for forsøket. Unger med åpenbare anomalier undersøkes ikke. Ungene må være mellom 22 og 40 g av vekt (gjennomsnitt ± 2 SD). Luftrør kanyleres med angiokateter nr. 18, mens de holdes varme under strålings- varme. Etter kanylering, innføres 0,2 ml av enten saltvann, SAM eller forsøksstoff (oppvarmet til 37° C i H20-bad og deretter ført gjennom en 25 g nål x 5 for å sikre uniform blanding av materialet) i luftrøret hos de tre ungene fra hvert kull samtidig som brystet langsomt ble klemt inntil lungefluid kommer til syne midt i nålen slik at det dannes en væske-til-væske grenseflate. Behandlingen etterfølges avb 0,45 ml luft.

Alle forsøksstoffer (men ikke saltvann eller SAM-kontroll-prøver) inneholder 50 mg fosfolipid/kg, tilført som 0,2 ml pr. dyr ved 10 mg fosfolipid/ml. Konsentrasjon og dose er konstante innenfor hver undersøkelse. Dyrene plasseres på bomullsslyngen, ECG-elektrodene tilknyttes og tracheotomi-røret forbindes med en adapter koblet til en respirator. Tiden som gjennomsnittlig går med fra fødsel til begynnelsen av den assisterte ventileringen er 10 minutter, den maksimale tiden er 15 minutter. Ventilering startes med oksygen ved en fremvens på 48 åndedrag/minutt ved anvendelse av en innåndingstid på 0,35 sekunder. I det første minuttet er ventiler-ingsinnstillingen den samme for alle dyr; innåndingstid 0,35 sekunder, maksimalt innåndingstrykk 40 cml^O. Etter det første minuttet reguleres innåndingstrykket slik at respirasjonsvolumet holdes konstant ved 6,5-7,5 ml/kg. Dyrenes vekt er ca. 30 g slik at dette oppnås med et absolutt volum på ca. 0121 ml. Strømmen, respirasjonsvolumet og luftveistrykket registreres hvert 5. minutt for hver av de 3 kulldeltagerne. Dyrene ventileres i 30 minutter.

Data fra alle dyrene i en serie avvises dersom et medlem utvikler en luftlekkasje eller dør av andre årsaker.

Etter 30 minutters ventilering, lukkes luftrørene med stengehaner og lungene får avgasses i 10 minutter. Deretter forbindes hvert luftfylty angiokateter med en horisontal, kalibrert lengde på 5 mm plastrør inneholdende 3 ml luft ved lungeenden og farget vann ved den andre enden. De fluidfylte endene av tre plastrør forbindes via et forgreningsrør til et enkelt resesrvoar av farget vann, hvis overflate befinner seg ved samme nivå som rørene. Dette reservoaret kan heves i 50 cm vanntrinn med tilsvarende økning av trykket i røret og lungene. Ettersom trykket øker eller avtar, trer gass inn i eller forlater lungene, erstatter fluidkolonnen, og tillater måling av endringene i gassvolum. Denne apparaturen ligner på den som er beskrevet av Robertson, B. Lung (1980) 158:57-68. Trykket heves trinnvis fra 0 til 5, 10, 15, 20, 25, 30 cmH20, med en pause hvert minutt ved hvert nivå før volumendringen registreres. Etter ett minutt ved 20 mmHgO, reduseres trykket med reduksjoner på 5 mm H2O, igjen opprettholdes hvert trykk 1 1 minutt før volumet registreres. Hver volummåling korri-geres for kompresjon. Under undersøkelsene .holdes dyrene ved 37°C ved at de plasseres i et vannbad like under overflaten.

Data oppnås for Pjns»ettergivenhet (C) og volum ved spesifikke trykk (Vp). P^ns er trykket som kreves for å opprettholde et netto lungevolum; lavere tall Indikerer naturligvis virksomhet. Ettergivenhet, et mål for hvor lett lungene fylles, måles også og høyere verdier er ønsket. Vp er volumet i cm<3>av lungene ved det angitte trykket i cm vann. Resultatene er som følger.

For Pjns ved 30 minutter er resultatene som i tabell 1 (PL er fosfolipid; 32K-protein er humant 32 kd ASP produsert i CHO-celler; 10K er en blanding av 5 kd, 8 kd og 18 kd isolerte native humane proteiner).

Som vist i tabell 1 er 32K alene minimalt effektiv, mens 10K-blandingen eller 5 kd- eller 18 kd-proteinene alene er relativt effektive. Tilsats av 32K-proteinet til 10K-blandingen øker imidlertid effektiviteten.

For ettergivenhet viser tabell 2 tilsvarende resultater.

Igjen viser 10K-blandingen eller 18 kd- og 5 kd-protelnene god aktivitet, og mens 32K er langt mindre effektiv, øker tilsats av 32K-proteinet i stor grad aktiviteten av 10K-blandingen.

Tabellene 3 og 4 viser henholdsvis V30og V5(30 cm vann og 5 cm vann).

Resultatene samsvarer med de som er oppnådd for Pjns°§ettergivenhet i de foregående tabellene.

Resultater oppnådd med de tilsvarende bovinproteinene er 1ignende.

D.ll. Vertsvektorer

pTrp233 fremstilles fra pKK233-2, som er beskrevet i detalj i Amann, E., et al, Gene (1985) 40:183-190 ved å erstatte tac-promotoren av pKK233-2 med en syntetisk trp-promotor av nukleotidsekvensen vist i fig. 15. Ndel-setet av utgangsplas-

midet elimineres med nedbrytning av pKK233-2 med Ndel, det gjøres buttendet med Klenow og religeres. Ndel-minus produktet ble deretter nedbrutt med EcoRI og Pstl, og ligert til en EcoRI/Pstl-nedbrytning av den syntetiske trp-promotoren i fig. 15 slik at den ønskede vektoren, pTrp233 oppnås.

For å fremstille pBGal-vertsvektor ble pTrp233 nedbrutt med EcoRI, renset på en gel og gjort buttendet med Klenow. Plasmidet ble rellgert og forsterket i E. coil slik at man fikk det tilsvarende plasmidet som mangler EcoRI-setet. En syntetisk oligonukleotidsekvens som koder aminoterminalen av p<->galaktosidase etterfulgt av 6 threoninrester,

ble ligert inn i Ndel/Hindlll nedbrutt mellom plasmid, og plasmider inneholdende innskuddet (pBGal-vertsvektor) ble identifisert ved susceptibilitet til EciRI-spaltning.

For å konstruere pTrp-20 ble en del av SP-18 cDNA #3, sammen med et syntetisk fragment, ligert inn i Ndel/Hindll nedbrutt pTrp233. SP-18-fragmentet legert inn i pUC-9 beskrevet ovenfor ble utskåret ved nedbrytning med Pstl (kutter ved nukleotid 694) og med Hindlll (kutter etter 3' enden i plasmidpolylinkeren). To oligonukleotider ble fremstilt, som når de er rekombinert, koder restene oppstrøm for nukleotid 694 til N-terminalen (rest 201) og et forutgående metionin

(ATG):

Disse oligonukleotidene ble

rekombinert, ligert til det utskårede cDNA og innført i den nedbrutte vektoren slik at man fikk pTrp-20.

For å konstruere pBGal-20, ble analog fremgangsmåte benyttet ved anvendelse av EcoRI/Hindlll nedbrutt pBGal-vertsvektor, Pstl/Hindlll utskåret SP-18 DNA, og fyllenukleotldene:

slik at man fikk

pBGal-20.

Vektorer for ekspresjonen av genet som koder kortere former av SP-18 ble konstruert fra pTrp-20 eller pBGal-20. For å konstruere pTrp-9, ble pTrp-20 skåret med Ncol (nukleotid 846) og Hindlll og igjen sammenføyet med rekombinerte oligonukleotidene CATGGATGACAGCGCTGGCCCAGGGTA og AGCTTACCTTGGGCCAGCGCTGTCATC. pBGal-9 ble konstruert på en fullstendig analog måte ved anvendelse av pBGal-20 som utgangsmateriale.

For å konstruere vektorer som koder SP-5, ble cDNA #18 (fig.

5) nedbrutt med Smal (nukleotid 94 - nukleotid 680) og det Smal-utskårede fragmentet ble innført i Smal-setet av pUC8. Fra det klonede genet ble fragmentet utskåret ved nedbrytning med ApaLI (nukleotid 123) og Hindlll (linker) ble ligert med Ndel/Hindlll nedbrutt pTrp-233 og de sammenføyende rekombinerte nukleotidene: TATGGGCATTCCCTGCTGCCCAG og

TGCACTGGGCAGCAGGGAATGCCCA, for å opppnå pTrp-5.

Tilsvarende ble pBGal-5 (N:G) og pBGal-5 (V8) konstruert ved å anvende det samme cDNA-utskårede fragmentet, pBGal-vertsvektor skåret med EcoRI og Hindlll, og nukleotidparene: henholdsvis AATTCAACGGCATTCCCTGCTGCCCAG og TGCACTGGGCAGCAGGGAATCCCGTTG; og AATTCGGCATTCCCTGCTGCCCAG og TGCACTGGGCAGCAGGGAATGCCG.

Claims (12)

1. Alveolært overflateaktivt protein (ASP) fritt for proteiner som normalt ledsager det in situ, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av et protein som kodes av human SP-18 DNA og human SP-5 DNA innbefattende de bearbeidede formene derav.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det kodes av DNA vist i fig. 2, fig. 3, fig. 5 eller fig.

6, eller vesentlig ekvivalent derav.

3. Rekombinant DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder proteinet ifølge krav 1, hvilket DNA er fritt for DNA som koder proteiner som normalt ledsager proteinene ifølge krav 1.

4 . DNA ifølge krav 3, karakterisert ved at det er operabelt forbundet med kontrollsekvenser som er effektive ved uttrykking av nevnte sekvenser i egnede rekombinante vertsceller.

5 . Rekombinante vertsceller, karakterisert ved at de er transformert med DNA ifølge krav 3 eller ekspre-sjonssystemet ifølge krav 4.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av ASP, karakterisert ved at den innbefatter dyrkning av cellene ifølge krav 5.

7. Rekombinant ASP, karakterisert ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 6.

8. Fremgangsmåte for rensing av 32K ASP-protein, karakterisert ved at den innbefatter at en blanding inneholdende nevnte 32K-protein underkastes karbohydrat-affinitetskromatografi ved anvendelse av en karbohydrat-bundet bærer ved (a) å bringe blandingen i kontakt med den karbohydrat-bundne bæreren under betingelser hvorved 32K-proteinet adsorberes til den karbohydrat-bundne bæreren; og (b) eluering av 32K-proteinet under betingelser hvorved proteinet ikke bindes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at karbohydrataffiniteten tilveiebringes ved hjelp av en mannoserest, bindingen av 32K-proteinet til bæreren gjennomføres i nærvær av kalsiumion, og elueringen av nevnte 32K-protein foregår under betingelser som reduserer kalsium-ionkonsentrasjonen.

10. ASP-protein, karakterisert ved at det er renset ved fremgangsmåten ifølge krav 8.

11. Farmasøytisk preparat som er effektivt ved behandling av åndenød (RDS) i pattedyr, karakterisert ved at den innbefatter proteinet Ifølge krav 1 eller krav 7 eller krav 10 i blanding med et fosfolipidpreparat og, eventuelt, med et farmasøytisk akseptabel eksipiens.

12. Farmasøytisk preparat som er effektivt ved behandling av RDS I pattedyr, karakterisert ved at det innbefatter proteinet ifølge krav 1 eller krav 7 eller krav 10 i blanding med en effektiv mengde av 32K ASP-protein i blanding med et fosfolipidpreparat og, eventuelt, med en farmasøytisk akseptabel eksipiens.