DK173172B1 - Rekombinant overfladeaktivt alveolarprotein (ASP), rekombinant-DNA-sekvens kodende herfor, værtscelle transformeret med DNA - Google Patents

Description

i DK 173172 B1

Teknisk område

Den foreliggende ansøgning beskriver fremgangsmåder og materialer til anvendelse ved fremstilling af rekombinant 5 overfladeaktivt human-lungeprotein, der kodes af human-SP-18-DNA og human-SP5-DNA.

Den foreliggende opfindelse angår mere specifikt det protein, som kodes af human-SP-5-DNA eller hunde-SP-5-DNA, samt 10 rekombinante materialer til dets fremstilling. Opfindelsen angår ligeledes et farmaceutisk præparat, der er effektivt ved behandling af respiratoriske sygdomme.

Teknik, hvorpå opfindelsen bygger 15

Menneskets lunge består af et stort antal små sække eller alveoli, hvori luftarter udskiftes mellem blodet og lungens luftrum. I sunde individer formidles denne veksling af tilstedeværelse af et overfladeaktivt proteinindeholdende 20 kompleks, der syntetiseres i mikrosomale membraner af type II alveolarceller. I fravær af et tilstrækkeligt omfang af dette kompleks kan en lunge ikke fungere ordentligt, eftersom alveoli falder sammen under udåndingen og efterfølgende ikke kan pustes op under indånding. En ubehandlet manglende evne til 25 syntetisering af dette kompleks kan derfor resultere i døden eller i svære fysiske skader.

Det mest veldokumenterede tilfælde af utilstrækkeligt indhold af overfladeaktivt kompleks forekommer hos for tidligt fødte 30 børn og børn, der er født efter komplicerede graviditeter, og er almindelig kendt som respiratorisk åndedrætsbesværsyndrom (RDS) (engelsk: respiratory distress syndrom). En almindelig kendt form af dette syndrom er blevet betegnet hyalinmenbransygdom eller idiopatisk-RDS. RDS er for tiden den 2 DK 173172 B1 førende årsag til børnedødelighed- og sygelighed i USA og andre udviklede lande, og der er blevet udfoldet væsentlige forsøg på diagnose og behandling. Aktuel behandling har fokuseret på mekanisk (tryk)-ventilation, der i bedste fald er et 5 indgribende nødhjælpemiddel, som ofte resulterer beskadigelse af lungen eller andre skadelige bivirkninger herunder komplikationer, såsom bronchopulmonae dysplasia, interstitial emphysema og pneumothorax. Anvendelse af denne behandling har også lejlighedsvis resulteret i mental retardering (Hallmann, 10 M., et al., Pediatric Clinics of North America (1982) 29: 1057- 1075).

Der er blevet udført begrænsede forsøg på at behandle syndromet ved substitution af overfladeaktivt stof. Dette ville være en 15 foretrukken fremgangsmåde, idet der almindeligvis kun kræves en indgivelse, og muligheden for skade reduceres. F.eks. anvendes der ifølge Fujwara, et al., Lancet (1980) 1:55, et overfladeaktivt proteinforarmet præparat, der hidrørte fra okselunger. Præparatet er effektivt, men immunogenisk.

20 Hallmann, M., et al., Pediatrics (1983) 71: 473-482, anvendte med en vis succes et overfladeaktivt isolat fra humanfostervand til behandling af et begrænset antal børn. I beskrivelsen til US patent nr. 4.312.860 til Clements beskrives et kunstigt overfladeaktivt stof, der ikke indeholder protein og som siges 25 at være anvendeligt i denne fremgangsmåde, selv om der ikke angives nogen data. Kort fortalt har substitution af overfladeaktivt stof ikke været almindeligt klinisk anvendt.

Det foretrukne overfladeaktive substitut vil være selve det 30 overfladeaktive lungekompleks. Dette kompleks er sammensat af apoprotein, 2 phospholipider (dipalmitoylphosphocholin (DPPC) og phosphatidylglycerol (PG)), som er til stede i en stor mængde adskillige lipidbestanddele, der kun er til stede i meget små mængder, og calciumioner. Apoproteinet indeholder * 3 DK 173172 B1 proteiner med molekylevægte af størrelsesordnen 32.000 dalton og meget hydrofobe proteiner af størrelsesordnen ca. 10.000 dalton (King, R.J., et al., Am. J. Physiol. (1973) 224: 788-795) . 32.000 daltonproteinet er glycosyleret og indeholder 5 hydroxyprotein.

En hovedårsag til det begrænsede fremskridt inden for overfladeaktiv erstatningsterapi har været mangelende rådighed over kompleksets proteindel. Erstatningsterapier har været 10 fokuseret på forsøg med anvendelse af lipidbestanddelene alene, og det viser sig, at virkningen af en sådan behandling kan forbedres markant ved tilsætning af apoprotein (Hallmann, M., et al., Pediatric Clinics og North America (1982) (se ovenfor)). For tiden er flere af disse proteiner imidlertid kun 15 opnåelige fra normale lunger hos voksne mennesker og fra fostervand. Selv effektive isoleringsfremgangsmåder vil ikke tilvejebringe en tilstrækkelig forsyning. Det ville derfor således være ønskeligt at have rådighed over en fremgangsmåde til fremstilling af praktiske mængder af apoprotein til 20 anvendelse alene eller i forbindelse med kompleksets mættede phospholipiddel.

I beskrivelsen til PCT patentansøgning nr. W086/03408 beskrives rekombinant produktion af human-ASP-protein på ca. 32 kd, 25 genfinding af DNA-sekvenser, som koder for forskellige hunde-ASP-proteiner, og genfinding af en enkelt repræsentant fra human-ASP-proteingruppen med en molekylvægt på ca. 10 kd. Det er nu tydeligt, at effektiv produktion af "10 K"-gruppen er påkrævet ved anvendelsen i en adækvat terapi.

30

Forklaring af opfindelsen

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der midler til opnåelse af yderligere elementer af apoproteindelen af det 4 DK 173172 B1 overfladeaktive lungekompleks i mængder og under forhold, der tillader optimering af dets egenskaber. De resterende bestanddele af komplekset, dipalmitoylphosphatidylcholin og phosphatidylglycerol sammen med calciumioner, er allerede let 5 tilgængelige, ligesom visse enheder af ASP-gruppen, som beskrevet i W086/03408 (se ovenfor). Rådighed over nødvendige mængder af yderligere apoproteinformer muliggør forskningsindsats til optimering af den kompleksform, som er anvendelig i terapi, og åbner mulighed for rutinemæssig 10 erstatningsterapi "af respiratory distress symdromet".

Den foreliggende beskrivelse omtaler således rekombinant fremstillet overfladeaktivt pattedyralveolarprotein (ASP) fra 10K gruppen. De forholdsvis højmolekylevægtige, forholdsvis 15 vandopløselige proteiner på ca. 32 kd (32K ASP) er beskrevet, som omtalt ovenfor. De lavmolekylevægtige, hydrofobe proteiner på ca. 5-20 kd (10K ASP) er beskrevet heri. Begge proteingrupper fremmer dannelse af overfladespændings-nedsættende film, når de bringes i forbindelse med phospholipid 20 under tilstedeværelse af calciumioner. In vivo undersøgelser viser imidlertid, at 10K-gruppen og individuelle medlemmer heraf er opsigtsvækkende mere effektive end 32K ASP til opnåelse og opretholdelse af oppustning af lungerne, og at kombinationen af 10K og 32K proteiner er synergistisk.

25

Den foreliggende opfindelse angår produkterne af human- og hunde-SP-5-genet og yderligere de DNA-sekvenser, der koder for yderligere pattedyr-ASP-proteiner, ekspressionsvektorer, der er egnede til produktion af disse proteiner, rekombinantværts-30 celler, der er transformeret med disse vektorer, og fremgangsmåder til fremstilling af rekombinant-ASP’er og deres forstadier. I andre aspekter angår den foreliggende opfindelse farmaceutiske sammensætninger, der indeholder human-ASP og fremgangsmåder til behandling af RDS under anvendelse af disse.

" 5 DK 173172 B1

Kort beskrivelse af tegningen

Fig. 1 viser sekvensen af de oligonukleotidgrupper, som 5 anvendes til at isolere det cDNA, der koder for human-5 kd/8 kd protein.

Fig. 2 viser DNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens af "cDNA *18", som koder for human-5 kd protein.

10

Fig. 3 viser en analog cDNA "*19", som koder for human-5 kd protein.

Fig. 4 viser resultaterne fra en in vitro bestemmelse af 15 forskellige ASP-proteiners evne til at forstærke nedsættelsen af phospholipiders overfladespænding.

Fig. 5 viser resultaterne af en yderligere in vitro bestemmelse af human-18 kd og -5 kd proteiners evne til at forstærke 20 nedsættelsen af phospholipiders overfladespænding.

Fig. 6 viser resultater, som svarer til dem i fig. 5, for hundeproteiner, med og uden tilsætning af 32 kd protein.

25 Fig. 7 viser nukleotidsekvensen af en hunde-SP-5-cDNA-klon.

Fig. 8 viser nukleotidsekvensen af en syntetisk trp-promotor, som anvendes til bakterieekspression af overfladeproteinerne.

30 6 DK 173172 B1

Udførelsessformer for opfindelsen A. Definitioner 5 Som anvendt i nærværende beskrivelse refererer "overfladeaktivt alveolarprotein (ASP)" til et apoprotein, der er forbundet med et overfladeaktivt lungekompleks og med den ASP-aktivitet, der er defineret i det følgende. ASP for alle undersøgte arter ser ud til at omfatte én eller flere bestanddele med relativ høj 10 molekylevægt (af størrelsesordnen 32 kd), der heri angives som "32K ASP", og én eller flere ret hydrofobe bestanddele af relativ lav molekylevægt (af størrelsesordnen 5-20 kd), der heri angives som "10K ASP". (King, R.J., et al., J. Appl. Physiol. (1977) 42: 483-491; Phizackerley, P.J.R., Biochem. J.

15 (1979) 183: 731-736).

32K Proteiner viser sig for alle arter at være afledt fra én eller flere homologe aminosyresekvenser i hver art. Der findes tegn på at 32K proteinet kodes af flere gener med mindre 20 variationer i sekvens. Disse variationer af human-32K sekvensen er vist heri. De multiple komponenter, som under nogle forhold findes med tydeligt forskellige molekylvægte, skyldes imidlertid variationer i glycosyleringsmønstre. I den foregående ansøgning WO86/03408 beskrives den komplette 25 aminosyresekvens for human- og hunde-32K ASP-proteiner, som udviser en høj grad af homologi. Denne gruppe højmolekylvægtige, relativt hydrofile proteiner udgør basis for den foregående ansøgning, og 32K ASP, som er afledt fra andre pattedyrarter, forventes at udvise en høj grad af homologi med 30 de præsenterede hunde- og humansekvenser. Dog beskrives der navnlig to yderligere varianter af humanproteinet heri.

De lavmolekylvægtige "10Kn proteiner er relativt hydrofobe og synes også at være blandinger af adskillige proteiner med DK 173172 B1 ‘ 7 variende molekylvægt. Både human- og hundeproteinerne udviser ikke-reduceret molekylvægt på 18 kd, 8 kd og 5 kd. 8 kd og 5 kd proteinerne ser ud til at være identiske i den N-terminale sekvens og hidrører formodentlig fra samme messenger, men 5 indeholder variationer i den C-terminale bearbejdning. 18 kd Proteinet, som har en molekylvægt på 10 kd under reducerende forhold, har på den anden side en klart forskellig aminosyresekvens. De 18 kd, 8 kd og 5 kd proteiner fra pattedyrarter, der er beskrevet heri, viser sig imidlertid alle 10 at fungere ækvivalent in vivo. Den foreliggende opfindelse angår primært denne 10K gruppe. I den tidligere ansøgning W086/03408 beskrives den komplette cDNA og den afledte aminosyresekvens for 18 kd hundeproteinet, men kun en delvis DNA-sekvens for humanmodparten. Der blev kun beskrevet en kort 15 N-terminal aminosyresekvens for 8 kd/5 kd hundeproteinet. Det behørige cDNA er nu blevet indvundet for humanproteinet, og den komplette sekvens for begge repræsentative 10K proteiner er blevet fastlagt. Fordi 10K blandinger syntes at give produkter med kun to DNA-sekvens er, selv om variationer i 20 posttranslationel bearbejdning kan resulterer i flere molekylvægte, er betegnelserne "SP-18 og SP-5" blevet indført for disse to typer af proteiner og gener.

Fig. 2 i W086/03408 viser den komplette cDNA-sekvens for det 25 modne hunde-SP-18 protein, som begynder ved leucin og slutter ved phenylalanin i position 183. Den tilsvarende sekvens for human-SP-18 proteinet er kun lidt forskellig i aminosyresekvens, som det beskrives i det følgende. Begyndelsen på det modne protein er phenylalaninenheden i position 201, og 30 den slutter ved leucin i position 381. cDNA'et Koder således formodentligt for et 181 aminosyres humanprotein. Både human-og hundeproteinerne menes imidlertid at blive bearbejdet til kortere sekvenser ved deletion af en del af den caroxyterminale sekvens. For humanprotein menes det at ske således, at det 8 DK 173172 B1 secernerede protein termineres ved den argininenhed, som er i position 286. En sådan bearbejdning ville resultere i et protein med en molekylvægt på ca. 10K, som det ses i reducerede elektroforesegeler af isoleret modent protein.

5 cDNA- og afledte aminosyresekvenser for to analoge former af human-SP-5 proteinet er vist i figurerne 2 og 3. Selv om cDNA’et, som begynder ved den formodede N-terminus af det modne protein, koder for 173 eller 174 aminosyrer, kan variationer 10 ved C-terminal bearbejdning igen resultere i isolerede proteiner på 5 kd eller 8 kd.

Samme viser 10K gruppen med lavemolekylære proteiner sig at hidrøre fra DNA'er, som koder for to forskellige arter, som 15 heri benævnes SP18 og SP5. De SP18 kodende arter benævnes således, idet de koder for et modent protein, der migreres som et protein på ca. 18 kd under ikke-reducerede forhold. Dette protein er øjensynligt en dimer af mindre monomerenheder på ca.

10 kd. Monomerenhederne dannes ved posttranslationel 20 bearbejdning, som involverer spaltning ved carboxyterminus af det kodede protein, der, som det yderligere er forklaret nedenfor, ellers ville omfatte 181 aminosyrer. På tilsvarende måde koder SP5 for et protein med en formodet molekylvægt på ca. 19 kd. Denne proteinmolekylvægt findes imidlertid ikke i 25 ekstrakter, og den kodede aminosyresekvens bearbejdes sandsynligvis til de opnåede 5 kd og 8 kd proteiner.

De rekombinante ASP-proteiner ifølge den foreliggende opfindelse har aminosyresekvenser svarende til de, der er 30 illustreret heri. Det vil forstås, at begrænsende modifikationer imidlertid kan udføres uden at aktiviteten ødelægges.

9 DK 173172 B1

Som det er tilfældet for alle proteiner kan ASP-proteiner forekomme i neutral form eller i form af base- eller syreadditionssalte afhængigt af dets fremstillingsfremgangsmåde, eller hvis det er i opløsning, af 5 dets omgivelser. Det er en velforstået kendsgerning, at proteiner almindeligvis og derfor specielt ethvert ASP kan findes i form af dets syreadditionssalte involverende frie aminogrupper eller basesalte dannet med frie carboxyler. Farmaceutisk acceptable salte kan faktisk øge proteinets 10 funktionalitet. Egnede farmaceutisk acceptable syreadditionssalte indbefatter de, som dannes ud fra uorganiske syrer, såsom f.eks. saltsyre eller svovlsyre, eller ud fra organiske syrer, såsom eddikesyre eller glycolsyre. Farmaceutisk acceptable baser indbefatter alkalihydroxider, 15 såsom kalium- eller natriumhydroxider, eller organiske baser, såsom piperidin, glucosamin, trimethylamin, cholin eller koffein. Ydermere kan proteinet modificeres ved kombination med andre biologiske materialer, såsom lipider og saccharider, eller ved sidekædemoldifikation, såsom acetylering af 20 aminogrupper, phosphorylering af hydroxylsidekæder, eller ved oxidation af sulfhydrylgrupper eller ved anden modifikation af den kodede primære sekvens. I dets native form er ASP-proteiner glycosylerede, og visse af de kodede prolinenheder kan være omdannet til hydroxyprolin. Proteinerne findes også i 25 forbindelse med phospholipiderne DPPC og PG. Indbefattet af den foreliggende definition af enhver ASP-proteinform er glycosylerede og ikke-glycosylerede former, hydroxylerede og ikke-hydroxylerede former, apoproteinet alene eller i forbindelse med lipider, kort sagt enhver sammensætning af en 30 aminosyresekvens, der i det væsentlige svarer til de native sekvenser, som bibeholder deres evne til at lette udskiftningen af luftarter mellem blodet og lungeluftrummet og tillader genoppustning af alveoli.

10 DK 173172 B1

Det må yderligere forstås, at mindre modifikationer af den primaere aminosyresekvens kan resultere i proteiner, som har en i det væsentlige tilsvarende eller forøget aktivitet i sammenligning med enhver illustreret sekvens. Disse 5 modifikationer kan være tilsigtede, som ved positionsrettet mutagenese, eller tilfældige, som ved mutationer i værter, der er ASP-producerende organismer. Alle disse modifikationer er indbefattet som sålænge ASP-aktiviteten bevares.

10 "ASP-aktiviteten" af et protein er defineret som evnen, når det kombineres med lipider enten alene eller i kombination med andre proteiner, til at udvise aktivitet ved in vivo afprøvning ifølge Robertson, B., Lung (1980) 158: 57-68, og beskrevet nedenfor. Ved denne afprøvning indgives den prøve, der skal 15 fastlægges gennem et endotrachealt rør til føtale kaniner eller lam, som er født for tidligt ved kejsersnit. {Disse for tidligt fødte (engelsk: "preemies") mangler deres eget ASP og understøttes af en ventilator). Målinger af lungeeftergivenhed, luftarter i blodet og ventilatortryk tilvejebringer indicier på 20 aktivitet. Indledende bestemmelse af aktiviteten kan også udføres ved en in vitro analyse, f.eks. den ifølge King, R.J., et al., Am. J. Physiol. (1972) 223: 715-726, eller den, der illustreres nedenfor, ifølge Hawgood, et al., hvor der anvendes en direkte måling af overfladespændingen ved en luft-25 vandgrænseflade, når proteinet er blandet med et phospholipid-ves i kelpræparat. De heri beskrevne 10K og 32K ASP-proteiner udviser ASP-aktivitet i kombination såvel som uafhængigt. Selv om det tidligere er blevet ment, at 10K proteinet kun udviste ASP-aktivitet, når det virkede sammen med 32K familien, har

30 opfinderne af den foreliggende opfindelse nu vist, at 10K

proteinet alene udviser væsentlig ASP-aktivitet, og at supplering med 32K proteinet virker synergistisk til forøgelse af 10K proteinets (proteinernes) aktivitet.

11 DK 173172 B1

Med udtrykket "operativt forbundet" refereres til en sammenknytning, hvori komponenterne har en sådan konfiguration, at de er i stand til at udføre deres normale funktion. Styringssekvenser, som operativt er forbundet til kodende 5 sekvenser, er således i stand til at foranledige ekspression af den kodende sekvens.

Med udtrykket "styringssekvens" menes en DNA-sekvens- eller sekvenser, som er i stand til ved en passende ligation til en 10 ønsket kodesekvens, at udøve sin ekspression i de værter, som er kompatible med disse sekvenser. Disse styringssekvenser indbefatter promotorer i både procaryotiske og eucaryotiske værter, og indbefatter også ribosombindingsstedsekvenser i procaryotiske organismer og terminatorsignaler i eucaryoter.

15 Yderligere faktorer, som er nødvendige eller hjælper med til at fremkalde ekspression, kan efterfølgende identificeres. Som anvendt heri betegner udtrykket "styringssekvens" simpelthen den DNA-sekvens som kræves til at fremkalde ekspression i den specielle vært, som anvendes.

20

Udtrykkene "celler", "rekombinante værtceller" eller "værtceller" anvendes ofte i flæng, hvilket vil fremgå af sammenhængen. Disse udtryk omfatter den umiddelbart foreliggende celle og selvfølgelig dennes efterkommere. Det vil 25 forstås, at ikke alle efterkommere er nøjagtigt identiske med stamcellen på grund af tilfældige mutationer eller forskelle i omgivelserne. Et sådant ændret afkom er imidlertid indbefattet i ovenanførte betegnelser.

30 B. Generel beskrivelse

De nedenfor omtalte metoder til opnåelse af den DNA-sekvens, der koder for ASP, er kun til illustrationsformål og er typiske for de, som kan anvendes. Imidlertid kan der også anvendes 12 DK 173172 B1 andre fremgangsmåder, hvilket vil forstås af fagfolk inden for området.

B.1.Naturen af overfladeaktivt kompleks 5

Lungens alveolaroverflade er blevet omfattende undersøgt ved et antal metoder og af et antal grupper. Det ser ud til, at alveolusmembranen består af type I og type II alveolarceller, af hvilke type II cellerne udgør ca. 3% af overfladen. Type II 10 celler er ansvarlige for exocrin sekretion af materiale i et foringsvæskelag, der dækker basismembranen, og som mindsker overfladespændingen mellen væsken i foringen og luftfasen af det indeholdte volumen. Væskelaget udgøres da af vand, som hidrører fra blodplasmaet i alveolarkapillarene og sekretet af 15 overfladeaktivt stof fra type II cellerne.

Selve type II cellerne indeholder 60-100 pg protein og ca. 1 pg phosphorlipid pr. celle, hvor forholdet mellem type II celle DPPC- og PG-phosphor er ca. 8 til 1. Studier af 20 apoproteinbestanddelene har været baseret på lungeudskyl fra forskellige arter og har vist sig at omfatte 2 hovedproteiner, som beskrevet ovenfor, med omtrentlige molekylevægte på 10-20 kd og på 32 kd (Kikkawa, Y., et al., Laboratory Investigation (1983) 49: 129-139). Det er ikke klart, hvorvidt apoproteinerne 25 er bundet til phospholipidkomponenten (King, R.J., et al., Am. Rev. Respir. Dis. (1974) 110: 273) eller ikke (Shelly, S.A., et al., J. Lipid. Res. (1975) 16: 224).

Det har vist sig, at det højmolekylvægtige protein, der opnås 30 ved lungeudskylning af hunde, og som separeres ved gelelektroforese, består af 3 hovedbestanddele med molekylevægte på 29.000, 32.000 og 36.000 dalton. Proteinet på 32.000 Dalton blev anvendt til opnåelse af sekvensdata, som beskrevet nedenfor. Imidlertid besidder alle disse 3 proteiner 13 DK 173172 B1 identiske N-terminalsekvenser, og der er tegn på, at de kun er forskellige i glycosyleringsgrad. Fordøjelse af 36 kd og 32 kd båndene med endoglycosidase F, som fjerner kulhydratsidekæder resulterer i produkter som co-migrerer med 29 kd komponenten.

5 Mobiliteten af 29 kd komponenten er upåvirket af denne behandling. Det er også blevet vist, at 32 kd fraktionen aggregerer i dimerer og trimerer.

De mindre molekylevægtsproteiner udvindes mere vanskeligt, men 10 synes også at være blandinger (Phizackerley, et al., (se ovenfor), beskrevet nedenfor). For både hunde- og humanproteiner, som er blevet undersøgt med hensyn til deres kodende DNA, og med hensyn til kvægudskylning, på proteinniveau, viser de lavmolekylære proteinblandinger sig at 15 indeholde to typer af aminosyresekvenser, som heri benævnes SP-18 og SP-5. SP-18-Sekvenserne kodes af cDNA, som svarer til en primær sekvens med en molekylvægt på ca. 18 kd, ca. 180 aminosyrer. Produkterne viser sig imidlertid at blive bearbejdet in vivo til kortere proteiner. SP-5-DNA Koder for et 20 modent protein på ca. 173 aminosyrer, men dette protein bearbejdes også til i det væsentlige til mindre proteiner på øjensynlig ca. 5 kd og 8 kd. Ovennævnte bearbejdning synes at omfatte deletion af sekvenser fra C-terminus af de producerede proteiner.

25 B.2. Kloning af kodesekvenser til hunde- og human-ASP-proteiner

Hele de for hunde- og human-ASP 32 K proteinet kodende sekvenser er blevet klonet og udtrykt, som anført i 30 beskrivelsen til W086/03408. Heri er DNA-sekvenser, som koder for flere af de lavmolekylvægtige proteiner fra både human- og hundekilder, også blevet opnået og udtrykt. Ændrede former af human-32K proteinet er også beskrevet.

14 DK 173172 B1

Hundelunge-cDNA-biblioteket blev proberet med to syntetiske oligomerblandinger, som var udformet til at svare til den N-terminale aminosyresekvens af et 18 kd (på ikke-reducerede geler) hundeprotein, og kloner, som hybridiserede til begge 5 probér, blev indvundet og sekvenseret. Dette tilvejebragte de i fig. 1 viste resultater. En af disse kloner, som omfattede den hunde-ASP-kodende sekvens, blev anvendt til probering af et cDNA-bibliotek, som var fremstillet i bakteriophag XgtlO fra mRNA, der var isoleret fra en voksen humanlunge, til opnåelse 10 af human-SP-18, som derefter blev anvendt til at probere et humangenombibliotek. Der omtales den fuldstændige sekvens (sekvenser) for human-SP-18, som kodes af cDNA’et og af den genome klon. Prober, der er udformet til at svare til den N-terminale aminosyresekvens af et 5 kd hundeprotein, blev derpå 15 anvendt til opnåelse af SP-5-cDNA fra XgtlO lungebiblioteket. Varianter af denne sekvens er også beskrevet.

B.3.Ekspression af ASP

20 Da de nukleotidsekvenser, der koder for de forskellige human-og hunde-ASP-proteiner, nu er til rådighed, kan disse udtrykkes i en lang række systemer. Hvis der anvendes prokaryotiske systemer, bør der anvendes en intronfri kodesekvens sammen med egnede styresekvenser. cDNA-Klonerne for enhver af ovennævnte 25 ASP-proteiner kan udskæres med egnede restriktionsenzymer og ligeres i prokaryotiske vektorer med henblik på en sådan ekspression. For prokaryotisk ekspression af ASP genomisk-DNA, bør DNA modificeres til fjernelse af introner, enten ved positionsdirigerer mutagenese eller ved genvinding af 30 tilsvarende cDNA-dele og erstatning af de intronindeholdende genomiske sekvenser med disse. Det intronfrie kodende DNA ligeres derpå i ekspressionsvektorer til prokaryotisk ekspression. Adskillige illustrative ekspressionssystemer er beskrevet nedenfor.

15 DK 173172 B1

Som eksemplificeret nedenfor kan ASP-kodende sekvenser også anvendes direkte i et ekspressionssystem, som er i stand til at bearbejde introner, almindeligvis en pattedyrværtscellekultur.

5 For at bevirke denne ekspression, kan de genomiske sekvenser ligeres nedenstrøms for en kontrollerbar pattedyrspromotor, som regulerer ekspression af disse sekvenser i CHO-celler.

Ud over rekombinant fremstilling kan proteiner ifølge 10 opfindelsen med tilstrækkelig kort længde, såsom 5 kd proteinet, fremstilles ved proteinsyntesefremgangsmåder.

B.4.Proteinindvinding 15 ASP-Proteinet kan fremstilles enten som et modent protein eller som et fusionsprotein, eller det kan fremstilles sammen med en signalsekvens i de celler, som er i stand til at forarbejde denne sekvens til sekret. Det er fordelagtigt, at opnå sekretion af proteinet, idet dette minimerer vanskelighederne 20 ved oprensning. Det foretrækkes derfor at udtrykke det human-ASP-gen, som indbefatter codoner for nativ signalsekvens, i celler, der er i stand til passende forarbejdning. Det har vist sig, at dyrkede pattedyrsceller er i stand til at spalte og bearbejde heterologe pattedyrsproteiner indeholdende 25 signalsekvenser og at secernere dem til mediet (McCormick, F., et al., Mol. Cell. Biol. (1984) 4:166).

Når ASP-proteinet er secerneret til mediet, indvindes det ved anvendelse af standardproteinoprensningsfremgangsmåder.

30 Oprensningsfremgangsmåden er simplificeret, fordi relativt få proteiner secerneres til mediet, og hovedparten af det secernede protein vil derfor allerede være ASP. Endskønt procedurerne er mere besværlige, findes der dog kendte måder inden for dette fagområde til oprensning af dette protein fra 16 DK 173172 B1 lydbehandlede eller lyserede celler, i hvilke det produceres intracellulært i fusioneret eller moden form.

B. 5.ASP-aktivitetsanalyse 5

Der er blevet udtænkt in vitro fremgangsmåder til bedømmelse af ASP-proteiners funktionsevne til reduktion af overfladespændingen (synonym med større overfladetryk) ved frembringelse af en film på en vandig/luft-grænseflade.

10 Undersøgelser ved anvendelse af disse fremgangsmåder er blevet udført på det isolerede native 32K hunde-ASP. (Benson, B.J., et al., Prog. Resp. Res. (1984) jL8:83-92, Hagwood, S., et al., Biochemistry (1985) 2_4: 184-190).

15 Tanaka, Y., et al., Chem, Pharm. Bull, (1983) 31_: 4100-4109 beskriver, at et 35 kd protein, der var opnået fra okselunge, forstærkede overfladespredningen af DPPC, Suzuki, Y., J. Lipid. Res. (1982) 22: 62-69, Suzuki, Y., et al..

Preg. Resp. Res. (1984) 1_8: 93-100 viste, at et 15 kd protein 20 fra svinelunge forstærkede overfladespredningen af lipid-proteinkomplekset fra samme kilde.

Da funktionen af det overfladeaktive kompleks in vivo er at frembringe en film ved luft/væske-grænsefladen for at reducere 25 overfladespændingen, er ASP-proteinernes evne til at fremme dannelsen af den film, der skabes ved spredning af et lipid eller lipoprotein på en sådan overflade i en in vitro model, tydeligvis relevant for dets anvendelighed.

30 Den in vivo model, som er beskrevet i eksemplerne, kan også benyttes.

B.6. Indgivelse og anvendelse 17 DK 173172 B1

De oprensede proteiner kan anvendes alene eller i kombination i farmaceutiske præparater, der er egnede til indgivelser til behandling af respiratorisk distress-syndrom hos børn eller voksne. Kompositionerne og proteinprodukterne ifølge den 5 foreliggende opfindelse er også anvendelige ved behandling af relaterede respirationssygdomme, såsom lungebetændelse og bronkitis.

Komplekset indeholder fra ca. 50% til næsten ca. 100% 10 (vægt/vægt) lipid og fra 50% til mindre end 1% ASP. ASP udgør fortrinsvis fra 5% til 20% af komplekset. Lipiddelen udgøres fortrinsvis af 80-90% (vægt/vægt) DPPC, medens resten udgøres af umættet phosphatidylcholin, phosphatidylglycerol, triacylglyceroler, palmitinsyre eller blandinger heraf.

15 Komplekset samles ved at blande en ASP-opløsning med en suspension af lipidliposomer eller ved at blande lipidpro-teinopløsningerne direkte i nærværelse af en detergent eller et organisk opløsningsmiddel. Detergenten eller opløsningsmidlet kan derpå fjernes ved dialyse.

20

Selv om det er muligt at anvende den naturlige lipidkomponent fra lungeudskylninger ved rekonstruktion af komplekset og at supplere det med passende mængder ASP-proteiner, foretrækkes det at anvende syntetiske lipider. For det første er det et 25 spørgsmål om tilstrækkelig forsyning, hvilket er indlysende.

For det andet er renheden af præparatet og frihed for kontamination med fremmede proteiner, herunder infektiøse proteiner, som kan være til stede i de lunger, hvorfra de naturlige lipider isoleres, kun sikret i syntetiske præparater.

30 Naturligvis er rekonstruktionen af et virkningsfuldt kompleks mere vanskelig, når der anvendes syntetiske komponenter.

Som anført ovenfor har man tidligere ment, at 10K ASP-blandingen primært fungerede ved at øge aktiviteten af 32K- 18 DK 173172 B1 blandingen. Det er imidlertid nu af de foreliggende opfindere blevet fastlagt, at et foretrukket præparat omfatter enten et kompleks med 10K-proteinet alene, SP-5- eller SP-18-proteinet alene, et kompleks af 10K- og 32K-blandinger eller et kompleks 5 af et SP-18- eller SP-5-protein og 32K-blandingen. I sidstnævnte to tilfælde er et foretrukket proteinforhold, dvs. 32K:10K eller 32K:SP-18 eller 32K:SP-5, typisk på fra ca. 3:1 til 200:1, fortrinsvis fra ca. 10:1 til 5:1. 32K-proteinet kan sættes direkte til en vandig suspension af phospholipidvesikler 10 i en vandig opløsning. Fordi det er så hydrofobt, sættes 10K-blandingen (eller SP-5- eller SP-18-proteiner) til lipiderne i et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, opløsningsmidlerne afdampes, og vesiklerne gendannes ved hydratisering.

15

Tilsætning af 32K-proteinet til 1OK-typen for indgivelse af det overfladeaktive kompleks viser sig at have en synergistisk virkning, dvs. kombinationen af 32K- og 1OK-typeproteiner udviser den ønskede aktivitet ved proteinkoncentrationer, der 20 er lavere end de, som kræves for 10K-proteinet alene. Ved en foretrukken fremgangsmåde ifølge opfindelsen vil det indgivne overfladeaktive kompleks følgelig indeholde en effektiv mængde af 10K-blandingen eller af individuelle SP-5- eller SP-18-proteiner i blanding med 32K ASP. Særligt foretrukne præparater 25 indeholder 32K:10K proteintypeforhold som anført ovenfor, sammen med en passende mængde lipidkomponent, og udgør typisk fra 50 til næsten 100% af præparatet.

De præparater, der indeholder komplekset, er fortrinsvis de, 30 som er egnede til endotracheal indgivelse, dvs. almindeligvis som en væskeformig suspension, som et tørt pulver, "støv" eller som en aerosol. Til direkte endotracheal indgivelse suspenderes komplekset i en væske med egnede excipienser, såsom f.eks. vand, saltvand, dextrose eller glycerol og lignende.

19 DK 173172 B1

Kompositionerne kan også indeholde små mængder af ikke-toxiske hjælpestoffer, såsom pH-puffermidler, f.eks. natriumacetat eller -phosphat. For at fremstille "støvet", frysetørres komplekset, som evt. er blandet som ovenfor, og indvindes som 5 et tørt pulver.

Hvis det skal anvendes ved aerosol-indgivelse, tilføres komplekset i en findelt form sammen med et yderligere overfladeaktivt stof og drivmiddel. De typiske overfladeaktive 10 midler, som kan indgives, er fedtsyrer og estere, men det foretrækkes i det foreliggende tilfælde at anvende de andre komponenter, DPPC og PG, af det overfladeaktive kompleks. Anvendelige drivmidler er typisk luftarter ved omgivelsesforhold og kondenseret under tryk. Der kan anvendes lavere 15 alkalner og fluorerede alkaner, såsom Freon. Aerosolen emballeres i en beholder, der er forsynet med en passende ventil, således at bestanddelene kan holdes under tryk indtil de frigives.

20 Det overfladeaktive kompleks indgives, som det passer sig for doseringsformen, med et indotrachealrør, ved aeorosol- indgivelse eller ved forstøvning af suspensionen eller støvet i den indåndede luftart. Kompleksmængder på mellem ca. 0,1 mg og 200 mg, fortrinsvis 50-60 mg/kg legemsvægt indgives i en dosis.

25 Ved anvendlese til nyfødte børn er en indgivelse almindeligvis tilstrækkelig. Til voksne indgives tilstrækkeligt rekonstitueret kompleks til at erstatte manglen i det påviste omfang. (Hallman, M., et al, J. Clinical Investigation (1982) 70: 673-682).

30 C. Standardmetoder

De fleste af de metoder, som anvendes til at transformere celler, konstruere vektoer, ekstrahere messenger RNA, 20 DK 173172 B1 fremstille cDNA-biblioteker og lignende, er almindeligt udført af fagfolk inden for området, og de fleste fagfolk er velkendt med de standardhjælpematerialer, som foreskriver specifikke forhold og procedurer. Disse fremgangsmåder er navnlig 5 beskrevet i W086/03408.

Som anført i den foregående ansøgning kan der opnås ekspression i en lang række værtssystemer, inklusiv navnlig pattedyrs- og bakteriesystemer, såvel som gærbaserede systemer. Ydermere er 10 andre cellesystemer blevet opnåelige inden for fagområdet, såsom baculovirusvektorer, der anvendes til at udtrykke proteinkodende gener i insektceller. De nedenfor anførte ekspressionssystemer er illustrative, og det forstås af fagfolk inden for området, at der kan anvendes en lang række 15 ekspressionssystemer.

D. Eksempler D.1.Isolering af pattedyrs-ASP-proteiner 20

Hunde-, human- og kvæg-ASP-proteiner blev opnået i oprenset form.

D.1.a. Isolering af overfladeaktivt hundekompleks 25

Overfladeaktivt lungekompleks blev fremstillet ud fra hundelunger opnået fra afblødte hunde. Alle procedurerne, herunder udskylning, blev udført ved 4°C, og det isolerede materiale blev opbevaret ved -15°C.

30

Lungerne blev tømt for luft og udskyllet 3 gange med 1 liter 5 mM Tris-HCl puffer, med 100 mM NaCl, pH 7,4 pr. udskylning. Ca+2 koncentrationen i denne puffer var mindre end 5 x 10~6 M (Radiometer F2112 Ca; Radiometer A/S, København, Danmark). De 21 DK 173172 B1 sammenføjede lungeudskylninger blev centrifugeret ved 150 x ga„ i 15 min. (Sorval RC2-B) til fjernelse af cellemateriale. Supernatanten blev centrifugeret ved 20.000 x gav i 15 timer (Beckman L3-40) under anvendelse af en type 15 rotor (Beckman 5 Instruments), og den resulterende pellet blev dispergeret i puffer indeholdende 1,64 M natriumbromid. Efter ækvilibrering i 1 time blev suspensionen centrifugeret ved 100.000 x gay i 4 timer (Beckman L5-50B) i en SW 28 rotor (Beckman Instruments). Hinden (eng.: pellicle) blev resuspenderet i puffer og 10 centrifugere ved 100.000 x gav i 1 time (Beckman L5-50B). Denne pellet, der indeholdt komplekset, blev resuspenderet i dobbelt destilleret vand.

Pelleten, der blev resuspenderet i vand i en koncentration på 15 10-15 mg phospholipid/ml, blev indsprøjtet i et 50 gange volumenoverskud af n-butanol (Sigrist, H., et al., Biochem. Biophys.Res. Commun. (1977) 74: 178-184) og blev omrørt ved stuetemperatur i 1 time. Efter centrifugering ved 10.000 x gav i 20 min. (sorval RC2-B), blev pelleten, som 20 indeholdte 32K ASP, indvundet til yderligere oprensning, som beskrevet nedenfor. Supernatanten, der er en enkelt fase, indeholder lipider og lavmolekylvægtproteiner. For at opnå lipiderne blev supernatanten tørret under vakuum ved 40°C, og lipiderne blev ekstraheret (Folch, J., et al., J. Biol, Chem.

25 (1957) 226: 497-509).

Til opnåelse af det hydrofobe protein blev supernatanten udsat for rortationsfordampning til fjernelse af butanolen og yderligere tørret ved tilsætning af ethanol fulgt af 30 rotationsfordampning. Den tørrede rest blev suspenderet i redistilleret chloroform indeholdende 0,1 N HC1, og uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering.

22 DK 173172 B1

Den resulterende opløsning blev kromatograferet over en LH-20 kolonne (Pharmacia) og udviklet med chloroform. (LH-20 er et hydroxypropylderivat af Sephadex G-50; den er en hydrofob gel, som er inert over for organiske opløsningsmidler.) Proteinerne 5 udelukkes; lipider/phospholipider elueres fra det inkluderede volumen.

Proteinet blev genvundet fra hulrumsvolumenfraktionerne ved fordampning af chloroformet under nitrogen og blev derpå udsat 10 for størrelsessortering på polyacrylamidgeler. Ved udførelse under ikke-reducerende forhold blev der opnået bånd af ca. 18 kd (i W086/03408 identificeret som 16,5 kd), 8 kd {i W086/03408 identificeret som 12 kd) og 5 kd (i W086/03408 identificeret som 6 kd). Under reducerende forhold blev der fundet et enkelt 15 bredt bånd af 5-12 kd.

18 kd, 8 kd og 5 kd båndene fra de ikke-reducerede geler blev udsat for N-terminal analyse ved Edman-degradering til opnåelse af følgende sekvenser: 20

For 18 kd: ?-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Cys-Arg-Thr-

Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-Val-Leu-Ala-Val-Thr- ? -Gly-Gln- 25 For 8 kd: Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-

Leu-Ile-Ile-Val-Trp-

For 5 kd: Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-

Leu-Ile-Ile-Val-Trp-30 5-12 kd båndet repræsenterede også en blanding af 18 kd-, 8 kd-og 5 kd-proteiner, der heri benævnes som "10K" proteinblandingen.

23 DK 173172 B1

Praecipitatet fra ovennævnte n-butanolekstraktion blev anvendt til opnåelse af det oprensede 32K apoprotein som beskrevet i W086/03408 (se ovenfor).

5 D.l.b. Isolering af human-ASP

Human-32K og lavmolekylvægts ASP blev fremstillet ved den procedure, som er beskrevet i den offentliggjorte patentansøgning W086/03408.

10

De isolerede, hydrofobe lavmolekylvægts proteiner udviste bånd svarende til 18 kd, 8 kd og 5 kd, når de blev udsat for polyacrylamidgelelektroforese under ikke-reducerende forhold. Under reducerende forhold blev et enkelt bånd svarende til 5-12 15 kd opnået. Molekylvægten af disse bånd er svagt forskellig fra de, som er anført i den publicerede ansøgning.

D.l.c. Isolering af kvæg-ASP

20 10K kvæg-ASP omfattende 5 kd- og 18 kd-proteiner blev isoleret fra udskylningsvæsken fra kvæglunger ved en fremgangsmåde, som svarer til den, der anvendes til hunde-ASP.

Udskårede kvæglunger blev fyldt med Tris-pufret saltopløsning, 25 og væsken blev fjernet fra lungerne med vakuum. Udskylningen blev centrifugeret ved 200 xg i 10 min, og supernatanten blev indvundet og centrifugeret ved 8-9.000 xg i 20 min. Pelleten blev derpå suspenderet i 0,8 M succrose, som havde en vægtfylde, der var højere end det overfladeaktive stofs 30 opdriftsvægtfylde, og centrifugeret ved ca. 100.000 xg i 3 timer. Det flydene, overfladeaktive stof blev derpå suspenderet i vand og sedimenteret ved ca. 9-10.000 xg i 20 min for at fjerne sucrose.

24 DK 173172 B1

Det phospholipidrige overfladeaktive stof blev derpå først ekstraheret med 98% n-butanol, hvortil der blev sat op til 2% vandigt, overfladeaktivt stof (på basis af voluminet). Denne en-faseekstraktion tillader solubilisering af 5- kd og 18 kd-5 proteiner og lipider, medens andre proteiner præcipiterer, hvilke fjernes ved centrifugering ved 9-10.000 xg. Butanolopløsningen blev derpå kromatograferet over en LH-20-gelpermeeringssøjle (Pharmacia) for at adskille lipider fra 5 kd- og 18 kd-proteiner. Den ønskede proteintop blev derpå 10 rekromatograferet over LH-60, som adskilte 18 kd- fra 5 kd-protein. Begge søjler blev gennemløbet under anvendelse af chloroform: methanol (2:1, volumen:volumen) indeholdende 0,5% 0,IN HC1.

15 De oprensede 5 kd- og/eller 18 kd-proteiner, enten alene eller i kombination (1:1), blev blandet i forskellige vægtforhold med syntetiske phosphorlipider til opnåelse af et effektivt overfladeaktivt stof.

20 D.2.cDNA, der koder for hunde-10K ASP-proteiner

Messenger RNA, der var ekstraheret fra lungevæv fra voksne hunde, blev anvendt til fremstilling af et DNA-bibliotek under anvendelse af GC-haleforsyning i pBR322, som beskrevet i 25 W086/03408 (se ovenfor).

cDNA, der koder for SP-5-proteiner:

Der blev syntetiseret en oligomer probe, som svarede til den 30 formodede sekvens af det overfladeaktive human-5 kd lungeprotein. Et hundelunge-cDNA-bibliotek blev konstrueret, • som beskrevet ovenfor og screenet. Det isolerede cDNA var på ca. 800 bp. Dette var ikke et fuldlængde cDNA, idet Northern-analyse viste, at fuldlængdeklonen burde være ca. 1,1 kb. cDNA- 25 DK 173172 B1 klonen begyndte ca. 30 aminosyreenheder opstrøms for N-terminus af den modne hunde-5 kd- eller -8 kd-protein. Et muligt klippested er (Gln-Gln), hvilket vil give et protein på ca. 5 kd.

5 D.3.Human-ASP-DNA'er

Et human-genomt bibliotek, der var klonet i bakteriophag Charon 28 (Rimm, D.L., et al., Gene (1980) 12: 301-310) blev opnået 10 fra Dr. T. Haniatis, Harvard University. Ca. 1,5 x 10® phag blev dyrket på E. coli K803 og plaquelysater blev overført til nitrocellulosefiltre, som beskrevet af Benton, W. D., et al., Science (1977) 196: 180-182. Isolering af den genome klon gHS-15, som koder for 32 kd humanproteinet, og ekspression af dette 15 gen, er allerede blevet beskrevet.

Ydermere blev cDNA-biblioteker fra humanlunge fremstillet som beskrevet tidligere enten ved GC-haleforsyning eller i XgtlO. Indvinding af cDNA, som koder for 32 kd human-ASP-proteinet, er 20 også beskrevet i W086/03408.

Indvinding af SP-5:

For SP5-proteiner blev en nukleotidblanding af 6 25 oligonukleotider hældt sammen (figur 1), hvilke nukleotider var fremstillet til den N-terminale aminosyresekvens af hunde-8 kd-og 5 kd-protein. Humanlunge-cDNA-biblioteket i XgtlO, der er fremstillet som beskrevet ovenfor, blev screenet, og der blev opnået 8 cDNA'er, som koder for SP5 proteinet. En cDNA-klon, 30 som begynder ca. 19 enheder opstrøms for den formodede N-terminus af det modne SP-5-protein, indeholder 820 bp og blev indsat i λ-phagen, der benævnes λίι6Κ-3, og deponeret hos American Type Culture Collection under ATCC deponeringsnr. 40.294.

26 DK 173172 B1

To repræsentative cDNA-kloner, nr. 18 og 19, er vist i figurerne 2 og 3. cDNA # 18 indeholder den længste indføjelse på 862 bp inklusive 12 enheder af poly(A). Ud fra Northern-5 blot-analyse har mRNA, som koder for SP-5-proteinet, imidlertid en længde på 1-1,1 kb. cDNA'er # 18 og 19 er forskellige i 4 nukleotider, som er understreget i cDNA # 19-sekvensen, hvilket resulterer i to aminosyreforskelle: Asn-138 i # 18 er Thr-138 i # 19, og Asn-186 i # 18 er Ser-186 in # 19.

10

Der ses to N-terminale aminosyreenheder i human-5-kd- og 8 kd-proteinerne, svarende til Phe-24 og Gly-25 i figurerne 2 og 3. Carboxyterminus af 5 kd- og 8 kd-proteinerne er ikke blevet bestemt nøjagtigt. Det er blevet postuleret, at 8 kd-proteinet 15 slutter ved Gln-108, medens 5 kd-proteinet slutter ved Glu-80 eller ved Thr-65.

(Et hundelungebibliotek i pBR322 blev fremstillet som i det væsentlige beskrevet ovenfor og screenet med human 820 bp 20 klonen. Det isolerede cDNA, der benævnes pD6k-ll, var ca. 800 bp (se figur 7), og ikke et fuldlængde cDNA. Klonen begyndte ca. 30 aminosyreenheder opstrøms for N-terminus af det modne hunde-SP-5-protein og indeholdte et muligt Gln-Gln-klipningssted.) 25 D.4.Konstruktion af pattedyrsekspressionsvektorer

Der blev konstrueret vektorer, som var egnede til ekspression af forskeligge ASP-kodende sekvenser i pattedyrsceller, og som 30 også var i stand til at bearbejde intronholdigt DNA. Ekspression styres med metallothionein II (hMTII) styresekvenser, som beskrevet af Karin, m., et al., Nature (1982) 299: 797-802.

27 DK 173172 B1

En intermediær værtsvektor, pMT, blev opnået ved ligation af promotoren i pUC8 som følger:

Plasmid 84H (Karin, M., et al., (se ovenfor)), der bærer hMTII-5 genet, blev fordøjet til fuldstændighed med BamHI, behandlet med exonuklease Bal-31 for at fjerne terminale nukleotider og derpå fordøjet med Hindlll for at få frigjort et 840 bp fragment indeholdende nukleotiderne -765 til +70 af hMTII-genet (nukleotid +1 er det første transcriberede nukleotid). 840 bp 10 fragmentet blev isoleret og ligeret med Hindlll/HincII-fordøjet pUC8 (Vieira, J., et al., Gene (1982) 1J3: 259-268) og ligationsblandingen blev transformeret i E. coli MC1061. Den rette konstruktion af pMT blev bekræftet ved dideoxynukleotidsekvensering.

15

Ydermere blev der også fremstillet et derivat af pMT, pMT-Apo, indeholdende regulatoriske C-terminalsignaler. pMT-Apo huser en del af human-leverproteinet apoAI-genet (Shoulders, C. C., et al., Nucleic Acids Res (1983) 11/, 2827-2837), som indeholder de 20 regulatoriske 3'-terminalsignaler. Et Pstl/PstI 2,2 kb fragment af apoAI-genet (stumpendet) blev klonet i Smal-stedet af pMT-polylinkerområdet, og hovedparten af apoAI-genet blev fjernet ved fordøjelse med BamHI, stumpendet med klenow, fordøjet med Stul, og religeret. Den resulterende vektor indeholdte omtrent 25 500 bp af apoAI-genet fra 3’ terminus, som bekræftes ved dideoxy-sekvenseringsanalyse.

Yderligere ekspressionsvektorer, som indeholdt SV40 viralforstærker, blev også konstrueret ved at indsætte et 1100 30 bp SV40 DNA-fragment i Hindlll-stedet, som var skåret med Hindlll, og 1100 bp SV40 DNA-fragmentet blev isoleret ved gelelektroforese og ligeret i Hindlll-fordøjet, CIP-behandlet pMT. De resulterende vektorer, der benævnes pMT-SV(9) og pMT-SV(10), indeholder fragmentet i modsatte orienteringer forud 28 DK 173172 B1 for MT-11-promotoren. I pMT-SV(9) er forstærkeren ca. 1600 bp fra 5' mRNA startstedet. I den modsat orienterede SV(10) er den ca. 980 bp fra 5’ mRNA startstedet. Begge orienteringer er brugbare, men den orientering, hvori forsærkersekvenserne er 5 proximale i forhold til startstedet, tilvejebringer højere ekspressionsniveauer.

500 bp apoAI-fragmentet blev indsat i pMT-SV(lO) ved at isolere dette fragment, som var opnået ved fordøjelse af pMT-Apo 10 (beskrevet ovenfor) og ligere det isolerede i EcoRI/BamHI-fordøjet pMT-SV(10) til opnåelse af den ønskede værtsvektor, pMTApo10.

Den stumpendede EcoRI-indføj eiser af SP-5- klonerne i figurerne 15 2 og 3 blev placeret i BamHI-fordøjet pMTApolO til opnåelse af pMT(E):SP-5-vektorer og transformeret til CHO-celler.

D.5.Ekspression i pattedyrsceller 20 Kinesisk hamsterovarie (CHO)-Kl-celler blev dyrket på et medium bestående af en 1:1 blanding af Coon's F12-medium og DMEM 21-medium med 10% føtalt kalveserum. De kompetente celler blev co-transformeret med vektoren af interesse og pSV2:NEO (Southern, P., et al., J. Mol. Appl. Genet (1982) 1: 327-341). pSV2:NEO 25 indeholder et funktionelt gen, som giver resistens over for neomycinanalogen G418. Ved en typisk transformation blev 0,5 μg pSV2-NEO og 5 μg eller mere ekspressionsvektor DNA overført til en 100 mm skål med celler. Calciumphosphat-DNA-co-precipitation i overensstemmelse med protokollen ifølge Wigler, M., et al., 30 Cell (1979) 1_6: 777-785, blev anvendt med inklusion af et to min "chok" med 15% glycerol i PBS efter 4 timers udsættelse for DNA.

29 DK 173172 B1

Kort fortalt udsås cellerne med 1/10 sammenløb, dyrkes natten over, vaskes to gange med PBS og placeres i 0,5 ml Hepes-pufret saltopløsning indeholdende CaP04-DNA-co-præcipitatet i 15 min og fodres derpå med 10 ml medium. Mediet fjernes ved 5 bortsugning og erstattes med 15% glycerol i PBS i 1,5-3 min. De chokerede celler vaskes og fodres med dyrkningsmedium. Indtil induktion af MT-II-styret ekspression indeholder mediet F12/DMEM21, 1:1 med 10% FBS. En dag senere udsættes cellerne for 1 mg/ml G418 for at tilvejebringe en pulje af G418-10 resistente kolonier. Vellykkede transformanter, der også har en stabil nedarvning af det ønskede plasmid, udplades derved med lav tæthed for at oprense klonale isolater.

Transformanterne analyseres for produktion af det ønskede 15 protein, først som puljer og derpå som isolerede kloner i multibrønds plader. Pladeanalyseomfang er noget afhængig af brøndestørrelsen, f.eks. er resultater fra 24 brønds plader ikke direkte sammenlignelige med de fra 96 brønds plader. Kloner, som ved pladeanalyser viser sig at producere proteinet 20 i tilfredstillende omgang kan derpå dyrkes i produktionsgennemløb i rulleflasker. Produktionsomfanget er typisk højere, når der udføres en opskallering. Der er imidlertid ingen absolut korrelation mellem ydeevne ved pladeanalyse og i rulleflasker, dvs. kulturer, som er de bedste 25 producenter ved pladeanalyse er ikke nødvendigvis de bedste efter opskallering. På grund af dette analyseres typisk 100-200 eller flere individuelle kloner ved forskellige screeningsmetoder på plader, og 5-10 af de højestproducerende analyseres under produktionsforhold (rulleflasker).

30

Puljer af transformerede celler blev dyrket i multibrønds plader og blev derpå udsat for en fra 5 x 10“5 til 1 x 10”^ zinkionkoncentration for at inducere ASP-produktion.

30 DK 173172 B1

Semisammenløbne monolag af individuelle cellelinier, som vokser i McCoy's 5A medium med 10% FBS blev vasket med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og genfodret med McCoy's indeholdende 10% FBS, 1 x 10"^ zinkchlorid, og 0,25 mM natriumascorbat.

5 (Ascorbat kan hjælpe til at mediere hydroxylering af prolinenheder). 24 Timer efter induktion blev cellerne vasket med PBS og genfodret med serumfrit McCoy's indeholdende zinkchlorid og ascorbat. Efter 12 timer blev det konditionerede medie høstet.

10

For ekspression i bakterier blev det ønskede fragment cDNA # 18 (figur 2), som strækker sig fra Gly-25 med en ATG foran til det carboxyterminale Ile-197 af SP-5 "præcursoren", indsat i EcoRI/Hindlll fordøjet pTrp-233 til opnåelse af pTrp-5 og i 15 pBGal værtsvektoren til opnåelse af pBGal-5, hvori SP-5-sekvensen sammensmeltes til en β-galactosidaseleder gennem en hydroxylamin-følsom Asn-Gly.

Den spaltning af proteinet med Staph V8, som forventes ud fra 20 denne konstruktion, ved det Glu som går forud for Phe-24, og ved Glu-66 giver modent 5 kd protein, hvis den formodede C-terminus er korrekt.

Disse konstruktioner transformeres i E. coli W3110 og udtrykkes 25 som beskrevet ovenfor.

D. 6.Aktivitet af ASP-komponenterne

Evnen af de isolerede ASP-komponenter til at forstærke dannelse 30 af lipidfilm ved en luft/væskegrænseflade blev bestemt in vitro under anvendelse af den fremgangsmåde, som er beskrevet af Hagwood, S., et al., Biochemistry, (1985) 24:184-190. Kort fortalt sættes et præparat af phospholipidvesikler med et passende omfang forsøgsproteiner i et lille volumen omhyggeligt 31 DK 173172 B1 til bunden af en teflonskål indeholdende vandig puffer, en magnetomrører og en platinplade, der er ophængt ved pufferoverfladen og fastgjort til en spændt nål. Forandringer i overfladespændingen som registreres på den spændte nål optegnes 5 som funktion af tiden ved start for omrøringen.

10K Proteiner blev sat til phospholipidet ved at blande en chloroformopløsning indeholdende disse med en 2:1, volumen/volumen, chloroform:methanolopløsning af lipidet.

10 Opløsningsmidlerne blev afdampet, og de faste stoffer blev hydreret i puffer til opnåelse af vesikler. 32K Proteiner kan i vandig opløsning sættes direkte til en suspension af vesiklerne, og associering med og aggregering af vesiklerne kan måles ved turbidimetriske målinger.

15

Som beskrevet af Hagwood et al (se ovenfor) var 32K hunde-ASP i stand til at aggregere phospholipidvesikler og til at forstærke dannelse af film, når det blev inkluderet i phospholipidvesiklerne, og når phospholipiderne var de, der 20 opnås fra det overfladeaktive hundelungekompleks. Proteinernes aktivitet ifølge den foreliggende opfindelsen bestemmes under anvendelse af samme procedure til måling af aggregering og forstærkning af filmdannelse, som beskrevet af Hawgood.

25 Der blev anvendt både phospholipidpræparat fra hundelunge (300 pg), der er fremstillet som beskrevet ovenfor, og en syntetisk blanding af phospholipider. Det syntetiske phospholipid indeholdte 240 pg kommercielt opnåeligt DPPC og 60 pg ægge-PG, og det var mere uvilligt til at danne film end det naturlige 30 lipid. Imidlertid blev forsøgsphospholipidet udvalgt, for at dramatisere proteinernes aktivitet mest virkningsfuldt.

32K Proteinet og blandingen af 10K ASP blev isoleret fra hundelunge, som beskrevet ovenfor. Medens tilsætning af 60 pg 32 DK 173172 B1 32 K protein var i stand til at forstærke filmdannelsen af det "naturlige" phospholipid, som opnås fra lunge, til næsten det niveau, som udvises af komplekset alene, forstærker det kun moderat filmdannelse ved anvendelse af syntetisk lipid.

S Lignende resultater blev opnået ved tilsætning af 13 pg 10 K protein alene. Når 13 μg 10K præparat blev inkuberet med de syntetiske phospholipidvesikler forud for tilsætning af 60 pg 32K protein skete filmdannelsen imidlertid ved en hastighed og i en grad, som er sammenlignelig med den af det naturlige 10 kompleks alene. Disse resultater er vist i fig. 4.

Resultaterne for individuelle 5 kd og 18 kd human- og hundeproteiner er vist i figurerne 5 og 6, som viser afbildning af overfladetryk efter 3 min (y-akse) mod 15 proteinkoncentrationen (x-akse) . Som det fremgår af fig. 5 er det maksimalt opnåede tryk 40-45 mN/m og både 5 kd og 18 kd forårsager spredning af lipiderne ved ca. 10 pg. Dette svarer til et phospholipid:proteinforhold på 10:1 idet 100 pg lipid blev anvendt i alle tilfælde. Lipidblandingen var DPPC:PG 20 (7;3), men 8:2- og 9:l-forhold gav ingen signifikant forskellige resultater.

For hundeproteinerne, som er vist i fig. 6, er resultaterne identiske med de for humanprotein. Fig. 6 viser også 25 resultaterne fra forsøg, hvor rekombinant produceret 32K sættes til 18 kd eller 5 kd protein. Synergien mellem proteinerne er vist som de cirkelformede pletter. 10 pg 32 kd Protein blev sat til 5 pg og 7,5 pg 18 kd og 7,5 og 11 pg 5 kd protein.

30 18 kd Og 5 kd kvægproteiner gav resultater, der er identiske med de for hunde- og humanproteiner.

33 DK 173172 B1 D.7.In vivo forsøg

Det overfladeaktive kontrolmateriale (SAM) til in vivo afprøvning blev fremstillet som følger. Lunger af unge, voksne 5 kaniner blev udskyllet med saltopløsning. Raske kaniner blev bedøvet gennem ørevenen med 3 ml natriumpentobarbital. Luftrøret blev fritlagt og en 3-vejs stophane med en fastgjort slange blev indsat i luftrøret og fikseret. Brystet blev åbnet, brystvæggene blev fjernet, og lungearterien blev forsynet med 10 kateter med en størrelse 8 fødeslange fra hjertet. Kredsløbet blev gennemskyllet med 50 ml normal saltvandsopløsning, samtidig med at lungerne blev ventileret gennem luftrørsslangen med en 60 ml sprøjte, og lungerne blev derpå forsigtigt fjernet med luftrøret intakt. 60 ml Normal saltvandsopløsning 15 inddryppedes i lungerne gennem luftrørsslangen, og lungerne masseredes derpå blidt i 1 min, og saltvandsopløsningen blev tilbagesuget. Udskylningen gentoges fire gange, og skyllevandet sammenhældtes. Cellematerialet blev fjernet fra

udskylningsvæsken ved stuetemperatur ved centrifugering ved 20 1.000 x g i 2 timer. Pelleten blev suspenderet i 0,1 N

saltvandsopløsning plus 2 M CaCl2 med en endelige koncentration på 10 mg/ml phospholipid. Koncentrationen justeredes ved ekstraktion af lipiderne med chloroform og methanol og måling af lipidphosphor. I bobletensitometeret gav dette materiale 25 hurtig adsorption (tidskonstant 0,3 sekunder eller mindre) og minimale overfladespændinger på fra 0 til 3 mN/m ved 50% reduktion af arealet. Maksimal spænding ved ekspansion var på fra 32 til 35 mN/m.

30 Individerne og det apparatur, der blev anvendt til in vivo afprøvning, var som følger: sunde, unge, tidsdaterede drægtige hunkaniner blev opnået fra White Hare Rabbitory of Missouri. På 21. eller 22. dagen af drægtighedsperioden blev hunkaninerne sendt med fly og blev ved ankomsten kontrolleret til sikring 34 DK 173172 B1 af, at de var drægtige og sunde. Hunkaninerne blev anbragt i store standardkaninbure i kaninanlægget (14 92—S) og igen undersøgt dagen før anvendelse.

5 Fire plethysmografer blev konstrueret med 203 cm længder af acrylcylindre med en diameter på 5,1 cm, hvortil der var fæstnet en 7,6 cm lang kanal af en 1,3 cm acrylslange (i.d. 1,3 cm) . Kanalen blev fyldt tilstrækkeligt med bomuldsgaze til at frembringe en lav modstand mod luftgennemstrømningen ind og ud 10 af plethysmografen. Strømning ind og ud af kammeret bestemmes ved at måle differenstrykændringen mellem det indre af plethysmografen og rummet (tidskonstant mindre end 0,1 sekund). Ledninger føres fra enden af hovedcylinderen til en tryktransducer (Validyne DP45, Validyne Engineering Company, 15 Northridge, CA) og til en kalibreringssprøjte. Ved udførelse af forsøgene kalibreres det elektrisk integrerede strømningssignal (volumen) hyppigt med sprøjten. Den anden ende af hovedcylinderen forsegles med en 5,1 cm gummiprop, hvorigennem der var anbragt 2 5,1-20,3 cm metalstænger, og gennem hvilke 20 der var trukket 3 ECG-ledere. Bomuldslærred blev anbragt mellem de to metalstænger til dannelse af en slynge, på hvilken forsøgsdyret blev anbragt. Elektroder af bajonet-typen blev fastgjort til ECG-lederne. En adaptor blev anbragt gennem proppen, således at muffen på luftrørsangiokateteret kunne 25 forbindes med et gennemstrømningsforgreningsrør, som igen blev fastgjort til slangen fra en respirator (Mark VIII, Bird Respirator Company, Palm Springs, CA) . Det eksterne restrum i luftvejen var på fra 0,05 til 0,07 ml. Luftvejstrykket blev målt i forgreningsrøret med en Alltech MSDICE/1 transducer 30 (Alltech, City of Industry, CA) . Plethysmografkalibreringen er lineær ved voluminer på fra 0,01 til 1 ml og ved frekvenser på fra 10 til 100 svingninger per min. De fire plethysmografer blev monteret i et enkelt vandbad, der var opvarmet til 37°c. Hvert dyr havde sin egen respirator. Omskiftningsanordninger 35 DK 173172 B1 tillod at strømning, volumen, luftvejstryk og ECG optegnedes for hver kanin sekvensvis på et Brush-optegningsapparat. Almindeligvis anvendes tre dyr i 1 min, hvor hver 5 min fra hvert dyr optegnes.

5

Den anvendte procedure var som følger. Der anvendtes kaninunger med et undfangelsesliv på 27 dage ± 4 timer. Efter at have givet en dosis spinalanæsthesi (1 ml pontocain), blev bugen åbnet og livmoderen blotlagt. 2 Min før åbningen af livmoderen 10 modtog hvert foster 15 mg/kg pentobarbital og 0,1 mg/kg pancuronium interperitonealt. Når føtalbevægelsen stopper er fostrene bedøvede, og de udtages hurtigt. Efter vejning udvælges tre unger med ca. samme vægt til forsøget. Unger med tydelige anomaliteter undersøges ikke. Ungerne må have en vægt 15 på mellem 22 og 40 g (gennemsnit ± 2 SD) . Luftrørene forsynes med 18 gauge angiokatetere samtidig med, at de holdes varme.med strålevarme. Efter forsyning med kanyler indføres 0,2 ml af enten saltvandsopløsning, SAM eller forsøgsstof (opvarmet til 37°c i et H20-bad og derpå ført gennem en 25 g nål x 5 til 20 sikring af ensartet blanding af materialet) i luftrøret hos 3 matchende unger fra hvert kuld samtidig med, at brystet sammenpressedes blidt indtil der kom lungevæske til syne ved nålens muffe, således at der frembragtes en væske-til-væske grænseflade. Behandlingen efterfølges af 0,45 ml luft.

25

Alle forsøgsforbindelser (men ikke saltvandsopløsning eller SAM-kontroller) indeholdt 50 mg phospholipid/kg, der blev indgivet som 0,2 ml per dyr med 10 mg phospholipid/ml. Koncentration og dosis var konstante for hver undersøgelse.

30 Dyrene blev anbragt på slyngerne, ECG-elektroderne fastgjort, og tracheotomirøret forbundet til en adaptor, som var forbundet til en respirator. Det gennemsnitlige tidsforløb fra indgivelse til påbegyndelse af understøttet ventilation var 10 min, og maksimalt tidsforløb var 15 min. Ventilationen påbegyndtes med 36 DK 173172 B1 oxygen ved en frekvens på 48 åndedræt/min under anvendelse af en inspirationstid på 0,35 sekunder. I det første min var de ventilatoriske indstillinger ens for alle dyr, nemlig inspirationstid 0,35 sekunder, højeste inspirationstryk 40 cm 5 H20. Efter det første min justeredes inspirationstrykket således at respirationsvoluminet holdtes på 6,5-7,5 ml/kg. Dyrenes vægt var ca. 30 g så dette blev opnået med et absolut volumen på ca. 0,21 ml. Flowet, åndedrætsvoluminet og luftvejstrykket optegnedes hvert 5 min for hver af de tre 10 kuldmedlemmer. Dyrene ventileredes i 30 min.

Resultater for alle dyr i en gruppe blev kasseret, hvis 1 medlem udviklede luftlækage eller døde af andre årsager.

15 Efter 30 min ventilation lukkedes luftrørsslangerne med stophanerne, og lungerne fik lov til at aflufte i 10 min. Derpå blev hvert luftfyldt angiokateter forbundet med en horisontal, kalibreret plastslange med en længde på 5 mm indeholdende 3 ml luft i lungeenden og farvet vand i den anden ende. De 20 væskefyldte ender af tre plastslanger blev forbundet via et forgreningsrør til et enkelt reservoir med farvet vand, hvis overflade var på samme niveau som slangernes. Dette reservoir kunne hæves med 50 cm vandtrin, som tilsvarende øger trykket i slangen og lungerne. Når trykket stiger eller falder, kommer 25 der luft ind eller ud af lungerne og forskubber væskesøjlen, hvorved måling af luftvolumemændringer muliggøres. Dette apparat svarer til det, der er beskrevet af Robertson, B. Lung (1980) 158:57-68. Trykket øgedes gradvis fra 0 til 5, 10, 15, 20, 25, 30 cm H20 med en pause på 1 min for hvert niveau før 30 optegning af volumenændringen. Efter 1 min ved 20 mm H20 mindskedes trykket med 5 cm H20 formindskelser, hvor hvert tryk igen opretholdes i 1 min før optegning af voluminet. Hver volumenmåling korrigeres for kompression. Under undersøgelserne 37 DK 173172 B1 blev dyrene holdt ved 37°C ved anbringelse af dem i et vandbad lige under overfladen.

Resultater opnåedes for PjNg, eftergivenhed (C) og volumen ved 5 specifikke tryk (Vp). PINg er det tryk# som er nødvendig for at opretholde et nettolungevolume. Lavere tal indikerer naturligvis effektivitet. Eftergivenhed, der er et mål for hvor let lungerne oppustes, måltes også, og høje værdier er ønskelige. Vp Er voluminet af lungerne i cm3 ved det noterede 10 tryk i cm vand. Resultaterne var som følger.

For Pins efter 30 min er resultaterne anført i tabel 1 (PL er phospholipid, 32K protein er human-32 kd-ASP, som er produceret i CHO-celler, og 10K er en blanding af 5 kd, 8 kd og 18 kd af 15 isolerede naturlige humanproteiner).

Tabel 1

Behandling n PINS

20 _ _ _ SAM 13 18 ± 4

Saltopløsning (kontrol) 9 31 ± 1 PL alene 4 32 ± 1 PL + 32K 3 28 ± 5 25 PL + 10K 8 17 ± 2 PL + 10K (200:1) + 32K (4:1) 8 20 ± 5 PL + 10K (200:1) 5 25 dt 8 PL + 18 kd (50:1) 21, 22, 20 PL + 5 kd (50:1) 19 30

Som det fremgår af tabel 1 er 32K alene minimal effektiv, medens 10K blandingen eller 5 kd eller 18 kd proteinerne alene er rimelig effektive. Tilsætning af 32K proteinet til 10K blandingen øger imidlertid effektiviteten.

38 DK 173172 B1

For eftergivenhed er der i tabel 2 anført tilsvarende resultater.

5 Tabel 2

Behandling n Eftergivenhed SAM 13 0/441 ± 0,113

Saltopløsning (kontrol) 9 0,243 ± 0,025 10 PL alene 4 0,219 ± 0,028 PL + 32K 3 0,247 ± 0,029 PL + 10K 8 0, 467 ± 0,078 PL + 10K (200:1) + 32K (4:1) 8 0,401 ± 0,041 PL + 10K (200:1) 5 0, 328 ± 0,176 15 PL + 18 kd (50:1) 0,4 ± 0,045 PL + 5 kd (50:1) 0,4 ± 0,045

Igen udviser 10K blandingen eller 18 kd og 5 kd proteinerne god aktivitet, og medens 32K er meget mindre effektiv. Tilsætning 20 af 32K proteinet øger i høj grad aktiviteten af 10K blandingen.

I tabellerne 3 og 4 er anført V30 henholdsvis V5 (30 cm vand og 5 cm vand).

Tabel 3 25

Behandling n V3Q

SAM 12 72 ± 9

Saltopløsning (kontrol) 4 23 ± 11 30 PL alene 1 26 PL + 32K 3 38 ± 15 PL + 10K 7 65 ± 9 PL + 10K (200:1) + 32K (4:1) 7 58 ± 11 PL + 10K (200:1) 2 55 ± 33 39 DK 173172 B1

Tabel 4

Behandling n V5 5 _ _ _ SAM 12 56 ± 9

Saltopløsning (kontrol) 4 11 ± 7 PL alene 2 14 PL + 32K 3 20 ± 7 10 PL + 10K 7 48 ± 9 PL + 10K (200:1) + 32K (4:1) 7 45 ± 10 PL + 10K (200:1) 2 43 ± 27

Resultaterne følger de, der er opnået for PINS °9 eftergivenhed 15 i de foregående tabeller.

De resultater, som opnås for de tilsvarende kvægproteiner, svarer hertil.

20 D.8.Værtsvektorer pTrp233 Fremstilles ud fra pKK233-2, som er beskrevet detaljeret i Amann, E., et al., Gene (1985) 4£:183-190, ved at erstatte tac-promotoren af pKK233-2 med en syntetisk trp-25 promotor med den i fig. 8 viste sekvens. Ndel-stedet på udgangsplasmidet elimineres ved at fordøje pKK233-2 med Ndel, stumpendet med Klenow og religere. Ndel-minusproduktet blev derpå fordøjet med EcoRI og PstI og ligeret til en EcoRI/PstI fordøjelse af den syntetiske trp-promotor i fig. 15 til 30 opnåelse af den ønskede vektor, pTrp233.

For at fremstille pBGal-værtsvektoren blev pTrp233 fordøjet med EcoRI, oprenset på en gel og stumpendet med Klenow. Plasmidet blev religeret og forstærket i E. coli til opnåelse af det 40 DK 173172 B1 korresponderende plasmid, som mangler EcoRI-stedet. En syntetisk oligonukleotidsekvens, som koder for aminoterminus af β-galatosidase fulgt af seks threoninenheder, ^ (thr)6_·,.

CO ’TATGACCATGATTACGflA ATTTAACCACCACCACCACCACCGAATTCATT^ t33 jACTG(?TACTAAT6CTTAA|ATTGGTGGTG6TCGTCGTGGCTTAAOTAATTCOAt Ndol' EcoflI Hlndlll 10 blev ligeret til Ndel/Hindlll fordøjet intermediær plasmid, og plasmider indeholdende indføjelsen (pBGal-værtsvektor) blev identificeret ved følsomhed over for EcoRI-spaltning.

For at konstruere pTrp-20 blev en del af SP-18 cDNA # 3 sammen 15 med et syntetisk fragment ligeret i Ndel/Hindll fordøjet pTrp233. SP-18-Fragmentet, der er ligeret i pUC-9, som beskrevet ovenfor, blev udskåret ved fordøjelse med PstI {skærer ved nukleotid 694) og med Hindlll (skærer efter 3’-enden i plasmidpolylinkeren). To oligonukleotider blev 20 fremstillet, som, når de reassocieres, koder for enhederne opstrøms for nukleotid 694 til N-terminus (enhed 201) og en forudgående methionin (ATG): 2 5 TATGTTCCCCATTCCTCTCCCCTATTGCTGGCTCTGCA og

GAGCCAGCAATAGGGAGAGGAATGGGGAACA

Disse oligonukleotider blev reassocieret, ligeret til det 30 skårede cDNA og indsat i den fordøjede vektor til opnåelse af pTrp-20.

For at konstruere pBGal-20 blev der anvendt en analog fremgangsmåde ved anvendelse af EcoRI/Hindlll fordøjet pBGal- 41 DK 173172 B1 værtsvektor, Pstl/Hindlll udskåret SP-18 DNA og de udfyldende nukleotider: AATTGAACGGTTTCCCCATTCCTCTCCCCTATTGCTGGCTCTGCA og 5 GAGCCAGCAATAGGGGAGAGGAATGGGGAAACCGTTG, til opnåelse af pBGal-20.

10 Vektorer til udtryk af genet, som koder for kortere former af SP-18, blev konstrueret ud fra pTrp-20 eller pBGal-20. For at konstruere pTrp-9 blev pTrp-20 skåret med Ncol (nukleotid 846) og Hindlll, og forenet med de reassocierede oligonukleotider 15 CATGGATGACAGCGCTGGCCCAGGGTA 0<3 AGCTTACCTTGGGCCAGCGCTGTCATC.

pBGal-9 Blev konstrueret på fuldstændig tilsvarende måde under 20 anvendelse af pBGal-20 som udgangsmateriale.

For at konstruere vektorer, som koder for SP-5, blev cDNA # 18 (fig. 2) fordøjet med Smal (nukleotid 94-nukleotid 680), og det Smal-udskårede fragment blev indsat i Smal-stedet på pUC8. Fra 25 det klonede gen blev det fragment, som blev udskåret ved fordøjelse med ApaLI (nukleotid 123) og Hindlll (linker), ligeret med Ndel/Hindlll-fordøjet pTrp-223 og de forenende reassocierede nukleotider: 30 TATGGGCATTCCCTGCTGCCCAG og TGCACTGGGCAGCAGGGAATGCCCA.

til opnåelse af pTrp-5.

42 DK 173172 B1 På tilsvarende måde blev pGBal-5 (N:G) og pBGal-5 (V8) konstrueret under anvendelse af det samme udskårne cDNA-fragment, pBGal-vaertsvektor skåret med EcoRI og Hindlll og 5 nukleotidparrene: AATTCAACGGCATTCCCTGCTGCCCAG 99 TGCACTGGGCAGCAGGGAATCCCGTTG; 10 henholdsvis AATTCGGCATTCCCTGCTGCCCAG °9 TGCACTGGGCAGCAGGGAATGCCG.

Claims (9)

43 DK 173172 B1

1. Rekombinant overfladeaktivt alveolarprotein (ASP), kendetegnet ved, at kodes af human-SP-5-DNA eller hunde-

2. Protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det kodes af det DNA, der er illustreret i figurerne 2 eller 3.

3. Rekombinant-DNA-sekvens, som koder for proteinet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er fri for DNA, som koder for proteiner, der almindeligvis er forbundet med proteinerne ifølge krav 1.

4. DNA ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er operativt forbundet til styresekvenser, der er effektive til at udtrykke sekvenserne i egnede rekombinante værtsceller.

5. Rekombinant værtscelle, kendetegnet ved, at den 20 er transformeret med DNA'et ifølge krav 3 eller ekspressionssystemet ifølge krav 4.

5 SP-5-DNA.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af ASP, kendetegnet ved, at cellerne ifølge krav 5 dyrkes. 25

7. Rekombinant-ASP, kendetegnet ved, at det fremstilles ved fremgangsmåden ifølge krav 6.

8. Farmaceutisk præparat, der er effektivt ved behandling af 30 respiratorisk distress-syndrom (RDS) i pattedyr, kendetegnet ved, at præparatet omfatter proteinet ifølge krav 1 eller 7 i blanding med et phospholipidpræparat og eventuelt en farmaceutisk acceptabel bærer. 44 DK 173172 B1

9. Farmaceutisk præparat, der er effektivt ved behandling af RDS i pattedyr, kendetegnet ved, at præparatet omfatter proteinet ifølge krav 1 eller 7 i blanding med en effektiv mængde 32K ASP-protein sammen med et 5 phospholipidpræparat og eventuelt sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.