JPH05207883A - 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド - Google Patents
魚類の新規成長ホルモンポリペプチドInfo
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- JPH05207883A JPH05207883A JP4204982A JP20498292A JPH05207883A JP H05207883 A JPH05207883 A JP H05207883A JP 4204982 A JP4204982 A JP 4204982A JP 20498292 A JP20498292 A JP 20498292A JP H05207883 A JPH05207883 A JP H05207883A
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- JP
- Japan
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- dna
- growth hormone
- fishes
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- cdna
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを含む微生物。 【効果】 魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換え体
ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらは魚類の新規成長
ホルモンポリペプチドの大量生産に利用することができ
る。
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを含む微生物。 【効果】 魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換え体
ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらは魚類の新規成長
ホルモンポリペプチドの大量生産に利用することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は魚類の新規成長ホルモン
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込ん
だ組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物に関
する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖産業分野におい
て広い用途が期待される。
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込ん
だ組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物に関
する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖産業分野におい
て広い用途が期待される。
【０００２】
【従来の技術】哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体におい
て生産されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、ユー・ジ
ェイ・レビィス（U.J.Lewis)らによってジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（ J.Am.Che
m.Soc.), 80 , 4429(1958)に、エイ・エス・ハートリ
ー（A. S. Hartree)によってバイオケミカル・ジャーナ
ル（Biochem.J.), 100 ,754(1966)に、シー・エイチ・
リー（C.H.Li) らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストリイ・アンド・バイオフィジクス・（サプルメン
ト）〔Arch.Biochem.Biophys. (Suppl.)〕, １，327 (1
962)に報告されている。
て生産されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、ユー・ジ
ェイ・レビィス（U.J.Lewis)らによってジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（ J.Am.Che
m.Soc.), 80 , 4429(1958)に、エイ・エス・ハートリ
ー（A. S. Hartree)によってバイオケミカル・ジャーナ
ル（Biochem.J.), 100 ,754(1966)に、シー・エイチ・
リー（C.H.Li) らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストリイ・アンド・バイオフィジクス・（サプルメン
ト）〔Arch.Biochem.Biophys. (Suppl.)〕, １，327 (1
962)に報告されている。
【０００３】魚類の成長ホルモンについても、これまで
に単離されたという報告は多く見られるが、その生理活
性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数が少な
い。信頼性のある報告の例には次のようなものがある。 ティラピアよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
（S. W. Farmer）ら、ジエネラル・アンド・コンパラテ
イブ・エンドクリノロジイ（Gen. Comp. Endocrin.,
30, 91(1976). チョウザメよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
（S. W. Farmer）ら、エンドクリノロジイ（Endocrinol
ogy), 108, 377(1981). コイよりの単離例：エイ・エフ・クック（A. F. Cook）
ら、ジエネラル・アンド・コンパラテイブ・エンドクリ
ノロジイ（Gen. Comp. Endocrin.),50, 335(1983). 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ（P.H. S
eeburg）ら：ネイチャー（Nature) 270, 486(1977)
〕，ウシおよびブタの成長ホルモン遺伝子〔ピー・エ
イチ・シーバーグ（P.H. Seeburg）ら：デイー・エヌ・
エイ（DNA), ２, 37 (1983)〕、ヒト成長ホルモン遺伝
子〔ジエイ・エイ・マーシャル（J. A. Martial)ら：サ
イエンス（Science), 205,602(1979)〕などがすでに知
られており、魚類の成長ホルモン遺伝子についても本発
明者らにより既に単離されている〔特願昭59-134536 お
よび同59-213360 〕。該遺伝子によりコードされる魚類
成長ホルモンポリペプチドは、川内らにより先にサケ脳
下垂体より調製され、硬骨魚類における成長促進効果を
有することも確認されているサケ成長ホルモンポリペプ
チド〔特願昭59-68670〕で、Ｎ末端（40個）、Ｃ末端
（21個）のアミノ酸配列が完全に一致していた。
に単離されたという報告は多く見られるが、その生理活
性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数が少な
い。信頼性のある報告の例には次のようなものがある。 ティラピアよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
（S. W. Farmer）ら、ジエネラル・アンド・コンパラテ
イブ・エンドクリノロジイ（Gen. Comp. Endocrin.,
30, 91(1976). チョウザメよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
（S. W. Farmer）ら、エンドクリノロジイ（Endocrinol
ogy), 108, 377(1981). コイよりの単離例：エイ・エフ・クック（A. F. Cook）
ら、ジエネラル・アンド・コンパラテイブ・エンドクリ
ノロジイ（Gen. Comp. Endocrin.),50, 335(1983). 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ（P.H. S
eeburg）ら：ネイチャー（Nature) 270, 486(1977)
〕，ウシおよびブタの成長ホルモン遺伝子〔ピー・エ
イチ・シーバーグ（P.H. Seeburg）ら：デイー・エヌ・
エイ（DNA), ２, 37 (1983)〕、ヒト成長ホルモン遺伝
子〔ジエイ・エイ・マーシャル（J. A. Martial)ら：サ
イエンス（Science), 205,602(1979)〕などがすでに知
られており、魚類の成長ホルモン遺伝子についても本発
明者らにより既に単離されている〔特願昭59-134536 お
よび同59-213360 〕。該遺伝子によりコードされる魚類
成長ホルモンポリペプチドは、川内らにより先にサケ脳
下垂体より調製され、硬骨魚類における成長促進効果を
有することも確認されているサケ成長ホルモンポリペプ
チド〔特願昭59-68670〕で、Ｎ末端（40個）、Ｃ末端
（21個）のアミノ酸配列が完全に一致していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】魚類の成長ホルモンは
魚類の成長促進効果を有するので、養魚用餌料の組成物
として有用であるが、魚類の脳下垂体からの採取は供給
量が限られている。従って魚類の成長ホルモンを安価に
大量に供給する方法の開発が望まれている。
魚類の成長促進効果を有するので、養魚用餌料の組成物
として有用であるが、魚類の脳下垂体からの採取は供給
量が限られている。従って魚類の成長ホルモンを安価に
大量に供給する方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換えＤ
ＮＡ技法により魚類の成長ホルモンを製造する方法につ
いて研究を行った。その結果、魚類の成長ホルモン製造
に使用することができる、魚類の成長ホルモンポリペプ
チドに相補的なＤＮＡの採取ならびにこれを含む組換え
体ＤＮＡおよび微生物の製造に成功した。即ちサケ脳下
垂体からメッセンジャーＲＮＡ(mRNA)を抽出し、これと
相補的なＤＮＡ(cDNA)を合成し、次いでサケの成長ホル
モンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロ
ーブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮ
Ａを選択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をク
ローン化することに成功し、すでに特許出願した（特願
昭59-134536 および同59-213360)。さらにいくつかのサ
ケ成長ホルモン遺伝子を詳細に検討する過程で、先に特
許出願したものと相関性の高い別の遺伝子があることが
わかり、そのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。本発明
者らはさらに研究を進め、該新規サケの成長ホルモンを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微
生物を培養することにより、培養物中にサケ成長ホルモ
ンポリペプチドが著量生成蓄積することを見い出し、本
発明を完成するに到った。
ＮＡ技法により魚類の成長ホルモンを製造する方法につ
いて研究を行った。その結果、魚類の成長ホルモン製造
に使用することができる、魚類の成長ホルモンポリペプ
チドに相補的なＤＮＡの採取ならびにこれを含む組換え
体ＤＮＡおよび微生物の製造に成功した。即ちサケ脳下
垂体からメッセンジャーＲＮＡ(mRNA)を抽出し、これと
相補的なＤＮＡ(cDNA)を合成し、次いでサケの成長ホル
モンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロ
ーブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮ
Ａを選択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をク
ローン化することに成功し、すでに特許出願した（特願
昭59-134536 および同59-213360)。さらにいくつかのサ
ケ成長ホルモン遺伝子を詳細に検討する過程で、先に特
許出願したものと相関性の高い別の遺伝子があることが
わかり、そのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。本発明
者らはさらに研究を進め、該新規サケの成長ホルモンを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微
生物を培養することにより、培養物中にサケ成長ホルモ
ンポリペプチドが著量生成蓄積することを見い出し、本
発明を完成するに到った。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、魚類の新規成長ホルモンポリペプチド、とくに配列
番号１に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを
提供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用い
て下記のごとく製造することができる。即ち、魚類成長
ホルモンのｍＲＮＡを鋳型として用いて該ｍＲＮＡに相
補性を示すＤＮＡ（ｃDNA)を調製し、該ｃＤＮＡを組み
込んだ組換え体プラスミドを調製する。さらに、該組換
え体プラスミドを宿主微生物に挿入する。該ＤＮＡおよ
び組換え体プラスミドは、とくにエッシエリヒア・コリ
のような細菌中で新規成長ホルモン遺伝子の増幅に使用
することができる。該組換え体プラスミドを有する微生
物は魚類の新規成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造するために有用である。
は、魚類の新規成長ホルモンポリペプチド、とくに配列
番号１に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを
提供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用い
て下記のごとく製造することができる。即ち、魚類成長
ホルモンのｍＲＮＡを鋳型として用いて該ｍＲＮＡに相
補性を示すＤＮＡ（ｃDNA)を調製し、該ｃＤＮＡを組み
込んだ組換え体プラスミドを調製する。さらに、該組換
え体プラスミドを宿主微生物に挿入する。該ＤＮＡおよ
び組換え体プラスミドは、とくにエッシエリヒア・コリ
のような細菌中で新規成長ホルモン遺伝子の増幅に使用
することができる。該組換え体プラスミドを有する微生
物は魚類の新規成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造するために有用である。
【０００７】従って、本発明は、魚類の新規成長ホルモ
ンポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込
んだ組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物お
よび該微生物を用いる新規成長ホルモンポリペプチドの
製造法を提供する。本発明のＤＮＡと組換え体プラスミ
ドは下記の一般的手法で調製される。シロザケ脳下垂体
より全RNA を調製し、これをオリゴ(dT)セルロース〔ol
igo(dT)cellulose〕カラムを通すことによりポリアデニ
ル酸〔ポリ(A) 〕を有するＲＮＡ〔ポリ(A) ＲＮＡ〕を
分離する。
ンポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込
んだ組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物お
よび該微生物を用いる新規成長ホルモンポリペプチドの
製造法を提供する。本発明のＤＮＡと組換え体プラスミ
ドは下記の一般的手法で調製される。シロザケ脳下垂体
より全RNA を調製し、これをオリゴ(dT)セルロース〔ol
igo(dT)cellulose〕カラムを通すことによりポリアデニ
ル酸〔ポリ(A) 〕を有するＲＮＡ〔ポリ(A) ＲＮＡ〕を
分離する。
【０００８】このポリ(A) ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素により二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内
ＤＮＡ組換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡの
ようなベクターＤＮＡに該合成ＤＮＡを挿入して得られ
る。次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製
法について具体的に説明する。
素により二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内
ＤＮＡ組換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡの
ようなベクターＤＮＡに該合成ＤＮＡを挿入して得られ
る。次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製
法について具体的に説明する。
【０００９】捕獲されたシロザケより脳下垂体を摘出
し、即座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート(guanidium isot
hiocyanate) を加え破砕し、可溶化する。次いでＣｓＣ
ｌ溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全細胞質ＲＮ
Ａを得る。またグアニジウム・イソチオシアネート可溶
化物にＬｉＣｌを加えてＲＮＡのみを沈殿させ回収する
こともできる。
し、即座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート(guanidium isot
hiocyanate) を加え破砕し、可溶化する。次いでＣｓＣ
ｌ溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全細胞質ＲＮ
Ａを得る。またグアニジウム・イソチオシアネート可溶
化物にＬｉＣｌを加えてＲＮＡのみを沈殿させ回収する
こともできる。
【００１０】抽出したＲＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの
高塩濃度（たとえば0.５Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ (d
T) セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有する
ｍＲＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ
リ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。以下、オカヤマ
−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔オカヤマ・アンド・
バーグ（Okayama ＆ Berg)；モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.）２,161(198
2)〕に従い、ｃDNA の合成および、そのベクターへの組
み込みを行う。
高塩濃度（たとえば0.５Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ (d
T) セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有する
ｍＲＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ
リ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。以下、オカヤマ
−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔オカヤマ・アンド・
バーグ（Okayama ＆ Berg)；モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.）２,161(198
2)〕に従い、ｃDNA の合成および、そのベクターへの組
み込みを行う。
【００１１】まずベクタープライマーを合成する。ベク
ターとしてはたとえばｐＣＤＶ１を適当な溶液、たとえ
ばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば pH7.5, 10mM), Ｍ
ｇＣｌ2(たとえば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１０ｍ
Ｍ）を含む溶液中でＫｐｎＩで 処理し、ｐＣＤＶ１の
ＫｐｎＩ部位を切断する。このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ
緩衝液（たとえばpH 6.8, 30mM), カコジル酸ナトリウ
ム（たとえば１４０ｍＭ），ＣｏＣｌ2(たとえば１ｍ
Ｍ），ジチオスレイトール（たとえば0.１ｍＭ）および
ｄＴＴＰ（たとえば0.２５ｍＭ）中、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度
（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イ
ンキュベートし、ベクターＤＮＡの両３’末端に６０個
前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをト
リス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ7.５，10ｍＭ）、Ｍ
ｇＣｌ2 （たとえば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１０
０ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断後、低融点アガ
ロースゲル電気泳動〔ラルス・ウイスランダー（Lars W
ieslander ）: アナリティカル・バイオケミストリイ
（Analytical Biochemistry,）98，３０５(1979)〕にて
分画し、約3.1 キロベースの断片を回収する。次いで該
ＤＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃度（たとえば0.
５Ｍ）溶液に溶解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに
通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープライマー分子の
みをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ
（Ｔ）の付加したベクタープライマー分子のみを単離す
る。
ターとしてはたとえばｐＣＤＶ１を適当な溶液、たとえ
ばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば pH7.5, 10mM), Ｍ
ｇＣｌ2(たとえば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１０ｍ
Ｍ）を含む溶液中でＫｐｎＩで 処理し、ｐＣＤＶ１の
ＫｐｎＩ部位を切断する。このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ
緩衝液（たとえばpH 6.8, 30mM), カコジル酸ナトリウ
ム（たとえば１４０ｍＭ），ＣｏＣｌ2(たとえば１ｍ
Ｍ），ジチオスレイトール（たとえば0.１ｍＭ）および
ｄＴＴＰ（たとえば0.２５ｍＭ）中、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度
（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イ
ンキュベートし、ベクターＤＮＡの両３’末端に６０個
前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをト
リス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ7.５，10ｍＭ）、Ｍ
ｇＣｌ2 （たとえば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１０
０ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断後、低融点アガ
ロースゲル電気泳動〔ラルス・ウイスランダー（Lars W
ieslander ）: アナリティカル・バイオケミストリイ
（Analytical Biochemistry,）98，３０５(1979)〕にて
分画し、約3.1 キロベースの断片を回収する。次いで該
ＤＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃度（たとえば0.
５Ｍ）溶液に溶解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに
通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープライマー分子の
みをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ
（Ｔ）の付加したベクタープライマー分子のみを単離す
る。
【００１２】次にリンカーＤＮＡを合成する。たとえば
ｐＬ１ＤＮＡを適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩
衝液（たとえばｐＨ7.５，１０mM），ＭｇＣｌ2 （たと
えば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば５０mM）を含む溶液
中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬ１のＰｓｔＩ部位を切断す
る。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加え
る以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処理
し、１５個前後のオリゴ(dG)鎖を付加する。該ＤＮＡを
適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ7.５，１０ｍＭ），ＭｇＣｌ2(たとえば６ｍＭ），
ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中ＨｉｎｄII
I にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約0.５キ
ロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパーにて
回収する。このようにしてリンカーＤＮＡを得る。
ｐＬ１ＤＮＡを適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩
衝液（たとえばｐＨ7.５，１０mM），ＭｇＣｌ2 （たと
えば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば５０mM）を含む溶液
中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬ１のＰｓｔＩ部位を切断す
る。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加え
る以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処理
し、１５個前後のオリゴ(dG)鎖を付加する。該ＤＮＡを
適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ7.５，１０ｍＭ），ＭｇＣｌ2(たとえば６ｍＭ），
ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中ＨｉｎｄII
I にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約0.５キ
ロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパーにて
回収する。このようにしてリンカーＤＮＡを得る。
【００１３】以上のようにして得たポリ (A)ＲＮＡ，ベ
クタープライマー，リンカーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合
成を行う。ポリ (A)ＲＮＡ，ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ8.３，５０ｍ
Ｍ），ＭｇＣｌ2 （たとえば８ｍＭ），ＫＣｌ（たとえ
ば３０ｍＭ），ジチオスレイトール（たとえば0.３ｍ
Ｍ），ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（たと
えば各々２ｍＭ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度
（たとえば３７℃）、一定時間（たとえば４０分間）反
応させる。こうして得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３’末
端に、ｄＴＴＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープラ
イマーに(dT)鎖を付加した条件と同様の操作でオリゴ(d
C)鎖を１５個前後付加する。
クタープライマー，リンカーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合
成を行う。ポリ (A)ＲＮＡ，ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ8.３，５０ｍ
Ｍ），ＭｇＣｌ2 （たとえば８ｍＭ），ＫＣｌ（たとえ
ば３０ｍＭ），ジチオスレイトール（たとえば0.３ｍ
Ｍ），ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（たと
えば各々２ｍＭ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度
（たとえば３７℃）、一定時間（たとえば４０分間）反
応させる。こうして得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３’末
端に、ｄＴＴＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープラ
イマーに(dT)鎖を付加した条件と同様の操作でオリゴ(d
C)鎖を１５個前後付加する。
【００１４】このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たと
えばｐＨ7.５，１０ｍＭ），ＭｇＣｌ2(たとえば６mM),
ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄ
IIIで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカー
ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばpH7.
５，２０ｍＭ），ＭｇＣｌ2 （たとえば４ｍＭ），（Ｎ
Ｈ4)2 ＳＯ4 （たとえば１０ｍＭ），ＫＣｌ（たとえば
0.１Ｍ），β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（β−NAD)（たとえば0.１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌
DNA リガーゼとともに一定時間（たとえば１６時間）、
一定温度（たとえば１２℃）でインキュベートする。こ
うしてｃＤＮＡとリンカーＤＮＡとの環状化が行われ
る。この反応液にｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣ
ＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう加え、大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼＩ、大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換する
ことにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラス
ミドを得る。
えばｐＨ7.５，１０ｍＭ），ＭｇＣｌ2(たとえば６mM),
ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄ
IIIで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカー
ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばpH7.
５，２０ｍＭ），ＭｇＣｌ2 （たとえば４ｍＭ），（Ｎ
Ｈ4)2 ＳＯ4 （たとえば１０ｍＭ），ＫＣｌ（たとえば
0.１Ｍ），β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（β−NAD)（たとえば0.１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌
DNA リガーゼとともに一定時間（たとえば１６時間）、
一定温度（たとえば１２℃）でインキュベートする。こ
うしてｃＤＮＡとリンカーＤＮＡとの環状化が行われ
る。この反応液にｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣ
ＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう加え、大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼＩ、大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換する
ことにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラス
ミドを得る。
【００１５】こうして得た組換えプラスミドを用い大腸
菌、たとえば大腸菌ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコ
ット（Ｓｃｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学
２, 616(1983) 〕により形質転換する。上記で得た組換
え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在す
るため、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示
す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性（Ａｐr ）菌
株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝
子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株
を選択するのに一般的に用いられる。すなわち、上記で
得られた形質転換株をニトロセルロースフィルター上に
固定し、既知のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸配列よ
り予想されるＤＮＡ配列を有する合成ＤＮＡプローブと
会合させ、強く会合するものを選択する〔グルンステイ
ン−ホグネス（Grunstein - Hogness)の方法、プロシー
デイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci)., USA., 72, 3961(1
975)〕。プローブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ジヤ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ
（J.Am. Chem. Soc.）, 97 ,7327(1975)〕で合成され
る。合成ＤＮＡプローブによる選択はサザーン（Southe
rn）らの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジイ（J. Mol. Biol.), 98, 503 (1975)〕によって
さらに確実にでき、この方法でシロザケ成長ホルモンｍ
ＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドＤＮＡを同定できる。
菌、たとえば大腸菌ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコ
ット（Ｓｃｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学
２, 616(1983) 〕により形質転換する。上記で得た組換
え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在す
るため、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示
す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性（Ａｐr ）菌
株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝
子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株
を選択するのに一般的に用いられる。すなわち、上記で
得られた形質転換株をニトロセルロースフィルター上に
固定し、既知のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸配列よ
り予想されるＤＮＡ配列を有する合成ＤＮＡプローブと
会合させ、強く会合するものを選択する〔グルンステイ
ン−ホグネス（Grunstein - Hogness)の方法、プロシー
デイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci)., USA., 72, 3961(1
975)〕。プローブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ジヤ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ
（J.Am. Chem. Soc.）, 97 ,7327(1975)〕で合成され
る。合成ＤＮＡプローブによる選択はサザーン（Southe
rn）らの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジイ（J. Mol. Biol.), 98, 503 (1975)〕によって
さらに確実にでき、この方法でシロザケ成長ホルモンｍ
ＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドＤＮＡを同定できる。
【００１６】このようにして得られる組換え体プラスミ
ドの１例がｐＳＧＨ１４である。このプラスミドをサケ
成長ホルモンをコードするＤＮＡの供給源として用いる
ことができる。微生物中でのサケ成長ホルモンをコード
するＤＮＡの発現による魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの生産：サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む
プラスミドから該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤ
ＮＡに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導
入し、得られる形質転換体を培養することによってサケ
成長ホルモンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、
これを採取することによってサケ成長ホルモンポリペプ
チドを製造することができる。
ドの１例がｐＳＧＨ１４である。このプラスミドをサケ
成長ホルモンをコードするＤＮＡの供給源として用いる
ことができる。微生物中でのサケ成長ホルモンをコード
するＤＮＡの発現による魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの生産：サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む
プラスミドから該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤ
ＮＡに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導
入し、得られる形質転換体を培養することによってサケ
成長ホルモンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、
これを採取することによってサケ成長ホルモンポリペプ
チドを製造することができる。
【００１７】サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含
むプラスミドとしては、上記ｐＳＧＨ１４が好適な例と
してあげられる。ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤ
ＮＡを微生物中で発現させることができるものなら、い
かなるものでも用いることができる。好ましくは、適当
なプロモーター、たとえばトリプトファン（trp)系、ラ
クトース(lac) 系、PL系などのプロモーターを持ち、そ
の下流にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダ
ルガーノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コ
ドン（ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩
基対に調 節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的
に好適なベクターＤＮＡとしては、プラスミドpGEL1 を
あげることができる。ｐＧＥＬ１は図４に示すプラスミ
ドで、それを含む大腸菌はEscherichia coli ＩＧＥ
Ｌ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）として昭和５９年１０
月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）
に寄託されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡと
ベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用いて両ＤＮ
Ａを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する一般
的組換えＤＮＡ手法を用いて行うことができる。
むプラスミドとしては、上記ｐＳＧＨ１４が好適な例と
してあげられる。ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤ
ＮＡを微生物中で発現させることができるものなら、い
かなるものでも用いることができる。好ましくは、適当
なプロモーター、たとえばトリプトファン（trp)系、ラ
クトース(lac) 系、PL系などのプロモーターを持ち、そ
の下流にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダ
ルガーノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コ
ドン（ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩
基対に調 節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的
に好適なベクターＤＮＡとしては、プラスミドpGEL1 を
あげることができる。ｐＧＥＬ１は図４に示すプラスミ
ドで、それを含む大腸菌はEscherichia coli ＩＧＥ
Ｌ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）として昭和５９年１０
月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）
に寄託されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡと
ベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用いて両ＤＮ
Ａを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する一般
的組換えＤＮＡ手法を用いて行うことができる。
【００１８】具体例として示したpSGH14とpGEL１の場合
は図４に示したごとく２段階の造成を行う。すなわちpS
GH14よりサケ成長ホルモン成熟ペプチドＮ末端付近をコ
ードする MboII-PvuII断片と、ｃDNA の残りの部分およ
びベクター部分を含む PvuII−HindIII 断片を別々に得
る。一方、以下のような合成ＤＮＡリンカーを作製す
る。
は図４に示したごとく２段階の造成を行う。すなわちpS
GH14よりサケ成長ホルモン成熟ペプチドＮ末端付近をコ
ードする MboII-PvuII断片と、ｃDNA の残りの部分およ
びベクター部分を含む PvuII−HindIII 断片を別々に得
る。一方、以下のような合成ＤＮＡリンカーを作製す
る。
【００１９】
【化１】
【００２０】上記ＤＮＡ断片と合成ＤＮＡリンカーとを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し、図４に示した組換え体プ
ラスミドpSGHIIB9を得る。次にpSGHIIB9よりサケ成長ホ
ルモン成熟ペプチドをコードするHindIII −BamHI 消化
断片を得、pGEL1 からはトリプトファンプロモーターを
含むHindIII −BamHI 消化断片を得る。上記２つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、図４に示した組
換え体プラスミドpSGHIIC2を得る。本プラスミドはトリ
プトファンプロモーター下流に、成熟サケ成長ホルモン
をコードする領域が連結した形を有する。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し、図４に示した組換え体プ
ラスミドpSGHIIB9を得る。次にpSGHIIB9よりサケ成長ホ
ルモン成熟ペプチドをコードするHindIII −BamHI 消化
断片を得、pGEL1 からはトリプトファンプロモーターを
含むHindIII −BamHI 消化断片を得る。上記２つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、図４に示した組
換え体プラスミドpSGHIIC2を得る。本プラスミドはトリ
プトファンプロモーター下流に、成熟サケ成長ホルモン
をコードする領域が連結した形を有する。
【００２１】上記組換え技法における反応の条件は、一
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は、通常0.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００ｍ
Ｍ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ6.０〜9.５好ましくはｐＨ7.０〜8.０）、０〜２００
ｍＭのＮａＣｌ、２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍ
Ｍ）のＭｇＣｌ2 を含む反応液中で、制限酵素0.１〜１
００単位（好ましくは１μｇのDNA に対して１〜３単
位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素
により異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反
応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱す
ることによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボ
ネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用
いることができる。
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は、通常0.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００ｍ
Ｍ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ6.０〜9.５好ましくはｐＨ7.０〜8.０）、０〜２００
ｍＭのＮａＣｌ、２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍ
Ｍ）のＭｇＣｌ2 を含む反応液中で、制限酵素0.１〜１
００単位（好ましくは１μｇのDNA に対して１〜３単
位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素
により異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反
応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱す
ることによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボ
ネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用
いることができる。
【００２２】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の
精製は、低融点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ウイ
スランダー（L.Wieslander):アナリテイカル・バイオケ
ミストリイ（Analytical Biochemistry) 98 ,305(197
9), 以下ＬＧＴ法という〕やポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、
２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ6.１〜9.５、好ましくはｐＨ7.０〜8.
０）、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ
Ｃｌ2 、0.１〜１０ｍＭ（好ましくは0.５〜2.０ｍＭ）
のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）の
ジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ0.３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３
〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）行う。結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりCohen らの形質転換法〔エス・
エヌ・コーエン（S.N. Cohen）ら：プロシーテイング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci.）, USA 69, 2110(1972)〕に
よって、大腸菌に導入する。
精製は、低融点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ウイ
スランダー（L.Wieslander):アナリテイカル・バイオケ
ミストリイ（Analytical Biochemistry) 98 ,305(197
9), 以下ＬＧＴ法という〕やポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、
２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ6.１〜9.５、好ましくはｐＨ7.０〜8.
０）、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ
Ｃｌ2 、0.１〜１０ｍＭ（好ましくは0.５〜2.０ｍＭ）
のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）の
ジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ0.３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３
〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）行う。結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりCohen らの形質転換法〔エス・
エヌ・コーエン（S.N. Cohen）ら：プロシーテイング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci.）, USA 69, 2110(1972)〕に
よって、大腸菌に導入する。
【００２３】組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌か
ら該ＤＮＡの単離は、後に述べる実施例１に示した方法
あるいはバーンボイム（ Birnboim ）らの方法〔エイチ
・シー・バーンボイム（H.C.Birnboim）ら：ヌクレイッ
ク・アシド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）７，1513
(1979)〕などを用いて行う。プラスミドＤＮＡを１〜１
０種類の制限酵素で消化後アガロースゲル電気泳動ある
いはポリアクリルアミドゲル電気泳動により切断部位を
調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある
時はマキサム・ギルバード法〔プロシーデイング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Pr
oc. Natl. Acad. Sci.）, 74, 560 (1977)〕またはＭ13
ファージを用いたサンガー（Sanger）法〔サンガー（Sa
nger）らプロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）USA,74, 5463(1977); アマーシャム（Amersham）社
M13クローニング・アンド・シークエンシング・ハンド
ブック（cloning and sequencing handbook)〕によって
決定する。以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮ
Ａを製造することができる。
ら該ＤＮＡの単離は、後に述べる実施例１に示した方法
あるいはバーンボイム（ Birnboim ）らの方法〔エイチ
・シー・バーンボイム（H.C.Birnboim）ら：ヌクレイッ
ク・アシド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）７，1513
(1979)〕などを用いて行う。プラスミドＤＮＡを１〜１
０種類の制限酵素で消化後アガロースゲル電気泳動ある
いはポリアクリルアミドゲル電気泳動により切断部位を
調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある
時はマキサム・ギルバード法〔プロシーデイング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Pr
oc. Natl. Acad. Sci.）, 74, 560 (1977)〕またはＭ13
ファージを用いたサンガー（Sanger）法〔サンガー（Sa
nger）らプロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）USA,74, 5463(1977); アマーシャム（Amersham）社
M13クローニング・アンド・シークエンシング・ハンド
ブック（cloning and sequencing handbook)〕によって
決定する。以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮ
Ａを製造することができる。
【００２４】本発明の魚類の成長ホルモンペプチドは以
下のとおりに製造できる。すなわち、プラスミド（例え
ばpSGHIIC2) を用いて大腸菌Ｋ−12 ＨＢ１０１を形質
転換させ、アンピシリン耐性のコロニーの中からpSGHII
C2を有する大腸菌を選びだす。pSGHIIC2を有する大腸菌
を培地に培養することにより培養物中に魚類の成長ホル
モンポリペプチドを生成させることができる。
下のとおりに製造できる。すなわち、プラスミド（例え
ばpSGHIIC2) を用いて大腸菌Ｋ−12 ＨＢ１０１を形質
転換させ、アンピシリン耐性のコロニーの中からpSGHII
C2を有する大腸菌を選びだす。pSGHIIC2を有する大腸菌
を培地に培養することにより培養物中に魚類の成長ホル
モンポリペプチドを生成させることができる。
【００２５】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびに魚類の成長ホルモンポリペプチドの生産に好適な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース，フラクトース，ラクトー
ス，グリセロール，マンニトール，ソルビトールなど
が、窒素源としては、ＮＨ4 Ｃｌ，（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，
カザミノ酸，酵母エキス，ポリペプトン，肉エキス，バ
クトトリプトン，コーン・スティープリカーなどが、そ
の他の栄養源としては、Ｋ2 ＨＰＯ4 ，ＫＨ2 ＰＯ4 ，
ＮａＣｌ，ＭｇＳＯ4 ，ビタミンＢ1 ，ＭｇＣｌ2 など
が使用できる。
らびに魚類の成長ホルモンポリペプチドの生産に好適な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース，フラクトース，ラクトー
ス，グリセロール，マンニトール，ソルビトールなど
が、窒素源としては、ＮＨ4 Ｃｌ，（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，
カザミノ酸，酵母エキス，ポリペプトン，肉エキス，バ
クトトリプトン，コーン・スティープリカーなどが、そ
の他の栄養源としては、Ｋ2 ＨＰＯ4 ，ＫＨ2 ＰＯ4 ，
ＮａＣｌ，ＭｇＳＯ4 ，ビタミンＢ1 ，ＭｇＣｌ2 など
が使用できる。
【００２６】培養はｐＨ5.５〜8.５，温度１８〜４０℃
で通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培
養菌体中にシロザケ成長ホルモンポリペプチドが蓄積す
るので、培養物から菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処
理後、凍結、融解を繰り返して菌体を破砕し、遠心して
えられる上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従っ
てポリペプチドを採取する。
で通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培
養菌体中にシロザケ成長ホルモンポリペプチドが蓄積す
るので、培養物から菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処
理後、凍結、融解を繰り返して菌体を破砕し、遠心して
えられる上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従っ
てポリペプチドを採取する。
【００２７】また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直
接レムリ（Laemmli ）のサンプルバッファー〔レムリ(L
aemmli),ネイチャー（ Nature), 227 , 680 （1970) 〕
に加熱，溶解後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レ
ムリ（Laemmli ）の方法：同上文献〕にかけ、クマシー
ブリリアントブルー染色によって行う。以下に本発明の
実施例を示す。
接レムリ（Laemmli ）のサンプルバッファー〔レムリ(L
aemmli),ネイチャー（ Nature), 227 , 680 （1970) 〕
に加熱，溶解後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レ
ムリ（Laemmli ）の方法：同上文献〕にかけ、クマシー
ブリリアントブルー染色によって行う。以下に本発明の
実施例を示す。
【００２８】
実施例１ シロザケ脳下垂体よりのポリ（Ａ）ＲＮＡの
調製：シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネー
ト−セシウムクロライド法〔マニアティス（ Maniatis
）ら編, モレキュラー・クローニング（Molecular Clo
ning), p196, コールド・スプリング・ハーバー（ Cold
Spring Harbor ）刊；重定勝哉，細胞工学，2 ,616(19
83)〕に従いポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく
調製した。
調製：シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネー
ト−セシウムクロライド法〔マニアティス（ Maniatis
）ら編, モレキュラー・クローニング（Molecular Clo
ning), p196, コールド・スプリング・ハーバー（ Cold
Spring Harbor ）刊；重定勝哉，細胞工学，2 ,616(19
83)〕に従いポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく
調製した。
【００２９】シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体
分）を４Ｍグアニジウムチオシアネート、0.５％ザルコ
シン、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および0.１
Ｍβ−メルカプトエタノールからなる溶液１０ml中でテ
フロンホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化し
た。このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮ
Ａを分断した。5.７Ｍ ＣｓＣｌ、0.１Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）の溶液各1.２mlを超遠心管中に分注してお
き、前記ホモジネートを重層した。Hitachi ＲＰＳ４０
ローターにて35,000rpm 、１５時間遠心後、ＲＮＡを沈
殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを
含むトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）溶液10mlに溶解し、フ
ェノール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿によ
り回収した。得られたＲＮＡ約１mgを１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液１mlに溶かした。６５℃、５分間インキュベートし、
0.１mlの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ(dT)
セルロース・カラム（Ｐ−ＬBiochemicals社製）クロマ
トグラフィー（カラム体積0.５ml）にかけた。吸着した
ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（pH7.5)および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し0.
２mlずつ分画した。３〜５番目の画分を回収し、ポリ
（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１０μｇを得た。
分）を４Ｍグアニジウムチオシアネート、0.５％ザルコ
シン、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および0.１
Ｍβ−メルカプトエタノールからなる溶液１０ml中でテ
フロンホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化し
た。このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮ
Ａを分断した。5.７Ｍ ＣｓＣｌ、0.１Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）の溶液各1.２mlを超遠心管中に分注してお
き、前記ホモジネートを重層した。Hitachi ＲＰＳ４０
ローターにて35,000rpm 、１５時間遠心後、ＲＮＡを沈
殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを
含むトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）溶液10mlに溶解し、フ
ェノール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿によ
り回収した。得られたＲＮＡ約１mgを１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液１mlに溶かした。６５℃、５分間インキュベートし、
0.１mlの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ(dT)
セルロース・カラム（Ｐ−ＬBiochemicals社製）クロマ
トグラフィー（カラム体積0.５ml）にかけた。吸着した
ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（pH7.5)および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し0.
２mlずつ分画した。３〜５番目の画分を回収し、ポリ
（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１０μｇを得た。
【００３０】実施例２ ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベク
ターへの挿入：オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
（Mol.Cell.Biol.）, 2 ,161(1982)〕に従い、ｃＤＮＡ
の合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミドの造成を
行った。その工程の概略を図１および図２に示す。
ターへの挿入：オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
（Mol.Cell.Biol.）, 2 ,161(1982)〕に従い、ｃＤＮＡ
の合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミドの造成を
行った。その工程の概略を図１および図２に示す。
【００３１】ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ
（Okayama ＆ Berg ）: モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（Mol. Cell.Biol.), 3, 280 (198
3) 〕４００μｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および10ｍＭ ＮａＣｌから
なる溶液３００μｌに加え、さらに５００単位のＫｐｎ
Ｉ（宝酒造社製，以下特記しない限り制限酵素はすべて
宝酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラ
スミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ (ｐＨ
6.8)，１ｍＭ ＣａＣｌ2 および0.１ｍＭ ジチオスレ
イトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩衝液（以
下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを0.２５ｍＭと
なるよう加えた溶液200 μｌに加え、さらに８１単位の
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（以下TdT と略記する）（Ｐ−ＬBiochemicals 社製）
を加えて、３７℃１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤ
Ｖ１のＫｐｎＩ切断部位の３’末端にポリ(dT)鎖が約67
個付加された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿により、ポリ(dT)鎖の付加したｐＣ
ＤＶ１ＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH 7.５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2,
１００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液１５０μｌに加
え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時
間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後、約3.１Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を回収し、約60μｇのポリ(dT)鎖付加ｐ
ＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ8.０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５０
０μl に溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷
して５０μl の５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリ
ゴ(dA)セルロースカラムコラボラテイブリサーチ社製）
クロマトグラフィーにかけた。ポリ(dT)鎖長が充分なも
のはカラムに吸着し、これを１０ｍＭトリスーＨＣｌ(p
H8.0)および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
リ(dT)鎖の付加したｐＣＤＶ１（以下ベクタープライマ
ーと略記する）２７μｇを得た。
（Okayama ＆ Berg ）: モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（Mol. Cell.Biol.), 3, 280 (198
3) 〕４００μｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および10ｍＭ ＮａＣｌから
なる溶液３００μｌに加え、さらに５００単位のＫｐｎ
Ｉ（宝酒造社製，以下特記しない限り制限酵素はすべて
宝酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラ
スミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ (ｐＨ
6.8)，１ｍＭ ＣａＣｌ2 および0.１ｍＭ ジチオスレ
イトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩衝液（以
下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを0.２５ｍＭと
なるよう加えた溶液200 μｌに加え、さらに８１単位の
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（以下TdT と略記する）（Ｐ−ＬBiochemicals 社製）
を加えて、３７℃１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤ
Ｖ１のＫｐｎＩ切断部位の３’末端にポリ(dT)鎖が約67
個付加された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿により、ポリ(dT)鎖の付加したｐＣ
ＤＶ１ＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH 7.５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2,
１００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液１５０μｌに加
え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時
間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後、約3.１Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を回収し、約60μｇのポリ(dT)鎖付加ｐ
ＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ8.０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５０
０μl に溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷
して５０μl の５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリ
ゴ(dA)セルロースカラムコラボラテイブリサーチ社製）
クロマトグラフィーにかけた。ポリ(dT)鎖長が充分なも
のはカラムに吸着し、これを１０ｍＭトリスーＨＣｌ(p
H8.0)および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
リ(dT)鎖の付加したｐＣＤＶ１（以下ベクタープライマ
ーと略記する）２７μｇを得た。
【００３２】次にリンカーＤＮＡの調製をなう。ｐＬ１
〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Berg）: モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Mol. Cel
l.Biol.), ３, 280(1983) 〕約１４μｇを10ｍＭトリス
ーＨＣｌ（ｐＨ7.5)，６mM ＭｇＣｌ2 および５０ｍＭ
ＮａＣｌからなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５
０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬ
１ＤＮＡ中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
い、ＰｓｔＩで切断したｐＬ１ＤＮＡ約13μｇを回収し
た。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.２５
ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液50μｌに加え、さらにＴｄＴ
（P-L Biochemicals社製）５４単位を加えて37℃１３分
間インキュベートし、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３’末
端に(dG)鎖を約１４個付加した。フェノール−クロロホ
ルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該Ｄ
ＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および６０ｍＭ ＮａＣｌか
らなる緩衝液１００μｌに加え、さらに８０単位のHind
III を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ１Ｄ
ＮＡのＨｉｎｄIII 部位で切断した。該反応物をアガロ
ースゲル電気泳動にて分画し、約0.５ＫｂのＤＮＡ断片
をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン（Dretzen)ら，アナ
リテイカル・バイオケミストリイ（Anal. Biochem.）,
112, 295(1981) 〕にて回収し、オリゴ(dG)鎖付きのリ
ンカーＤＮＡ（以下単にリンカーＤＮＡと略記する）を
得た。
〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Berg）: モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Mol. Cel
l.Biol.), ３, 280(1983) 〕約１４μｇを10ｍＭトリス
ーＨＣｌ（ｐＨ7.5)，６mM ＭｇＣｌ2 および５０ｍＭ
ＮａＣｌからなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５
０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬ
１ＤＮＡ中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
い、ＰｓｔＩで切断したｐＬ１ＤＮＡ約13μｇを回収し
た。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.２５
ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液50μｌに加え、さらにＴｄＴ
（P-L Biochemicals社製）５４単位を加えて37℃１３分
間インキュベートし、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３’末
端に(dG)鎖を約１４個付加した。フェノール−クロロホ
ルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該Ｄ
ＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および６０ｍＭ ＮａＣｌか
らなる緩衝液１００μｌに加え、さらに８０単位のHind
III を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ１Ｄ
ＮＡのＨｉｎｄIII 部位で切断した。該反応物をアガロ
ースゲル電気泳動にて分画し、約0.５ＫｂのＤＮＡ断片
をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン（Dretzen)ら，アナ
リテイカル・バイオケミストリイ（Anal. Biochem.）,
112, 295(1981) 〕にて回収し、オリゴ(dG)鎖付きのリ
ンカーＤＮＡ（以下単にリンカーＤＮＡと略記する）を
得た。
【００３３】上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２μ
ｇ，ベクタープライマー約1.４μｇを５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，３０ｍＭ
ＫＣｌ，0.３ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１０単
位のリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemi
cals社製) からなる溶液２2.３μｌに溶解し、１０単位
の逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、３７℃４０分
間インキュベートし、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成
させた。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿を行ない、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加し
たベクタープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６
６μＭｄＣＴＰおよび0.２μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ
緩衝液２０μｌに溶かし、１４単位のＴｄＴ（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製) を加えて３７℃８分間インキュベー
トし、ｃＤＮＡ３’末端に１２個の(dC)鎖を付加した。
該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿により(dC)鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌからなる液４００μｌに溶かし、２０単位
のＨｉｎｄIII を加え、３７℃２時間インキュベート
し、ＨｉｎｄIII 部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.５ｐmole
の(dC)鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得
た。該ＤＮＡ0.０８ｐmoleおよび前記のリンカーＤＮＡ
0.１６ｐmoleを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、
0.１Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
４０μｌに溶かし、６５℃，４２℃，０℃でそれぞれ１
０分，２５分，３０分間インキュベートした。２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5)、４mM ＭｇＣｌ2, 10mM (N
H4)2SO4 ，0.１Ｍ ＫＣｌおよび0.１ｍＭ β−ＮＡＤ
の組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調製し
た。該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（New
England Biolabs 社製）を加え、１１℃で一夜インキュ
ベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ，0.１５
ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、５単位
の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、７単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（P-L Biochemicals社製）および２単位の大腸
菌リボヌクレアーゼＨ（P-L Biochemicals社製）を加
え、12℃，２５℃で順次１時間ずつインキュベートし
た。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化
と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がDNA に置換さ
れ、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミドが生成し
た。
ｇ，ベクタープライマー約1.４μｇを５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，３０ｍＭ
ＫＣｌ，0.３ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１０単
位のリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemi
cals社製) からなる溶液２2.３μｌに溶解し、１０単位
の逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、３７℃４０分
間インキュベートし、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成
させた。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿を行ない、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加し
たベクタープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６
６μＭｄＣＴＰおよび0.２μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ
緩衝液２０μｌに溶かし、１４単位のＴｄＴ（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製) を加えて３７℃８分間インキュベー
トし、ｃＤＮＡ３’末端に１２個の(dC)鎖を付加した。
該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿により(dC)鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 および６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌからなる液４００μｌに溶かし、２０単位
のＨｉｎｄIII を加え、３７℃２時間インキュベート
し、ＨｉｎｄIII 部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.５ｐmole
の(dC)鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得
た。該ＤＮＡ0.０８ｐmoleおよび前記のリンカーＤＮＡ
0.１６ｐmoleを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、
0.１Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
４０μｌに溶かし、６５℃，４２℃，０℃でそれぞれ１
０分，２５分，３０分間インキュベートした。２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5)、４mM ＭｇＣｌ2, 10mM (N
H4)2SO4 ，0.１Ｍ ＫＣｌおよび0.１ｍＭ β−ＮＡＤ
の組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調製し
た。該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（New
England Biolabs 社製）を加え、１１℃で一夜インキュ
ベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ，0.１５
ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、５単位
の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、７単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（P-L Biochemicals社製）および２単位の大腸
菌リボヌクレアーゼＨ（P-L Biochemicals社製）を加
え、12℃，２５℃で順次１時間ずつインキュベートし
た。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化
と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がDNA に置換さ
れ、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミドが生成し
た。
【００３４】実施例３ シロザケ成長ホルモンｃＤＮＡ
を含む組換えＤＮＡの選択：実施例２で得た組換え体プ
ラスミドを用い、大腸菌c600SF8 株〔カメロン（Camero
n): プロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）US
A, 72 ,3416(1975) 〕をスコット（Scott)らの方法〔重
定勝哉：細胞工学, 2,616(1983) 〕に従い形質転換し
た。得られた約１万個のコロニーのうち 4800 個をニト
ロセルロース上に固定した。シロザケ成長ホルモンのＮ
末端から２３番目−２８番目のアミノ酸配列に対応する
合成DNA、すなわち
を含む組換えＤＮＡの選択：実施例２で得た組換え体プ
ラスミドを用い、大腸菌c600SF8 株〔カメロン（Camero
n): プロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）US
A, 72 ,3416(1975) 〕をスコット（Scott)らの方法〔重
定勝哉：細胞工学, 2,616(1983) 〕に従い形質転換し
た。得られた約１万個のコロニーのうち 4800 個をニト
ロセルロース上に固定した。シロザケ成長ホルモンのＮ
末端から２３番目−２８番目のアミノ酸配列に対応する
合成DNA、すなわち
【００３５】
【化２】
【００３６】（３番目の塩基はＡまたはＧ，９番目はＴ
またはＣ，１２番目はＣまたはＴ，１５番目はＣまたは
Ｔであり、組み合わせて１６通りの合成ＤＮＡの混合物
となる）を32Ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合
した８菌株を選んだ〔グルンステイン−ホグネス（Grun
stein-Hogness ）の方法，プロシーデイング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（ Proc.
Natl.Acad. Sci.） USA，72,3961(1975) 〕。得られた
８菌株についてサザーン（Southern）の方法〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（J.Mol.Bio
l.), 98, 503(1975)〕により、上記プローブおよびＣ末
端付近のアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡプローブ
またはＣ，１２番目はＣまたはＴ，１５番目はＣまたは
Ｔであり、組み合わせて１６通りの合成ＤＮＡの混合物
となる）を32Ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合
した８菌株を選んだ〔グルンステイン−ホグネス（Grun
stein-Hogness ）の方法，プロシーデイング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（ Proc.
Natl.Acad. Sci.） USA，72,3961(1975) 〕。得られた
８菌株についてサザーン（Southern）の方法〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（J.Mol.Bio
l.), 98, 503(1975)〕により、上記プローブおよびＣ末
端付近のアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡプローブ
【００３７】
【化３】
【００３８】（３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡ
またはＧ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、１２番
目はＧまたはＡであり、組み合わせて３２通りの合成Ｄ
ＮＡの混合物となる）とも会合が確認された。これらの
プラスミドはpSGH１，３，６，８，９，10，14, 17と命
名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンcDNAを含んでいるものと考えられた。
またはＧ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、１２番
目はＧまたはＡであり、組み合わせて３２通りの合成Ｄ
ＮＡの混合物となる）とも会合が確認された。これらの
プラスミドはpSGH１，３，６，８，９，10，14, 17と命
名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンcDNAを含んでいるものと考えられた。
【００３９】実施例４ 該プラスミドpSGH１４の塩基配
列：上記で得られたプラスミド８種につき、種々の制限
酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定した。制限酵
素部位の存在位置から、得られたプラスミドは３群に分
類でき、pSGH１，６，９，10，17の群、pSGH 3の群、pS
GH８，14の群と分けられた。それぞれの群の制限酵素地
図を図３に示す。
列：上記で得られたプラスミド８種につき、種々の制限
酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定した。制限酵
素部位の存在位置から、得られたプラスミドは３群に分
類でき、pSGH１，６，９，10，17の群、pSGH 3の群、pS
GH８，14の群と分けられた。それぞれの群の制限酵素地
図を図３に示す。
【００４０】これらのうち、pSGH1 の群のプラスミド、
とくにpSGH1 についてはすでに全塩基配列が決定されて
おり、そのｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列
は、シロザケ成長ホルモンペプチドから決定されている
Ｎ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配列と完全に一
致し、該cDNAはシロザケ成長ホルモンをコードしている
ことが確認されている〔特願昭59-134536 および同59-2
13360 〕。
とくにpSGH1 についてはすでに全塩基配列が決定されて
おり、そのｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列
は、シロザケ成長ホルモンペプチドから決定されている
Ｎ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配列と完全に一
致し、該cDNAはシロザケ成長ホルモンをコードしている
ことが確認されている〔特願昭59-134536 および同59-2
13360 〕。
【００４１】さらにこの群とは制限酵素切断部位の異な
るプラスミドであるpSGH８，pSGH14のうち、ほぼ完全長
を有すると思われるより長いcDNAを含むpSGH14につい
て、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３ファー
ジを用いたサンガー法〔サンガー（Sanger) ら、プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.),USA, 74 , 54
63(1977)：アマーシャム（Amersham）社 Ｍ１３クロー
ニング・シークエンシング・ハンドブック（cloning an
d sequencing handbook ）〕に従って決定した。配列を
配列番号１に示す。
るプラスミドであるpSGH８，pSGH14のうち、ほぼ完全長
を有すると思われるより長いcDNAを含むpSGH14につい
て、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３ファー
ジを用いたサンガー法〔サンガー（Sanger) ら、プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.),USA, 74 , 54
63(1977)：アマーシャム（Amersham）社 Ｍ１３クロー
ニング・シークエンシング・ハンドブック（cloning an
d sequencing handbook ）〕に従って決定した。配列を
配列番号１に示す。
【００４２】配列番号１の塩基配列中、既知のシロザケ
成長ホルモンとの比較から、塩基数１−６６がシグナル
ペプチドを、６７−６３０がシロザケ新規成長ホルモン
の成熟ペプチドをコードすると考えられる。該cDNAによ
りコードされるポリペプチドは、pSGH1 によりコードさ
れるポリペプチドとはシグナルペプチドの２２個のアミ
ノ酸配列は完全に一致しているが、成熟ペプチド部分で
は、１８８個中、配列番号１に示したアミノ酸配列にお
いて下線で示してある１２個のアミノ酸が異なってい
る。またシロザケ成長ホルモンポリペプチドから決定さ
れたＮ末端４０個のアミノ酸配列に限っても５個のアミ
ノ酸が明らかに異なっており、pSGH14に含まれるcDNAは
pSHG1 の群とは異なる魚類の新規成長ホルモンをコード
していると考えられる。pSGH14を組込んだ組換え体プラ
スミドを含む大腸菌はEscherichia coli ESGH14(FERM
BP-611) として微工研に昭和５９年９月２０日付で寄託
してある。
成長ホルモンとの比較から、塩基数１−６６がシグナル
ペプチドを、６７−６３０がシロザケ新規成長ホルモン
の成熟ペプチドをコードすると考えられる。該cDNAによ
りコードされるポリペプチドは、pSGH1 によりコードさ
れるポリペプチドとはシグナルペプチドの２２個のアミ
ノ酸配列は完全に一致しているが、成熟ペプチド部分で
は、１８８個中、配列番号１に示したアミノ酸配列にお
いて下線で示してある１２個のアミノ酸が異なってい
る。またシロザケ成長ホルモンポリペプチドから決定さ
れたＮ末端４０個のアミノ酸配列に限っても５個のアミ
ノ酸が明らかに異なっており、pSGH14に含まれるcDNAは
pSHG1 の群とは異なる魚類の新規成長ホルモンをコード
していると考えられる。pSGH14を組込んだ組換え体プラ
スミドを含む大腸菌はEscherichia coli ESGH14(FERM
BP-611) として微工研に昭和５９年９月２０日付で寄託
してある。
【００４３】実施例５ 新規シロザケ成長ホルモンをコ
ードする組換え体プラスミドの造成： (1) pSGH14 から成熟シロザケ成長ホルモンをコードす
る組換え体プラスミドpSGHIIB9の造成：新規シロザケ成
長ホルモンをコードする DNAを含むプラスミド pSGH14
５μgを２０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5)，10mM ＭｇＣ
ｌ2 、および10mM ＮａＣｌを含む溶液１００μl に溶
かし、制限酵素ＭｂｏII（New England Bio Labs社製）
１０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った。続い
てＮａＣｌ濃度を５０mMとなるよう調製し、ＰｖｕII
１０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った。この
反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＤＥＡＥ
ーペーパー法によりＮ末端付近に相当する１０８bpのDN
A 断片約0.０５μg を得た。
ードする組換え体プラスミドの造成： (1) pSGH14 から成熟シロザケ成長ホルモンをコードす
る組換え体プラスミドpSGHIIB9の造成：新規シロザケ成
長ホルモンをコードする DNAを含むプラスミド pSGH14
５μgを２０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5)，10mM ＭｇＣ
ｌ2 、および10mM ＮａＣｌを含む溶液１００μl に溶
かし、制限酵素ＭｂｏII（New England Bio Labs社製）
１０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った。続い
てＮａＣｌ濃度を５０mMとなるよう調製し、ＰｖｕII
１０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った。この
反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＤＥＡＥ
ーペーパー法によりＮ末端付近に相当する１０８bpのDN
A 断片約0.０５μg を得た。
【００４４】次にpSGH14 ５μg を20mMトリス−ＨＣｌ
（pH7.5)、10mM ＭｇＣｌ2 および50mM ＮａＣｌを含
む溶液（以下“Ｙ−50緩衝液”と略記する）４０μl に
溶かし、PvuII ，HindIII 各々１０単位を加え、３７℃
３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法によ
り、pSGH14でコードされる成長ホルモンのＣ末端側、
３’−非翻訳領域およびベクター部分を含む約3.3 Kbの
ＤＮＡ断片約0.５μg を得た。
（pH7.5)、10mM ＭｇＣｌ2 および50mM ＮａＣｌを含
む溶液（以下“Ｙ−50緩衝液”と略記する）４０μl に
溶かし、PvuII ，HindIII 各々１０単位を加え、３７℃
３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法によ
り、pSGH14でコードされる成長ホルモンのＣ末端側、
３’−非翻訳領域およびベクター部分を含む約3.3 Kbの
ＤＮＡ断片約0.５μg を得た。
【００４５】一方成熟シロザケ成長ホルモンをコードす
るＤＮＡの発現に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加
し、さらにベクターＤＮＡと上記ＤＮＡを連結する目的
で下記のＤＮＡリンカーを合成した。
るＤＮＡの発現に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加
し、さらにベクターＤＮＡと上記ＤＮＡを連結する目的
で下記のＤＮＡリンカーを合成した。
【００４６】
【化４】
【００４７】まず一本鎖ＤＮＡ、14mer と９mer を通常
のトリエステル法〔アール・クレア（R.Crea) ら：プロ
シーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.) USA., 75, 57
65(1978)〕により合成した。14mer および９mer の一本
鎖ＤＮＡ各々39pmole を50mMトリス−ＨＣｌ（pH 7.5)
、10mM ＭｇＣｌ2 ，10mMジチオスレイトールおよび
１mM ATPを含む溶液２０μl に溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃，
６０分間リン酸化反応を行った。
のトリエステル法〔アール・クレア（R.Crea) ら：プロ
シーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.) USA., 75, 57
65(1978)〕により合成した。14mer および９mer の一本
鎖ＤＮＡ各々39pmole を50mMトリス−ＨＣｌ（pH 7.5)
、10mM ＭｇＣｌ2 ，10mMジチオスレイトールおよび
１mM ATPを含む溶液２０μl に溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃，
６０分間リン酸化反応を行った。
【００４８】上記で得たpSGH 14 由来の MboII-PvuII断
片(108bp)0.08pmole, PvuII−HindIII 断片（約3.7Kb)
0.02 pmole を５０mMトリス−ＨＣｌ(pH 7.5)，10mM
ＭｇＣｌ2 ，10mMジチオスレイトールおよび１mMＡＴＰ
を含む溶液３０μl に溶かし、これに上記の合成ＤＮＡ
リン酸化反応液５μl を加えた。この混合液にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ６単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行
った。
片(108bp)0.08pmole, PvuII−HindIII 断片（約3.7Kb)
0.02 pmole を５０mMトリス−ＨＣｌ(pH 7.5)，10mM
ＭｇＣｌ2 ，10mMジチオスレイトールおよび１mMＡＴＰ
を含む溶液３０μl に溶かし、これに上記の合成ＤＮＡ
リン酸化反応液５μl を加えた。この混合液にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ６単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行
った。
【００４９】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１〔ボリ
バー（Bolivar)ら、ジーン(Gene,２，75(1977)〕株を形
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、図４に示したpSGHIIB9を得た。pS
GHIIB9の構造はHindIII ，XbaI， BglII，BamHI で切断
してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
バー（Bolivar)ら、ジーン(Gene,２，75(1977)〕株を形
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、図４に示したpSGHIIB9を得た。pS
GHIIB9の構造はHindIII ，XbaI， BglII，BamHI で切断
してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
【００５０】(2) pSGHIIB9の成熟シロザケ成長ホルモ
ンをコードする領域の発現ベクターpGEL1 への組み込
み：pSGHIIB9 ５μg を４０μl のＹ−５０緩衝液に溶
かし、BamHI とHindIII を各々１０単位加え、３７℃３
時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法により、
成熟シロザケ成長ホルモン全体をコードする約1200bpの
ＤＮＡ断片約0.１μg を得た。
ンをコードする領域の発現ベクターpGEL1 への組み込
み：pSGHIIB9 ５μg を４０μl のＹ−５０緩衝液に溶
かし、BamHI とHindIII を各々１０単位加え、３７℃３
時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法により、
成熟シロザケ成長ホルモン全体をコードする約1200bpの
ＤＮＡ断片約0.１μg を得た。
【００５１】別にpGEL1 ５μg を４０μl のＹ−５０緩
衝液に溶かし、BamHI とHindIII とを各々１０単位加
え、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法によりトリプトファンプロモーターを含む約2.７
KbのＤＮＡ断片約0.１μg を得た。上記で得たpSGHIIB9
のHindIII −BamHI 断片（約1200bp）0.０１μg とpGEL
のHindIII −BamHI 断片（約2.７Kb）0.０１５μg を５
０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.５），10mM ＭｇＣｌ2 ，10
mMジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰを含む溶液３
０μl に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）６
単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。
衝液に溶かし、BamHI とHindIII とを各々１０単位加
え、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法によりトリプトファンプロモーターを含む約2.７
KbのＤＮＡ断片約0.１μg を得た。上記で得たpSGHIIB9
のHindIII −BamHI 断片（約1200bp）0.０１μg とpGEL
のHindIII −BamHI 断片（約2.７Kb）0.０１５μg を５
０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.５），10mM ＭｇＣｌ2 ，10
mMジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰを含む溶液３
０μl に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）６
単位を加え、４℃，１８時間結合反応を行った。
【００５２】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、図４に示したpSGHIIC2を得た。pS
GHIIC2の構造はEcoRI,HindIII ，ClaI，BglII ，BamHI
で切断してアガロースゲル電気泳動にて確認した。pSGH
IIB9，pSGHIIC2を含む大腸菌菌株は Escherichia coli
ESGHIIC2 FERMBP-708 および同ESGHIIB9 FERM BP-70
7として、それぞれ微工研に寄託されている。
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、図４に示したpSGHIIC2を得た。pS
GHIIC2の構造はEcoRI,HindIII ，ClaI，BglII ，BamHI
で切断してアガロースゲル電気泳動にて確認した。pSGH
IIB9，pSGHIIC2を含む大腸菌菌株は Escherichia coli
ESGHIIC2 FERMBP-708 および同ESGHIIB9 FERM BP-70
7として、それぞれ微工研に寄託されている。
【００５３】実施例６ pSGHIIC2を含む大腸菌によるシ
ロザケ新規成長ホルモンペプチドの生産：実施例５で得
た組換え体プラスミドpSGHIIC2を用い常法により大腸菌
Ｗ３１１０strA株（FERM BP-732）を形質転換した。得
られたApr コロニーを８mlのＭＣＧ培地〔0.６％ Na2HP
O4, 0.3 ％ KH2PO4, 0.5％ NaCl ，0.1 ％ NH4Cl, 0.
5％ グルコース，0.5 ％ カザミノ酸，１mM MgSO4，
４μg ／mlビタミンＢ1 ，pH 7.2〕に接種し、３０℃で
１８時間培養した。得られた培養液を8,000 rpm,１０分
間遠心して菌体を回収した。この菌体を Laemmliのサン
プルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて
染色して、分子量約 25,000 の部位にポリペプチドバン
ドを検出した。このバンドは該プラスミドを含まない大
腸菌を用いた場合には存在しなかった。この結果、pSGH
IIC2を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモンポリペプ
チドを大量に生産していることがわかった。
ロザケ新規成長ホルモンペプチドの生産：実施例５で得
た組換え体プラスミドpSGHIIC2を用い常法により大腸菌
Ｗ３１１０strA株（FERM BP-732）を形質転換した。得
られたApr コロニーを８mlのＭＣＧ培地〔0.６％ Na2HP
O4, 0.3 ％ KH2PO4, 0.5％ NaCl ，0.1 ％ NH4Cl, 0.
5％ グルコース，0.5 ％ カザミノ酸，１mM MgSO4，
４μg ／mlビタミンＢ1 ，pH 7.2〕に接種し、３０℃で
１８時間培養した。得られた培養液を8,000 rpm,１０分
間遠心して菌体を回収した。この菌体を Laemmliのサン
プルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて
染色して、分子量約 25,000 の部位にポリペプチドバン
ドを検出した。このバンドは該プラスミドを含まない大
腸菌を用いた場合には存在しなかった。この結果、pSGH
IIC2を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモンポリペプ
チドを大量に生産していることがわかった。
【００５４】
【発明の効果】本発明によれば、魚類の新規成長ホルモ
ンポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え
体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、こ
れらは魚類の新規成長ホルモンポリペプチドの大量生産
に利用することができる。
ンポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え
体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、こ
れらは魚類の新規成長ホルモンポリペプチドの大量生産
に利用することができる。
【００５５】
【００５６】配列番号：1 配列の長さ：630 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：シロザケ 組織の種類：脳下垂体 配列の特徴 1..66 S sig peptide 67..630 S mat peptide 配列 ATG GGA CAA GTG TTT CTG CTG ATG CCA GTC TTA CTG GTC AGT TGT TTC 48 Met Gly Gln Val Phe Leu Leu Met Pro Val Leu Leu Val Ser Cys Phe -20 -15 -10 CTG AGT CAA GGG GCG GCG ATG GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GTG 96 Leu Ser Gln Gly Ala Ala Met Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Val -5 1 5 10 GTC AAC CGG GTG CAA CAC CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAC 144 Val Asn Arg Val Gln His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn 15 20 25 GAC TTT GAA GGC ACC CTG TTG TCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG 192 Asp Phe Glu Gly Thr Leu Leu Ser Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys 30 35 40 ATA TTC CTG CTG GAC TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCC ATC 240 Ile Phe Leu Leu Asp Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Ile 45 50 55 GAC AAG CAG GAG ACT CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAT ATC 288 Asp Lys Gln Glu Thr Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile 60 65 70 TCT TTC CGC CTG ATT GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ACC 336 Ser Phe Arg Leu Ile Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Thr 75 80 85 90 ATC TCC AAC AGC CTA ATG GTC AGA AAC TCC AAC CAG ATC TCT GAG AAG 384 Ile Ser Asn Ser Leu Met Val Arg Asn Ser Asn Gln Ile Ser Glu Lys 95 100 105 CTC AGC GAC CTC AAA GTG GGC ATC AAC CTG CTC ATC GAG GGG AGC CAG 432 Leu Ser Asp Leu Lys Val Gly Ile Asn Leu Leu Ile Glu Gly Ser Gln 110 115 120 GAA GGG GTA CTG AGC CTG GAT GAC AAT GAC TCT CAG CAT CTG CCC CCC 480Glu Gly Val Leu Ser Leu Asp Asp Asn Asp Ser Gln His Leu Pro Pro 125 130 135 TAC GGG AAC TAC TAC CAG AAC CTG GGG GGC GAC GGC AAC GTC AGG AGG 528 Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gln Asn Leu Gly Gly Asp Gly Asn Val Arg Arg 140 145 150 AAC TAC GAA CTG TTG GCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAT AAG GTT GAG 576 Asn Tyr Glu Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu 155 160 165 170 ACC TAC CTG ACC GTC GCT AAG TGC AGG AAG TCA CTG GAG GCC AAC TGC 624 Thr Tyr Leu Thr Val Ala Lys Cys Arg Lys Ser Leu Glu Ala Asn Cys 175 180 185 ACTCTGTAA 633 ThrLeu
【図１】オカヤマーバーグ法によるcDNA合成と該ＤＮＡ
を含む組換え体プラスミドの造成過程の概略を示した図
である。
を含む組換え体プラスミドの造成過程の概略を示した図
である。
【図２】オカヤマ−バーグ法によるcDNAを含む組換え体
プラスミドの造成過程の概略を示した図である。
プラスミドの造成過程の概略を示した図である。
【図３】pSGH1, pSGH3, pSGH14に含まれるcDNAの制限酵
素地図を示した図である。
素地図を示した図である。
【図４】組換え体プラスミドpSGHIIB9，pSGHIIC2の造成
過程を示した図である。
過程を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ２３Ｋ 1/165 Ｂ 9123−2Ｂ Ａ６１Ｋ 35/74 ＡＥＲ Ｇ 7431−4Ｃ 37/36 8314−4Ｃ
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１に示したペプチド配列を有す
る魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１に示したペプチド配列を有す
る魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項３】 プラスミドｐＳＧＨ１４と名づけた請求
項２記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号１に示したペプチド配列を有す
る魚類の新規成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む細菌。 - 【請求項５】 該細菌がエッシェリヒア・コリに属する
請求項４記載の細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4204982A JPH0695938B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4204982A JPH0695938B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60050096A Division JPS61210100A (ja) | 1984-06-29 | 1985-03-13 | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05207883A true JPH05207883A (ja) | 1993-08-20 |
| JPH0695938B2 JPH0695938B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=16499518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4204982A Expired - Lifetime JPH0695938B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0695938B2 (ja) |
-
1992
- 1992-07-31 JP JP4204982A patent/JPH0695938B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0695938B2 (ja) | 1994-11-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19950516 |