NO841810L - Fremgangsmaate ved fremstilling av dextran-sakkarase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for samtidig rensning og konsentrasjon av et enzym bestående av dekstransakkarase fra supernatantfasen av kulturen av de enzymproduserende bakterier.

Dekstranene er glukosepolymerer som oppnås ved enzymatisk'transformasjon av sakkarose. Disse polysakkarider har for-skjellig industriell anvendelse, avhengig av deres molekylvekt. Som eksempler kan nevnes anvendelsen av høymolekylar-vekt-dekstraner i petroleumsindustri som viskositetsgiven.de middel, anvendelsen av dekstraner med gjennomsnittlig molekylvekt i næringsmiddelindustrien og av lavmolekylvekt-dekstraner i.den farmasøytiske industri.

Tallrike bakteriestammer som utgjør deler av Lactobacillus, Streptococcus eller Leuconostoc typer har en dekstran-sakkarase aktivitet. Blant disse har imidlertid stammen Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 512 (F), som utskiller dekstrån-sakkarase-enzymet, når den .dyrkes i nærvær av sakkarose, spesielt interessante stabilitetsegenskaper, god produktivitet og ikke patogen karakter, hvilket har gjort det mulig å bruke den i en industriell skala. Videre gir dekstransakkarasen som. stammer fra denne bakter-iestamme et eneste svakt forgre-

. net lineært dekstran (.95 % al — > 6 glykoside bindinger) , som

er løselig i vann, kvaliteter som gjør den til et meget verdi-fult produkt i industriell skala.

Tidligere industrielle fremgangsmåter for enzymatisk syntese

av dekstraner,'hvori dekstran-sakkarase av Leuconostoc Mesenteroides B 512 (F) brukes, medfører imidlertid ulem<p>er.

Den industrielle prosess består fraktisk i å produsere dekstran;—sakkarase-enzymet i meget store fermenteringstanker. Såsnart enzymet er utskilt av bakterien L. Mesenteroides NRRL

B 512 (F), lite eller ikke renset, bringes den i kontakt med sitt substrat, sakkarose, og man får således produksjon av rått dekstran hvis syntesebetingelser.ikke effektivt kan kon-trolleres. Dette dekstran behandles deretter på forskjellige fysikalsk-kjemiske måter for isolering og rensning, men to-talutbyttet av reaksjonen blir således relativt lav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en økonomisk renseprosess for dekstran-sakkarase-enzymet fra Leuconostoc-Mesenteroides, som videre kan lett Integreres i en produksjonslinjeprosess for enzymet. Den derved erholdte høye produktivitet i forbindelse med en- enkelt og■bemerkelsesverdig effektiv renseteknikk, som. er gjenstand for foreliggende oppfinnelse, beretti-ger anvendelsen av denne enzymatiske fremstilling i industriell skala og tillater ytterligere,, ved en nøyaktig kontroll av syntesebetingelsene, oppnåelsen av forskjellige typer dekstraner innenfor det angitte bruksfe.lt.

Nye utviklinger av enzymatiske synteseprosesser har ført for-skere til å interessere seg for renseproblemene for enzymer. Tallrike renseteknikker er anvendt for å oppnå dette, og som eksempel kan nevnes filtrering og dens mikro- og ultra-fil-treringsutførelsesformer, sentrifugering, kromatografi, ut-felling, væske-væske-ekstraksjon, som nylig har vært gjenstand for utviklinger innbefattet fenomenet som er kjent som "fasefordeling". I denne forbindelse kan nevnes arbeidene til M.R. Kula (Applied Biochemistry and Bioengineering Vol. 2, s. 71-95 Academic Press 1977 og USP 4 144 130), som beskriver en renseteknikk for forskjellige enzymer som medfører faseforde-^-ling mellom to polymerer, glykolpolyetylen og dekstranet soin ved visse konsentrasjoner i vandig løsning blir uforenelige, og således frembringer to adskilte flytende faser, mellom.hvilke substansene som er tilstede i mediet fordeles som funksjon av deres løselighet eller deres affinitet til den ene eller den andre av de to faser under operasjonsbetingelsene.

Dyrkningsmediet.for stammen som produserer dekstran-sakkarase inneholder andre ekstra cellulære enzymer som det er viktig,

å kunne fjerne. Spesielt to sakkarolytiske.enzymer som er i stand til å anvende sakkarose utskilles av Leuconostoc Mesenteroides type stammer levan-sakkarase og invertase. Disse to enzymer er spesielt skadelige, for på den ene side reduserer de dekstranutbyttet., og på den annen side forhindrer de til-

fredsstillende kontroll av dekstranproduks jonen.' Disse to kontaminerende aktiviteter kan vises skjematisk som følger:

Nærværet av glukose viser en kontaminerende virkning; faktisk produserer en ren løsning av dekstran-sakkarase i nærvær av sakkarose ikke glukose i fri form. Analysen av den relative andel av glukose og fruktose som foretas under rensningen etter måling av dekstran-sakkarase-aktiviteten er således et kriterium på enzymets renhet.

Formålet for foreliggende oppfinnelse er å overvinne de tidligere ulemper ved å tilveiebringe.en virkningsfull, enkelt og økonomisk prosess for samtidig rensning, og konsentrering av dekstran-sakkarase som virker på en original måte ved væske-væske-ekstraks jon ved fasefordeling.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for samtidig rensning og konsentrering av dekstran-sakkarase-enzymet fra dyrkningsmediet på sakkarose av Leuconostoc. Mesenteroides bakterier som danner det ekstra cellulære enzym, hvilket medium inneholder dekstran, hvori under et første trinn'en vandig løsning av en polyeter settes til mediet i en slik mengde at to ikke blandbare faser opptrer i mediet, og dette medium holdes under røring for å sikre intim og langvarig kontakt mellom de to polymerer og de biokjemiske substanser, og deretter i et andre trinn skilles den lavere dekstran-rike fase av mediet fra.den øvre pqlyeter-rike fase, idet den nedre fase utgjør et dekstran-sakkarase anriket enzympreparat.

Fremgangsmåten kommer til .uttrykk ved en separasjon i to faser av dyrkningsmediet: en tung dekstran-anriket fase som inneholder det konsen- trerte og rensete dekstran-sakkarase-enzym med en forde- lingskoeffisient

nær null;

en lettere polyeter-rik fase som inneholder forurensninger, spesielt proteiner og sukre samt de kontaminerende enzymatiske aktiviteter, hvilken fase fjernes.

Som eksempel på anvendelige polyetere ved fremgangsmåten, iføl-ge oppfinnelsen kan nevnes:

polyetylenglykol (PEG)',

polypropylenglykol,

og deres derivater, slik som

metoksypolyetylenglykol,

polyetylenglykoltrimetylamin,

pOlyety lenglykolsulf onat, etc...

Den gjennomsnittlige molekylvekt til polyeteren som anvendes vil generelt ligge mellom 400 og 2 000. Denne molekylvekt vil velges som funksjon, av arten av det foreliggende dekstran i mediet.

Mengden av polyeter som tilsettes vil i alminnelighet være slik at utbyttet av mediet i polyalkoholen etter tilsetningen vil ligge mellom 1 og 15 vekt%. Det optimale utbytte vil bestemmes som funksjon av dekstraninnholdet i mediet.

Fremgangsmåten utføres i det vesentlige ved romtemperatur, dvs. ved en maksimumstemperatur på 30°C. Videre vil pH for me-, diet i alminnelighet ligge mellom 4,5 og 7.

Det vil være fordelaktig for å lette utførelsen av fremgangsmåten å forutfjerne cellene fra mediet, f.eks. ved sentrifu-. gering.

Fra arbeidene til M.R. Kula som er nevnt forut er vist at det var mulig å rense enzymer ved å gjøre bruk av fasefordelings-fenomenet. Imidlertid viste det seg tydelig at under rense prosessen fordeles enzymene mellom de to faser, men at den rensete enzymfraks jon bare oppnås fra den øverste PEG-fase, idet"den nedre dekstranfase hovedsakelig virket ved å opp-samle det cellulære avfall og forurensninger som var tilstede i mediet.

Nå har man funnet at ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kommer nesten alt dekstran-sakkarase-enzymet i den nedre dekstranfase, mens de andre kontaminerende enzymatiske aktiviteter fortrinnsvis går i den øvre polyeterfase. Den lavere dekstranfase kan også virke som en kilde for dekstran-sakkarase-enzymatiske preparater, og spesielt for-di denne rensning fører til en meget høy konsentrasjon., idet volumet til den nedre fase tilsvarer flere % av volumet til mediet .som underkastes fasefordelingen.

Selvfølgelig kan prosessen utføres i to eller flere trinn, under hvilke den nedre fase som stammer fra det foregående trinn vil underkastes en videre ekstraksjon ved fasefordeling under analogt virkende betingelser, og etter, om nød-vendig, lett fortynning for å lette utførelsen.

Denne renseprosess' i flere trinn kan utføres i serie i en væske-væske-ekstråksjonskolonne som virker i mots.trøm.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er illustrert ved eksempler som er gitt nedenunder, hvilke skal forstås i lys av de følgende definisjoner.

Definisjon av enzymatiske aktiviteter

Ved å starte fra sakkerose, kan tre enzymatiske hovedreak-sjoner foregå:

G-F : sakkarose

G : glukose

F : fruktose..

Dekstran-sakkarasen frigjorde utelukkende fruktose. Levan-sakkarasen frigjør utelukkende glukose. Invertasen friajør en lik mengde fruktose og glukose.

Hvis en glukoseproduksjon observeres under måling av den sakkarolytiske aktivitet, stammer dette fra en kontamine-

rende aktivitet, invertase eller leva sakkarase. For klart å uttrykke resultatene tilskrives■imidlertid produksjonen av glukose en levan-sakkarase-aktivitet som er sterkt over-veiende. Derfor bestemmes levan-sakkarase-aktiviteten og dekstran-sakkarase-aktiviteten som opptrer i tabellene som følger: levan-sakkarase-aktivitet (ULS) : totalt frigjort

glukose dekstran-sakkarase-aktivitet (UDS) : totalt frigjort

fruktose

total sakkarolytisk aktivitet : fruktose + glukose.

Målemetoder

For å spesifikt fordele glukosen og fruktosen er en metode for enzymatisk titrering (heksokinase/ATP, glukose-6-fosfat dishydrogenase/NADP<+>, fosfogluko-isome-rase) blitt anvendt.

Den totale sakkarolytiske aktivitet måles ved titre-

ring av de samlete reduserende sukre (glukose + fruktose) ved en reakjon med DNS (dinitro-salicylsyre);

Summer, J.B. J. Biol. Chém. ;47 , 5 1921).

2^ MåIi!22_SY_PI2i§i?2e.£'

Lowry's metode er blitt anvendt [Lowry, O.H., Rose-

brough NM, Farr A.L. , og R.M. Randall, J.Biol.Chem. 193

(1951) 265-275].

Det foreliggende polyetylenglykol og oligosakkarider fjernes først fullstendig ved ultrafiltrering i en pa-tron av hule fibre (Amicon) ved en kutt-ut terskel på 100.000, og polymeren titreres deretter ved bruk av et antron-reaktivt reagens; Scott, T.A. og Melvin,

J E.H. (1953) Anal. Chem. 25, 1656.

Levanet titreres spesifikt ifølge den teknikk som er beskrevet av P. Perlot, Doctorate thesis, Engineer. Institut Na-tional des Sciences Apøliquées, Toulouse (1980). Det ble kontrollert at dekstraner ikke interfererte med denne teknikk.

Prinsipp for beregning av aktiviteten

•1 mg sakkarose (molekylvekt 342) frigjør 0,474.mg i form

av polymer (levan eller dekstran: molekylvekt av monomerde-len: 162), og 0,526 mg fritt sukker (fruktose eller glukose: molekylvekt 180).

Aktiviteten måles i enheter pr. ml løsning eller pr. mg proteiner. En enhet representerer overføringen av 1 mg sakkarose pr. time ved 30°C i natriumacetat-puffer 20 mM ved 5,2.

Produksjon av supernatant- fasen av kulturen

I en fermenteringskjeie dyrkes Leuconostoc Mesenteroides . NRRL B 512 (F) bakterier i nærvær av sakkarose. Under fermenteringen utskilles de sakkarolytiske enzymer og spesielt dekstran-sakkarase i mediet av bakteriene. Dekstran-sakkarase-enzymet syntetiserer dekstranet i mediet. Fermenteringen avbrytes så, de tilstedeværende celler fjernes ved sentrifugering og supernatant-fasen i kulturen oppsamles for å underkastes renseprosessen.

EKSEMPEL 1

I dette eksempel, behandles en supernatant fase av en kultur oppnådd som ovenfor angitt med et volum på 500 ml ved gradvis tilsetning av.175 ml av en vandig løsning av PEG 1500 på 50 % (vekt/ volum), idet mediets homogenitet sikres ved magnetrøring.

Deretter skilles det nedre dekstran-sjikt fra den øvre PEG fase. Fraksjonene av disse faser tas prøver av for analyse.' Så tas 2,7 ml dekstranfase ut og fortynnes til 45 ml med en natriumacetatpufferløsning 20 mM pH 5,2 og en andre separe-ring utføres ved fasefordeling ved å tilsette dertil 11,7 ml PEG løsning.

De erholdte resultater er sammensatt i de følgende tabeller.

Disse resultater (IA og IB) ble oppnådd etter det første trinn i prosessen. De viser nærvær av levaner i en betydelig mengde (35 %) i supernatantsjiktet fra fermenteringen, hvilket angir tilstedeværelse av levai-sakkarase i supernatantsjiktet..Videre går dette levan fortrinnsvis over i PEG fa- . sen (90 %), til forskjell fra dekstranet. De erholdte resultater er sammensatt i tabell IB som viser at enkie glukose-og' fruktosesukre fortrinnsvis går.i PEG fasen.

henholdsvis 0,84 for glukosen og 0,65 for fruktosen (sml. tabell 1C nedenunder).

En konsentrasjonseffekt vil man se ved å undersøke resultatene av tablene 1C da nesten hele dekst-ran-sakkaraseaktiviteten (90 %) gjenfinnes i et volum tilsvarende ca. 5 % av den opprinnelige løsningsvolum.

Videre observerer man at fasefordelingen som oppnås fra su-pernatentsjiktet av kulturen erkarakterisert vedat den gjenvinnes, i den nedre fase med bare 53 % dekstran tilstede i den- opprinnelige løsning, som imidlertid inneholder 90 % av dekstran-sakkaraseaktiviteten.

Resultatene som er sammenfattet i tabell ID viser at under den første fasefordeling går hoveddelen av dekstran-sakkaraseaktivitet i den nedre dekstranfase, mens levavsakkarasen fordeles likt mellom de to faser, idet fordelingskoeffi-sientene henholdsvis er 0,00253 for dekstran-sakkarase og 0,033 for levan-sakkar.asen. Under den andre adskillelse går. all dekstran-sakkaraseaktiviteten i dekstranfasen (forde-.lingskoeffisient~0).

E KSEMPEL 2

Dette eksempel skal illustrere rensningen av dekstransakkarase ved fasefordeling i to trinn dg dette foregår i nærvær av et tilsatt protein (bovinalbumen) for å studere dets inn-virkning på renseprosessen..Under det første trinn tilsettes 4144 mg bovinalbumen til 200 ml av et supernatantsjikt av kulturen. Supernatantsjiktet behandles deretter ifølge fremgangsmåten i to trinn beskrevet i eksempel 1. Under det første trinn settes 52 ml av en PEG 1500 løsning med 50 % vekt/volum. Under det andre trinn tas 6 ml av dekstranfasen fra det første trinn ut, og det fortynnes til 33 ml ved hjelp av pufferløsningen anvendt i eksempel 1, og fasefordelingen utføres ved tilsetning av 10,3 ml PEG. De oppnådde resultater er sammenfattet i tabell 2. De viser en konsentrasjon i dekstranfasen for den spesifikke dekstran-sakkaraseaktivitet til tross for nærværet av proteiner som fjernes fra dekstrånfasen i store mengder (ca. 90 %).

EKSEMPEL 3

I dette eksempel behandles ifølge fremgangsmåten, beskrevet

i eksempel 1, men bare omfattende ett trinn, 279 ml av et supernatant sjikt av kulturen som er tilsatt 170.000 eksogeninvertase-enheter gjennorn 89 ml PEG. Hensikten med tilsetning av invertase-enheter er å studere innflytelsen til nærvær av overskytende invertase på rensningens kvalitet.

Resultatene, er sammenfattet i tabell 3A. Det observeres at tilstedeværelsen av invertaseoverskudds-enheter på ingen må-te modifiserer rensningen av dekstran-sakkarasen i dekstranfasen, mere enn 97 % av invertase-enhetene går i den øvre PEG fase.

Utbyttene er angitt i tabell 3B, og divisjonskoeffisientene

som oppnås er henholdsvis 0,002 for dekstran-sakkarase og 1»37 for invertasen....

EKSEMPEL 4

I dette eksempel behandles 40 ml av en allerede renset deks-tran—sakkaraseløsning i et enkelt rensetrinn i nærvær av eksogeninvertase ved å tilsette mediet 13,5 ml PEG løsning.

De erholdte resultater er sammenfattet i tabell 4. Man vil

se, som i foregående eksempel 3, at ingen ytterligere deks-tran—sakkarase-aktivitet forblir i PEG fasen, mens hoved-

delen av. invertaseaktiviteten forblir i den øvre PEG fase.

EKSEMPEL 5

I dette eksempel behandles 150 ml av et supernatant sjikt

fra fermentering ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen,

men ved å underkaste det fem påfølgende fasefordelinger som på det kvantitative nivå er representativt for hva som kan oppnås i en ekstraksjonskolonne som drives kontinuerlig.

De erholdte resultater er sammenfattet i tabell 5A. Det kan ses.at praktisk talt all dekstran-sakkaraseaktivitet er for-blitt i dekstranfasen med en konsentrasjonskoefficient på

mere enn 20.

Videre er mere enn 75 % levan-sakkarase-enheter fjernet. Den spesifikke aktivitet er multiplisert mer enn 1000 ganger. Fordelingskoeffisienten for dekstran-sakkarasen er nær 0,002. Utbyttene er vist i tabell 5B..

Til slutt skal man merke seg at konsentrasjonen og rensnin-

gen utføres i et stabilt miljø som følger med en rask fjer-

ning av sakkaroseresten som stammer fra fermenteringen og således tillater avbrudd av syntesen av dekstranene i fra-

vær av substrat, og det er faktisk viktig å begrense deks-transkonsentrasjonen i enzymløsningen til et maksimum.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte ved samtidig rensning og konsentrering av dekstran-sakkarasenzymet fra dyrkningsmediet på sakkarose av Leuconostoc Mesenteroides bakterier som produserer det ekstracellulære enzym, hvilket medium inneholder dekstran, karakterisert ved at det under det første trinn tilsettes en vandig løsning av en polyeter til mediet i en slik mengde at mediet danner to ikke-blandbare faser og dette medium holdes under røring for å sikre intim og langvarig kontakt mellom de to polymerer og de biokjemiske forbindelser, og i et andre trinn skilles så den lavere dekstran-rike fase av mediet fra den øvre polyeter-rike fase, idet den nedre fase utgjør et dekstrah-sakkarase-anriket enzympreparat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som polyeter anvendes en polygly-kol med en molekylvekt mellom 400 og 20 000.

3. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 og 2, karakterisert ved at det anvendes en poly-etermengde i mediet som etter tilsetning gir 1 til 15 vekt%.

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 og 3, karakterisert ved at den utføres ved en temperatur under eller lik 30°G og en pH mellom 4,5 og 7.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 4, karakterisert ved at dyrkningsmediet forut behandles for å fjerne cellene.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den utføres i flere påfølgende trinn, idet den behandlete løsning i hvert trinn utgjøres av dekstranfasen som oppsamles fra det foregående trinn.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den utføres kontinuerlig i væske-væske-ekstraksjonskolonne som virker motstrøms.

8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, karakterisert ved at den anvendes for rensning av dekstran-sakkaraseenzymet fra Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 512. (F) bakterier.