CN109182321A - 肝素黄杆菌肝素酶ⅰ的高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法,所述方法,包括以下步骤:将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基培养、离心收集沉淀、渗透胁迫得到粗酶液,对粗酶液进行一次CS(Cellufine Sulfate)柱纯化层析,即可得到高纯度的肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ,本发明具有工艺简单、易放大,设备需求少,试剂成本低等特点,制备的肝素酶I比活达135IU/mg,纯酶活性收率高达57%,与已有方法相比,纯化收率增加将近一倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素酶Ⅰ的制备方法,尤其涉及一种使用渗透胁迫产生粗酶,并经一步CS层析纯化制备肝素酶Ⅰ的方法。
背景技术
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶,最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的,其后,又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛,如:清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。
已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种,分别为肝素酶I、II、III,这三种酶的酶学特性各不相同。在肝素黄杆菌纯化出的三种肝素酶中,只有肝素酶II的结构被解析,它的底物特异性也最差;肝素酶I则最适用于低分子量肝素的制备。
肝素酶Ⅰ是一种分子量大约43kd的单体蛋白质,其等电点为9.0,可能是现有肝素酶中裂解肝素能力最强的酶,目前被大量用于凝血弹力图检测仪配用耗材肝素酶杯中。
肝素酶Ⅰ的制备工作有许多研究报道,但已报道的制备工艺大都存在工艺复杂、收率低等缺点。
Yang等人(J Biol Chem,1985,260(3):1849-1857)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化,首先制得纯酶,活性收率大约1%;
Daniel等人(J Bio Chem,1992,267(34):24347-24355)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石HPLC、Mono-SFPLC、GPC-HPLC等五步纯化,最终获得纯酶,活性回收率10.8%;
马小来等(食品与药品,2005,32(5):446-450)使用羟基磷灰石处理、DEAE-Sepharose柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法,纯化得到酶,活性收率13.4%;
Xiaolai Ma等(J Chrom B,2006,843(2):209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose柱层析、CM-650柱层析、SP-650柱层析、sephadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯酶,收率达17.8%;
中国专利CN200910039360-一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法,公开了一种工艺,通过对粗酶液进行连续三次洗脱条件各不相同的SP-Sepharose FF层析,纯化得到高纯度的酶,获得高达30%的活性收率,为已报道的最高收率制备纯化技术。
绝大多数肝素酶制备工艺中粗酶从细胞中的释放采用超声破碎法,该法需要特殊设备,处理效率低,而且制得的粗酶含有的杂蛋白较多导致纯化步骤复杂。
Zimmermann等(Appl Biochem Biotechnol.1991 Aug;30(2):137-48.)通过渗透胁迫法使得肝素酶从菌体内部释放出来,可免于使用超声破碎仪。
本发明在借鉴使用渗透压胁迫法制备粗酶时,采用了新的工艺,降低了粗酶中的杂蛋白含量,粗酶从细胞中的释放处理效率大为提高,本发明进一步对粗酶进行纯化,发现使用CS柱层析可容易的获得高纯度的酶。而现有技术中使用CS柱层析则需要复杂的层析过程。
发明内容
本发明提供一种新的肝素酶Ⅰ的制备方法,可快速有效地通过一次柱层析即获得高纯度酶,进一步提高肝素酶Ⅰ的纯酶活性收率。
本发明包括下述顺序的步骤:
(1)肝素黄杆菌的发酵制备:将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中,23℃、150rpm培养1天,然后按5%接种量二级种子培养基同样条件培养1天,再按5%接种量接入发酵培养基,培养2-3天,菌液10000rpm、4℃离心30分钟,收集沉淀,为含酶的菌体细胞;
(2)渗透胁迫法制备粗酶液:将含酶的菌体细胞4℃悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时,4℃、10000rpm离心30min,取沉淀悬浮于Tris-HCl缓冲液中,冰浴中渗透胁迫提取0.5小时以上,再离心,得到的清液为粗酶提取液,将沉淀再渗透胁迫提取一次,合并二次提取液,即为粗酶液;
(3)肝素酶Ⅰ的CS(Cellufine Sulfate)柱纯化:步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱,以同样缓冲液平衡3个柱体积,再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱3-6个柱体积,收集有酶活性的含0.35-0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管,合并,以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩,得到纯化的肝素酶Ⅰ。
其中,步骤(1)所述的发酵培养基组成为:肝素8g/L,K2HPO4 2.5g/L,NaH2PO42.5g/L,NH4Cl 2.0g/L,MgCl2 0.5g/L,组氨酸0.5g/L,甲硫氨酸0.5g/L,微量元素NaMoO3、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2各1×10-4M。步骤(1)所述的种子培养基和二级种子培养基的组成均为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl为0.5%,pH7.0。
其中,步骤(2)渗透压胁迫法所用蔗糖溶液为10-40%(m/v),优选30-40%;所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-50mM,优选10-20mM;Tris-HCl缓冲液含0.1-10mM CaCl2,优选浓度为1-5mM;Tris-HCl缓冲液含50-250mM NaCl,优选浓度为100-200mM;Tris-HCl缓冲液pH6.5-8.0,优选pH7.0-7.5)。
其中,步骤(3)所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-150mM,优选10-100mM;其pH在6.5-8.0之间,优选pH7.0-7.5;Tris-HCl缓冲液含0.1-20mM CaCl2,优选浓度为1-10mM。步骤(3)所用CS层析柱的填料优选使用CHISSO公司的亲和层析填料Cellufine Sulfate,也可使用其它类似亲和填料。
对本发明所得肝素酶Ⅰ进行活性测定,测定方法如下:
肝素酶I活性测定:在5ml石英比色皿中加入在30℃预热过的2.5ml肝素浓度为1mg/ml的Tris-HCl(50mM,含CaCl2 10mM,pH7.0)缓冲液,移取5-20μl酶液,摇匀后在232nm测定吸光值,读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数,并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。本发明中纯化中肝素酶Ⅰ的酶活性为0.3-30IU/ml,最终获得的酶活性为9-10IU/ml。
对本发明所得肝素酶Ⅰ进行蛋白质浓度测定,测定方法如下:
蛋白质浓度测定:向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0.1ml,摇匀,测定A595,根据标准曲线换算蛋白浓度。本发明纯化前粗酶蛋白质浓度为0.9-1.0mg/ml,纯化后肝素酶Ⅰ的蛋白质浓度为0.05-0.1mg/ml。
本发明在现有技术的基础上对现有技术进行了改进,并对每一个步骤中的相关条件进行了筛选,以取得最好结果,本发明的筛选过程如下:
步骤1
步骤2
步骤3
经过本发明的研究改进,本发明的制备方法在以下方面优于现有技术
根据以上筛选数据,本发明的核心改进在于:
采用了一种渗透胁迫法将粗酶从细菌细胞中释放出来,并对过程中的蔗糖浓度、缓冲液浓度、氯化钙和氯化钠用量、pH值等做优化。
采用CS柱层析,使用了一种缓冲液浓度随氯化钠浓度同时线性梯度上升的洗脱方式,将肝素酶Ⅰ只用一步柱层析即纯化获得,而现有技术基本都需要至少三步柱层析,在层析方法上比本发明复杂许多。通过上述改进,本发明借鉴采用渗透胁迫法产生粗酶,高效、快速,设备需求简单;本发明进一步借鉴柱层析进行纯化,意外的发现,纯化出肝素酶Ⅰ只需要一步柱层析,即可达到现有技术中多出柱层析的结果,极为简单明了。所制备的肝素酶Ⅰ比活可达135IU/mg,每升发酵液可最终得到约75IU的纯化肝素酶Ⅰ,纯化工艺活性收率达到57%,高于已有报道的最高值约一倍。本发明所述制备方法,还具有工艺简单、产品单次制备量大、试剂成本低的特点,可用以工业大规模制备高纯度肝素酶Ⅰ。
附图说明
图1.肝素酶经CS柱纯化后的组分分布
图2.肝素酶纯化前后电泳分析。其中:M-低分子量标准蛋白,C-粗酶液,E-纯化后的肝素酶Ⅰ。
具体实施方式
下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例1
肝素酶的发酵制备:从肝素黄杆菌平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基(牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 0.5%,pH 7.0)中,23℃,150rpm,培养1天。按5%接种量接入二级种子培养基同样条件培养1天。再按5%接种量接入4L发酵培养基培养2天。发酵培养基组成:肝素8g/L,K2HPO4 2.5g/L,NaH2PO4 2.5g/L,NH4Cl 2.0g/L,MgCl20.5g/L,组氨酸0.5g/L,甲硫氨酸0.5g/L,微量元素NaMoO3、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2各1×10-4M,pH 7.0。23℃,150rpm,培养2天。菌液10000rpm,4℃离心30分钟,收集沉淀。
将含酶的菌体细胞4℃悬浮在40ml蔗糖溶液中2小时,4℃、10000rpm离心30min,取沉淀悬浮于80ml 10mM Tris-HCl缓冲液(含CaCl2 1mM及NaCl 150mM、pH7.0)中,冰浴中渗透胁迫提取2小时以上,再如前离心,得到的160ml粗酶提取液,将沉淀再如前渗透胁迫提取一次,合并二次提取液,得到约400ml粗酶液。
将粗酶液用10mM Tris-HCl缓冲液(含CaCl2 1mM、pH7.0)稀释4倍,上一根用同样缓冲液平衡过的CS柱(2.5×40cm),以10mM Tris-HCl缓冲液(含CaCl2 1mM、pH7.0)冲洗平衡300ml,以10mM Tris-HCl缓冲液(含CaCl2 1mM、pH7.0)至100mM Tris-HCl缓冲液(含CaCl210mM及NaCl 500mM、pH7.0)各300ml线形梯度洗脱柱子,测定各洗脱组分酶活力,结果如附图1。收集合并有酶活性的洗脱管第110-140管,以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩,得到肝素酶Ⅰ,冷冻保藏。纯化前后记录体积,并分别测定活性、蛋白浓度,计算比活性、总活性、收率等,见表1。对所制得的肝素酶Ⅰ进行测定,活性为135.43IU/mg,纯化活性收率为57.13%,SDS-PAGE电泳显示为单一蛋白条带,见附图2。
表1.肝素酶Ⅰ纯化表
Claims (4)
1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法,所述方法包括下述步骤:
(1)肝素黄杆菌的发酵制备:将肝素黄杆菌从平板或斜面上接到种子培养基中培养1天,再接入二级种子培养基培养1天,然后接入发酵培养基,培养1-2天,离心收集沉淀,为含酶的菌体细胞;
(2)渗透胁迫法制备粗酶液:将含酶的菌体细胞悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时,离心,取沉淀悬浮于Tris-HCl缓冲液(含CaCl2及NaCl、pH6.5-8.0)中,冰浴中渗透胁迫提取0.5-5小时,离心收集清液,将沉淀再如前渗透胁迫提取一次,合并二次提取液,即为粗酶液;
(3)肝素酶Ⅰ的CS柱纯化:步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱,以同样缓冲液平衡冲洗,再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱3-6个柱体积,收集有酶活性的含0.35-0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管,合并,以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩,得到纯化的肝素酶Ⅰ。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)渗透压胁迫法所用蔗糖溶液为10-40%(m/v),优选30-40%;所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-50mM,优选10-20mM;Tris-HCl缓冲液含0.1-10mM CaCl2,优选浓度为1-5mM;Tris-HCl缓冲液含50-250mM NaCl,优选浓度为100-200mM;Tris-HCl缓冲液pH6.5-8.0,优选pH7.0-7.5)。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-150mM,优选10-100mM;其pH在6.5-8.0之间,优选pH7.0-7.5;Tris-HCl缓冲液含0.1-20mMCaCl2,优选浓度为1-10mM。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(5)所用CS层析柱的填料优选使用CHISSO公司的亲和层析填料Cellufine Sulfate,也可使用其它同类亲和填料。
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