NO841234L - Fremgangsmaate for kvantitativ bestemmelse av konsentrasjonen av hemoglobin i en biologisk proeve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en spesifikk og kvantitativ

prøve på hemoglobin i en biologisk prøve slik som fecalier,

urin eller mavesaft. Den er basert på visse unike egenskaper hos heme (hemin), et naturlig pigment som binder seg til et protein (globin) for å danne hemoglobin. Heme i seg selv er et jernkompleks av en klasse røde pigmenter kalt "porfyrin".

Ved bestråling med egnede bølgelengder av lys avgir porfyriner rød fluorescens; heme gjør ikke det. Mere spesielt angår således oppfinnelsen en fremgangsmåte og en prøve på kvantitativ bestemmelse av konsentrasjonen av hemepigmentdelen i hemoglobin i et biologisk materiale ved å fjerne jern fra det ikke fluorescerende heme og dermed omdanne det til fluorescerende porfyrin, og deretter bedømme fluorescensen for det omdannede porfyrin. Denne prøve har spesiell anvendelighet på et biologisk materiale slik som fecalier, urin eller mavesaft.

Forskjellige hurtige bedømmelsesprøver for bestemmelse av nærværet av økede mengder hemoglobin i biologiske materialer slik som fecalier er idag tilgjengelige. Disse brukes i medisinen som den primære bedømmelsesprøve for innvoldstumorer. Det an-slås at det utføres over 10 millioner slike prøver hvert år i USA for dette formål. På tross av det faktum at disse prøver ikke gir kvantitative data og at feil i prøveresultatene er ekstremt kostbare, både hva personell og finanser angår, og på tross av det faktum at disse prøver som idag er tilgjengelige gir signifikant høye falske positive og falske negative resultater, har bruken fortsatt fordi det ikke finnes noe alternativ.

BedømmeIsesprøvene som idag er tilgjengelige for hemoglobin i stoffer slik som fecalier er indirekte prøver basert på hemoglo-binets peroksydaselignende (pseudoperoksidase) virkning. I nær-vær av hemoglobin blir farveløse leuko farvestoffer slik som guaiac, farvet etter tilsetning av et egnet peroksyd. Slike prøver har imidlertid flere begrensninger. På grunn av de forskjellige faktorer inkludert non-spesifisitet og på grunn av det faktum at reaktiviteten generelt påvirkes av stoffer slik som jern, ascorbinsyre eller endringer i hemoglobinmole-kylet, er for det første signifikant høye falske positive og falske negative resultater hyppige. For det andre er tolkning-en av disse prøver ofte forvirrende fordi prøveresultatene ofte angis kun som "positiv" eller "negativ". I tillegg til inher-ente differanser i sensitiviteten for de forskjellige prøver varierer prøvesensitiviteten sterkt avhengig av væskeinnholdet i stolprøven. Mengden feclie som inkluderes i prøven som foretas kan også variere med en faktor ti eller mer. Disse faktorer såvel som den ovenfor anførte ikke-spesifisitet og differansene i de personlige bedømmelser av farveutviklingen, bidrar alt til å begrense disse prøvers brukbarhet. På tross av disse begrensninger er prøver på okkult blod basert på leukofarvestoffer blant de få gjenværende ikke-spesifikke og ikke-kvantitative prøver i klinisk og laboratoriemedisin.

Fra 1844 til 1960 beskrev flere rapporter kvalitativ omdanning av heme til porfyriner med fjerning av jern gjennomført med forskjellige syrer og andre spesialbehandlinger. Så og si alle disse prosedyrer var basert på bruken av blod eller av hemoglo-binpigment, hemin, isolert fra blod. Disse og tilsvarende prosedyrer ble også benyttet for det formål å fremstille porfyriner fra forskjellige andre hemeprotein forbindelser slik som cyto-krom eller myoglobin. Imidlertid beskrev disse prosedyrer ikke og foreslo heller ikke bruk i forbindelse med en kvantitativ prøve. Videre henviste ingen til bruken av fecalier, urin eller mavesaft som kilde for hemeforbindelsene eller disses kvantitative prøving i disse prosedyrer. Anvendelsen av denne generelle til-nærmelse til kvantitativ bedømmelse av hemoglobin eller andre hemeforbindelser i vev begynte med en rapport av G.R. Morrison med titlen "Fluorimetric Microdetermination of Heme Protein"

(Anal.Chem., 37:1124-1126, 1965). Han målte hemoglobin eller

andre hemeproteiner i dyrevev ved omdanning av heme til porfyrin under anvendelse av en mettet vandig oppløsning av oksalsyre oppvarmet til 100 eller 120°C. Han målte så fluorescens intensiteten for det fremstilte porfyrin. Denne metode var imidlertid kun effektiv for kvantitativ bestemmelse av hemoglobin ved meget lave konsentrasjonsnivåer. Ved konsentrasjoner som gikk ut over ca. 0,8 mikrogram hemoglobin/ml oksalsyre-oppløsning rapporterte han at det ble dannet relativt lite ytterligere fluorescens slik at metoden var total ineffektiv ved høyere hemoglobinkonsentrasjoner. Fordi enkelte fecal-prøver kan ha mer.e enn 100.000 ganger den maksimale konsentrasjon som Morrison fant var brukbar ville fecalieprøver med høye nivåer hemoglobin måtte fortynnes flere tusen ganger før oppvarming i oksalsyre ved Morrisons metode. Slik ekstrem fortynning er ikke egnet for prøver i stor skala.

En annen faktor av stor betydning og viktighet er nærværet av visse intestinalbakterier (antatt å være såkalte "anaerober")

som omdanner hemoglobinet heme til porfyriner i fordøyelses-kanalen, hovedsakelig i tykktarmen. Mengden slik omdanning varierer fra individ til individ men tidligere ikke-kvantitative studier såvel som de studier som ble gjennomført i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, antar at en stor andel hemoglobin som er tilstede i tarmen kan omdannes til porfyriner på denne måte hos noen individer. Fordi disse porfyriner ikke reagerer med noen av de leukofarvestoffer som benyttes i dagens prøver på fecalieblod vil denne bakterievirkning således være en hovedgrunn til falske negative reaksjoner i tidligere leuko-farvestoffprøver.

I henhold til dette er det et behov i denne teknikk for en nøy-aktig og kvantitativ prøve for bestemmelse av mengden hemoglobin i biologiske stoffer slik som fecalier, urin og mavesaft og som eliminerer eller i vesentlig grad reduserer opptredenen av falske positive og falske negative resultater, inkludert de som stammer fra den del av hemoglobin som omdannes til porfyrin av innvolds bakterier, og som lett kan benyttes for massebedømmelses formål.

Oppfinnelsen angår således en spesifikk og kvantitav prøve på hemoglobin i et biologisk materiale og som eliminerer falske positive og falske negative resultater og som har spesiell egnethet for massebedømmelse. Prøven som er gjenstand for oppfinnelsen har vist seg å være 1) spesifikk for hemeforbindelser slik som hemoglobin inkludert både det totale protoheme-innhold i den biologiske prøve og den del som omdannes til porfyriner p.g.a. innvollsbakterier, 2) fri for interferens fra andre stoffer., i prøven, spesielt de som er tilstede i fecalier, urin eller mavesaft, 3) ekstremt følsom, 4) anvendelse på kvantitativ prøving over et område for hemoglobinkonsentrasjoner som er adskilt med en faktor på mer enn 75.000, fra konsentrasjoner på mindre enn 0,02 mikrogram/ml til mer enn 1500 mikrogram/ml prøveoppløsning, og 5) ikke i vesentlig grad på-virket av forbindelser som kan være tilstede i fecalier, urin eller mavesaft slik som jern, ascorbinsyre, saltsyre, aspirin, cimetidin eller alkohol som er kjent å påvirke visse leukofarve-stoff prøver.

Med den spesifikke prosedyre ifølge oppfinnelsen omdannes ikke-fluorescerende hemoglobin (heme) kvantitativt til fluorescerende porfyrin ved alle de prøvede hemoglobinkonsentrasjoner. Denne omdanning skjer når hemeforbindelsene i prøven kombineres med en effektiv mengde av en omdannende reaksjonsblanding. I den foretrukne metode har denne omdannende reaksjonsblanding en relativt lav pH-verdi og har en reduksjonskapasitet som er tilstrekkelig til å fjerne jernmolekylet fra hemeforbindelsene. Friradikalforbindelser tilsettes også i en foretrukket prosedyre for å minimalisere sidereaksjoner og varme legges på systemet for å øke hastigheten på omdanningsreaksjonen. Etter denne omdanning blir hemeavledet porfyriner renset, konsentrasjonen av porfyrin bestemmes i en fluorescensprøve og denne konsentrasjon sammenlignes med en standard for å bestemme mengden hemoglobin i prøven.

Det er antatt at vanlige nivåer av hemoglobin i en fec.alie-prøve (inkludert den andel som er omdannet til porfyrin av bakterier) vanligvis ligger innen området ca. 0,2 til 1,0 mg (200 til 1000 mikrogram) hemoglobin/g fecalier hos et individ på en diett som er fri for "rødt" kjøtt slik som storfe- eller svinekjøtt. På en diett på opptil 225 g av slikt kjøtt daglig kan fecal hemoglobinnivåene stige til 2 eller 3 mg hemoglobin/

g fecalier. Forhøyede nivåer helt opp til 200 mg (200.000 mikrogram) eller mere av hemoglobin/g fecalier er funnet ved alvor-lige blødninger. Undre preparering av fecalieprøven inkludert tilsetning av omdannende reaksjonsblanding fortynnes den omtrent 250 ganger slik at de vanlige konsentrasjoner av hemoglobin i den fortynnede prøve ligger i området ca. 1 - 10 mikrogram hemoglobin/ml (avhengig av dietten) og forhøyede nivåer kan være helt opp til 1000 (eller mer) mikrogram hemoglobin/milliliter.

I ufortynnet urin er det antatt at vanlige nivåer av hemoglobin vil være ca. 0,1 mikrogram hemoglobin/milliliter som er ekviva-lent med ca. tre rød blodceller/mikroliter urin. Det antas at forhøyede nivåer kan være helt opp til flere tusen mikrogram hemoglobin/milliliter prøve både i urin og magesaft. Med en fortynnelse på tre under preparering av prøven for urinen og en fortynnelse på 20 for mavesaft ligger de mulige konsentrasjoner for hemoglobinområdet fra mindre enn 0,1 til flere hundre mikrogram hemoglobin/ml fortynnet prøve.

For å virke tilfredsstillende må omdanningsreaksjonsblandingen fortrinnsvis være en som omdanner i det vesentlige all eller en reproduserbar mengde eller andel hemoglobin til porfyrin over det mulige område av hemoglobinkonsentrasjonene. Når det gjeld-er fecalier, urin og mavesaft kan disse konsentrasjoner fra meget minimale nivåer på mindre enn 1 mikrogram hemoglobin/ml oppløsning og helt opp til 1000 eller mer mikrogram hemoglobin/ ml fortynnet oppløsning, avhengig av graden av fortynning. En tilfredsstillende blanding vil resultere i en i det vesentlige rettlinjet eller lineær kurve når konsentrasjonen av hemoglobin plottes mot fluorescensnivået for det omdannede porfyrin. Denne foretrukne blanding er en kombinasjon av et reduksjonsmiddel slik som oksalsyre og et reduserende salt slik som jern II sulfat, FeSO^. Når denne kombinasjon benyttes som omdanningsreaksjonsblanding foreligger det et i det vesentlige lineært forhold mellom hemoglobinkonsentrasjonen og fluorescensnivået for det omdannede porfyrin. Imidlertid vil blandinger andre enn oksalsyre og FeSO^også omdanne hemoglobin til porfyrin ved de mulige områder av hemoglobinkonsentrasjoner. Disse andre blandinger vil virke tilfredsstillende som omdanningsreåk-sjonsblanding ifølge oppfinnelsen, forutsatt at i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobinet omdannes til porfyrin. Når dette skjer kan mengden hemoglobin beregnes ved å bestemme nivået for omdannet porfyrin og å sammenligne dette med en standard. Ved fortynningsfaktorer tilsvarende de som er nevnt ovenfor bør den foretrukne omdann-ingsblanding være en som omdanner i <det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobinet til porfyrin ved konsentrasjoner av hemoglobin på minst ca. 40 mikrogram/ml og fortrinnsvis helt opp til flere hundre mikrogram/ml fortynnet prøve.

Fecalier, urin og mavesaft har fluorescens som ikke står i forbindelse med porfyriner avledet fra hemoglobin. Under egnede betingelser kan mengden av slik "ikke-spesifikk" fluorescens

(inkludert den fra porfyriner som skilles ut på vanlig måte)

prøves separat og uten rensing i et annet reagens som ikke omdanner signifikante mengder restheme til porfyriner men som bi-beholder andre fluorescerende materialer som finnes med omdanningsreagensen. Denne tilstand nås ved 1,5 molar sitronsyre som generelt omdanner mindre enn 0,2% hemoglobinheme til porfyrin under de anbefalte betingelser. Under ideelle omstendigheter gir subtraksjon av den verdi som oppnås med sitronsyre reagens fra den totale verdi som oppnås ved hemeomdannende reagens en verdi som skyldes i det vesentlige det porfyrin som dannes fra hemoglobin som et resultat av omdanningsreaksjonen.

Selv om bruken av en sitronsyre "blank" som beskrevet ovenfor har funnet å være av verdi i visse tilfeller er den av begren-set verdi når den anvendes på fecalier. En hovedgrunn er at ca. 20-70% av heme som trer inn i fordøyelseskanalen hos voksne omdannes til porfyrin av visse innvollsbakterier. En substrak-sjon av verdiene som oppnås i en sitronsyre "blank" vil maksi-malt indikere kun omdanningen av restheme i fecalier og ikke det totale hemoglobinheme som trådte inn i fordøyelseskanalen.

I tillegg er ikke-spesifikke forbindelser som ofte er tilstede

i feces, slik som klorofyll, ikke fluorescente på samme måte i omdanningsreagensen og i sitronsyren. Under disse betingelser kan sitronsyre ikke være noen pålitelig blank prøve, selv for restheme. Til slutt, i visse prøver, kan heme relatert fluorescens være meget mindre enn 1 % av den totale opprinnelige fluorescens, slik at beregningsfeilen vil være uakseptalt høy. Den foretrukne metode separerer derfor porfyrin fra hemoglobin (både via innvollsbakterier og eksternt stimulert kjemisk omdanning) fra andre påvirkende fluorescenser før den fluorimet-riske prøve. Dette kan skje ved en egnet rensing eller ekstrak-sjonsprosedyre. Med en slik prosedyre blir sitronsyre reagensen inkludert ikke som en "blank" men som en spesifikk kilde for de porfyriner som avledes fra heme ved aktivering av innvollsbakterier.

I henhold til dette er en gjenstand for oppfinnelsen å tilveiebringe en forbedret prøve for spesifikt og kvantitativt å bestemme mengden hemoglobin i et biologiskt materiale.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for spesifikt og kvantitativt å bestemme mengden hemoglobin i en prøve ved omdanning med hemedelen av hemoglobin til porfyrin og prøving av fluorescensen i denne.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret prøve for spesifikk og kvantitativ bestemmelse av mengden av hemoglobin i en biologisk prøve der prøven er spesielt

egnet for massebedømmelse.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe

en forbedret fremgangsmåte for spesifikt og kvantitativt å bestemme mengde hemoglobin i en prøve av et biologiskt materiale slik som fecalier, urin eller mavesaft over hele området for mulige hemoglobinkonsentrasjoner i slike prøver.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe

en forbedret fremgangsmåte for spesifikt og kvantitativt å bestemme mengden .hemoglobin i en fecalie-, urin- eller mave-saftprøve som anvender en omdanningsreaksjonsblanding som bevirker .omdanning av i det vesentlige all eller en reproduserbar mengde eller andel hemoglobin til porfyrin over hele området for den mulige hemoglobinkonsentrasjon.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en kvantitativ prøve på hemoglobin i fecalier, urin eller mavesaft og som sørger for omdanning av heme ved innvollsbakterier og som i kombinasjon inkluderer en fremgangsmåte for isolasjon av heme avledet porfyrin.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe

en forbedret fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av mengden av hemoglobin i en prøve der ugunstige sidereaksjoner p.g.a. friradikal- og andre kjemiske stoffer minimaliseres.

Disse og andre gjenstander for oppfinnelsen vil bli åpenbare ut fra de ledsagende tegninger og den beskrivelse av den foretrukne fremgangsmåte som skal gis nedenfor samt fra de ledsagende krav.

I figur 1 er et diagram der fluorescens intensiteten er plottet mot hemoglobin konsentrasjonen for omdanningsreaksjonsblandinger bestående av oksalsyre og forskjellige mengder jern II sulfat. Figur 2 er et diagram der fluorescensintensiteten er plottet mot hemoglobinkonsentrasjonene for forskjellige omdanningsreaksjonsblandinger.

Den kvantitative prøve som benytter den foretrukne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen inkluderer fire prinsippielle fremgangsmåtetrinn. Det første omfatter preparering av en prøve av det biologiske materiale som skal undersøkes kvantitativt på hemoglobin; det andre inkluderer kvantitativ omdanning av den ikke fluorescerende hemedel i hemoglobinet i prøven til fluorescerende porfyrin; det tredje inkluderer rensing for å

eliminere ikke-spesifikke fluorescens og interfererende forbindelser; og det fjerde inkluderer prøving av fluorescensen for det kvantitativt tilbakeholdte porfyrin som er avledet fra hemoglobin, og sammenligning av denne verdi med en hemoglobin standard av kjent konsentrasjon. Anvendt på fecalier (men ikke på urin eller mavesaft) inkluderer det andre trinn også et andre reagens som ikke omdanner heme til porfyrin men som holder porfyrin avledet fra heme ved intenstinalbakterier.

Preparering av prøven inkluderer samling, blanding og bestemmelse av vekten eller volumet for en prøve av det biologiske materialet der hemoglobinnivået skal bestemmes. Mens det er antatt at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes på mange forskjellige materialer er den spesielt anvendelig på fecalier- urin- og mave-saftprøver. Beskrivelsen av den foretrukne metode skjer under henvisning til en fecalieprøve. En prøvemengde av fecalieprøven samles først og holdes fortrinnsvis frossen ved -15°C inntil prøving.

Fremgangsmåtetrinn 2 ifølge oppfinnelsen medfører kvantitativ omdanning av hemedelen av hemoglobinet i prøven til porfyrin. Dette inkluderer blanding av prøven med en egnet omdanningsreaksjonsblanding og oppvarming av denne. Trinnet inkluderer fortrinnsvis også tilsetning av en fri radikal oppfanger for å redusere eller eliminere skadelige sidereaksjoner.

Undertrinnet med blanding av fecalieprøven med omdanningsreaksjonsblandingen inkluderer blanding av en egnet mengde, f. eks. 8,0 mg, av prøven med et egnet volum, f. eks. 2,0 ml av en om-danningsreaks jonsblanding for å omdanne den ikke-fluorescerende hemedel i hemoglobin til fluorescerende porfyrin. Mens det er ment at mange forskjellige omdanningsreaksjonsblandinger vil være effektive for kvantitativt å omdanne heme til porfyrin må slike omdanningsreaksjonsblandinger ha tilstrekkelig reduksjonskapasitet til å fullføre denne omdanning for de forskjellige forventede konsentrasjoner av hemoglobinen ved det fortynnings-nivå som benyttes. Således er de spesifikke omdanningsreaksjonsblandinger som vil være aksepterbare delvis avhengig av den grad med hvilken prøven er fortynnet. Hvis som i den foretrukne prosedyre 8,0 mg fecalprøve kombineres med 2,0 ml omdanningsreaksjonsblanding vil fecalprøven og således det deri inneholdte hamoglobin være fortynnet omtrent 250 ganger. Denne fortynningsfaktor bestemmes ved å dividere mengden i ml av omdanningsreaksjonsblandingen, her 2,0 ml, med mengden i gram av fecalprøven, her 0,008 gram. Med en 250 gangers fortynning av fecalprøven vil et vanlig hemoglobinnivå være ca. 1 - 10 mikrogram hemoglobin/ml fortynnet prøve. For å kunne være aksepterbar som om-danningsreaks jonsblandingen bør en slik blanding fortrinnsvis omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobinet til porfyrin over et hemoglobinkon-sentras jonsområde som inkluderer hemoglobinkonsentrasjonen for et individ met et fecalhemoglobidnivå på ca. 4 ganger det normale. Med en 250 gangers fortynning som beskrevet ovenfor vil således en aksepterbar omdanningsreaksjonsblanding være en som har en reduserende kapasitet tilstrekkelig til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobin til porfyrin opp til et hemoglobin konsentrasjonsnivå på minst ca. 4 0 mikrogram hemoglobin/ml fortynnet prøve.

Hvis fecalprøven fortynnes i større grad vil det hemoglobinkon-sentras jonsnivå over hvilket omdanningsreaksjonsblandingen må være effektiv, reduseres. Dette tillater at mulige ytterligere omdanningsreaksjoner kan benyttes, f. eks. de som har en util-strekkelig reduksjonskapasitet til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobinet ved en konsentrasjon på 40 mikrogram/ml, men som ikke har tilstrekkelig reduksjonskapasitet ved ét lavere hemoglobinnivå.

Hvis f. eks. fecalprøven fortynnes 1000 ganger vil omdannings-reaks jonsblandingen måtte være effektiv kun opptil en hemoglobin konsentrasjon på ca. 10 mikrogram/ml. Således er hemoglobin-konsentras jonsnivået ved hvilken omdanningsreaksjonen bør være effektiv for en fecalprøve, omvendt proporsjonal med fortynningsnivået. Hvis man. kjenner fortynningsnivået eller fortynningsfaktoren, bestemt ved å dividere mengden i ml av omdanningsreaksjonsblanding eller annen fortynningsoppløsning med mengden i gram av fecalieprøven, kan hemoglobinkonsentrasjonsnivået i mikrogram/ml ved hvilken omdanningsreaksjonsblandingen må være effektiv (ca. 4 ganger hemoglobinnivået for et vanlig tilfelle) bestemmes ved å dividere 10.000 med fortynningsfaktoren. For å være effektiv må en omdanningsreaksjonsblanding ha en reduksjonskapasitet tilstrekkelig til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde eller andel av hemoglobinet til porfyrin over det angjeldende konsentrasjonsområde.

En vei for bestemmelse om hvorvidt en spesiell omdanningsreaksjonsblanding er effektiv over et spesielt hemoglobinkonsentrasjons-område er å plotte hemoglobinkonsentrasjonen mot fluorescensnivået for det omdannede porfyrin. Hvis den resulterende kurve er i det vesentlige lineær over konsentrasjonsområde som undersøkes vil omdanningsreaksjonsblandingen være effektiv ved disse konsentrasjoner. Den foretrukne reaksjonsblanding som består av oksalsyre og FeSO^viser et i det vesentlige lineært forhold mellom hemoglobinkonsentrasjonen og fluorescensnivået for omdannede porfyrin opptil minst en hemoglobinkonsentrasjon på ca. 1.000 mikrogram/ml. Således blir i det vesentlige alt hemoglobin omdannet til porfyrin ved disse nivåer. Dette illustreres best i figur 1 som viser et diagram der hemoglobinkonsentrasjonen er oppført mot fluorescensnivået for flere omdanningsreaksjonsbland inger av oksalsyre og forskjellige mengder FeSO^. De data som ble benyttet for å frembringe dette diagram ble oppnådd ved å oppvarme prøver av fortynnet blod hvortil det var satt oksalsyre og forskjellige mengder (0,1 - 3%) av jern II sulfat.

Som vist er oksalsyre i kombinasjon med forskjellige mengder jern II sulfat tilstrekkelig til å omdanne heme i fortynnet blod opptil nivåer på minst 1000 mikrogram/ml. På den annen side begynner oksalsyre alene å vise ikkelinearitet ved ca. 10-15 mikrogram/ml eller derunder. En fecalprøve må således være vesentlig fortynnet (i størrelsesorden minst ca. 1.000 ganger) før oksalsyre alene vil ha reduksjonskapasitet tilstrekkelig til bruk som omdanningsreaksjonsblanding..

En foretrukket omdanningsreaksjonsblanding inneholder 2,5 molar oksalsyre og 0,09 molar FeS04. Også inkludert i denne blanding er 0,05 molar urinsyre og 0,1 molar manitol som virker som friradikal oppfangere. Innarbeiding av disse ytterligere komponenter skal diskuteres i større detalj nedenfor. Under omdann-ingsreaks jonen fjernes jern fra det ikke-fluorescerende heme-molekyl, noe som resulterer i jernfritt fluorescerende protoporfyrin og andre porfyriner som fluorescerer rødt ved eksponer-ing til nær ultrafiolett lys. Maksimal intensitet for fluorescens i denne sure oppløsning oppnås ved belysning eller eksitering med egnede bølgelengder 400-406 nanometer (nm). P.g.a. at de individuelle porfyriner som er tilstede har noe forskjell-ig eksitering og emisjons maksima, benyttes brede (-20 nm) spalter. Blandingen av de fremstilte porfyriner fluorescerer også selv om de gjør det mindre intenst, når de eksponeres til grønt eller gult lys med en omtrentlig bølgelengde på 550-555 eller 595-600 nm. I tillegg til protoporfyrin dannes det også betydelige mengder av det som synes å være hematoporfyrin og isomerer av monovinyl-monohydroksyetyl mellomprodukter fra heme i reaksjon med oksalsyre:jern II sulfatet. Flere ytterligere porfyriner med tilsvarende fluorescensegenskaper dannes fra heme ved innvoldsbakterier.

Selv om oksalsyre:jern II systemet er foretrukket vil andre systemer også virke. I denne henseende ble omdanningsprøver gjennomført på flere andre mulige omdanningsreaksjonsblandinger. I hver av disse omdanningsprøvene ble kjente mengder hemoglobin (blod) tilsatt til like mengder av et vanlig fecalmateriale inneholdende 0,71 mg hemoglobin/gram fecaliemateriale for å gi fecalieprøver med syv forskjellige kjente hemoglobinkonsentrasjoner. Hver av ti forskjellige mulige omdanningsreaksjonsblandinger ble så benyttet ved gjennomføring av oppfinnelsens kvantitative prøve med duplikat for hver av de ovenfor angitte syv fecalprøver.. I hver prøve ble 8,0 mg fecalprøve kombinert med 2,0 ml av omdanningsreaksjonsblandingen. Prøvene ble så oppvarmet i 20 min. i et kokende vannbad av 100°C og den nedenfor beskrevne tretrinns ekstraheringsprosedyre ble gjennomført på prøvene. En fluorescensanalyse ble gjennomført på hver prøve. Resultatene som reflekterer gjennomsnittsverdier for duplikat analysene er angit i tabell 1. Resultater fra fire av disse blandingene er også vist i figur 2 hvori konsentrasjonen av tilsatt hemoglobin er anført mot fluorescensnivået.

Som vist av resultatene som er angitt i tabell 1 og fig. 2

viste visse av de prøvede omdanningsreaksjonsblandinger en større omdanning av heme til porfyrin enn andre, spesielt ved høyere hemoglobinkonsentrasjoner. F. eks. viste omdannings-reaks jonsblandingen av oksalsyre:FeSO^(nr. 3) og oksalsyre: FeSO^:urinsyre:manitol (nr. 4) de høyeste omdanningsnivå

under hele områder av hemoglobinkonsentrasjonene som her ble utprøvet. Således er disse omdanningsreaksjonsblandinger foretrukket. Andre systemer viser relativt god omdanning ved lavere hemoglobinkonsentrasjoner men dårligere omdanning ved høyere konsentrasjonsnivåer. I tillegg til de to overfor nevnte systemer viste oksalsyre alene, nr. 1, oksalsyre:SnC^/ nr, 2, oksalsyre:H^P05nr.5 samt askorbinsyre: E^ PO^ (nr. 7) relativt god omdanning ved lavere konsentrasjoner. Imidlertid begynner omdanning med oksalsyre alene, nr. 1, å synke ved hemoglobinkon-sentras joner over ca. 15 mikrogram/ml reagens mens omdanning med oksalsyre: SnC^ (nr. 2) begynte å synke ved ca. 75-100 mikrogram/ml og askorbinsyre:H^PO^ (nr. 7) begynte å synke ved ca. 20 - 30 mikrogram/l. Oksalsyre:H^P02(nr. 5) systemet viste generelt redusert fluorescensnivåer over hele hemoglobinkonsentrasjonsom-rådet men fremdeles et generelt lineært forhold. Således vil disse fire systemer, nemlig nr. 1, nr. 2, nr. 5 og nr. 7, virke som omdanningsreaksjonsblanding selv om det er klart at nr. 1, nr. 2 og nr. 7 vil være effektive (i det vesentlige lineær) for en hemoglobinkonsentrasjon på opptil ca. 15, 75 - 100 henholds-vis 20-30 mikrogram/l. De andre systemer i tabell 1 (bortsett fra sitronsyre) viste lavere fluorescensutbytter ved alle hemo-globinkonsentras joner , men viste ikke desto mindre et visst forhold mellom hemoglobinkonsentrasjon og fluorescensnivået. Det er antatt at en prøve ville måtte være vesentlig fortynnet før noen av disse vil være effektive. Sitronsyre systemet viste minimal omdanning og er derfor ikke aksepterbart for bruk som en omdanningsreaksjonsblanding i foreliggende prosedyre.

Systemer andre enn det foretrukne system av oksalsyre:jern II sulfat som er beskrevet ovenfor vil være aksepterbare i varierende grad som omdanningsreaksjonsblanding hvis de omdanner i det vesentlige all eller en reproduserbar mengde eller andel av heme til porfyrin ved de relevante konsentrasjoner. I visse, slik som reagensene nr 1, 2, 5 og 7, vil imidlertid virke bedre med ytterligere fortynning av prøven, for derved å redusere de relevante konsentrasjonsnivåer. Generelt kan man si at jo høy-ere omdanningsgraden er for et spesielt middel jo mere aksepterbar er midlet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Sikker-heten vil vanligvis også spille en vesentlig rolle ved bestemmelse av det reagens som skal benyttes. For eksempel er reagenser som H^PG^, H2S04HCl mer risikofylte å arbeide med enn det foretrukne oksalyre:Fe2S04system selv om disse systemer ville virke akseterbart som en del av en omdanningsreaksjonsblanding. Et hvert reduksjonsmiddel kan imidlertid benyttes hvis de er istand til å omdanne i det vesentlige all eller en reproduserbar mengde eller andel heme til porfyrin under de benyttede reaksjonsbeting-elser, d.v.s. mengder og oppvarmingsvarighet, prøvefortynning, den grad i hvilken uønskede sidereaksjoner reguleres eller elimi-neres ved bruk av friradikal oppfangere som beskrevet nedenfor osv.

Graden og hurtigheten og således effektiviteten for omdanningsreagensen med henblikk på å fjerne jern fra hememolekylet for å sette fri fluoerescerende porfyrin avhenger primært av en kombinasjon av to kjemiske faktorer, (1) reduksjonskapasiteten for reagenssystemet og (2) surhetsgraden eller pH-verdien i systemet.

Mens oksalsyre alene har tilstrekkelig reduksjonskapasitet og tilstrekkelig lav pH-verdi til å være effektiv som et omdannings-middel ved relativt lave hemoglobinkonsentrasjoner krever andre reduksjonsmidler slik som askorbinsyre, tilsetning av en sterkere syre for å nå en ønskelig lav pH-verdi. Syrer slik som fosfor-syre, maursyre, svovelsyre, saltsyre og vinsyre har tilstrekkelig lav pH-verdi men de må supplementeres ved tilsetning av et reduserende salt og/eller en annen reduserende forbindelse. For å funksjonere adekvat som omdanningsreaksjonsblanding ifølge opp finnelsen bør pH-verdien for en slik blanding ved 25°C være mindre enn 2 og fortrinnsvis mindre enn 1,3.

Som beskrevet ovenfor kombineres jern II sulfat med oksalsyre eller forskjellige andre reduksjonsmidler i den hensikt å øke reduksjonskapasiteten for systemet. Det er funnet at forskjellige andre reduserende salter eller andre forbindelser også vil virke. F. eks. kan forskjellige jern II-, mangan II-, tinn II-, kobolt II- og nikkelsalter slik som jern II oksalat, mangan II sulfat (MnS04), tinn II klorid (SnCl2), nikkel klorid (NiCl2) kobolt II klorid ..(CoCl2) og ditiotreitol virke til å forbedre reduksjonskapasiteten for et omdanningsreaksjonssystem. Hypofosforsyre (H^PG^) har også vist seg å være effektiv i det formål å øke reduksjonskapasiteten for systemet.

Andre faktorer kan også bevirke omdanning av heme til porfyrin og typene porfyrin som dannes. Selv om reaksjonen som omdanner heme til porfyrin vil skje i en viss grad ved romtemperatur vil imdilertid hastigheten og graden av reaksjon forbedres ved til-føring av varme. Forskjellige typer varmekilder har vært benyttet inkludert autoklaver (100°C i 90 min.), kokende eller varme vannbad (80-100°C i 20 min. eller mer) og mikrobølgeovner i noen min. eller mindre. Alle har vist seg aksepterbare for bruk i forbindelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen selv om oppvarming til ca. 100°C har fordelen med enkelhet og forbedret fluorescens i det foretrukne system. Temperaturen og varigheten av oppvarmingen påvirker ikke bare omdanningshastig-heten men også sammensetningen av de resulterende porfyriner. Hvis temperaturen er for høy kan noe av porfyrinene ødelegges som et resultat av uønskede sidereaksjoner. Selv om dette kan minimaliseres i en viss grad ved bruk av friradikal "oppfanger" slik som urinsyre og manitol, bør temperaturen vanligvis ikke overskride 120°C. Fortrinnsvis holdes temperaturen mellom ca. 90 og 110°C.

Varigheten av oppvarmingen som er nødvendig vil avhenge av om-danningsreaks jonstemperaturen og typen varmekilde. Omdanningen er altså hurtigere i fortynnet blod en i fecalier og synes å

være i det minste delvis relatert den fullstendige blanding av prøven. Mens et antall forskjellige temperaturer og oppholds-tider vil være aksepterbare bør temperatur og oppholdstid være effektiv til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar andel, av heme til porfyrin. I en foretrukket metode blir systemet oppvarmet i 20 min. til en temperatur på ca. 10 0°C.

Mengden av sluttporfyrin som gjenvinnes kan også påvirkes i vesentlig grad av dannelsen av reaktive produkter inkludert såkalte "friradikaler" som kan foreandre eller ødelegge heme og i en mindre grad de dannede porfyriner. Disse virkninger påvirkes av de . spesielle kjemiske forbindelser i systemet eller av bestanddelene i prøven. Dannelsen av slike friradikaler er vel-kjente i systemer som inneholder jern II ("Fenton reaksjonen") som tilfelle er i de foretrukne omdanningsreaksjoner med oksalsyre og FeSO^. Ved å tilsette en komponent til omdanningsreaksjonsblandingen som lett reagerer med disse forskjellige frie radikal-er og bevirker fjerning av dem fra systemet, kan ødeleggelse eller endring av heme eller av omdannede porfyriner minimaliseres og nøyaktigheten for prøven forbedres. Flere såkalte "oppfangere" for friradikaler har vært prøvet for å bestemme hvilke som beskytter heme og porfyriner i best mulig grad fra uønskede sidereaksjoner som kan ledsage oppvarming eller behandling med omdanningskomponenter i oppdanningsreagenset. Av de som ble prøvet viste urinsyre og manitol de beste resultater. I en foretrukket metode ble det benyttet 0,05 molar urinsyre og 0,1 molar manitol.

Generelt er et hvilket som helst system som er tilstrekkelig

surt (lavere enn en pH-verdi på ca. 2) og som har tilstrekkelig reduksjonskapasitet til å fjerne jern fra heme molekylene i prøv-en, istand til å virke som omdanningsreaksjon ifølge oppfinnelsen.

Selv om enkelte systemer er bedre enn andre p.g.a. den større effektivitet og reproduserbarhet ved omdanning av heme til fluorescerende porfyrin, skal det være klart at enhver reagens som omdanner en hovedandel (fortrinnsvis over ca. 50%) og reproduserbar andel av heme til porfyrin, kan benyttes for kvantitativt å bestemme nivået av hemoglobin i prøven i h.h.t. foreliggende oppfinnelse.

Etter blanding av prøven med omdanningsreagens og oppvarming gjennomføres det fortrinnsvis en ekstrahering eller rensing av den resulterende ±)landing for å isolere og å rense porfyriner avledet fra hemoglobin. I den ovenfor nevnte resulterende blanding foreligger det flere forurensninger som vil påvirke evnen til på nøyaktig måte å bestemme nivået av porfyrin som stammer fra hemoglobin når nivået av porfyrin; .bestemmes ved fluorescens proving som anvendt i foreliggende oppfinnelse, eller ved en absorbsjonsprøving. Det er ønskelig å eliminere disse interfererende komponenter som kan inkludere elementer som naturlig forekommende porfyriner, klorofyll og forskjellige andre stoffer med en fluorescensbølgelengde som faller sammen med bølgelengden for omdannet porfyrin.

I den foretrukne prosedyre medfører fremgangsmåten for isolering og separering av porfyriner avledet kun fra omdanning av hemedelen av hemoglobin tre generelle ekstraherings- eller rensetrinn som er spesielt beskrevet i den paralleltløpende US SN 418 282 av 13. september 1982. Det første trinn medfører å ryste blandingen med et oppløsningsmiddel. Dette er fortrinnsvis et organisk opp-løsningsmiddel slik som etylacetat inneholdende en liten mengde iseddik som er istand til å ekstrahere de porfyriner hvis ende-lige bestemmelse er ønsket, nemlig porfyrinene som stammer fra hemaglobin. I en foretrukket automatisert prosedyre blir etylacetat : eddiksyrereagensen erstattet med en kombinasjon av iso-butylalkohol, diisopropylbenzen og eddiksyre i et forhold på 6:4:1.

Det andre trinn i renseprosedyren involverer tilsetning av et vandig oppløsningsmiddel for å ekstrahere urenheter inkludert naturlig forekommende porfyriner slik som coproporfyrin. Spesielt inkluderer dette trinn tilsetning av n-butyl alkohol til etylacetat ekstrakten og rysting av denne med en vandig alkalisk oppløsning. I den foretrukne automatiserte prosedyre blir overstående væske fra trinn 1 rystet direkte med en vandig alkalisk oppløsning. Et tredje ekstraheringstrinn gjennomføres så for å ekstrahere porfyriner fra hemoglobin og etterlater rød-fluorescerende klorofyll og andre "fettoppløselige" stoffer. Dette tredje trinn involverer ekstrahering av porfyrin fra etylacetat :butylalkohol (eller isobutylalkohol:diisopropylbenzen) fasen med en 9:1 blanding av to molare fosforsyrer og iseddik. Det endelig trinn i den foretrukne prosedyre ifølge oppfinnelsen er å bestemme nivået av omdannet porfyrin i prøven. Dette benytter fortrinnsvis en fluorescens-prøve hvori en bestemmelse av fluorescensnivået for det omdannede porfyrin skjer ved kjente prosedyrer og deretter sammenlignes med en standard fremstilt på tilsvarende måte med kjente konsentrasjoner av (omdannet) hemoglobin eller cyanmethemoglobin. Når en omdanningsreagens benyttes som på reproduserbar måte omdanner i det vesentlige alt heme til porfyrin kan konsentrasjonen av forløper heme og således hemoglobin i prøven direkte beregnes.

Selv om beskrivelsen av den foretrukne metode er heller spesifik skal det være klart at man kan foreta diverse endringer uten å gå utenfor oppfinnelsens ramme. I henhold til dette er det ment at oppfinnelsens ramme bestemmes av de ledsagende krav og ikke av omfanget av beskrivelsen.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av hemoglobinmengden i fecalier, urin eller mavesaft, karakter-sert ved at den omfatter følgende trinn: a) fremstilling av en analyseprø ve av feces, urin eller mavesaft, b) omdanning av hemoglobinet i analyseprøven til porfyrin ved å kombinere analyseprøven med en omdannelsesreagens som er sur og har en reduserende evne som er tilstrekkelig til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde av hemoglobinet i analyseprøven til porfyrin, og c) å bestemme porfyrin-nivået i analyseprøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnene for fremstilling av en analyseprøve og omdanning av hemoglobinet i analyseprøven til porfyrin omfatter fortynning av analyseprøven for å danne en fortynnet oppløsning, fortrinnsvis med en fortynningsfaktor som bestemmes ved å dividere volumet i ml av omdanningsreagensen eller annen fortynningskomponent med vekten i gram av ana-lyseprøven .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at omdanningsreagensen har en reduserende evne som er tilstrekkelig til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar mengde av hemoglobinet i analyseprøven til porfyrin i det minste inntil et relevant hemoglobin-konsentras jonsnivå i ug/ml oppløsning, definert ved å dele 10.000 med fortynningsfaktoren, idet omdanningsreagensen fortrinnsvis har en pH-verdi på ikke mer enn 2, og idet omdanningsreagensen fortrinnsvis omfatter en kombinasjon av a) en syrekomponent som omfatter en eller flere forbindelser valgt blant oksalsyre, askorbinsyre, maursyre, svovelsyre, saltsyre, forforsyre, hypofosforsyre og ortofosfor syre, og b) en reduserende komponent som består av en eller flere forbindelser valgt blant jern II salter, mangan II salter, tinn II salter, kobolt II salter og nikkelsalter, ditiotreitol,oksalsyre,askorbinsyre, hypofosforsyre og ortofosforsyre, og idet omdanningsmidlet fortrinnsvis har en reduksjonsevne som er tilstrekkelig til å danne et i det vesentlige lineært forhold mellom hemoglobinkonsentrasjonen og omdannet por-fyrins fluorescensnivå i det minste opp til det relevante hemoglobinkonsentrasjonsnivå.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at omdanningsreagensen har en reduserende kapasitet som er tilstrekkelig til å omdanne idet vesentlige alt eller en reproduserbar del av hemoglobinet i analyseprøven til porfyrin ved et konsentrasjonsnivå opptil minst 40 yg hemoglobin/ml fortynnet oppløsning, fortrinnsvis hovedsakelig lineær.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at omdanningsreagensen har en reduksjonsevne som er tilstrekkelig til å omdanne i det vesentlige alt eller en reproduserbar del av hemoglobidet i analyseprøven til porfyrin ved et konsentrasjonsnivå opptil minst 4 ganger det forventede hemoglobinkonsentrasjonsnivå i den fortynnede oppløsning av en analyseprøve tatt fra en person med normalt hemoglobin nivå.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter at det omdannede porfyrin i det vesentlige isoleres fra forurensninger, og fortrinnsvis omfatter tilsetning av et annet reagens for omsetting med friradikaler som dannes under hemoglobins omdanning til porfyrin, idet dette andre reagens fortrinnsvis omfatter urinsyre og manitol.

7. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-6, karakterisert ved at den kvantitative hemoglobinbestemmelse foretas på fecalier.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 7, karakterisert ved at den omfatter oppvarming til en.temperatur mellom ca. 80 og 120°C.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 7, karakterisert ved at porfyrinnivået bestemmes ved fluorescensanalyse.