NO800647L - Fremgangsmaate til selektive sidekjedeavbygning av steroidforbindelser og egnede mikroorganisme-defektmutanter til fremstilling av dette samt nye mikro-organismestammer - Google Patents

Description

Gjenstand for norsk søknad nr. 791 247 i det følgende betegnet patent I er blandt annet en fremgangsmåte til fremstilling av mjikro-organismus- blokkmutanter, som under aerobe betingelser ejr i stand til teknisk utvinnelse av 17-C-steroid-a-propionsyrejf orbindelser, spesielt til fremstilling av 3-oxo-pregna-1, 4-dijen-20-carboksylsyre (A-4 BNC) og/eller 3-oxo-pregna-1, 4-di;en-20-carboksylsyre (A-I,4 BNC), fra 17-C-sidekjede-steroidjsubstrater f.eks. fra sterinforbindelser av dyrisk eller planteopprinnelse ved en sterk selektiv sidekjedeavbygning og også ji fravær av steroidringoppbyggings og/eller veksthemmende inhibitorer. Fremgangsmåte i følge patent I er. kara-

i kterisert ved! at man 1. isolerer og dyrker en mikro-organisme villstamme som

er istand til; vekst på sterinforbindelser som eneste carbonkilde og dervted foretrekke 17-C-sidekjedeavbygning ovenfor en ringavbygning;, 2. underkaster villstammen en i og for seg kjent mut-ant ion sbe handling,

3. dyrker mutanpopulation på et skillemedium hvorpå

17-C-steroid-a-propionsyreforbindelsesleverende mutanter praktisk talt ikke vokser, mens uønskede følgende mutanstamme vokser og utryddes- herved respektiv under dens vekst og 4. dyrker den gjenblivende rest av mutanstammene på 17-C-sidekj edesterinene og derved isoleres stammene med maksimal produksjon av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser.

A-4 BNC og A-I,4 BNC er verdifulle mellomprodukter ved fremstilling av steroidforbindelser fra progesteron-serien. Deres strukturformler er følgende: 3-oxo-pregna-4-en-20-carboksylsyre

3-oxo-pregna-l,4-dien-20-carboksylsyre

Fortrinnsvis -utvelges fremgangsmåte i følge patent I i fremgangsmåtefcrinn 1 villstammer og dyrkes under aerobe bet-, ingelser som vekst på sterinforbindelser med mettede eller umettede alkylrester i 17-C- med 8 til 10 C-atomer gir selektiv avbygning'sytelse målt under standardbetingelser som definert i den generelle beskrivelse i patent I, i henhold til den generelle form<i>elen

hvori a er vekstfaktor og b er selektivitetsfaktoren av villstammen og selektivitetsindeksen utgjør tallverdi på minst 10, fortrinnsvis på minst 100 og spesielt verdier på minst 10 . Spesielt foretrekkes det da å utvelge villstammer å anvende.i den etterfølgende mutasjon, hvis selektivitetsfaktor b minst ut-gjør 1, fortrinnsvis minst 2, og hvis vekstfaktor a fortrinnsvis likeledes utgjør minst 1, idet det videre kan være foretrukket å ta hensyn til villstammene først etter dens selektivitetsfaktor b, med høyst mulig tallverdi for b, og først deretter etter dens vekstfaktor a.

Bestemmelsene av denne selektivitetsfaktor b foregår derved etter angivelsen i patent I, ved aerodyrkning av villstammen i paralellforsøk på''radioaktivt markerte sterinforbindelser, f .eks. 4-14 C- og 26-1.4 C-k<o>lesterol eller de tilsvarende radioaktivt markerte sitosterinforbindelser. Derved bearbeides hensiktsmessig såkalt Warburg-kar. Ved den hver gang foregående substratspalting dannede radioaktiv CC^, opp-fanges i en base og måles i en scintillasjonsteller. Selek- "

tivitetsfaktoren b fremkommer som dimensjonsløse forhold av den således målte! radioaktivitet

■ i

i

Dejtte valg • f ra villstamme i den. lære som fremgår av patent I, bl.Tannet etter deres selektivitetsfaktor b krever dermed et megbt omstendelig arbeid med hver gang to radioaktivt markerte sterinforbindelser i paralellforsøk.

Gjenstanden for patent I er videre en fremgangsmåte

til fremstilling av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser, spesielt' A-4; BNC og/eller A-I,4 BNC ved mikrobielt sidekjedeavbygning vedj 17-C-sidekjedesteroidsubstrater under aerobe betingelser i denne fremgangsmåte erkarakterisert vedat man,

■ i hvis ønsket, arbeider også i fravær av inhibitorer for steroidringavbygning og/eller veksthemmende inhibitorer med defekt blokkmutanter. som mikro-organismer som er blitt fremstilt i henhold til den ovenfor omtalte fremstillingsfremgangsmåte. .Oppfinnelsens gjenstand er derimot en vider utform-ing av disse forskjellige aspekter av den lære som fremgår av patent I. Overraskende ble det funnet at det som mikro-organisme villstamme for den etterfølgende mutasjon adskiller seg under dyrkning av mutantpopulasjonen og til slutt dermed for fremgangsmåten til fremstilling av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser fra 17-C-sidekjedesteroidsubstrater, spesielt egnet slike mikro-organisme villstammer som ved vekst på sterinforbindelser av nevnte type i nærvær av inhibitorer for den enzymatiske ringavbygning av sterinfprbindelsene finnes delvis i 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser.

Den foreliggende videreutvikling adskiller seg således fra den innledningsvis omtalte fremgangsmåte i følge patent I, i fremstilling, av de ønskede mikro-organisme-defektmutanter i trinn--.1, d.v.s. i trinnet for valg av mikro-organisme-villstamme. Mens i henhold til lære i følge patent I, egnede mikroorganismestammer identifiseres ved at deres enzym-aktivitet bestemmes på den ene side for sidekjedeavbygning og' pa den .annen , side for ringavbygning, og sammenlignet med hverandre legges til grunn som kriterier for egenskaper ay villstammene i henhold til foreliggende videreutvikling, den evnen av villstammene hver gang å gi sterinf orbindelser. med bestemte sidekj edesubsjtitusj on i 17-C- i nærvær av inhobitorer for sterin-ringavbygningl.

Inhibitorer for den enzymatiske ringavbygning med dyrkning av rnikro-organismer på sterinf orbindelser er tidlig-■ ere utførlig «omtalt sammenlign eksempelvis Ch.K.A. Martin, "Microbial Clfevage of Sterol Side Chains", Adv.Appl.Microbiol. 22, 29-58 (19j77), spesielt underkapittel IV, B, sidene 44-50 a.a.O. såvel som Nagasawa et al.: Agr. Biol. Chem. 34, 838-

844(1970). Atj visse mikro-organismevillstammer i nærvær av slike inhibifprer under tiden kan være i stand til fra naturlig dyrisk eller plante-sterinforbindelser som cholesterin og sitosterin å danne A-I,4 BNC er kort omtalt ved K.Arima et al., "Microbial Production og 3-0xobisirorchola-l,4-dien-22-oic-Acid" in Agri.c. Biol. Chem. 42 (2) 4ll-4l6 (1978). Ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen anvendes slike mikro-organismevillstammer som utgangsmateriale til utvinning av forbedrete og mere virkningsfulle defektmutanter. Fortrinnsvis anvendes derved bestemte utvalgte villstammer av denne type som basis for utvinning av defektmutantene i følge oppfinnelsen.

Modifikasjonen i følge oppfinnelsen av fremgangsmåten, respektiv' fremgangsmåten i følge patent I., til identi-fisering av egnede mikro-organismevillstammer for den etter-følgende mutasjonsbehandling ligger det til grunn to fastslåing-er: Søken etter mikro-organismus som fortærer sterinforbindelser av nevnte type kan med overraskende høy treffkoeffisient isoleres slike stammer som i nærvær av inhibitorer for den enzymatiske ringavbygning av sterinforbindelsene gi 17-C-steroid-a-propionsyref orbindelser og spesielt A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC. Faktisk er slike stammer også allerede beskrevet og ved nedleggelse funnet som nevnt tidligere. Videre ble det fastslått at villstammer av denne type er spesielt egnet utgangsmateriale for den etterfølgende, mutasjon og seleksjon innen læren av det som fremgår av patent I for derved til slutt å g-i defektmutanter som er egnet til utvinning av 17-C-steroid-a-propionsyref olrbindelse med mikrobiell sidekjedeavbygning på 17-C-sidekjedesteroidsubstrater i en teknisk fremgangsmåte og i godt utbytte. Defektmutanter av typen i følge oppfinnelsen er også egnet til inhibitor ved fremstilling av A-4 BNC og/eller A-I,,4 BNC.

Som spesielt egnet, har det vist. seg slike villstammer av nevnjte type for den etterfølgende mutasjon og seleksjon som ved yekst på sterinforbindelser med mettede eller umettede alkylrester i 17-C-stilling med fortrinnsvis 8 til 10 C-atomer under standardbetingelsene gir et utbytte av 17-C-steroid-a-propionsyref orbindelser på minst 5 vekt-#, fortrinnsvis på minst 10 vekt-$ hver gang referert til de i standard-forsøket anvendte sterinforbindelse eller sterinforbindelser. Betingelsene jfor dette standardforsøk omtales i det følgende

i forbindelsejmed bestemmelsen av selektivitetsfaktoren p.

De' i seleksjontrinnnet i følge oppfinnelsen fast-slåtte foretrukne villstammer innen oppfinnelsens ramme,.danner ved deres dyrkning på steriner som eneste carbonleverant et vanlig næringsmedium med tilsetting av inhibitorer for den enzymatiske ringavbygning på sterin.vanligvis A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC. Seleksjonen av mikro-organismen innen oppfinnelsens ramme kan følgelig i en foretrukket utførelsesform rettes til dannelsesevnen av mikroorganismevillstammer, d.v.s. utbytting av.A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC under standardbetingelser. Bestemmelse av denne evne og dermed selektivitetsfaktoren p av villstammeveksten foregår derved under følgende standardbetingelser: Utbytte, respektiv selektivitetsfaktor p av ' villstammene.

Mikro-organismestammen inkuberes hver gang i 500 ml Erlenmeyerkolber (100 ml næringsoppløsning i den i den nedenfor angitte sammensetning) ved 30°C på rystemaskin (rystefrekvens: 150 omdr./min.). Her og i alle ytterligere trinn av mikro-org-anismedyrkningen arbeides det under aerobe betingelser.

Næringsmed let har følgende sammensetning (hver gang

i vékt-%):

0,20 % K2HPO^

0,05 % NaHjPO^

0,,80 % pepton

i

0,90 % gjærekstrakt

0,30 % glukose PH 7,2

Etjber 48 timers kulturvarighet ved 30°C foregår tilsetning av 0,1 % "Tween 80" (polyoxyethylensorbinanmonooleat) og 0,1 % 17-C-sidekjedestermforbindelse, f.eks. cholesterin eller sitosterin. Etter ytterligere 4 timer foregår tilsetningen av inhibitoren i en konsentrasjon på 10~^mol/l (M).

Veji tidspunktet for inhibitortilsetningen justeres mediets pH-verdi til 8,0. Etter videre inkubasjon på 62 timer høstes kulturen og innholdet av A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC bestemmes ettjer vanlige metoder i vekt-%, referert til. anvendt sterinforbindelse.

Selektivitetsfaktoren p utregner seg derved fra det prosentuelle BNC-utbytte i følge

innen gruppen av mikro-organismestammer som i nærvær . av inhibitorer danner BNC blir for oppfinnelsen vanligvis stammene desto mer egnet jo høyere BNC-utbytte er og dermed jo høyere selektivitetsfaktoren p er i enkelttilfelle. Som nedre grense-verdi for egnet villstamme er det vanligvis å anse en selektivitetsfaktor p på minst 0,5 i det imidlertid stammer med selek-tivitetsf aktor p på minst 1 eller minst 1,5 gis fortrinn. Som spesielt egnet har det Vist seg stammer med en selektivitetsfaktor p på 2 eller mer, i det etter de beste hittil kjente re-sultater er det blitt fastslått selektivitetsfaktorer i størel-sesorden på 4.

Som inhibitorer til å hemme den enzymatiske avbygning av sterinringsystemet egner det seg hertil kjente grupper av forbindelser, eksempelvis a,a'-dipyridyl, o-phenanthrolih, 8-oxochinolin og rent generelt' midler som under chelatdannelse danner komplekssalte.r med tungmetaller som'l-nitroso-2-naphtol, salicylaldoxim, nitrosophenylhydroxylamin, l-nitroso-2-naphtol-''3,6-disulfonsyre', tetrahy.droxyantrachinon og lignende. Foretrukket inhibitor for gjennomføring av standardprøven til bestemmelse av selektivitetsfaktoren p er a,a'-dipyridyl og o-phen-anthrolin i det det er tilstrekkelig for utbyttebestemmelse til standardprøven når det krevede minsteutbytte oppnås ved en ■ av disse to inhibitorer under ellers ikke dyrkningsbetingelser..

Uavhengig av bestemmelsen av selektivitetsfaktoren

i

p foregår detj foretrukkede utvalg av egnet villstamme innen rammen av oppfinnelsen under ekstra adskilt bestemmelse av vekst-hastigheten, ay I den eventuelle villstamme. Her gjelder angivelsen i patent I for å fastslå den tilsvarende vekstfaktor a.

i

I

Vekstfaktor a!

Mikro-organi.smusstammen hver gang inkuberes i 500 ml Erlenmeyerkolber (100 ml.næringsoppløsning av den nedenfor omtalte sammensetning) ved 30°C under aerobe betingelser på rystemaskin (rystefrekvens 150 omdr./min.).

Nær ing smed i a-, har følgende sammensetning (pr. liter):

i,o gkh2po4

0,5 g MgSO^ . ' 7 H20

0,1 g NaOl 0,1 g CaCl2* 2 H20

5 g (NH1|)2SOij

1,0 g "Tween 80" (polyoxyethylensorbitanmonooleat) 2,0 . g 17-C-sidekjedesterinforbindelser,f.eks..

cholesterin eller sitosterin

0,5 g gjærekstrakt

0,01 g 1-histidin 0,02 g dl-methionin

0,02 g dl-tryptophan

2 ug biotin

■ 4 00 ' yg kalsiumpantothenat

2 yg folsyre

2000 yg. inosit 400. ug niacin

200 yg p-aminobenzosyre

■400 yg pyridoxinhydroklorid 1

2 Op yg riboflavin

4'0j0 yg thiaminhydroklorid

spbrelementoppløsning

næri ingsmediets pH-ver■ di 6,8

i

i<.>..

Tii måling av veksten . (celletettheten) uttas i tids-messig avstanher fra rystekulturen aliquote mengder cellesuspensjon og målesj hver gang ekstinsjonen (E<1>) i Zeiss-fotometer (Type PL 4) ved en bølgelengde på 620 nm (sjikttykkelse d = 1 cm) mot destillert vann. Utgangsektinsjonen EQutgjør før begynnel-sen av veksten i ved tidspunktet tnca. 0,775. Suspensjonen for-tynnes hver gang såvidt at den kan måles i området E' = 0,7-Vekstfaktoren a fremkommer som den maksimale optiske tetthet av cellesuspensjonen ved enden av den logaritmiske vekstfase (tidspunkt t-^ ekstinksjon E-^) som under .de gitte kulturbetingelser oppnås etter senest 5 dager, d.v.s. a = AE = E^- Eq.

I følge oppfinnelen er det for den etterfølgende mutasjon og seleksjon spesielt egnet slike mikro-organismevills.tam-. mer som under hensyntagen til de ovenfor omtalte faktorer a og p gir en selektiv avbygningsytelse i følge den generelle formel

(hvor I = selektivitetsindeks) med en tallverdi på minst 1, fortrinnsvis på minst 2 og spesielt på minst 20. Dessuten kan det komme i betraktning betraktelige høyere tallverdier, f.eks. verdier på I > 1*10^ eller sågar > 5*10^. Innen rammen av oppfinnelsen foretrekkes da spesielt tilstander med vekstfaktor a. på minst 0,2, fortrinnsvis på minst 1, spesielt på 4 eller mer.

Også innen rammen av foreliggende videreutvikling

kan det for valg av den for de ytterligere trinn av fremgangsmåten i følge oppfinnelen best egnede villstammer være mest hensiktsmessig å avveie faktorene a og p mot hverandre. Således kan innen oppfinneléns ramme Være hensiktsmessig å gi villstammer med en spesiell høy selektivitetsfaktor p fortrinn, og ved valget mellom forskjellig isolerte villstammer i første rekke etter denne selektivitetsfaktor p å utvelge-høyst mulig tallver-

di for p.. Omvendt.kan selvsagt også en spesiell god vekst ut-, trykt ved spesielt høy tallverdi for vekstfaktor a, være grunn for<:>en etterfølgende mutasjon og derpå følgende seleksjon av

i

mutantpopulasjonen'å gi en slik villstamme fortrinn.

I nærvær av inhibitoren A-4 BNC og/eller A-I,4' BNC

i leverende villstammer'befinner det seg i stor bredde av mikro-organismeklasifikasjon. Egnet er eksempelvis slike av akromo-bacter, arthrjobacter, bacillus,brevibakterium, corynebakterium, flavobakterium, mikrobakterium, mykrobakterium, nocardia,prota-minobakteriumi, serratia eller streptomyces. Som nevnt finnes

i

det også i lijtteraturen allerede en henvisning til stammer som

i

ved dyrkning på 17-C-sidekjedesteriner i nærvær av inhibitorer. som a, ot'-dipyiiridyl og o-phentanthrolin, gir A-1,4'BNC med forskjellige utbytter, sammenlign K. Arima et al. a.a.O..

i

Etjter at valg av den egnede villstamme er foregått, kan da videre! mutasjon- og seleksjonsfremgangsmåten foregå innen rammen av det' som er angitt i patent I. I detalj gjelder her:

Mutasjonsbehandling ( trinn 2):.

Mutasjonen av den valgte villstamme foregår på i og for seg kjent måte. Den.kan eksempelvis foregå ved energirik bestråling, f.eks. med UV eller røntken-stråling.. Egnet er imidlertid også spesielt behandling av cellene med mutagene stoffer. Egnede mutagene stoffer er eksempelvis nitrosoguanidinfor-bindelser, som l-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidin eller ethyl^methansulfonat. I detalj kan det her henvises til de generel-

le angivelser i følge teknikkens stand eksempelvis.US patent 4 029 5^9, spalte 2, linje 57 ff- med de der omtalte henvis-ninger.

Prinsipielt gjelder også for oppfinnelsen at resul-tatet av villstammemutasjonen forsåvidt er ubestemt da egen-skapene av de dannede defektmutanter i detalj ikke er forut-bestemmbare.

Alikevel lar det seg faststille prinsipper for en optimal mutasjonsoppløsning, da statistikklovene er anvendbaré

på en mikro-organismuspopulasjon. Fra litteraturen er det kjent fremgangsmåter til å bestemme de optimale betingelser for in-duksjon og mutasjoner (se også E.A. Adelberg, M. Mandel, GCC

Chem (1965) "'Optimal Conditions for Mutagenisis by N-methyl-N<1->

i

nitro-N-nitro|soguanidine in Escherichia coli" Biochem. Biophys. Res. Commun.. 08, -788-795) •

Vahligvis velges økning av hyppigheten av mutasjoner i mikro-organjismepopulasjoner i konsentrasjon og innvirknings-tiden av de mutagene stoffer således, at allerede en del av mikro-organismepopulasjonen er beskadiget letalt. Derved øker, i den overlevende del av populasjonen, hyppigheten av de forskjelligste mutasjoner mer eller mindre sterkt.

i

Innen rammen av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen velges betingelsene av konsentrasjon og innvirkningstid av det mutagene stoff således, at utgangspopulasjonen inaktiveres ved behandlingen j til 10-99, 999 Fortrinnsvis velges en utryd-ningsgrad på ;90-99,99

Til fremgangsmåte/trinn 2 av mutasjon slutter det

seg fremgangsmåtetrinn 3 og 4.

Til trinn 3

I den.etterfølgende utplukking av de i følge oppfin-. nelsen spesielt ønskede mutanter fra den store.populasjon av mikro-organismer etter mutasjonsbehandling, velges i følge oppfinnelsen kulturbetingelser hvorunder de endrede spesifike egenskaper av de dannede mutantstammer blir til seleksjonsfordél. Anrikning av de ønskede defektmutanter foregår i følge oppfinnelsen hyppig under betingelser hvorunder de spesielle mutanter ikke, eller praktisk talt ikke, vokser, mens uønskede følgeor-ganismer vokser og ved deres eller dens vekst utryddes. På denne måte lykkes det å isolere de defektmutantstammer hvis ringavbyggende enzymer er blokkert midlertidig som tidligere er i stand til avbygning av 17-C-sidekjede på sterinforbindelsen,

i det den ytterligere forholdsregel sier at dette trinn 3 sik-rer at nettop slike defektmutanter kan isoleres som sidekjede-. avbygning fortrinnsvis danner a-propionsyrerester i 17-C-stilling.

Derpå dyrkes i fremgangsmåtétrinn 3 mutantpopulasjonen på et "skillemedium" som til slutt tjener som anriknings-medium for de ønskede mutantstammer. Som mutantskillemedium kan det anvendes et vanndig næringsmedium som som carbonkilde- inneholder enj steroidforbindelse med 17-C-sidekjede med bare begrenset C-tall eller også ingen sidekjede i 17-C-stilling, Egnet er som barbonkilde i dette mutantskillemediet ved siden av de i 17-C-istillin<g>ikke substituerte steroidforbindelser, spesielt slikb i' som inneholder sidekjede■r med inntil 5 C-atomer.

Fortrinnsvis er det riktignok-som carbonkilde i

i

disse mutantskille- respektiv anrikningsmedier å anvende en steroidforbindelse med 3 C-atomer i 17-C-sidekjeden .i det hensiktsmessig her anvendes en 17-C-steroid-a-propionsyrefor-bindelse eller også- et flertall slike ønskede 17-C-a-propion-syreforbindellser som eneste carbonkilde.

Det kan dermed videre være fordelaktig .i dette mu-tant skillemedium som carbonkilde å anvende de 17-C-steroid-a-propionsyref ojrbindelser hvis fremstilling tilstrebes ved hjelp av de i følge! oppfinnelens dyrkede defektmutanter. Slik skal det altså inn.en oppfinnelsens ramme fra steriner av plante-eller dyrisk opprinnelse eksempelvis finnes A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC tilslutt som fremgangsmåteprodukt, så kan det være hensiktsmessig i mutanskille- respektive.anrikningsmediet,

dette trinn 3; som eneste carbonkilde å anvende A-4 BNC og/eller A-I,4 BNC.

Forøvrig arbeides det her med vanlige næringsoppløs-ninger under aerobe betingelser.

De muterte mikroorganismer som på grunn av mutasjonsbehandlingen har tapt sin evne. til å vokse på de nu foreliggende carbonkilder, kan ved dyrking av mutantskillemediet ikke formere seg. De.vokser altså ikke, eller ikke vesentlig. Under annen del av mutantpopulasjonen som ved mutasjonsbehandling i det annet trinn enten ikke er blitt tilstrekkelig beskadiget eller har undergått andre defekter, er i stand til å vokse på mutant-skillemediets carbonkilde. Ved dyrkning inntrer altså her en formering.

I følge oppfinnelsen gjøres det nytte av disse forskjellige forhold således at betingelsene i mutantskillemediet velges således, at de voksende stammer utryddes på grunn av deres vekst eller under deres vekst uten at de ikke voksende mutantstammer .beskadiges.

En slik skilling er eksempelvis mulig ved tilsetning

j

av antibiotika eksempelvis ved tilsetning av penicilinforbindelser. Tilsetningen av penicilinforbindelser fører til utryddelse av den voksende mikro-organismus-stammedel mens den ikke-voksendej stamme forblir ubeskadiget.

Frk de gjenblivende ubeskadigede blokkmutanter kan da f.eks. vedj ihjelp av den i og for seg kjente Lederbergske stempelmetode| de i følge oppfinnelsen tilstrebede defektmutanter isoleres. Med hensyn til den her anvende fremgangsmåte-teknikk og til penicilinanriknihgsmetoden og til den Leder-

i bergske stempelmedode henvises eksempelvis til J. Amer. Chem. Soc. 70,4267, (1948.) Davis, B.D. (Penicillin-Anreicherungs-methode), J.Bact. 63, 399 (1952) Lederberg, J.,Lederberg E.M.

(Lederbergsche Stempelmethode).

■En| anne i følge oppfinnelen egnet medode er utryd-delsen av dé uegnede mutanter ved anvendelsen av næringsmedier som inneholder radioaktive komponenter som til slutt beskadiger de voksende celler, spesielt under innbygning i cellestruktur-en. Egnet er her eksempelvis utryddelse av de uegnede mutanter

32

ved hjelp av et nænrigsmedia som inneholder P, spesielt 32 ..1form av saltet NaH"2 PO^, til denne maktiveringsteknikk se Fuerst, C.R., Stent, G.S.: Inactivation of Bacteria by Decay of Incorporated Radioactive Phosphorus, J.Gen.Physiol. 40, 73-90 (1956).

Til trinn 4

De således isolerte og selekterte defektmutanter

kan nu dyrkes på vanlig næringsmedium og deretter underkastes hvis ønskes den ytterligere seleksjon. Seleksjonen kan her eksempelvis foregå etter tilstebede resultat av mikro-organis-musstammene på tilsiktede anvendte materialer, eksempelvis på naturlig eller plante-sterinforbindelser, i det her spesielt kjemiske natur av stoffvekselproduktet av mikro-organismevekstén og vekstevnen av stammen-__er_.._bestemmende. Selvsagt vil man foretrekke defe.ktmutanter med optimal produktivitet av det sist ønskede fremgangsmåteprodukt. Disse stammer kan anvendes i den tekniske fremgangsmåte. Dyrkning og seleksjon kan her gjentas en eller flere ganger.

Innen rammen av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen

er imidlertid også mulig å gjenta rekkefølgen av fremgangsmåte^trinn av mutasjon i følge trinn 2 og den etterfølgende mutant-skilling i følge trinn 3 en eller flere ganger, hvis det synes ønskelig en ennu sterkere innvirkning av de mutagene stoffer på de. defekte! mutantstammer- for oppnåelse til slutt av et op-timalt produksjonsresultat. Avsluttende opparbeides da vanligvis i følgb trinn 4.

I følge oppfinnelsen kan det være å foretrekke å fastslå de spésielt ønskede .def ektmut ant stamme r. ved._d.eres.____ transformasjohsytelse i en standard prøve. Her bestemmes ytelsesevnen av stammen med hensyn til dannelsen av A-4 og/

i

eller A-I,4 BNC Por utbyttebestemmelsen i følge denne stand-ardprøve gjelder da følgende betingelser:

i

i BNC utbytte etter standardprøve

En' defektmutantstamme som skal undersøkes dyrkes i

5 00 ml Erlenmeyerkolber med 100 ml næringsoppløsning av følgende sammensetning: 0,8 % pepton, 0,9 % gjærekstrakt, 0,3- % glykose, 0,06 % "Tween 80" (polyoxyehylensobitanmonooleat), 0,06 % sterinf orbindelse (cholesterin eller sitosterin), pH 7,2. Kulturen videredyrkes på rystemaskin (rystefrekvens 150 omdr/min)

ved 30°C i 62 timer.. Deretter tilsettes 0,1 % BRlJ 35 (polyoxyethylenmonolauryleter) og.0,1 % av på forhånd valgte sterinforbindelse (cholesterin eller sitosterin) og dyrkes ytterlig-

ere i. 120 timer. Etter avbrudd av kulturen blir det tatt prø-

ver og disse ekstraheres og analyseres tynnsjiktkromatografisk. Det prosentuelle utbytte av A-4 og/eller A-I,4 BNC blir bestemt. Samtlige prosentangivelser er vekt-#. Utbyttet referer seg

til den i standardforsøk anvendte vektmengde av sterinforbindel--sen som skal overføres.

De innen oppfinnelsens ramme foretrukne defektmutant-stammer gir under visse standardbetingelser med cholersterin eller sitosterin som steroidsubstrat et minsteutbytte på 15 vekt-^, fortrinnsvis utbytte på 30 vekt-# og mer. Ved anvendelse av cholesterin som steroidsubstrat kan det foretrukkede minsteutbytte innen rammen av denne standardprøve gi 50 vekt-# eller mer, i det spesielt virkningsfulle stammer gir BNC utbyt te i området fra 70 til 80 vekt-$. Ved anvendelse av sitosterin som steroidsubstrat kan utbytte ligge noe lavere. men_også her oppnås verdier i området fra 40-til 50 vekt-%.

Oppfinnelsen omfatter videre fremgangsmåten til frem-i

stilling av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser og. spesielt fremstilling av 3-oxo-pregna-l,4-dien-20-carboksylsyre og/eller 3-oxo-pregna-4-en-20-carboksylsyre ved hjelp av de således ut-vunnede defekjtblokkmutanter fra sterinforbindelser med side-kjeder i 17-Cj-stilling, spesielt av dyrisk eller planteopprinnelse.

Ved siden av eller i stedet for anvendelse av stero-idsubstrater av naturlig opprinnelse som cholesterin og sitosterin og så videre, kan det. også finnes anvendelse for herav avledete forbindelser'som cholestenon, sitostenon, stigmastenon og lignende sbm utgangsmateriale.

i

Dei selektive omdannelser av det som utgangsmateriale valgte steroidsubstrat, spesielt også en naturlig sterinforbindelse, kan etter tilveiebringelse og valg av defektmutant i henhold til den tidligere omtalte fremgangsmåte foregå på i og for seg kjent måte. Således kan altså eksempelvis den som anvendt materiale valgte steroidforbindelse tilsettes i kulturen under inkubasjonsperioden eller den kan tilsettes i næringsmediet før inokulering.av defektmutanter. Det kan anvendes en steroidforbindelse eller også en blanding av flere steroidforbindelser. Fortrinnsvis anvendes steroidforbindelser som skal avbygges selektivt i kulturen i mengder på ca. 0,1 til 100 g/l. Den optimale konsentrasjon av sterinforbindelser som skal over-føres i dyrkningstrinnet er vanligvis stammeavhehgig og kan fastslås hver gang ved enkle forforsøk. Vanligvis ligger sterinf orbindelsens konsentrasjon i mediet fortrinnsvis ikke over 20 g/l og ofte ikke over 15 g/l, imidlertid foretrekkes mengder over lg/l.

Det kan da være foretrukket å tilsette substratet som skal.Underkastes sidekjedeavbygning ikke på en gang til reaksjonsmediet, men tilsetningen foretas etterhvert i lø-pet av reaksjonen. Fortrinnsvis tilsettes utgangssubstrat i denne utførelsesform i det vesentlige kontinuerlig i reaksjonsblandingen i løpet av avbygningsreaksjonen. På denne måte kan

ofte utbytte av det ønskede avbygningsprodukt økes.

Kulturen dyrkes i et. næringsmédium som som_carbonkilde enten inneholder sterinene som skal overføres, eller også ekstra metaboliserbare carbohkilder samt de vanligvis for disse mikro-organismer nødvendige nærings- og vekststoffer. Spesielt gunstig for veksten av mikro-organismer er f.eks.

i

;parafin,.glycerol, carboksylsyre, stivelse, dextrin, saccarase, glycose, frucjtose og sukkerholdig avfallsstoffer. Egnede ni-trogerikilder er ammoniumssalter, nitrater, pepton, maissvell-vann, soyamelj, slamp og fiskemel. Videre kan det tilsettes fermantasjonsakseleratbrer som gjærekstrakt og vitaminer. Næringsmediet inneholder dessuten hensiktsmessige uorganiske salter som natrium-, kalium eller ammoniumfosfater samt kalsium-mangan-, magnesium eller jernsalter.

Emulgeringen av sterinene i næringsmediet foregår fortrinnsvis yed. hjelp av kjente emulgatorer, f .eks. ved hjelp av f ettsyrer-'sorbitanester. eller deres ethylenoxydaddukter, polyoxyethylenmonolauryleter eller fettsyreamidoalkylbetain.

Det anvendte kulturmedia steriliseres for begynnel-sen av bakterieveksten hensiktsmessig under oppvarming. Etter avkjøling og podning av kulturmediet med en egnet forkultur

av den transformerende bakteriestamme inkuberes mellom 25° til 55°C, fortrinnsvis ved 27° til 30°C. Næringsoppløsningens pH-verdi ligger mellom pH 4 til 8,5, fortrinnsvis ved 7,0 til 8,0. Kulturen forsørges med oksygen ved hjelp av vifting, røring eller gassinnføring og inkuberes til. fullstendig avbygging av steriner til det ønskede trinn. Avbygging av sterinene krever alt etter substraktkonsentrasjon og de andre fermenteringsbet-ingelser vanligvis 24 til.160 timer.

Det på denne måte fremstilte fremgangsmåt.eprodukt

som vanligvis anriker seg på fermentasjonsvis, kan deretter utvinnes på i og for seg kjent måte fra reaksjonsblandingen. Således kan eksempelvis BNC forbindelser isoleres ved ekstrahering med organiske oppløsningsmidler 'som methylisobutylketon, eddiksyreestere, n-hexanol, n-octanol, kloroform eller n-hexan fra kulturmediet før eller- etter adskillelsé av cellene.

Eksempelvis lykkes en-isolering av BNC-forbindelse

i det man ekstraherer 1 liter av en fermentasjonsoppløsning som

l

inneholder 1 g BNC med omtrent like volum organisk oppløsnings-i middel som med methylisbbutylketon, eddiksyreester, n-hexanol, n-octanol,kloroform eller n-hexan i perforator,turborører eller skilletrakt. I begge sistnevnte tilfeller må det for adskillel-se. av den BNCrholdige organiske fase fra emulsjonen utelukkes et sentrifugecfingstrinn.

Etter fordampning av oppløsningsmiddelet blir det tilbake et "BNjC-holdig reside som etter omkrystallisering f.eks. fra benzene kan opparbeides' til ren BNC av smeltepunkt 233° til 236°C. I

Oppløsriingsmiddelekstaksjonen er spesielt mulig i surt pH områdde.. Dertil blir eksempelvis med 50 %- ig HpSOj.

f.eks. på pH 2 innstilt og ekstraheres med methylisobutylketon, eddiksyreesteire, n-hexanol, n-octanol, kloroform eller n-hexan på den ovenfor angitte måte. Etter inndamping av den organiske fase fåes også her et BNC-holdig reside som igjen etter,omkrystallisering fører til renproduktet med smeltepunkt 233° til 236°C. Ekstraheringen kan også gjennomføres i nøytralt område. .Alternativt er det også mulig en renskning ved hjelp av anionutveksling. Hertil oppkonsentreres fermenteringsopplø-sningen mest hensiktsmessig i første rekke og innstilles'deretter på en alkalisk verdi, eksempelvis pH 12. Etter tilsetning av en begrenset mengde methanol.og utrøring i turborører ad-skilles cellemassen ved hjelp av en passeringssentrifuge. Det vanndige methanoliske overstående pUmpes en ioneutvekslersøyle som er fylt med en anionutvekslerharpiks f.eks. i acetatform. Det dannede BNC bindes derved fullstendig ioneutveksleren.

Ved eluering i- 10 %-ig eddiksyre i methanol til et produkt som

i første rekke overveiende inneholder BNC etter omkrystallisering fåes også her ren BNC av smeltepunkt .233° til 236°C.

I følge en foretrukket utførelsesform lykkes isoler-ingen av BNC forbindelsen fra.fermenteringsvæsken ganske enkelt ved utfelling i surt område og frafiltrering. Hertil filtreres den alkalisk innstilte fermenteringsvæs~ke i første rekke for å fjerne cellemateriale og andre faste bestanddeler. Deretter surgjøres, derved faller BNC ut i fast filtrerbar form og kan f.,eks. utvinnes ved enkel frasugning..

Til surgjøring er enhver mineralsyre anvendbar, men det kan imidlertid også anvendes organsike syrer f.eks. eddiksyre og !sågar gassformet CC^. Ved pH 5 er det nådd en praktisk talt fullstendig utfelling. Til bedre filtrerbarhet kan...det være gunstig kort å oppvarme suspensjonen.

De isolerte faste stoffer kan inneholde inntil 90% BNC forbindelser. De rene forbindelser lar seg gjenvinne ved omkrystallisering'; herav.

I

Spesielle detaljer til oppfinnelsen-1

Ved hjelp av en i følge oppfinnelsen villstamme-seleksjonsmetbde kunne det i løpet av forholdsvis kort tid isoleres et sjtort antall villstammer som prinsipiell er egnet som utgangsmajteriale for mutasjonsfremgangsmåten i følge oppfinnelsen. De viktigste av disse villstammer er deponert med følgende deponeringsnummere: ATCC 31455, ATCC 31458, DSM 1418, DSM 1419, DSM| 1423.DSM 1424, DSM 1425, DSM 1426, ,DSM 1427, ' DSM 1428, DSM! 1429, DSM 1430, DSM 1431, DSM 1432. Videre detaljer inneholdes i sammenstillingen i slutten av eksemplene.

Ved disse mikroorganismer dreier det seg om spesielle bakteriestammer som i det minste delvis skulle være å tilregne de coryneforme bakterier.

Interessant ble det fastslått at også den allerede .

i patent I nevnte villstamme Chol 73, som er deponert under deponeringsnummer CBS 660.77 i Baarn,Holland, samt under deponeringsnummer ATCC 31384 i Rockville, Maryland/ USA, som oppfyller seleksjonsmetodikken i følge oppfinnelsen, d.v.s.

i nærvær av inhibitorer i betraktelige mengder av. A-4 og/eller A-I,4 BNC-forbindelser. Også denne til gruppen av coryneforme bakterie hørende villstamme er dermed prinsipiélt et innen oppfinnelsens ramme egnet utgangsmateriale for den etterfølgende mutasjon til de ønskede defektmutanter.

Fra den på.forhånd.nevnte villstamme ATCC 31455 ble det ved mutasjonsbehandlingen i følge oppfinnelsen oppnådd defektmutanter som er høyvirksomme innen oppfinnelsens ramme og eksempelvis muliggjør en inhibitorfri storteknisk fremstilling av A-4 og A-I,4 BNC-forbindelser fra cholesterin eller sitosterin. Det samme gjelder for defektmutantstammene av de andre nevnte villstammer, f.eks. villstammen ATCC 31458. Spesielt i ' '■■

virkningsfulle defektmutantstammer ble deretter deponert under deponeringsnufnmer ATCC 31456 og ATCC 31457 -i det det ble gått ut fra villstammen ATCC 31455. På basis av villstammen ATCC 31458 ble det utviklet og deponert defektmutantene ATCC 31459

og ATCC 31460.

Alle her nevnte vill- og defektmutant-stammer faller innen oppfinnelsens ramme.

Eksempel 1 A. Utvinning av egnede villstammer.

I følge, i og for seg vanlige anrikningsmetoder iso-

i leres fra jordprøver sterinavbygde mikroorganismer, som man i første rekke undersøker i en plateprøve på deres evne å vokse .

på 3-sitoste!rin. Stammer med tydelig kolonidannelse anlegges som renkulturj og underkastes ytterligere seleksjonsfremgangs-måter.

B.. Bestemmelse av vekstfaktoren a.

Til fastleggelse av vekstfaktoren a dyrkes aerobt

de isolerte renkulturer under de generelle beskrivelsesdeler angitte betingelser. Til bestemmelse av deri optiske tetthet av cellesuspensjonene uttas hver gang i 24 timers avstand prø-ver og målingene gjennomføres etter angivelsene av standard-prøven i den generelle beskrivelsesdel. Etter oppnåelse av hver gang maksimal celletetthet avbrytes forsøket.

C. Bestemmelse av seleksjonsfaktor p.

De villstammer som i rystekolbeprøven med B-sitosterin viser den beste vekst, undersøkes deretter i inhibitor-prøve på deres evne til intermediær BNC-opphopning. Den aerobe dyrkning av stammene foregår for dette formål i 100.ml nærings-oppløsning av følgende sammensetning: 0,20 % K-pHPO^, 0,05 f° NaH2P0jp 0,80 % pepton, 0,90.$ gjærekstrakt, 0,30 % glukose,

pH 7,2. Kulturblandingene inkuberes 48 timer ved 30°C på rystemaskin, blandes deretter med 0,1 % "Tween 80" (polyoxyeth-ylénsorbitanmonooleat) og 0,1 % cholesterin og.tilsettes etter ytterligere 4 timer 10 a,a'-dipyridyl. Ved tidspunktet for. inhibitortilsetningen justeres pH-verdien av mediet til 8,0. Kulturene stusses etter 62 timer og innholdet av BNC bestemmes tynnsjiktkromatografisk etter vanlig metode.

t ■

D. Villstamme som tilsvarer definisjonen i følge oppfinnelsen .. De mest virkningsfulle av de undersøkte stammer ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockvill, Maryland, USA, reppektiv ved den tyske samling av mikro-organismer, .Grisebachstr.i 8, 340.0 Gtfttingen, Tyskland..

i 'i.

Eksempel 2 J'

A. ■ Mutasj on. l.| Mutasjonsbehandling med kjemiske midler. Stammen SC-309 formeres i første rekke, i følgende næringsoppløsning ved 30°C (næringsoppløsning.A): 0,8 % peptonj 0,9 % gjærekstrakt, 0,3 % glukose, 0,06 % "Tween 80" (polyoxyethylensorbitanmonooleat), 0,06 % sitosterin, pH 7,2. Etter oppnåelse av den logaritmiske vekstfase behandles kulturoppløsningen 1,5 time med det mutagene stoff 1-methyl- i<..> 3-nitro-l-nitrosoguanidin i konsentrasjon på 1 mg pr ml kul-turvæske. Deretter frasentrifugeres cellene, den mutagene forbindelse f<_>jernes ved vasking med sterilt physiologisk koke-salt igjen, og cellene resuspenderes.i ny næringsoppløsning A og inkuberes.! 2. 1 Mutasjonsbehandling ved hjelp av UV- bestråling.

Mutasjonsbehandlingen foregår ved UV-bestråling med samme<1>cellemateriale som angitt under A 1. Etter oppnåelse av den logaritmiske vekstfase, frasentrifugeres cellene av stammen SG 309 under sterile betingelser, vaskes to ganger med sterilt 0,1 mol.fosfatpuffér (pH 6,5), resuspenderes i samme puffer og under mikroskop innstilles celletettheten på 10 fl-celler/ml. 8 ml av denne cellesuspensjon overføres i en Petiskål og be-stråles 90 sekunder under UV-lampe (30 cm avstand., UV-bestrål-ingslampe fra firma E.. Schiltt Jun., GdJttingen). Den således behandlede cellesuspensjon resuspenderes i friskt næringsopp-løsning A og dyrkes.

B.. Seleksjon og isolering av de ønskede defektmutanter. 1. Penicilline- og " replica- stempel" metode.

Den under punkt A 2 behandlede kultur inkuberes ca. •72 timer ved 30°C på rystemaskin inntil en celletiter på over 10^- celler pr ml kulturoppløsning.

0,1 ml av denne cellesuspensjon overføres i 10 ml av følgende næringsoppløsning (næringsoppløsning B) :. 0,05 % NaH^PO^, 0,20 % K2HPOij, 0,05 % MgSO^ • 7H20, 0,02 % CaCl2 • 2H20, 0,005 7» MnSO^. •<*>fH20, 0, 005 % (Fe)2SOiJ- 7H2<0,>0,10 % (NH)i|SOi|, 0,0001 % biotin, 0,10 % "Tween 80" og 0,10 %. BNC. Etter 18 timers ryStingved 30°C, fortynnet med frisk foropp--

varmet næringsoppløsning av samme sammensetning på ca. 10^ celler pr. ml, 1000 internationale enheter penicillin G_tilsettes og inkuberes ytterligere 7 timer ved 30°C. Deretter fjernes

i ■ ' antibiotikumet ved frasentrifugerihg fra cellene med vasking med steril physiologisk koksaltoppløsning og cellene inkuberes i overnevnte mjedium med 0,2 % sitosterin i stedet for BNC i ytterligere 3! dager. Penicillinbehandling gjentas en ytterligere gang, og cellesuspensjonen utplasseres deretter på næringsmedium A plusjs 1,6 % agar. Etter formering av cellene til syn-

j

lige kolonierj avstemples ved hjelp av "replica-stempel-teknikk" på næringsmedjia B pluss 1,6 % agar og de kolonier selekteres og anlegges sp' m stammekultur, som ikke eller knapt nok formår å vokse på delt te me'dium. 1 32 2 . i P - skillemetode og " replica - stempel "- teknikk .

Kulturen behandles som under punkt A 1, inkuberes

ca. 48 timer yed 30°C på rystemaskin inntil det er oppnådd en

I Q

celletiter påi over 10 .

Den utvokste kultur høstes ved sentrifugering og vaskes to ganger med physologisk kokesaltoppløsning. Cellene oppdemmes i en fosfatfri næringsoppløsning av følgende sammensetning : 0,2 % BRU 35, 0,2 % ammoniumsulfat, 0,1 % bisnorcholenonsyre,. 0,8 $NaCl, springvann pH 7,0. Det rystes 24 timer ved 30°C, i denne tid har de inpodede celletall på 10 oceller pr. ml for-32 doblet seg. Til en blanding av 20 ml haes en mol C NaH2PO^ av spesifik aktivitet på 200 m C/mMol. Det rystes ytterligere i 24timer ved 30°C, deretter frasentrifugeres kulturen, vaskes' 3 ganger med physiologisk kokesaltoppløsning, opptas i 20 ml en 10 $-ig gluceroloppløsning og innfryses i 10 smårør til 2 ml.

Etter forskjellig lang lagringsvarighet tines de inn-frosne kulturer og utplaseres på glukose-pepton-gjærekstrakt-næringsagar. Celletallene av de overlevende bakterier avtok i løpet av 3 ukers lagring med 99,9 %• De overlevende celler fra denne blanding ble etter vekst til kolonier avstemplet fra full-næringsmediet til agar med bisnorcholenonsyre som carbonkilde

og de kolonier selektert som ikke eller knapt formår å vokse på sistnevnte medium.

C. Utvalg av de mest aktive defektmutanter.

i

I følge den under B 1 respektiv B 2 avgitte, skille-og seleksjons'fremgangsmåte, ble det hver gang isolert ca. 90 stammer.

Til valg av de mest aktive BNC-opphopende mutanter ble samtlige stammer igjen prøvet i SubmerskUltur. Dyrkingen foregikk i reagensglass med hver gang 2 ml næringsoppløsning A. Etter' 24 timejr ved 30°C på "Roler Tube" ble det tilsatt 0,1 # "Tween 80" og 0,1 % $-s.itosterin og etter. ytterligere 96 timer

■ analysert trai hsformasjonsproduktene ve-d ekstrahering og tynn-sjiktkromatografi.

i

Derved viste det seg av mutanten som<y>ar isolert etter penicillihmetoden en- stamme SC 309 179 (ATCC 31459) med en BNC-dannelsesgrad på 30. % og av mutantene, som var blitt isolert etter P-<52->metbden, stamme SC-309 189 (ATCC 31^60) med en grad

på 35 % som de mest aktive stammer.

I

Eksempel 3

A. BNC- utbytte av de mest aktive mutantstammer.

1. BNC- utbytte av stammen SC- 309- 179

Stammen SC-309-179 ble dyrket i 500 ml Erlenmeyerkolber med 1.00 ml næringsoppløsning av følgende sammensetning: 0,8 % pepton, 0,9 % gjærekstrakt, 0,3 % glukose. 0,06 % "Tween 80" (polyethylensorbitanmonooleat), 0,06 % 3-sitosterin, pH 7,2. Kulturen fordyrkes på rystemaskin (rystefrekvens 150 omdr/ min) ved 30°C i 62 timer, deretter tilsatt 0,1 % BRU 35 (polyoxyethylenmonolauryleter) og 0,1 % 8-sitosterin og dyket i ytterligere 120 timer. Etter kulturens avbrudd uttas prøver og disse ekstraheres, analyseres tynnsjiktkromatografisk. Referert til den anvende substratmengde ble det dannet 35 % 3-oxo-pre-gna-1,4-dien-20-carboksylsyre og-4 % 3-oxo-pregna-4-en-20-carboksylsyre og mindre mengder av androst-1,4-dien-3,17-dion.

2. BNC-utbytte av stammen SC-309-189

Under samme betingelser som angitt ovenfor dannet stammen SC-309-189 følgende.produkt: 42 % 3-oxo-pregna-l,4-dien-20-.carboksylsyre, 9 % 3-oxo-pregna-4-en-20-carboksylsyre og spor av AD og ADD.

Claims (1)

1

1. Fremgangsmåte til fremstilling av mikroorganisme-defektmutanter, som er i stand til teknisk utvinning av 17-C-steroid-a- pro <p> ions <y> ref orbindelser, spesielt til fremstilling av 3-oxo-prégna-4-en-20-carboksylsyre (A-4 BNC) og/eller 3-oxo-pregna-1 j|4-dien-20-carboksylsyre (A-I,4 BNC) fra 17-C- .

i

sidekjedesterpidsubstratet, f.eks. fra sterinforbindelser av dyrisk eller planteopprinnelse, med en sterkt selektiv side

kj edeavbygning under aerobe betingelser osså i fravær av steroidringavbygning <p> g/eller veksthemmende inhibitorer k a r -

i ■ ■ akterisjert ved at man

1. ' isolerer og dyrker en mikro-organisme-villstamme som er i stand til vekst på sterinforbindelser som eneste carbonkilde,

2. underkaster villstammen en i og for seg kjent mutasjonsbehandling,

3-' dyrker den mutanpopulasjonen på et skillemedium., hvorpå de 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelsesleverende mutanter praktisk talt ikke vokser,

mens de uønskede medfølgende mutantstammer vokser og herved utryddes respektiv utryddes under deres vekst, og

4. dyrker den gjenblivende rest av mutantstammen på 17-C-sidekjedesteriner og derved isoleres defekt-mutantstammen med optimal produksjon av 17-C-steroid-a-propionsyref orbindelser,

i det man i trinnet til 1. isolerer en villstamme og dyrker som ved aerob vekst på sterinforbindelser' i nærvær av inhibitorer for-den enzymatiske ringavbygning av sterinforbindelsene sted-vis gir 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser..

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at man i trinnet til 1 isolerer slike villstammer og dyrker som ved vekst på sterinforbindelser med mettede eller umettede alkylrester i 17-C- med 8 til 10 C-atomer, gir et utbytte av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser målt under standardbetingelser som definert ovenfor, på minst 5 vekt-#, fortrinnsvis på minst 10 vekt-%, referert til den eller dé i

I

standardforsøket anvendte sterinforbindelser.

3- Framgangsmåte i følge krav 1 og 2, karakterisert v| e d at man i trinnet til 1, isolerer og dyrker mikro-organismevillstammer som ved vekst på sterinforbindelser med mettede_ eller umettede alkylrester i 17-C- med 8 til 10 C-atomer, gir en selektiv avbygningsytelse målt under standardbetingelser søm definert ovenfor, i følge den generelle formel

I = a 10p

hvori a er vekstfaktoren og p selektivitetsfaktoren av vill-s.tammeveksten, og selektivitesindeks I utgjør tallverdi på minst

1, fortrinnsvis på minst 2 og spesielt verdier på minst 20.

i

4. Fremgangsmåte i følge krav 1 til 3 , karakterisert ved at det isoleres og dyrkes mikro-organismevillstammer hvis vekstfaktor a under standardbetingelser utgjør minst 0,2, fortrinnsvis minst 1, og deres selektivitetsfaktor p under standarbetingelsene minst utgjør 0,5, fortrinnsvis minst 1.

5- Fremgangsmåte i følge kravene 1 til 4, karakterisert ved at man i trinn til 1. isolerer og

dyrker villstammer som foretrekker 17-C-sidekjedeavbygning

.ovenfor en ringavbygning.

6.. Fremgangsmåte i følge krav 1 til 5>karakterisert ved at villstammens mutasjonsbehandling i følge trinnet til 2. gjennomføres under slike betingelser at konsentrasjon og innvirkningstid av det mutagene stoff, at utgangspopulasjonen av mikro-organismene inaktiveres ved den mutagene behandling til 10 til 99, 999 %, i det det. fortrinnsvis arbeides med en utryddelsesgrad fra 90 til 99}99 %•

7- Fremgangsmåte i følge kravene 1 til 6, karakterisert ved at det som villstamme anvendes en av følgende mikro-organismer: ATCC. 31455.' ATCC 31458. DSM I4l8, DSM 1419, DSMj 1423, DSM 1424, DSM 1425, DSM 1426, DSM_l42J, DSM 1428, DSMj 1429," DSM 1430, DSM 1431' og DSM 1432.

8. Fremgangsmåte til fremstilling av 17-C-steroid-ot-propionsyreforbindelser ved mikrobiell sidekjedeavbygning på

i 17-C-sidekjedesteroidsubstrater, spesielt slike av dyrisk og/

eller av planteopprinnelse, hvor man

a) dyrkermikroorganismedefektmutanter, som også i fravær av steroidringavbygning og/eller veksthemmende inhibitorer gir steroidforbindelser. med 17-C-a-propionsyrerest i et vanndig næringsmedium'' under aerobe betingelser i nærvær av steroidsub-I strater under anrikning av 17-C-steroid-a-propion-syreforbindelsene i fermentasjonsvæsken, og b.)| isolerer de dannede 17-C-steroid-a-propionsyre-

I forbindelser, karakterisert ved at man arbeider med defektmutanter som mikro-organismer som er blitt fremstillet ved fremgangsmåten i følge et eller flere av kravene 1 til 7.

9. Fremgangsmåte i følge krav 8, karakterisert ved . at man arbeider med defektmutanter som ved dyrkning på cholesterol eller sitosterin under standardbetingelser gir minsteutbytte av A-4- og/eller A-I,4 BNC på 15 %, fortrinnsvis på minst 30 % og ved dyrkning på cholesterol, spesielt et utbytte på minst 50 %, hver gang referert til vekten av anvendt,. sterinforbindelse.

10..Fremgangsmåte.i følge kravene 8 og 9, karakterisert vedat man arbeider med defektmutanter av achromobacter, arthrobacter, bacillus, brevibakterium, corynebakterium, flavobakterium, mikrobakterium, mykrobakterium, no-cardia, protaminobakterium, serratia og streptomyces.

11. Fremgangsmåte i følge kravene 8 til 10, karakterisert ved at man setter steroidsubstratet som skal transformeres til.reaksjons-sonen i det minste sterkt kon-

I

tinuerlig. j

12. Frjemgangsmåte i følge kravene 8 til 11, karakterisert ved at man arbeider med en-av følgende

defektmutantep: ATCC, 31456, ATCC 31457, ATCC 31459 og ATCC 31460.

13. Ny,e mikro-organismedef ektmutant stammer fremstilt i følge fremgangsmåten i følge kravene 1 til 7.

i