NO762716L

NO762716L -

Info

Publication number: NO762716L
Application number: NO762716A
Authority: NO
Inventors: M R Brown; J E F Rivier; Jr W W Vale
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1975-08-06
Filing date: 1976-08-05
Publication date: 1977-02-08
Also published as: FI762252A; PT65388A; IE44532L; CH623806A5; IL50047A0; JPS5219658A; DK351576A; FR2320108A1; SE7608794L; AU504070B2; IE44532B1; NL7608764A; FR2320108B1; PT65388B; GB1551929A; IL50047A; DE2634416A1; US4372884A; CA1125282A; AU1643676A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling

av peptider med inhiberende innvirkning på 1) sekresjonen av veksthormon av hypofysen, 2) sekresjon av glukagon og insulin av bukspyttkjertelen, og 3) sekresjon av vasoaktivt intestinalt polypeptid, sekretin, gastrin og mavesyresekresjon i mennesker og dyr. Mer spesielt vedrører -den foreliggende oppfinnelse peptider som er effektive for å inhibere sekresjon av veksthormon av hypofysen og å inhibere sekresjon av glukagon og insulin av bukspyttkjertelen.

Et peptid med inhiberende virkning på sekresjonen av veksthormon

erkarakterisertog beskrevet i US.patentansøkning Serial No.478.175

som nå foreligger som US.patent 3.904.595. Dette peptid er gitt navnet "somatostatin". Somatostatin er et tetradekapeptid og.

har følgende struktur, med aminosyredelene gitt nummer fra venstre til høyre i samsvar med vanlig nomenklatur.;'

Somatostatin, den lineære form av somatostatin (dihydrosomatostatih)

og forskjellige acylerte derivater av somatostatin og dihydro-

somatostatin er beskrevet i den ovennevnte US.patentansøkning.

,Den foreliggende oppfinnelse beror på den erkjennelse at visse aminosyrer kan substitueres for aminosyresubstituentene i•hoved-

kjeden for somatostatin og dihydrosomatostatin til å gi peptider som er terapeutisk verdifulle når de enten direkte eller indirekte innføres i blodstrømmen i pattedyr til å inhibere sekresjonen av veksthormon fra hypofysen og insulin og glukagon fra bukspyttkjertelen.

Peptidene kan innføres direkte i blodstrømmen, nasallt, ved imprantering av peptidene subkutant eller intramuskulært eller ved en hvilken som helst annen kjent metode enten med eller uten nærvær av et fortynningsmiddel eller en bærer. Peptidene kan innføres direkte i blodstrømmen ved injeksjon. Forskjellige peptider fremstilt i samsvar med oppfinnelsen er funnet å ha en virkning som er flere ganger større enn for somatostatin når de anvendes for å inhibere veksthormon, insulin og glukagon.

Det vesentlige formål for den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe peptidmaterialer som har en inhiberende effekt på 1) sekresjon av veksthormon av hypofysen og 2) sekresjonen av glukagon og insulin av bukspyttkjertelen i pattedyr, inklusive mennesker. Et annet formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe peptider som påvirker sekresjonen av tyroid-stimulerende hormon i pattedyr, inklusive mennesker.

Disse og andre formål for oppfinnelsen vil fremgå mer detaljert av den følgende beskrivelse.

Generelt, er det på bakgrunn av oppfinnelsen erkjent at peptider med følgende struktur er biologisk aktive for å inhibere sekresjon av veksthormon:

hvori R er en asylgruppe eller hydrogen og R o er valgt fra Ala, Asn og des F^. Det er konstatert at Tyr kan erstattes for enten den ene eller begge av Phe lokalisert ved 7- og Il-stillingene uten å påvirke effektiviteten av peptidene. Det er også erkjent at Ala kan substitueres for hvilken som helst aminosubstituent i de ovenfor beskrevne peptider.

Foretrukne asylgrupper som er funnet å være funksjonelle for .. i de ovenfor beskrevne peptider er valgt fra følgende:.

(a) des-Ala-Gly. Nao r R^er des-Ala-Gly kan Cys 3 være des-amino-Cysj

(b) en hvilken som helst aminosyre. For de brodannede peptider foretrekkes det at aminosyren ikke inneholder en sulfhydrylgruppe: (c) et dipeptid fremstilt fra hvilket som helst to aminosyrer hvori den annen aminosyre forbundet til Cys 3 ikke fremrbinger sterisk hindring. Foretrukne sekundære aminosyrer er Gly, Ala og (3-Ala. For de brodannede peptider foretrekkes det at aminosyrene i de peptidene ikke inneholder en sulf hy drylgruppe j -Cd) et tripeptid hvori den tredje aminosyre forbundet til Cys 3 ikke bidrar til sterisk hindring og hvori de resterende to aminosyrer er hvilket som helst aminosyrer. Foretrukne tredje aminosyrer for tripeptidet er Gly, Ala og D-Ala. For brodannede peptider foretrekkes det at ingen av aminosyrene i tripeptidet inneholder en sulfhydryl-gruppej (e) et pentapeptid hvori de første tre aminosyrekomponenter er Gly, den fjerde aminosyre er valgt fra Ala og D-Ala og den femte aminosyre forbundet til Cys 3 bidrar ikke til sterisk hindring og er valgt fra Ala, Gly og D-Alaj (f) alifatiske, aromatiske og cykliske organiske syrer, andre enn aminosyrer, med fra 1 til 10 karbonatomer. De organiske syrer kan være mettet og/eller kan inneholde andre funksjonelle grupper. Spesielt foretrukne acylgrupper velges fra de følgende: Gly, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sark-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Acetyl ,Ac.,ryl, Pivalyl og Benzoyl.

Med unntagelse av bruk av D-Trp er hver av aminosyrene i den-, del av peptidene fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse som strekker seg gjennom og omfatter de to Cys-grupper, d.v.s. 3-stillingen til og med 14-stillingen, den L-isomere hvor aminosyren har isomere former. Hvilken som helst aminosyre som omfatter hvilken som helst av R-gruppene i peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan være enten L-isomeren eller D-isomeren hvor aminosyren har isomere former. Et foretrukket peptid med høy virkning tilveiebringes når D-.Ala er er aminosyren av R^som er forbundet til Cys<3>.

Overraskende tilveiebringer substituering av D-Trp for Trp

i 8-st'illingen peptider med effekt flere ganger større enn somatostatin med hensyn til. veksthormon-inhibering og også med hensyn til glokagori..- og insulin-sekresjon. Substituering av Ala for forskjellige aminosyrer i hoyedkjeden i somatostatin tilveiebringer altså peptider med betraktelig farmasøytisk aktivitet.

Peptidene fremstilles fordelaktig ved hjelp av den såkalte fastfase-teknikk, generelt i samsvar med fremgangsmåten beskrevet i US. patentansøkning Serial No. 478.175, nå US. patentskrift 3.904.595. Syntesen ble gjennomført trinnvis på klorometylert harpiks. Harpiksen var sammensatt av fine kuler (20-70) mikron i diameter av en syntetisk harpiks fremstilt ved kopolymerisering av styren med 1 eller 2% divinylbenzen. Benzenringene i harpiksen ble klorometylert ved en Friedel-kraftsreaksjon med klorometyl-metyleter og stanniklorid. Det såledesiinnførte klor er bundet ved en benzyl-kloridtype av binning. Friedel-kraftsreaksjonen fortsettes inntil harpiksen inneholder 0,5 til 2 mmol klor pr. gram harpiks. Ved den videre beskrivelse av syntese av peptidene vil de anvendte reagenser først beskrives ved deres kjemiske navn med deres vanlige forkortelse i parentes. Deretter vil reagenset benevnes ved hjelp av den vanlige forkortelse.

Et peptid med strukturen:

ble syntetisert ved hjelp av den følgende fastfase-metode.

Andre peptider,beskrevet i'det følgende ble syntetisert ved en lignende teknikk.

Teriobutyloksykarbonyl-S-parametoksybenzyl (Boc-SpOMe-Bzl) derivatet av Cys ble knyttet til harpiksen ved hvilken som helst av de tre kjente metoder: (1) koking under tilbakeløp i etanol i nærvær av trietylamin, 2) seciumsaltet av Boc-beskyttet aminosyre holdes ved 50°C i dimetylformamid (DMF) over natten 3) kaliumsaltet av den Boc-beskyttede aminosyre holdes ved 80°C i dimetylsulfoksyd (DMSO) i 2 timer. Bare en milliekvivalent av det beskyttede Cys pr. milliekvivalent Cl på harpiksen anvendes. Metoden 3) er beskrevet mer detaljert i det følgende: Til en oppslemning av harpiksen og det oppløste beskyttede Cys i DMSO tilsettes 0,.9 méky ■ kaliumtertiobutoksyd (KOtBut) pr. mékv aminosyre. Reaksjons-blandingen utsettes i-sålliten grad som mulrg for luften slik at det ikke iakttas noen ravgul farging. Reaksjon ved 80°C i 2 timer gir en passende substituert harpiks for- syntese av peptidene (omtrent 2 mekv aminosyrederivat pr. gram harpiks). Etter deprodeksjon og nøytralisering bygges peptidkjeden på harpiksen. Deprodeksjon, nøytralisering og addisjon av hver aminosyre gjennomføres i samsvar med plan I. Na<->t-butyloksykarbonyl (Boe) derivatet av hver aminosyre anvendes ved unntagelse av at hvilken som helst oc-aminobeskyttende gruppe kan anvendes for alanin-1-resten (benzyloksykarbonyl$ Zj Boe eller andre). Etter deprodeksjon av den første rest (d.v.s., SpOMe Bzl Cys) i henhold til plan- I

(trinnene 3 til 8 inkludert), adderes deretter N<a>Boc-derivatet av Ser sammen med et koblingsmiddel som er dicykloheksylkarbodiimid'

(DCC) (trinn 9 i plan I). Sidekjeden av Ser beskyttes med benzyleter (OBzH). Den O-benayl (OBzl) beskyttende gruppe anvendes også for beskyttelse av trionin. P-nitrofenylester (ONp) ble anvendt for å aktivere karboksylenden av Asn. O-nitrofenylester kan også anvendes for dette formål. Formylgrupper kan anvendes for beskyttelse av indol N-H. Benzyloksykarbonyl (Z) eller benzyloksykarbonyl-2Cl (Z (2-C1)) ble anvendt som beskyttende gruppe for Lys-sidekjeden. Den Na<->béskyttende gruppe for den siste aminosyre tilført til peptidet kan være hvilket som helst oksy-karbonyl, som'f.eks. Boe eller Z. Når R^-gruppen i peptidet er en organisk syre knyttes denne organiske syre til peptidet før peptidet avspaltes fra harpiksen. Den organiske- syre knyttes til peptidet på harpiksen ved å innføre den organiske syre i nærvær av DCC eller det organiske syreanhydrid eller den organiske syreanhydrid eller den organiske aktive ester. Den organiske syre kan også adderes ved å anvende den organiske syre som en Na<->beskyttende gruppe for den siste adderte aminosyre. I. Plan for kobling av aminosyrene andre Asn ved fastfase-syntese (5-10 g harpiks)

Etter trinn 13 tas det ut en delmengde for en ninhydrin-prøve.

Hvis prøven er negativ går man tilbake til trinn 1 for kobling av den neste aminosyre. Hvis prøven er positiv eller svakt positiv går man tilbake til trinnene 9 til 13. Plan I ble anvendt for kobling av hver av aminosyrene i peptidet til Cys med unntagelse av Asn når denne er tilstede. For Asn er trinnene 1 til 8 de samme og plan II anvendes for resten av koblingsreaksjonen;

II. Plan for Box-Asn-ONp eller for en hvilken som helst

aktiv esterkobling med.fastfase-syntese (5-10 g harpiks).

Etter trinn 14 tas en delmengde for en ninhydrinprøve. Hvis prøven

er negativ går man tilbake til trinn 1 for kobling av den neste aminosyre. Hvis prøven er positiv eller svakt positiv går man tilbake til trinnene 9 til 14.

Avspaltingen av peptidene fra harpiksen (5^ g) og deprodeksjon av

de sidekjede-beskyttende grupper i peptidet ble gjennomført i fluss -syre (75 ml) i nærvær av anisoli (8 ml). Etter fjernelse av fluss-syren under høyvakuum ble harpiks-peptidet vasket med eter.

Den tørkede harpiks ble med en gang ekstrahert med 25 % eddiksyre

(150 ml) og fortynnet til 3000 ml med avgasset F^CK^). pH i løsningen ble innstilt til 6,6 -7,0 med NH.OH. Oppløsningen ble tritrert dråpevis under omrøring med kalium-ferricyanidløsning (1 g/500 ml H^O) inntil det ble iakttatt en permanent gul farge. Oppløsningen ble satt bort i 10 min. og pH ble innstilt til 5,0 med iseddik, og "Bio Rad AG 3-X4A harpiks (100-200 meshj kloridformen, 10-15 g) ble tilsatt til den uklare løsning og omrørt i 15 min. Oppløsningen ble fil trert.oyer selit og påført i rekkefølge på

to kolonner a) Bio Rad AG 3-X4A harpiks-kloridform (10 ml),

b) Bio Réx-70 harpiks (lOOtml)-kationformen. Selit+ harpiksmasse ble grundig vasket med vann (500 ml) som ble påført kolonnene a) og b)

som en vasking. Peptidmaterialet ble så eluert fra "Bio Rex 70"-harpikskolonnen med pyrridin/eddiksyre/vann (30:4:66) eller 50% eddiksyre. Fraksjonene ble samlet idet bare den som inneholdt peptid (ninhydrinpositive) ble fortynnet med vann og øyeblikkelig frysetørket. Det ble oppnådd 1,2 g rått fløtefarget material.

Det ble tilført en "Sephadex G-25 F gel kolonne (3 x 200 cm) ekvilibrert og eluert med 2 N eddiksyre.

Elueringsmønsteret iakttatt ved 280 nm viste en hoved-symmetrisk topp sentrert ved 2 Vq (260 mg). Den ble deretter tilført en fordelingskolonne 1,8 x 100 cm (n-butanol:eddiksyre:vann, 4:1:5). Elueringsmønsteret (280 nm) viste en hoved.topp fra Vq 2.5-4.0.

To fraksjoner ble tatt som deretter viste seg å være identiske ved tsk (165 mg) (omtrent 80% renhet). Dette material (150 mg)

ble påført i en 0,1 M NH4OAc pH 7.0 løsning på en CMC-kolonne (4,5 x 1 cm, 5 ml) og eluert med 0,2 M nH40Ac pH 7,0. Rensing på CMC eliminerer de medfølgende forurensinger som ofte iakttas ved tsk for syntetiske peptider. Det ønskede produkt eluerte som et meget smalt bånd som etter to frysetørkinger ga et hvitt voluminøst pulver (115 mg). En mindre ( mindre enn 5%) forurensing somuikom foran D-Trp 8 -somatostatinet ble iakttatt ved påo føring på o silikagel-plater (Eastman 6061) og gjennomføring med den øvre fase av et system butanol: eddiksyre: vann (4:1:5) (BAW). Dette material (100 mg) ble tilført en fordelingskolonne 1,8 x 100 cm. Eluerings-mønsteret (280 nm) viste en topp sentrert ved 3.3 Vq. Det ble oppnådd 65 mg homogent material etter frysetørking.

23 +

Den spesifikke optiske dreining £aj =-47,3_ 0,5 (c = 1 i 1%

D

23 + eddiksyre) er helt forskjellig fra somatostatin / jxj = -33 0,5

D

under de samme betingelser; Peptidet er åtte ganger mer kraftig enn somatostatin når det anvendes for inhibere sekresjonen av veksthormon av hypofyseceller anbragt i kultur eller å inhibere arginin-indusert sekresjon av insulin og glukagon av bukspytt-kj ertelen.

Aktive estere kan anvendes i fastfase-syntese og den klassiske metode for syntese kan også anvendes for fremstilling av peptidene i henhold til oppfinnelsen..

En invitro prøve på effektiviteten av somatostatinpeptider for å inhibere sekresjonen av veksthormon er utviklet. Forsøket gjennomføres ved å behandle hypofysekjertler fjernet fra rotter for å separere celler derfra. Cellene anbringes i dyrkingsskåler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco et al. Virology,

Vol 8, side 396, 1949). Karbondioksydgass og oksygen tilføres cellekulturene som holdes ved 37°C i 4 - 5 døgn før de anvendes

.ved forsøket..Følgende mediaendringer, cellekulturer inkubert i

en periode på 4 timer og spesielt somatostatin-p.eptider tilsettes dertil.

Radio-immunoforsøksanalyse anvendes for å bestemme hastigheten for veksthormon-sekresjon som uttrykkes i nanogram pr. time.

Peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen inhiberer basal og stimulert insulin og glukagon-sekresjon i pattedyr, inklusive mennesker, hunder og aper. Peptidene inhiberer også insulin og glukagon-sekres j on fra knust rotte-bukspy t-tk j er til, isolerte cellegrupper og primære kulturer av enzymatisk dispergerte bukspytt-kjertelceller in vitro. Det antas at peptidene har en direkte virkning på a - og (3-bukspyttkjertelcellene for inhibering av sekresjon av insulin og glukagon.

En undersøkelse av virkningen av somatostatin, dihydrosomatostatin (som kontroller) og av peptidene fremstilt i henhold til den

foreliggende oppfinnelse for inhibering av sekresjon av glukagon

og insultin ble gjort på følgende måte:

Hannrotter Sprague-Dawley som veide 180 -220 g, som oppholdt seg under temperatur- og fuktighets-styrte forhold ved 14 timers lyd og 10 timers mørke (lys 0700 -2100) ble anvendt i alle eksprimenter. Dyrene ble tilført mat og vann ad lib. Ekprimenter ble gjennomført minst .5 døgn etter omkomst av rotter fra leverandøren mellom timene 14°° og 16o°. Etter eterbedøvelse ble peptider eller såltlaket tilført et volum på 0,2 ml via den ytre halsvene etter-fulgt øyeblikkelig av en 1 ml argininpille. Fem minutter senere ble kroppsblod samlet ved hurtig fjernelse av hodet. Plasmainsulin og glukagon-bestemmelser ble gjort ved spesifikke radio-iminoforsøk. Effektivitetsverdier i forhold til somatostatin (100%) ble

bestemt ved 4 og 6-punkt bioforsøk.

Arginen,tilført ved en dose på 100 mg/100 g kroppsvekt økte betraktelig både insulin- og glukagon-sekresjon. Somatostatin og dihydrosomatostatin inhiberer arginin-indusert^insulin- og glukagon-sekresjon på en dose av avhengig like kraftig måte

(begge gitt ved 100 mg/100 g kroppsvekt.)

De forsk jellige peptider fremstilt i samsvar med oppf innelsen .ble fremstilt ved hjelp av fastfase-metoden beskrevet ovenfor. Sammensetningen av peptidene er gjengitt i den følgende tabell I. Effektiviteten av av somatostatin '('kontroll) og av peptider fremstilt i henhold til oppfinnelsen for å inhibere sekresjon av veksthormon ble bestemt ved hjelp av den ovenfor beskrevne in vitro test. Hver av peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen beskrevet i tabell I var 8 til 10 ganger mer effektive enn somatostatinkontrollen for inhibering av sekresjonen av veksthormon. De relative effektivitetsverdier for peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen beskrevet i"" tabell I for å inhibere arginin-indusert sekresjon av glukagon og insulin ble også bestemt. Hvert av peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen var 8 til 10 ganger mer effektive enn somatostatin for å inhibere arginin-indusert sekresjon av glukagon og insulin.

Forskjellige andre peptider fremstilt i samsvar med oppfinnelsen

ble fremstilt med striikturer identiske til dem angitt i tabell I

med unntagelse av at Tyr ble substituert for Phe ved enten den ene eller begge 7- og 11-stillingene. Disse Tyr-substituerte peptider har også effektivitet overfor veksthormon, glukagon og insulin-inhibering' som er minst 8 ganger så stor som for somatostatin.

Lineære motstykker av peptidene i fremstilt i henhold til oppfinnelsen angitt i tabell I ble også syntetisert. Disse lineære peptider hadde også effektivitet overfor veksthormon, glukagon og insulin-inhibering minst 8 ganger så stor som for somatostatin.

Relative effektivitetsverdier (somatostatin = 100%) for en

rekke peptider fremstilt i henhold til oppfinnelsen for inhibering av veksthormonsekresjon og inhibering av argininindusert insulin-

og glukagon-sekresjon er vist i tabell II.

TABELL II

Relative effektivitetsverdier for somatostaton (SRIF) og substituert somatostatin for inhibering av veksthormon (GH) sekresjon fra for-hypofyseceller in vitro og inhibering av insulin og glukagon-sekresjon indusert av arginin in viv'b«For in vivo-bestemmelsene ble peptidene tilført ved injeksjon i hals-venen umiddelbart før arginin-injeksjon (100 mg/100g kroppsvek).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et' farmsøytisk aktivt peptid, karakterisert ved å fremstille en ester av N ccbeskyttet Cys aminosyre og en klormetylert harpiks, deprodeksjon-ering av den nevnte Cys aminosyre og trinnvis kobling av Noc og sidekjede-beskyttede aminosyrer til den nevnte Cys aminosyre for å danne et harpiks-koblet peptid med strukturen R^-Cys-Lys-R^-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-resin hvori R^ er en acylgruppe avledet fra gruppen beståénde av aminosyrer, dipeptider, tripeptider, pentapeptider, alifatiske,aromatiske og sykliske organiske syrer med fra 1 til 10 karbonatomer, hydrogen og des R^ og R^ er valgt fra Ala,Asn og des R^ »

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R^ er en aminosyre.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved • at R^ er ah dipeptid.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1^ karakterisert ved at et tripeptid.

5. Fremgangsmåte som angitt i fcirav 1, karakterisert ved at R^ er et pentapeptid.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,' karakterisert " "ved" at R^ er en "aromatisk syre med fra 1 til 10 kkarbonatomer.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R^ er en syklisk organisk syre' med fra 1 til 10 karbonatomer.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R. er valgt fra gruppen bestående av Gly, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, des Ala-Gly-des amino Cys, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Gly-Gly-Gly-Ala-Gly, Gly-Gly-Gly-Ala-Ala, Gly-Gly-Gly-Ala-D-Ala, Gly-Gly-Gly-Ala-Gly, Acetyl, Akryl, Pivalyl og Benzoyl.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, k a r a k t e ri s e r ;t . v- é d at R2 er Ala.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R2 er Asn.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Gly.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav-8, karakterisert ved at R^ er Ala.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er D-Ala.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Ala-Gly.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Acetyl-Ala-Gly.

16. "--" Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Tyr-Gl^ y.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Sarc-Gly.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 8 , karakterisert ved at R^ er Tyr-Ala-Gly.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at er Ala-Tyr-Gly.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Acetyl.

21. Eremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Akryl.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Pivalyl.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at R^ er Benzoyl.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at eventuell Ala forbundet 3 til Cys er D-xsomere.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R^ er Ala.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R^ er D-Ala.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert3 ved at R, er Ala-Gly, R er Asn og Ala- er substituert for Cys .

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R.er Ala-Gly, R_ er Asn, og Ala er substituert for Lys .

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 1. karakterisert ved at R^ er Ala-Gly, R2 er Asn og Ala er substituert for Phe^.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R, er Ala-Gly, R~ er Asn og Ala er substituert for Phe .

7

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R, er Ala-Gly, R„ er Asn og Ala er substituert for Lys 9 . id

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R. er Ala-Gly, R? er Asn og 10 Ala er substituert for Thr

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R, er Ala-Gly, Rp er Asn og 11 Ala er substituert for Phe

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R, er Ala-Gly, R~ er Asn og Ala er substituert for Thr Ala er substituert for 12

35. Fremgangsmåte som ..angitt i krav 1, karakterisert 13ved at R, er Ala-Gly, R„ er Asn og Ala er substituert for Ser

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert 14ved at R. er Ala-Gly, R_ er Asn og Ala er substituert for Cys

37. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at R. er Ala-Gly, R~ er Asn og 3 14 Ala er substituert for Cys og Cys

38. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at Ala er substituert for D-Trp.