NO344859B1 - Farmasøytisk sammensetning omfattende et interleukin-13 antistoff, fremgangsmåte for rensing av et interleukin-13 antistoff og anvendelse av den farmasøytiske antistoffsammensetningen - Google Patents

Description

Oppfinnelsen er relatert til en farmasøytisk sammensetning omfattende et interleukin-13 antistoff, mer spesielt et monoklonalt interleukin-13 antistoff, spesielt et humant interleukin-13 monoklonalt antistoff, til en fremgangsmåte for å rense nevnte antistoff og til nevnte sammensetning for anvendelse i behandling av interleukin-13 relaterte lidelser, slik som atopisk dermatitt.

Interleukin (IL)-13 er et 114 aminosyre cytokin med en umodifisert molekylær masse på omtrentlig 12 kDa. IL-13 er nærmest relatert til IL-4 hvormed det deler 30% sekvenshomologi ved aminosyrenivået. Det humane IL-13 genet er lokalisert på kromosom 5q31 nærliggende IL-4 genet [McKenzie, A. N. et al., J Immunol, 1993. 150(12), 5436-5444; Minty, A. et al., Nature, 1993.362(6417), 248-50].

Selv om initielt definert som et Th2 CD4+ lymfocyttderivert cytokin, er også IL-13 produsert ved Th1 CD4+ T-celler, CD8+ T lymfocytter, NK-celler og ikke-T-celle populasjoner slik som mastceller, basofiler, eosinofiler, makrofager, monocytter og luftveis glattmuskelceller.

IL-13 har blitt forbundet med et antall av sykdommer, spesielt sykdommer som er forårsaket ved en inflammatorisk respons. For eksempel ble administrasjon av rekombinant IL-13 til luftveiene av naive ikke-sensibiliserte gnagere vist å forårsake mange aspekter av astma fenotypen, inkluderende luftveisinflammasjon, slimproduksjon og luftveis hyper-mottakelighet (AHR) [Wills-Karp, M. et al., Science, 1998.282(5397), 2258-2261; Grunig, G. et al., Science, 1998.282(5397), 2261-2263; Venkayya, R., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2002.26(2), 202-208; Morse, B. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002.282(1), L44-49]. En lignende fenotype ble observert i en transgen mus hvori IL-13 spesifikt var overuttrykt i lungen. I denne modellen resulterte mer kronisk eksponering for IL-13 også i fibrose [Zhu, Z. et al., J Clin Invest, 1999.103(6), 779-788].

Et antall av genetiske polymorfismer i IL-13 genet har også blitt forbundet til allergiske sykdommer. Spesielt har en variant av IL-13 genet hvor argininresiduen ved aminosyre 130 er substituert med glutamin (Q130R) blitt assosiert med bronkial astma, atopisk dermatitt og forhøyede serum IgE-nivåer [Heinzmann, A. et al., Hum Mol Genet, 2000.

9(4), 549-559; Howard, T. D. et al., Am J Hum Genet, 2002.70(1), 230-236; Kauppi, P. et al., Genomics, 2001.77(1-2), 35-42; Graves, P. E. et al., J Allergy Clin Immunol, 2000.105(3), 506-513]. Denne bestemte IL-13 varianten er også referert til som Q110R varianten (argininresiduet ved aminosyre 110 er substituert med glutamin) ved noen grupper som ekskluderte 20 aminosyresignalsekvensen fra aminosyretellingen.

IL-13 produksjon har også blitt assosiert med allergisk astma [van der Pouw Kraan, T. C. et al., Genes Immun, 1999.1(1), 61-65] og forhøyede nivåer av IL-13 har blitt målt i humane individer med atopisk rhinitt (høysnue), allergisk dermatitt (eksem) og kronisk sinusitt.

I tillegg til astma, har IL-13 blitt assosiert med andre fibrotiske tilstander. Økte nivåer av IL-13, opp til 1000 ganger høyere enn IL-4, har blitt målt i serumet av pasienter med systemisk sklerose og i bronkoalveolær utskilling (BAL) prøver fra pasienter rammet av andre former av pulmonal fibrose [Hasegawa, M. et al., J Rheumatol, 1997.24(2), 328-332; Hancock, A. et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 1998.18(1), 60-65].

Det har blitt demonstrert at overekspresjon av IL-13 i muselungen forårsaket emfysem, forhøyet slimproduksjon og inflammasjon, som reflekterer aspekter av human kronisk obstruktiv pulmonal sykdom (COPD) [Zheng, T. et al., J Clin Invest, 2000.106(9), 1081-1093].

Det har blitt foreslått at IL-13 også kan spille en rolle i patogenesen av inflammatorisk tarmsykdom [Heller, F. et al., Immunity, 2002.17(5), 629-38] og forhøyede nivåer av IL-13 har blitt detektert i serumet fra noen Hodgkin's sykdom pasienter når sammenlignet med normale kontroller [Fiumara, P. et al., Blood, 2001.98(9), 2877-2878].

IL-13 inhibitorer er også trodd til å være terapeutisk nyttige i forebyggingen av tumortilbakekomst eller metastase [Terabe, M. et al., Nat Immunol, 2000.1(6), 515-520]. Inhibering av IL-13 har også blitt vist til å forsterke anti-virale vaksiner i dyremodeller og kan være fordelaktig i behandlingen av HIV og andre infeksiøse sykdommer [Ahlers, J. D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2002.99(20), 13020-13025].

En antistoff-rettet fremgangsmåte til IL-13 inhibering har blitt beskrevet. For eksempel beskriver WO 2005/007699 (Cambridge Antibody Technology Limited) en serie av humane anti-IL-13 antistoffmolekyler som er vist til å nøytralisere IL-13 aktivitet og som er hevdet å være av potensiell anvendelse i behandlingen av IL-13 relaterte lidelser.

US 2005/158316 A1 er rettet mot en stabil vandig farmasøytisk formulering omfattende et antistoff. Det beskrives en fremgangsmåte for å behandle hemoragisk sjokk med en stabil vandig farmasøytisk formulering som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff som ikke er utsatt for tidligere lyofilisering, en buffer som opprettholder pH i området fra ca.4,8 til ca.5,5, et overflateaktivt middel og en polyol.

WO 2004/001007 A2 angir en konsentrert antistoffsammensetning som i det vesentlige består av en vandig løsning av antistoffer og histidin- eller acetatbuffer i en konsentrasjon i området fra ca.2 mM til omtrent 48 mM. Den buffrede antistoffsammensetningen kan konsentreres effektivt ved en membranfiltreringsprosess. De konsentrerte antistoffsammensetninger kan anvendes til å fremstille farmasøytiske antistofformuleringer nyttige for humanterapi.

WO 2005/081873 A2 angår minst et nytt MUT-IL-13-protein, antistoffer, inkludert isolerte nukleinsyrer som koder for minst ett MUT-IL-13-protein eller antistoff, MUT-IL-13-vektorer, vertsceller, transgene dyr eller planter og fremgangsmåter for fremstilling og bruk av disse, inkludert terapeutiske sammensetninger, metoder og anordninger.

Bottomley Sp. et al., ”Elution of human IgG from affinity columns containing immobilised variants of protein A”, J Immunol Methods.1995, Vol.182, Nr.2, side 185-192, gjør kjent en fremgangsmåte for å rense antistoff ved hjelp av affinitetskromatografi. Bufferen som brukes for eluering av antistoffet er acetatbuffer med en pH på mellom 3,2- 5,0.

I henhold til et første aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning omfattende et IL-13 antistoff, 50 mM natriumacetatbuffer, 85 mM natriumklorid og 0,01 % (vekt/vekt) Polysorbat 80 bufret til en pH på 5,2-5,7 med natriumacetatbuffer, hvori IL-13 antistoffet omfatter et sett av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, hvori

HCDRl har aminosyresekvensen NYGLS;

HCDR2 har aminosyresekvensen WISANNGDTNYGQEFQG;

HCDR3 har aminosyresekvensen DSSSSWARWFFDL;

LCDRl har aminosyresekvensen GGNIIGSKLVH;

LCDR2 har aminosyresekvensen DDGDRPS; og

LCDR3 har aminosyresekvensen QVWDTGSDPVV.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for rensing av et IL-13 antistoff, som omfatter ett eller flere kromatografiske separasjonstrinn hvor hvert av de nevnte separasjonstrinn omfatter eluering med en elueringsbuffer omfattende en eller flere farmasøytisk akseptable tilsetninger bufret til en pH på 3,5-7,0 med acetatbuffer, hvori de kromatografiske separasjonstrinnene er valgt fra affinitetskromatografi og ionebytterkromatografi, hvori acetatbuffer er natriumacetatbuffer til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 1 og 100 mM, hvori IL-13 antistoffet omfatter et sett av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, hvori HCDRl har aminosyresekvensen NYGLS;

HCDR2 har aminosyresekvensen WISANNGDTNYGQEFQG;

HCDR3 har aminosyresekvensen DSSSSWARWFFDL;

LCDRl har aminosyresekvensen GGNIIGSKLVH;

LCDR2 har aminosyresekvensen DDGDRPS; og

LCDR3 har aminosyresekvensen QVWDTGSDPVV.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt anvendelse av en farmasøytisk antistoffsammensetning som definert over i fremstillingen av et medikament for behandlingen av en IL-13 relatert lidelse, hvor den IL-13 relaterte lidelsen er valgt fra astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk antistoffsammensetning som definert over, for anvendelse i behandlingen av en IL-13 relatert lidelse, hvori den IL-13 relaterte lidelsen er valgt fra gruppen bestående av astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom.

Det er alminnelig kjent at prosedyrer for antistoffrensing vanligvis krever et antall av separasjonsteknikker, slik som kromatografiseparasjoner (f. eks. Protein A kromatografi, ionebytterkromatografi). En konsekvens av denne måten av separasjon krever anvendelsen av et antall av forskjellige buffere. For eksempel krever antistoffrenseprosedyren beskrevet i WO 2004/076485 anvendelsen av 50 mM glycin/glycinat pH 8,0 for Protein A kromatografi, 50 mM TrisHCl pH 8,0 og 20 mM natriumfosfat pH 6,5 for Q-Sepharose kromatografi, og 25 mM TrisHCl pH 8,6 for DEAE-sepharose kromatografi.

I motsetning krever den foreliggende oppfinnelsen anvendelsen av en enkel acetatbuffer ved en satt konsentrasjon og på forhånd bestemt pH til stede i sammensetningen av oppfinnelsen som har fordelen av å være til stede gjennom alle IL-13 antistoff rensetrinn. Anvendelsen av denne bufferen, ikke bare ved starten av renseprosessen, men gjennom hele renseprosessen, resulterer derfor i en reduksjon av prosesseringstid, kostnad og en økning i produktutbytte.

Det vil bli forstått at referanser til ”antistoff” inkluderer referanser til et immunglobulin, enten naturlig eller delvis eller fullstendig syntetisk produsert. Betegnelsen dekker også ethvert polypeptid eller protein omfattende et antigenbindende domene.

Antistoff-fragmenter som omfatter et antigenbindende domene er molekyler slik som Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; og diabodier.

Det er mulig å ta monoklonale eller andre antistoffer og benytte teknikker av rekombinant DNA-teknologi for å produsere andre antistoffer eller chimere molekyler som beholder spesifisiteten av det opprinnelige antistoffet. Slike teknikker kan involvere å introdusere DNA kodende for den immunoglobulinvariable regionen, eller de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR’ene), av et antistoff til de konstante regionene, eller konstante regioner pluss rammeverksregioner, fra et forskjellig immunoglobulin. Se for eksempel EP-A-184187, GB2188638A eller EP-A-239400, og et stort omfang av påfølgende litteratur.

Alternativt kan nye VH eller VL regioner som bærer CDR-deriverte sekvenser bli generert ved å benytte tilfeldig mutagenese av ett eller flere valgte VH og/eller VL gener for å generere mutasjoner i hele det variable domenet. En slik teknikk er beskrevet av Gram et al., PNAS USA, 1992.89, 3576-3580, som benytter feiltilbøyelig PCR. En annen fremgangsmåte som kan bli benyttet er å direkte mutagenisere CDR regioner av VH og VL gener. Slike teknikker er angitt ved Barbas et al., PNAS USA 1994.91, 3809-3813 og Schier et al., J. Mol. Biol.1996.263, 551-567.

Ettersom antistoffer kan bli modifisert på et antall av måter, burde betegnelsen “antistoff” bli oppfattet til å dekke ethvert spesifikt bindende medlem eller substans som har et antistoffbindende domene med den nødvendige spesifisiteten. Denne betegnelsen dekker derfor antistoff-fragmenter og derivater, inkluderende ethvert polypeptid omfattende et immunoglobulinbindende domene, enten naturlig eller fullstendig eller delvis syntetisk. Chimere molekyler omfattende et immunoglobulinbindende domene, eller ekvivalent, fusjonert til et annet polypeptid er derfor inkludert. Kloning og ekspresjon av chimere antistoffer er beskrevet i EP-A-0120694 og EP-A-0125023, og et stort omfang av påfølgende litteratur.

Ytterligere teknikker tilgjengelig i fagfeltet av antistoff manipulering har gjort det mulig å isolere humane og humaniserte antistoffer. For eksempel kan humane hybridomer bli laget som beskrevet ved Kontermann et al., [2001; Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals]. Fagfremvisning, en annen etablert teknikk for å generere spesifikke bindende medlemmer, har blitt beskrevet i detalj i mange publikasjoner slik som Kontermann et al. (supra) og W092/01047. Transgene mus hvor museantistoffgenene er inaktivert og funksjonelt erstattet med humane antistoffgener, mens de etterlater intakte andre komponenter av museimmunsystemet, kan bli benyttet for å isolere humane antistoffer til humane antigener. Ribosomfremvisning, en cellefri translasjonsteknologi som introduserer mutasjoner i kjente gensekvenser, kan også bli benyttet for å generere og/eller optimalisere spesifikke bindende medlemmer [Hanes og Plückthun PNAS USA, 1994.94, 4937-4942; He og Taussig Nucleic Acids Res.1997.

25, 5132-5134; Schaffitzel et al., J. Immunol. Methods, 1999.231, 119-135; He et al., J. Immunol. Methods, 1999.231, 105-117; He et al., Methods Mol. Biol.2004.248, 177-189].

Syntetiske antistoffmolekyler kan bli laget ved ekspresjon fra gener generert ved hjelp av oligonukleotider syntetisert og samlet i egnede ekspresjonsvektorer, for eksempel som beskrevet ved Knappik et al., J. Mol. Biol.2000.296, 57-86 or Krebs et al., Journal of Immunological Methods 2001.254, 67-84.

Det har blitt vist at fragmenter av et helt antistoff kan utføre funksjonen av å binde antigener. Eksempler på bindende fragmenter er (i) Fab-fragmentet bestående av VL, VH, CL og CH1 domener; (ii) Fd-fragmentet bestående av VH og CH1 domenene; (iii) Fv-fragmentet bestående av VL og VH domenene av et enkelt antistoff; (iv) dAbfragmentet [Ward, E. S. et al., Nature, 1989.341, 544-546; McCafferty et al., Nature, 1990.348, 552-554; Holt et al., Trends Biotechnol.2003.21(11), 484-490] som består av et VH eller et VL domene; (v) isolerte CDR regioner; (vi) F(ab') 2 fragmenter, et bivalent fragment omfattende to forbundede Fab-fragmenter (vii) enkelkjede Fvmolekyler (scFv), hvor et VH domene og et VL domene er forbundet ved en peptidlinker som tillater de to domenene å assosiere for å danne et antigenbindende sete [Bird et al., Science, 1988.242, 423-426; Huston et al., PNAS USA, 1988.85, 5879-5883]; (viii) bispesifikke enkelkjede Fv-dimerer (PCT/US92/09965) og (ix) "diabodier", multivalente eller multispesifikke fragmenter konstruert ved genfusjon [W094/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993.90, 6444-6448]. Fv, scFv eller diabody molekyler kan bli stabilisert ved inkorporeringen av disulfidbruer som forbinder VH og VL domenene [Y. Reiter et al., Nature Biotech., 1996.14, 1239-1245]. Minibodier omfattende et scFv sammenføyd til et CH3 domene kan også bli laget [S. Hu et al., Cancer Res., 1996.56, 3055-3061].

Hvor bispesifikke antistoffer skal bli benyttet, kan disse være konvensjonelle bispesifikke antistoffer, som kan bli fremstilt på et utvalg av måter [Holliger og Winter Current Opinion Biotechnol.1993.4, 446-449], f. eks. fremstilt kjemisk eller fra hybride hybridomer, eller kan være ethvert av de bispesifikke antistoff-fragmenter nevnt ovenfor. Eksempler på bispesifikke antistoffer inkluderer dem av BiTE-teknologien, hvor bindingsdomenene av to antistoffer med forskjellig spesifisitet kan bli benyttet og direkte forbundet via korte fleksible peptider. Dette kombinerer to antistoffer på en kort enkel polypeptidkjede. Diabodier og scFv kan bli konstruert uten en Fc-region ved å benytte bare variable domener, som potensielt reduserer effekten av anti-idiotypisk reaksjon.

Bispesifikke diabodier, i motsetning til bispesifikke hele antistoffer, kan også være spesielt nyttige fordi de enkelt kan bli konstruert og uttrykt i E. coli. Diabodier (og mange andre polypeptider slik som antistoff-fragmenter) av hensiktsmessige bindingsspesifisiteter kan enkelt bli selektert ved å benytte fagfremvisning (WO94/13804) fra bibliotek. Om en arm av diabodien for eksempel skal bli holdt konstant, med en spesifisitet direkte rettet mot IL-13, så kan et bibliotek bli laget hvor den andre armen er variert og et antistoff av hensiktsmessig spesifisitet selektert.

Bispesifikke hele antistoffer kan bli laget ved ”knobs-into-holes” manipulering [Ridgeway et al., Protein Eng., 1996.9, 616-621].

Det vil bli forstått at referanser til ”et IL-13 antistoff” inkluderer referanser til et helt antistoff eller antistoff-fragment som er i stand til å nøytralisere naturlig forekommende IL-13 ved en konsentrasjon på mindre enn 500 nM ved å følge testene som presentert i eksemplene 2-10 og 25 i WO 2005/007699.

Fortrinnsvis nøytraliserer IL-13 antistoffet naturlig forekommende IL-13 med en potens som er lik eller bedre enn potensen av et IL-13 antigenbindende sete dannet ved BAK502G9 VH domene (SEQ ID NO: 15 i WO 2005/007699) og BAK502G9 VL domene (SEQ ID NO: 16 i WO 2005/007699).

Fortrinnsvis er IL-13 antistoffet et monoklonalt IL-13 antistoff, mer foretrukket et humant IL-13 monoklonalt antistoff.

Et spesielt foretrukket IL-13 antistoff er ett valgt fra dem beskrevet i WO 2003/035847, WO 2003/086451, WO 2005/007699 eller WO 2005/081873.

I en bestemt foretrukket utførelsesform er for eksempel IL-13 antistoffet BAK278D6 HCDR1-3 og LCDR1-3 (henholdsvis SEQ ID NOS: 1-6 i WO 2005/007699). Et sett av CDR’er med BAK278D6 settet av CDR’er, BAK278D6 settet av HCDR’er eller BAK278D6 LCDR’er, eller en eller to substitusjoner deri, er sagt til å være av BAK278D6 linjen.

I en ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform er IL-13 antistoffet BAK502G9 HCDR1-3 og LCDR1-3 (henholdsvis SEQ ID NOS: 7-12 i WO 2005/007699).

I en ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform er IL-13 antistoffet BAK1111D10 HCDR1-3 og LCDR1-3 (henholdsvis SEQ ID NOS: 91-96 i WO 2005/007699).

I en ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform er IL-13 antistoffet BAK1167F2 HCDR1-3 og LCDR1-3 (henholdsvis SEQ ID NOS: 61-66 i WO 2005/007699).

I en ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform er IL-13 antistoffet BAK1183H4 HCDR1-3 og LCDR1-3 (henholdsvis SEQ ID NOS: 97-102 i WO 2005/007699).

Det relevante settet av CDR’er er tilveiebrakt i antistoff rammeverksregioner eller andre proteinskaffolder, f. eks. fibronektin eller cytokrom B [Koide et al., J. Mol. Biol.1998.

284, 1141-1151; Nygren et al., Current Opinion in Structural Biology, 1997.7, 463-469]. Fortrinnsvis er antistoff rammeverksregioner benyttet, og hvor de er benyttet er de fortrinnsvis kimbane, mer foretrukket kan antistoff rammeverksregionen for den tunge kjeden være DP14 fra VH1-familien. Den foretrukne rammeverksregionen for den lette kjeden kan være λ3-3H. For BAK502G9 settet av CDR’er er det foretrukket at antistoff rammeverksregionene er for VH FR1-3, henholdsvis SEQ ID NOS: 27-29 i WO 2005/007699, og for lett kjede FR1-3, henholdsvis SEQ ID NOS: 30-32 i WO 2005/007699. I en foretrukket utførelsesform er et VH domene tilveiebrakt med aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 15 i WO 2005/007699, dette er betegnet “BAK502G9 VH domene”. I en ytterligere sterkt foretrukket utførelsesform er et VL domene tilveiebrakt med aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 16 i WO 2005/007699, dette er betegnet “BAK502G9 VL domene.

I en foretrukket utførelsesform kryssreagerer IL-13 antistoffet med cynomolog IL-13 og/eller IL-13 varianten, Q130R.

Fortrinnsvis er IL-13 antistoffet til stede i den farmasøytiske sammensetningen i en mengde på mellom 1 og 200 mg/ml, mer foretrukket 50 og 100 mg/ml, spesielt 50 mg/ml.

Den farmasøytiske sammensetningen er bufret til en pH på 5,2 til 5,7, mest foretrukket 5,5 ± 0,1, med natriumacetatbuffer. Valget av slik pH medfører signifikant stabilitet til den farmasøytiske sammensetningen. Eksempler på alternative buffere som kontrollerer pH i dette området inkluderer succinat, glukonat, histidin, citrat, fosfat, glutar, kakodylyt, natriumhydrogenmaleat, tris-(hydroksylmetyl)aminometan (Tris), 2-(N-morfolino)etansulfonsyre (MES), imidazol og andre buffere med organisk syre.

Natriumacetatbufferen er til stede i den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen i en mengde på 50 mM.

Det vil bli forstått at referanser til ”farmasøytisk akseptabel tilsetning” inkluderer referanser til enhver tilsetning konvensjonelt benyttet i farmasøytiske sammensetninger. Slike tilsetninger kan vanligvis inkludere ett eller flere overflateaktive stoffer, uorganisk eller organisk salt, stabilisator, fortynningsmiddel, løselighetsgjørende middel, reduksjonsmiddel, antioksidant, chelaterende middel, konserveringsmiddel.

Eksempler på et typisk overflateaktivt stoff inkluderer: Ikke-ioniske overflateaktive stoffer (HLB 6 til 18) slik som sorbitanfettsyreestere (f. eks. sorbitanmonokaprylat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonopalmitat), glycerinfettsyreestere (f. eks. glycerinmonokaprylat, glycerinmonomyristat, glycerinmonostearat), polyglycerinfettsyreestere (f. eks. dekaglycerylmonostearat, dekaglyceryldistearat, dekaglycerylmonolinoleat), polyoksyetylensorbitanfettsyreestere (f. eks. polyoksyetylensorbitanmonolaurat, polyoksyetylensorbitanmonooleat, polyoksyetylensorbitanmonostearat, polyoksyetylensorbitanmonopalmitat, polyoksyetylensorbitantrioleat, polyoksyetylensorbitantristearat), polyoksyetylensorbitolfettsyreestere (f. eks. polyoksyetylensorbitoltetrastearat, polyoksyetylensorbitoltetraoleat), polyoksyetylenglycerinfettsyreestere (f. eks. polyoksyetylenglycerylmonostearat), polyetylenglykolfettsyreestere (f. eks. polyetylenglykoldistearat), polyoksyetylenalkyletere (f. eks. polyoksyetylenlauryleter), polyoksyetylenpolyoksypropylenalkyletere (f. eks. polyoksyetylenpolyoksypropylenglykoleter, polyoksyetylenpolyoksypropylenpropyleter, polyoksyetylenpolyoksypropylencetyleter), polyoksyetylenalkylfenyletere (f. eks. polyoksyetylennonylfenyleter), polyoksyetylenhydrogenerte lakseroljer (f. eks. polyoksyetylenlakserolje, polyoksyetylenhydrogenert lakserolje), polyoksyetylen bivoksderivater (f. eks. polyoksyetylensorbitol bivoks), polyoksyetylenlanolinderivater (f. eks. polyoksyetylenlanolin) og polyoksyetylenfettsyreamider (f. eks. polyoksyetylenstearylamid);

anioniske overflateaktive stoffer slik som C10-C18 alkylsulfatsalter (f. eks. natriumcetylsulfat, natriumlaurylsulfat, natriumoleylsulfat), polyoksyetylen C10-C18 alkyletersulfatsalter med et gjennomsnitt på 2 til 4 mol av etylenoksid (f. eks. natriumpolyoksyetylenlaurylsulfat) og C8-C18 alkylsulfosuccinatestersalter (f. eks. natriumlaurylsulfosuccinatester); og naturlige overflateaktive stoffer slik som lecitin, glycerofosfolipid, sfingofosfolipider (f. eks. sfingomyelin) og sukroseestere av C12-C18 fettsyrer.

Det beskrives overflateaktivt stoff valgt fra polyoksyetylensorbitanfettsyreestere. Det beskrives overflateaktivt stoff som er Polysorbate 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 og 85, mest foretrukket Polysorbate 20 og 80, spesielt Polysorbate 80.

Det beskrives at det overflateaktive stoffet kan være til stede i den farmasøytiske sammensetningen i en mengde på mellom 0,001 og 0,1 vekt-%, mer foretrukket 0,005 og 0,05 vekt-%, spesielt 0,01 vekt-%.

Eksempler på et typisk uorganisk salt inkluderer: natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumfosfat, natriumsulfat, ammoniumsulfat, kaliumfosfat og natriumbikarbonat eller ethvert annet natrium-, kalium- eller kalsiumsalt. Fortrinnsvis er det uorganiske saltet natriumklorid.

Det er beskrevet at det uorganiske saltet kan være til stede i den farmasøytiske sammensetningen i en mengde på mellom 10 og 200 mM, mer foretrukket 60 og 130 mM, spesielt 85 mM.

Eksempler på et reduksjonsmiddel inkluderer N-acetylcystein, N-acetylhomocystein, tioktinsyre, tiodiglykol, tioetanolamin, tioglycerol, tiosorbitol, tioglykolsyre og et salt derav, natriumtiosulfat, glutation og en C1-C7 tioalkansyre.

Eksempler på en antioksidant inkluderer erythorbinsyre, dibutylhydroksytoluen, butylhydroksyanisol, alfa-tokoferol, tokoferolacetat, L-askorbinsyre og et salt derav, L-askorbinsyrepalmitat, L-askorbinsyrestearat, natriumbisulfitt, natriumsulfitt, triamylgallat og propylgallat.

Eksempler på et chelaterende middel inkluderer dinatriumetylendiamintetraacetat (EDTA), natriumpyrofosfat og natriummetafosfat.

Eksempler på en stabilisator inkluderer kreatinin, en aminosyre valgt fra histidin, alanin, glutaminsyre, glycin, leucin, fenylalanin, metionin, isoleucin, prolin, asparginsyre, arginin, lysin og treonin, et karbohydrat valgt fra sukrose, trehalose, sorbitol, xylitol og mannose, overflateaktive stoffer valgt fra polyetylenglykol (PEG; f. eks. PEG3350 eller PEG4000) eller polyoksyetylensorbitanfettsyreestere (f. eks. Polysorbate 20 eller Polysorbate 80), eller enhver kombinasjon derav.

Det er beskrevet at stabilisatoren omfatter et enkelt karbohydrat som her tidligere definert (f. eks. trehalose).

Det er beskrevet at stabilisatoren omfatter en aminosyre i kombinasjon med et karbohydrat (f. eks. trehalose og alanin eller trehalose, alanin og glycin).

Det er beskrevet at stabilisatoren omfatter en aminosyre i kombinasjon med et karbohydrat og et overflateaktivt stoff (f. eks. trehalose, alanin og PEG3350 eller trehalose, prolin og PEG3350 eller trehalose, alanin og Polysorbate 80 eller trehalose, prolin og Polysorbate 80 eller trehalose, alanin, glycin og PEG3350 eller trehalose, alanin, glycin og Polysorbate 80).

Det er beskrevet at stabilisatoren omfatter en aminosyre i kombinasjon med et overflateaktivt stoff (f. eks. alanin og PEG3350 eller alanin, glycin og PEG3350).

Det er beskrevet at stabilisatoren omfatter et karbohydrat i kombinasjon med et overflateaktivt stoff (f. eks. trehalose og PEG3350 eller trehalose og Polysorbate 80).

Eksempler på et konserveringsmiddel inkluderer oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid (en blanding av alkylbenzyldimetylammoniumklorider hvor alkylgruppene er langkjede forbindelser), benzetoniumklorid, aromatiske alkoholer slik som fenol-, butyl- og benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl- eller propylparaben, katekol, resorcinol, cykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol.

Farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri kan omfatte et IL-13 antistoff, et overflateaktivt stoff og et uorganisk salt bufret til en pH på 5,5 ± 0,1 med acetatbuffer.

Farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri kan omfatte et IL-13 antistoff, natriumklorid og Polysorbate 80 bufret til en pH på 5,5 ± 0,1 med natriumacetatbuffer.

Farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri kan omfatte 50 mg/ml av et IL-13 antistoff, 85 mM natriumklorid og 0,01 vekt-% Polysorbate 80 bufret til en pH på 5,5 ± 0,1 med 50 mM natriumacetatbuffer.

I henhold til et andre aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å rense et IL-13 antistoff som omfatter ett eller flere kromatografiske separasjonstrinn hvor hvert av nevnte separasjonstrinn omfatter eluering med en elueringsbuffer omfattende en eller flere farmasøytisk akseptable tilsetninger bufret til en pH på 3,5-7,0 med acetatbuffer, hvori de kromatografiske separasjonstrinnene er valgt fra affinitetskromatografi og ionebytterkromatografi, hvori acetatbuffer er natriumacetatbuffer til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 1 og 100 mM, hvori IL-13 antistoffet omfatter et sett av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, hvori HCDRl har aminosyresekvensen NYGLS;

HCDR2 har aminosyresekvensen WISANNGDTNYGQEFQG;

HCDR3 har aminosyresekvensen DSSSSWARWFFDL;

LCDRl har aminosyresekvensen GGNIIGSKLVH;

LCDR2 har aminosyresekvensen DDGDRPS; og

LCDR3 har aminosyresekvensen QVWDTGSDPVV.

Det beskrives kromatografiske separasjonstrinn valgt fra affinitetskromatografi (f. eks. Protein A eller Protein G affinitetskromatografi), ionebytterkromatografi (f. eks. kationog anionbytterkromatografi), hydrofob interaksjonskromatografi (f. eks. fenylkromatografi), hydroksyapatittkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, immobilisert metallaffinitetskromatografi, hydrofil interaksjonskromatografi, tiofil adsorpsjonskromatografi, euglobulinadsorpsjonskromatografi, fargeligandkromatografi eller immobilisert boronatkromatografi. Mest foretrukket er kromatografisk separasjon utført ved Protein A affinitetskromatografi etterfulgt av kationbytterkromatografi (f.

eks. ved å benytte en SP-sepharose matrise) fulgt av anionbytterkromatografi (f. eks. ved å benytte en Q-sepharose matrise).

Fortrinnsvis omfatter den ene eller flere farmasøytisk akseptable tilsetninger et uorganisk salt slik som natriumklorid.

Fortrinnsvis er det uorganiske saltet til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 10 og 200 mM, mer foretrukket 60 og 130 mM, spesielt 85 mM.

Eksempler på alternative buffere som kontrollerer pH i området 3,5-7,0 inkluderer succinat, glukonat, histidin, citrat, fosfat og andre buffere av organisk syre.

Fortrinnsvis er natriumacetatbufferen til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 30 og 70 mM, spesielt 50 mM.

Mest foretrukket omfatter elueringsbufferen 50 mM natriumacetat og 85 mM natriumklorid bufret til pH 5,5 ± 0,1.

En nukleinsyre kodende for ethvert IL-13 antistoff av oppfinnelsen (f. eks. CDR eller sett av CDR’er eller VH domene eller VL domene eller antistoff antigenbindende sete eller antistoffmolekyl, f. eks. scFv eller IgG4 som tilveiebrakt) kan bli uttrykt ved å dyrke under hensiktsmessige forhold rekombinante vertsceller inneholdende nevnte nukleinsyre. Etter produksjon ved ekspresjon kan et VH eller VL domene, eller spesifikt bindende medlem, bli isolert og/eller renset ved å benytte enhver egnet teknikk, og så benyttet som hensiktsmessig.

Spesifikke bindingsmedlemmer, VH og/eller VL domener og kodende nukleinsyremolekyler og vektorer kan bli tilveiebrakt isolert og/eller renset, f. eks. fra deres naturlige omgivelse, i hovedsakelig ren eller homogen form, eller, i tilfelle av nukleinsyre, fri eller hovedsakelig fri for nukleinsyre eller genopprinnelse annen enn sekvensen kodende for et polypeptid med den nødvendige funksjonen. Nukleinsyre kan omfatte DNA eller RNA og kan være fullstendig eller delvis syntetisk.

Referanse til en nukleotidsekvens som presentert her omslutter et DNA-molekyl med den spesifiserte sekvensen, og omslutter et RNA-molekyl med den spesifiserte sekvensen hvor T er byttet ut med U, med mindre en sammenheng krever noe annet.

Systemer for kloning og ekspresjon av et polypeptid i et utvalg av forskjellige vertsceller er godt kjent. Egnede vertsceller inkluderer bakterier, mammalske celler, planteceller, gjær- og baculovirussystemer og transgene planter og dyr.

Mammalske cellelinjer tilgjengelige i fagfeltet for ekspresjon av et heterologt polypeptid inkluderer kinesisk hamster ovarie (CHO) -celler, HeLa-celler, babyhamster nyreceller, NS0 muse melanomceller, YB2/0 rotte myelomceller, humane embryonale nyreceller, humane embryonale retinaceller og mange andre.

Fortrinnsvis er nevnte mammalske cellelinje en myelomcellekultur slik som f. eks. NS0-celler [Galfre and Milstein Methods Enzymology, 1981.73, 3]. Myelomceller er plasmacytomceller, dvs. celler av lymfoid cellelinje. En eksemplarisk NS0 cellelinje er f. eks. cellelinje ECACC nr.85110503, fritt tilgjengelig fra European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP40JG, Storbritannia. NS0 har blitt funnet å være i stand til å gi opphav til ekstremt høye produktutbytter, spesielt om benyttet for produksjon av rekombinante antistoffer.

En alternativt foretrukket mammalsk cellelinje er kinesisk hamster ovarie (CHO) -celler. Disse kan mangle dihydrofolatreduktase (dhfr) og på denne måten avhenge av thymidin og hypoksantin for vekst [PNAS, 1990.77, 4216-4220]. Den parentale dhfr CHO cellelinjen er transfektert med antistoffgenet og dhfr-genet som muliggjør seleksjon av CHO celletransformanter av dhfr positiv fenotype. Seleksjon er utført ved dyrking av koloniene på medium fritt for thymidin og hypoksantin, hvor fravær av dette hindrer utransformerte celler fra å dyrke og transformerte celler fra berging av folatveien og derved forbigå seleksjonssystemet. Disse transformantene uttrykker vanligvis lave nivåer av produktgenet i kraft av ko-integrering av begge transfekterte gener. Ekspresjonsnivåene av antistoffgenet kan bli økt ved amplifisering ved å benytte metotrexat (MTX). Dette medikamentet er en direkte inhibitor av dhfr-enzymet og tillater isolering av resistente kolonier som amplifiserer deres dhfr-gen kopitall tilstrekkelig til å overleve under disse forholdene. Siden dhfr og antistoffgenene er nærmere forbundet i de opprinnelige transformantene, er det vanligvis medvirkende amplifisering og derfor økt ekspresjon av det ønskede antistoffgenet.

Et annet seleksjonssystem for anvendelse i CHO- eller myelomceller er glutaminsyntetase (GS) amplifiseringssystemet beskrevet i WO 87/04462. Dette systemet involverer transfeksjonen av en celle med et gen kodende for GS-enzymet og det ønskede antistoffgenet. Celler er så selektert som vokser i glutaminfritt medium.

Disse selekterte klonene er så utsatt for inhibering av GS-enzymet ved å benytte metioninsulfoksimin (MSX). For å overleve vil cellene amplifisere GS-genet med medvirkende amplifisering av genet kodende for antistoffet.

Ekspresjon av antistoffer og antistoff-fragmenter i prokaryote celler slik som E. coli er godt etablert i fagfeltet. For en gjennomgåelse, se for eksempel Pluckthun, A.

Bio/Technology 1991.9, 545-551. Ekspresjon i eukaryote celler i kultur er også tilgjengelig for fagpersoner som en mulighet for produksjon av et spesifikt bindingsmedlem, for eksempel [Chadd, H. E. og Chamow, S. M., Current Opinion in Biotechnology 2001.12, 188-194; Andersen, D. C. og Krummen, L. Current Opinion in Biotechnology 2002.13, 117; Larrick, J. W. og Thomas, D. W. Current opinion in Biotechnology 2001.12, 411-418].

Egnede vektorer kan bli valgt eller konstruert, inneholdende hensiktsmessige regulatoriske sekvenser, inkluderende promotersekvenser, terminatorsekvenser, polyadenyleringssekvenser, enhancersekvenser, markørgener og andre sekvenser som hensiktsmessig. Vektorer kan være plasmider, virale, f. eks. fag, eller fagmid, som hensiktsmessig. For ytterligere detaljer, se for eksempel Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook og Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mange kjente teknikker og protokoller for manipulering av nukleinsyre, for eksempel i fremstilling av nukleinsyrekonstruksjoner, mutagenese, sekvensering, introduksjon av DNA i celler og genekspresjon og analyse av proteiner, er beskrevet i detalj i Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 4th edition 1999.

Introduksjon av en nukleinsyre i en vertscelle kan benytte enhver tilgjengelig teknikk. For eukaryote celler kan egnede teknikker inkludere kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-Dextran, elektroporering, liposommediert transfeksjon og transduksjon ved å benytte retrovirus eller andre virus, f. eks. vaccinia, eller baculovirus for insektceller.

Introduksjon av nukleinsyre i vertscellen, spesielt en eukaryot celle, kan benytte et viralt eller et plasmidbasert system. Plasmidsystemet kan bli opprettholdt episomalt eller kan bli inkorporert i vertscellen eller i et kunstig kromosom [Csonka, E. et al., Journal of Cell Science, 200.113, 3207-3216; Vanderbyl, S. et al., Molecular Therapy, 2002.5 (5), 10]. Inkorporering kan enten være tilfeldig eller målrettet integrering av en eller flere kopier ved enkle eller multiple loci. For bakterielle celler kan egnede teknikker inkludere kalsiumkloridtransformasjon, elektroporering og infeksjon ved å benytte bacteriophage.

Introduksjonen kan bli fulgt ved å forårsake eller tillate ekspresjon fra nukleinsyren, f. eks. ved dyrking av vertsceller under forhold for ekspresjon av genet.

I en utførelsesform er nukleinsyren beskrevet heri integrert i genomet (f. eks. kromosomet) av vertscellen.

Integrasjon kan bli fremmet ved inkludering av sekvenser som fremmer rekombinasjon med genomet, i overensstemmelse med standard teknikker.

I henhold til et tredje aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en anvendelse av en farmasøytisk antistoffsammensetning som definert her i fremstillingen av et medikament for behandling av en IL-13 relatert lidelse,

der den IL-13 relaterte lidelsen valgt fra astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom. Mer foretrukket er den IL-13 relaterte lidelsen atopisk dermatitt.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en farmasøytisk antistoffsammensetning som definert her for anvendelse i behandlingen av en IL-13 relatert lidelse, hvori den IL-13 relaterte lidelsen er valgt fra gruppen bestående av astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom.

Den farmasøytiske sammensetningen av oppfinnelsen kan være en væskeformulering eller en lyofilisert formulering som er rekonstituert før anvendelse. Som tilsetninger for en lyofilisert formulering kan for eksempel sukkeralkoholer eller sakkarider (f. eks. mannitol eller glukose) bli benyttet. I tilfelle av en væskeformulering, er den farmasøytiske sammensetningen av oppfinnelsen vanligvis tilveiebrakt i formen av beholdere med definert volum, inkluderende forseglede og steriliserte plastikk- eller glassrør, ampuller og sprøyter, så vel som i formen av beholdere med større volum slik som flasker. Fortrinnsvis er sammensetningen av oppfinnelsen en væskeformulering.

Den farmasøytiske sammensetningen av oppfinnelsen kan bli administrert oralt, ved injeksjon (for eksempel subkutant, intravenøst, intraperitonealt eller intramuskulært), ved inhalering, eller topikalt (for eksempel intraokulart, intranasalt, rektalt, i sår, på hud). Ruten for administrasjon kan bli bestemt ved de fysisk-kjemiske egenskapene av behandlingen, ved spesielle betraktninger av sykdommen eller ved behovene til å optimalisere virkeevne eller til å minimalisere bieffekter.

Fortrinnsvis er sammensetningen av oppfinnelsen administrert ved subkutan injeksjon. Det er regnet med at behandling ikke vil være begrenset til anvendelse i klinikken. Derfor kan subkutan injeksjon ved å benytte en nålfri anordning også bli foretrukket.

I overensstemmelse med oppfinnelsen kan sammensetninger tilveiebrakt bli administrert til individer. Administrasjon er fortrinnsvis i en ”terapeutisk effektiv mengde”, hvor dette er tilstrekkelig til å vise nytte for en pasient. Slik nytte kan være minst forbedring av minst ett symptom. Den virelige mengden administrert, og hastighet og tidsforløp av administrasjon, vil avhenge av naturen og kraftigheten av hva som blir behandlet. Preskribering av behandling, f. eks. bestemmelser om dosering osv., er innenfor ansvarligheten av allmennleger og andre medisinske leger. Hensiktsmessige doser av antistoff er godt kjent i fagfeltet; [Ledermann, J. A. et al., Int. J. Cancer, 1999.

47, 659-664; Bagshawe, K. D. et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1991.4, 915-922].

Den presise dosen vil avhenge av et antall av faktorer, inkluderende størrelsen og lokaliseringen av området som skal bli behandlet, den presise naturen av antistoffet (f. eks. helt antistoff, fragment eller diabody) og naturen av ethvert detekterbart merke eller annet molekyl festet til antistoffet. En typisk antistoffdose vil være i området 100 pg til 10 g for systemiske anvendelser, og 1 µg til 100 mg for topikale anvendelser.

Vanligvis vil antistoffet være et helt antistoff, fortrinnsvis IgG4 isotypen. En dose for en enkel behandling av en voksen pasient kan bli proporsjonalt justert for barn og spebarn, og også justert for andre antistoff-formater i forhold til molekylær vekt. Behandlinger kan bli repetert ved daglige, to ganger i uken, ukentlige eller månedlige intervaller, etter legens bedømmelse. I foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen er behandling periodisk, og perioden mellom administrasjoner er omkring to uker eller mer, fortrinnsvis omkring tre uker eller mer, mer foretrukket omkring fire uker eller mer, eller omkring en gang i måneden.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

FIGUR 1 viser resultatene av SDS-PAGE analyse av prøver ved dag 1 av en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen.

FIGUR 2 viser resultatene av SDS-PAGE analyse av prøver ved dag 21 av en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen.

FIGUR 3 viser resultatene av GP-HPLC analyse av prøver ved dag 1 av en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen.

FIGUR 4 viser en amalgam av resultater oppnådd fra GP-HPLC analyse av prøver under en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen ved 2-8ºC.

FIGUR 5 viser en amalgam av resultater oppnådd fra GP-HPLC analyse av prøver under en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen ved 25ºC.

FIGUR 6 viser en amalgam av resultater oppnådd fra GP-HPLC analyse av prøver under en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen når nøytralisert med forskjellige buffere.

FIGUR 7 viser resultatene av IEF analyse av prøver ved dag 28 av en 28 dagers stabilitetsbestemmelse av sammensetningen av oppfinnelsen.

FIGUR 8 viser resultatene av gelfiltrering HPLC analyse av en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer lagret ved -70ºC.

FIGUR 9 viser resultatene av gelfiltrering HPLC analyse av en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer lagret ved 5ºC.

FIGUR 10 viser resultatene av gelfiltrering HPLC analyse av en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer lagret ved 25ºC.

FIGUR 11 viser resultatene av gelfiltrering HPLC analyse av en 8 ukers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer lagret ved 37ºC.

FIGUR 12 viser resultatene av gelfiltrering HPLC analyse av en 5 dagers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer lagret ved 45ºC.

FIGUR 13 viser resultatene av redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved -70ºC.

FIGUR 14 viser prosentandelen overflod av BAK502G9 tunge og lette kjeder etter redusert SDS-PAGE analyse i FIG.13 når lagret ved -70ºC.

FIGUR 15 viser resultatene av redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 5ºC.

FIGUR 16 viser prosentandelen overflod av BAK502G9 tunge og lette kjeder etter redusert SDS-PAGE analyse i FIG.15 når lagret ved 5ºC.

FIGUR 17 viser resultatene av redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 25ºC.

FIGUR 18 viser prosentandelen overflod av BAK502G9 tunge og lette kjeder etter redusert SDS-PAGE analyse i FIG.17 når lagret ved 25ºC.

FIGUR 19 viser resultatene av redusert SDS-PAGE analyse ved 0 og 8 uker under en 8 ukers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 37ºC.

FIGUR 20 viser prosentandelen overflod av BAK502G9 tunge og lette kjeder etter redusert SDS-PAGE analyse i FIG.19 når lagret ved 37ºC.

FIGUR 21 viser resultatene av redusert SDS-PAGE analyse ved 0 og 5 dager under en 5 dagers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 45ºC.

FIGUR 22 viser prosentandelen overflod av BAK502G9 tunge og lette kjeder etter redusert SDS-PAGE analyse i FIG.21 når lagret ved 45ºC.

FIGUR 23 viser resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved -70ºC.

FIGUR 24 viser prosentandelen overflod av intakt BAK502G9 monomer etter ikkeredusert SDS-PAGE analyse i FIG.23 når lagret ved -70ºC.

FIGUR 25 viser resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 5ºC.

FIGUR 26 viser prosentandelen overflod av intakt BAK502G9 monomer etter ikkeredusert SDS-PAGE analyse i FIG.25 når lagret ved 5ºC.

FIGUR 27 viser resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse ved 0, 6 og 12 måneder under en 12 måneders stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 25ºC.

FIGUR 28 viser prosentandelen overflod av intakt BAK502G9 monomer etter ikkeredusert SDS-PAGE analyse i FIG.27 når lagret ved 25ºC.

FIGUR 29 viser resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse ved 0 og 8 uker under en 8 ukers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 37ºC.

FIGUR 30 viser prosentandelen overflod av intakt BAK502G9 monomer etter ikkeredusert SDS-PAGE analyse i FIG.29 når lagret ved 37ºC.

FIGUR 31 viser resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse ved 0 og 5 dager under en 5 dagers stabilitetsbestemmelse av forskjellige formuleringer når lagret ved 45ºC.

FIGUR 32 viser prosentandelen overflod av intakt BAK502G9 monomer etter ikkeredusert SDS-PAGE analyse i FIG.31 når lagret ved 45ºC.

Den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli illustrert, bare ved eksempel, med referanse til de følgende fremgangsmåtene og eksemplene.

Eksempel 1: Ekspresjon av BAK502G9

BAK502G9 ble uttrykt i en GS NS0 cellelinje på en analog måte til prosedyrene beskrevet i WO 87/04462 og WO 2004/076485 og ga dyrkningssupernatant inneholdende 598 mg/l BAK502G9 antistoff.

Eksempel 2: Rensing av BAK502G9

(a) rmp Protein A Sepharose rensing

Kolonnen benyttet for rmp Protein A Sepharose fast flow kromatografitrinnet var 2,6 cm diameter, pakket i 0,9% vekt/volum natriumklorid, til en bunnhøyde på 14,5 cm som gir et kolonnevolum på 77 ml. Resin var fra GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-5138. Kromatografi ble utført ved å benytte en Amersham Biosciences P-50 pumpe, UV1 detektor og strømningscelle. Kolonnen ble renset med 6M guanidinhydroklorid før anvendelse.

rmp Protein A Sepharose fast flow kolonnen ble deretter ekvilibrert med 350 ml fosfatbufret salt pH 7,2, etter vasking med vann og rensing.2,6 l dyrkningssupernatant ble lastet direkte på kolonnen ved 200 cm/Tid og romtemperatur.

Kolonnen ble så vasket med 567 ml fosfatbufret salt pH 7,2 etterfulgt ved 568 ml 50 mM natriumacetat pH 5,55. BAK502G9 antistoff ble eluert fra kolonnen ved vasking med 380 ml 50 mM natriumacetat pH 3,75. Etter eluering ble kolonnen vasket med 50 mM eddiksyre pH 3,0. Elueringstoppen ble samlet mellom 2% maksimal UV avbøyning på opp- og nedskråningen av toppen.1,5 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 217 ml.

(b) Lav pH viral inaktivering

rmp Protein A Sepharose fast flow eluatet ble justert til pH 3,70 med 173 ml 100 mM eddiksyre. Det justerte eluatet ble så holdt i 60 minutter for viral inaktivering. Etter denne tiden ble det justerte eluatet nøytralisert med 437 ml 50 mM natriumhydroksid til pH 5,50 og 0,22 µm filtrert ved å benytte en Millipore stericup (produkt nr.

SCGPU11RE).1,4 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 823 ml.

(c) SP Sepharose rensing

Kolonnen benyttet for SP Sepharose fast flow kromatografitrinnet var 1,6 cm diameter, pakket i fosfatbufret salt pH 7,2, til en bunnhøyde på 15,5 cm som gir et kolonnevolum på 31 ml. Resin var fra GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0729. Kromatografi ble utført ved å benytte en Amersham Biosciences P-50 pumpe, UV1 detektor og strømningscelle. Kolonnen ble renset med 0,5M natriumhydroksid før anvendelse.

SP Sepharose fast flow kolonnen ble deretter ekvilibrert med 145 ml 50 mM natriumacetat pH 5,50, etter vasking med vann og rensing.

400 ml BAK502G9 antistoff som nøytralisert rmp Protein A eluat ble lastet direkte på kolonnen ved 200 cm/Tid og romtemperatur.

Kolonnen ble så vasket med 302 ml 50 mM natriumacetat 30 mM natriumklorid pH 5,50.

BAK502G9 antistoff ble eluert fra kolonnen ved vasking med 150 ml 50 mM natriumacetat 85 mM natriumklorid pH 5,50. Etter eluering ble kolonnen vasket med 50 mM natriumacetat 2M natriumklorid pH 5,50.

Elueringstoppen ble samlet mellom 2% maksimal UV avbøyning på skråningen oppover og 30% på skråningen nedover av toppen. Eluat ble 0,22 µm filtrert ved å benytte en Millipore steriflip (produkt nr. SCGPOO525).0,67 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 54 ml.

Dette prosesstrinnet ble repetert med gjenværende 392 ml BAK502G9 antistoff som nøytralisert rmp Protein A eluat. Ytterligere 0,67 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 54 ml. De to filtrerte SP Sepharose eluatene ble forenet før det neste trinnet.

(d) Q Sepharose Fast Flow kromatografi

Kolonnen benyttet for Q Sepharose fast flow kromatografitrinnet var 1,6 cm diameter, pakket i fosfatbufret salt pH 7,2, til en bunnhøyde på 13,3 cm som gir et kolonnevolum på 27 ml. Resin var fra GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0510. Kromatografi ble utført ved å benytte en Amersham Biosciences P-50 pumpe, UV1 detektor og strømningscelle. Kolonnen ble renset med 0,5M natriumhydroksid før anvendelse.

Q Sepharose fast flow kolonnen ble deretter ekvilibrert med 138 ml 50 mM natriumacetat 85 mM natriumklorid pH 5,50, etter vasking og rensing med vann.

44 ml BAK502G9 antistoff som SP Sepharose eluat ble lastet direkte på kolonnen ved 200 cm/Tid og romtemperatur.

Isokratisk eluering av BAK502G9 antistoffet ble foretatt ved vasking av kolonnen med 124 ml 50 mM natriumacetat 85 mM natriumklorid pH 5,50. Etter eluering ble kolonnen vasket med 50 mM natriumacetat 2M natriumklorid pH 5,50.

Elueringstoppen ble samlet mellom 2% maksimal UV avbøyning på skråningen opp og 2% på skråningen ned av toppen. Eluat ble 0,22 µm filtrert ved å benytte en Millipore stericup (produkt nr. SCGPU01RE).0,52 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 88 ml. Dette prosesstrinnet ble repetert med gjenværende 44 ml BAK502G9 antistoff som SP Sepharose eluat. Ytterligere 0,54 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 51 ml. De to filtrerte Q Sepharose eluatene ble så forenet.

(e) Konsentrasjon

Produktet ble oppnådd i 50 mM natriumacetat 85 mM natriumklorid pH 5,50 og krevde ikke diafiltrering.

95,31 g BAK502G9 antistoff som Q Sepharose eluat i 17,5 l ble konsentrert til 1,5 l. Et Millipore Pellicon 2 TFF system og en 0,1 M<2>30KDa membran (Millipore P2B030A01) ble benyttet for å utføre konsentrasjonen. BAK502G9 antistoffet ble så utvunnet fra utstyret, utstyret ble så bufferspylt med 50 mM natriumacetat 85 mM natriumklorid pH 5,50. Det konsentrerte antistoffet ble så kombinert med bufferspylingen.1,67 ml 10% vekt/volum Polysorbate 80 ble tilsatt til den forenede prøven for å gi en endelig Polysorbate 80 konsentrasjon på 0,01% vekt/volum. Den forenede prøven ble så 0,22 µm filtrert.91,6 g BAK502G9 antistoff ble utvunnet i 1,67 l.

(f) Materialer benyttet

Kjemikaliene benyttet for å fremstille bufrene ovenfor var som følger:

Guanidinhydroklorid. Sigma Aldrich. G4505

Dinatriumhydrogenortofosfat. VWR.1038349

Natriumdihydrogenortofosfat. VWR.102454R

Natriumacetat 3-hydrat. VWR.102354X.

Natriumklorid. VWR.10241AP.

Eddiksyre. VWR.10001CU.

Polysorbate 80. J. T. Baker.7394.

Eksempel 3: 28 dagers stabilitetsanalyse

Metodologi

rmp Protein A kromatografi ble utført som presentert i Tabell 1 nedenfor:

Tabell 1: Protein A kromatografi parametere

1,6 CV av elueringsbuffer var nødvendig for å eluere toppen og for absorbansen å returnere til <2% full skala avbøyning (AuFS). Etter dette ble bufferen byttet til strippebuffer.

Lav pH virus inaktivering ble så utført ved å benytte Protein A eluatet som presentert i Tabell 2 nedenfor:

Tabell 2: Lav pH virus inaktivering

Alle prøver ble lagret i 200 ml Hyclone BioProcess beholdere som er laget av polyetylen med C-flex innløps- og utløpsrør festet.

I tillegg ble en 50 ml prøve av virus inaktivert Protein A eluat nøytralisert med den opprinnelige bufferen (50 mM natriumhydroksid) og lagret i en bioprosessbeholder ved 2 til 8ºC i 28 dager før analyse.

Alle prøver ble enten lagret i et klasse 100.000 kjølerom (2 til 8ºC, monitorert med punktskriver og alarm) eller i en termostatisk kontrollert inkubator satt til 25ºC, som hensiktsmessig.

Det var fem tidspunkter og to lagringstemperaturer (2 til 8ºC og 25ºC), dvs.10 separate prøvetakingspunkter.

Det filtrerte nøytraliserte Protein A eluatet ble splittet til 10 mengder; 5 mengder som ble lagret ved hver av temperaturene. En ytterligere beholder av ufiltrert, nøytralisert Protein A eluat ble lagret ved 2 til 8ºC.

For å fylle hver bioprosessbeholder, ble det nøytraliserte Protein A eluatet pumpet gjennom 0,2 µm Millipak filter inn i en 200 ml bioprosessbeholder. Hver bioprosessbeholder ble fylt med omtrentlig 100 ml for å etterligne forholdet av produkt til overflatekontakt forestilt seg for den endelige 2000 l skala produksjonen.

En bioprosessbeholder ble benyttet for prøvetaking for hver temperatur og hvert tidspunkt og forsiktighet ble tatt for ikke å etterlate materiale i slangene under lagring.

En bioprosessbeholder fra hver temperatur ble fjernet på dagene 1, 3, 15, 21 og 28. Innholdet av hver bioprosessbeholder ble tillatt å nå romtemperatur før prøvetaking.

Prøver ble tatt i Bijoux beholdere eller 50 ml Falcon rør. De første få millilitrene av prøven ble kastet ettersom de hadde noe kontakt med slangen under lagring.

Etter prøvetaking ble beholderne inneholdende det gjenværende materiale frosset ved -70ºC.

Den følgende analysen ble utført på dagen av hvert tidspunkt og for hver lagringstemperatur for å bestemme sammenlignbarhet av disse prøvene med hverandre og referansestandarden. Et friskt rør av BAK502G9 standard ble benyttet ved hvert tidspunkt for sammenligning til stabilitetsstudiematerialet. Referansen ble tint ved romtemperatur fra -70ºC lagring. Det er kjent at mulTidrnivåer kan være forhøyede kort tid etter tining av dette antistoffet, slik at GP-HPLC analysen ble utført sist.

(A) Turbiditetsanalyse

Turbiditet ble bestemt som et mål for proteindegradering over tid og tjener derfor som en nyttig stabilitetsbestemmelse for sammensetningen av oppfinnelsen.

Turbiditet ble målt ved å ta den gjennomsnittlige absorbansen av prøven mellom A340 og 360 nm (Eckhardt et al.1993). Denne testen ble utført uten ytterligere filtrering.

Data oppnådd fra rmp Protein A kromatografien er oppsummert i Tabell 3, og kromatogrammet er vist i Figur 1.

Tabell 3: rmp Protein A kromatografidata

*50 ml utvunnet fra virus-inaktivert eluat for justering med 50 mM natriumhydroksid. Endelig volum er etter prøvetaking.

rmp Protein A kromatografi utførte som forventet genererende volum av buffere sammenlignbare med det sett ved stor skala. Det nøytraliserte eluatet var synlig mer turbid enn det vanligvis sett med eluat nøytralisert med 50 mM natriumhydroksid. Under filtrering til bioprosessbeholdere, begynte presipitering å bli observert, dette forekom i løpet av en Tid av nøytralisering. Turbiditet ble ikke bestemt inntil etter dette tidspunktet. Gjenvinning var innenfor det forventede område etter filtrering.

Alle eluatprøver ble testet for turbiditet på dag 1. Filtrerte eluater lagret ved begge temperaturer ble testet for turbiditet på dagene: 1, 3, 15, 21 og 28. I tillegg ble eluater lagret ufiltrert (justert med enten 50 mM natriumhydroksid eller 100 mM natriumhydroksid) testet for turbiditet både før og etter filtrering ved dag 28.

Resultatene av turbiditetsanalysen er vist i Tabell 4, hvor det kan bli sett at selv om det var en bemerkelsesverdig økning i turbiditet på dag 28 prøven lagret ved 25ºC, var prøvene generelt stabile ved 25ºC i minst 21 dager.

Tabell 4: Turbiditetsmålinger av prosess og stabilitetsstudieprøver

(B) Proteinkonsentrasjonsanalyse

IgG konsentrasjon ble målt o ert ved å benytte absorbans ved 280 nm og en ekstinksjonskoeffisient påE <0>g

<.1% >kalkul

1cm <= 1.723.>

Eluatene som ble filtrert ved tidspunktet av nøytralisering ble ikke filtrert om igjen før absorbans ved 280 nm ble målt for kalkulering av proteinkonsentrasjoner. Ettersom turbiditetene alle var lave, er det trodd at dette ikke vil ha innvirkning på resultatene. Absorbans ved 280 nm var samsvarende mellom lagringstemperaturer og tidspunkter som er vist i Tabell 5.

Tabell 5: Proteinkonsentrasjoner av eluatprøver

(C) SDS-PAGE analyse

Redusert og ikke-redusert SDS-PAGE ble kjørt ved å benytte 4 til 12% Bis-Tris NuPAGE geler. Geler ble kjørt ved å benytte MES kjøringsbuffer og farget med Pierce gel kode blå.

SDS-PAGE analyse demonstrerte variasjoner i nivåer av halvt antistoff, men det var ingen synlig trend og det er trolig at dette er innenfor variasjonen av testen (se figurene 1 og 2 og tabeller 6 og 7). Ved dag 21 ble noen ytterligere mindre bånd sett i 25ºC prøven. Disse båndene ble ikke sett ved dag 28. Derfor kan disse være ved grensen av deteksjon av testen. Disse båndene kan korrespondere med de mindre ytterligere toppene sett på GP-HPLC (se Eksempel 3D).

Prøver ble ikke kjørt ved slutten av studien, ettersom det ikke ville være mulig å skjelne mellom forskjeller som var til stede i den opprinnelige prøven eller var et resultat av den lengre lagringen. Et nylig tint rør av referansestandard ble kjørt på hver gel. Dette var sammenlignbart mellom de forskjellige tidspunktene, som indikerer at analyse hadde oppført seg som forventet. Det er også merkbart at de ekstra båndene sett i dag 21, 25ºC prøven ikke ble sett i referansestandarden eller 2 til 8ºC prøven, kjørt på den samme gelen. For klarhet, er alle bånd i Figur 2 indikert med en sirkel.

Tabell 6: SDS PAGE densitometri resultater, reduserte prøver

Tabell 7: SDS PAGE densitometri resultater, ikke-reduserte prøver

(D) GP-HPLC analyse

Prøver ble analysert ved å benytte en TSK GS3000SW størrelseseksklusjonskolonne med 200 mM natriumfosfat og 0,05% natriumazid pH 7,0 som den mobile fasen og deteksjon ved 280 nm.

Alle fraksjoner fra Protein A kromatografi ble testet på dag 1. Eluater lagret ved begge temperaturer ble så testet på dagene: 1, 3, 15, 21 og 28. Referanseprøver ble også kjørt ved alle tidspunkter. Eluater separat nøytralisert med enten 100 mM natriumhydroksid eller 50 mM natriumhydroksid på dag 1, men ikke filtrert inntil dag 28, ble testet på dag 28 ved GP-HPLC.

Kromatogrammer fra GP-HPLC analyse dag 1 er vist i Fig.3. Disse er som forventet hvor det endelige eluatet er >95% monomer, som tilfredsstiller den endelige spesifikasjonen for BAK502G9.

GP-HPLC analyse av prøver gjennom forløpet av studien viste en lett økning i avkortet (spesielt en liten topp som elueres mellom 9,9 og 10,3 minutter) BAK502G9 ved 25ºC (Tabell 8 og figurene 4 og 5). Nivåer av monomer var konsekvent mellom 97,0 og 98,2% over hele studien.

Eluater nøytralisert med 50 mM natriumhydroksid hadde høyere nivåer av monomer (99,2% monomer) enn eluat nøytralisert med 100 mM natriumhydroksid (97,4% monomer), hvor begge er høyere enn det nødvendige nivået av 95% monomer for endelig produkt (Tabell 9 og Figur 6).

Resultatene oppnådd fra den automatiske integrasjonen ble funnet til å være upresise, derfor ble GP-HPLC kromatogrammene manuelt reintegrert.

Tabell 8: GP-HPLC av eluater lagret ved forskjellige temperaturer

Tabell 9: GP-HPLC av eluater nøytralisert med enten 100 mM eller 50 mM natriumh droksid

(E) IEF analyse

Prøver ble analysert ved å benytte Invitrogen pH 3 til 10 IEF geler, ved å benytte Invitrogen buffere.

IEF analyse av BAK502G9 viste en konsistent forsvinning igjennom denne studien (Figur 7). Tre hovedbånd og to mindre bånd mellom tilnærmede pI’er på 7,1 og 6,4 er sett.

(F) Endotoksin analyse

Prøver tatt på dag 28 fra begge lagringstemperaturer ble testet for endotoksinnivåer ved å benytte en LAL test.

Endotoksinnivåer i prøver lagret ved begge temperaturer var lave. Dette demonstrerer at det ikke har vært noen kontaminering ved gram-negative bakterier over forløpet av studien.

Eluat lagret ved 2 til 8ºC = 0,87 EU/mg.

Eluat lagret ved 25ºC < 0,44 EU/mg.

Oppsummering av 28 dagers stabilitetsanalyseresultater

BAK502G9 lagret i opp til 15 dager ved 2 til 8ºC eller 25ºC er ekvivalent i alle testene utført i Eksempel 3. Etter 21 dager er noen mindre forskjeller observert ved SDS-PAGE (Eksempel 3C) og GP-HPLC (Eksempel 3D) analyse, men produktet blir sammenlignbart opp til 28 dager.

Eksempel 4: 12 måneders stabilitetsanalyse

12 måneders stabilitetsanalysen ble utført på en analog måte til det beskrevet for 28 dagers stabilitetsanalysen av Eksempel 3.

Studien ble designet til å undersøke stabiliteten av forskjellige konsentrasjoner av BAK502G9 når lagret ved forskjellige temperaturer (f. eks. -70, 5, 25, 37 og +45ºC). De forskjellige formuleringene benyttet i denne testen er presentert i Tabell 10 nedenfor:

Tabell 10: Sammensetning av formuleringer benyttet i 12 måneders

stabilitetsanal se

Analyse av prøver ble tatt ved varierende tidspunkter, for eksempel ble formuleringene lagret ved -70, 5, 25ºC målt ved 0, 3, 6, 9 og 12 måneder, formuleringene lagret ved 37ºC ble målt ved 0, 1, 2, 4 og 8 uker, og formuleringene lagret ved 45ºC ble målt ved 0, 1, 2 og 5 dager.

(A) pH analyse

pH ble målt ved å benytte et PHM220 pH-meter (Radiometer Analytical) tilpasset med en pH-elektrode med lite volum (BDH) og resultatene av pH-måling av formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i tabellene 11-15 nedenfor: Tabell 11: pH etter lagring ved -70°C

Tabell 12: H etter larin ved 5°C

Tabell 13: H etter larin ved 25°C

Tabell 14: pH etter lagring ved 37°C

Tabell 15: pH etter lagring ved 45°C

NT = ikke testet

(B) Konsentrasjonsanalyse

Prøver ble fortynnet til et hensiktsmessig nivå med den relevante bufferen og deres absorbans ved 280 nm bestemt ved å benytte et HP8453 UV/synlig spektrofotometer (Agilent Technologies). Absorbansverdier ble omdannet til BAK502G9 konsentrasjoner ved å benytte den kjente ekstinksjonskoeffisienten på 1,723. Resultatene av absorbansmåling av formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i tabellene 16-20 nedenfor:

Tabell 16: BAK502G9 konsentrasjon etter lagring ved -70°C

Tabell 17: BAK502G9 konsentrasjon etter lagring ved 5°C

Tabell 18: BAK502G9 konsentrasjon etter lagring ved 25°C

Tabell 19: BAK502G9 konsentrasjon etter lagring ved 37°C

Tabell 20: BAK502G9 konsentrasjon etter lagring ved 45°C

<a >n=3

NT = ikke testet

(C) Gelfiltrering HPLC analyse

Gelfiltrering HPLC ble utført på et HP1100 system (Agilent Technologies). En TSK-Gel 3000S kolonne ble ekvilibrert med 0,2 M natriumfosfat pH 7,5. Prøver ble fortynnet til 1 mg/ml med den relevante bufferen og sentrifugert ved 13.000 rpm i 10 minutter for å fjerne ethvert partikkelmateriale.3 x 20 µl injeksjoner av hver prøve ble gjort på kolonnen, som ble kjørt ved en strømningshastighet på 1 ml/min. En variabel bølgelengdedetektor ble benyttet for å monitorere absorbans ved 220 og 280 nm.

Resultatene av gelfiltreringsanalyse av formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i figurene 8-12.

(D) Redusert SDS-PAGE analyse

Prøver ble fortynnet til 1 mg/ml med den relevante bufferen og 16,7 µl tilsatt til 12,5 µl av 4X LDS prøvebuffer (Invitrogen), 15,8 µl av Milli-Q vann og 5 µl reduksjonsmiddel (Invitrogen). Prøvene ble varmet opp ved 95ºC i ett minutt og så plassert på is.15 µl av hver prøve ble lastet på en 4-12% BisTris gel (Invitrogen) i en tank inneholdende 1 x MES SDS kjøringsbuffer og gelen kjørt i 35 minutter ved en konstant strøm på 500 mA. Etter elektroforese ble gelen fjernet fra sin beholder, renset i 3 x 10 minutter med Milli-Q vann, farget med Gelcode® Blue fargingsreagens (Pierce) i minimum en Tid og så avfarget med Milli-Q vann. Gelen ble fotografert og analysert ved å benytte et UVP GDS8000 geldokumentasjonssystem. Den relative rikeligheten på BAK502G9 tung og lett kjede i hver prøve ble bestemt.

Resultatene av redusert SDS-PAGE analyse av formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i figurene 13, 15, 17, 19 og 21. Målinger av rikelighet på BAK502G9 tunge og lette kjeder ved hver temperatur er også vist i figurene 14, 16, 18, 20 og 22.

(E) Ikke-redusert SDS-PAGE analyse

Prøver ble fortynnet til 1 mg/ml med den relevante bufferen og 16,7 µl tilsatt til 25 µl av 2X ikke-reduserende prøvebuffer (0,125M Tris pH 6,8, 4% (vekt/volum) SDS, 30% (volum/volum) glycerol, 0,004% (vekt/volum) bromfenolblå), 3,3 µl av Milli-Q vann og 5 µl 1M jodacetamid. Prøvene ble varmet opp ved 95ºC i ett minutt og så plassert på is.

15 µl av hver prøve ble lastet på en 4-12% BisTris gel (Invitrogen) i en tank inneholdende 1 x MES SDS kjøringsbuffer og gelen kjørt i 35 minutter ved en konstant strøm på 500 mA. Etter elektroforese ble gelen fjernet fra sin beholder, renset i 3 x 10 minutter med Milli-Q vann, farget med Gelcode® Blue fargingsreagens (Pierce) i minimum en Tid og så avfarget med Milli-Q vann. Gelen ble fotografert og analysert ved å benytte et UVP GDS8000 geldokumentasjonssystem. Den relative rikeligheten på BAK502G9 monomer i hver prøve ble bestemt.

Resultatene av ikke-redusert SDS-PAGE analyse av formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i figurene 23, 25, 27, 29 og 31. Målinger av rikelighet på intakt BAK502G9 monomer ved hver temperatur er også vist i figurene 24, 26, 28, 30 og 32.

(F) Isoelektrisk fokuseringsanalyse

Før lasting av prøve, ble elektroforesesengen avkjølt og en pH 3-10 IEF gel (Cambrex) ble prefokusert i 10 minutter ved 1 W, 2000 V, 150 mA ved å benytte en Apelex PS9009TX kraftforsyningsenhet. Prøver ble fortynnet til 1 mg/ml med den relevante bufferen. En prøvemaske ble plassert på overflaten av gelen og 5 µl av hver prøve ble lastet. Gelen ble prefokusert igjen og prøvemasken fjernet. Gelen ble så fokusert i 60 minutter ved 25 W, 1500 V, 50 mA. Etter elektroforese, ble gelen fiksert med 50% volum-% metanol, 6% (vekt/volum) trikloreddiksyre, 3,6% (vekt/volum) 5-sulfosalicylsyre i 30 minutter, så vasket med vann og tørket i en ovn ved 40-50ºC i en Tid. Gelen ble farget i 30 minutter ved å benytte PhastGel Blue R (Pharmacia; en tablett oppløst i 60 volum-% metanol), vasket med Milli-Q vann for å fjerne overskudd farge og så avfarget i omtrentlig 3 minutter med 9 volum-% iseddiksyre, 25 volum-% etanolløsning. Gelen ble tørket i en ovn ved 40-50ºC i en Tid. Den tørkede gelen ble fotografert og analysert ved å benytte et UVP GDS8000 geldokumentasjonssystem. Antallet og pI-området av isoformene i hver prøve ble bestemt og resultatene observert med formuleringer CF, TF1A, TF1B og TF1C ved hver temperatur er vist i tabellene 21-25 nedenfor:

Tabell 21: pI-område og antall av isoformer ved IEF etter lagring ved -70°C

Tabell 22: pI-område og antall av isoformer ved IEF etter lagring ved 5°C

Tabell 23: pI-område og antall av isoformer ved IEF etter lagring ved 25°C

5

Tabell 24: pI-område og antall av isoformer ved IEF etter lagring ved 37°C

Tabell 25: pI-område og antall av isoformer ved IEF etter lagring ved 45°C

NT = ikke testet

Oppsummering av stabilitetsanalyseresultater

Stabilitet ved -70°C

Både CF og TF1A var stabile i 12 måneder ved -70°C. De analytiske profilene var lignende ved 0 og 12 måneder med unntak av % intakt IgG ved ikke-redusert SDS-PAGE, som ble redusert fra 95,9% ved t=0 til 89,9% ved 12 måneder for CF og fra 96,2% ved t=0 til 89,2% ved 12 måneder for TF1A. Ved HPLC etter 12 måneder, var prosentandelen monomer for både CF og TF1A prøver 100%. Både CF og TF1A prøver viste 4 bånd på IEF etter 12 måneder. Resultatene indikerte at CF og TF1A er sammenlignbare ved denne temperaturen.

Stabilitet ved 5ºC

Både CF og TF1A var stabile i 12 måneder ved 5°C. De analytiske profilene var lignende ved 0 og 12 måneder med unntak av % intakt IgG ved ikke-redusert SDS-PAGE, som ble redusert fra 95,9% ved t=0 til 89,5% ved 12 måneder for CF og fra 96,2% ved t=0 til 88,9% ved 12 måneder for TF1A. Ved HPLC etter 12 måneder, var prosentandelen monomer for både CF og TF1A prøver 100%. Både CF og TF1A prøver viste 4 bånd på IEF etter 12 måneder. Resultatene indikerte at CF og TF1A er sammenlignbare ved denne temperaturen.

Stabilitet ved 25°C

Både CF og TF1A var stabile i 12 måneder ved 25°C. % intakt IgG ved ikke-redusert SDS-PAGE ble redusert fra 95,9% ved t=0 til 89,1% ved 12 måneder for CF og fra 96,2% ved t=0 til 87,5% ved 12 måneder for TF1A. Det er også et mindre høymolekylærvekt (>220 kDa) bånd i begge formuleringer på den ikke-reduserte SDS-PAGE gelen som ikke ble detektert ved t=0. Ved HPLC etter 12 måneder var prosentandelen monomer for både CF og TF1A prøver henholdsvis 98,9 og 96,42%. Både CF og TF1A prøver viste 4 bånd på IEF etter 12 måneder. Resultatene indikerte at CF og TF1A er sammenlignbare ved denne temperaturen.

Stabilitet ved 37°C

Både CF og TF1A var stabile i 4 uker ved 37°C, men sviktet i å tilfredsstille den skisserte spesifikasjonen for noen parametere etter 8 uker, nemlig renhet ved redusert SDS-PAGE (begge formuleringer) og % monomer ved GF-HPLC (bare TF1A; grenseresultat). Resultatene indikerte at CF er mer stabil enn TF1A ved denne temperaturen over en 8 ukers periode.

Stabilitet ved 45°C

Både CF og TF1A var stabile i 5 dager ved 45°C, selv om det var mindre endringer i de analytiske profilene etter denne tiden (noen ytterligere mindre bånd på SDS-PAGE og IEF geler). Resultatene indikerte at CF og TF1A er sammenlignbare ved denne temperaturen over en 5 dagers periode.

Claims (20)

Patentkrav

1.

Farmasøytisk sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter et IL-13 antistoff, 50 mM natriumacetatbuffer, 85 mM natriumklorid og 0,01 % (vekt/vekt) Polysorbat 80 bufret til en pH på 5,2-5,7 med natriumacetatbuffer, hvori IL-13 antistoffet omfatter et sett av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, hvori HCDRl har aminosyresekvensen NYGLS;

HCDR2 har aminosyresekvensen WISANNGDTNYGQEFQG;

HCDR3 har aminosyresekvensen DSSSSWARWFFDL;

LCDRl har aminosyresekvensen GGNIIGSKLVH;

LCDR2 har aminosyresekvensen DDGDRPS; og

LCDR3 har aminosyresekvensen QVWDTGSDPVV.

2.

Farmasøytisk sammensetning som definert i krav 1, k a r a k t e r i -s e r t v e d at IL-13 antistoffet er et humant IL-13 monoklonalt antistoff.

3.

Farmasøytisk sammensetning som definert i krav 1 eller krav 2, k a r a k -t e r i s e r t v e d at IL-13 antistoffet er til stede i den farmasøytiske sammensetningen i en mengde på mellom 1 og 200 mg/ml.

4.

Farmasøytisk sammensetning som definert i ethvert av de foregående kravene, k a r a k t e r i s e r t v e d at IL-13 antistoffet omfatter en tung kjede variabel region (VH) som har aminosyresekvensen :

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMG WISANNGDTNYGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARD SSSSWARWFFDLWGRGTLVTVSS;

og en lett kjede variabel region (VL) som har aminosyresekvensen:

SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGD RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPVVFGGGTK LTVL.

5.

Farmasøytisk sammensetning som definert i krav 1, k a r a k t e r i -s e r t v e d at den er bufret til en pH på 5,5 ± 0,1 med natriumacetatbuffer.

6.

Farmasøytisk sammensetning som definert i ethvert av de foregående kravene, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter 50 mg/ml av IL-13 antistoffet.

7.

Farmasøytisk sammensetning som definert i ethvert av de foregående kravene, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter 100 mg/ml av IL-13 antistoffet.

8.

Farmasøytisk sammensetning som definert i ethvert av de foregående kravene, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter 150 mg/ml av IL-13 antistoffet.

9.

Fremgangsmåte for rensing av et IL-13 antistoff, k a r a k t e r i -s e r t v e d at den omfatter ett eller flere kromatografiske separasjonstrinn hvor hvert av de nevnte separasjonstrinn omfatter eluering med en elueringsbuffer omfattende en eller flere farmasøytisk akseptable tilsetninger bufret til en pH på 3,5-7,0 med acetatbuffer, hvori de kromatografiske separasjonstrinnene er valgt fra affinitetskromatografi og ionebytterkromatografi, hvori acetatbuffer er natriumacetatbuffer til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 1 og 100 mM, hvori IL-13 antistoffet omfatter et sett av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, hvori HCDRl har aminosyresekvensen NYGLS;

HCDR2 har aminosyresekvensen WISANNGDTNYGQEFQG;

HCDR3 har aminosyresekvensen DSSSSWARWFFDL;

LCDRl har aminosyresekvensen GGNIIGSKLVH;

LCDR2 har aminosyresekvensen DDGDRPS; og

LCDR3 har aminosyresekvensen QVWDTGSDPVV.

10.

Fremgangsmåte som definert i krav 9, k a r a k t e r i s e r t v e d at den kromatografiske separasjonen er utført ved Protein A affinitetskromatografi etterfulgt ved kationbytterkromatografi etterfulgt ved anionbytterkromatografi.

11.

Fremgangsmåte som definert i krav 9 eller 10, k a r a k t e r i s e r t v e d at den ene eller flere farmasøytisk akseptable tilsetninger omfatter et uorganisk salt.

12.

Fremgangsmåte som definert i krav 11, k a r a k t e r i s e r t v e d at det uorganiske saltet er natriumklorid til stede i elueringsbufferen i en mengde på mellom 10 og 200 mM.

13.

Fremgangsmåte som definert i ethvert av kravene 9 til 12, k a r a k -t e r i s e r t v e d at elueringsbufferen omfatter 50 mM natriumacetatbuffer og 85 mM natriumklorid bufret til pH 5,5 ± 0,1.

14.

Anvendelse av farmasøytisk antistoffsammensetning som definert i ethvert av kravene 1 til 8 i fremstillingen av et medikament for behandlingen av en IL-13 relatert lidelse, hvor den IL-13 relaterte lidelsen er valgt fra astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom.

15.

Anvendelse som definert i krav 14, hvor den IL-13 relaterte lidelsen er atopisk dermatitt.

16.

Farmasøytisk antistoffsammensetning som definert i ethvert av kravene 1 til 8, for anvendelse i behandlingen av en IL-13 relatert lidelse, hvori den IL-13 relaterte lidelsen er valgt fra gruppen bestående av astma, atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, fibrose, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, sklerodermi, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin’s lymfom.

17.

Farmasøytisk antistoffsammensetning for anvendelse som definert i krav 16, hvori den IL-13 relaterte lidelsen er atopisk dermatitt.

18.

Fremgangsmåte som definert i krav 9, k a r a k t e r i s e r t v e d at IL-13 antistoffet er et humantmonoklonalt antistoff.

19.

Fremgangsmåte som definert i krav 9, k a r a k t e r i s e r t v e d at IL-13 antistoffet omfatter en tung kjede variabel region (VH) som har aminosyresekvensen :

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMG WISANNGDTNYGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARD SSSSWARWFFDLWGRGTLVTVSS;

og en lett kjede variabel region (VL) som har aminosyresekvensen:

SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGD RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPVVFGGGTK LTVL.

20.

Fremgangsmåte som definert i krav 19, k a r a k t e r i s e r t v e d at IL-13 antistoffet er til stede etter eluering i en mengde på omtrent 50 mg/ml, omtrent 100 mg/ml eller omtrent 150 mg/ml.