NO343225B1

NO343225B1 - Nytt polypeptid med esteraseaktivitet og rekombinant esterase samt anvendelse derav

Info

Publication number: NO343225B1
Application number: NO20082864A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Steinbauer; Michael Stanek; Peter Pojarliev; Wolfgang Skranc; Helmut Schwab; Marcel Wubbolts; Joannes Kierkels; Harald Pichler; Manuela Hermann; Christoph Zenzmaier
Original assignee: Patheon Austria Gmbh & Co Kg
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2018-12-10
Also published as: WO2007073845A2; BRPI0621280A2; HK1128306A1; SG170757A1; IL192400A; EP1966373B1; CN101351548A; US8642312B2; PL1966373T3; EP1966373A2; CA2635380C; AT502990A1; US20120220014A1; CN101351548B; BRPI0621280A8; JP5119166B2; KR101388391B1; NO20082864L; WO2007073845A3; JP2009521239A

Abstract

Polypeptid og rekombinant protein som har esteraseaktivitet som utviser aminosyresekvensen SEQ. ID. No 1 og anvendelsen derav.

Description

Oppfinnelsen er knyttet til et polypeptid eller et rekombinant protein som angitt i krav 1 som har esteraseaktivitet, særlig som har 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksyesteraseaktivitet, proteinet er enzymatisk aktivt og kan løse opp racemater av 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreester enantiomerblandinger.

Enantiomerisk anriket 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyre og deres estere er verdifulle intermediater for fremstilling av legemidler, slik som f.eks. delta-aminogamma-hydroksy-omega-arylalkankarboksamider, som har renininhiberende egenskaper og som kan anvendes som et antihypertensivmiddel i farmasøytiske fremstillinger.

Esterase er generelt anvendt i oppløsningen av racemater og asymmetrisering. Imidlertid er kun svært få esteraser egnede for fremstilling av kirale kommersielt tilgjengelige forbindelser. Anvendelsen av esteraseekstrakter fra svinelever er kjent på det preparative området. Svineleveresterase (PLE) ble isolert for lenge siden fra naturlige kilder, og dens aktivitet har også vært kjent i lang tid (Simonds, J.P.

(1919) Amer. K. Physiol. 48, 141; Bamann, E. et al. (1934) Hoppe-Seyler, Z. 229, 15; Falconer J.S. og Taylor, D.B. (1946) biochem. J. 40, 831-834), Lange et al. “Cloning, functional expression and characterization of recombinant pig liver esterase”, Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology, vol. 2, nr. 7-8, 2001.08.03, side 576-582.

Mange studier har også allerede blitt gjennomført for å karakterisere PLE (Heymann, E. og Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95, 509-518; Lehner, R. og Verger, T. (1997) Biochemistry 36, 1861-1868). Det har videre blitt mulig å vise, f.eks. i WO 01/09079, at esteraseekstrakter fra svinelever selektivt kan hydrolysere (R) enantiomeren av metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat. Peptidet med esteraseaktivitet er også kjent fra WO 2004055177 A.

Uansett er anvendelsen av slike esteraseekstrakter fra naturlige kilder, slik som svine-lever, assosiert med ulemper. For det første varierer kvaliteten på de ulike batchene og gjør det således vanskelig å optimalisere industrielle prosesser. For det andre er bruken av dyreresurser i fremstillingen av farmasøytiske produkter uønsket pga. nærværet av virus og prioner ikke alltid kan forhindres. På grunn av dette er det behov for å produsere rekombinant svineleveresteraser av standardisert kvalitet i mikroorganismer. Kloning av antatte esterasegener er f.eks. beskrevet i FEBS Lett. (1991), 293, 37-41. Den første funksjonelle ekspresjonen av et aktivt svineleveresteraseenzym ble beskrevet for første gang i WO 02/48322. WO 2004/055177 beskriver fremstillingen av ytterligere rekombinante esteraser ved seterettet mutagenese av den rekombinante svineleveresterasen av SEQ ID No. 1 (rPLE) fra WO 02/48322. Hvilket er tydelig fra beskrivelsen av WO 2004/055177 og fra artikkelen skrevet av de samme oppfinnerne i Protein Engineering, 16 1139-1145, 2003, ble modifikasjonene av rPLE-sekvensen fra WO 02/48322 valgt slik at en rekombinant intestinal svineesterase (PICE) beskrevet i David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148 oppnås. Oppløsningene av racemisk 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere er ikke beskrevet i noen av disse artiklene.

Imidlertid siden behovet for esteraser som har den ønskede stereoselektive aktiviteten for 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere og som enkelt kan bli fremstilt bioteknologisk ikke er møtt, var det et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe korresponderende ny rekombinant esterase.

I et forøk på å isolere og klone genet beskrevet i FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 og WO 02/48322 for kjent svineleveresterase (PLE) som cDNA startende fra mRNA fra svinelever, ble en andre ny esterasesekvens funnet i tillegg til den kjente PLE-sekvensen. Etterfølgende ekspresjon av de to sekvensene, hvori de korresponderende proteinene eller esterasene, nemlig det kjente rPLE og en ny rekombinant “alternativ” esterase (rAPLE), ble fremstilt, fremkom det uventet at kun rAPLE er i stand til selektiv oppløsning av racemiske 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere.

Det var således mulig å oppnå målet med den foreliggende oppfinnelsen ved et nytt polypeptid som har esteraseaktivitet og et nytt rekombinant esterase (rAPLE), hvilkens aminosyresekvens avviker, i 21 av totalt 548 aminosyrer, fra den kjente PLE sekvensen. Det nye rAPLE avviker i aminosyresekvensen også fra den kjente svineintestinale karboksylesterasen (PICE) i 12 av totalt 548 aminosyrer. Imidlertid er PICE funnet i svinetarmkanalen.

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg følgelig til et polypeptid eller et rekombinant protein som har esteraseaktivitet, har 98 % identitet med aminosyresekvensen SEQ. ID. No 1, og kan skille racemater av 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere av formel (I) som angitt i krav 1.

Polypeptidet og den rekombinante rAPLE av oppfinnelsen, har evnen til å oppløse stereoselektivt racemisk 2-alkyl-5-halopent-4-enekarboksylsyreestere av formelen (I)

hvori R er et C1-C6-alkylradikal, R1er C1-C4-alkyl og X er klor, brom eller jod.

Polypeptidet av oppfinnelsen har esteraseaktivitet, og den nye rekombinante esterasen rAPLE avviker, som fastslått ovenfor, i 21 av totalt 548 aminosyrer av den kjente sekvensen beskrevet i FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 og i 12 av totalt 548 aminosyrer fra det kjente PICE-proteinet beskrevet i David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148.

Sekvensen av proteinet av det nye rAPLE av oppfinnelsen avviker i de følgende aminosyreposisjonene fra den kjente sekvensen av PLE-proteinet:

Proteinet av oppfinnelsen og det nye rekombinante rAPLE kan i tilegg være i formen av en modifisert sekvens som vist i SEQ ID No 1, som kan bli oppnådd f.eks. ved vanlige modifikasjoner slik som, f.eks. bytte, sletting eller festing av aminosyre(r) i sekvensen ved N eller C terminus, slik som f.eks. GluAlaGluAla fra α-faktorsignalsekvensen, eller ved fusjon til andre proteiner. Oppfinnelsen inkluderer også videre muteiner som har modifikasjoner innen proteinsekvensen av enzymet av oppfinnelsen som har den passende aktiviteten, særlig på 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere. Muteiner kan bli oppnådd f.eks. ved modifikasjoner av DNAet som koder for enzymet av oppfinnelsen, ved kjente mutageneseteknikker (tilfeldig mutagenese, seterettet mutagenese, kontrollert evolusjon, genstokking etc.) slik at DNAet koder for et enzym som avviker med minst én aminosyre fra enzymet av oppfinnelsen, og etterfølgende ekspresjon av det modifiserte DNA i en egnet vertscelle. Oppfinnelsen inkluderer således også modifiserte DNA-sekvenser som vist i SEQ ID No 2, oppnådd ved mutasjonene, slettingene, ekstensjonene, fusjonene beskrevet ovenfor, og som koder for enzymer som har den ønskede esteraseaktiviteten.

Esteraseaktivitet, særlig 2-alkyl-5-halopent-4-en-karboksylesteraseaktivitet, er definert i denne sammenheng som evnen til å oppløse racemater av 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere av formel (I).

Polypeptidet av oppfinnelsen og den rekombinante rAPLE kan fremstilles som beskrevet nedenfor:

Først isoleres mRNA fra svinelever ved anvendelse av et egnet kit, og deretter genereres cDNA ved revers transkripsjon basert på mRNA-ekstraktet. Etterfølgende fremstilles spesifikke PCR-primere basert på sekvensen av det kjente svineleveresterasegenet av GenBank-aksesjonsnr. X63323 (Matsushima et al., 1991), etterfulgt av forsterkning og kloning. Disse spesifikke primerene er:

Primer 1: 5’-CAGAATTCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3’

Primer 2: 5’- CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3’

Denne delen av primerene som omfatter den passende nukleotidsekvensen som koder for PLE-proteinet og som er obligatorisk til stede i primerene i fet skrifttype. Den andre sekvensdelen av primere omfatter f.eks. informasjon for spalteseter for restriksjonsendonukleaser (i kursiv) eller sekvenselementer som er viktige for ekspresjon. Denne delen kan variere i fremstillingen av rAPLE av oppfinnelsen.

Utvidelse finner deretter sted med primere 1 og 3 ved tidligere teknikks PCR-fremgangsmåter. PCR-produktet anvendes deretter for å fremstille ved tidligere teknikks fremgangsmåter ekspresjonskonstrukter for heterolog ekspresjon av det kodede rAPLE-proteinet i egnede vertsorganismer. Dette fører fortrinnsvis med seg PCR-produksjonene initielt klonet inn i egnede plasmidvektorer.

De rekombinante plasmidene oppnådd på denne måten transformeres deretter inn i en egnet vert, f.eks. Escherichia coli. Innsetting av mange resulterende kloninger blir deretter sekvensert. Uventet ble 2 grupper av rekombinante kloninger med ulike sekvenser identifisert deri, én er 100 % identisk med den forventede sekvensen for PLE ifølge Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, og en ny nukleotidsekvens som vist i SEQ ID No. 2 (APLE sekvens) som etter ekspresjon leder til aminosyresekvensen SEQ ID No. 1 av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg videre til en nukleinsyre eller nukleotidsekvens som koder for polypeptidet av oppfinnelsen og det rekombinante esterase rAPLE. F.eks. har slik nukleinsyre nukleotidsekvensen vist i SEQ ID No. 2. Oppfinnelsen relaterer seg videre også til nukleotidsekvenser som inkluderer en nukleotidsekvens som koder for polypeptidet av oppfinnelsen og det rekombinante esterase rAPLE, eller omfatter nukleotidsekvensen vist i SEQ ID No. 2.

En ytterligere mulighet er å fremstille passende oligonukleotider korresponderende til nukleinsyresekvenser ifølge den forliggende oppfinnelsen som koder for esterasen av oppfinnelsen ved standardiserte syntetiske teknikker, f.eks. med anvendelse av automatiserte DNA-syntetisatorer. Den rene syntetiske fremstillingen av nukleinsyresekvensene som koder for esterasen av oppfinnelsen er særlig fordelaktig for anvendelse i produksjonen av legemidler eller deres intermediater, fordi enzymer således ikke blir oppnådd fra dyreresurser.

Ekspresjon av de to sekvensene som er funnet (PLE og APLE sekvenser), finner deretter sted. Den kjente svineleveresterasen (PLE, Swiss-Prot ID Q29550) omfatter en N-terminal signalsekvens og et C-terminalt ER retensjonssignal, de 4 siste aminosyrer HAEL. For å uttrykke den kjente PLE og den nye APLE, konstrueres vektorer hvori sekvensene er innført i egnede ekspresjonssystemer. Disse ekspresjonskonstruktene transformeres deretter inn i egnede vertsceller. Egnede vertsceller i denne forbindelse er f.eks. mikroorganismer, dyrecellelinjer og planter. Både prokaryotiske og eukaryotiske mikroorganismer kan bli anvendt. Foretrukne prokaryotiske verter (bakterier) er Escherichia coli, og linjer fra slekten Bacillus (f.eks.

B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens), Pseudomonas (f.eks. P.fluorecens, P.putida), eller Streptomyces (f.eks. S.lividans, S.tendae). Eukaryotiske mikroorganismer er foretrukket og sopp er særlig foretrukket. Eksempler derav er Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis eller Aspergillus sp. Ekspresjon kan være sekretorisk eller intracellulær og begge induserbare og konstitutive.

For bakteriell ekspresjon kan et utvalg av artsspesifikke signaler oppnås, som kommersielt tilgjengelige kjeder og vektorer for proteinekspresjon (f.eks. tilveiebrakt av selskaper som Invitrogen, Novagen, New England Biolabs), som tillater induserbar eller konstitutiv ekspresjon, intracellulær og sektretorisk lokalisering av målproteinet; og i tillegg kan teknologi for å muliggjøre eller promotere den korrekte foldingen av proteiner for å resultere i oppløselige og aktive proteiner anvendes. Proteinene blir fortrinnsvis uttrykt på en sekretorisk måte, hvori saksvektorer til hvilke sekvensene av PLE og APLE er bundet N-terminalt til α-faktorsignalsekvensen av S. cerevisiae, fortrinnsvis konstrueres. Det er videre mulig å fremstille konstrukter hvor C-terminal tetrapeptidet HAEL, som tjener som ER-retensjonssignal som er beskrevet f.eks. i Hardwick et al., (1990) EMBO J. 9, 623-630, er ytterligere slettet.

En ytterligere foretrukket ekspresjon er induserbar ekspresjon av konstrukter med eller uten ER-retensjonssignal. Uventet kan også konstrukter som har ER-retensjonssignalet, bli uttrykt og fører til en rAPLE som er i stand til selektiv oppløsning av racemisk 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere.

Aminosyresekvensen av det nye esterase rAPLE som er utledet fra nukleotidsekvensen av APLE-genet, er beskrevet i SEQ ID No. 1.

Det har uventet blitt mulig å finne at det nye polypeptidet eller rAPLE proteinet er i stand til, til forskjell fra det kjente rPLE, i hvert tilfelle oppnådd fra ekspresjon av DNA-segmentene som koder for APLE og PLE, respektivt, f.eks. i P. pastoris celler, å oppløse racemisk 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere stereoselektivt.

Oppfinnelsen relaterer seg følgelig videre til anvendelsen av polypeptidet som har esteraseaktivitet og til den rekombinante esterasen (rAPLE) av oppfinnelsen, som er minst 98 % identisk med sekvensen vist i SEQ ID No. 1, for oppløsning av racemater av 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere av formelen (I)

Polypeptidet som har esteraseaktivitet og den rekombinante esterasen (rAPLE) av oppfinnelsen, har minst 98 %, likhet med sekvensen av proteinet vist i SEQ ID No.

1. Det er også mulig å anvende polypeptid som har en esteraseaktivitet eller den rekombinante esterasen (rAPLE) av oppfinnelsen med modifiserte DNA-sekvenser vist i SEQ ID. No. 2, oppnådd ved alminnelige modifikasjoner, slik som, f.eks., mutasjoner, slettinger, forlengelser, sammenføyelser som koder for enzymer som har den ønskede esteraseaktiviteten.

I denne sammenheng oppnås enantiomerisk anriket 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksyl-syrer eller deres estere av formelen (II)

hvori R er et C1-C6-alkylradikal, A er lik H, R1, hvor R1kan være C1-C4-alkyl eller R2er en alkylgruppe, men er ikke lik som R1, og X er klor, brom eller jod, av en enantiomerisk blanding av en 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreester av formelen (I)

hvori R, R1og X er som definert ovenfor, som er omdannet ved hjelp av polypeptidet av oppfinnelsen eller av rAPLE av oppfinnelsen i nærvær av vann eller en alkohol av formelen R2OH, hvori R2er en alkylgruppe som ikke er lik R1som nukleofil og

a) enten det gjenværende enantiomerisk anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreester av formelen (II) med A lik som R1værende isolert eller b) hvis en alkohol er anvendt som nukleofil, vil den resulterende enantiomeriske anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreester av formelen (II) med A tilsvarende R2bli isolert, eller

c) hvis vann anvendes som nukleofil, vil den resulterende 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyren av formelen (II) med A tilsvarende H bli isolert.

R i formel (II) r et C1-C6alkylradikal slik som f.eks. metyl, etyl, n- og i-propyl, n-, iog t-butyl, pentyl og heksyl. C1-C4-alkylradikaler er foretrukket og i-propylradikalet er særlig foretrukket. A er H, R1, hvor R1er et C1-C4-alkylradikal, fortrinnsvis et C1-C2-alkylradikal, fortrinnsvis et metylradikal, eller R2, hvor R2er et alkylradikal som ikke er likt som R1. R2er særlig foretrukket et C1-C6-alkylradikal. X er klor, brom eller jod, fortrinnsvis klor.

Enantiomerisk anrikede forbindelser betyr i denne sammenheng de som utviser et enantiomerisk overskudd (ee) av > 80 %, foretrukket > 90 % og særlige foretrukket > 97 %.

Enzymet av oppfinnelsen kan videre anvendes i en hvilken som helst form. For eksempel som dispersjon, som løsning, immobilisert, som råenzym, som enzym som har blitt oppnådd fra dets kilde ved en kombinasjon av kjente rensemetoder, som hele celler (hvor passende immobilisert og/eller permeabilisert) som har den påkrevde enzymatiske aktiviteten (naturlig eller gjennom genetisk modifikasjon) eller i et lysat av slike celler.

Reaksjonstemperaturen for omdanningen av oppfinnelsen ligger normalt mellom 0 og 90 °C, fortrinnsvis mellom 10 og 60 °C. pH av reaksjonsløsningen ligger mellom 4 og 11, fortrinnsvis mellom 6 og 9.

Valget av løsningen avhenger av nukleofilen anvendt. Hvis, f.eks., vann er nukleofilen, er løsninger som kan anvendes vann, en blanding av vann med et vannblandbart løsemiddel, f.eks. med en alkohol slik som f.eks. metanol, etanol, isopropanol, t-butanol, etc., dioksan, tetrahydrofuran, aceton eller dimetylsulfoksid eller et tofasesystem av vann og av et løsemiddel ikke oppløselig i vann, f.eks. toluen, xylen, etc., en alkan slik som f.eks. heksan, heptan, sykloheksan, etc., enten slik som f.eks., diisopropyleter, metyl t-butyleter, etc. Hvis nukleofilen er en alkohol er løsemidlet fortrinnsvis anvendt alkoholen R2OH hvor R2er en alkylgruppe som uansett ikke er lik som R1. Imidlertid, er det også mulig å anvende blandinger av alkoholen med et organisk løsemiddel slik som f.eks. tetrahydrofuran, heptan, toluen, heksan, CH3CN, metyl t-butyleter etc.

Etter at den enzymatiske katalyserte racematoppløsningen har funnet sted, isoleres det ønskede sluttproduktet. Dette kan enten være den gjenværende enantiomerisk anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreesteren av formel (II), med A lik som R1, eller hvis vann er nukleofilen, den enantiomerisk anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyren av formel (II) med A tilsvarende H som er dannet, eller hvis alkohol er nukleofilen, den enantiomerisk anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyren av formel (II) med A lik som R2. Isoleringen kan finne sted f.eks. ved konvensjonelle fremgangsmåter slik som f.eks. ekstraksjon, krystallisering, kolonnekromatografi, destillasjon etc. Fremgangsmåten av oppfinnelsen resulterer i korresponderende syrer eller estere av formel (I) i teoretiske utbytter opp til 98 % utbytte og med en ee opp til >99 %.

Eksempel 1: mRNA-isolasjon og generering av cDNA

0,7 g lever fra nylig slaktet gris, oppnådd fra en lokal slakter, ble frosset i væskeformig nitrogen og homogenisert med en morter, og det frigjorte mRNA ble isolert eller ekstraktert ved anvendelse av Fast Track mRNA ekstraksjonskit 2,0 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) i samsvar med erklæringene gjort av forhandleren (Fast Track 2.0 kit manual; versjon J; 082301; 25-0099). Ekstraksjonen ga et totalt antall på 12,9 μg mRNA. 0,26 μg av dette rRNA ble deretter anvendt som templat for generering av cDNA ved anvendelse av SuperScript III First-Strand syntesesystem for ROMTEMPERATUR-PCR i henhold til forhandlerens erklæringer.

Eksempel 2: Amplifikering og kloning av cDNA-fragmenter fra svinelever

Spesifikke primere basert på sekvensen av svineleveresterasegenet av GenBank aksesjon nr. X63323 (Matsushima et al., 1991) ble fremstilt.

Primer 1: 5’CAGAATTCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3’ (SEQ ID No. 3)

Primer 2: 5’-CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3’ (SEQ ID No. 4)

Baser homologe til den kjente PLE-sekvensen er i fet skrift. Gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser står i kursiv for å utheve. Amplifikeringen fant sted i en 50 μl blanding med 1 U Phusion DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland), med 500 ng cDNA som templat, 20 μmol hver av primer 1 og 2, 5 μl dNTP-blanding (2nM hver), alle i en 1xPhusion HF buffer i samsvar med ˋPhusion High-Fidelity DNA Polymerase’ manual (Finnzymes), å starte med et 30 sekunders denatureringstrinn ved 98 °C, etterfulgt av 30 sykluser (10 sek 98 °C, 20 sek 68 °C, 1 min 72 °C) for amplifikering og en siste inkubasjon ved 70 °C i 8 min for å fremstille fullstendige produkter. Denne PCR resulterte i et DNA-fragment med en størrelse på 1,8 karboksylsyregrupper (funnet ved agarosegelelektroforese). Dette PCR-produktet ble deretter renset ved anvendelse av Qiaquick kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i samsvar med manualen vedlagt. Omtrent 0,1 μg av renset PCR-produkt ble spaltet med restriksjonsendonukleasen EcoRI og klonet inn i plasmidvektorene pHILZ og pHIL-D2 via EcoRI spaltestedene. Vektorene ble deretter transformert inn i TOP10 elektrokomponentceller fremstilt i henhold til ˋCurrent Protocols in Molecular Biology’. Innsettinger av flere resulterende kloner ble sekvensert ved anvendelsen av ˋDye Deoxy Terminator Cycle Sequencing’ kit (Applied Biosystems Inc., Forster City, California, USA). To sekvenser ble dermed identifisert, én korresponderende 100 % til den forventede sekvensen publisert av Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, og den andre sekvensen korresponderende til SEQ ID No. 2.

Eksempel 3: Introduksjon av α-faktorsignalsekvensen og variasjoner av C-terminalenden

For å gjøre sekretorisk ekspresjon av det kjente proteinet PLE og proteinet rAPLE av oppfinnelsen mulig, ble vektorer hvori sekvensen av PLE og APLE bundet N-terminalt til α-faktor startsekvensen av den klonende vektoren pPICZ α (Invitrogen) konstruert. I tillegg ble konstrukter hvor C-terminalt tetrapeptid HAEL var slettet, fremstilt.

PCR I: EcoRIalfa1/alfaPLE2 primerparet ble anvendt for å forsterke α-faktorsignalsekvensen av den klonede vektor pPICZ α (Invitrogen). PCR ble utført i en 50 μl blanding (2 ng av templat, 0,5 μM av hver primer, 0,2 mM dNTPs, 1U av Phusion DNA polymerase (Finnzymes) alle i 1xPhusion HØY-FASTSTOFF buffer i samsvar med ˋPhusion High-Fidelity DNA Polymerase’ manualen (Finnzymes)). Denaturering ved 95 °C i 3 minutter ble etterfulgt av amplifikering i 30 sykluser (30 sek 95 °C, 30 sek 57 °C, 15 sek 72 °C) og et siste trinn ved 72 °C i 7 minutter.

PCR II: PLE og APLE-sekvensene ble amplifikert fra pHILZ plasmider ved anvendelse av enten PLEalfa1/EcoRIPLE-ER2 primerparet eller PLEalfa1/EcoRIPLE2 (sletting av det C-terminale HAEL tetrapeptidet) primerpar. Disse PCR ble igjen utført ut i 50 μl blandinger (2 ng av templat, 0,5 μM av hver primer, 0,2 mM dNTPer, 1 Utførelsesform av Phusion DNA polymerase (Finnzymes) all i 1xPhusion HF buffer i samsvar med ˋPhusion High-Fidelity DNA Polymerase’ manualen (Finnzymes)). En denaturering ved 95 °C i 3 minutter ble etterfulgt av amplifikering i 30 sykluser (30 sek 95 °C, 30 sek 57 °C, 15 sek 72 °C) og et siste trinn ved 72 °C i 7 minutter.

PCR III: 3 μl av produkter fra PCR 1 og PCR II ble anvendt for å kombinere disse to produktene med primerløs PCR. Ekstensjonene ble utført i en 45 μl blanding med 0,2 mM dNTP, 1U av Phusion DNA polymerase (Finnzymes) alle i 1xPhusion HF buffer. Reaksjonsblandingen ble varmet opp ved 95 °C i 3 minutter og deretter ble 10 sykluser med 30 sek ved 95 °C og 45 sekunder ved 72 °C utført. For å amplifikere disse overlappende ekstensjonsproduktene, ble 5 μl primerblanding (3 μl vann, 1 μl av 5 μM EcoRIalfa1 primer og 1 μl av 5 μM EcoRIPLE+ER2 eller EcoRIPLE2 primer) tilsatt. Produktene ble amplifikert med 20 PCR sykluser (30 sekunder 95 °C, 30 sekunder 57 °C, 1 minutt 72 °C) og en enkel temperaturstopp ved 72 °C i 7 minutter.

Primersekvenser:

EcoRlalfa1: 5’-TCTTCGAAGAATTCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3’ (SEQ ID No. 5)

alfaPLE2: 5’-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3’ (SEQ ID No. 6)

PLEalfa1: 5’ AGAGAGGCTGAAGCTGGGCAGCCAGCCTCGCCG-3’ (SEQ ID No. 7)

EcoRIPLE+ER2: 5’ATGGTACCGAATTCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3’ (SEQ ID No. 8)

EcoRIPLE2:5’-ATGGTACCGAATTCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3’ (SEQ ID No. 9)

Regioner med homologi til templatene står med fet skrift, gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonuklease står i kursiv.

Eksempel 4: Konstruksjon av ekspresjonskonstrukter for den heterologe ekspresjon av svineleveresterase i Pichia pastoris

De overlappende ekstensjon-PCR-produktene fra eksempel 3 ble renset ved anvendelse av Qiaquick kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), i samsvar med manualen vedlagt. Omtrent 0,1 μg av de rensede PCR-produktene ble kuttet ved anvendelse av EcoRI restriksjonsendonukleasen og klonet via EcoRI spaltningssetet inn i plasmidvektoren pGAPZ A (Invitrogen). Riktig orientering av innsettingen i forhold til promoterne ble sjekket ved hjelp av kontrollspaltinger, f.eks. med NcoI. I hvert tilfelle ble en klon med korrekt orientert innsetting valgt, sekvensert og beskyttet. De korresponderende plasmidene ble benevnt som følger: Plasmider som inneholdt den kjente PLE-sekvensen som beskrevet i Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, ble kalt pGAPZ A PLE-ER (HAEL tetrapeptidet ble slettet) og pGAPZ A PLE+ER (HAEL tetrapeptid fortsatt til stede). Plasmider utledet fra den nye APLE-sekvensen ble kalt pGAPZ A APLE-ER (HAEL tetrapeptidet ble slettet) og pGAPZ A APLE-ER (HAEL tetrapeptid fremdeles til stede).

Eksempel 5: Konstitutiv ekspresjon av svineleveresterase i Pichia pastoris

Plasmidet pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER og pGAPZ A AP-LE+ER ble transformert inn i P. pastoris X-33. Transformasjonene fant sted i samsvar med instruksjonene av protokollen for Pichia ekspresjonskittet fra Invitrogen. Transformantene ble valgt på YPD plater (1 % gjæringsekstrakt, 2 % pepton, 2 % D-glukose, 2 % agar) som inneholdt 100 mg/l zeocin. 52 zeocin-resistente kloner ble stripet på YPD-plater med 100 mg/l zeocin og konservert i 15 % glyserol.

Eksempel 6: Kvalitativ analyse av esteraseaktiviteten

P. pastoris transformanter ble dyrket på YPD-plater med 100 mg/l zeocin ved 30 °C i 48 timer. Cellene ble løftet opp på Whatmann 541 herdede askefrie mmØ filtre og lufttørket. Filtrene ble inkubert med en løsning av 6 mg α-naftylacetat (Sigma, løst i 500 μl aceton), 2,5 mg tetrazotert o-dianisidin (Fast Blue Salt BN, Sigma, løst i 125 μl vann) og 5 ml 0,1 M kaliumbuffer, pH 7, for å visualisere esteraseaktiviteten ved en fargereaksjon. Aktiviteter ble detektert i alle transformanter som hadde integrert én av de 4 plasmidene pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER og pGAPZ A APLE+ER. Dette beviser ekspresjon av funksjonelle proteiner som har esteraseaktivitet. Som kontroll ble en klon med integrert tom vektor også testet på samme måte. I dette tilfellet var ingen signifikant esteraseaktivitet synelig i den sammenlignbare reaksjonsperioden.

Eksempel 7: Stereoselektiv esteraseaktivitet i forhold til metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat

P. pastoris transformanter som beskrevet i eksempel 6, ble dyrket på YPD-plater med 100 mg/l zeocin ved 30 °C i 48 timer. Cellene ble løftet opp på Whatman 541 herdede askefrie 70 mmØ filtre og lufttørket. Filtrene ble inkubert enten med substratløsning A (100 μl racemisk metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat, 200 μl 0,1 M kaliumfosfatbuffer, pH 8; 150 μl 10 mg/ml fenol rød; 450 μl DMSO; 650 μl H2O) eller med substratløsning B (identisk med løsning A, men anvender metyl (2S, 4E)-5-klor-2-(1-metyl-etyl)-4-pentenoat istedenfor racematet). På grunn av den spesifikke esteraseaktiviteten på substratene, resulterer frigjøringen av syre på hydrolyse av estersubstratet i en pH-nedgang som i sin tur leder til en endring av farge på fenol rød-indikator til gul. Det fremkom fra dette at transformantene inneholdende plasmidet pGAPZ A APLE-ER ga signal (gulfarging rundt kolonien) etter inkubasjon i 3 til 4 timer hvis de ble testet på substratløsning A, mens ingen signifikant omdanning kunne bli funnet med substratløsning B (figur 1). Transformanter oppnådd med plasmidet pGAPZ A PLE-ER eller pGAPZ A PLE+ER viste ingen reaksjon med substratløsninger A eller B under samme forhold. Dette viste at det rekombinante rAPLE har en substratspesifisitet forskjellig fra rekombinant rPLE og at hydrolyse av metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat ved anvendelse av rAPLE finner sted stereoselektivt for (R) enantiomeren.

Eksempel 8: SDS polyakrylamid gel elektroforese

10 μl av en 2x SDS prøvebuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8; 4 % SDS, 20 % glyserol, 5 % β-mercaptoetanol, 0,05 % bromfenol blå) ble tilsatt til 10 μl kommersielt tilgjengelig svineleveresterase eller 10 μl 60-dobbelt konsentrert (Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns, fra Sartorius) supernatanter av P. pastoris dyrkningene (72 timer ved 100 rpm og 28 °C i 250 ml YPD medium i 2 l Erlenmeyerflasker med ledeplater) som inneholdt enten plasmidet pGAPZ A APLE-ER eller et tomt pGAPZ A plasmid (kontrollstamme). Etter at prøvene ble oppvarmet til 95 °C i 5 minutter ble proteinene separert på en 12,5 % polyakrylamidgel (4 % stacking gel) og farget med Coomasssie Brilliant Blue R250 for deteksjon. SDS-PAGE viser et proteinbånd med den utvidede størrelsen for rAPLE (~60 kDa) i gjærstammen som har pGAPZ A APLE-plasmidet, men ikke i kontrollstammen (figur 2). Den kommersielt tilgjengelige svineleveresterasen som også ble analysert for sammenligning, viste to proteinbånd i samme størrelsesbredde (pil i figur 2).

Eksempel 9: Indusert ekspresjon av svineleveresteraser med AOX1-promoteren

Plasmidene pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER og pGAPZ A AP-LE+ER ble spaltet med restriksjonsendonukleasen XhoI, og de respektive fragmentene som koder for APLE og PLE proteinene, med eller uten ER-retensjonssignal, ble klonet via XhoI-spaltningssetet inn i pPIC9-vektoren (Invitrogen). Korrekt orientering av fragmentene i forhold til AOX1-promoteren ble sjekket ved hjelp av kontrollspalting med restriksjonsendonukleasen NcoI. Vektorene som har AOX1 promoter ble navngitt, i analogi til plasmidene navngitt i eksempel 4, pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE-ER, pPIC9 APLE-ER og pPIC9 APLE+ER, linearisert med SalI og transformert inn i P. pastoris KM71. Transformasjon og seleksjon for His prototrofi fant sted i samsvar med instruksjonene for Pichia ekspresjonskittet fra Invitrogen. Utvalgte transformanter og KM71-stammen ble dyrket på komplett medium i samsvar med Pichia ekspresjonskittet fra Invitrogen over natten og indusert med 1 % metanol i 48 timer. De resulterende dyrkningene ble analysert ved hjelp av det kvalitative pH-shiftassayet beskrevet i eksempel 7, ved å teste 2 μl av dyrkningene i blandingen i hvert tilfelle. Ekspresjon under kontroll av den induserbare AOX1-promoteren førte til veldig mye høyere, sammenlignet med situasjonen beskrevet for konstitutiv ekspresjon i eksempel 7, rAPLE enzymatiske aktiviteter i forhold til racemisk metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat. Fenyl rød fargebyttet (rød til gul) ble detekterbart etter kun noen få minutter (figur 3). Uventet var rAPLE-aktiviteten uavhengig av nærværet av ER-retensjonssignalet HAEL ved C-terminusen, dvs. selv celler som uttrykte rAPLE med ER-retensjonssignal viste aktivitet. I motsetning hadde gjærstammer for produksjon av rPLE ingen aktivitet i forhold til racemisk metyl 5-klor-2-(1-metyletyl)-4-pentenoat.

Claims

Patentkrav 1. Polypeptid eller rekombinant protein, k a r a k t e r i s e r t v e d at polypeptidet eller det rekombinante proteinet utviser minst 98 % identitet med aminosyresekvensen vist i SEQ ID No. 1 og har aktivitet for racematoppløsning av 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreestere av formelen (I)

hvori R er et C1-C6-alkylradikal, R1er C1-C4-alkyl og X er klor, brom eller jod.
2. Polypeptid eller rekombinant protein som har esteraseaktivitet ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det utviser en aminosyresekvens modifisert ved en modifikasjon valgt fra gruppen av mutasjon, sletting, innsetting, ekstensjon og fusjon.
3. Nukleotidsekvens, k a r a k t e r i s e r t v e d at den koder for et polypeptid eller rekombinant protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 2.
4. Nukleotidsekvens, k a r a k t e r i s e r t v e d at den har sekvensen vist i SEQ ID No. 2.
5. Nukleotidsekvens ifølge krav 3 eller krav 4, k a r a k t e r i s e r t v e d at den kan fremstilles ved å isolere mRNA fra griselever ved å anvende et passende kit, så generere cDNA ved revers transkripsjon basert på mRNA-ekstraktet fulgt av amplifikasjon av et nukleinsyrefragment ved å bruke en første primer omfattende nukleotidsekvensen GGGCAGCCAGCCTCGC og en andre primer omfattende nukleotidsekvensen GGGCAGCCAGCCAGCCTCGC.
6. Anvendelse av polypeptid eller rekombinant protein ifølge krav 1 - 2 for racemisk oppløsning av 2-alkyl-5-halopent-4-en-karboksysyreestere av formel (I)

hvori R er et C1-C8-alkylradikal, R1er C1-C4-alkyl og X er klor, brom eller jod.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av enantiomerisk anriket 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksysyreer eller estere derav av formelen (II)

hvori R er et C1-C8-alkylradikal, A er lik H, R1, hvor R1kan være C1-C4-alkyl, eller R2, hvor R2er en alkylgruppe, men er ikke lik R1, og X er klor, brom eller jod, som omfatter en blanding av enantiomerer av en 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreester av formelen (I)

hvori R, R1og X er som definert ovenfor, k a r a k t e r i s e r t v e d at forbindelsene konverteres ved hjelp av et polypeptid eller en rekombinant esterase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 – 2, ved nærvær av vann eller en alkohol av formelen R2OH, hvor R2er en alkylgruppe som ikke er lik R1, som nukleofil, og a) hvor enten den gjenværende enantiomeriske anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreesteren av formel (II) med A lik som R1isoleres, eller b) hvis en alkohol anvendes som nukleofil, blir den resulterende enantiomerisk anrikede 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreesteren av formel (II) med A tilsvarende R2, isolert, eller c) hvis vann anvendes som nukleofil, blir den resulterende 2-alkyl-5-halopent-4-enkarboksylsyreen av formel (II) med A tilsvarende H, isolert.