JP2009521239A - エステラーゼ活性を有する新規なポリペプチドおよび組換えエステラーゼ、並びに、それらの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(式中、RはC1〜C6のアルキル基であり、R1はC1〜C4のアルキルであり、Xは塩素、臭素またはヨウ素である)で示されるラセミ化合物2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを立体選択的に分解することができる。
これらの特定のプライマーは、
である。
(式中、RはC1〜C6のアルキル基であり、R1はC1〜C4のアルキルであり、Xは塩素、臭素またはヨウ素である)で示されるラセミ化合物2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを分解するための、配列番号1に示す配列に対し少なくとも80%の同一性を有する、本発明のエステラーゼ活性を有するポリペプチドおよび組換えエステラーゼ(rAPLE)の使用に関する。
(式中、RはC1〜C6のアルキル基であり、AはH、R1(ここで、R1はC1〜C4のアルキルであってよい)またはR2(ここで、R2はR1とは異なるアルキル基である)であり、Xは塩素、臭素またはヨウ素である)で示される2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボン酸またはそのエステルは、式(I)
(式中、R、R1およびXは上で定義されたとおりである)
で示される2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルのエナンチオマー混合物を、水、または式R2OH(ここで、R2はR1とは異なるアルキル基である)で示されるアルコールの求核試薬としての存在下、本発明のポリペプチドまたは本発明のrAPLEによって変換し、
a)残存する、エナンチオマー的に濃縮された、式(II)においてAがR1である2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
b)アルコールが求核試薬として使用されている場合、得られた、エナンチオマー的に濃縮された、式(II)においてAがR2である2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
c)水が求核試薬として使用されている場合、得られた、式(II)においてAがHである2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボン酸を分離する
ことによって得ることができる。
新しく食肉処理されたブタの肝臓0.7g(地域の食肉処理場から入手)を液体窒素中で凍結し、乳鉢でホモジナイズし、放出されたmRNAを、Fast Track mRNA extraction kit 2.0(Invitrogen、カールスバッド(Carlsbad)、カリフォルニア州(Calif.)、米国(USA))を使用し、製造者によって作成された説明書(Fast Track 2.0 kit manual;バージョンJ;082301;25−0099)にしたがって、分離または抽出した。抽出により、全量12.9μgのmRNAが得られた。
GenBankアクセス番号X63323(マツシマ(Matsushima)ら、1991年)のブタ肝臓エステラーゼ遺伝子配列をベースに、特定のプライマーを調整した。
公知のタンパク質PLEおよび本発明のタンパク質rAPLEを分泌発現させるために、PLEおよびAPLEの配列がクローニングベクターpPICZ α(Invitrogen)のα因子開始配列に、N−末端で結合しているベクターを構築した。さらに、C−末端テトラペプチドHAELを欠失させた構築体を作製した。
実施例3で得られたオーバーラップ伸長PCR生成物を、Qiaquick kit(Qiagen、Hilden、ドイツ)を使用し、付属のマニュアルに従って精製した。約0.1μgの精製PCR生成物を、EcoRI制限エンドヌクレアーゼを使用して切断し、EcoRI開裂点を介して、プラスミドベクターpGAPZ A(Invitrogen)にクローニングした。
pGAPZ A PLE−ER、pGAPZ A PLE+ER、pGAPZ A APLE−ER、pGAPZ A APLE+ERのプラスミドを、P.パストリス(P.pastoris)X−33に形質転換した。形質転換は、InvitrogenのPichia Expressions kit取扱説明書に従って行った。形質転換体を、100mg/lのゼオシン(zeocin)を含有するYPDプレート(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%D−グルコース、2%寒天)上で選別した。100mg/lのゼオシンを含有するYPDプレート上へ、52個のゼオシン耐性クローンをストリークし、15%グリセロール中で保存した。
100mg/lのゼオシンを含有するYPDプレート上で、P.パストリス(P.pastoris)形質転換体を、30℃で48時間培養した。細胞をWhatman 541 hardened ashless 70mmφ filter上に採り、空気乾燥させた。呈色反応によりエステラーゼ活性体を可視化するために、6mgのα−ナフチルアセテート(Sigma、500mμlのアセトンに溶解)、2.5mgのテトラアゾ化o−ジアニシジン(Fast Blue Salt BN、Sigma、125μlの水に溶解)および5mlの、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7)からなる溶液とともに、フィルターをインキュベートした。
実施例6に記載したように、100mg/lのゼオシンを含有するYPDプレート上で、P.パストリス(P.pastoris)形質転換体を、30℃で48時間培養した。細胞をWhatman 541 hardened ashless 70mmφ filter上に採り、空気乾燥させた。フィルターを、基質溶液A(ラセミ化合物メチル5−クロロ−2−(1−メチルエチル)−4−ペンテノエート100μl、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8)200μl、10mg/mlフェノールレッド150μl、DMSO450μl、H2O650μl)または基質溶液B(ラセミ化合物に代えてメチル(2S、4E)−5−クロロ−2−(1−メチルエチル)−4−ペンテノエートを使用する以外は溶液Aと同じ)とともにインキュベートした。基質に特異的なエステラーゼ活性により、エステル基質の加水分解で酸が放出される結果、pHが低下し、それによりフェノールレッド指示薬の色が黄色に変化する。
10μlの2×SDSサンプル緩衝液(125mMトリス塩酸、pH6.8;4%SDS、20%グリセロール、5%β−メルカプトエタノール、0.05%ブロモフェノールブルー)を、10μlの商業的に入手可能なブタ肝臓エステラーゼ、または、pGAPZ A APLE−ERもしくは空のpGAPZ Aプラスミド(コントロール菌株)を含有するP.パストリス(P.pastoris)培養物(2リットルのバッフル付アーレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコ内、250mlのYPD培地中、100rpm、28℃で72時間)の60倍濃縮(SartoriusのCentricon Ultrafiltrations−Spin Columns)上澄み10μlに加えた。
制限エンドヌクレアーゼXhoIにより、プラスミドpGAPZ A PLE−ER、pGAPZ A PLE+ER、pGAPZ A APLE−ER、pGAPZ A APLE+ERを切断し、APLEおよびPLEをコードするそれぞれのフラグメントを、ERリテンションシグナルを有しているものも有していないものも、XhoI開裂点を介して、pPIC9ベクター(Invitrogen)にクローニングした。制限エンドヌクレアーゼNcoIによるコントロール開裂を用いて、AOX1プロモータに対して、正しい方向のフラグメントをチェックした。AOX1プロモータを有するベクターを、実施例4でプラスミドに命名したように、pPIC9 PLE−ER、pPIC9 PLE+ER、pPIC9 APLE−ERおよびpPIC9 APLE+ERと命名し、SalIで直線化し、P.パストリス(P.pastoris)KM71に形質転換した。形質転換およびHis原栄養体の選別は、Invitrogenのピヒア(Pichia)発現キットの取扱説明書に従って行った。選別した形質転換体およびKM71菌株を、Invitrogenのピヒア(Pichia)発現キットに従って、完全培地上で終夜培養し、1%メタノールで48時間、誘導した。得られた培養物を、実施例7で記載した定性的pHシフト法を用い、それぞれの場合、混合物中の培養物2μlを試験することによって分析した。AOX1誘導プロモータのコントロール下での発現は、実施例7の構成的発現を記載した状況と比較すると、ラセミ化合物メチル5−クロロ−2−(1−メチルエチル)−4−ペンテノエートに対して非常に高いrAPLE酵素活性を示した。フェニルレッドの色の変化(赤から黄色)は、わずか数分後に検出することができた(図3)。意外にも、rAPLE活性は、C末端におけるERリテンションシグナルHAELの存在の有無に無関係であった。すなわち、ERリテンションシグナルを有するrAPLEを発現する細胞でさえ、活性を示した。対照的に、rPLEを産生する酵母菌株は、ラセミ化合物メチル5−クロロ−2−(1−メチルエチル)−4−ペンテノエートに対して全く活性を示さなかった。
Claims (9)
- エステラーゼ活性を有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列を示すポリペプチド。
- エステラーゼ活性を有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列を示す組換えタンパク質。
- 突然変異、欠失、挿入、伸長および/または融合の群からの通常の修飾によって修飾されたアミノ酸配列を示す請求項1〜3のいずれか一項に記載のエステラーゼ活性を有するポリペプチドまたは組換えタンパク質。
- 請求項1に記載のポリペプチド、または請求項2に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
- 配列番号2に示す配列を有するヌクレオチド配列。
- 請求項5または6に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列。
- エナンチオマー的に濃縮された式(II)
(式中、RはC1〜C6のアルキル基であり、AはH、R1(ここで、R1はC1〜C4のアルキルであってよい)またはR2(ここで、R2はR1とは異なるアルキル基である)であり、Xは塩素、臭素またはヨウ素である)で示される2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボン酸またはそのエステルを製造する方法であって、式(I)
(式中、R、R1およびXは上で定義されたとおりである)
で示される2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルのエナンチオマー混合物を、水、または式R2OH(ここで、R2はR1とは異なるアルキル基である)で示されるアルコールの求核試薬としての存在下、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは組換えエステラーゼによって変換し、
a)残存する、エナンチオマー的に濃縮された、式(II)においてAがR1である2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
b)アルコールが求核試薬として使用されている場合、得られた、エナンチオマー的に濃縮された、式(II)においてAがR2である2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
c)水が求核試薬として使用されている場合、得られた、式(II)においてAがHである2−アルキル−5−ハロペンタ−4−エンカルボン酸を分離する
ことを含む方法。
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