NO338247B1 - Fremgangsmåter for måling av kraften av glatirameracetat - Google Patents

Fremgangsmåter for måling av kraften av glatirameracetat Download PDF

Info

Publication number
NO338247B1
NO338247B1 NO20042816A NO20042816A NO338247B1 NO 338247 B1 NO338247 B1 NO 338247B1 NO 20042816 A NO20042816 A NO 20042816A NO 20042816 A NO20042816 A NO 20042816A NO 338247 B1 NO338247 B1 NO 338247B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
batch
glatiramer acetate
cells
reference standard
sample
Prior art date
Application number
NO20042816A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20042816L (no
Inventor
Ety Klinger
Original Assignee
Teva Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23326090&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO338247(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Teva Pharma filed Critical Teva Pharma
Publication of NO20042816L publication Critical patent/NO20042816L/no
Publication of NO338247B1 publication Critical patent/NO338247B1/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5428—IL-10
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/55—IL-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

OPPFINNELSENS FAGOMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for å standardisere målingen av effekten av glatirameracetat basert på T-cellers spesifikke gjenkjennelse av glatirameracetat. Fremgangsmåten utføres som angitt i krav 1 ved å måle effekten av en testbatch av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten av en referansebatch.
BAKGRUNN
Det er generelt ønskelig å standardisere målingen av effekten av farmasøytiske sammensetninger, da det foreligger en optimal effekt og kvalitet av aktiv bestanddel som er effektiv ved behandling av sykdommen den blir administrert for.
Glatirameracetat (GA, også kalt kopolymer-1 (Physician's Desk Reference), kopolymer 1, Cop-1 eller COPAXONE®), er et godkjent medikament for behandling av multippel sklerose (MS). Glatirameracetat består av acetatsalter av syntetiske polypeptider inneholdende fire naturlig forekommende aminosyrer (Physician's Desk Reference): L-glutaminsyre, L-alanin, L-tyrosin og L-lysin (Physician's Desk Reference) med henholdsvis en gjennomsnittlig molar fraksjon av L-glutaminsyre: 0,129-0,153; L-alanin: 0,392-0,462, L-tyrosin: 0,086-0,100; L-lysin: 0,300-0,374. Den gjennomsnittlige molarvekten av glatirameracetat er 4700-11.000 daltoner (Physician's Desk Reference). Glatirameracetat er kjemisk kalt L-glutaminsyrepolymer med L-alanin, L-lysin og L-tyrosin, acetat (salt) (Physician's Desk Reference). Dens strukturelle formel er:
(Physician's Desk Reference). Glatirameracetat er også skrevet som : poly[L-Glu<13>"<15>, L-Ala<39>"<46>, L-Tyr<8>'<6>"<10>, L-Lys30"37]' nCH3COOH.
Glatirameracetat ble vist å undertrykke eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) - en eksperimentell modell for multippel sklerose (MS) i forskjellige dyrearter (Lando et al., 1979; Aharoni, 1993). Undersøkelser av murin EAE antydet at beskyttelsen mot EAE er mediert ved T-celleaktivitet (Aharoni, 1993). Denne beskyttelsen fra aktiv induksjon av EAE av mus ryggmargshomogenat hvor flere autoantigener er involvert, kunne adoptivt overføres til normale mottakere ved injeksjon av glatirameracetat-spesifikke T-suppresorceller (Aharoni, 1993). Daglig subkutan injeksjon av glatirameracetat ble i fase III kliniske studier funnet å forsinke progresjon av invaliditet og redusere tilbakefallshyppigheten i eksasserbasjons-remiterende multippel sklerose (Johnson, 1987). Fremgangsmåter for fremstilling av glatirameracetat er beskrevet i US patent nr. 3.849.550 og 5.800.808 og PCT internasjonal publikasjon nr. WO 00/05250.
Det er generelt akseptert at et høyt nivå antigenspesifisitet er et trekk ved T-celleaktivering. Immunforsvarets T-celler gjenkjenner immunogene peptider som kompleksert til hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II eller I molekyler, uttrykt på antigenpresenterende celler (APCer). Spesifisiteten av antigengjenkjenneise av T-celler er definert ved flere parametere: 1) T-cellereseptoraffinitet for MHC-peptidkomplekset; 2) primær sekvens til antigenpeptidet; og 3) synergieffekter av visse aminosyrekombinasjoner innen det antigene peptidet. Med utgangspunkt i gjeldende kunnskap vedrørende virkningsmekanismen for glatirameracetat antas det at den biologiske aktiviteten av glatirameracetat i MS blir mediert ved immunmodulering av T-celleaktivitet.
SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å måle effekten av en testbatch av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten fra en referansebatch av glatirameracetat som omfatter: a. å immunisere mellom 8 og 12 uker gamle (SJLXBALB/C)F1 hunnmus med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standard batchen b. å fremstille en primærkultur av T-celler fra musen ifølge trinn (a) 9-11 dager etter immunisering; c. å separat inkubere minst fem referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat på mellom 1 \ ig/ m\ og 25 \ ig/ m\ fra en referanse standardbatch; d. å inkubere minst to prøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra den primære kulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen;
e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden interleukin-2 skilt
ut fra cellene i hver prøve etter 18-21 timer med inkubasjon av hver prøve;
f. å korrelere mengdene interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med testbatchen av glatirameracetat med mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for så å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat,
hvori i hver prøve i trinn (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen, foreligger en tilsvarende referanse prøve inneholdende en vesentlig identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen.
Dette er en fremgangsmåte hvori seks referanseprøver blir inkubert separat i trinn (d).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å måle effekten av en testbatch av et glatirameracetat i forhold til den kjente effekten fra en referanse standardbatch av glatirameracetat som omfatter: a. å immunisere et testpattedyr med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen hvor pattedyret ikke er et menneske og pattedyret danner T-celler som er spesifikke overfor glatirameracetat referansestandarden; b. å fremstille en primærkultur av celler fra testpattedyret ifølge trinn (a) ved en forhåndsbestemt tid etter immunisering; c. separat å inkubere separat minst to referanseprøver, hvorav hver inneholder et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra en referanse standardbatch; d. å inkubere minst to prøver, hvorav hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen i trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde av glatirameracetat fra testbatchen;
e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden cytokin utskilt av cellene i hver prøve etter en forhåndsbestemt tidsperiode med inkubering av hver prøve;
f. å korrelere mengdene cytokin utskilt av prøvene inkubert med testbatchen av glatirameracetat med mengdene av cytokin utskilt av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat,
hvori i hver prøve i trinnene (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler i hver prøve er i hovedsak identisk, og hvori, for hver immuniseringsprøve inneholdende en på forhånd bestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen, det foreligger en tilsvarende referanseprøve som inneholder en i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1: Immunisering med GA RS (referansestandard). Primær kultur av LN-celler. IL-2 deteksjon med ELISA. Figur 2: Induksjon av GA-spesifikke T-celler. Primærkulturer av LN-celler avledet fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA eller med kun CFA ble dyrket i nærvær av økende konsentrasjoner GA RS. Etter inkubasjon over natten ved 37°C ble dyrkemediet samlet og undersøkt for IL-2 med ELISA.
Figur 3: Diagram av hemacytometer
Figur 4: Optimalisering av immuniseringsfremgangsmåten - kulturkilde og GA referansestandard (RS) doseeffekt. Primære kulturer av lymfeknute (LN) og miltceller ble avledet fra mus immunisert med 10 eller 250^g GA RS + komplett Freunds adjuvans (CFA). Cellene ble dyrket i nærvær av økende konsentrasjoner GA RS. Etter inkubasjonen ved 37°C over natten ble dyrkemediet samlet og undersøkt for IL-2 ved enzymtilknyttet immunsorbentassay (ELISA). Figur 5: Optimalisering av immuniseringsfremgangsmåten - adjuvans og doseeffekt. Primære kulturer av LN-celler avledet fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA eller med 10 mg GA RS + ufullstendig Freunds adjuvans (ICFA) ble dyrket i nærvær av økende konsentrasjoner GA RS. Etter inkubasjon ved 37°C over natten ble dyrkemediet samlet og undersøkt for interleukin-2 (IL-2) med ELISA. Figur 6: Effekten av immuniseringsperioden. Mus ble immunisert med 250^g GA RS i CFA og LN ble fjernet etter 9, 10 og 11 dager. Responsen av LN-cellene fra forskjellige grupper til forskjellige konsentrasjoner GA RS ble undersøkt in vitro ved å måle IL-2 utskillelse med ELISA. Figur 7: Effekten av dyrkemediet på GA-spesifikk T-cellerespons. Primære kulturer av LN-celler ble dyrket med forskjellige medier inneholdende enten 1% normalt museserum (NMS), 1% fetalt kvegserum, (FBS) eller definert cellekulturmedium (DCCM1). Cellene ble inkubert med økende konsentrasjon GA RS ved 37°C i 21 timer. Deretter ble dyrkemediet samlet og undersøkt for IL-2 med ELISA. Figur 8: Kinetikk av IL-2-utskillelse i respons til GA RS. En primær kultur av LN-celler ble fremstilt fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA. Cellene ble inkubert med 0, 0,5, 2,5 og 5 \ ig/ m\ GA RS ved 37°C i de anviste intervallene. Ved hvert tidspunkt ble en alikvot av 5 X 10<6>celler sentrifugert og supernatanten ble holdt ved -20°C. Alle prøvene ble undersøkt samtidig for IL-2 med ELISA. Figur 9: IL-2-stabilitet i dyrkemedia. En primærkultur av LN-celler ble fremstilt fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA. Cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av GA RS ved 37°C. Etter inkubasjon over natten ble supernatantene samlet og fordelt på to alikvoter. En alikvot ble straks undersøkt ved ELISA, mens den andre ble holdt ved -20°C i 7 dager før den ble undersøkt. Figur 10: Stabilitet av GA RS-løsning ved -20°C. En GA RS-løsning på 1 \ ig/ m\ ble fremstilt, fordelt på alikvoter og oppbevart ved -20°C. Doseresponsen av GA-spesifikke celler til GA RS-løsningen ble undersøkt ved nulltid (dato 1) og etter 5 måneder ved -20°C. Figur 11: Effekt av gjennomsnittlig molekylvekt (MW) på GA RS-spesifikk T-cellerespons. En primær kultur av LN-celler ble fremstilt fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA. Cellene ble dyrket i nærvær av to forskjellige konsentrasjoner av GA RS og GA "Drug Substance" (DS) med forskjellig molekylvekt. Etter inkubasjon ved 37°C over natten ble dyrkemediene samlet og undersøkt for IL-2 med ELISA. Figur 12 (A & B): Kryssreaktiviteten til GA RS-spesifikke T-celler med GA DS og "Drug Product" (DP) batcher. En primær kultur av LN-celler ble fremstilt fra mus immunisert med 250^g GA RS + CFA. De GA RS-spesifikke T-cellenes respons over for en annen GA DS-batch (figur 12A), over for en DA DP-batch og over for mannitol (figur 12B) ble sammenlignet med GA RS-batchens respons. IL-2 nivåer i dyrkemediet ble målt med ELISA. Figur 13: Kinetikk for GA RS-proteolyse med trypsin. GA RS ble proteolysert med tyroksin på tidspunktene som vist. De proteolyserte prøvenes aktivitet ble undersøkt med in vitro effekttesten. Figur 14: Reversfase høytrykks væskekromatografi (RP-HPLC) av GA før og etter proteolyse med trypsin. GA RS ble proteolysert med trypsin og den kromatografiske profilen av prøvene ble undersøkt med RP-HPLC. Figur 15: Kinetikk av GA RS proteolyse med kymotrypsin. GA RS ble proteolysert med kymotrypsin for de anviste tidspunktene. Aktiviteten til de proteolyserte prøvene ble undersøkt med in vitro effekttesten. Figur 16: RP-HPLC av GA før og etter proteolyse med kymotrypsin. GA RS ble proteolysert med kymotrypsin og den kromatografiske profilen av prøvene ble undersøkt med RP-HPLC.
DETALJERT BESKRIVELSE
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning omfattende glatirameracetat, hvor fremgangsmåten omfatter å fremstille en batch av glatirameracetat som skal testes samt å måle effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten av en referanse standardbatch av glatirameracetat ved en fremgangsmåte som omfatter: a. å immunisere mellom 8 og 12 uker gamle (SJLXBALB/C)F1 hunnmus med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen; b. å fremstille en primær kultur av T-celler fra den immunisere musen ifølge trinn (a); c. å separat inkubere minst fem referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat på mellom 1 \ ig/ m\ og 25 \ ig/ m\ fra referanse standardbatchen; d. å inkubere minst to prøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen av trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra batchen av glatirameracetat;
e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden interleukin-2 skilt ut fra cellene i hver prøve etter 18-21 timer med inkubasjon av an slik prøve;
f. å korrelere mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med batchen av glatiramracetat med mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat,
hvori i hver prøve i trinn (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra batchen av glatirameracetat, det foreligger en tilsvarende referanseprøve inneholdende en i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen. Den farmasøytiske sammensetningen fremstilles ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom den relative effekten av glatirameracetat ligger mellom 80% og 125% av effekten av referanse standardbatchen.
I en utførelse er seks referanseprøver inkubert separat i trinn (b).
Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning omfattende glatirameracetat, hvor fremgangsmåten omfatter å fremstille en batch av glatirameracetat som skal undersøkes og å måle effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til effekten av en referanse standardbatch av glatirameracetat ved en fremgangsmåte omfattende:
a. å immunisere et forsøkspattedyr med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen, hvor pattedyret ikke er et menneske og pattedyret danner T-celler som er spesifikke for glatirameracetat referansestandarden; b. å fremstille en primærkultur av T-celler fra forsøkspattedyret ifølge trinn (a) ved en på forhånd bestemt tid etter immunisering; c. å separat inkubere minst to referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen; d. å separat inkubere minst to referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen.
e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden av et cytokin skilt ut fra cellene i hver prøve etter en på forhånd bestemt tidsperiode med inkubasjon av hver prøve;
f. å korrelere mengdene cytokin skilt ut av prøvene inkubert med batchen av glatirameracetat med mengdene av cytokinet skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat,
hvori i hver prøve i trinn (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen foreligger en tilsvarende referanseprøve inneholdende en vesentlig identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referansebatchen.
Videre å fremstille den farmasøytiske sammensetningen ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom der relative effekten av batchen av glatirameracetat ligger mellom 80% og 125% av effekten av referanse standardbatchen I en utførelse er cytokinet et interleukin.
I en foretrukket utførelse er interleukinet interleukin-2.
I en ytterligere utførelse er interleukinet interleukin-6.
I en videre utførelse er interleukinet interleukin-10.
I en annen utførelse er cytokinet interferon-gamma.
I en annen utførelse er pattedyret en gnager.
I en ytterligere utførelse er gnageren en mus.
I enda en annen utførelse er musen en (SJLXBALB/C)F1 hunnmus.
I en videre utførelse er pattedyret fra omkring 8 til omkring 12 uker gammelt.
I en videre utførelse er cellene lymfeknuteceller.
I en utførelse er cellene miltceller.
Forliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av en batch glatirameracetat som er akseptabel for farmasøytisk bruk som omfatter: a. å fremstille en batch glatirameracetat;
b. å måle den relative effekten av batchen i henhold til fremgangsmåte.
c. å kvalifisere batchen som akseptabel for farmasøytisk bruk dersom den relative målte effekten er på mellom 80% og 125% av referansebatchen av glatirameracetat.
I tillegg omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av glatirameracetat som er akseptabelt for farmasøytisk bruk som omfatter å fremstille en batch glatirameracetat for deretter å måle den relative effekten av batchen i henhold til fremgangsmåten beskrevet over. Batchen må kvalifiseres som akseptabel for farmasøytisk bruk dersom den relative effekten målt er mellom 80% og 125% av referanse standardbatchen av glatirameracetat.
Den farmasøytiske sammensetning framstilles ved følgende framgangsmåte, der den farmasøytiske sammensetning inneholder glatirameracetat og framgangsmåten omfatter følgende:
- å oppnå en batch av glatirameracetat som skal undersøkes.
- å måle separat mengden av interleukin-2 som utskilles av en primær kultur T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C)F1 hunnmus immunisert med en bestemt mengde av en referanse standardbatch av glatirameracetat hvor en prøve inneholdende et forhåndsbestemt antall slike celler inkuberes ved nærvær av en forhåndsbestemt mengde av referansestandarden og hvor en prøve inneholdende det i hovedsak identiske forhåndsbestemte antall celler inkuberes ved nærvær av samme forhåndsbestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt, samt også å sammenligne mengdene av utskilt interleukin-2 som blir slik målt for å bestemme effekten av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt, og også å inkludere i den farmasøytiske sammensetning en batch kun dersom effekten således målt er mellom 80% og 125% av referanse standardbatchen.
Fremgangsmåten for å bestemme effekten av en batch av glatirameracetat omfatter å immunisere hunn (SJLXBALB/C)F1 mus med en definert mengde av en referanse standardbatch av en blanding av polypeptider, deretter å måle separat mengden av interleukin-2 som skilles ut av en primærkultur av T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C) Fl hunnmus immunisert med en definert mengde v en referanse standardbatch av glatirameracetat. Videre skal prøven inneholdende et på forhånd bestemt antall slike celler inkuberes ved nærvær av en på forhånd bestemt mengde av referanse standardbatchen. En prøve skal inneholde det i hovedsak identiske på forhånd bestemte antall av celler, og inkuberes ved nærvær av samme på forhånd bestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir testet, for å sammenligne mengdene av interleukin-2 som utskilles og som blir slik målt for derved å bestemme effekten av batchen.
Fremgangsmåten kan også benyttes for å bestemme hvorvidt en batch av glatirameracetat har en på forhånd bestemt effekt som er akseptabel for inkludering i en farmasøytisk sammensetning, og som omfatter å måle separat mengden av interleukin-2 som skilles ut av en primærkultur av T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C) hunnmus immunisert med en definert mengde av en referanse standardbatch av glatirameracetat, hvor en prøve inneholdende et på forhånd bestemt antall av slike celler inkuberes ved nærvær av en på forhånd bestemt mengde av referanse standardbatchen, og hvor en prøve inneholdende det det i hovedsak identiske på forhånd bestemte antall celler inkuberes separat ved nærvær av den samme på forhånd bestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt, for å sammenligne mengdene av interleukin-2 som utskilles og som blir slik målt for å bestemme effekten av batchen, og sammenligne effekten således målt med en på forhånd bestemt effekt for å hvorvidt batchen er akseptabel for inkludering i den farmasøytiske sammensetningen.
I følge den beskrevne fremgangsmåten er referanse standardbatchen er en batch av glatirameracetat med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7000 Da.
Fremgangsmåten for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning inneholdende glatirameracetat omfatter å oppnå en batch av glatirameracetat og måle effekten effekten av glatirameracetat i forhold til effekten av en referansestandard av glatirameracetat ved
a. å fremstille en primærkultur av T-celler fra (SJLXBALB/C)Fl hunnmus som er mellom 8 og 12 uker gamle immunisert med en på forhånd bestemt mengde av referansestandarden;
b. separat å inkubere referanseprøvene hvorav hver inneholder et på forhånd bestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (a) og en på forhånd bestemt mengde av referansestandarden mellom 1 ug/ml og 25 ug/ml; c. å inkubere minst to prøver hvorav hver inneholder et på forhånd bestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (a) og en på forhånd bestemt mengde av batchen av glatirameracetat; d. bestemme for hver prøve i trinn (b) og (c) mengden av interleukin-2 som skilles ut av T-cellene i hver prøve etter 18-21 timers inkubering av en slik prøve; og
e. korrelere mengdene av interleukin-2 som skilles ut av prøven inkubert med batchen av glatirameracetat med mengdene av interlaukin-2 som skilles ut av prøvene inkubert med referansestandarden for å bestemme effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til referansestandarden,
f. hvor i hver prøve i trinn (b) og (c) det på forhånd bestemte antall celler er i hovedsak identisk og hvor for hver prøve inneholdende en på forhånd
bestemt mengde av glatirameracetat, det finnes en tilsvarende referanseprøve inneholdende i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde av referansestandarden, og fremstille den farmasøytiske sammensetningen ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom dens relative effekt sålede målt er mellom 80% og 125% av effekten av referansestandarden.
Cellene er lymfeknuteceller, nærmere bestemt er cellene miltceller
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således standardiseringen av målingen av effekten av GA. Effekttesten bestemmer kvantitativt GAs biologiske aktivitet. Dette er den første visningen av en slik test noensinne. Denne standardiseringsmetoden er helt nødvendig for å vise reproduserbarheten vedrørende effekt og kvalitet for DS og DP mellom ulike batchproduksjoner. I forbindelse med denne søknaden viser DS til den aktive ingrediensen, dvs. GA. DP benyttes for å vise til sluttproduktet, dvs. Copaxone®, RS står for en batch med glatirameracetat med en gjennomsnittlig molekylvekt på omkring 7000 Da.
Foreliggende oppfinnelse utnytter observasjonen om at T-celler inkubert med cytokin, for eksempel IL-2, formerer seg i respons til dette cytokinet (Lisak et al., 1974).
Eksemplene under beskriver oppfinnelsen i detalj når det gjelder å vise hvordan visse spesifikke representative utførelser derav kan lages, materialene, apparatene og trinnene ved fremgangsmåten som skal forstås å være eksempler er ment å kun være illustrative.
EKSPERIMENTELLE EKSEMPLER
SKISSE FOR DEN GENERELLE FREMGANGSMÅTEN
Mus ble immunisert med 250^g GA RS i CFA. GA RS ble produsert som beskrevet i US patent nr. 5.800.808 eller PCT internasjonal publikasjon nr. WO 00/05250. GA RS ble valgt basert på kjemiske og biologiske egenskaper som er i midtområdet til Copaxone® som beskrevet over. Etter 9-11 dager ble en primærkultur av LN-celler fremstilt og cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av GA RS og med testprøver. Etter 18-21 timer inkubasjon ved 37°C i en C02-inkubator med en høy luftfuktighet, ble dyrkemediet hentet og IL-2-nivået ble målt ved ELISA. T-celleresponsen til hver DS-batch ble undersøkt ved to konsentrasjoner (innenfor det lineære området), og %-effekten av DS-batchen ble beregnet i forhold til den for GA RS-batchen.
EKSEMPEL 1: STANDARD FREMGANGSMÅTE
Formål
Formålet med denne fremgangsmåten var å bestemme den relative effekten av GA DS-batchen in vitro, ved anvendelse av GA RS-spesifikke T-celler.
Utstyr
Avtrekkskap, hamacytometer, kastbart dekkglass, celleteller sentrifuge, temperaturstyrt risteinkubator, fuktet, temperaturstyrt 5% C02-inkubator, lys og omvendt mikroskop, ELISA-avleser (450 nm-filter), fryser, kjøleskap, saks, tang, trinnpipette, 40-200^1 pipette, 200-1000^1 pipette, 5-40^1 pipette, elektrisk pipettestyrer, sterile glassprøyter og luerbroer.
Engangsutstyr
Kryorør, 96-brønns forbedret binding ELISA plate (Nunc, katalog nr. 442404), 96-brønns ikke-steril mikrotestplate (Falcon katalog nr. 3911), 24-brønns flat bunn sterilisert vevskulturplate (Nunc, katalog nr. 143982), petriskåler, Eppendorfrør (polypropylen), sterilisert pipetterør 200-1000 ul, pipetter, 2, 5 & 10 ml, laboratoriefrakk, hansker, 0,2 celluloseacetatfilter, filtreringssystem 200 ml (Corning, katalog nr. 430767) Kim Wipes® støtteplattform, 10 ml sprøyter, 21Gxl V- 2." nåler, insulinsprøyter og kombitipper 5 ml.
Materialer og reagenser
For immuniserinqsfremqanqsmåten
95% etanol (Bio Lab, katalog nr. 13680605, eller tilsvarende), 70% etanol fremsilt fra 95% etanol ved fortynning med destillert vann, fosfatbufret saltvann (PBS) x 1 (SIGMA, katalog nr. 3813, eller tilsvarende), CFA inneholdende 1 mg Mycobacterium Tuberculosis (MT) (H37Ra, ATCC 255177), (SIGMA, katalog nr. F-5881 eller tilsvarende), og GA RS-batch.
For in vitro bioassavfremganqsmåten
95% etanol (Bio lab, katalog nr. 13680605, eller tilsvarende), 70% etanol fremstilt fra 95% etanol ved fortynning med destillert vann, trypan blå (BDH, katalog nr. 3407), DCCM1 ("Defined Cell Culture Media") (Beit Haemek, katalog nr. 05-010-lA eller tilsvarende), RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Beit Haemek, katalog nr. 01-100-lA), sterilisert L-glutamin 2mM x 100 (Bio Lab, katalog nr. 13.015), sterilt MEM (minimum nødvendig medium) - ikke-essensielle aminosyrer x 100 (Bio Lab, katalog nr. 11.080), sterilisert natriumpyruvat 1 mM x 100 (Bio Lab, katalog nr. 13.016), antibiotika/antisoppløsning 1 (Bio Lab, katalog nr. 13.020), 2-merkaptoetanol (SIGMA, katalog nr. M-7154), PBS (SIGMA, katalog nr. 3813), konkavalin A (Con A) (SIGMA, katalog nr. C-5275), MBP ("Myelin Basic Protein") peptid (87-99) (BACHEM, katalog nr. H-1964, eller tilsvarende) og GA RS.
For ELISA
IL-2 ble målt med ELISA-kitet: OptEIA™ Set: mus IL-2 (Pharmingen, katalog nr. 2614KI eller tilsvarende).
Dyr
Hunn (SJLXBALB/C)F1 mus mellom 8-12 uker gamle (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble anvendt, selv om hunn (BALB/C)F1 mus mellom 8-12 uker gamle fra andre kilder kan anvendes. Dyrehusene og stelleforholdene ble opprettholdt i spesifikke patogenfrie (SPF) forhold.
Løsninger
Immunisering
GA RS-emulsjon i CFA ble fremstilt under sterile forhold, dvs. i et avtrekksskap, ved anvendelse av sterilt utstyr og materialer.
Fremstilling av GA RS- løsning
Omkring 15 mg GA RS ble veid nøyaktig og oppløst i sterilt PBS til en konsentrasjon på 5 mg/ml.
Fremstilling av GA RS- emulsion
Like volumer GA RS-løsning (5 mg/ml) og CFA ble blandet. Blandingen ble overført til en steril glassprøyte koplet til en andre glassprøyte gjennom en luerbro. Blandingen ble blandet godt ved overføring fra en sprøyte til en annen til blandingen var godt emulgert. En stabil emulsjon ble bekreftet når en dråpe fløt på vann uten å dispergere.
Injeksjon
GA RS-emulsjonen ble overført til en insulinsprøyte. Deretter ble 100^1 av emulsjonen (250^g GA per mus) injisert i fire poter hos hver naiv mus (omkring 25^1 til hver pote). De immuniserte musene ble anvendt for in vitro testen 9-11 dager etter immunisering.
Fremstilling av en primær kultur av LN- celler
Den primære kulturen av LN-celler ble fremstilt 9-11 dager etter immunisering, i henhold til følgende fremgangsmåte.
Kirurgisk fremgangsmåte for fjerning av LN- celler
UV-lampen ble slått på 20 minutter før arbeidet i avtrekkskapet begynte og skrudd av når arbeidet ble påbegynt. Før reagenset ble plassert i avtrekksskapet ble arbeidsoverflatene vasket med 70% etanolløsning. Anriket DCCMl-medium ble fremstilt. Det anrikede DCCM1 og RPMI-mediet ble forvarmet ved 37°C før anvendelse. Musene ble avlivet ved halsforskyvning ("cervical dislocation"). Hver mus ble lagt på ryggen og festet til en støtteplattform. Magen ble sprayet med 70% alkohol og et midtre kutt ble laget (et 2 cm langt kutt var vanligvis tilstrekkelig). Huden ble gjennomskåret mot de bakre bena og LN ble lokalisert fra bakbena og forbena. LN ble overført til sterile petriskåler innholdende omkring 5 ml sterilt RPMI-medium, og LN-cellene ble trukket ut med et sterilt sprøytestempel. Den sterile sprøyten ble anvendt for å samle cellenes suspensjon fra petriskålen (innsamling av vevdebris ble unngått ved anvendelse av sterile nåler). Cellenes suspensjon ble overført til et 50 ml sterilt rør.
Celletelling: Eksempelfremgangsmåte fortelling av LN- celler derivert fra 5 immuniserte mus
Cellerøret ble fylt med RPMI-medium opp til 40 ml. LN-cellene ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur (15-25°C). Pelleten ble resuspendert med 40 ml RPMI. To alikvoter på 50^1 ble hver tatt fra cellenes suspensjon fortynnet fire ganger med 150^1 0,1% trypan blå i en mikrotestbrønn. Alikvotene ble blandet godt ved å pipettere forsiktig opp og ned. Hemacytometeret ble dekket med et dekkglass. En 50-200^1 pipette ble anvendt for å laste begge alikvotene på de øvre og nedre kamrene på hemacytometeret, en suspensjon i hvert kammer. Blandingen fikk stabilisere seg i kamrene i omkring 2 minutter. Det ble utøvd forsiktighet for ikke å introdusere bobler i kammeret. Blandingen (cellesuspensjon + trypan blå) fikk dekke hele kammerets overflate. Dersom bobler var tilstede i kammeret eller dersom det ble overlastet, ble hemacytometeret renset fullstendig og tørket med papirkluter og kamrene ble lastet på nytt.
De levedyktige cellene ble talt i den midterste firkanten (bestående av 25 større firkanter og 16 små firkanter hver, se figur 3) av de øvre og nedre kamrene. De levedyktige cellene absorberte ikke trypan blå og de var derfor særpreget ved et klart utseende. Døde celler var imidlertid gjennomtrengelige for trypan blå og var blå på farge. Celler som forekom på grensen til den midterste firkanten ble kun talt dersom en del av cellen faktisk var innenfor den midtre firkanten. Dersom en celle var på kanten og ikke innenfor den midtre firkanten i det hele tatt, ble den ikke telt. Celletettheten ble beregnet ved følgende ligning: Gjennomsnittlig antall levedyktige celler (begge kammer) x 4 x 10<4>= celler/ml
Cellene ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Cellene ble resuspendert til en tetthet på 1 x IO<7>celler/ml med anriket DCCM1.
In vitro bioundersøkelse
In vitro bioundersøkelsen ble utført i en 24 brønns, flatbunnet vevskulturtestplate ved et totalt volum på 1 ml.
Fremstilling av en GA RS- kalibrerinaskurve
En alikvot på 1 mg/ml GA RS-stamløsning ble tint. GA RS stamløsningen ble fortynnet til 100 \ ig/ m\ (10 ganger) med anriket DCCMl-medium og filtrert gjennom et 0,2 celluloseacetatfilter. Seks etterfølgende fortynninger med GA RS-løsningen med anriket DCCMl-medium ble fremstilt mellom 2 og 50^g/ml, som beskrevet i eksempelet i tabell 2.
Fremstilling av GA DS- fortvnninqer
Omtrent 10-20 mg GA DS fra batchen som skulle undersøkes ble veid nøyaktig og fortynnet med ddH20 til 1,2 mg/ml. OD minus nullresultatet fra løsningen ble målt ved 275 nm. Prøvens OD ble justert til omtrent 1,03 med ddH20 for å oppnå en stamløsning på 1 mg/ml GA. Stamløsningen på 100 \ ig/ m\ ble fremstilt med anriket DCCM1 og filtrert gjennom et 0,2 celluloseacetatfilter. Stamløsningen ble fortynnet til 10 og 20^g/ml som beskrevet i tabell 2 for RS-batchen.
Assavreaksion
Følgende ble tilsatt til den 24-brønns flatbunnede vevskulturplaten (se et eksempel av en platemodell under):
GA RS
0,5 ml LN-celler (endelig tetthet, for eksempel, 5 x 106 celler/brønn).
0,5 ml av hver GA RS-fortynning, følgelig var sluttkonsentrasjoner på GA RS i brønnene 25, 15, 10, 5, 2,5 og 1 \ ig/ m\.
GA DS- prøver
0,5 ml LN-celler (endelig tetthet, for eksempel, 5 x IO6 celler/brønn).
0,5 ml av hver prøve-fortynning, følgelig var sluttkonsentrasjoner på testprøven i brønnen 5 og 10 \ ig/ m\.
Hver prøve inkluderte følgende kontroller:
1) Negativ kontroll - LN-celler inkubert med et kontrollpeptid:
0,5 ml LN-celler (endelig tetthet 5 x IO6 celler/brønn)
0,5 ml MBP-peptidløsning (20 ug/ml) i anriket DCCM1 (endelig konsentrasjon 10 ug/ml) 2) Positiv kontroll - LN-celler stimulert med Con A (ikke-spesifikk T-cellestiumlerende middel):
0,5 ml LN-celler (endelig tetthet på 5 x IO6 celler/brønn)
0,5 ml Con A (5 \ ig/ m\) i anriket DCCM1 (endelig konsentrasjon 2,5 ug/ml)
Eksempel på en platemodell
Cellenes tetthet ble endret avhengig av deres respons til GA. Kulturene ble lagret ved 37°C i en fuktet 5% C02inkubator i 18-21 timer. Platen ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Supernatantene ble samlet i kryorør. Supernatantene ble delt opp i arbeidsalikvoter for å unngå repetert frysing/tining av prøvene. Supernatantene ble lagret ved -20°C i opp til 1 uke. Avtrekksskapet ble renset med 70% etanolløsning og tørket med papirkluter ("Kim wipes™"). Hanskene ble fjernet og hendene ble straks vasket med desinfiserende middel.
ELISA for IL-2-deteksjon
Alle prøvene ble undersøkt i triplikat. Hver platekjøring inkluderte følgende:
1) IL-2 standardkurve - inkluderende minst 6 ikke-null konsentrasjoner IL-2 2) Nullprøve + første antistoff, uten IL-2 standard, + andre antistoff (nullpunkt)
3) Prøver
Dyrkemdium av GA RS, testprøver og kontroller ble fortynnet med anriket DCCM1 som følger: a) en 2-ganger fortynning av 1 og 2,5^g/ml GA RS prøve og av den negative kontroll prøven; b) 5-10-ganger fortynninger av 5-25 \ ig/ m\ GA RS prøver og av testprøvene; og c) 15-20-ganger fortynning av den positive kontrollprøven (Con A).
ELISA-protokollen for måling av IL-2-nivåer ble utført ifølge produsentens
anvisninger. Dersom den optiske tettheten til noen av prøvene oppnådde de øvre eller nedre grensene til plateleseren, ble prøven analysert på nytt med en høyere eller lavere fortynning etter behov.
Beregninger og godtakelseskriterier
ELISA- målinqer
Gjennomsnittsabsorbansen ble trukket fra nullprøven (null IL-2 standardpunkt) fra absorbansen til standardene, prøvene og kontrollene. Gjennomsnittet (absorbans - nullprøven), standard avvik (SD) og relativt standard avvik (RSD) ble beregnet for hvert triplikatsett.
Prøvereplikater
Hver gang det ble fattet mistanke om en sterkt avvikende verdi var det nødvendig å sikre at den sterkt avvikende verdien var statistisk basert, for å kunne finne ut av eventuelle mulige problemer som kan ha påvirket sluttresultatene. Dersom RSD mellom triplikatmålinger ble høyere enn 10% og gjennomsnittlig OD - null var >
0,300, ble sterkt avvikende verdi forkastet ved anvendelse av Dixon Q-test. Dixon Q-test ble benyttet for å forkaste mulige sterkt avvikende verdier når det aktuelle godtakelseskriteriet ikke ble oppfylt i en test basert på replikater. Testen for sterkt avvikende verdier var gjeldende kun for replikatmålinger av samme standardløsning. For mindre enn 10 observasjoner kunne bare en sterkt avvikende verdi bestemmes og fjernes. Denne fremgangsmåten utvidet bruken av Dixon Q-test i forkasting av sterkt avvikende verdier fra ethvert antall replikatmålinger mellom 3 og 7 med et konferensintervall på 95%.
Fremgangsmåte
Den antatte sterkt avvikende verdien ble designer Xi. Alle andre målinger ble merket i forhold til den antatte avvikende verdien, for eksempel var X2den neste verdien som var antatt å være en avvikende verdi, X3var den andre verdien som var antatt å være en avvikende verdi, Xkvar den mest avvikende verdien fra den antatte avvikende verdien og Xk_ivar verdien som var den andre fra den som var lengst bort, osv.
For 3-7 replikater ble følgende ligning benyttet:
En egnet k-verdi ble bestemt fra den beregnede fraksjonen ved anvendelse av tabell 3.
Dersom ingen sterkt avvikende verdier ble identifisert ved Dixon Q-test, men prosentforskjellen mellom to av de tre replikatene ikke var mer enn 10%, ble de to nærmeste replikatene benyttet for å beregne prosenteffekten. Ellers ble ELISA-testen kjørt på nytt fra denne prøven. Sterkt avvikende verdiforkasting fra prøvene med OD < 0,300 (nullprøven, negativkontroll og lave standardpunkter) ble anvendt. Når en sterkt avvikende verdi ble funnet, ble den forkastet og rapportert. Duplikatmålinger ble benyttet for beregning av prosenteffekt.
Nullprøver
Absorbansen for hver av nullprøvene var under eller lik 10% av gjennomsnittsabsorbansen til IL-2-standardens høyeste konsentrasjon. Dersom en av nullprøvereplikatene var over de øvre grensene, ble den forkastet og duplikatprøver ble benyttet.
IL- 2- standard kurve
IL-2-standardkurven ble tegnet som en graf ifølge produsentens anbefalinger. IL-2-standarder som viste dårlig sensitivitet eller prøvebearbeidelsesfeil ble også forkastet dersom et minimum på seks ikke-null konsentrasjon IL-2-standarder ble
værende i kurven. Den tilbakeberegnede standardkonsentrasjonen hadde en relativ feilmargin (RE) på mer enn 20% for det nedre kalibreringspunktet og ±15% for alle øvrige konsentrasjoner. IL-2-kalibreringskurven ble konstruert fra minst seks ikke-null konsentrasjonspunkter (minst 17 kalibreringspunkter), som dekket det området av forventede konsentrasjoner. Standardkurveområdet var i stand til å bli forkortet dersom høye eller lave konsentrasjoner sviktet. R<2>for den lineære regresjonskurven var >0,97.
Assaykontroller
Konsentrasjonen til IL-2 ble beregnet i alle prøvene fra den lineære regresjonsgrafen for IL-2-standarden, ved anvendelse av ligningen for den lineære regresjonskurven. Sluttkonsentrasjonen for IL-2 ble beregnet for alle prøvene ved å multiplisere med prøvens fortynn i ngsfaktor.
Negativ kontroll ( MBP- peptid)
Sluttkonsentrasjoner! til IL-2 i minst to av tre replikater av negativ kontrollprøve var under nivåene til IL-2 målt for det laveste kalibreringspunktet av GA RS-kurven.
Positiv kontroll ( Con A)
Sluttkonsentrasjonen til IL-2 i minst to av tre replikater av den positive kontrollprøven var like eller over nivået til IL-2 ved det høyeste kalibreringspunktet av GA RS-kurven.
Beregning av relativ effekt av GA DS-batcher
GA RS- kurven
GA RS-kurven ble tegnet på en log-log-graf, med log IL-2-konsentrasjon på y-aksen og log GA RS-konsentrasjon på x-aksen. Kalibreringskurven ble konstruert fra minst fem ikke-null konsentrasjoner (minst 14 kalibreringspunkter). Kalibreringspunktene ble forkastet som beskrevet overfor IL-2-standardpunkter. Regresjonskurven med beste tilpasning ble beregnet gjennom standardpunktene. R<2>var >0,97. Stigningen (P) var<>>0,77.
Parallellismeanalyse
Dose-responskurven for hver testprøve ble tegnet på en log-log skalagraf, med log IL-2-konsentrasjon på y-aksen og log GA DS-konsentrasjon på x-aksen. Regresjonskurven for best tilpasning ble beregnet gjennom prøvepunktene. Stigningen (P<*>) var innen følgende område: p x 0,635 < p<*>< p x 1,365
Dersom p<*>var utenfor grensene, ble in vitro testen repetert i duplikat (to separate prøvefremstillinger). Dersom p<*>sviktet i en ny undersøkelse ble batchen forkastet. Dersom p<*>i begge de nye testene var innenfor grensene, ble prosenteffekt og 95% avlesningsgrenser bestemt.
Beregning av prosenteffekt for avlesningsqrensene
Estimatet av tilfeldige feil som skal benyttes for å bestemme avlesningsgrensene (som har en 95% sannsynlighet for å inkludere "sann prosenteffekt") ble tilveiebrakt ved anvendelse av ANOVA. Denne statistiske metoden deler totaIvahansen mellom observerte responser i separate bestanddeler, nemlig:
1. grunnet lineær doserespons }
2. grunnet gjennomsnitt av preparasjonen } Modell
3. grunnet avvik fra parallellisme }
4. grunnet avvik fra linearitet }
5. grunnet residuvarians mellom Tilfeldig
replikatene } feil
Bestanddelene 3 og 4 ble inkludert i tilfeldig feil-uttrykket på grunn av ikke-signifikante avvik fra henholdsvis linearitet og parallellisme. Totalsummen av kvadratene ble fordelt på tre bestanddeler (SS-regresjon, SS-preparasjon og SS-feil), og et passende antall frihetsgrader og F-testen for signifikans.
Den undersøkte batchens prosenteffekt og den beregnede effektens 95% avlesningsgrense ble beregnet som beskrevet under: Bereoningsalgoritme for beregning av relativ effekt oo 95% avlesningsgrensene
Trinn 1: Beregning av transformasjonen av gitt data (GA, batch og GA, RS) til logi0 skala:
Yki = logio(responsk|); i=l,...nk
Xki= logio(dosek|); i=l,... nk
hvor k=l,2 er en fremstillingsindeks av henholdsvis GA batch og GA RS, r\ iog n2er totalt antall målinger utført for henholdsvis GA-batch og GA RS. Således er N=ni+n2lik totalt antall observasjoner.
Trinn 2: Beregne felles stigning for lineær regresjon basert på alle målte datapunkter via formelen:
hvor Y er en total gjennomsnittsverdi for logi0(respons);
X er en total gjennomsnittsverdi for logi0(dose).
Trinn 3: Beregne totalen av kvadrater grunnet regresjon på log10(dose) som:
Trinn 4: Beregne tilfeldig error total av kvadratene som:
hvor Yk, Xker henholdsvis gjennomsnittlige loglO(respons) og loglO(dose) verdier for preparatet k.
Trinn 5: Beregne det gjennomsnittlige kvadratfeiluttrykket som følger:
DFERR(tilfeldig feil frihetsgrad)=N-3;
MSerr=SSerr/DFerr
Trinn 6: Bruk av statistiske tabeller for t-fordeling for å finne egnede verdier for t-statistikken:
t=t(0,975,DFERR).
Trinn 7: Beregne punktestimatet for den relative effekten som følger:
Trinn 8: Beregne ekspresjonen merket C i formelen:
Trinn 9: Beregne logaritmene for nedre og øvre grenser for 95% avlesningsintervallet:
Trinn 10: Transformere verdiene beregnet i det foregående trinnet til den opprinnelige skalaen ved å ta antialgoritmer fra de resulterende log-grensene og multiplisere med 100%
Beregnet effekt av GA DS-batchen var ikke mindre enn 80% og ikke mer enn 125% av den oppgitte effekten. Avlesningsfeilgrensene (P=0,95) for beregnet effekt var mindre enn 70% og ikke mer enn 143% av den oppgitte effekten. Dersom batchen var utenfor disse grensene ble in-vitro-testen repetert to ganger. Dersom resultatene av begge omtestene var innenfor spesifikasjonene, ble batchen akseptabel. Dersom en omtest sviktet, ble batchen forkastet.
Dokumentasjon
LN-cellelinjetellingen og ELISA-platemønsterene ble skrevet ned. Den originale ELISA-avlesningsdokumentasjonen og resultatskjemaet ble arkivert.
EKSEMPEL 2: UTVIKLING AV STANDARDFREMGANGSMÅTE FOR EKSEMPEL 1
Eksperiment 2A: Profil av cytokiner utskilt fra GA RS-spesifikke T-celler
LN-cellene ble avledet fra hunn (SJLx BALB/QFl mus immunisert med 250 GA RS i CFA 9-11 dager tidligere, ble dyrket i nærvær av forskjellige konsentrasjoner GA RS. Cellene ble inkubert med GA RS i 18-24 timer ved 37°C i en 5% C02-fuktet inkubator. Kulturene ble deretter sentrifugert og supernatantene samlet og undersøkt for cytokiner ved ELISA.
ELISA ble utført ved anvendelse av biotinylerte antistoffer spesifikke for cytokiner og strepavidin-pepperrotperoksidase (HRP) konjugert for deteksjon. Hver plate kjørt inkluderte en nullkontroll (første og andre antistoffer uten cytokinstandard). Hver plate kjørt inkluderte også kvalitetskontroll (QC) prøver (tre konsentrasjoner av cytokinstandard innenfor assayets lineærområde). Hver in vitro test inkluderte en positiv kontroll (Con A, et ikke-spesifikt T-cellestimulerende middel) og en negativ kontroll (ingen GA eller annet antigen). Alle cytokinene ble målt etter 18-24 timer inkubasjon. Nivåene på TGF-fJ, IL-10 og IL-4 ble undersøkt på nytt etter 72 timer inkubasjon. Resultatene er vist i tabell 4.
De maksimale nivåene målt for hver cytokin er gitt i ubestemte enheter: (-) < deteksjonsnivået, (+) opp til~400 pg/ml og (++) > 400 pg/ml. Tabell 4 viserat som svar på GA RS i kultur, skilte LN-celler ut IL-2, IFN-y, IL-10 og IL-6, mens TNF-a, IL-4, IL-13 og TGF-p ikke ble påvist i dyrkemediet. Disse resultatene viser at cytokinene produsert av GA RS-spesifikke T-celler er av Th0-typen. Det bør bemerkes at en Th0-profil blir observert i forskjellige immuniseringsprotokoller, dvs. immunisering med IFA eller med lave doser GA.
Siden IL-2 er en god markør for T-celleaktivering og siden utskillelse av IL-2 som svar på GA RS var svært reproduserbar med et lineært dose-responsforhold, så IL-2 ut til å være det optimale cytokinet for å måle T-celleaktivering.
Eksperiment 2B: Optimalisering av immuniseringsprosedyren
Flere eksperimenter ble utført for å etablere optimal immuniseringsprotokoll. Det første eksperimentet undersøkte effekten av GA RS (immuniserende antigen) dose på T-celleresponser i LN og i milten. Grupper på 10 mus ble immunisert med enten 250^g GA i CFA (gruppe 1) (som i EAE-blokkeringstesten) eller med 10^g GA i CFA (gruppe 2). Primære kulturer ble fremstilt fra både LN-cellene og miltene til de immuniserte musene. Kulturer ble inkubert natten over med forskjellige doser GA RS og deretter ble dyrkemediet samlet og undersøkt for IL-2 som i eksperiment 2A. Resultatene i figur 4 viser tydelig at i begge immuniseringsprotokollene er nivåene IL-2 utskilt fra LN-celler begge høye sammenlignet med de utskilt fra miltceller. Basert på disse resultatene ble det bestemt å benytte primærkulturer fra LN-celler for dette assayet. I tillegg påvirket ikke doser av GA RS injisert i mus T-celleresponsen i kultur. Både LN og miltcellene skilte ut lignende mengder IL-2 uavhengig av immuniserende dose GA RS. Dette viser at immuniseringsprosedyren er robust, og at selv store variasjoner i immuniseringsdosen av GA RS ikke påvirker det immunologiske utfallet.
For videre optimalisering av immuniseringsprotokollen ble en gruppe injisert med 250^g GA RS i CFA og den andre gruppen fikk 10 mg GA i ICFA. Dosen GA RS i den andre gruppen var høyere siden ICFA, en svakere adjuvans, ble benyttet. Ti dager senere ble responsen til LN-celler fra begge grupper til GA RS undersøkt in vitro. Figur 5 viser at immuniseringen med 250^g GA RS i CFA induserte en mye sterkere respons i kulturen til tross for at en mye lavere dose antigen ble benyttet.
Basert på disse funnene og på det faktum at 250 mg GA i CFA per mus er svært effektiv for å blokkere EAE (minst 80% blokkering av EAE i denne musestammen), ser 250^g/mus GA i CFA ut til å være den optimale dosen.
Spesifikke T-celler ble vanligvis fremstilt innen omkring ti dager etter en enkel immunisering med CFA. Figur 6 viser responsen av LN-celler til GA RS i kultur, fremstilt 9, 10 og 11 dager etter immunisering. Siden doseresponsen til IL-2-utskillelse var ganske lik alle dager, kunne immuniseringsperioden vare i 9-11 dager.
Eksperiment 2C: Optimalisering av in vitro testforholdene
Flere eksperimenter ble utført for å etablere den optimale fremgangsmåten for in vitro reaksjoner. Disse undersøkelsene inkluderte optimalisering av dyrkeforholdene, inkubasjonstid, stabiliteten av IL-2 i testprøvene og stabiliteten til GA RS ved -20°C.
i) Dvrkemedium
Kulturer av muselymfoidceller er vanligvis opprettholdt i RPMI-medium, supplert med 1% normalt museserum. Normalt museserum kan inneholde indogen IL-2 som kan detekteres ved anti-mus IL-2-monoklonale antistoffene benyttet i ELISA-kitet. I tillegg kan anvendelsen av forskjellige normalserum-batcher øke variasjonene ved in vitro testene fra dag til dag. For å unngå krysskontaminering med endogen mus IL-2, og for å redusere dag til dag variasjoner i fremgangsmåten, ble responsene til GA-spesifikke T-celler undersøkt i fire forskjellige medier: 1) RPMI + 1% normalt museserum (NMS); 2) RPMI + 1% fetalt bovinserum (FBS) (bovint IL-2 blir ikke gjenkjent av anti-mus IL-2 som benyttet i ELISA-kitet); 3) Biotarget (serumfritt medium produsert utelukkende av BeitHaemek, Israel); og
4) DCCM1 (serumfritt medium fremstilt av forskjellige produsenter.
Figur 7 viser resultatene av et representativt eksperiment som sammenligner responsen av LN-celler til GA RS i forskjellige dyrkemedium. De beste responsene ble observert når serumfritt medium ble benyttet. Doseresponsområdet ble forskjøvet til venstre i fravær av serum. Dette kan forklares ved tidligere studier som viser at GA binder til albumin og til andre serumproteiner. Denne bindingen kan redusere tilgjengeligheten av GA i kultur til interaksjoner med APCer og således blir høyere konsentrasjoner av GA nødvendig for å stimulere T-cellene. Basert på disse resultatene ser det optimale mediet ut til å være DCCM-1 medium.
ii) Kinetikk av IL- 2 sekresjon
IL-2 er en autokrin og parakrin vekstfaktor nødvendig for klonal T-celleformering for funksjonelle egenskaper av B-cellerog makrofager. Etter stimulering av GA RS-kulturen, blir IL-2 utskilt av aktiverte GA-spesifikke T-celler og deretter konsumert av LN-celler. Kinetikkundersøkelser av IL-2-sekresjon ble utført for å bestemme
optimal (topp) tid for samling av supernatanter etter stimulering med GA. LN-celler ble dyrket og inkubert med forskjellige konsentrasjoner GA RS ved 37°C i en fuktet C02-inkubator. Ved intervallene vist i figur 8 ble det tatt alikvotprøver, og cellene ble fjernet ved sentrifugering. Supernatantene ble holdt ved 20°C, og ved slutten av eksperimentet ble disse undersøkt for IL-2 med ELISA.
Figur 8 viser at toppen av IL-2-nivåer i dyrkemediet er på mellom 18 og 21 timer. Reduksjonen i IL-2-nivåer i prøvene samlet fra 24 til 48 timer kan forklares ved konsumpsjon av IL-2 ved LN-cellene. Den optimale tiden for supernatantsamling ser derfor ut til å være etter 18 til 21 timer inkubasjon.
iii) Måling av cytokiner
Denne fremgangsmåten hviler på nøyaktige målinger av IL-2 i prøvene av GA RS og testprøvene. Under eksperimentene ble IL-2-nivåene målt ved OptEIA (Pharmingen, katalog nr. 2614KI) - et ELISA-kit spesifikt for mus IL-2. Dette ELISA-kitet er svært sensitivt og resultatene er nøyaktige og reproduserbare.
iv) Stabiliteten til IL- 2 i testprøver ved - 20°C
I de fleste eksperimentene ble dyrkemediet samlet og holdt ved -20°C før det ble analysert med ELISA. Preliminære undersøkelser av stabiliteten til IL-2 i dyrkemedium viser at cytokinet er stabil i en uke ved -20°C (figur 9). Følgelig kan dyrkemediet til in vitro testprøvene holdes ved -20°C i opp til en uke før IL-2 blir målt. Resultatene av dette eksperimentet viste også at ELISA-resultatene er svært reproduserbare: IL-2-nivåene som ble målt i prøvene var praktisk talt identiske i to ELISA-platekjøringer som ble utført på to forskjellige dager med en ukes mellomrom.
v) Stabilitet av GA RS- løsning ved - 20°C
For å undersøke stabiliteten til GA RS-løsning ved -20°C ble doseresponsen av en GA RS-løsning undersøkt rett etter fremstilling og etter lagring i fem måneder ved - 20°C. Figur 10 viser at det er praktisk talt ingen forskjell i dose-responskurvene til GA RS-løsningen før og etter lagring i 5 måneder ved -20°C. Følgelig kan alikvoter av GA RS-løsning fremstilles og holdes ved -20°C i minst 5 måneder før bruk.
Eksperiment 2D: Bestemmelse av lineærområdet til GA RS-kalibreringskurver
Den statistiske bekreftelsen ble utført basert på GA RS-kalibreringskurver beregnet og vurdert separat for hver av de 21 platene som ble mottatt for analysen. Disse 21 prøvene ble samlet ved forskjellige tidspunkt over en tidsperiode på omkring 4 måneder. GA-konsentrasjonsområdet for de nevnte platene varierte fra 0,25 til 50 mg/ml. Kjernen til analysen bestod av følgende valideringskarakteristikker avledet fra GA RS-kalibreringskurver: 1. Optimal transformering for å sikre bredere grenser for det lineære området; 2. Bestemmelse av grensene for det lineære området; 3. Totalkriterier for å akseptere en kalibreringskurve; 4. Beregning av assaynøyaktighet og -presisjon;
5. Vurdering av duplikatspålitelighet (se avsnittet under).
Eksperimentenes egenskaper var slik at det vanligvis var 3 replikater (triplikater) ved hvert kalibreringspunkt. Når en triplikatmåling imidlertid ikke i noen tilfeller kunne tilveiebringes, ble vurderingen av duplikatpålitelighet en nødvendighet.
GA dose- responsforholdets linearitet
Utgangspunktet for de fleste trekkene ved valideringsdiskusjonen presentert under var en lineær regresjonsmodell som relaterte IL-2 konsentrasjonen (pg/ml) til GA-konsentrasjonen (^g/ml). Antagelsen av linearitet ved dette forholdet var nødvendig for egnet tilpasning av den lineære regresjonsmodellen. Dataene ble tegnet i en graf på en lineær-lineær skala. Det samme forholdet ble transformert på log-log-skala, samt en log-lineær-skala og en log-kvadratrot-skala. Log-log-transformeringen viste de mest egnede lineære trekk. Således var den valgte formen for regresjonsmodellen log-log-formelen:
Log10(IL-2 kons.) = a + fJ<*>Log10(GA kons.) + feil
Responsvariabelen var et log-transformert gjennomsnitt av de tre replikatene målt ved hvert kalibreringspunkt. Denne modellen ble tilpasset til hver kalibreringsprøve og egnede statistikker (R<2>, avskjæringspunkt og stigning) ble beregnet for hver tilpasset kurve. R<2->verdien gjenspeilet forholdet mellom residualsummen av kvadrater (RSS) og totalsummen av kvadrater (TSS) via formelen:
R<2>= 1-RSS/TSS
Lineær områdebestemmelse
Det lineære området ble bestemt basert på følgende kriterier:
1. Visuell inspeksjon av de tegnede logi0(IL-2-kons.) versus logi0(GA-kons.) på en graf; 2. Regresjonsinnvirkningsdiagnostikk, slik som Cooks, kjent innen fagområdet avstå ndsstatistikk; 3. Vurdering av variasjon av presisjon og nøyaktighetsverdier, regnet for kalibreringskurvene for flere mulige lineærområdedefinisjoner fra en visuell vurdering av lineariteten av forholdet. Det fantes ingen bevis for ikke-linearitet ved forholdet innen det valgte lineære området 1-25 \ ig/ m\.
Eksperiment 2E: Bestemmelse av kriteriene for GA RS-standardkurve
Valideringsparametrene avledet fra GA RS-kalibreringskurver, tilpasset valgte grenser (1-25^g/ml) av det lineære området, ble bestemt til å være følgende: 1. R<2>av de lineære regresjonstilpasningene av logi0(IL-2-kons.) til logi0 (GA-kons.) for hver plate i undersøkelsen; 2. stigninger og krysninger for disse rette linjetilpasningene;
3. nøyaktigheten beregnet for hvert kalibreringspunkt for hver plate; og
4. presisjon beregnet ved hvert kalibreringspunkt for hver plate.
For å beregne nøyaktighet og presisjon ble hver kalibreringskurve for å kalibrere (tilbakeberegne) GA-konsentrasjonene gitt verdiene til IL-2-konsentrasjonen:
X— 1 n(|o9 (IL_2 kons.) -cO/p
l-back —±V10 I
i = 1,2,3 - triplikatindeks
Det grunnleggende målet av (u)nøyaktighet benyttet var prosentforskjellen mellom gjennomsnittet av estimatene for konsentrasjonen og den sanne konsentrasjonen i triplikatprøvene:
unøyaktighet = ([gj.snitt (X|.back) - GA kons.]/GA kons.)<*>100%
Det grunnleggende presisjonsmålet benyttet var det relative standardavviket (RSD eller CV) for triplikatestimatene av konsentrasjonen:
presisjon = CV(X|.baCk) = [std.avvik (X|.back)/<g>j-snitt(X|.baCk)]<*>100%
Hensikten med analysen var å foreslå godtakelseskriterier for den tilpassede kalibreringskurven som sikret at nøyaktigheten og presisjonen ved fremgangsmåten var tilstrekkelig. Godtakelseskriteriene var basert på R<2>og stigningen av GA RS-kalibreringskurven. Omkring 80% av platene kunne karakteriseres ved litt unøyaktige verdier (<13%) og med god presisjon (1,1%-6,7%). For disse 16 standardkurvene "som oppførte seg ordentlig", ble følgende resultater oppnådd: 1. Høye R<2->verdier (>0,98); 2. Relativt høye stigningsverdier, som reflekterer doseresponsforholdene (>0,78 i 15 av 16 plater).
Siden flertallet av kalibreringskurvene blekarakterisert vedet relativt høyt R<2>(gjennomsnitt = 0,99) og ved relativt bratte stigninger (gjennomsnitt = 0,87), i motsetning til de ekskluderte platene som begge hadde relativt lave R<2>(gjennomsnitt = 0,94) og ganske flate stigninger (gjennomsnitt = 0,72), ble de totale godtakelseskriteriene for kalibreringskurver vurdert ut fra R<2>og stigning. Denne enkle regelen som definerer godtakelsesparametrene ble basert på beregningen av cut-off-punkter for stigningen og R<2>separat og lokaliserte dem på et midtpunkt mellom maksimalverdien for forkastede kurver (maks_R<2>= 0,95 maks_stigning = 0,77) og minimumsverdien for aksepterte kurver (min_R<2>= 0,98 min_stigning = 0,77). Godtakelseskriteriene ble således avledet som følger: 1. R<2>> 0,97;
2. Stigning > 0,77.
Disse kriteriene ble anvendt på minst fem forskjellige (triplikat) konsentrasjoner for å tilpasses kalibreringskurver innen området 1,25 \ ig/ m\ av GA-konsentrasjonen. I tillegg var området for avskjæringsverdiene på mellom 1,42 og 1,78, gjennomsnitt = 1,58. Dette området var likt for de 16 aktuelle og de 5 fjernede platene.
Nøyaktighet og presisjon ble beregnet for hver kurve og for hver konsentrasjon blant disse på platen. Det ble også regnet ut et gjennomsnitt for disse individuelle verdiene (for hver kurve og konsentrasjon): 1. forskjellige konsentrasjoner for hver kurve;
2. forskjellige kurver for hver konsentrasjon; og
3. over alle kurvene og konsentrasjonene.
Den relevante konklusjonen var at for GA RS-kalibreringskurver basert på minst fem forskjellige kalibreringspunkter i det lineære området 1-25 ug/ml, og når kalibreringskurven ble begrenset til å ha en R<2>> 0,97 og en stigning > 0,77 var den resulterende gjennomsnittsnøyaktigheten og presisjonene beregnet som: 1. den gjennomsnittlige SD) nøyaktighetsverdien for fremgangsmåten var: 8,0% ± 2,3%; og 2. den gjennomsnittlige (± SD) presisjonsverdien for fremgangsmåten var: 2,9% ± 1,7%.
Pålitelig hetsvurdering av GA RS kalibreringskurver basert på duplikatmålinger
En sammenligning av undersøkelsens nøyaktighet og presisjonsbeskrivende statistikker ble utført for å vurdere påliteligheten til GA RS-kalibreringskurvene tilpasset ved anvendelse av duplikatmålinger ved hvert kalibreringspunkt. I tillegg ble hver individuell nøyaktighets- og presisjonsverdi (for hver kurve og konsentrasjon) for alle tre mulige seleksjoner av duplikatmålinger, ut fra det gitte triplikatet undersøkt. Ved konsentrasjon av disse kurvene som tilfredsstilte godtakelseskriteriene beskrevet over og tilpasset innen grensene til det definerte lineære området på 1-25\ig/m\, var det åpenbart at når en triplikatmåling ikke kan benyttes av visse årsaker, kan det oppnås et godt resultat dersom dette erstattes med en duplikatmåling.
Den gjennomsnittlige (± SD) nøyaktigheten og presisjonen for fremgangsmåten basert på triplikater var henholdsvis 8,0% ± 2,3% og 2,9% ± 1,7% (tabell 5).
Den gjennomsnittlige (± SD) nøyaktigheten og presisjonen for fremgangsmåten basert på duplikatene var:
1. nøyaktighet: 8,1% ± 2,8%; presisjon: 2,5% ± 1,7%
2. nøyaktighet: 8,0% ± 2,5%; presisjon: 2,9% ± 2,1%; og
3. nøyaktighet: 8,4% ± 2,8%; presisjon: 2,4% ± 1,5%.
Eksperiment 2F: Bestemmelse av statistisk forhold
Det ble funnet at den gjennomsnittlige (u)nøyaktigheten av fremgangsmåten er 8,0% med SD = 2,3%. Hensikten var å utvikle en pålitelig test for stigningssammenligning av to log(dose)-log(respons) linjer av en ny GA-batch versus GA RS. Undersøkelsen tok høyde for (u)nøyaktigheten fra fremgangsmåten over. Den høyeste grensen for omkring det 95% individuelle toleranseområdet for den gjennomsnittlige (u)nøyaktigheten ved denne fremgangsmåten tjente som en terskelverdi: gjennomsnitt + 2<*>SD = 12,6%. Slik ble variasjoner innen området 12,6% ansett å ikke være signifikant.
En detaljert matematisk forklaring forforholdet mellom p<*>(stigningen av batchlinjen), p (stigningen til standardlinjen) og den høyeste tillatte (u)nøyaktige verdien følger. Uten å miste generalitet, vil kun det tilfellet hvor p<*>er høyere enn p bevises i detalj (på grunn av eksisterende symmetri vil forlengelse av beviset til tilfellet der p<*>< p være åpenbart). Den tilbakeberegnede doseverdien for en gitt log(respons) var:
Xback= 10(Y~a)/p hvorY = logio(IL-2 konsentrasjon).
Formelen for (u)nøyaktighetsberegningen var:
(u)nøyaktighet = [(10(Y a)/|3-Xsann) /X«n]<*>100%
Yiavog Yhøy var de laveste og høyeste (log)respons verdier tillatt ved den høyeste tillatte (u)nøyaktigheten av ± 12,6%.
Området der hypotesen for like stigninger kunne aksepteres var følgelig:
Grensene for likhet ved stigningene var følgelig:
Stigningen til en rett linje ble beregnet som følger:
P<*>= (Yhøy-Ylav)/(log X2-log X1)=[p-log([X2/X1]-[l,126/0,74])]/log(X2/X1)
p = [p-log(l#288)]/log(X2/X1) = p ■ (1 + logCl^SSyiogCXj/X!))
Dersom man for denne bestemte saken antar at X2/X1= 2 (for doseverdier på 5 og 10 \ ig/ m\), ble p<*>beregnet som følger:
Ved å kombinere dette resultatet med det som ble oppnådd fra det symmetriske tilfellet, hvor p<*>> p, ble grensene beregnet som:
I dataene gitt var alle stigningsverdiene innen de passende kritiske grensene, noe som betydde at ingen avvik fra parallellismeantagelsen ble observert.
Når en batch ble akseptert som statistisk gyldig (at linearitet og parallellisme hadde bevist å være til stede), ble effektforholdet av testpreparatet i forhold til standarden beregnet. Dette ble gjort i en parallell linjeassay ved å tilpasse rette parallelle linjer til dataene og å bestemme den vannrette avstanden mellom disse: hvor p står for effekten, Ys, YT, Xs, XTbetyr gjennomsnittlige log(responser) og log(doser) av henholdsvis standarden og testpreparatene. B - betyr en fellesstigning for standard og test log(dose) - log(respons) linjer. Det minste kvadratestimatet for den felles stigningen - B var et vektet gjennomsnitt av det minste kvad ratesti matet for to stigninger separat fra standardlinjen og testlinjen. Ved å ta antilogaritmen til standardlinjen og testlinjen, kunne det oppnås et punktestimat for "sann% effekt" for et testpreparat i forhold til dets standard:
EKSEMPEL 3: VALIDERING AV STANDARDFREMGANGSMÅTEN IFØLGE EKSEMPEL 1
Malet ved analysen presentert under var å etablere validerte frigjøringsspesifikasjoner for den relative effekten av en GA-batch. En GA-batch ble ansett som gyldig dersom følgende kriterier basert på statistisk konklusjon var oppfylt: 1. Ingen overtredelser av antagelsene involvert i
bioassayanalyseløsningsmåten:
a. uavhengighet og normalitet av log(responser);
b. homogenitet av varians av log(responser),
c. ingen sterkt avvikende verdier
d. parallellisme (ikke-signifikans av stigningsforholdtesten); 2. Punktestimatet av den relative effekten var innen det forhåndsbestemte området: 80% - 125%; og 3. 95% avlesningsgrensene for "sann relativ effekf-verdien var innen et bredere forhåndsbestemt konfidensintervall på 70% - 143%.
Modellen antok at standarden og testpreparatene burde oppføre seg som om den var en enkel fortynning av den andre. Dette betyr at log(dose) - responslinjene for de to preparatene ikke burde avvike vesentlig fra linearitet og parallellisme. Slik kunne en anti-logaritme av konstant horisonten forskyvning mellom disse rette linjene tjene som et estimat for effektforholdet. Disse to kravene, linearitet og parallellisme, utgjorde et konsept for assayvaliditeten. Validitetskontrollen var en forhåndsbestemt nødvendighet for estimatet av relativ effekt og dens avlesningsg renser.
Beregningen av tilfeldig feil var nødvendig for å beregne avlesningsgrensene for sannverdien av relativ effekt. Denne målingen ble oppnådd ved implementering av den statistiske metoden kjent som "Analysis of Variance" (ANOVA). Således må nødvendigvis de klassiske statistiske antagelsene for ANOVA ha vært tilfredsstillende. Kravene for den statistiske analysen av parallellinje bioassaymodellen var som følger: 1. Responsene var uavhengig normalt fordelt omkring sine forventede verdier; 2. Variansen av responsen var ikke påvirket av gjennomsnittsresponsverdien; 3. Det forelå ingen sterkt avvikende verdier ("outliers"); 4. Forholdet mellom log(dose) og respons kunne representeres ved en rett linje over doseområdet; og 5. Testpreparatets rette linje var parallell med standardens rette linje.
Batchanalysedataene ble oppnådd fra forskjellige eksperimenter utført forskjellige dager med forskjellige operatører. Valideringsforsøk av standard prosedyren ifølge eksempel 1 ble utført ved en serie eksperimenter, hver omfattende: 1. å immunisere mus med 250^g GA RS i CFA; 2. å fremstille en primær kultur fra LN-cellene 9-11 dager etter immunisering; 3. å inkubere LN-cellene med forskjellige konsentrasjoner av GA RS og med testforbindelsene; 4. å samle dyrkemedium og analyse av IL-2-nivåer med ELISA; 5. å tegne en GA RS-kurve baser på triplikat IL-2-målinger utført ved 6 dosenivåer fra 1-25^g/ml; og 6. å sammenligne T-celleresponsen til hver testprøve med responsen av RS-batchen (i duplikat) ved to konsentrasjoner innen det lineære området (5 og 10 ^ig/ml).
Prosent CV ble også beregnet for hver triplikat for å detektere eventuelle problemer forbundet med variabilitet mellom triplikatene (normalt burde % CV mellom triplikater ikke overstige 10-15%). Ingen overtredelse av forholdene for de gitte dataene ble avslørt.
Valideringskarakteristikkene benyttet for å tilveiebringe en oversiktskunnskap av kapabiliteten ved den analytiske prosedyren var: linearitet, område, nøyaktighet, presisjon, spesifisitet og robusthet. Valideringskriteriene og analysene ble basert på ICH-konsensusveiledningen "Validation of Analytical Procedures: Methodology", november 1996 (CPMP/ICH/281/95). Statistiske metoder anbefalt i "European Pharmacopoeia" veiledningen ble tilpasset de aktuelle dataene for analyseformål.
Eksperiment 3A: Linearitet og område
I hver in vitro test ble en dose-responskurve av GA RS-batch anvendt for å beregne cellenes relative respons på prøvene som ble undersøkt. Hver kalibreringskurve inkluderte minst fem punkter (uten null). 22 kalibreringskurver samlet fra forskjellige in vitro tester utført under utviklings- og valideringstrinnene ble kartlagt og evaluert for hver plate.
Statistisk analyse av data avslørte at grafene av logi0(IL-2-konsentrasjon) versus logio(GA RS-konsentrasjon) ga den beste lineære tilpasningen. Det lineære området kom hovedsakelig frem ved visuell inspeksjon og vurdering av nøyaktighet og presisjon av kalibreringspunktene. Prosent RSD ble beregnet for hvert triplikat for å avsløre problemer forbundet med variabilitet mellom triplikatene (normalt burde ikke %RSD mellom triplikatene overstige 10-15%). Området for GA RS-kurven ble spesifisert mellom 1-25 \ ig/ m\.
Basert på disse analysene burde GA RS-kurven omfattes av minst 6 kalibreringspunkter, et med nullkonsentrasjon (negativ kontroll) og minst 5 GA RS-konsentrasjoner i området 1-25 \ ig/ m\. Lineær regresjon av logio(IL-2-konsentrasjon) versus log10(GA RS-konsentrasjon) burde ha en R<2>> 0,97 og en stigning > 0,77.
Eksperiment 3B: Nøyaktighet
Fremgangsmåtens nøyaktighet ble etablert for det spesifiserte lineære området av GA RS-kurven. Statistisk analyse av dataene avslørte at den gjennomsnittlige nøyaktigheten av fremgangsmåten var 8,0% ± 2,3%.
Eksperiment 3C: Presisjon
Det grunnleggende målet for presisjon benyttet var relativt standardavvik (RSD) av replikat (vanligvis triplikat) estimatet av konsentrasjonen.
RSD ble etablert over det lineære området av GA RS-kurver. Statistiske analyser av dataene avslørte at metodens gjennomsnittlige presisjonen var 2,9% ± 1,7%. Duplikatmålingspåliteligheten tilsvarte den for triplikat. Når et av de tre replikatene ble identifisert som en sterkt avvikende verdi, ble følgelig den sterkt avvikende verdien utelatt og resultatene fra duplikatmålinger ble akseptert.
Eksperiment 3D: Metodegjentagbarhet
Den GA-spesifikke T-celleresponsen til en GA DS-batch ble målt flere ganger, 3 ganger, i den samme in vitro testen. Tre vekter av den samme batchen som ble fortynnet til 5 og 10 \ ig/ m\ ble inkubert med GA-spesifikke T-celler. IL-2-nivåene i testforbindelsenes og GA RS prøvenes kulturmedium ble målt ved ELISA i triplikat. Prosenteffekt og 95% avlesningsgrenser for cellene for hvert replikat ble beregnet relativt til GA RS. Tabell 6 viser prosentrespons beregnet for hver replikat.
Eksperiment 3E: Intermediat presisjon
Prosentresponsen av en GA DS-batch ble undersøkt i tre forskjellige in vitro tester, utført forskjellige dager med tre forskjellige forskere fra samme laboratorium. Tabell 7 gir et sammendrag av %-effekten og 95% avlesningsgrensene bestemt for denne batchen i tre repeterte eksperimenter.
Eksperiment 3F: Metodereproduserbarhet
Metodens reproduserbarhet ble vurdert ved hjelp av undersøkelse mellom laboratorier, %-respons GA DS-batch ble undersøkt i to forskjellige eksperimenter utøvd i to forskjellige laboratorier som benyttet forskjellige analytikere, utstyr og reagenser. Tabell 8 gir et sammendrag av resultatene fra begge laboratoriene.
Basert på eksperimentene over kan det konkluderes at in vitro testen er reproduserbar.
Eksperiment 3G: Spesifisitet
Differensieringen ved fremgangsmåten ble undersøkt på tre nivåer.
1) Differensiering mellom prøver inkubert med/uten GA RS (matriks effekt); 2) Differensiering mellom GA RS og andre relaterte og ikke-beslektede proteiner og peptider, inkludert GA DS, og 3) Differensiering mellom GA RS og GA-relaterte kopolymerer, hvori peptidsekvensen har blitt modifisert med vilje.
i) Gjenkjennelse av GA RS med GA RS- spesifikke T- celler ( matriks effekt)
GA-spesifikke T-celler ble indusert ved immunisering av hunn (SJL x BALB/C) Fl mus med 250 g GA RS i CFA. Denne dosen GA blir vanligvis anvendt for å undersøke den biologiske aktiviteten av GA-batcher i denne musestammen ved anvendelse av EAE-blokkeringstesten. Kontrollgruppen i dette eksperimentet ble injisert med kun CFA. Ti dager etter immunisering ble LN-celler fjernet fra begge musegruppene. Cellene ble inkubert med GA RS 18-24 timer ved 37°C i en 5% C02-fuktet inkubator.
Deretter ble kulturene sentrifugert og supernatantene ble samlet og undersøkt for interleukin-2 (IL-2, et cytokin utskilt fra aktiverte T-celler) ved ELISA ved anvendelse av biotinylerte antistoffer spesifikke for IL-2 og streptavidin-pepperrot peroksidase (HRP) konjugat for deteksjon (figur 1). Hver plate som ble kjørt inkluderte en nullkontroll (første og andre antistoffer uten cytokinstandarden). Hver plate som ble kjørt inkluderte også kvalitetskontroll (QC) prøver (tre konsentrasjoner cytokinstandard innen assayets lineærområde). Hver in vitro test inkluderte en positiv kontroll (Con A, en ikke-spesifikk T-celle stimulans) og en negativ kontroll (ingen GA eller annet antigen). Figur 2 viser at LN-cellene fra mus immunisert med GA RS skiller ut IL-2 doseavhengig i respons til GA RS i kultur, mens LN-celler fra kontrollmusen ikke svarte til GA RS i kultur. IL-2-nivåene i de negative kontroll prøvene var vanligvis under eller nær ELISA-deteksjonsgrensen (omtrent 3 pg/ml). Disse IL-2-nivåene er alltid under nivåene utskilt fra det laveste kalibreringspunktet av GA RS (1^g/ml). Disse resultatene viser at utskillelse av IL-2 av GA-spesifikke T-celler er avhengig av GA.
ii) Evnen til å skille mellom beslektede og ikke- beslektede antigener
Evnen til å skille mellom beslektede og ikke-beslektede antigener (proteiner og enkle peptider) ble vist ved undersøkelse av responsen til GA RS-spesifikke T-celler mot forskjellige antigener in vitro. En primær kultur av LN-celler avledet fra hunn (SJLx BALB/C)Fl-mus immunisert 9-11 dager tidligere med 250^g GA RS i CFA. Den primære kulturen ble inkubert natten over med GA RS og med forskjellige andre antigener ved 37°C i en 5% C02-fuktet inkubator. Deretter ble kulturene centrifugert og supernatantene ble samlet og undersøkt for IL-2 ved ELISA som i eksperiment 3G(i).
Tabell 9 viser at i dette eksperimentelle systemet svarte GA-spesifikke T-celler ikke til verken human MBP (myelin basisk protein), MBP immundominant peptid pp. 87-99 (et encefalitogenisk peptid) eller dets analog pp. 87-99A|a96(et EAE suppressor peptid). Lysozym, et ikke-relevant basisk protein, ble heller ikke gjenkjent av de GA-spesifikke T-cellene. TV-35 og TV-109 var peptider med en molekylvekt på henholdsvis 3757 og 11727 (PCT internasjonalt publikasjonsnummer WO 00/18794). Disse peptidene hadde en definert sekvens omfattende de samme fire aminosyrene av GA (Ala, Glu, Lys, Tyr) i det samme molarforholdet som i GA. GA RS-spesifikke LN-celler svarte ikke til TV-35 og hadde en svært lav kryssreaktivitet med TV-109. Disse resultatene kan forklares ved observasjonen av at immunisering med GA RS induserte dannelsen av en blanding T-celler med forskjellige spesifisiteter mot flere T-celleepitoper som er tilstede i GA. TV-35 og TV-109 kan imidlertid dele fellessekvenser med GA og inkubasjon av GA-spesifikke T-celler med et enkelt peptid forårsaket sannsynligvis kun en delvis stimulering av en liten andel GA-spesifikke celler i kultur. Således var den totale T-celleresponsen (sekresjon av IL-2) under eller nær deteksjonsgrensene).
In vitro testen var sensitiv for GA-batchens gjennomsnittlige molekylvekt (MW).
Figur 11 viser responsen til GA RS-spesifikke celler over for GA RS (MW = 7900) og overfor GA DS-batchene som har ulik gjennomsnittlig molekylvekt. Som det kan ses korrelerte responsen i hovedsak med den gjennomsnittlige molekylvekten; jo høyere gjennomsnittlig molekylvekt, jo høyere respons. Det burde imidlertid bemerkes at frigjøringsspesifikasjoner for gjennomsnittlig molekylvekt av GA DS er 4700-10000, og at lignende verdier for IL-2 ble utskilt i respons til DS-batcher med gjennomsnittlig molekylvekt innen spesifikasjonene (figur 11). Disse resultatene viser at fremgangsmåten var svært spesifikk for GA og sensitiv over for endringer i den gjennomsnittlige molekylvekten til GA.
iin Gjenkjennelse av GA- stoffsubstans ( DS) oa Copaxone® stoffprodukt ( DP) av GA RS- spesifikke T- celler
9-11 dager etter immunisering av hunn (SJL x BALB/C)Fl-mus med 250^g GA RS i CFA ble LN-cellene fjernet og dyrket med forskjellige doser GA RS-batch (det immuniserende antigenet) og med en DS-batch.
IL-2 ble målt som i eksperiment 3G(i). Figur 12A viser at LN-cellene kryssreagerte med begge standardbatchene. Dose-responskurvene til IL-2-sekresjon (målt ved ELISA som over) av begge batchene var like, noe som viser at de undersøkte batchene delte lignende T-celleepitoper. Sammenligning mellom GA RS og en Copaxone®-batch viser at GA RS-spesifikke T-celler også kryssreagerte med DP-batchen og at mannitol, eksipiensen i Copaxone®-formuleringen, ikke påvirket eller forstyrret T-celleresponsene (figur 12B). Således omfatter fremgangsmåten en indikasjon av reproduserbarhet mellom batcher.
v) Evnen til å skille mellom GA og beslektede kopolvmerer
I ekspermiment 3G(ii) ble det vist at in vitro testen var sensitiv over for GA-peptiders gjennomsnittlige molekylvekt ved anvendelse av GA DS-batcher med forskjellig molekylvekt. Siden eksperimentet ble basert på biogjenkjennelse av GA ved GA-sepsifikke T-celler som svarer spesifikt til lineære sekvenser, ble det forventet at fremgangsmåten ville være sensitiv over for variasjoner/modifikasjoner i sekvensene av GA-peptider. Dette ble vist ved anvendelse av: 1) kopolymerer syntetisert fra kun 3 av de 4 aminosyrene omfattet av GA; 2) en GA-batch (XX) resulterende fra bestemt modifisering i fremstillingsforholdene, dvs. tilføyelse av overskytende frie aminosyrer til GA-monomerene under syntese. Den gjennomsnittlige molekylvekten til denne batchen var høy og utenfor sepsifikasjonen (molekylvekt = 11.150 Da), og 3) degraderingsproduktene av GA RS oppnådd ved proteolyse med trypsin og kymotrypsin.
Tabell 10 viser at GA-spesifikke T-celler ikke svarte til 3 aminosyrekopolymerer som manglet lysin, alanin eller tyrosin. I tillegg var prosentresponsen av cellene til batchen XX relativ høy og ut fra fremgangsmåtespesifikasjonene (100 ± 30%) viste dette at fremgangsmåten kunne være sensitiv over for modifikasjoner i produksjonsprosessen. En høy prosentrespons kan også forklares ved testens sensitivitet over for molekylvekten av GA-peptider, som vist. Kinetikkundersøkelser av GA RS-proteolyse ved trypsin og kymotrypsin viser at in vitro testen var sensitiv over for degradering av GA-peptider. Figurene 13 og 15 viser at utskillelse av IL-2 fra cellene ble redusert ved proteolysetiden, og at %effekten av cellene til de proteolyserte peptidene var utenfor fremgangsmåtens spesifikasjoner (100 ± 30%) (tabell 11). Overlagskromatogramer (ved RP-HPLC) av de degraderte prøvene (figurene 14 og 16) viste kinetikken av proteolyse med henholdsvis trypsin og kymotrypsin. De kumulative resultatene fra alle spesifisitetsundersøkelsene avslørte at fremgangsmåten var svært spesifikk for GA og skilte mellom GA og nært beslektede antigener.
Eksperiment 3G: Robusthet
i) Godtakelseskriterienes robusthet
De definerte godtakelseskriterienes samsvar og robusthet ble undersøkt ved å sammenligne de resulterende estimatene av relativ effekt skaffet fra repeterte GA-batcher. Batchanalysedataene inkluderte et antall repeterte GA-batcher. To batcher ble målt tre forskjellige dager med forskjellige operatører. En batch ble testet to forskjellige dager med forskjellige operatører.
I parallellismeundersøkelsen for de repeterte GA-batchene var alle GA-batchstigningsverdiene innen egnede kritiske grenser for
parallellismestigningsforholdtesten. Alle GA-batchene tilfredsstilte godtakelseskriteriene for punktestimatene til de relative effektverdiene med 95% avlesningsgrenser (beregnet %effekt var innen grensene på 80% til 125% og 95%
avlesningsgrensen var innen området 70% til 143%). For dataene som ble analysert for repeterte GA-batcher var validiteten ikke avhengig av dagen eksperimentet ble utført eller hvilken operatør som utførte testen. Disse resultatene støtter robustheten til de etablerte spesifikasjonene.
ii) Robusthet til kritiske parametere i immuniserinqsfremqanqsmåten og in vitro reaksjonen
Robustheten til kritiske parametere i både immuniseringsfremgangsmåten og in vitro reaksjonen ble vurdert. Kort fortalt er det vist at: 1) den immunologiske responsen til LN-celler ikke ble påvirket ved immuniseringsdosen av GA RS; 2) immuniseringinsperioden var 9-11 dager; 3) responsen av LN-celler til GA RS var høyere sammenlignet med miltcelleresponsen; 4) immunisering med GA RS + CFA resulterte i LN-celler uten å ha en sterkere respons sammenlignet med immunisering med ICFA; 5) nærværet av serum i dyrkemedium påvirket den GA-spesifikke T-celleresponsen kraftig, og slik ble in vitro reaksjonen utført i et serumfritt medium; 6) den optimale tidsrammen for å samle dyrkemedium var 18-21 timer etter inkubering med GA RS og testprøvene; og 7) dyrkemediet kan opprettholdes ved -20°C i opp til en uke før det undersøkes i ELISA. Det ble således vist at fremgangsmåten var robust.
Sammendragsstatistikker for punktestimatet og 95% avlesningsgrensene for relativ effekt
95% toleransegrenser for gjennomsnittlig relativ effekt
For å vurdere motakelsesgrensene for den beregnede relative effekten til en ny batch ble gjennomsnittet og standard avvik for de uavhengige log(effekt)-estimatene beregnet: Gjennomsnitt(Mi) = 0,0074;
SD(M|) = 0,402.
Et beregnet 95% toleranseområde for den gjennomsnittlige relative effektverdien basert på de analyserte dataene var:
P QgjennomsnltiM^.SDiM,) -j „ 1(x)% = jg^ X22%]
Område for 95% avlesnin<g>s<g>rensene for den relative effekten
Minimum og maksimumverdiene for 95% avlesningsgrensene for de uavhengige relative effektestimåtene var:
Minimum (nedre grense) = 79,3%
Maksium (øvre grense) = 147,3%
Tilfredsstillelse av mottakelseskriteriene
Basert på analysen ble godtakelseskriteriene bestemt å være:
1. Antakelsene involvert i bioassayanalysetilnærmingsmåten var tilfredsstilt, nemlig: a. uavhengighet og normalitet av log(responser);
b. homogenitet av variansen av log(responser);
c. ingen sterkt avvikende verdier; og
d. parallellisme (ikke-signifikans av stigningsforholdstesten).
2. Den beregnede relative effekten var ikke mindre enn 80% og ikke mer enn 125% av standardeffekten; og 3. 95% avlesningsgrensene for feilmarginen for den beregnede relative effekten var ikke mindre enn 70% og ikke mer enn 143% av standardeffekten.
Diskusjon av eksempel 3
Validering av in vitro testen avslørte at fremgangsmåten var reproduserbar og gjennomsnittsnøyaktigheten og presisjonen var innen et akseptabelt område. Fremgangsmåten var svært spesifikk for GA-peptidene og sensitiv over for kvaliteten til den aktive substansen.
OPPSUMMERING OG DISKUSJON
En in vitro fremgangsmåte ble utviklet for GA DS- og Copaxone®-batcher. Fremgangsmåten ble basert på biogjenkjennelse av T-celleepitoper (lineære sekvenser) av GA RS-spesifikke T-celler. GA RS-spesifikke T-celler skiller ut Th0-cytokiner i svar til GA i kultur. I denne fremgangsmåten blir gjenkjennelse av GA-batcher av T-celler overvåket ved å måle IL-2-nivåene i dyrkemedium ved ELISA-metoden. Det ble vist at GA RS-spesifikke T-celler er kryssreaktive med både DS-og DP-batcher, noe som viser at disse batchene deler lignende sekvenser med RS-batchen og at mannitol, eksipiensen i DP-formuleringen, ikke forstyrrer reaksjonen.
Fremgangsmåten var svært spesifikk for GA-peptider og er sensititv over for den gjennomsnittlige molekylvekten til peptidblandinger. MBP ble ikke gjenkjent av GA-spesifikke T-celler. MBP immundominante peptider (både encefalitogene og suppressive peptider), samt enkle peptider med aminosyresammensetninger som lignet de til GA, stimulerte ikke T-cellene. Kritiske parametere i immuniseringsprosedyren samt i in vitro reaksjonen ble optimalisert under dette eksperimentet. Eksperimentet viste at fremgangsmåten var svært reproduserbar og robust.
Fremgangsmåten kan tilpasses for å standardisere andre T-celle antigener for anvendelse i farmasøytiske sammensetninger. En primær kultur T-celler spesifikke for et antigen RS i stedet for GA RS kan lages fra dyr immunisert mot antigenet RS. Cytokin produksjon av denne kulturen i respons til antigen RS og i respons til prøveantigenet kan måles. Cytokinproduksjon i respons til antigen RS kan tegnes i en graf mot konsentrasjonen av antigen RS for å danne en standardkurve. Cytokinproduksjonen i respons til prøveantigenet kan sammenlignes med standardkurven for å bestemme om antigenet er innen det akseptable effektområdet.
Det optimale cytokinet for overvåkning kan bestemmes som i eksperiment 2A. Immuniseringsbetingelsene og in vitro testen kan optimaliseres som i eksperimentene 2B og 2C.
Referanser
US patent nr. 3.849.550, tildelt 19. november 1974 (Teitelbaum, et al.)
US patent nr. 5.800.808, tildelt 1. september 1998 (Konfino, et al.)
PCT søknad nr. WO 00/05250, publisert 3. februar 2000 (Aharoni et al.)
PCT søknad nr. WO 00/18794
Aharoni, R. etal., Eur. J. Immunol., (1993), 23: 17-25
Bornstein, et al., New Eng. J. Med., 1987, 317(7), 408-414
Lando etal., J. Immunol. (1979) 123(5): 2156-2160
Lisak et al., Cell. Immunol. (1974) 11:212-220
"Copaxone" i Phvsician' s Desk Reference, 2000, Medical Economics Co., Incl, Montvale, NJ, 3115
"Validation of Analytical Procedures: Methodology", nov. 1996 (CPMP/ICH/281/95) European Pharmacopoeia, 1997

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for å måle effekten av en testbatch av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten av en referansebatch som omfatter: a. å immunisere mellom 8 og 12 uker gamle (SJLXBALB/C)F1 hunnmus med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen b. å fremstille en primærkultur av T-celler fra musen ifølge trinn (a) 9-11 dager etter immunisering; c. å separat inkubere minst fem referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat på mellom 1 \ ig/ m\ og 25 \ ig/ m\ fra en referanse standardbatch; d. å inkubere minst to prøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen av trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen; e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden interleukin-2 skilt ut fra cellene i hver prøve etter 18-21 timer med inkubasjon av hver prøve; f. å korrelere mengdene interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med testbatchen av glatirameracetat med mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for så å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat, hvori i hver prøve i trinn (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen, foreligger en tilsvarende referanse prøve inneholdende en vesentlig identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori seks referanseprøver blir inkubert separat i trinn (d).
3. Fremgangsmåte for å måle effekten av en testbatch av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten av en referanse standardbatch som omfatter: a. å immunisere et testpattedyr med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen hvor pattedyret ikke er et menneske og pattedyret danner T-celler som er spesifikke overfor glatirameracetat referansestandarden; b. å fremstille en primærkultur av T-celler fra testpattedyret ifølge trinn (a) ved en forhåndsbestemt tid etter immunisering; c. separat å inkubere separat minst to referanseprøver, hvorav hver inneholder et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra en referanse standardbatch; d. å inkubere minst to prøver, hvorav hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen i trinn (b) og en forhåndsbestemt mengde av glatirameracetat fra testbatchen; e. å bestemme for hver prøve i trinnene (c) og (d) mengden cytokin utskilt av cellene i hver prøve etter en forhåndsbestemt tidsperiode med inkubering av hver prøve; f. å korrelere mengdene cytokin utskilt av prøvene inkubert med testbatchen av glatirameracetat med mengdene av cytokin utskilt av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat, hvori i hver prøve i trinnene (c) og (d) det forhåndsbestemte antallet celler i hver prøve er i hovedsak identisk, og hvori, for hver immuniseringsprøve inneholdende en på forhånd bestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen, det foreligger en tilsvarende referanseprøve som inneholder en i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning omfattende glatirameracetat, hvor fremgangsmåten omfatter a) å fremstille en batch av glatirameracetat som skal testes; b) å måle effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til den kjente effekten av en referanse standardbatch av glatirameracetat ved en fremgangsmåte som omfatter: i) å immunisere mellom 8 og 12 uker gamle (SJLXBALB/C)F1 hunnmus med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen ii) å fremstille en primær kultur av T-celler fra den immunisere musen ifølge trinn (i); iii) å separat inkubere minst fem referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (ii) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat på mellom 1 \ ig/ m\ og 25 \ ig/ m\ fra referanse standardbatchen; iv) å inkubere minst to prøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen av trinn (ii) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra batchen av glatirameracetat; v) å bestemme for hver prøve i trinnene (iii) og (iv) mengden interleukin-2 skilt ut fra cellene i hver prøve etter 18-21 timer med inkubasjon av an slik prøve; vi) å korrelere mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med batchen av glatiramracetat med mengdene av interleukin-2 skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat, hvori i hver prøve i trinn (iii) og (iv) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra batchen av glatirameracetat, det foreligger en tilsvarende referanseprøve inneholdende en i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen; og c) fremstille den farmasøytiske sammensetningen ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom den relative effekten av glatirameracetat ligger mellom 80% og 125% av effekten av referanse standardbatchen.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor de seks referanseprøvene blir inkubert separat i trinn (b).
6. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning omfattende glatirameracetat, hvor fremgangsmåten omfatter a) å fremstille en batch av glatirameracetat som skal undersøkes; b) å måle effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til effekten av en referanse standardbatch av glatirameracetat ved en fremgangsmåte omfattende: i) å immunisere et forsøks pattedyr med en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen, hvor pattedyret ikke er et menneske og pattedyret danner T-celler som er spesifikke for glatirameracetat referansestandarden ii) å fremstille en primær kultur av T-celler fra forsøkspattedyret ifølge trinn (i) ved en på forhånd bestemt tid etter immunisering; iii) å separat inkubere minst to referanseprøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen ifølge trinn (ii) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referanse standardbatchen; iv) å inkubere minst to prøver, hver inneholdende et forhåndsbestemt antall celler fra primærkulturen av trinn (ii) og en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra batchen av glatirameracetat; v) å bestemme for hver prøve i trinnene (iii) og (iv) mengden av et cytokin skilt ut fra cellene i hver prøve etter en på forhånd bestemt tidsperiode med inkubasjon av hver prøve; vi) å korrelere mengdene cytokin skilt ut av prøvene inkubert med batchen av glatirameracetat med mengdene av cytokinet skilt ut av prøvene inkubert med referanse standardbatchen av glatirameracetat for å bestemme effekten av testbatchen av glatirameracetat i forhold til referanse standardbatchen av glatirameracetat, hvori i hver prøve i trinn (iii) og (iv) det forhåndsbestemte antallet celler er i hovedsak identisk, og hvori det for hver prøve som inneholder en forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra testbatchen foreligger en tilsvarende referanseprøve inneholdende en vesentlig identisk forhåndsbestemt mengde glatirameracetat fra referansebatchen; og c) fremstille den farmasøytiske sammensetningen ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom der relative effekten av batchen av glatirameracetat ligger mellom 80% og 125% av effekten av referanse standardbatchen.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori cytokinet er et interleukin.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori interleukinet er interleukin-2.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori interleukinet er interleukin-6.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori interleukinet er interleukin-10.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori cytokinet er interferon-gamma.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori pattedyret er en gnager.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvori gnageren er en mus.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvori musen er en (SJLXBALB/C)F1 hunnmus.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori pattedyret er omkring 8 til omkring 12 uker gammelt.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori cellene er lymfeknuteceller.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 6, hvori cellene er miltceller.
18. Fremgangsmåte for fremstilling av en batch glatirameracetat som er akseptabel for farmasøytisk bruk omfattende: a. å fremstille en batch glatirameracetat; b. å måle batchens relative effekt ifølge fremgangsmåten ifølge krav 1 eller krav 2; og c. å kvalifisere batchen som akseptabel for farmasøytisk bruk dersom den relative effekten målt er mellom 80% og 125% av referansebatchen av glatirameracetat.
19. Fremgangsmåte for fremstilling av glatirameracetat akseptabel for farmasøytisk bruk omfattende: a. å fremstille en batch glatirameracetat; b. å måle batchens relative effekt ifølge fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 3 eller 7 - 17; og c. å kvalifisere batchen som akseptabel for farmasøytisk bruk dersom den relative effekten målt er mellom 80% og 125% av referanse standardbatchen av glatirameracetat.
20. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning inneholdende glatirameracetat og som omfatter: å oppnå en batch av glatirameracetat som skal undersøkes; å måle separat mengden av interleukin-2 som utskilles av en primær kultur T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C)F1 hunnmus immunisert med en bestemt mengde av en referanse standardbatch av glatirameracetat, a. hvor en prøve inneholdende et forhåndsbestemt antall slike celler inkuberes ved nærvær av en forhåndsbestemt mengde av referansestandarden, og b. hvor en prøve inneholdende det i hovedsak identiske forhåndsbestemte antall celler inkuberes ved nærvær av samme forhåndsbestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt; sammenligne mengdene av utskilt interleukin-2 som blir slik målt for å bestemme effekten av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt; og inkludere i den farmasøytiske sammensetning en batch kun dersom effekten således målt er mellom 80% og 125% av referanse standardbatchen.
21. Fremgangsmåte for å bestemme effekten av en batch av glatirameracetat, og som omfatter å immunisere hunn (SJLXBALB/C)Fl mus med en definert mengde av en referanse standardbatch av en blanding av polypeptider, å måle separat mengden av interleukin-2 som skilles ut av en primærkultur av T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C) Fl hunnmus immunisert med en definert mengde av en referanse standardbatch av glatirameracetat, a. hvor prøven inneholdende et på forhånd bestemt antall slike celler inkuberes ved nærvær av en på forhånd bestemt mengde av referanse standardbatchen, og b. hvor en prøve inneholdende det i hovedsak identiske på forhånd bestemte antall av celler, inkuberes ved nærvær av samme på forhånd bestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir testet; for å sammenligne mengdene av interleukin-2 som utskilles og som blir slik målt for derved å bestemme effekten av batchen.
22. Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en batch av glatirameracetat har en på forhånd bestemt effekt som er akseptabel for inkludering i en farmasøytisk sammensetning, og som omfatter å måle separat mengden av interleukin-2 som skilles ut av en primærkultur av T-celler oppnådd fra (SJLXBALB/C) hunnmus immunisert med en definert mengde av en referanse standardbatch av glatirameracetat, a. hvor en prøve inneholdende et på forhånd bestemt antall av slike celler inkuberes ved nærvær av en på forhånd bestemt mengde av referanse standardbatchen, og b. hvor en prøve inneholdende det det i hovedsak identiske på forhånd bestemte antall celler inkuberes separat ved nærvær av den samme på forhånd bestemte mengde av batchen av glatirameracetat som blir undersøkt; for å sammenligne mengdene av interleukin-2 som utskilles og som blir slik målt for å bestemme effekten av batchen; og sammenligne effekten således målt med en på forhånd bestemt effekt for å hvorvidt batchen er akseptabel for inkludering i den farmasøytiske sammensetningen.
23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 22, hvor referanse standardbatchen er en batch av glatirameracetat med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7000 Da.
24. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning inneholdende glatirameracetat omfattende å oppnå en batch av glatirameracetat og måle effekten effekten av glatirameracetat i forhold til effekten av en referansestandard av glatirameracetat ved a. å fremstille en primærkultur av T-celler fra (SJLXBALB/C)F1 hunnmus som er mellom 8 og 12 uker gamle immunisert med en på forhånd bestemt mengde av referansestandarden; b. separat å inkubere referanseprøvene hvorav hver inneholder et på forhånd bestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (a) og en på forhånd bestemt mengde av referansestandarden mellom 1 ug/ml og 25 ug/ml; c. å inkubere minst to prøver hvorav hver inneholder et på forhånd bestemt antall celler fra primærkulturen fra trinn (a) og en på forhånd bestemt mengde av batchen av glatirameracetat; d. bestemme for hver prøve i trinn (b) og (c) mengden av interleukin-2 som skilles ut av T-cellene i hver prøve etter 18-21 timers inkubering av en slik prøve; og e. korrelere mengdene av interleukin-2 som skilles ut av prøven inkubert med batchen av glatirameracetat med mengdene av interlaukin-2 som skilles ut av prøvene inkubert med referansestandarden for å bestemme effekten av batchen av glatirameracetat i forhold til referansestandarden, hvor i hver prøve i trinn (b) og (c) det på forhånd bestemte antall celler er i hovedsak identisk og hvor for hver prøve inneholdende en på forhånd bestemt mengde av glatirameracetat, det finnes en tilsvarende referanse prøve inneholdende i hovedsak identisk forhåndsbestemt mengde av referansestandarden, og fremstille den farmasøytiske sammensetningen ved å bruke batchen av glatirameracetat dersom dens relative effekt sålede målt er mellom 80% og 125% av effekten av referansestandarden.
25. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 20 - 24, hvor cellene er lymfe knuteceller.
26. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 20-24, hvor cellene er miltceller.
NO20042816A 2001-12-04 2004-07-02 Fremgangsmåter for måling av kraften av glatirameracetat NO338247B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33876701P 2001-12-04 2001-12-04
PCT/US2002/038859 WO2003048735A2 (en) 2001-12-04 2002-12-04 Processes for the measurement of the potency of glatiramer acetate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20042816L NO20042816L (no) 2004-09-06
NO338247B1 true NO338247B1 (no) 2016-08-08

Family

ID=23326090

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20042816A NO338247B1 (no) 2001-12-04 2004-07-02 Fremgangsmåter for måling av kraften av glatirameracetat

Country Status (22)

Country Link
US (6) US7429374B2 (no)
EP (1) EP1459065B1 (no)
JP (1) JP4369234B2 (no)
KR (1) KR100657048B1 (no)
CN (1) CN1308683C (no)
AT (1) ATE475883T1 (no)
AU (1) AU2002353059B2 (no)
CA (1) CA2469393C (no)
CY (1) CY1110878T1 (no)
DE (1) DE60237170D1 (no)
DK (1) DK1459065T3 (no)
ES (1) ES2349033T3 (no)
HK (1) HK1070421A1 (no)
IL (3) IL162127A0 (no)
IS (1) IS7286A (no)
MX (1) MXPA04005433A (no)
NO (1) NO338247B1 (no)
NZ (1) NZ533327A (no)
PT (1) PT1459065E (no)
SI (1) SI1459065T1 (no)
WO (1) WO2003048735A2 (no)
ZA (1) ZA200404472B (no)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2337688C (en) 1998-07-23 2016-04-05 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with copolymer 1 and related copolymers
ES2527760T3 (es) 1998-07-23 2015-01-29 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tratamiento de enfermedad de Crohn con copolímero 1 y polipéptidos
US6800287B2 (en) * 1998-09-25 2004-10-05 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
ZA200206457B (en) * 2000-02-18 2003-08-13 Yeda Res & Dev Oral, nasal and pulmonary dosage formulations of copolymer 1.
US20020077278A1 (en) 2000-06-05 2002-06-20 Yong V. Wee Use of glatiramer acetate (copolymer 1) in the treatment of central nervous system disorders
WO2002076503A1 (en) * 2000-06-20 2002-10-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treatment of central nervous system diseases by antibodies against glatiramer acetate
WO2003048735A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Processes for the measurement of the potency of glatiramer acetate
WO2005084377A2 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Combination therapy with glatiramer acetate and riluzole
CA2579656C (en) * 2004-09-09 2014-11-04 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for preparation of mixtures of polypeptides using purified hydrobromic acid
US7560100B2 (en) * 2004-09-09 2009-07-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, for treating neurodegenerative diseases
US8324641B2 (en) * 2007-06-29 2012-12-04 Ledengin, Inc. Matrix material including an embedded dispersion of beads for a light-emitting device
EP1827108B1 (en) * 2004-11-29 2015-04-08 Yeda Research And Development Co., Ltd. Induction of neurogenesis and stem cell therapy in combination with copolymer 1
UA93669C2 (ru) * 2005-02-02 2011-03-10 Тева Фармасьютикл Индастриз, Лтд. Способ приготовления полипептидной смеси c использованием гидрогенолиза
CA2596664A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-24 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Combination therapy with glatiramer acetate and rasagiline for the treatment of multiple sclerosis
CA2606194A1 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 Yeda Research And Development Company Markers associated with the therapeutic efficacy of glatiramer acetate
WO2008157697A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Copolymer assay
JP2011504925A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド 臨床的に確実な多発性硬化症の発症を遅延させる方法
EP2277050B2 (en) * 2008-04-16 2022-09-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Analysis of amino acid copolymer compositions
CZ30474U1 (cs) 2009-08-20 2017-03-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Glatiramer acetát a terapeutická kompozice s jeho obsahem pro použití k léčení s nízkou frekvencí ošetření
JP2013511724A (ja) * 2009-11-17 2013-04-04 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 血清タンパク質に基づく指向性配列ポリマー組成物の検出による、指向性配列ポリマー組成物の設計、生物学的利用性、及び有効性を改良するための方法
USRE49251E1 (en) 2010-01-04 2022-10-18 Mapi Pharma Ltd. Depot systems comprising glatiramer or pharmacologically acceptable salt thereof
US8759302B2 (en) 2010-03-16 2014-06-24 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Methods of treating a subject afflicted with an autoimmune disease using predictive biomarkers of clinical response to glatiramer acetate therapy in multiple sclerosis
NZ609938A (en) 2010-10-11 2015-11-27 Teva Pharma Cytokine biomarkers as predictive biomarkers of clinical response for glatiramer acetate
WO2013009885A2 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluation of copolymer diethylamide
US8575198B1 (en) 2011-09-07 2013-11-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. In-process control for the manufacture of glatiramer acetate
US8815511B2 (en) 2011-10-10 2014-08-26 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Determination of single nucleotide polymorphisms useful to predict response for glatiramer acetate
US20130210054A1 (en) * 2012-02-09 2013-08-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Amino Acid Copolymer Assay
EP2642290A1 (en) 2012-03-19 2013-09-25 Synthon BV Glatiramer acetate human monocytic cell line-based potency assay
WO2013139728A1 (en) 2012-03-19 2013-09-26 Synthon Bv Glatiramer acetate human monocyte cell-based potency assay
TW201420111A (zh) 2012-10-10 2014-06-01 Teva Pharma 對格拉默醋酸鹽（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ ａｃｅｔａｔｅ）之臨床反應具預測性之生物標記
KR20150111945A (ko) * 2013-01-04 2015-10-06 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 글라티라머 아세테이트 관련 완제의 특성조사
CA2903805A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Mylan Inc. Glatiramer acetate response biomarker mrna potency assay
WO2014173463A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-30 Synthon Bv Glatiramer acetate human monocytic cell line-based potency assay
UY35790A (es) 2013-10-21 2015-05-29 Teva Pharma Marcadores genéticos que predicen la respuesta al acetato de glatiramer
CA2928084A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Mylan Inc. Human t cell line assay for evaluating the immunologic identity of glatiramer acetate preparations
US9155775B1 (en) 2015-01-28 2015-10-13 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for manufacturing glatiramer acetate product
WO2016128957A1 (en) * 2015-02-12 2016-08-18 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of determining relative potency of glatiramer acetate and use thereof in preparing a batch of glatiramer acetate as acceptable for pharmaceutical use
EP3600553A4 (en) 2017-03-26 2020-09-02 Mapi Pharma Ltd. GLATIRAMER DEPOT SYSTEMS FOR TREATMENT OF PROGRESSIVE FORMS OF MULTIPLE SCLEROSIS

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL36670A (en) * 1971-04-21 1974-09-10 Sela M Therapeutic basic copolymers of amino acids
US3991210A (en) * 1974-03-11 1976-11-09 The Dow Chemical Company Acetamidine urinary antiseptics
US4129666A (en) * 1977-04-29 1978-12-12 Walter Wizerkaniuk Method of providing pellets with a water insoluble coating using a melt
US4339431A (en) * 1980-12-31 1982-07-13 Colgate-Palmolive Company Anticalculus oral composition
JPS6053535A (ja) 1983-09-02 1985-03-27 Nitto Boseki Co Ltd 規則性ポリアミノ酸樹脂の製造方法
SU1182051A1 (ru) 1984-04-28 1985-09-30 Таджикский государственный университет им.В.И.Ленина Политрипептиды,обладающие энантовой селективностью в реакци х гидролиза @ -нитрофениловых эфиров карбобензокси - @ - и @ -аланина
DE3681144D1 (de) 1985-06-18 1991-10-02 Univ Emory Verwendung biologisch aktiver copolymere zur herstellung eines arzneimittels zur stimulierung des wachstums von tieren.
DD257174A3 (de) 1985-12-20 1988-06-08 Ve Forschungszentrum Biotechno Verfahren zur herstellung der peptide z-ala-ala-lon-p-nitranilid oder z-asp-phe-ome mit metalloprotease
SU1469826A1 (ru) 1986-05-30 1995-11-20 Институт Высокомолекулярных Соединений Ан Ссср Сополимер l-лизина с l-глутаминовой кислотой, содержащий дофаминовые боковые группы, обладающий пролонгированной гипотензивной активностью и компенсаторным эффектом при геморрагическом шоке, и способ его получения
US5554372A (en) * 1986-09-22 1996-09-10 Emory University Methods and vaccines comprising surface-active copolymers
JP2512796B2 (ja) 1987-06-24 1996-07-03 オートイミュン・インコーポレイテッド 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患の治療法
CA2009996A1 (en) 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
SU1690368A1 (ru) 1989-07-20 1995-08-20 Институт Высокомолекулярных Соединений Ан Ссср Статистические сополимеры в качестве низкотоксичных веществ, обладающих пролонгированным гипотензивным действием, и способ их получения
DE3930733A1 (de) 1989-09-14 1991-03-28 Roehm Gmbh Verfahren zur herstellung eines komplexierten arzneimittels
FR2658076B1 (fr) * 1990-02-12 1992-06-12 Sanofi Sa Composition cosmetique contenant des copolymeres d'aminoacides, utile comme agent hydratant.
AU8305491A (en) 1990-08-01 1992-03-02 Cytel Corporation Novel immunosuppressant peptides
US5668117A (en) * 1991-02-22 1997-09-16 Shapiro; Howard K. Methods of treating neurological diseases and etiologically related symptomology using carbonyl trapping agents in combination with previously known medicaments
US5734023A (en) * 1991-11-19 1998-03-31 Anergen Inc. MHC class II β chain/peptide complexes useful in ameliorating deleterious immune responses
US5583031A (en) * 1992-02-06 1996-12-10 President And Fellows Of Harvard College Empty major histocompatibility class II heterodimers
NZ254496A (en) * 1992-07-31 1996-08-27 Merrell Dow Pharma Polypeptides (3-4 amino acids) with antioxidant moieties covalently attached and their use as pulmonary surfactants
WO1994026774A1 (en) 1993-05-19 1994-11-24 Cytel Corporation Novel treatments for allergic diseases
NZ283876A (en) * 1994-03-31 2001-03-30 Vertex Pharma Pyrimidinyl derivatives as interleukin inhibitors
CA2186873A1 (en) 1994-04-01 1995-10-12 Charles J. Hackett Haptenated peptides and uses thereof
US5591629A (en) * 1994-04-29 1997-01-07 Mayo Foundation For Medical Education & Research Monoclonal antibodies which promote central nervous system remyelination
US5502022A (en) * 1994-05-16 1996-03-26 Biosepra, Inc. Chromatography adsorbents utilizing mercapto heterocyclic ligands
AU7242994A (en) 1994-05-20 1995-12-18 United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army, The Model for testing immunogenicity of peptides
IL113812A (en) * 1994-05-24 2000-06-29 Yeda Res & Dev Copolymer-1 pharmaceutical compositions containing it and its use
GB9411292D0 (en) 1994-06-06 1994-07-27 Teva Pharma Pharmaceuticals compositions
US5858964A (en) * 1995-04-14 1999-01-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising synthetic peptide copolymer for prevention of GVHD
US5665764A (en) * 1995-06-02 1997-09-09 Warner-Lambert Company Tricyclic inhibitors of matrix metalloproteinases
US5627206A (en) * 1995-06-02 1997-05-06 Warner-Lambert Company Tricyclic inhibitor of matrix metalloproteinases
US5719296A (en) 1995-10-30 1998-02-17 Merck & Co., Inc. Pseudopeptide lactam inhibitors of peptide binding to MHC class II proteins
US5965600A (en) 1996-01-17 1999-10-12 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. 3-(bis-substituted phenylmethylene) oxindole derivatives
US5716946A (en) * 1996-02-13 1998-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Multiple sclerosis treatment
IL119989A0 (en) 1997-01-10 1997-04-15 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions for oral treatment of multiple sclerosis
US6214791B1 (en) * 1997-01-10 2001-04-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of multiple sclerosis through ingestion or inhalation of copolymer-1
US6024981A (en) * 1997-04-16 2000-02-15 Cima Labs Inc. Rapidly dissolving robust dosage form
US6114317A (en) * 1998-05-21 2000-09-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of locking 1α-OH of vitamin D compounds in axial orientation
WO2000005249A2 (en) 1998-07-23 2000-02-03 The President And Fellows Of Harvard College Synthetic peptides and methods of use for autoimmune disease therapies
CA2337688C (en) * 1998-07-23 2016-04-05 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with copolymer 1 and related copolymers
ES2527760T3 (es) * 1998-07-23 2015-01-29 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tratamiento de enfermedad de Crohn con copolímero 1 y polipéptidos
US6800287B2 (en) * 1998-09-25 2004-10-05 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
EP2090583B1 (en) 1998-09-25 2011-07-13 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
US6514938B1 (en) * 1998-09-25 2003-02-04 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
WO2000020010A1 (en) 1998-10-02 2000-04-13 Yeda Research And Development Co., Ltd. Alternate day administration of copolymer 1 for treating autoimmune diseases
EP1128839A4 (en) 1998-11-12 2002-10-09 Yeda Res & Dev PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING COPOLYMERS OF SYNTHETIC PEPTIDES AND METHODS FOR PREVENTING AND TREATING GVHD AND HVGD
WO2001052878A2 (en) * 2000-01-20 2001-07-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. The use of copolymer 1 and related peptides and polypeptides and t cells treated therewith for neuroprotective therapy
DE60120648D1 (de) 2000-02-18 2006-07-27 Yeda Res & Dev Formulierungen von copolymer 1 (glatirameracetat) zur oralen, nasalen und pulmonalen verabreichung
ZA200206457B (en) * 2000-02-18 2003-08-13 Yeda Res & Dev Oral, nasal and pulmonary dosage formulations of copolymer 1.
ATE536375T1 (de) 2000-05-10 2011-12-15 Mayo Foundation Menschliche igm antikörper, welche die fähigkeit besitzen, den wiederaufbau der myelinstruktur zu induzieren und deren diagnostische und therapeutische anwendung im zentralen nervensystem
US20020107388A1 (en) * 2000-05-12 2002-08-08 Vandenbark Arthur A. Methods of identifying and monitoring disease-associated T cells
HUP0302333A3 (en) 2000-06-05 2005-07-28 Teva Pharma The use of glatiramer acetate (copolymer 1) for the preparation of pharmaceutical compositions available in the treatment of central nervous system disorders
US20020077278A1 (en) * 2000-06-05 2002-06-20 Yong V. Wee Use of glatiramer acetate (copolymer 1) in the treatment of central nervous system disorders
US20020037848A1 (en) 2000-06-07 2002-03-28 Michal Eisenbach-Schwartz Use of copolymer 1 and related peptides and polypeptides and T cells treated therewith for neuroprotective therapy
WO2002076503A1 (en) 2000-06-20 2002-10-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treatment of central nervous system diseases by antibodies against glatiramer acetate
CN2469393Y (zh) 2001-03-08 2002-01-02 祁新 暖气热水器
CN1152258C (zh) * 2001-03-19 2004-06-02 上海肿瘤特殊项目检测中心 一种检测化学药物在体内抗癌功效的方法
US6855270B2 (en) * 2001-06-07 2005-02-15 The University Of Kentucky Research Foundation Nanoscintillation systems for aqueous-based liquid scintillation counting
WO2003048735A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Processes for the measurement of the potency of glatiramer acetate
EP1565486A2 (en) 2002-11-13 2005-08-24 Apotex Pharmachem Inc. Process for the preparation of glatiramer acetate by polymerisation of n-carboxy anhydrides of l-alanine, l-tyrosine, benzyl l-glutamate and benzyloxycarbonyl l-lysine
CA2513567C (en) * 2003-01-21 2012-10-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Cop 1 for treatment of inflammatory bowel diseases
PL1638589T3 (pl) * 2003-05-14 2014-10-31 Teva Pharmaceutical Industries Ltd Terapia kombinowana obejmująca octan glatirameru i mitoksantron do leczenia stwardnienia rozsianego
AU2004274957B2 (en) * 2003-09-19 2009-02-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
KR20060097020A (ko) 2003-10-31 2006-09-13 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 약물 전달용 나노입자
CA2579656C (en) * 2004-09-09 2014-11-04 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for preparation of mixtures of polypeptides using purified hydrobromic acid
US7560100B2 (en) * 2004-09-09 2009-07-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, for treating neurodegenerative diseases
JP5297653B2 (ja) 2004-10-29 2013-09-25 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト グラチラマーの製造法
UA93669C2 (ru) * 2005-02-02 2011-03-10 Тева Фармасьютикл Индастриз, Лтд. Способ приготовления полипептидной смеси c использованием гидрогенолиза
CA2606194A1 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 Yeda Research And Development Company Markers associated with the therapeutic efficacy of glatiramer acetate
US20070059798A1 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Alexander Gad Polypeptides useful for molecular weight determinations
CN101511862A (zh) 2006-07-05 2009-08-19 莫门塔制药股份有限公司 制备共聚物-1的改进方法
ITRM20070552A1 (it) 2007-10-23 2009-04-24 Acqua Minerale S Benedetto S P Contenitore in materiale plastico

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHARONI, R et al., Bystander suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by T-cell lines and clones of the Th2 type induced by copolymer 1, Journal of Neuroimmunology, 1998, Vol. 91, side 135-146., Dated: 01.01.0001 *
AHARONI, R et al., T suppressor hybridomas and interleukin-2-dependent lines induced by copolymer 1 or by spinal cord homogenate down-regulate experimental allergic encephalomyelitis, European Journal of Immunology, 1993, Vol. 23, side 17-25., Dated: 01.01.0001 *
DUDA, P W et al., Human and murine CD4 T cell reactivity to a complex antigen: recognition of the synthesis random random polypeptide Glatiramer acetate, The Journal of Immunology, 2000, Vol. 165, Nr. 12, side 7300-7307., Dated: 01.01.0001 *
WEISEMANN, E et al., Glatiramer acetat (GA) induces IL-13/IL-5 secretion in naive T cells, Journal of Neuroimmunology, 2001, Vol. 119, Nr. 1, side 137-144., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20030170729A1 (en) 2003-09-11
CY1110878T1 (el) 2015-06-10
US20110189706A1 (en) 2011-08-04
KR20050044676A (ko) 2005-05-12
CN1308683C (zh) 2007-04-04
CN1618018A (zh) 2005-05-18
US20150094488A1 (en) 2015-04-02
ES2349033T3 (es) 2010-12-22
US7429374B2 (en) 2008-09-30
AU2002353059A1 (en) 2003-06-17
HK1070421A1 (en) 2005-06-17
EP1459065A4 (en) 2008-08-27
KR100657048B1 (ko) 2006-12-12
IL198285A (en) 2013-07-31
DE60237170D1 (de) 2010-09-09
US8389228B2 (en) 2013-03-05
EP1459065B1 (en) 2010-07-28
MXPA04005433A (es) 2004-10-11
JP4369234B2 (ja) 2009-11-18
WO2003048735A3 (en) 2003-09-18
IS7286A (is) 2004-05-26
IL198285A0 (en) 2011-07-31
CA2469393A1 (en) 2003-06-12
US20120309671A1 (en) 2012-12-06
ATE475883T1 (de) 2010-08-15
EP1459065A2 (en) 2004-09-22
JP2005511060A (ja) 2005-04-28
IL162127A0 (en) 2005-11-20
NO20042816L (no) 2004-09-06
IL162127A (en) 2010-11-30
US7923215B2 (en) 2011-04-12
AU2002353059B2 (en) 2008-06-19
CA2469393C (en) 2010-05-25
US20090053253A1 (en) 2009-02-26
SI1459065T1 (sl) 2010-11-30
NZ533327A (en) 2006-11-30
DK1459065T3 (da) 2010-10-11
WO2003048735A2 (en) 2003-06-12
US20160025707A1 (en) 2016-01-28
PT1459065E (pt) 2010-10-11
ZA200404472B (en) 2005-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO338247B1 (no) Fremgangsmåter for måling av kraften av glatirameracetat
Shigehara et al. IL-12 and IL-18 are increased and stimulate IFN-γ production in sarcoid lungs
Rapoport et al. Decreased secretion of Th2 cytokines precedes up-regulated and delayed secretion of Th1 cytokines in activated peripheral blood mononuclear cells from patients with insulin-dependent diabetes mellitus
JP2016128402A (ja) セリアック病の処置のための組成物および方法
Jyonouchi et al. Aberrant responses to TLR agonists in pediatric IBD patients; the possible association with increased production of Th1/Th17 cytokines in response to candida, a luminal antigen
Agarwal et al. Pregnancy ameliorates induction and expression of experimental autoimmune uveitis
AU2019204756A1 (en) A cell mediated immune response assay
Jais et al. Reduced levels of genital tract immune biomarkers in postmenopausal women: implications for HIV acquisition
Xu et al. The anti-inflammatory immune response in early Trichinella spiralis intestinal infection depends on serine protease inhibitor–mediated alternative activation of macrophages
Bomb et al. Destructive fibrotic teamwork: how both microenvironment stiffness and profibrotic interleukin 13 impair alveolar macrophage phenotype and function
Moazezi et al. Evaluation of immunological parameters in diabetic patients: are these patients immunodeficient?
AU2016328277A1 (en) Compositions and methods for diagnosing lyme disease and for predicting lyme disease spirochete elimination after treatment
Frisullo et al. T-bet and pSTAT-1 expression in PBMC from coeliac disease patients: new markers of disease activity
Burcel et al. Levels of lactoferrin, lysozyme and albumin in the tear film of keratoconus patients and their correlations with important parameters of the disease
US20080138833A1 (en) Methods and compositions for assessing il-12 or the neutralization of il-12 in a sample
Jambari et al. Effect of O-linked glycosylation on the antigenicity, cellular uptake and trafficking in dendritic cells of recombinant Ber e 1
Upton et al. Enhanced ISGylation reduces respiratory distress following Francisella novicida infection
Nomura et al. Spontaneous and Lipopolysaccharide-Stimulated Secretion of Cytokines by Peripheral Blood Monocytes in IgA Nephropathy Is Inhibited by lnterleukin-10
Xiong Regulation of T-cell adhesion and megakaryopoiesis by immune adaptor ADAP
Kennedy et al. Fifty-five-year-old man with chronic yeast infections
Weed et al. Automated analysis of nail clippings for onychomycosis using convolutional neural networks: A pilot study
Crawley et al. Soluble IL-7R
Sultan Molecular Mechanisms of Postoperative Lymphopenia
Ge et al. Peptide-MHC Cellular Microarray with Innovative Data Analysis System for Simultaneously

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees