NO329693B1

NO329693B1 - Kimaerisk virus samt anvendelse derav, nukleinsyremolekyl og vaksinesammmensetning.

Info

Publication number: NO329693B1
Application number: NO19994185A
Authority: NO
Inventors: Thomas J Chambers; Thomas P Monath; Farshad Guirakhoo
Original assignee: Univ St Louis
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2010-12-06
Also published as: CZ306499A3; EP2251036A1; EP0977587A1; JP4504464B2; ATE468858T1; IL193170A0; IL131600A0; JP2001514622A; HUP0002139A2; CA2282790C; DE69830579T2; DE69830579D1; EP0977587A4; PL335481A1; RU2209082C2; IL207517A0; NZ337522A; AU740961B2; PL192957B1; HK1025743A1

Description

Denne oppfinnelse angår infeksiøse, svekkede virus egnet som vaksiner mot sykdommer forårsaket av flavivirus.

Flere medlemmer av flavivirus-familien representerer aktuelle eller potensielle trusler mot den globale folkehelsen. For eksempel er japansk encefalitt et betydelig folke-helseproblem som innbefatter millioner individer i risikogruppen i det fjerne østen. Denguevirus, med en beregnet årlig forekomst på 100 millioner tilfeller av primær denguefeber og over 450 000 tilfeller av hemoragisk dengue-feber over hele verden, er fremkommet som den viktigste artropod-overførte enkeltsykdom hos mennesker. Andre flavivirus fortsetter å forårsake endemiske sykdommer med variabel beskaffenhet og har potensial til å oppstå på nye områder som resultat av forandringer i klima, vektorpopulasjoner og miljø-forstyrrelser forårsaket av menneskelig aktivitet. Disse flavivirus innbefatter for eksempel St. Louis-encefalittvirus, som forårsaker sporadisk, men alvorlig akutt sykdom i det midtvestlige, sydøstlige og den vestlige del av De forente stater; West Nile-virus, som forårsaker febersykdom, leilighetsvis komplisert ved akutt encefalitt, og er alminnelig utbredt i Afrika, Midtøsten, det tidligere Sovjetunionen og deler av Europa; Murray Valley-encefalittvirus, som forårsaker endemisk nervesystemsykdom i Australia; og flått-båret encefalittvirus, som er utbredt i hele det tidligere Sovjetunionen og det østlige Europa, hvor dets ixodid-flåttvektor er fremherskende og ansvarlig for en alvorlig form av encefalitt i disse områder.

Hepatitt C-virus (HCV) er et annet medlem av flavivirus-familien, med en genom-organisasjon og replikasjonsstrategi som er lik, men ikke identisk med, genom-organisasjonen og replikasjonsstrategien hos flavivirusene nevnt ovenfor. HCV overføres hovedsakelig ved parenteral eksponering, er forbundet med kronisk hepatitt som kan utvikle seg til cirrhose og hepatocellulært karsinom, og er en hovedårsak til leversykdom som fordrer ortotopisk transplantasjon, i De forente stater.

Flaviviridae-familien er forskjellig fra alfavirusene (f.eks. WEE, VEE, EEE, SFV osv.) og inneholder for tiden tre slekter, flavivirusene, pestivirusene og hepatitt C-virusene. Fullstendig bearbeidede fullt utviklede virioner av flavivirus inneholder tre strukturproteiner, kappe (E), kapsid (C) og membran (M), og syv ikke-strukturproteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5). Ikke fullt utviklede flavivirioner funnet i infiserte celler inneholder pre-membran-(prM)-protein, som er forløperen til M-proteinet.

Etter binding av virioner til vertscellereseptorer, gjennomgår E-proteinet en irreversibel formforandring ved eksponering forden sure pH i endosomer, noe som bevirker fusjon mellom kappe-dobbeltlagene hos virionene og de endocyttiske vesikler, hvorved virusgenomet frigis ut i vertens cytosol. PrM-holdige flåttbårne encefalitt (TBE)-virus erfusjons-inkompetente, noe som viserat proteolytisk bearbeidelse av prM er nødvendig for frembringelse av fusjons-kompetente og fullstendig infeksiøse virioner (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72 (Pt. 2):333-338, 1991). Ved anvendelse av ammoniumklorid sent i virus-replikasjonssyklusen ble prM-holdige Murray Valley-encefalitt-(MVE)-virus dannet og vist å være fusjons-inkompetente. Ved anvendelse av sekvens-spesifikke peptider og monoklonale antistoffer ble det vist at prM vekselvirker med aminosyrer 200-327 i E-proteinet. Denne vekselvirkning er nødvendig for beskyttelse av E-proteinet mot de irreversible formforandringer forårsaket av metning i de sure vesikler ved den eksocyttiske vei (Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992).

Bray M et al. "Construction of intertypic chimeric dengue vimses bu substitution of structural protein genes". Proe Nati Acad Sei USA. 1991 Nov 15; 88(22): 10342-6 beskriver konstruksjon av kimære dengue virus.

Venugopal K et al. "Towards a new generation of flavivirus vaccines". Vaccine. 1994 Aug; 12(11): 966-75 gjennomgår forskning på vaksiner til behandling av flavivirusinfeksjoner.

WO 9306214 beskriver levende kimære flavivirus og vaksiner for dengue og andre flavivirus.

Spaltningen av prM til M-protein skjer like før frigjøring av virioner ved en furin-liknende celleprotease (Stadier et al., J. Virol. 71:8475-8481, 1997), som er nødvendig for aktivering av hemagglutinerende aktivitet, fusogen aktivitet og smitteevne hos virioner. M-proteinet spaltes fra sitt forløperprotein (prM) etter konsensus-sekvensen R-X-R/K-R (X er variabel) og innlemmes i virus-lipidkappen sammen med E-proteinet.

Spaltningssekvenser er blitt konservert ikke bare i flavivirus, men også i proteiner i andre ikke-beslektede virus, så som PE2 i muse-koronavirus, PE2 i alfa-virus, HA i influensavirus og p160 i retrovirus. Spalting av forløperproteinet er av vesentlig betydning for virus-smitteevnen, men ikke partikkeldannelsen. Det ble vist at når det gjaldt en TBE-dengue 4-kimære, resulterte en forandring i prM-spaltningssetet i nedsatt neurovirulens hos denne kimære (Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993), i overensstemmelse med den tidligere observasjon at effektiv bearbeidelse av prM er nødvendig for fullstendig smitteevne (Guirakhoo et al., 1991, som ovenfor, 1992, som ovenfor; Heinz et al., Virology 198:109-117, 1994). Antistoffer mot prM-protein kan formidle beskyttende immunitet, tydeligvis på grunn av nøytralisering av frigjorte virioner som inneholder en del uspaltet prM. Det proteolytiske spaltningssete i PE2 i VEE (4 aminosyrer) ble utelukket ved setedirigert mutagenese av den infeksiøse klon (Smith et al., ASTMH-møte, 7-11. desember 1997). Delesjonsmutanter replikert med høy effektivitet og PE2-proteiner ble innlemmet i partikler. Denne mutant ble vurdert i ikke-humane primater og vist å forårsake 100% serumomdannelse, og beskyttet alle immuniserte aper mot døds-trussel.

Foreliggende oppfinnelse omfatter kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus, kjennetegnet ved at den omfatter: et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein er enten utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og

innlemmet i genomet til nevnte gulfeberviruset, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-protein fra det annet flavivirus uttrykkes, hvor signalsekvensen ved C/prM grensen til nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

Det kimæriske virus består således av genene og genproduktene som er ansvarlige for intracellulær replikasjon, og som hører til det første flavivirus, og genene og genproduktene for kappen hos det annet flavivirus. Siden viruskappen inneholder alle de antigene determinanter som er ansvarlige for indusering av nøytraliserende antistoffer, er resultatet av infisering med det kimæriske virus at slike antistoffer bare dannes mot det annet flavivirus.

Et foretrukket levende virus for anvendelse som det første flavivirus i de kimæriske virus ifølge oppfinnelsen, er gulfeber-viruset. Dette levende, svekkede virus er allerede anvendt i minst én vaksine; vaksinen er kjent som YF17D og er blitt anvendt for immunisering av mennesker i over 50 år. YF17D-vaksinen er beskrevet i en rekke publikasjoner, innbefattende publikasjonr av Smithburn et al., («Yellow Fever Vaccination», World Health Org., s. 238, 1956) og Freestone (i Plotkin et al., (red.), Vaccines, 2. utgave, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995). Dessuten er gulfeberviruset blitt undersøkt på det genetiske nivå (Rice et al., Science 229:726-733, 1985), og informasjon som koordinerer genotype og fenotype, er blitt opprettet (Marchevsky et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).

Foretrukne flavivirus for anvendelse som det annet flavivirus i de kimæriske virus ifølge oppfinnelsen, og således kilder til immuniserende antigen, innbefatter japansk encefalitt-(JE)-virus, denguevirus (DEN, f.eks. hvilken som helst av dengue-typene 1-4), Murray Valley-encefalitt-(MVE)-virus, St. Louis-encefalitt-(SLE)-virus, West Nile-(WN)-virus, flåttbåret encefalitt-(TBE)-virus og hepatitt C-(HCV)-virus. Ytterligere flavivirus for anvendelse som det annet flavivirus innbefatter Kunjin-virus, sentraleuropeisk encefalitt-virus, russisk vår-sommer-encefalitt-virus, Powassan-virus, Kyasanur Forest-sykdomsvirus og omsk hemoragisk feber-virus. I et foretrukket kimærisk virus ifølge oppfinnelsen er den prM-E-protein-kodende sekvens i det annet flavivirus substituert i den prM-E protein-kodende sekvens i det levende gulfebervirus. I et foretrukket kimærisk virus stammer den prM-E-protein-kodende sekvens fra en svekket virusstamme, så som en vaksinestamme. Som beskrevet lenger nede, kan dessuten prM-delen av proteinet inneholde en mutasjon som forhindrer spalting under dannelse av ferdig membranprotein.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av et kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus ved fremstilling av et medikament for forebygging eller behandling av flavivirus-infeksjon hos en pasient, hvor det kimæriske, levende, infeksiøse, svekkede virus omfatter

et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein, enten er utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og

innlemmet i genomet i gulfeberviruset, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein fra et annet, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-protein fra nevnte annet flavivirus uttrykkes idet signalsekvensen ved C/prM-E-koplingene av nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre nukleinsyremolekyl kjennetegnet ved at det koder for et kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus, hvor viruset omfatter: et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein, enten er utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og

innlemmet i genomet til nevnte gulfebervirus, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein fra et annet, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-proteint fra nevnte annet flavivirus uttrykkes, hvor signalsekvensen ved C/prM-koplingene av nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

Oppfinnelsen beskriver også en vaksinesammensetning kjennetegnet ved at den omfatter det kimæriske viruset ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13.

Oppfinnelsen tilveiebringer flere fordeler. Foreksempel kan de kimæriske virus ifølge oppfinnelsen anvendes til frembringelse av langvarig beskyttende immunitet, på grunn av at de er levende og replikerende. På grunn av at virusene har replikasjonsgenene fra et svekket virus (feks. gulfeber 17D), er det resulterende kimæriske virus svekket i en slik grad at det er trygt for anvendelse i mennesker.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ut fra følgende detaljerte beskrivelse, tegningene og kravene.

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 er en skjematisk fremstilling av genmanipuleringstrinn som ble utført for konstruksjon av et kimærisk gulfeber/japansk encefalitt-(YF/JE)-virus ifølge oppfinnelsen. Fig. 2 er et sett av vekstkurver for de kimæriske YF/JE-virus ifølge oppfinnelsen i cellekulturer som er akseptable for fremstilling av en human vaksine. Fig. 3 er et diagram som viser en vekstsammenlikning mellom RMS (Research Master Seed, YF/JE SAu-14-2) og YF-Vax i MRC-5-celler. Fig. 4 er et diagram og en tabell som viser resultatene av en muse-neurovirulensanalyse utført med et kimærisk YF/JE-virus ifølge oppfinnelsen. Fig. 5 er en skjematisk fremstilling av et toplasmid-system for dannelse av kimærisk YF/DEN-2-virus. Fremgangsmåten er hovedsakelig som beskrevet for det kimæriske YF/JE-virus. Fig. 6 er en skjematisk fremstilling av strukturen av modifiserte YF-kloner utformet for utelukkelse av deler av NS1-proteinet og/eller ekspresjon av fremmede

proteiner under kontroll av et indre ribosom-innføringssete (IRES). Figuren viser kun E/NS1-området i virusgenomet. Et translasjons-stoppkodon innføres i den karboksylterminale ende av kapsel (E)-proteinet. Nedstrøms translasjon igangsettes i en åpen intergen-leseramme (ORF) ved IRES-1, som styrer ekspresjonen av fremmede proteiner (f.eks. HCV-proteinene E1 og/eller E2). Det andre IRES (IRES-2) regulerer translasjons-initiering i YF-ikkestruktur-området, hvor «nested», avkuttede NS1-

proteiner (f.eks. NS1del-1, NS1del-2 eller NS1del-3) uttrykkes. Størrelsen av NS1-delesjonen er omvendt proporsjonal med størrelsen avORF knyttet til IRES-1.

Fig. 7 er et diagram som viser den nøytraliserende antistoff respons hos mus immunisert med en kimærisk YF/JE SAu-14-2-vaksine.

Oppfinnelsen tilveiebringer kimæriske flavivirus som kan anvendes ved vaksinasjonsmetoder mot flavivirusinfeksjon. Konstruksjon og analyse av kimæriske flavivirus ifølge oppfinnelsen, så som kimærer av gulfebervirus og japansk encefalitt-(JE)-virus, denguevirus-typer 1-4- (DEN 1-4), Murray Valley-encefalitt- (MVE)-virus, St. Louis-encefalitt-(SLE)-virus, West Nile-(WN)-virus, flåttbåret encefalitt-(TBE)-virus og hepatitt C (HCV)-virus er beskrevet som følger.

Flavivirusproteiner dannes ved translasjon av en enkelt, lang åpen leseramme (som bl.a. koder for strukturproteinene, kapsid (C)-protein, pre-membran-(pr-M)-protein og kapsel-(E)-protein samt ikke-strukturproteiner) og en kompleks serie av post-translasjonelle proteolytiske spaltninger. De kimæriske flavivirus ifølge oppfinnelsen, som omtalt ovenfor, innbefatter slike hvor pr-M- og E-proteinene hos ett flavivirus er blitt erstattet med pr-M- og E-proteinene fra et annet flavivirus. Således innbefatter frembringelse av disse kimæriske flavivirus dannelse av nye koplinger mellom kapsid- og pre-membran-proteinene, og kapselproteinet og ikke-strukturområdet (NS1) hos to forskjellige flavivirus. Spaltning mellom hvert av disse sett av proteiner (C og pr-M, og E og NS1) skjer under den naturlige proteolytiske bearbeidelse av flavivirus-proteiner, og fordrer tilstedeværelse av signalsekvenser som flankerer koplingene mellom spaltningssetene.

I de kimæriske flavivirus ifølge oppfinnelsen er det foretrukket at signalsekvensene hos virusene som utgjør kimærene, hovedsakelig opprettholdes, slik at passende spaltning mellom C- og pr-M- og E- og NS1-proteinene effektivt kan finne sted. Disse signalsekvenser er blitt opprettholdt i kimærene beskrevet nedenfor. Alternativt kan hvilken som helst av de tallrike kjente signalsekvenser konstrueres slik at de knytter sammen C- og pre-M- eller E- og NS1-proteinene hos kimærene (se f.eks. von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983; von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985), eller en fagperson på området kan, for eksempel under anvendelse av de kjente sekvenser for rettledning, utforme ytterligere signal-sekvenser som kan anvendes i kimærene ifølge oppfinnelsen. Typisk vil signal-sekvensen for eksempel innbefatte som sin siste rest en aminosyre med en liten, ikke-ladet sidekjede, så som alanin, glycin, serin, cystein, treonin eller glutamin. Andre krav til signalsekvenser er kjent på området (se f.eks. von Heijne, 1983, som ovenfor, von Heijne, 1985, som ovenfor). Dessuten kan signalsekvensene hos hvilket som helst av virusene som utgjør kimærene, opprettholdes eller hovedsakelig opprettholdes, slik at det finner sted passende spaltning.

Konstruksjon av cDNA- templater for dannelse av kimæriske YF/ JE- virus

For oppnåelse av cDNA-templater med hel lengde for YF/JE-kimærer ifølge oppfinnelsen beskrevet nedenfor ble det anvendt en fremgangsmåte i likhet med den som tidligere forskere anvendte for regenerering av YF17D fra cDNA for molekylær-genetisk analyse av YF-replikasjon. Fremgangsmåten er f.eks. beskrevet av Nestorowicz et al. ( Virology 199:114-123, 1994).

Kort angitt innbefatter oppnåelse av en YF/JE-kimær ifølge oppfinnelsen følgende: YF-genomsekvenser får formeres i to plasmider (YF5'3'IV og YFM5.2), som koder for YF-sekvensene fra nukleotidene 1-2 276 og 8 279-10 861 (YF5'3'IV) og fra 1 373-8 704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989). cDNA-templater i hel lengde dannes ved ligering av passende restriksjonsfragmenter avledet fra disse plasmider. Denne metode har vært den mest pålitelige for sikring av stabil ekspresjon av YF-sekvenser og dannelse av RNA-transkripter med høy spesifikk smitteevne.

Vår fremgangsmåte for konstruksjon av kimærer innbefatter erstatting av YF-sekvenser i YF5'3'IV- og YFM5.2-plasmidene med de tilsvarende JE-sekvenser fra begynnelsen av prM-proteinet (nukleotid 478, aminosyre 128) til og med E/NS1-spaltningssetet (nukleotid 2 452, aminosyre 817). I tillegg til kloning av JE-cDNA, var det nødvendig med flere trinn for innføring eller eliminering av restriksjonsseter både i YF- og JE-sekvensene for å gjøre mulig ligering in vitro. Strukturen av templatet for regenerering av kimæriske YF (C)/JE (prM-E)-virus er vist på fig. 4. En andre kimære, som koder for hele JE-strukturområdet (C-prM-E) ble konstruert under anvendelse av en liknende fremgangsmåte.

Molekylærkloning av JE- virus- strukturområdet

Kloner av autentiske JE-strukturprotein-gener ble dannet fra JE SAi4-14-2-stammen (levende, svekket JE-vaksinestamme) på grunn av at de biologiske egenskaper og molekylkarakteriseringen for denne stamme er veldokumentert (se f.eks. Eckels et al., Vaccine 6:513-518, 1988; JE SAi4-14-2-virus leveres fra Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado og Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut, som er utpekt av Verdens Helseorganisasjon som referansesentrene for arbovirus i De forente stater). JE SAi4-14-2-virus ved overføringsnivå PDK-5 ble oppnådd og overført i LLC-MK2-celler for oppnåelse av tilstrekkelige mengder av virus for cDNA-kloning. Metoden vi anvendte, innbefattet kloning av det strukturelle område i to stykker som overlapper ved et Nhel-sete (JE-nukleotid 1 125), som så kan anvendes for ligering in vitro.

RNA ble ekstrahert fra monolag av infiserte LLC-MK2-celler, og førstekjede-syntese av negativ sense-cDNA ble utført under anvendelse av revers transkriptase med en negativ sense-primer (JE-nukleotidskvens 2 456-71) inneholdende «nested» Xbal- og Narl-restriksjonsseter for kloning henholdsvis i begynnelsen i pBluescript II KS(+) og deretter i YFM5.2 (Narl). Førstekjede-cDNA-syntese ble fulgt av PCR-amplifikasjon av JE-sekvensen fra nukleotidene 1 108-2 471 under anvendelse av den samme negative sense-primer og en positiv sense-primer (JE-nukleotidskvens 1 108-1 130) inneholdende «nested» Xbal- og Nsil-restriksjons-seter for kloning i henholdsvis pBluescript og YFM5.2 (Narl). JE-sekvensene ble verifisert ved restriksjonsenzym-nedbrytning og nukleotid-sekvensering. JE-nukleotidskvensen fra nukleotider 1-1130 ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon av negativ JE cDNA-kjede under anvendelse av en negativ sense-primer svarende til JE-nukleotider 1116-1 130 og en positiv sense-primer svarende til JE-nukleotider 1-18, begge inneholdende et EcoRI-restriksjonssete. PCR-fragmenter ble klonet i pBluescript, og JE-sekvensene ble verifisert ved nukleotid-sekvensering. Sammen representerer dette kloning av JE-sekvensen fra nukleotidene 1-2471 (aminosyrer 1-792).

Konstruksjon av YF5' 3' IV/ JE- og YFM5. 2/ JE- derivater

For innsetting av den C-terminale ende av JE-kapselproteinet ved YF E/NS1-spaltningssetet ble det innført et unikt Narl-restriksjonssete i YFM5.2-plasmidet ved oligonukleotid-dirigert mutagenese av signalase-sekvensen ved E-NS1-spaltningssetet (YF-nukleotider 2 447-2 452, aminosyrer 816-817) for frembringelse av YFM5.2(Narl). Transkripter avledet fra templater innbefattende denne forandring ble undersøkt med hensyn til smitteevne og ga en spesifikk smitteevne i likhet med moder-templatene (omtrent 100 plakkdannende enheter pr. 250 nanogram transkript). JE-sekvensen fra nukleotidene 1 108-2 471 ble subklonet fra flere uavhengige PCR-oppnådde kloner av pBluescript/JE i YFM5.2(Narl) under anvendelse av de unike Nsil- og Narl-restriksjonsseter. YF5'3'IV/JE-kloner inneholdende det ikke-translaterte YF 5'-område (nukleotider 1-118) i nabostilling til JE prM-E-området ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon.

For oppnåelse av sekvenser inneholdende koplingene mellom YF-kapsidet og JE-prM ble det anvendt en kimærisk negativ sense-primer-måling («spanning») av dette område med en positiv sense-primer svarende til YF5'3'IV-nukleotider 6 625-6 639 for frembringelse av PCR-fragmenter, som så ble anvendt som negative sense-PCR-primere sammen med en positiv sense-primer komplementær til pBluescript-vektorsekvensen oppstrøms for EcoRI-setet, for amplifikasjon av JE-sekvensen (kodet i revers orientering i pBluescript-vektoren) fra nukleotid 477 (N-terminal ende av prM-proteinet) til og med Nhel-setet ved nukleotid 1 125. De resulterende PCR-fragmenter ble innsatt i YF5'3'IV-plasmidet under anvendelse av Noti- og EcoRI-restriksjonssetene. Denne konstruksjon inneholder SP6-promotoren som ligger foran det ikke-translaterte YF5'-område, fulgt av sekvensen YF (C) JE (prM-E), og inneholder Nhel-setet (JE-nukleotid 1 125) som kreves for ligering in vitro.

Konstruksjon av YFM5. 2 og YF5' 3' IV slik at de inneholder restriksjonsseter for ligering in vitro

For anvendelse av Nhel-setet i JE-kapselsekvensen som et in vitro-5'-ligeringssete ble et overflødig Nhel-sete i YFM5.2-plasmidet (nukleotid 5 459) eliminert. Dette ble utført ved stum mutasjon av YF-sekvensen ved nukleotid 5 461 (T-»C; alanin, aminosyre 1820). Dette sete ble innlemmet i YFM5.2 ved ligering av passende restriksjonsfragmenter og innført i YFM5.2(Narl)/JE ved utskifting av et Nsil/Narl-fragment som koder for den kimæriske YF/JE-sekvens.

For frembringelse av et unikt 3'-restriksjonssete for ligering in vitro ble det konstruert et BspEI-sete nedstrøms for Aarll-setet som normalt anvendes til dannelse av templater med full lengde fra YF5'3'IV og YFM5.2. (Multiple Aatll-seter er tilstede i JE-struktursekvensen, noe som utelukker anvendelse av dette sete for ligering in vitro). BspEI-setet ble frembrakt ved stum mutasjon av YF-nukleotid 8 581 (A-»C; serin, aminosyre 2 860) og ble innført i YFM5.2 ved utskifting av hensiktsmessige restriksjonsfragmenter. Det unike sete ble innlemmet i YFM5.2/JE ved utskifting av Xbal/Sphl-fragmentet og i YF5'3'IV/JE(prM-E)-plasmidene ved tredelers-ligering av passende restriksjonsfragmenter fra disse moderplasmider og fra et derivat av YFM5.2 (BspEI) under delesjon av YF-sekven-sen mellom EcoRI-setene ved nukleotider 1 og 6 912.

Utskifting av JE Nakayama- cDNA i kimæriske YF/ JE- plasmider

På grunn av usikkerhet angående evnen hos det PCR-oppnådde JE SAi4-14-2-strukturområde til å funksjonere riktig i forbindelse med det kimæriske virus, anvendte vi cDNA fra et klon av JE Nakayama-stammen som er blitt grundig karakterisert ved ekspresjonsforsøk og med hensyn til sin evne til indusering av beskyttende immunitet (se f.eks. Melda et al., Virology 158:348-360, 1987; JE Nakayama-stammen er tilgjengelig fra Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado, og Yale Arbovirus Research Unit, Yale Univesity, New Haven, Connecticut). Nakayama-cDNA ble innført i de kimæriske YF/JE-plasmider under anvendelse av tilgjengelige restriksjonsseter (Hindi 11 til Pvull og Bpml til Munl) under erstatning av hele prM-E-området i toplasmid-systemet, bortsett fra en enkelt aminosyre, serin, i stilling 49, som fikk forbli intakt for anvendelse av Nhel-setet for in vitro-ligering. Hele JE-området i Nakayama-klonen ble sekvensert for verifisering av at den erstattede cDNA var autentisk (tabell 2).

Dannelse av cDNA- templater i hel lengde, RNA- transfeksjon og gjenvinning av infeksiøst virus

Metoder for dannelse av cDNA-templater i hel lengde er i det vesentlige som beskrevet i Rice et al. ( The New Biologist 1:285-96, 1989) (se fig. 1). Når det gjelder kimæriske templater, nedbrytes plasmidene YF5'3'IV/JE(prM-E) og YFM5.2/JE med Nhel/BspEI, og ligering in vitro utføres under anvendelse av 50 nanogram rensede fragmenter i nærvær av T4 DNA-ligase. Ligeringsproduktene lineariseres med Xhol for å gjøre mulig «run off»-transkripsjon. SP6-transkripter syntetiseres under anvendelse av 50 nanogram renset templat, kvantifisert ved innlemming av <3>H-UTP, og integriteten av RNA verifiseres ved ikke-denaturerende agarosegel-elektroforese. Utbyttene er i området fra 5 til 10 mikrogram RNA pr. reaksjon ved anvendelse av denne metode, hvorav størstedelen er tilstede som transkripter med hel lengde. Transfeksjon av RNA-transkripter i nærvær av kationiske liposomer utføres som beskrevet av Rice et al. (som ovenfor) for YF17D. Ved begynnelses-forsøkene ble LLC-MK2-celler anvendt for transfeksjon og kvantifisering av virus, siden vi har bestemt tillateligheten av replikasjon og plakkdannelse av moderstammene av YF og JE. Tabell 1 illustrerer typiske resultater av transfeksjonsforsøk ved anvendelse av Lipofectin (GIBCO/BRL) som transfeksjonsbærer. Vero-cellelinjer er også blitt anvendt rutinemessig for tillaging av infeksiøse virus-stammer, karakterisering av merkede proteiner, samt nøytralisasjonstester.

Nukleotid- sekvensering av kimæriske cDNA- templater

Plasmider inneholdende den kimæriske YF/JE-cDNA ble underkastet sekvensanalyse av JE-delen av klonene for identifisering av de riktige sekvenser av SAh-14-2- og Nakayama-kapselproteinet. Nukleotidsekvens-forskjellene mellom disse konstruksjoner sammenliknet med de rapporterte sekvenser (McAda et al., som ovenfor) er vist i tabell 2.

Strukturell og biologisk karakterisering av kimæriske YF/ JE- virus

Genomstrukturen hos kimæriske YF/JE-virus gjenvunnet fra transfeksjons-forsøk ble verifisert ved hjelp av RT/PCR-basert analyse av virus-RNA høstet fra monolag av infiserte celler. Disse forsøk utføres for eliminering av muligheten til at virusstammer forurenses under transfeksjonsprosessene. Når det gjaldt disse forsøk ble første-gjennomgangs-virus anvendt til igangsetting av en infeksjonssyklus, for eliminering av eventuelle mulige artefakter frembrakt ved tilstedeværelse av rester av transfektert virus-RNA. Total-RNA-ekstrakter av celler infisert med enten YF/JE (prM-E)-SAi4-14-2- eller YF/JE (prM-E)-Nakayama-kimæren ble underkastet RT/PCR under anvendelse av YF- og JE-spesifikke primere som gjorde mulig gjenvinning av hele det strukturelle område som to PCR-produkter med størrelse omtrent 1 kilo-base. Disse produkter ble deretter analysert ved hjelp av restriksjonsenzym-nedbrytning under anvendelse av de forutsette seter i JE SAi4-14-2- og Nakayama-sekvensene som muliggjør differensiering av disse virus. Ved anvendelse av denne fremgangsmåte ble det vist at virus-RNA var kimærisk, og de gjenvunne virus ble verifisert til å ha de hensiktsmessige restriksjonsseter. Den aktuelle C-prM-grense ble deretter verifisert til å være intakt ved sekvensnivået ved cyklus-sekvensanalyse over den kimæriske YF/JE C-prM-kopling.

Tilstedeværelse av JE-kapselproteinet i de to kimærer ble verifisert både ved immunutfelling med JE-spesifikke antisera og ved plakk-reduksjonsnøytraliserings-undersøkelse under anvendelse av YF- og JE-spesifikke antisera. Immun-utfelling av <35>S-merkede ekstrakter av LLC-MK2-celler infisert med kimærene under anvendelse av et monoklonalt antistoff overfor JE E-proteinet viste at JE-kapselproteinet kunne gjenvinnes som et protein på 55 kD, mens de samme antisera ikke immun-utfelte et protein fra YF-infiserte celler. Både JE- og YF-hyperimmunsera viste kryss-reaktivitet med hensyn til de to kapselproteiner, men størrelsesforskjellen mellom proteinene (YF=53 kD, ikke-glykosylert; JE=55 kD, glykosylert) kunne observeres reproduserbart. Anvendelse av monoklonale YF-antistoffer var ikke tilfredsstillende under immunutfellingsbetingelsene, og således var spesifisiteten avhengig av de monoklonale JE-antistoffer ved denne analyse. Plakkreduksjons-nøytralisasjonsundersøkelse (PRNT) ble utført for de kimæriske virus og YF- og JE SAu-14-2-virusene under anvendelse av YF- og JE-spesifikt hyperimmun-ascites-væske (ATCC) og YF-spesifikt renset IgG (monoklonalt antistoff 2E10). Det ble observert betydelige forskjeller i 50% plakkreduksjonstiteret for disse antisera for kimærene sammenliknet med kontrollvirusene i disse forsøk (tabell 3). Således uttrykkes epitoper som er nødvendige for nøytralisering, i de infeksiøse kimæriske YF/JE-virus.

Vekstegenskaper i cellekultur

Vekstevnen hos kimærene er blitt undersøkt kvantitativt i cellelinjer både av primat- og moskito-opprinnelse. Fig. 2 illustrerer kurvene for kumulativ vekst av kimærene på LLC-MK2-celler etter lavmultiplisitets-infisering (0,5 plakkdannende enheter pr. celle). I dette forsøk ble det anvendt YF5.2iv- (klonet derivat) og JE SA14-14-2- (ikke-klonede) virus for sammenlikning. Begge de kimæriske virus nådde et maksimalt virusutbytte på omtrent én log høyere enn hvert modervirus. Når det gjaldt YF/JE SAi4-14-2-kimærene, oppsto toppen for virusdannelse 12 timer senere enn for YF/JE Nakayama-kimærene (50 timer sammenstilt med 38 timer). YF/JE-Nakayama-kimærene oppviste betydelig mer cytopatiske virkninger enn YF/JE SAi4-14-2-kimærene på denne cellelinje. Et liknende forsøk ble utført i C6/36-celler etter lavmultiplisitets-infisering (0,5 plakkdannende enheter pr. celle). Fig. 2 illustrerer også vekstkinetikken for virusene i denne invertebrat-cellelinje. Liknende virus-utbytter ble oppnådd på alle punkter anvendt for virushøst i dette forsøk, noe som ytterligere underbygger den oppfatning at kimæriske virus ikke er svekket når det gjelder replikasjonsevne.

Sammenlikning av vekstkinetikk hos RMS ( YF/ JE SAu- 14- 2) med YF 17D- vaksine i MRC- 5- celler

Det ble utført et forsøk for vurdering av evnen hos vaksine-kandidaten til formering i en cellelinje som er akseptabel for humane vaksiner. Kommersiell gulfeber 17D-vaksine (YF-Vax®) ble anskaffet fra Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. MRC-5 (diploide humane foster-lungeceller) ble anskaffet fra ATCC (171-CCL, sats nr.: F-14308, overføring 18) og dyrket i EMEM, 2 mM L-GIn, Earle's BSS justert til å inneholde 1,5 g/l natriumbikarbonat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, samt 10% FBS.

For sammenlikning av vekstkinetikken for RMS (Research Master Seed, YF/JE SAi4-14-2) med YF-Vax® ble celler dyrket til 90% konfluens og infisert med RMS eller YF-Vax® i en MOI på 0,1 pfu. Siden MRC-5-celler vanligvis vokser langsomt, ble disse celler holdt i 10 dager etter inokulering. Prøver ble frosset daglig i 7-10 dager og smitte-evnen bestemt ved hjelp av plakkanalyse i Vero-celler.

YF-Vax® og YF/JE-kimæren vokste til moderate titrer i MRC-5-celler (fig. 3). Topp-titeret var -4,7 log™ pfu for YF-Vax® oppnådd på den andre dag og var litt lavere, 4,5 log™ pfu, for RMS etter 6 dager.

Neurovirulens- undersøkelse hos normale voksne mus

Virulens-egenskapene hos YF/JE SAi4-14-2-kimærene ble analysert hos unge voksne mus ved intracerebral inokulering. Grupper på 10 mus (4 uker gamle hann-og hunn-ICR-mus, 5 i hver gruppe) ble inokulert med 10 000 plakkdannende enheter av YF/JE SA14-14-2-kimæren, YF5.2iv, eller JE SA14-14-2 og observert daglig i 3 uker. Resultatene av disse forsøk er illustrert på fig. 4. Mus som fikk YF5.2iv-moderviruset, bukket under omtrent 1 uke etter inokulering. Det ble ikke observert noen dødelighet eller sykdom blant mus som enten fikk JE SAi4-14-2-moderviruset eller kimæren. Inokuleringsmaterialene som ble anvendt for forsøkene, ble titrert på injeksjonstidspunktet, og en undergruppe av musene som overlevde, ble undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av nøytraliserende antistoffer for bekreftelse av at infisering hadde funnet sted. Blant de testede mus var titere mot JE SAu-14-2-viruset likt for dyr som enten fikk denne stamme eller kimæren.

Resultatene av ytterligere forsøk hvor neurovirulensen hos YF/JE SAi4-14-2-kimæren i mus ble undersøkt, er illustrert i tabell 4.1 disse forsøk døde alle musene som var inokulert med YF5.2iv, i løpet av 7-8 dager. I motsetning til dette døde ingen av musene inokulert med YF/JE SAi4-14-2 i løpet av to ukers observasjon etter inokulering.

Resultatene av forsøk hvor neuro-invasjonsevnen og patogenesen hos YF/JE-kimærer undersøkes, er illustrert i tabell 5.1 disse forsøk ble de kimæriske virus inokulert i 3 uker gamle mus i doser som varierte mellom 10 000 og 1 million plakkdannende enheter ved intraperitoneal administrering. Ingen av musene som var inokulert med YF/JE Nakayama eller YF/JE SAi4-14-2, døde i løpet av tre ukers observasjon etter inokulering, noe som viste at viruset ikke kunne forårsake sykdom etter perifer inokulering. Mus inokulert med YF/JE SAi4-14-2 utviklet nøytraliserende antistoffer overfor JE-virus (fig. 7).

Konstruksjon av cDNA- templater for dannelse av kimæriske gulfeber/ dengue-( YFZDEN)- virus

Frembringelse av kimæriske gulfeber/dengue-(YF/DEN)-virus er beskrevet som følger, og utføres i prinsippet på samme måte som konstruksjon av YF/JE-kimærene beskrevet ovenfor. Andre flavivirus-kimærer kan konstrueres ved en liknende fremgangsmåte, under anvendelse av naturlige eller konstruerte restriksjonsseter og for eksempel oligonukleotid-primere som vist i tabell 6.

Konstruksjon av kimæriske YF/ DEN- virus

Skjønt det er blitt utviklet flere molekylkloner for dengue-virus, har man vanligvis støtt på problemer når det gjelder stabiliteten av virus-cDNA i plasmid-systemer samt effektiviteten av replikasjonen av det oppnådde virus. Vi valgte å anvende en klon av DEN-2 utviklet av dr. Peter Wright, Dept. of Microbiology, Monash University, Clayton, Australia, på grunn av at dette system er relativt effektivt til regenerering av virus og anvender et toplasmid-system i likhet med vår egen metodikk. Den komplette sekvens for denne DEN-2-klon er tilgjengelig og gjorde konstruksjonen av kimæriske YF/DEN-templater lettere på grunn av at det bare var nødvendig med noen få modifikasjoner av YF-klonen. De aktuelle trinn er i store trekk angitt som følger.

I likhet med toplasmid-systemet for YF5.2iv- og YF/JE-virusene, anvender YF/DEN-systemet et unikt restriksjonssete i DEN-2-kapselproteinet (E) som avbrytelsespunkt («break point») for formering av strukturområdet (prM-E) i de to plasmider, i det følgende omtalt som YF5'3'IV/DEN (prM-E') og YFM5.2/DEN (E'-E)

(se fig. 5). De to restriksjonsseter for ligering in vitro av det kimæriske templat er Aatll og Sphl. Mottakerplasmidet for 3'-delen av DEN E-proteinsekvensen er YFM5.2(Narl[+]Sphl[-]). Dette plasmid inneholder Narl-setet ved E/NSI-koplingen,

som ble anvendt for innføring av den karboksylterminale ende av JE E-proteinet. Det ble ytterligere modifisert ved eliminering av et ekstra Sphl-sete i NS5-proteinområdet ved stum setedirigert mutagenese. Dette muliggjorde innføring av DEN-2-sekvens fra det unike Sphl-sete til Narl-setet ved enkel retningskloning. Det hensiktsmessige

fragment av DEN-2-cDNA ble oppnådd ved PCR fra DEN-2-klonen MON310 tilveiebrakt av dr. Wright. PCR-primere innbefattet en 5'-primer som flankerte Sphl-setet, og en 3'-primer homolog med DEN-2-nukleotidene like oppstrøms for signalase-setet ved E/NSI-koplingen, og erstattet signalase-setet ved substitusjoner som frembringer et nytt sete, men som også innfører et Narl-sete. Det resulterende PCR-fragment på 1 170 basepar ble deretter innført i YFM5.2(Narl[+]Sphl[-]).

5'-delen av DEN-2-klonen innbefattende prM og den aminoteminale del av E-proteinet ble konstruert i YF5'3'IV-plasmidet under anvendelse av en kimærisk PCR-primer. Den kimæriske primer, som innbefattet 3'-enden av negativ-sense-YF C-proteinet og 5'-enden av DEN-2 prM-proteinet, ble anvendt med en positiv sense-primer som flankerte SP6-promotoren av YF5'3'IV-plasmidet under dannelse av et PCR-produkt på 771 basepar med en 20 base-forlengelse som representerte DEN-2 prM-sekvensen. Dette PCR-produkt ble deretter anvendt til å prime DEN-2-plasmidet sammen med en 3'-primer som representerte DEN-2-sekvensen 1 501-1 522 og flankerte Sphl, under dannelse av et slutt-PCR-produkt med 1 800 basepar innbefattende YF-sekvensen fra Notl-setet til og med det ikke-translaterte SP6-promotor-YF 5'-område, og YF C-protein, som grenser opp til DEN-2 prM-E1522-sekvensen. PCR-produktet ble ligert i YF5'3'IV under anvendelse av Noti- og Sphl-seter, hvorved man fikk YF5'3'IV/DEN(prM-E)-plasmidet.

Konstruksjon av kimæriske templater for andre flavivirus

Metoder for frembringelse av cDNA-templater i hel lengde, som koder for kimæriske YF/MVE-, YF/SLE-, YF/WN-, YF/TBE-virus, er lik dem som er beskrevet ovenfor for YF/DEN-2-systemet. Tabell 6 illustrerer aspektene ved fremgangsmåten for frembringelse av YF17D-baserte kimæriske virus. De unike restriksjonsseter anvendt for in vitro-ligering, samt de kimæriske primere for konstruksjon av C/prM-og E/NSI-koplingene, er også vist. Kilder til cDNA for disse heterologe flavivirus er lett tilgjengelige (MVE: Dalgarno et al., J. Mol. Biol. 187:309-323,1986; SLE: Trent et al., Virology 156:293-304, 1987; TBE: Mandl et al., Virology 166:197-205, 1988; Dengue 1: Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Dengue 2: Deubel et al., Virology 155:365-377, 1986; Dengue 3: Hahn et al., Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao et al., Virology 155:77-88, 1986).

En alternativ fremgangsmåte for konstruksjon av ytterligere kimæriske virus er å danne C/prM-koplingen ved hjelp av stumpende-ligering av PCR-oppnådde restriksjonsfragmenter med ender som møtes ved denne kopling og 5'- og 3'-terminale ender som flankerer passende restriksjonsseter for innføring i YF5'3'IV eller et mellomliggende plasmid så som pBS-KS(+). Valget å anvende et kimærisk oligonukleotid eller stumpende-ligering vil variere, avhengig av tilgjengeligheten av unike restriksjonsseter i det kapselprotein-kodende område av det aktuelle virus.

Konstruksjon av YF- virus som koder for HCV- antigener

På grunn av at strukturproteinene E1 og E2 i HCV ikke er homologe med strukturproteinene i flavivirusene beskrevet ovenfor, innbefatter metoden for ekspresjon av disse proteiner innsetting i et ikke-essensielt område i genomet, slik at alle disse proteiner så ko-uttrykkes med gulfeber-proteiner under virus-replikasjon i infiserte celler. Området som skal innsiktes for innføring av proteinene, er den N-terminale del av NS 1-proteinet, siden hele NS1 -proteinet ikke fordres for virus-replikasjon. På grunn av de potensielle problemer med stabilitet av YF-genomet i nærvær av heterolog sekvens som overgår den normale størrelse av genomet (omtrent 10 000 nukleotider), kan påvisningsmetoden beskrevet nedenfor anvendes. Dessuten kan utelukkelse av NS1 være fordelaktig i de kimæriske YF/flavivirus-systemer beskrevet ovenfor, på grunn av at delvis utelukkelse av dette protein kan motvirke immuniteten overfor YF forbundet med antistoffer mot NS1, og således omgå problemer med vektor-immunitet hvis det var nødvendig med mer enn én kimærisk vaksine i en gitt mottaker, eller hvis en YF-vaksine tidligere var blitt gitt eller nødvendig på et fremtidig tidspunkt.

Metoden innbefatter frembringelse av en serie av delesjoner i ramme i det NS1-kodende område av YFM5.2-plasmidet, sammen med konstruksjon av et translasjonelt terminerings-kodon i enden av E, og en serie av to IRES (interne ribosominnføringsseter). Ett IRES er like nedstrøms for terminerings-kodonet og muliggjør ekspresjon av en åpen leseramme i området mellom E og NS1. Det annet IRES setter i gang translasjon fra avkortede NS1 -proteiner under tilveiebringelse av ekspresjon av resten av YF-ikkestruktur-polyproteinet. Disse derivater undersøkes med hensyn til gjenvinning av infeksiøse virus, og konstruksjonen med den største delesjon anvendes for innføring av fremmede sekvenser (f.eks. HCV-proteiner) i det første IRES. Denne spesielle konstruksjon kan også tjene som basis for bestemmelse av om hvorvidt utelukkelse av NS1 vil påvirke vektorspesifikk immunitet i forbindelse med kimæriske YF/flavivirus-virus som uttrykker prM-E, som beskrevet ovenfor.

Innsetting av nukleotider som koder for E1-, E2- og/eller E1 pluss E2-HCV-proteiner, er begrenset av størrelsen av delesjonen som tolereres i NS1 -proteinet. På grunn av dette kan avkortede HCV-proteiner anvendes til forøking av stabiliteten i den modifiserte YF-klon. HCV-proteinene konstrueres med en N-terminal signal-sekvens like etter IRES og et terminerings-kodon i den C-terminale ende. Denne konstruksjon vil styre HCV-proteinene inn i det endoplasmatiske retikulum for utsondring fra cellen. Metoden for denne konstruksjon er vist skjematisk på fig. 6. Plasmider som koder for HCV-proteiner av genotype I, kan anvendes for disse konstruksjoner, for eksempel HCV-plasmider anskaffet fra dr. Charles Rice ved Washington University (Grakoui et al., J. Virology 67:1385-1395, 1993), som har uttrykt dette område i viruset i bearbeidelsessystemer og i et replikasjons-komplement-HCV-klon i hel lengde.

PrM- spaltningsdelesjons- mutanter som svekkende vaksinekandidater for flavivirus

Ytterligere kimæriske virus som inngår i oppfinnelsen, inneholder mutasjoner som hindrer prM-spaltning, så som mutasjoner i prM-spaltningssetet. For ek-sempel kan prM-spaltningssetet i aktuelle infeksiøse flavivirus-kloner, så som dengue, TBE, SLE og andre, muteres ved setedirigert mutagenese. Hvilken som helst eller alle av aminosyrene i spaltningssetet, som angitt ovenfor, kan utelukkes eller erstattes. Et nukleinsyrefragment inneholdende de muterte prM-E-gener kan så innføres i en gulfebervirus-vektor under anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. prM-delesjonen kan anvendes med eller uten andre svekkende mutasjoner, for eksempel mutasjoner i E-proteinet, for innføring i gulfeberviruset. Disse mutanter har fordeler fremfor enkelt-substitusjons-mutanter som vaksine-kandidater på grunn av at det nesten er umulig å snu den utelukkede sekvens og gjenopprette virulens.

Følgende kimæriske flavivirus ifølge oppfinnelsen ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, U.S.A. under betingelsene ifølge Budapest-Traktaten, og innvilget deponeringsdatoen 6. januar 1998: Kimærisk gulfeber 17D/dengue type 2-virus (YF/DEN-2; ATCC adkomstnummer ATCC VR-2593) og kimærisk gulfeber 17D/japansk encefalitt SAi4-14-2-virus (YF/JE A1.3; ATCC adkomstnummer ATCC VR-2594).

1,2: Kolonnen illustrerer oligonukleotidet som anvendes til dannelse av kimæriske YF/flavivirus-primere svarende til C/prM- eller E/NSI-koplingen (se tekst). X = karboksylterminal kodingssekvens for YF-kapsidet. Det understrekede område svarer til den innsiktede heterologe sekvens like oppstrøms for Narl-setet (antisense-ccgcgg). Dette sete muliggjør innsetting av PCR-produkter i Yfm5.2 (Narl)-plasmidet som er nødvendig for dannelse av cDNA-templater i hel lengde. Andre nukleotider er spesifikke for det heterologe virus. Oligonukleotid-primere er oppført fra 5' til 3'.

3,4: De unike restriksjonsseter anvendt for frembringelse av restriksjonsfragmenter som kan isoleres og ligeres in vitro under dannelse av kimæriske cDNA-templater i hel lengde, er oppført. På grunn av at noen sekvenser ikke inneholder passende seter, er det i noen tilfeller nødvendig med konstruksjon av hensiktsmessige seter (fotnote 5).

5:1 parenteser er restriksjonsenzym-setene som enten må frembringes i YF-skjelettet eller i det heterologe virus for å muliggjøre effektiv ligering in vitro. Seter som ikke står i parentes, må elimineres. Alle slike modifikasjoner er utført ved stum mutagenese av cDNA for den respektive klon. Åpne mellomrom angir at det ikke er nødvendig med noen modifikasjon av cDNA-klonene.

Andre utførelsesformer

Andre utførelsesformer er innenfor de følgende krav. For eksempel kan prM-E-proteingenene fra andre flavivirus av medisinsk betydning innsettes i gulfeber-vaksinevirusskjelettet under dannelse av vaksiner mot andre medisinsk viktige flavivirus (se f.eks. Monath et al., «Flaviviruses» i Virology, Fields (red.), Raven-Lippincott, New York, 1995, volum I, 961-1034).

Eksempler på ytterligere flavivirus fra hvillke gener for innsetting i de kimæriske vektorer ifølge oppfinnelsen kan fås, innbefatter f.eks. Kunjin-, sentraleuropeisk encefalitt-, russisk vår-sommer-encefalitt-, Powassan-, Kyasanur Forest-sykdom- og omsk hemoragisk feber-virus. Dessuten kan det innsettes gener fra virus med enda fjernere slektskap i gulfeber-vaksineviruset for konstruksjon av nye vaksiner.

Vaksinefremstilling og - anvendelse

Vaksinene ifølge oppfinnelsen administreres i mengder, og ved anvendelse av metoder, som lett kan bestemmes av vanlige fagfolk på dette område. Vaksinene kan administreres og utformes for eksempel på samme måte som gulfeber 17D-vaksinen, f.eks. som en klaret suspensjon av infisert kyllingfostervev, eller en fluid høstet fra cellekulturer infisert med det kimæriske gulfebervirus. Således utformes det levende, svekkede kimæriske virus som en steril vandig løsning inneholdende mellom 100 og 1 000 000 infeksiøse enheter (f.eks. plakkdannende enheter eller vevskultur-infeksiøse doser) i et dosevolum på 0,1-1,0 ml, for administrering for eksempel ved intramuskulær, subkutan eller intradermal metode. På grunn av at flavivirus kan være i stand til å infisere den menneskelige vert via slimhinneveiene, så som oralt (Gresikova et al., «Tick-borne Encephalitis» i The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (red.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, volum IV, 177-203), kan vaksineviruset dessuten administreres ved en slimhinnemetode for oppnåelse av en beskyttende immunrespons. Vaksinen kan administreres som et primært profylaktisk middel til voksne eller barn med risiko for flavivirus-infeksjon. Vaksinene kan også anvendes som sekundære midler for behandling av flavivirus-infiserte pasienter ved stimulering av en immunrespons overfor flaviviruset.

Det kan være ønskelig å anvende gulfeber-vaksinevektorsystemet for immunisering av en vert mot ett virus (for eksempel japansk encefalitt-virus) og senere immunisere det samme individ på nytt mot et andre eller tredje virus under anvendelse av en annen kimærisk konstruksjon. En betydelig fordel med det kimæriske gulfebersystem er at vektoren ikke vil fremkalle sterk immunitet overfor seg selv. Heller ikke vil tidligere immunitet overfor gulfebervirus utelukke anvendelse av den kimæriske vaksine som vektor for heterolog gen-ekspresjon. Disse fordeler skyldes fjerning av den del av gulfebervaksine E-genet som koder for nøytralise-rende (beskyttende) antigener overfor gulfeber, og erstatning med et annet, heterologt gen som ikke gir kryssbeskyttelse mot gulfeber. Skjønt YF17D-virus-ikkestrukturproteiner kan spille en rolle ved beskyttelse, for eksempel ved frembringelse av antistoffer mot NS1, som inngår ved komplementavhengig antistoff-formidlet lysering av infiserte celler (Schlesinger et al., J. Immunology 135:2805-2809, 1985) eller ved indusering av cytotoksiske T-celleresponser overfor NS3 eller andre proteiner i viruset, er det usannsynlig at disse responser vil motvirke en levende virusvaksines evne til stimulering av nøytraliserende antistoffer. Dette underbygges av de faktum at (1) individer som på forhånd er blitt infisert med JE-virus, svarer på vaksinering med YF17D i likhet med personer uten tidligere JE-infeksjon, og (2) individer som tidligere har fått YF17D-vaksinen, svarer på re-vaksinering med en stigning i titere av nøytraliserende antistoff (Sweet et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Den kimæriske vektor kan således anvendes i populasjoner som er immune overfor gulfeber på grunn av tidligere naturlig infeksjon eller vaksinasjon, og kan anvendes gjentatte ganger, eller til immunisering samtidig eller sekvensielt med flere forskjellige konstruksjoner, innbefattende gulfeber-kimærer med innskudd fra for eksempel japansk encefalitt-virus, St. Louis-encefalittvirus eller West Nile-virus.

For vaksineanvendelser kan det anvendes hjelpestoffer som er kjent for fagfolk på området. Hjelpestoffer som kan anvendes for forøking av immuno-geniteten av de kimæriske vaksiner, innbefatter for eksempel liposom-preparater, syntetiske hjelpestoffer, så som saponiner (f.eks. QS21), muramyldipeptid, monofosforyllipid A eller polyfosfazin. Skjønt disse hjelpestoffer typisk anvendes for forøking av immunresponser overfor inaktiverte vaksiner, kan de også anvendes med levende vaksiner. Når det gjelder en kimærisk vaksine gitt via slimhinnemetode, for eksempel oralt, er slimhinne-hjelpestoffer så som det varmelabile toksin fra E. coli (LT) eller mutant-derivater av LT, egnede hjelpestoffer. Dessuten kan det innsettes gener som koder for cytokiner som har hjelpestoff-virkninger, i gulfeber-vektorene. Således kan det innsettes gener som koder for cytokiner, så som GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 eller IL-5, sammen med heterologe flavivirus-gener for dannelse av en vaksine som resulterer i økte immunresponser, eller for modulering av immunitet rettet mer spesifikt mot cellulær-, humoral- eller slimhinneresponser. I tillegg til vaksineanvendelser, kan vektorer, som en fagperson på området lett vil forstå, anvendes ved genterapimetoder for innføring av terapeutiske genprodukter i en pasients celler. Ved disse metoder innføres gener som koder for terapeutiske genprodukter, i vektorene, for eksempel i stedet for genet som koder for prM-E-proteinet.

En ytterligere fordel med gulfeber-vektorsystemet er at flavivirus replikeres i cellers cytoplasma, slik at virus-replikasjons-fremgangsmåten ikke innbefatter innlemming av virusgenomet i vertscellen (Chambers et al. (1990) «Flavivirus Genome Organization, Expression, and Replication», i Annual Review of Microbiology 44:649-688), noe som representerer en viktig sikkerhetsforanstaltning.

Claims

1. Kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus, karakterisert ved at den omfatter: et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein er enten utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og innlemmet i genomet til nevnte gulfeberviruset, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-protein fra det annet flavivirus uttrykkes, hvor signalsekvensen ved C/prM grensen til nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

2. Kimærisk virus ifølge krav 1-2, karakterisert ved at nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet fra nevnte annet, annerledes flavivirus, erstatter nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet i gulfeberviruset.

3. Kimærisk virus ifølge krav 1-2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er et japansk encefalitt-(JE)-virus.

4. Kimærisk virus ifølge krav 1-2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er et denguevirus.

5. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 1.

6. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 2.

7. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 3.

8. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 4.

9. Kimærisk virus ifølge krav 1-2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er valgt fra gruppen som består av et Murray Valley-encefalitt-virus, et St. Louis-encefalitt-virus, et West Nile-virus, et flåttbåret encefalitt-virus, et hepatitt C-virus, et Kunjin-virus, et centraleuropeisk encefalitt-virus, et russisk vår-sommer-encefalitt-virus, et Powassan-virus, et Kyasanur Forest-sykdomsvirus og et omsk hemoragisk feber-virus.

10. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er et West Nile-virus.

11. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er flåttbåret encefalitt-virus.

12. Kimærisk virus ifølge krav 1 -2, karakterisert ved at nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet fra nevnte annet, annerledes flavivirus, omfatter en mutasjon som forhindrer prM-spaltning under dannelse av M-protein.

13. Kimærisk virus ifølge krav 1,karakterisert ved at signalsekvensene i C/prM og E/NS1 -koplingene av nevnte gulfebervirus holdes i konstruksjon av nevnte kimæriske flavivirus.

14. Anvendelse av et kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus ved fremstilling av et medikament for forebygging eller behandling av flavivirus-infeksjon hos en pasient, hvor det kimæriske, levende, infeksiøse, svekkede virus omfatter et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein, enten er utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og innlemmet i genomet i gulfeberviruset, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein fra et annet, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-protein fra nevnte annet flavivirus uttrykkes idet signalsekvensen ved C/prM-E-koplingene av nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet fra nevnte annet, annerledes flavivirus, erstatter nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet i gulfeberviruset.

16. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er et japansk encefalitt (JE)-virus.

17. Anvendelse ifølge krav 14-15,hvor det annet flavivirus er et denguevirus.

18. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er dengue-type 1.

19. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er dengue-type 2.

20. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er dengue-type 3.

21. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er dengue-type 4.

22. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er valgt fra gruppen bestående av et Murray Valley-encefalitt-virus, et St. Louis-encefalitt-virus, et West Nile-virus, et flåttbåret encefalitt-virus, et hepatitt C-virus, et Kunjin-virus, et centraleuropeisk encefalitt-virus, et russisk vår-sommer-encefalitt-virus, et Powassan-virus, et Kyasanur Forest-sykdomsvirus og et omsk hemoragisk feber-virus.

23. Anvendelse ifølge krav 14-15, karakterisert ved at det annnet flavivirus er et West Nile-virus.

24. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor det annet flavivirus er et flåttbåret encefalittvirus.

25. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor nevnte nukleotidskvens som koder for prM-E-proteinet fra nevnte annet, annerledes flavivirus, omfatter en mutasjon som forhinderer prM-spaltning med dannelse av M-protein.

26. Anvendelse ifølge krav 14-15, hvor signalsekvensene i C/prM- og E/NS 1-koplingene i nevnte gulfebervirus blir opprettholdt i konstruksjon av nevnte kimæriske flavivirus.

27. Nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for et kimærisk, levende, infeksiøst, svekket virus, hvor viruset omfatter: et gulfebervirus hvor nukleotidskvensen som koder for et prM-E-protein, enten er utelukket, avkuttet eller mutert slik at funksjonelt gulfebervirus-prM-E-protein ikke uttrykkes, og innlemmet i genomet til nevnte gulfebervirus, en nukleotidskvens som koder for et prM-E-protein fra et annet, annerledes flavivirus, slik at nevnte prM-E-proteint fra nevnte annet flavivirus uttrykkes, hvor signalsekvensen ved C/prM-koplingene av nevnte gulfebervirus blir opprettholdt.

28. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27, karakterisert ved at nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet fra det annet, annerledes flavivirus, erstatter nukleotidskvensen som koder for prM-E-proteinet i gulfeberviruset.

29. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er et japansk encefalitt (JE)-virus.

30. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er et denguevirus.

31. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 1.

32. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 2.

33. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 3.

34. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte annet flavivirus er dengue-type 4.

35. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at det annet flavivirus er valgt fra gruppen som består av et Murray Valley-encefalitt-virus, et St. Louis-encefalitt-virus, et West Nile-virus, et flåttbåret encefalitt-virus, et hepatitt C-virus, et Kunjin-virus, et centraleuropeisk encefalitt-virus, et russisk vår-sommer-encefalitt-virus, et Powassan-virus, et Kyasanur Forest-sykdomsvirus og et omsk hemoragisk feber-virus.

36. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at det annet flavivirus er West Nile-viurs.

37. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at det annet flavivirus er flåttbåret encefalitt-virus.

38. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at nevnte nukleotidskvens som koder for prM-E-protein fra nevnte annet, annerledes flavivirus, omfatter en mutasjon som forhindrer prM-spaltning under dannelse av M-protein.

39. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 27-28, karakterisert ved at signalsekvensene i C/prM- og E/NS1 -koplingene avn nevnte gulfebervirus holdes i konstruksjon av nevnte kimæriske flavivirus.

40. Vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter det kimæriske viruset ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13.