CZ300172B6 - Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující - Google Patents
Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300172B6 CZ300172B6 CZ0306499A CZ306499A CZ300172B6 CZ 300172 B6 CZ300172 B6 CZ 300172B6 CZ 0306499 A CZ0306499 A CZ 0306499A CZ 306499 A CZ306499 A CZ 306499A CZ 300172 B6 CZ300172 B6 CZ 300172B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- prm
- protein
- flavivirus
- chimeric
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 121
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 title abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims abstract description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 51
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims abstract description 22
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 114
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 14
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 14
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 claims description 14
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 claims description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 13
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 11
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 10
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 7
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 241000710912 Kunjin virus Species 0.000 claims description 5
- 241000710884 Powassan virus Species 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 208000037404 Central European encephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000725177 Omsk hemorrhagic fever virus Species 0.000 claims description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 claims description 2
- 241000907329 Russian Spring-Summer encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000005476 soldering Methods 0.000 claims 2
- 206010057199 Flaviviral infections Diseases 0.000 claims 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 10
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 241001147422 tick-borne encephalitis virus group Species 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 7
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 7
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 229940124928 YF-Vax Drugs 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 3
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229960001515 yellow fever vaccine Drugs 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000013515 script Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- HSOLPAFROQCEQW-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SEK 15 Natural products Cc1cc(O)cc(O)c1C(=O)c2c(O)cc(O)cc2CC3=CC(=O)C=C(O)O3 HSOLPAFROQCEQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004398 Ethyl lauroyl arginate Substances 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 1
- 241001466978 Kyasanur forest disease virus Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 101710152005 Non-structural polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710114167 Polyprotein P1234 Proteins 0.000 description 1
- 101710124590 Polyprotein nsP1234 Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 1
- 241000710764 Yellow fever virus 17D Species 0.000 description 1
- 229940124926 Yellow fever virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000004294 calcium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- QCOXCILKVHKOGO-UHFFFAOYSA-N n-(2-nitramidoethyl)nitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NCCN[N+]([O-])=O QCOXCILKVHKOGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000010463 virion release Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Chimerický, živý, infekcní, oslabený virus, kterýzahrnuje virus žluté horecky, ve kterém je nukleotidová sekvence pro prM-E protein bud deletována, okleštena, nebo zmutována, takže není exprimován funkcní prM-E protein, a do genomu tohoto viru žluté horecky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, takže prM-E protein tohoto druhého flaviviru exprimován je, pricemž jsou signální sekvence v C/prM aE/NS1 spojeních udržovány v konstrukci zmíneného chimerickém flaviviru, jeho použití pro prípravu léciv pro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcíu pacientu a molekula nukleové kyseliny jej kódující.
Description
Chiméricky živý, infekční, oslabený virus, léčivo pro prevenci nebo léčbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje k infekčním, oslabeným virům, které jsou použitelné jako vakcíny proti onemocněním způsobovaným flaviviry.
io
Dosavadní stav těchniky
Několik členů patřících do čeledě Havivirů v současnosti jsou hrozbou nebo potenciálně mohou být ohrožením globálního obecného zdraví. Například Japonská encefalitida je závažným obec15 ným zdravotním problémem, který představuje nebezpečí pro miliony jednotlivců na Dalekém Východě. Virus horečky Dengue, který je každoročně celosvětově odhadován jako příčina 100 milionů případů primární horečky Dengue a více než 450 000 případů hemoragické horečky Dengue, byl vyhodnocen jako jedna z nej významnějších a rthropod přenosných lidských chorob. Další ílaviviry pokračují ve způsobování endemických chorob u různých živočichu a mají poten2o ciál vniknout i do nových oblastí, jakými jsou příčiny změn klimatu, vektor populací a výsledky narušení životního prostředí způsobované lidskou činností. Tyto ílaviviry zahrnují například St. Louis encefalitický virus, který' způsobuje sporadickou, ale vážnou akutní chorobu na středozápadě, jihovýchodě a západě Spojených států amerických; Západonilský virus, který způsobuje horečnatá onemocnění, příležitostně komplikovaná akutní encefalitidou a je významně rozšířen v Africe, na Středním Východě, v dřívějším Sovětském svazu a některých částech Evropy; Murray Val lev encefal ilický virus, který způsobuje endemieke onemocnění nervového systému v Austrálii a Klíšťový encefalitieký virus, který je rozšířen v bývalém Sovětském svazu a východní Evropě, kde jeho klíšťový nosič je běžný a je odpovědný za vážnou formu encefalitidy v těchto regionech.
Virus iiepatitidy C (HCV)je dalším členem čeledě flaviviru, jehož organizace genomu a replikační strategie jsou podobné, ale nikoliv identické těm virům, které jsou zmíněny výše. i ICV virus, který je přenášen hlavně mimo střevní expozicí, je spojen s chronickou hepatitidou. která sc může vyvinout do cirhóze jater a hepatoeelulárního karcinomu a je vedoucí příčinou jaterních onemoc55 nční, která vyžadují orthotopickou transplantaci ve Spojených státech amerických.
Čeleď Elaviviridae je odlišná od alfavirů (např.: WEE, VEE, EEE, SEV atd.) a v současnosti zahrnuje Iři rody: ílaviviry, pěst i viry a viry hepalitidy C. Zcela zralé viriony flavi v iru obsahují tři strukturní proteiny, obálky (E). kapsidy (C) a membrány (M) a sedm ncstrukturních proteinů
4«) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5). Nezralé viriony nalézají v buněčném obsahu infikovaných buněk pre-niembránový (prM) protein, který je prekurzorem membránového proteinu M.
Po navázání virionů na receptory hostitelské buňky, E protein prochází ne vratnou konformační změnou pod vlivem kyselého pH endozomů, což způsobuje fůzi mezi dvojvrstevnou obálkou virionů a endocytickými váčky, a tudíž dochází k vypuštění virálního genomu do cytosolu hostitelské buňky. Viry klíšťové encefalitidy (TBE), které obsahují prM protein, jsou neschopné fůze, což znamená, že proleolytická úprava prM proteinu je nezbytná pro vytvoření virionů. které jsou schopné fůze a jsou to zcela infekční viriony (Guirakhoo ei aí. J. Gen. Virol. 72 (pt. 2):333 až
338, 1991). Pozdějším použitím chloridu amonného vc virovém replikačním cyklu byly produkovány Murray Valley cncefalitícké viry (MVE), které obsahovaly prM protein, a které byly neschopné fúze. Za použití peptidů specifické sekvence a monoklonálních protilátek bylo demonstrováno, že prM protein interagujc s aminokyselinami 200 až 327 E proteinu. Tato interakce je nezbytná proto, aby ochránila E protein před nevratnými konfirmačními změnami způsobovaný- I CZ 300172 B6 mi maturací virionů v kyselých měchýřcích exocvtické cesty (Guirakhoo eí aL, Virology 191:921 až 931. 1992).
Štěpení prM proteinu na M protein se objevuje krátce před vypuštěním virionů. provádí ho celulární proteáza podobná furinu (Stadler eí al., i. Virol. 71:8475 až 8481, 1997) a je nezbytné pro aktivaci hcmoaglutinační aktivity, fusogení aktivity a infekčnosti virionů. M protein je vy štěpen ze svého prekurzoru v souhlasné sekvenci R-X-R/K-R (X je variabilní) a je začleněn do virové lipidové obálky společně s E proteinem.
io Štěpící sekvence byly konzervativní ne pouze u flavivirů, ale také u proteinů ostatních nepříbuzných v iru takový, jako jsou PE2 myších koronavirů, PE2 alíavirů. HA chřipkových virů a p 160 retrovirů. Štěpení prekurzového proteinu je hlavní pro virovou infektívitu, ale ne pro vy tvoření vírové částice. Bylo prokázáno, že v případě TBE-dengue 4 chiméry, změna v štěpícím místě prM proteinu vede ke snížení neurovirulence této chiméry (Pletncv eí al., J. Virol. 67:4956 až i? 4963, 1993). cožjc v- souladu s předchozím pozorováním, že dostatečná úprava prM proteinu je nezbytná pro plnou inťekčnost (Guirakhoo etaí, 1991. výše, 1992. výše; Heinz eí al., Virology 198:109 až 1 17, 1994). Protilátky proti prM proteinu mohou zprostředkovat ochranou imunitu. zjevně z důvodu neutralizace vypuštěných virionů, které obsahují nějaký nenašlěpený prM protein. Proteolytieké štěpící místo v PE2 u VEE (4 aminokyseliny) bylo deletováno cílenou
2(i inulagenezí infekčního klonu (Smith eíal., ASTMH meeting, Deceniber 7-1 t, 1997). Deleční mutanty se replikovaly s velkou účinností a PE2 proteiny byly začleňovány do částic. Tento mutant by l odzkoušen na neb umán nich primátech a vykazoval 100% scrokonzervaci a ochraňoval všechny imunizované opice před smrtelnými změnami.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález charakterizuje chimérické, živé, infekční, oslabené viry tak. že je každý tvořen takto:
a) první virus žluté horečky (např.: kmen 17D). který představuje živou, oslabenou virovou vakcínu. v které je nuklcolidová sekvence pro prM E protein buď delctována. oklestěna, nebo zmutována tak, že funkční prM-E protein prvního flavivirů není exprimován, a
b) nukleotidová sekvence kódující virálni obálku (prM-E proteinů) druhého, odlišného flaviviru. je integrována do genomu prvního flavivirů, takže prM-E protein druhého flavivirů jc exprimován z pozměněného genomu prvního flavivirů, přičemž jsou signální sekvence v C/prM a E/NS1 spojeních udržovány v konstrukci zmíněného chimérickém flavivirů.
Chimérický virus je tudíž tvořen geny a genovými produkty odpovědnými za intraeelulární replikaci patřící prvnímu flavivirů a geny a genovými produkty obálky druhého flavivirů. Protože virálni obálka obsahuje všechny antigenní determinanty odpovědné za indukci neutralizujících protilátek, výsledkem infekce chimérickým virem je, že tyto protilátky jsou produkovány pouze proti druhému flavívíru.
Upřednostňovaným živým virem pro použití jako první flavivirus v chimérických virech podle předkládaného vynálezu je virus žluté horečky. Nejméně jedna vakcína již použila tento živý, oslabeny virus; tato vakcína je známa jako YFI7D a byla použita pro imunizaci lidí před více než 50 lety. Vakcína YE17D je popsána v řadě publikací, včetně publikací Smithburna eíal.
(„Ycllow Eever Vaeeination“, World Health Org., p. 238, 1956) a Freestona (in Plotkin eíal.. (Eds.). Vacci nes, 2d edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995). Kromě toho byl virus žluté horečky studován na genetické úrovni (Rice eí al., Science 229:726 až 733. 1985) a informace vztahující se kc genotypu a fenotypu byly získány (Marchevsky eí a/.. Ant. J. Trop. Med. Hyg. 52:75 až 80, Ϊ995).
Upřednostňované viry pro použití jako druhý flavivirus v chimérických virech podle předkládaného vynálezu a tudíž zdroje imunizačního antigenu zahrnují virus japonské encefalitidy (JE), virus horečky Denguc (DEN. např: jakýkoliv z Dengue typů 1 až 4), Murray Valley ence fa litický virus (MVE). St. Louis encefalitický virus (SLE), Západonilský virus (WN), virus klíšťové _s encefalitidy (TBE) a viry hepatitidyC (HCV). Další flaviviry použitelné jako druhý flavivirus zahrnují Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus. Powassan virus, Kyasanur Eorest Disease virus a virus ornské hemoragické horečky. V upřednostňovaném chimérickém viru podle předkládaného vynálezu jc sekvence kódující prM-E protein druhého flaviviru zaměněna za sekvenci kódující prM-E protein živého viru žluté horeční ky. V upřednostňovaném chimérickém viru je sekvence kódující prM-E protein odvozena od oslabeného virového kmene lakového, jako jc vakcínový kmen. Také jak jc popsáno dále níže, prM část proteinu může obsahovat mutaci, která, zabraňuje štěpení, které umožňuje vytvoření zralého membránového proteinu.
V předkládaném vynálezu jsou také zahrnuty metody zabraňující nebo léčící flavivirovou infekci u savců takových, jako je člověk, podáváním chimérického flaviviru infekce savcům; použití chimérických flavi virů podle předkládaného vynálezu při přípravě medikamentů pro zabraňování nebo léčbu flavi virové infekce; a způsoby přípravy chimérických flavi virů podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález zajišťuje několik výhod. Například, protože jsou chimérické viry živé a replikují se, mohou být chimérické viry podle předkládaného vynálezu použity k vytvoření dlouhotrvající ochranné imunity. Protože mají tyto viry replikacní geny oslabeného viru (např.: virus Žluté horečky 17D). je výsledný virus oslabený na takový stupeň, žc skýtá bezpečí pro použití u lidí.
Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následného detailního popisu, obrázků a nároků.
Předkládaný vynález zajišťuje chimérické flaviviry. které mohou být použity při vakcinacních metodách proti flavivirové infekci. Zkonstruování a analýza chimérických flaviviru podle předkládaného vynálezu takových, jako jsou chiméry viru žluté horečky a viru japonské encefalitidy (JE), viru horečky Dengue (DEN 1 až 4), Murray Valley encefalitického viru (MVE), St. Louis enccfaliliekého viru (SLE). Západonilského viru (WN), viru klíšťové encefalitidy (TBE) a virů hepatitidy C' (HCV), jsou popsány v následující textu.
Proteiny flaviviru jsou vytvářeny translací z jednoho, dlouhého otevřeného čtecího rámce (kódovány jsou strukturní proteiny, kapsida <C), pre membránový (prM) protein a obálka (E), zrovna tak. jako nestrukturní proteiny) a komplexem několika posttranslačníeh proteolytiekých štěpení. Chimérické flaviviry podle předkládaného vynálezu, jak již bylo diskutováno výše. zahrnují tv.
4i) ii kterých byly pr-M a E proteiny jednoho flaviviru zaměněny za pr-M a E proteiny jiného flaviviru. Tudíž takto vytvořené chimérické flaviviry zahrnují generaci nových spojení mezi kapsidou a pre-mem hranovým i proteiny; a obálkový M proteinem a nestrukturní oblastí (NS1) dvou odlišných flaviviru. Štěpení mezi každou z těchto sad proteinů (C a pr-M; a E a NSI) se vyskytuje během přirozené proteolytické úpravy flavi virových proteinů a vyžaduje přítomnost signální sekvence, která vytváří boční sekvence spojení štěpících míst.
V chimérický cli tlav i virech podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby signální sekvence virů tvořících chiméry byly skutečně udržovány, takže vlastní štěpení mezi C a pr M proteiny a E a NSI proteiny by mohlo účinně proběhnout. Tyto signální sekvence byly so v udržovány v chimérách, které jsou popsány níže. Alternativně jakákoliv z řady známých signálních sekvencí může být zařazena, aby se připojila k C a prM proteinům nebo E a NSI proteinům chimér (např.: von Heijne, Eur. J. Biochem. 133: 17 až 21. 1983; von Heijnc, J. Mol. Biol. 184:99 až 105, 1985) nebo například použitím známých vedoucích sekvencí může ten, kdo je znalý stavu techniky, vytvořit doplňkové signální sekvence, které mohou být použity v chimérách podle předkládaného vynálezu. Obvykle například bude signální sekvence obsahovat jako svůj
- i CZ 300172 B6 poslední aminokyselinový zbytek aminokyselinu s malým, nenabitým postraním řetězcem, takovou, jako je alanin, glvcin, serin, cystein, threonin nebo glutamin, Další požadavky kladené na signální sekvence jsou známé těm. kdo znají stav techniky (např.: von Heijne, 1983, výše: von Heijne. 1985, výše). Také signální sekvence dalších virů, ktcrc tvoří chiméry', mohou být udržo5 vány nebo skutečně udržovány, takže vlastní štěpení probíhá. Konstrukce eDNA lemplátů pro vytvoření YE/JE chimérických virů - odvození celodélkovýeh eDNA templátů pro chiméry podle předkládaného vynálezu popsané níže zahrnuje strategii podobnou té. kterou dřívější pracovníci použili k vytvoření YE17D zcDNA pro molekularněgenetické analýzy replikace YF. Strategie jc popsána např.: v Nestorowicz et al. (Virology 199:1 14 123.1994).
io
V krátkosti, odvození YE/JE chiméry podle předkládaného vynálezu zahrnuje následující. Genomové sekvence YFjsou rozšířeny do dvou plazmidů (YF5'3'IV a YFM5.2). které kódují YF sekvence od nukleotidu 1 až do 2276 a od 8279 do 10 861 (YE5'3'IV) a od 1373 do 8704 (YFM5.2) (Rice et al·, The New Biologist 1:285-296. 1989). Celodclkové eDNA temp laty jsou vytvářeny ligací vhodných restrikčních fragmentů odvozených od těchto plazmidů. Tato metoda byla nejspolehlivější pro zajištění stabilní exprese YF sekvencí a vytvoření RNA transkriptů. které mají vysoce specifickou infekticivilu.
Naše strategie pro konstrukci chimér zahrnuje náhradu YF sekvencí mezi YF5'3'IV a YFM5.2
2o plazmidy odpovídajícími JE sekvencemi z oblasti startu prM proteinu (nukleotid 478. aminokyselina 128) přes E/NS1 štěpící místo (nukleotid 2 452, aminokyselina 81 7). Kromě toho, aby mohla být klonována eDNA JE, bylo nezbytné provést několik kroků pro zavedení nebo eliminování restrikčních míst v obou YF a JE sekvencích, aby bylo umožněna in viiro ligace. Struktura lemplátů pro regenerování chimérických YE (C)/JE (prM-E) virů je ukázána na obrázku 4. Druhá chiméra kódující celou JE strukturní oblast (C prM-E) byl vytvořen za použití podobné strategie.
Molekulární klonování JE virové strukturní oblasti klony genů skutečného JE strukturního proteinu byly vytvořeny z JE SA|4— 14 2 kmene (JE živý, oslabený v akci načni kmen), protože biolo3o gické vlastnosti a molekulární charakterizace tohoto kmene jsou dobře zdokumentovány (Eekels et al., Vaccine6:513 až 518, 1988; JE SAn—14-2 virus je dostupný v Centers for Diseasc Controk Fort Collins. Colorado a v Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Ha ven, Connectícut. které jsou Světovou zdravotnickou organizací označeny za referenční centra pro arbovirv ve Spojených státech amerických). JE SAU-14-2 virus v transportní formě PDK-5 byl získán a transportován v LLC-MK, buňkách, aby bylo získáno dostatečné množství pro klonování eDNA, Strategie, která byla použita, zahrnovala klonování strukturní oblasti ve dvou částech, které se překrývají vNhe 1 restrikčním místě (JE nukleotid 1 125). a ktcrc mohou být pak použity pro in viiro ligaci.
4o RNA bvl extrahována z jednovrstevných infikovaných ELC MK2 buněk a syntéza prvního řetězce z negativního vlákna eDNA byla provedena za použití reverzní transkriptázy s primerein pro negativní vlákno (JE nukleotidová sekvence 2 456 až 71), které obsahovalo naskládaná Xba 1 a Nar 1 restrikění místa pro klonování zpočátku do pBluescript Π KS(+) a následně do YFM5.2 (Nar I), respektive. Syntéza prvního řetězce eDNA byla následována PCR amplifikací JE sek15 venee od nukleotidů I 108 do 2 471 za použití stejného primeru pro negativní vlákno a primeru pro pozitivní vlákno (JE nukleotidová sekvence 1108 až 1130), který' obsahoval naskládaná Xba l a Nsi I restrikění místa pro klonování do pBluescriptu a do YFM5.2 (Až/rl), respektive JE sekvence byly určeny restrikčním štěpením za pomoci restrikeního enzymu a nukleotidovým sekvenováním. JE nukleotidová sekvence od nukleotidu 1 do nukleotidu 1 130 byla odvozena pomocí
PCR amptifikace negativního vlákna JE eDNA za použití primeru pro negativní vlákno, který odpovídal JE nukleotidům 1 116 až I 130 a primeru pro pozitivní vlákno, který odpovídal JE nukleotidům 1 až 18, oba primery obsahují EcoR I restrikění místo. PCR fragmenty byly klonovány do pBluescriptu a JE sekvence byly určeny nukleotidovým sekvenováním. Toto dohromady představuje klonování JE sekvence od nukleotidu 1 do nukleotidu 2 471 (aminokvsclinv 1 až.
7 92).
-4 C7. 300172 B6
Konstrukce derivátů YF5'34V/JE a YFM5.2/JE aby byl vložen C konec JE obálkového proteinu do YE E/NS1 štěpícího místa, bylo zavedeno unikátní restrikční místo Nar I do ΥΓΜ5.2 plazmidu řízenou oligonukleotidovou mutagenezí signální sekvence v E/NS 1 štěpícího místa (YF nukleotidy 2 447 až 2 452. aminokyseliny 816 až 817), aby se vytvořil YFM5.2 (A'orl). U tran skriptů odvozených od tem plátů začleněných touto změnou byla kontrolována intuici vita a výsledná specifická infekticivita zda je podobná parentálním templátům (přibližně 100 plaky tvořících jednotek/250 nanogramů transkriptu). JE sekvence z nukleotidů 1108 až 2471 byla subklonována z několika nezávislých pBluescript/JE klonů, které byly vytvořeny PCR, do io YEM5.2 (Nar I) za použití unikátních Nsi I a Nar 1 restrikčních míst. YF53IV/JE klony obsahující YF5' netraslalovatelnou oblast (nukleotidy! až 118) sousedící sJE prM-E oblastí byly připraveny PCR amplifíkaeí.
Aby byly odvozeny sekvence obsahující spojení YF kapsidu a JE prM. byl použit chimérický pri15 mer negativního vlákna zabírající tuto oblast spolu s primerem pozitivního vlákna, který odpovídá YE5'3'IV nukleotidům 6 625 až 6 639. aby vznikly PCR fragmenty, které byly pak použity jako PCR primery negativního vlákna v konjugaci s primerem pozitivního vlákna doplňujícím v pBlueseriptu vektoru upstrcam sekvenci EeoR I restrikčního místa, aby se pak amplifikovala JE sekvence (kódovaná v opačné orientaci v pBluescript vektoru) od nukleotidu 477 (N konec au prM proteinu) přes Nhe I restrikční místo do nukleotidu 1 125. Výsledné PCR fragmenty byly vneseny do YF5'3'1V plazmidu za použití Not I a EcoR I restrikčních míst. Tento konstrukt obsahuje SP6 promotor, který předchází YF5' netranslatovatelné oblasti, a je následován sekvencí: YF (C) JE (prM E) a obsahuje Nhe 1 restrikční místo (JE nukleotid 1 125). klére je nezbytné pro in vitro ligaci.
Vytvoření ΥΓΜ5.2 a YF5'3'1V plazmidu, které obsahují restrikční místa pro in vitro ligaeí - aby mohlo být použito Nhe 1 restrikční místo uvnitř sekvence JE obálky jako 5' koncové in vitro ligační místo, bylo nadbytečné Nhe I restrikční místo v YFM5.2 plazmidu (nukleotid 54S9) eliminováno. Toto bylo provedeno tichou mutací YF sekvence v nukleotidu 5 461 (T->C; alanin, .κι aminokyselina 1 820). Foto místo bylo začleněno do YFM5.2 ligaci vhodných restrikčních fragmentu a zavedeno do YFM5.2(Aí/r l)/JE výměnou za Nsi ]/Nar 1 fragment kódující chimérickou YF/JE sekvenci.
Aby se vytvořilo unikátní 3' koncové restrikční místo pro in vitro ligaci, bylo vytvořeno BspE 1 restrikční místo downstream od Aai \l restrikčního místa, které je normálně používané pro vytvářené eelodélkových templátů zYF5'3'lV a YEM5.2. (četná Aot U restrikční místa jsou přítomna v JE strukturní sekvenci, což zabraňuje použití tohoto místa pro in vitro ligaci). BspE 1 restrikční místo bylo vytvořeno tichou mutací YF nukleotidu 8 581 (A-»C; serin, aminokyselina 2860) a bylo zavedeno do YFM5.2 výměnou vhodné restrikční fragmenty. Unikátní místo bylo to začleněno do YFM5.2/JE výměnou za Xha VSph l fragment a do YF5'3'lV/JE(prM E) plazmidu tnčásfovou ligaeí vhodných restrikčních fragmentů z těchto parentálních plazmidů a z derivátu
YFM5.2 (BspE 1) delecí YF sekvence mezi EcoR I restrikčními místy nukleotidů 1 a 6912.
Výměna JE Nakayma cDNA s YE/JE chimérickými plazmidy - z důvodu nejistoty ohledně kapa45 city JE SAii-14-2 strukturní oblasti, která byla vytvořena PCR amplifíkaeí, aby fungovala správně v kontextu chimérického viru, byla použita cDNA z klonu JENakayama kmene, který byl široce charakterizován během expresních experimentů a pro jeho kapacitu navodit ochrannou imunitu (Mclda et aL Virology 158:348 až 360. 1987; JE Nakayama kmen je dostupný v Centers for Disease Control, Fort Collins. Colorado a v Vale Arbovirus Research Unit, Vale University,
5(i New Ilaven, Connecticut). Nakayama cDNA byla vnesena do YF/JE chimérických plazmidů za použití vhodných restrikčních míst (Hind Hl až Pvu II a Bpm 1 až Mun I), aby byla zaměněna celá prM-E oblast v dvou plazmidových systémech kromě jedné aminokyseliny, šeřinu, v pozici 49, která byla ponechána intaktní, aby mohla být použita pro Nhe I restrikční místo k in vitro ligaci. Celá JE oblast v Nakayama klonu byla sekvenována, aby bylo ověřeno, že záměna eDNA opravíš du proběhla (tabulka 2).
Vytvoření eelodélkových cDNA templátů, RNA transfekce a vytvoření infekčního viru - postupy pro vytvoření eelodélkových cDNA templátů jsou hlavně popsány v Rice et al. (The New Biologist 1:285-296. 1989) (obrázek 1). V případe chimérických templátů jsou plazmidy
YF5'3'!V/JE(prM-E) a YFM5.2/JE štěpeny restrikčními endonukleázami Nhe MBsp I a m vitro ligace byla provedena za použití 50 nanogramů puriUkovaných fragmentů a za přítomnosti T4 DNA ligázy. Produkty ligace byly linearizovánv enzymem Xha 1, aby byla umožněna ubíhající transkripce, SP6 Irán skripty byly syntetizovány za použití 50 nanogramů purifikovaného lemplátu, kvantifikován začleněním TI UTP a celistvost RNA byla určena nedenaturující elektrofoio rézou v agarózovém gelu. Výtěžky byly v rozmezí od 5 do 10 mikrogramů RNA na reakci při použití této procedury, jichž většina byla představována eelodéíkovými transkripty. Transfekce RNA transkripty v přítomnosti kationtovýeh liposomů bylo prováděno tak, jak je popsáno v Rice et ah (výše) pro YFI7D, V počátečních experimentech byly pro transfekci a kvantifikaci viru použity LLC-MK2 buňky, protože u nich byla určena tolerantnost pro replikaci a vytváření plaků i? parentálních kmenů YF a JE. Tabulka 1 ilustruje obvyklé výsledky transfekčních experimentů za použití Lipofectinu (GIBCO/BRL) jako transfekčního nosiče. Věro buněčné linie byly také běžně použity pro přípravu infekčních virových zásobních roztoků, charakterizaci značených proteinů a neutralizační testy.
2o Nukleotidové sckvenování chimérických cDNA templátů - plazmidy obsahující chimérickou YF/JE cDNA byty podrobeny sekvenční analýze části JE klonů, aby byla identifikována správné sekvence SAbt 14-2 a Nakayama obálkového proteinu. Odlišnosti nukleotidovýeh sekvencí mezi těmito konstrukty v porovnání s publikovanými sekvencemi (McAda et al.. výše) jsou ukázány v tabulce 2.
?5
Strukturní a biologická charakterizace chimérických YF/JE virů -genomová struktura chimérických YF/JE virů získaných z transfekčních experimentů byla ověřena analýzou založenou na RT/PCR virální RNA izolované z monovrstcvnýeh infikovaných buněk. Tyto experimenty byly provedeny tak, aby byla eliminována možnost, že virové zásobní roztoky budou kontaminovány ío během transfekčních procedur. Při těchto experimentech byl použit prvoprůchozí virus, který zahájil infekční cyklus, aby byla eliminována tvorba jakýchkoliv artefaktů přítomností reziduální transfektovanou virální RNA. Celkové RNA extrakty z buněk infikovaných buď YF/JE (prM E)-SA|.(-14 2 nebo YF/JE (prM -E)-Nakayama chimérami byly podrobeny RT/PCR za použití YF a JE-specifických primerů. které umožnily vytvoření celé strukturní oblasti, jako dva PCR produkty o přibližné velikosti 1 kilo báze. Tyto produkty byly poté analyzovány štěpením restrikčními enzymy za použití předpověděných restrikčních míst uvnitř sekvencí JESAm-14 2 a Nakayama, které umožňují diferenciaci těchto virů. Použitím tohoto přístupu byla virální RNA určena, že je chimérickou a u vytvořených virů byla ověřena přítomnost vhodných restrikčních míst. Aktuální vazba C-prM byla pak ověřena, že je intaktní na úrovni sekvence cyklickou
4o sekvenční analýzou před chimérické spojení YF/JE C-prM.
Přítomnost JE obálkového proteinu ve dvou chimérách byla ověřena imunoprecipitaci obou za použití JE-speeifiekého an ti séra a p lakovým redukčním neutralizačním testem za použití YF' a JE—specifického antiséra. lmunopreeipitaee extraktů z infikovaných LEC-MK> buněk, které byly označeny S. s chimérami za použití monoklonální protilátky k JE E proteinu ukázala, že JE obálkový protein by mohl být vytvořen 55 kD proteinem, kde stejné antisérum selhává při imunoprecipitaci proteinu z YF-in fí kovaných buněk. Obě JE a YF hypcrimunní séra vykázala křížovou reaktivitu ke dvěma obálkovým proteinům, ale rozdílnost ve velikosti mezí proteiny (YE = 53 kD, neglykosylovaný; JE - 55 kD. glykosylovaný) mohla být reprodukovalelnč pozoro50 vána. Použití YF monoklonálních protilátek nebylo za uspokojivých imunoprecipitačníeh podmínek, tudíž specifita této analýzy byla závislá na JE monoklonálních protilátkách. Plakový redukční neutralizační lest (PRNT) byl proveden na chimérických virech a na YF a JESAH-I4-2 vírech za použití YF a JE-specifickýeh hyperimunních aseitickýeh kapalin (ATCC) a YF-speciflckých purifl kovaných IgG (monoklonální protilátka 2E10). Významné odlišnosti v 50% plako55 vém redukčním titru těchto antisčr byly pozorovány pro chiméry; když byly porovnány s kont-6 Q1 300172 B6 rolními viry použitými v těchto experimentech (tabulka 3). l edy epitopv nezbytné pro neutralizaci jsou exprimovány v infekčních chimérických YF/JE virech.
Růstové vlastnosti v buněčné kultuře - růstová kapacita chimér byla zkoušena kvantitativně v buněčných liniích, obě v liniích původem pocházejících od primátů a komárů. Obrázek 2 ilustruje kumulativní růstové křivky chimér v EEC-MIG buňkách po nízké mnohonásobné infekci (0.5 plak tvořících jednotek/buňku). V tomto experimentu byly použity viry YF5.2ÍV (klonovaný derivát) a JE SAí4-14-2 (neklonovaný) pro srovnání. Oba chimérické viry dosáhly maximálního virového výtěžku přibližně o řád vyššího než parentální virus. V případě YF/JE SA,4-14-2 ni chiméry se pík virové produkce objevilo 12 hodin později než v případě YF/JE Nakayama chiméry (50 hodin proti 38 hodinám). YF/JE Nakayama chiméra vykázala významně vyšší cytopatieké vlivy než YF/JE SA(4-14-2 chiméra na této buněčné linii. Podobný experiment byl proveden v C6/36 buňkách po nízké mnohonásobné infekci (0.5 plak tvořících jednotek/buňku). Obrázek 2 také ilustruje růstovou kinetiku virů v této intervertebrální buněčné linii. Podobné virové výtěžky byly získány ve všech bodech použitých pro izolování viru v tomto experimentu, dále prokazující představu, žc chimérických virů není poškozena replikační účinnost.
Porovnání růstové kinetiky RMS (YF/JE SA)4-14-2) sYF17D vakcinou v MRC-5 buňkách experiment byl proveden, aby byla určena schopnost vakcinového kandidáta rozmnožit se
2o v buněčné linii akceptovatelně pro lidskou vakcínu. Komerční vakeína žluté horečky 17D(YFVax®) byla získána z Connaught Laboratories, Swiflwater, PA. MRC 5 (diploidní lidské embryonální plicní buňky) byly zakoupeny od ATCC (171 -CCL, vsádka#: F 14308, pasáž 18) a rostly v EMEM. 2 mM E-GIn. Earle's BSS. které bylo upraveno tak, aby obsahovalo 1,5 g/1 uhličitanu sodného. 0,1 mM neesenciálních aminokyselin a 10% FBS.
Aby mohla být porovnána růstová kinetika RMS (Research Master Seed, YF/JE $Au-l4-2) s YF-Vax00). rostly buňky do 90% splývání a infikovány byly s RMS nebo YF-Vaxíy při MOI okolo 0.1 pfu. Protože MRC 5 buňky obvykle rostou pomalu, byly tyto buňky inkubovány po dobu 10 dnů po inokulaci. Vzorky byly zmrazovány každodenně po dobu 7 až 10 dnů a infekti5o vita byla určena testem plaků ve Věro buňkách.
YF-Vax® a YF/JE chiméry rostly do slušných titrů v MRC-5 buňkách (obrázek 3). Pík litru byl '4.7 logm pfu pro YF-Vax® dosažený druhý den a byl nepatrně nižší než 4,5 logm pfu pro RMS po 6 dnech.
Testování ncurovirulence v normálních dospělých myších - virulenční vlastnosti YF/JE SAU14—2 chiméra byly analyzovány v mladých dospělých myších intracclebrální inokulaci. Skupiny po 10 myších (4 týdny staří samci a samice ICR myší. každých 5 na jednu skupinu) byly inokulovány 10 000 plak tvořícími jednotkami YF/JE SA]4-14-2 chiméry. YF5.2iv nebo JE SA](-14-2 •io a pozorovány každý den po dobu 3 týdnů. Výsledky těchto experimentů jsou zobrazeny na obrázku 4. Myši přijímaly parentální YF5.2ÍV odevzdaně přibližně jeden týden po inokulaci. Žádná mortalita nebo onemocnění nebyly pozorovány mezi myšmi přijímajícími buď JE SA14-14 2 parentální virus, nebo chiméru. Inokula, která byla použita pro experimenty, byla titrována v době injikace a podskupina myší, které přežily, byla testována na přítomnost neutralizačních protilátek, aby se potvrdilo, žc došlo k infekci. Mezi těmito testovanými myšmi byly titry proti viru JE SAu—14—2 podobné pro zvířata, která přijala bud' tento kmen, nebo chiméru.
Výsledky dalších experimentů zjišťujících ncurovirulenci YF/JE $ΛΗ-14-2 chiméry v myších jsou zobrazeny v tabulce 4. V těchto experimentech všechny myši inokulované YF5.2iv zemřely
5(i v rozmezí 7 až 8 dnů. Naopak žádná myš inokulovaná YF/JE SA14-14-2 nezemřela během dvou týdnů poslinokulačního pozorování.
Výsledky experimentů, které určovaly neuroínvazivítu a patogenezí YF/JE chimér jsou zobrazeny v tabulce 5. V těchto experimentech byly chimérické viry' inokulovány do 3 týdny stalých myší v dávkách pohybujících se v rozmezí mezi 10 000 a l milionem plak tvořících jednotek přes
-7CZ 300172 B6 intraperitoneální cestu. Žádná z myší inokulovaných buď YF/JE Nakayama. nebo YF/JE SAU14-2 nezemřela během tří týdnů postinokulačního pozorování, což naznačuje, že virus byl neschopný způsobit onemocnění po periferní inokulací, Myši inokulovanc YF/JE SA].i 14 2 virem vyvinuly neutralizující protilátky proti JE viru (obrázek 7).
Konstrukce cDNA templátú pro vytvoření žlutá horečka/dengue (YF/DEN) chimérických virů odvození chimérických žlutá horečka/dengue (YF/DEN) virů je popsáno v následujícím textu, a které je v principu prováděno stejně, jako konstrukce YF/JE chiméry, jak je popsáno výše. Další flav i virové chiméry mohou být vytvořeny podobnou strategií za použití přirozených nebo io vytvořených restrikčních míst a například oligonukleotidových primerů. jak je ukázáno v tabulce 6.
Konstrukce YF/DEN chimérického viru-ačkoliv bylo vyvinuto několik molekulárních klonů dengue virů. byly zjištěny problémy se stabilitou virálních cDNA plazmidových systémů as účinností replikace vytvořených virů. Pro použití byl vybrán klon DEN-2 vy vinutý Dr. Peterem
Wrightem. Dept. of Microbiology, Monash University. Clayton, Austrálie, protože tento systém je relativně účinný pro regeneraci viru a tvoří dvou-plazmidový systém, který je podobný naší vlastní metodologii. Kompletní sekvence tohoto DEN-2 klonu je přístupná a usnadňuje konstrukci chimérických YF/DEN templátú, protože pouze několik modifikací YE klonu bylo nezbyt20 ných. Významné kroky jsou naznačeny v následujícím textu.
Podobně jako dvou-plazmidový systém pro YF5.2iv a YF/JE viry používá YF/DEN systém unikátní restrikční místo uvnitř DEN 2 obálkového proteinu (E). jako zlomové místo pro rozšíření strukturní oblasti (prM-E) uvnitř dvou plazmidů, tímto způsobem odvolávající se jako
YF5'3'IV/DEN (prM-E ) a YFM5.2/DEN (E/-E) (obrázek 5). Dvě restrikční místa pro in vitro ligaei chimérického templátú jsou Aat II a Sph E Recipienlní plazmid pro 3'koncovou část DEN E proteinové sekvence je YFM5.2(.Y<vr I[+].S/>/?![—]). Tento plazmid obsahuje Nar I restrikční místo v E/NS1 spojení, které bylo použito pro začlenění karboxylového konce JE E proteinu. Dále bylo modifikováno eliminací Sph I restrikční ho místa, které bylo navíc, v oblasti NS5 pro30 teinu tichou v tomto místě řízenou mutagenezí. To dovolilo začlenění DEN 2 sekvence z unikátní Sph I místa do Nar 1 místa jednoduchým přímým klonováním. Vhodný fragment DEN-2 cDNA byl získán pomocí PCR z DEN-2 klonu MON3K). který by l poskytnut Dr. Wrightem. PCR primery zahrnovaly 5'koncový primer ohraničující Sph I restrikční místo a 3'koncový primer homologní k DEN-2 nukleotidům okamžitě upstrearn od signalázového místa v E/NS1 spojení a nahrazující signa lázové místo substitucí, takže vytváří nové místo, ale zároveň zavádí Nar 1 restrikční místo. Výsledný 1 170 párů bází dlouhý PCR fragment byl poté zaveden do YFM5.2CW l[+]V/?// IH).
5' koncová část DEN-2 klonu zahrnující prM a aminokoncová část E proteinu byla vytvořena
4ti a zavedena do YF5'3'1V plazmidů za použití chimérického PCR primeru. Chimérický primer zahrnující 3'konec negativního vlákna YF C proteinu a 5'konec DEN-2 prM proteinu byl použit sprimerem pozitivního vlákna, který ohraničuje SP6 promotor YF5'3TV plazmidů, tak, aby došlo k vytvoření 771 párů bází velký PCR produkt s 20 bázovým prodloužením představujícím DEN 2 prM sekvenci. Tento PCR produkt byl pak použit pro přípravu DEN-2 plazmidů pro konjugaci s 3' koncovým primerem. který představuje DEN-2 sekvenci 1501 až 1522 a ohraničuje Sph 1, aby došlo k vytvoření 1 800 párů bází velkého konečného PCR produktu, který zahrnuje YF sekvenci od Yo/1 restrikčního místa přes SP6 promotor, YF5' netranslatovatelnou oblast a YF C protein sousedící s DEN-2 prM El522 sekvencí. PCR produkt byl ligován do YF53TV za použití Not i a Sph 1 restrikčních míst, aby výsledkem ligace byl
YF5'3'IV/DEN(prM-E) plazmid.
Konstrukce chimérických templátú dalších fiavivirň - procedury pro vytváření eelodélkovýeh cDNA templátú kódujících chimérické YF/MVE. YF/SLE. YF/WN. YF/TBE viry jsou podobné těm. které byly popsané výše pro YF/DEN-2 systém. Tabulka 6 zobrazuje rysy strategie pro vytváření chimérických virů na základě YF17D. Unikátní restrikční místa použitá pro in vitro ligaci a chimérické primery pro vytváření C/prM a E/NS1 spojení jsou také dobře známy. Zdroje eDNA pro tyto hetelogní flaviviry jsou lehce přístupné (MVE: Dalgamo et aL, J, Mol. Biol. 187:309 až 323, 1986; SLE: Trent et aL Virology 156:293 až 304, 1987; TBE: Mandl et aL Virology 166:197 až 205. 1988; Dengue 1: Mason et aL Virology 161:262 až 267. 1987;
Dengue 2: Deubel el aL Virology 155:365 až 377, 1986; Dengue 3: Hahn et aL Virology 162:167 až 180. 1988; Dengue 4: Zhao et aL. Virology 155:77 až 88, 1986).
Alternativní přístup k vytváření dalších chimérických virů je vytvořit C/prM spojení ligaci tupých konců restrikčních fragmentů, které bylo připraveny PCR, a které mají konce, které se setkávají io v tomto spojení a 5' a 3'konce, které ohraničují vhodná restrikéní místa pro zavedení do
YE53TV nebo do intermediálového plazmidu takového, jako je pBS-KSp). Volba použití chimérické oligonukleotidy nebo ligaci tupých konců může být různá, závisí na vhodnosti unikátních restrikčních míst uvnitř obálkového proteinu kódujícího oblast uvažovaného viru. Konstrukce virů kódujících IICV antigeny protože strukturní proteiny El a E2 HCV nejsou homologní k strukturním proteinům flavivirů, které by ly popsány výše. strategie pro expresi těchto proteinů obsahuje inzerci uvnitř vedlejší oblasti genomu, takže všechny tyto proteiny jsou pak spoluexprimovány s proteiny žluté horečky během replikaci viru v infikovaných buňkách. Oblast vybraná pro inzerci proteinů je N koncové částí NSl proteinu, protože celý NS1 protein není nezbytný pro virální replikaci. Z důvodu potenciálních problémů se stabilitou YE genomu v přítomnosti hele?u rologni sekvence převyšující normální velikost genomu (přibližně 10 000 nukleotidů), může být použita detekční strategie popsaná níže. Kromě toho delece v NSl může být výhodná v chimérickém YF/ťlavivirus systému popsaném výše, protože částečná delece tohoto proteinu může odstranit imunitu k YE asociovanému s protilátkami proti NSl a tedy vyhnout se problémům s vektorovou imunitou, jestliže více než jedna chimérická vakcína byla nezbytné podána rcei25 pientovi nebo jestliže YE vakcína byla dříve podána nebo by byla potřeba v budoucností.
Strategie zahrnuje vytvoření série delecí v rámci uvnitř NSl kódující oblasti YEM5.2 plazmidu v konjugaci s vytvořením translačního terminačního kodonu na konci E a sérii dvou IRES (vnitřní ribozomální vstupní místo). Jedno IRES je ihned downstrcam od terminačního kodonu ,H) a dovoluje expresi z otevřeného čtecího rámce uvnitř oblasti mezi E a NSl. Druhé IRES iniciuje translaci z okleštěných NSl proteinů, zajišťující expresi zbytku YE nestrukturníeh polyproteinů. Tyto deriváty byly testována na schopnost vytvořit infekční virus a konstrukt s největší delecí by l použit pro inzerci cizorodých sekvencí (např,: HCV proteiny ) v oblasti prvního IRES. Tento jednotlivý konstrukt může také sloužit jako základ pro určování zda bude delece v NSl působit vektoroxou specifickou imunitu v kontextu YE/Elavivirus chimérických virů exprimujíeíeh prME; jak bylo popsána výše.
Inzerce nukleotidů kódujících El. E2 a/nebo El plus E2 HCV proteiny je limitována velikostí tolerované delece v NSl proteinu. Z toho důvodu okleštěné HCV proteiny mohou být použity k zesílení stability uvnitř modifikovaného YE klonu. 1ICV proteiny jsou vytvářeny sN koncovou signální sekvencí ihned následovanou IRES a s terminačním kodonem na C konci. Tálo konstrukce bude řídit HCV proteiny směrem do endoplasmatiekého réti kula /.důvodu sekrece ven z buněk. Strategie této konstrukce je schématicky ukázána na obrázku 6. Plazmid kódující HCV proteiny genotypu 1 může být použít pro tyto konstrukce, například HCV plazmidy získané od Dr. Charlese Riccho z Washington University (Grakoui t-7 o/., J. Virology 67:1385 až 1395. 1993), který exprimoval tuto virovou oblast v upravených systémech a uvnitř replikačně-komplementárních celodclkových HCV klonů.
prM štěpené deleění mutanty jako kandidáti oslabené vakcíny pro flaviviry - další chimérické
5ú viry zahrnuté v předkládaném vynálezu obsahují mutace, které zabraňují štěpení prM takové, jako mutace v prM štěpícím místě. Například prM štěpící místa ve flavivirových infekčních klonech, které jsou předmětem zájmu takové, jako jsou dengue, TBE, SLE a další mohou být mutována místní přímou mutagenezí. Jakákoliv nebo všechny aminokyseliny v štěpícím místě, tak jako výše popsané, mohou být deletovány nebo substituovány. Fragment nukleové kyseliny obsa’’ bující mutované prM-E geny může být pak vnesen do vektoru viru žluté horečky metodami,
-o CZ 300172 B6 které byly popsány výše. prM deleee může být použita s nebo bez ostatních zeslabujících mutací, například mutací v E proteinu, aby byla pak vnesena do viru žluté horečky. Tyto mutanty mají výhody oproti jednou substituovaným mutantům coby kandidátům na vakcínu. protože jc téměř nemožné vrátit zpět deletovanou sekvenci a obnovit tak virulenci.
Následující chimérické flaviviry podle předkládaného vynálezu byly umístěny do American Type
Culture Colleetion (ATCC) v Rockville, Maryland, U.S.A v souladu s Budapešlskou smlouvou a bylo jim uděleno datum umístění 6. ledna 1998: chimérický žlutá horečka 17D/denguc typ 2 virus (YF/DEN -2: ATCC přístupové číslo ATCC VR-2593) a chiméríeký žlutá horečka iu 17D/japonská encefalitida SA|4—14—2 virus (YE/JE AI.3: ATCC přístupové číslo ATCC VR2594).
Tabulka 1 charakterizace YE/JE chimér
| klon | výtěžek (pg) | infektíci vita plaky/100 ng ELC-MK2 | PBS log titr VĚRO | RNAsa log titr VĚRO | DNAsa log titr VĚRO |
| YE5.21 v | 5,5 | 15 | 7,2 | 0 | 7 |
| YF/JE-S | 7,6 | 50 | 6,2 | 0 | 6,2 |
| YF/JE-A | 7 | 60 | 5 | 0 | 5,4 |
Tabulka 2 - porovnání sekvencí JE kmenů a YE/JE chimér
| virus | E 107 | E 138 | E 176 | E 177 | E 227 | E 243 | E 244 | E 279 |
| JE SAu- 14-2 | F | K | V | T | S | K | G | M |
| YF/JE SAta-14-2 | F | K | V | Λ | s | E | G | M |
| YF/JE NAK | L | E | I | T | P | E | E | K |
| JENAK | L | E | Ϊ | T | P | E | E | K |
| JE SA14 | L | E | I | T | s | E | G | K |
CZ 300172 Bó
Tabulka 3 - plakovč redukční neutralizační titry na YF/JE chimérách
| virus | neimunní ascitická kapalina | YF ascitická kapalina | JE ascitická kapalina | neimunní IgG | YF IgG |
| YF5.2iv | <1,3 | 3,7 | <1,3 | <2,2 | >4,3 |
| JE SA]4- | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
| 14-2 | |||||
| YF/JE S A μ- | <1,3 | <1.3 | 3,1 | <2,2 | <1,9 |
| 14-2 | |||||
| YF/JE | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
Nakayama
Tabulka 4 neurovirulcncc YF/JE SAu-l4-2 chiméry. 3 týdny staré samčí ICR myši
| log dávky I.C. | % úmrtnosti | ||
| YF5.2iv | 4 | 100 | (7/7) |
| YF/JE SAt4-14-2 | 4 | 0 | (0/7) |
| YF/JE S A14-14-2 | 5 | 0 | (0/7) |
| YF/JE SA,4-14-2 | 6 | 0 | (0/8) |
| abulka 5 - ne liro i vaz i v nost YF/JE chimér, 3 týdny staré samčí ICR mvši |
| log dávky (intraperitoneální) | % úmrtnosti | ||
| YF/JE Nakayama | 4 | 0 | (0/5) |
| YF/JE Nakayama | 5 | 0 | (0/4) |
| YF/JE Nakayama | 6 | 0 | (0/4) |
| YF/JE SA,4-14-2 | 4 | 0 | (0/5) |
| YF/JE SAí4-14-2 | 5 | 0 | (0/4) |
| YF/JE SA,4-14-2 | ó | 0 | (0/4) |
-IICZ 300172 B6
Tabulka 6 - vytvoření Y/FIavivirus chimér
| virus | chimérické C/prM spojení1 | chimérické E/NS1 '2 Spojeni | 5' ligace | 3' ligace 1 | místa5 eliminováno nebo [změněno) |
| YF/WN | X-cactgggagagcttgaaggtc (SEQ ID NO: 1) | aaagccagttgcagccRcgglitaa (SEQ ID NO. 2) | Aat 11 | ΛΥ/ I | |
| YF/DEN-I | X-aaggiagaelggtgggciccc (SEQ ID NO: 3) | gatccicagtaccaaccKcggtuaa (SEQ ID NO: 4) | Aat 11 | Sph I | Sph 1 v DEN |
| YF/DEN-2 | X-aaggtagattggtgigcattg (SEQ ID NO: 5) | aaccctcagtaccacccccEíítttaa (SEQ ID NO: 6) | Aat II | Sph I | |
| YF/DEN-3 | X-aaggigaattgaagtgctcta (SEQ ID NO. 7) | accccca gcaccacccgcggtttaa (SEQ ID NO: 8) | Aat 11 | Sph 1 | Xho I v DEN (Sph I v DEN) |
| YF/DEN-4 | X-aaaaggaacagngilcicla (SEQ ID NO 9) | acccgaaglglcaaccgcggtttaa (SEQ ID NO: 10) | Aat II | Nsi I | |
| YF/SLE | X -a acgtgaai aguggatagtc (SEQ ID NO: 11) | accEiiKEtcEcacccKcggtttaa (SEQ ID NO 12) | Aat 1 | Sph 1 | Aat 1 v SLE |
| YF/MVE | X-aatncgaaaggiggaagglc (SEQ ID NO. 13) | gaccEgtgluacagccgcggtttaa (SEQ ID NO: 14) | Aat II | Xge I | (Age 1 v YF) |
| YE/TBE | X- lact gcgaacgacgllgccac (SEQ ID NO: 15) | act gg EaacctcacccRcggt t íaa (SEQ ro NO: 16) | Aat 11 | ďge I | (Age I v YF) |
| 2: sloupec | znázornuje o 1 igonuk 1 eotidy | použité pro vytvoření | chimérických | Y F/flavivirtis |
primerú. které odpovídají C/prM nebo E/NS1 spojení, (v textu). X = karboxylový konec kódující sekvence YE kapsidy. Podtrhnutá oblast odpovídá cílené hetcrologní sekvenci ihned upstream od η Nar I restrikčního místa (opačná sekvence - ecgegg). l oto místo dovoluje začlenění PCR produkt ů do YFM5.2 (/Vívr I) p I azm idu, k t e rý j e nezbytný pro vytvoření ce 1 odé 1 kových eDNA templátu. Další nukleotidy jsou specifické pro hetcrologní virus. Oligonukleotidové prímery jsou zapsány v orientaci od 5' konce k 3' konci.
: Unikátní restrikční místa použitá pro vytvoření restrikěníeh fragmentů, které mohou být izolovány a ligovány in vitro, aby mohlo dojít k produkci celodélkových chimérických cDNA templátů jsou zde zapsána. Protože některé sekvence neobsahují vhodná místa, je v některých případech nezbytné vhodná místa vytvořit (poznámka 5).
o : V závorkách jsou místa pro restrikční enzymy, která musí být vytvořena buď v YE páteři nebo v heterologním virus, aby umožnila účinnou in vitro ligaci. Restrikční místa, která nejsou v závorkách musí být eliminována. Všechny tyto modifikace jsou prováděny tichou mutagenezí cDNA pro určitý klon. Prázdná místa označují, že nebyly potřeba žádné modifikace.
Ostatní části jsou uvedeny v následujících patentových nárocích. Například geny prM-E proteinu dalších fiavivirů, které jsou důležité z medicínského hlediska, mohou být vneseny do vakcíny s páteří viru žluté horečky, aby mohlo dojít k produkci vakeín proti dalším medicínsky zajíma- I? C7. 300172 B6 vým flavivirům (Monath et aL „Flaviviruses”. ve Virology, Fields (ed.). Raven Lippíncott, New York. 1995, Volume I, 961-1 034).
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 je schématickým představením kroků genetické manipulace, které byly provedeny, aby byl zkonstruován chimérický virus podle předkládaného vynálezu virus žluté horečky/virus japonské encefalitidy (YF/JE).
io
Obrázek 2 zobrazuje sadu růstových křivek pro chimérické viry YE/JE podle předkládaného vynálezu v buněčné kultuře akceptovatelné pro přípravu lidské vakcíny.
Na obrázku 3 je graf ukazující porovnání růstu mezi RMS (Research Master Seed. YE/JE SANI? 14-2) a YE-Vax v MRC-5 buňkách.
Na obrázku 4 jc ukázána struktura templátu pro regenerování chimérických YE (C)/JE (prM-R) virů.
Na obrázku 5 jsou schématicky uvedeny dva plazmidové systémy, které jsou nutné pro vytvořeni chimérického YE/DEN-2 viru. Strategie je hlavně popsána pro YE/JE chimérický virus.
Na obrázku 6 je schématicky zobrazena struktura modifikovaných YF klonů vytvořených, aby byty deletovány částí NS1 proteinu a/nebo exprimovány cizí proteiny pod kontrolou vnitřního ríbozomálního vstupního místa (IRES). Obrázek ukazuje pouze E/NS1 oblast virálního genomu. Translační stop kodon je zaveden na karboxylový konec obálkového (E) proteinu. Downstream translace je zahajována uvnitř intergenového otevřeného čtecího rámce (ORF) pomocí IRES-I, což je cizí protein, který řídí expresi (např.: HCV proteiny El a/nebo E2). Druhý protein IRES (IRES-2) kontroluje iniciaci translace YE nestruktumí oblasti, v které jsou nahromaděné a ohrasu ničené NS1 proteiny (např.: NSldcl-1. Nsdel-2 nebo NSldel-3) exprimovány. Rozměr NS1 deleee je inverzně úměrný tomu. jak se IRES I připojuje na ORE.
Na obrázku 7 je graf, který ukazuje neutralizační odpověď protilátky u myší. které byly imunizovány YE/JE SA,., 14-2 chimérickou vakeínou.
Příklady pro vedení vynálezu
Příklady dalších ílavivirů, z jejíchž vynášených genů mohou být získány chimérické vektory to podle předkládaného vynálezu, zahrnují např.: Kunjin virus, středoevropský encefalitieký virus, ruský j a ro-1 ctní encefalitieký virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragícké horečky. Kromě toho mohou být vnášeny do vakcíny viru žluté horečky dokonce geny z mnohem vzdáleněji příbuzných virů za účelem vytvoření nových vakeín.
Výroba vakcíny a její použití - vakcíny podle předkládaného vynálezu jsou podávány v množstvích a za použití způsobů, které mohou být ihned určeny osobou, která má zkušenosti se stavem techniky. Vakcíny mohou být podávány vytvářeny například stejným způsobem, jako vakcína žluté horečky 17D např.: jako vyčištěná suspenze tkáně infikovaného kuřecího embrya nebo kapalina získaná z buněčných kultur infikovaných chimérickým virem žluté horečky. Tudíž živý, oslabený chimérický virus je vytvořen jako sterilní vodný roztok, který obsahuje mezi 100 a 1 000 000 infekčních jednotek (např.: plak tvořících jednotek nebo infekčních dávek tkáňové kultury) v dávce o objemu od 0.1 do 1,0 ml. aby byl podáván například intrainuskulární. podkožní nebo íntradermálni cestou. Navíc, protože flaviviry mohou být schopné infikovat lidského hostitele přes sliznice taková, jako je orální cesta (Gresikova et al., „lick-borne Eneephalitis.
v The Arboviruses. Ecologv and Epidcmilogy, Monath (ed.), CRC Press. Boea Raton, Florida.
j CZ 300172 Bó
1988. Volume IV, 177 až 203). může být virová vakeína podávána přes slizniee. aby bylo dosaženo ochranné imunitní odpovědi. Vakeína může být podávána jako primární profylaktieké činidlo dospělým nebo dětem v případě nebezpeční flavívirové infekce. Vakcíny mohou také být použity jako sekundární činidla pro léčbu pacientů, kteří byly infikováni flaviviry. aby stimulova5 Iv imunitní odpověď proti flavivirům.
Může být žádoucí použít vakcíny vektorového systému žluté horečky pro imunizaci hostitele proti jednomu viru (například proti viru japonské encefalitidy) a později přeočkovat stejného jedince proti druhému nebo třetímu viru za použití odlišného chimérického konstruktu. Hlavní výhodou io chimérického systému žluté horečky je, že vektor nebude sám vyvolávat silnou imunitní odpověď. Ani nebude dřívější imunita proti víru žluté horečky znemožňovat použití chimérické vakcíny. jako vektoru pro hctcrologní genovou expresi. Tyto výhody jsou z důvodu odstranění části
E genu vakcíny žluté horečky, která kóduje neutralizující (ochranné) antigeny Žluté horečky, a zaměnění za jiné hctcrologní geny, které neumožňují křížové ochranu proti žluté horečce.
Ačkoliv nestrukturní proteiny viru YFI7D mohou hrát roly v ochraně například vyvoláváním tvorby protilátek proti NS1, které jsou obsažen) v komplementárně dependentní protilátce zprostředkovávající lyži infikovaných buněk (Sehlesinger <?/£//., J. Immunology 135:2 805-2 809), nebo zahrnutím cytotieké odpovědi T buněk na NS3 nebo jiné virátní proteiny, je nepravděpodobné. že tyto odpovědi budou rušit schopnost živé virové vakcíny stimulovat neutralizační proti2o látky. Toto je podpořeno fakty, že (1) jedinci, kteří byly dříve infikováni Jf virem, odpovídali na vakcinaei YFI7D podobně, jako osoby, které nebyly dříve JE virem infikováni, a (2) jedinci, kteří dříve obdržely YE17D vakeínu odpovídali na přeočkování vzrůstajícími titry neutralizačních protilátek (Sweet et aí, AM. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Tudíž chimérický vektor může být použit v populacích, které jsou imunní vůči žluté horečce bez ohledu na před25 chozí přirozenou infekci nebo vakcinaei, a může být použit opakovaně nebo pro simultánní imunizaci nebo následnou imunizaci řadou odlišných konstruktů, které zahrnují chiméry žluté horečky s inzerty z například japonské encefalitidy, St. Louis encefalitickcho viru nebo Západonílského viru.
5o Pro vakcinační aplikace mohou být použity pomocné látky, které jsou známé tčm, kteří se zajímají o stav techniky. Pomocné látky, které mohou být použity, aby zesílily imunogenicitu chimérických vakeín. zahrnují například lipozomální formulace, syntetické pomocné látky takové, jako jsou saponiny (např.: QS2I), muramyl dipeptid, mono fosfory I lipid A nebo polyťosfazin. Ačkoliv tyto pomocné látky jsou obvykle používány pro zesílení imunitních odpovědí u inaktivo35 váných vakeín, mohou být také použity v případe živých vakeín. V případě chimérické vakcíny dopravované přes slizniee. například orálně, jsou použitelné pomocné látky takové, jako je tepelně—labilní toxin zf. coli (ET) nebo mutantní deriváty ET. Kromě toho geny kódující eylokiny, které mají aktivitu pomocných látek, mohou být vneseny do vektorů žluté horečky. Tudíž geny kódující cytokiny takové, jako jsou GM-CSE. IL-2, IL-12, IL—13 nebo IL-5, mohou být vnese•10 ny společně s heterologními flavivirovými geny, aby docházelo k produkci vakcíny, která ve výsledku zesiluje imunitní odpovědi nebo zmírňuje imunitu zaměřenou více specificky směrem k buněčným, humorálním nebo sliznicovým odpovědím. Kromě toho jako aplikace vakcíny tak. jak jim bude ten, kdo zná stav techniky ihned rozumět, mohou být vektory podle předkládaného vynálezu použity v metodách genové terapie, aby byly zavedeny do buněk pacienta produkty terapeutických genů. V těchto metodách jsou geny kódující terapeutické genové produkty zavedeny do vektorů, například v místě genu kódujícího prM-E protein.
Další výhodou vektorového systému žluté horečky je, že se flaviviry replikují v eytoplazmě buněk, takže virová replikační strategie nezahrnuje integraci virového genomu do genomu hosti?o telských buněk (Chambers et al. (1990) ..Elavivirus Genome Organization, Expression, and ReplicationA v Annual Review of Microbiology 44:649-688). což zajišťuje důležitou míru bezpečnosti.
Všechny odkazy zde citované jsou začleněny jako reference v jejich úplnosti.
- 14 CZ 300172 B6
Seznam sekvencí (1) obecné informace 5 (i) přihlašovatel: OraVax, lne., et al.
(ii) název vynálezu: CH1MERIC FLAVIV1RUS VACCINES (iii) počel sekvencí: 16 (iv) korespondenční adresa: κι (a) adresa: Clark & Elbing LEP (b) ulice: 176 Federal Street (c) město: Boston (d) stát: MA i? (c) země: USA (f) směrovací číslo: 02110 (v) forma čitelná počítačem:
(a) typ média: disketa (b) počítač: kompatibilní s IBM (c) operační systém: DOS (d) software: FastSFQ pro Windows verze 2.0 2? (vi) v současnosti přihlašovaná data:
(a) aplikační číslo:
(b) datum vyplnění: 2. březen 1998 (c) klasifikace:
(vii) dříve přihlášená data:
(a) aplikační číslo: 08/807.445 (b) datum vyplnění: 28. únor 1997 (viii) dříve přihlášená data:
(a) aplikační číslo: neznáme (b) datum vyplnění: 15. leden 1998 (íx) právní zástupee/agent informace:
(a) jméno: Clark, Paul T (b) registrační číslo: 30, 162 i? (e) odkaz/soudní číslo: 06132/033 W02
- 15 CZ 300172 B6 (x) telekomunikační informace:
(a) telefon: 617—428-0200 5 (b) telefax: 617—428—7045 (c) telex:
(2) informace o SEQ ID NO: 1:
ιο (i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 páru bází (b) typ: nuklcová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: I:
CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C (2) informace o SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 3:
4o (i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů b4ází (b) typ: nuklcová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
AAGGT AGACT GG1GGGCTCC C
- 16 CZ 300172 Bó (2) informace o SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 26 páru bází (b) typ: nuklcová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární io (íi) typ molekuly: eDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA 15 (2) informace o SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (e) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: eDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
AAGGI AGA 1T GGTGTGCA 1Ί G (2) informace o SEQ ID NO: 6:
(í) charakter ist i ka sekvence:
(a) délka: 26 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární 4o (ii) typ molekuly: eDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
AACCCTCAGT ACCACCCGCG GTTTAA 45 (2) informace o SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina
- 17 CZ 300172 B6 (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
AAGG TGAATT GAAGTGCTCT A io (2) informace o SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází 15 (b) typ: nukleová kyselina (e) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
ACCCCCAGCA CCACCCGCGG TTTAA
2? (2) informace o SEQ ID NO: 9:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází 50 (b) typ: nukleová kyselina (e) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
AAAAGGAACA G1 IGTTCTCT A (2) informace o SEQ ID NO: 10:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází 45 (b) typ: nukleová kyselina (e) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA
- 18 Cl 300172 B6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
ACCCGAAGTGTCAACCGCGGTTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 11:
(i) charakteristika sekvence:
ιο (a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární l? (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
AACGTGAATA GTTGGATAGT C (2) informace o SEQ ID NO: 12:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nuklcová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární 30 (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO; 12:
ACCG11GGTC GCACCCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) tvp: nukleová kyselina (e) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
AATTTCGAAA GGTGGAAGGT C
- IQ CZ 300172 B6 (2) informace o SEQ ID NO: 14;
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 26 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární io (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SF2Q ID NO: 14:
GACCGGTGI T TACAGCCGCG GTTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 15:
(i) charakteristika sekvence:
2o (a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie; lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
5o TACTGCGAAC GACG Π GCCA C (2) informace o SEQ ID NO: 16:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) ty p molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA
Claims (18)
- s 1. Chimérický živý. infekční, oslabený virus, který zahrnuje virus žluté horečky, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující prM-E protein bud1 dc letován a, okleštěná, nebo zrn utována. takže není exprimován funkční prM E protein viru žluté horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky jc integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného tlaviviru. takže prM-E protein tohoto druhého flavivirů exprimován je, přičemž jsou signální sekveuio ce v C/prM a E/NS1 spojeních udržovány v konstrukci zmíněného chimérického flavivirů.
- 2. Chimérický virus podle nároku 1, kde druhým flavivirem je virus japonské encefalitidy (JE).
- 3. Chimérický virus podle nároku 1. kde druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupii ? ny zah rn uj í c í ty py virůdengue I až 4.
- 4. Chimérický virus podle nároku 1, kde druhý virus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Val lev eneefa litický virus, St. Louis eneefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy. vity hepatitidv C, Kunjin virus, středoevropský eneefalitický virus, ruský jaroletní ence20 falítícký virus, Powassan virus, Kyasanur Eorest Disease virus a virus omské hemoragické horečky.
- 5. Chimérický virus podle nároku 1. kde nukleotidová sekvence kódující prM E protein druhého, odlišného flavivirů, nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein viru žluté25 horečky.
- 6. Chimérický virus podle nároku 1, kde nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého. odlišného flavivirů, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM, aby mohlo dojít k produkci M proteinu.
- 7. Použití chimérického živého, infekčního oslabeného viru pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčbu flavivirových infekcí u pacientů, přičemž chiméricky, živý. infekční oslabený virus zahrnuje virus žluté horečky, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující prM -E protein bud1 de letován a, oklestěna, nebo /mutována, takže není exprimován funkční prM-E protein viru žluté .b horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flavivirů, takže prM-E protein tohoto druhého flavivirů exprimován jc. přičemž jsou signální sekvence v C/prM a E/NSl spojeních udržovány v konstrukci zmíněného chimérického flavivirů.40
- 8. Použití podle nároku 7. kde druhým flavivirem je virus japonské encefalitidy (JE).
- 9. Použití podle nároku 7, kde druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupiny zahrnující typy virů dengue l až 4.45
- 10. Použití podle nároku 7, kde druhý flavivirus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Valley eneefalitický virus. St. Louis eneefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy, viry hepatitidv C. Kunjin virus, středoevropský eneefalitický virus, ruský jaro letní eneefalitický virus. Powassan virus, Kyasanur Eorest Disease virus a virus omské hemoragické horečky.50
- 11. Použití podle nároku 7, kde nukleotidová sekvence kódující prM E protein druhého, odlišného flavivirů, nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein virus žluté horečky.
- 12. Použití podle nároku 7. kde nukleotidová sekvence kódující prM -E protein druhého, odlišného flavivirů, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM, aby mohlo dojít k produkci M pro55 teinu.-21 CZ 300172 B6
- 13. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický živý, infekční oslabený virus, přičemž virus zahrnuje virus žluté horečky, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující prM-E protein bud1 deletována, okleštěná, nebo zmutována. takže není exprimován funkční prM-E protein viru5 žluté horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru. takže prM-E protein tohoto druhého flaviviru exprimován je. přičemž jsou signální sekvence v C/prM a E/NS1 spojeních udržovány v konstrukci zmíněného chimérického flaviviru.io
- 14. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde druhým flavivirem jc virus japonské encefalitidy (JE).
- 15. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupiny zahrnující typy virů dengue 1 až 4.
- 16. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13. kde druhý flavivirus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Valley encefalitický virus. St. Louis encefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy, viry hepatitidy C, Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro letní encefalitický virus. Powassan virus. Kvasanur Eorest Disease virus a virus omské io hemoragické horečky.
- 17. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde nukleotidová sekvence kódující prME protein druhého, odlišného flaviviru. nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein virus žluté horečky.
- 18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kde nukleotidová sekvence kódující prME protein druhého, odlišného flaviviru, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM. aby mohlo dojít k produkci M proteinu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80744597A | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| US766498A | 1998-01-15 | 1998-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ306499A3 CZ306499A3 (cs) | 2000-01-12 |
| CZ300172B6 true CZ300172B6 (cs) | 2009-03-04 |
Family
ID=26677253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0306499A CZ300172B6 (cs) | 1997-02-28 | 1998-03-02 | Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP1625852B1 (cs) |
| JP (2) | JP4504464B2 (cs) |
| KR (1) | KR100517323B1 (cs) |
| CN (1) | CN1187088C (cs) |
| AT (2) | ATE297757T1 (cs) |
| AU (1) | AU740961B2 (cs) |
| BR (1) | BR9807873A (cs) |
| CA (1) | CA2282790C (cs) |
| CZ (1) | CZ300172B6 (cs) |
| DE (2) | DE69841690D1 (cs) |
| DK (2) | DK1625852T3 (cs) |
| ES (2) | ES2345614T3 (cs) |
| HK (1) | HK1025743A1 (cs) |
| HU (1) | HU228705B1 (cs) |
| IL (4) | IL131600A0 (cs) |
| NO (1) | NO329693B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ337522A (cs) |
| PL (1) | PL192957B1 (cs) |
| PT (2) | PT1625852E (cs) |
| RU (1) | RU2209082C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998037911A1 (cs) |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962708B1 (en) | 1997-02-28 | 2005-11-08 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| CA2331368C (en) | 1998-06-04 | 2009-02-10 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7009044B1 (en) * | 1999-06-04 | 2006-03-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | HCV/BVDV chimeric genomes and uses thereof |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| WO2001039802A1 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Oravax, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| US6589531B1 (en) | 2000-01-21 | 2003-07-08 | The Regents Of The University Of California | Recombinant yellow fever virus and method of use thereof |
| WO2001059093A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | FULL-LENGTH INFECTIOUS cDNA CLONES OF TICK BORNE FLAVIVIRUS |
| AU3844101A (en) * | 2000-02-16 | 2001-08-27 | Us Health | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| AU2007202304B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-03-18 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| FR2823222B1 (fr) * | 2001-04-06 | 2004-02-06 | Merial Sas | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
| EP1399183B1 (en) * | 2001-05-31 | 2010-06-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Chimeric alphavirus replicon particles |
| US20030232324A1 (en) | 2001-05-31 | 2003-12-18 | Chiron Corporation | Chimeric alphavirus replicon particles |
| WO2002102828A2 (en) | 2001-06-01 | 2002-12-27 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vectors |
| US6682883B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-01-27 | Acambis, Inc. | Diagnosis of flavivirus infection |
| DK1441761T3 (da) * | 2001-10-19 | 2007-08-27 | Acambis Inc | Fremgangsmåder til forebyggelse og behandling af flavivirus-infektion hos dyr |
| JP2005510244A (ja) * | 2001-11-26 | 2005-04-21 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・クイーンズランド | フラビウイルスワクチン送達系 |
| JP2005519639A (ja) | 2002-01-15 | 2005-07-07 | アカンビス インコーポレーティッド | フラビウイルスワクチン |
| ES2427139T3 (es) * | 2002-06-20 | 2013-10-29 | Institut Pasteur | Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna |
| EP2110382A1 (en) | 2002-06-20 | 2009-10-21 | Institut Pasteur | Infectious cDNA of an improved vaccine strain of measles virus, use for immunogenic compositions |
| EP1546176A4 (en) * | 2002-07-19 | 2006-01-11 | Univ Texas | METHODS AND COMPOSITIONS ASSOCIATED WITH ALTERED YELLOW FEVER VIRUS STEM |
| MXPA05005140A (es) | 2002-11-15 | 2005-08-19 | Acambis Inc | Vacuna contra el virus del nilo occidental. |
| CA2432738A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-08-26 | Philippe Despres | New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications |
| CN1304579C (zh) * | 2003-07-21 | 2007-03-14 | 上海天甲生物医药有限公司 | 重组的以黄热病病毒为载体的疫苗 |
| WO2005040390A1 (fr) * | 2003-07-21 | 2005-05-06 | Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. | Vaccin recombine utilisant le virus de la fievre jaune comme vecteur |
| CN101018860B (zh) * | 2004-07-12 | 2013-02-27 | 美国天甲生物医药有限公司 | 黄病毒疫苗 |
| CA2584228C (en) * | 2004-10-20 | 2015-05-05 | Acambis Inc. | Vaccines against japanese encephalitis virus and west nile virus |
| AU2005318171B2 (en) | 2004-12-20 | 2011-09-29 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof |
| JP4871738B2 (ja) | 2004-12-24 | 2012-02-08 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス |
| ES2478303T3 (es) | 2005-04-24 | 2014-07-21 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Vacunas de flavivirus recombinantes |
| AU2006245734C1 (en) | 2005-05-12 | 2012-05-24 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| BRPI0504945B8 (pt) | 2005-10-31 | 2022-08-02 | Fundacao Oswaldo Cruz | Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos. |
| CU23586A1 (es) | 2005-11-22 | 2010-10-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus |
| EA031202B1 (ru) | 2006-06-06 | 2018-11-30 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Антитело человека, обладающее фагоцитарной активностью против стафилококков, и его применение |
| CA2659592C (en) | 2006-07-14 | 2016-10-04 | Konstantin V. Pugachev | Construction of recombinant virus vaccines by direct transposon-mediated insertion of foreign immunologic determinants into vector virus proteins |
| FR2906724B1 (fr) | 2006-10-04 | 2009-03-20 | Sanofi Pasteur Sa | Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue. |
| EP2086581B1 (en) * | 2006-11-07 | 2014-08-13 | Sanofi Pasteur Biologics, LLC | Stabilization of vaccines by lyophilization |
| EP2121010A4 (en) | 2007-01-31 | 2011-02-16 | Sanofi Pasteur Biologics Co | RECOMBINANT BICISTRONIC FLAVIRUS VECTORS |
| WO2008100464A1 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-21 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Viral vectors and methods of use |
| WO2009109550A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Sanofi Pasteur | Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition |
| WO2009114207A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors |
| EP2143440A1 (fr) | 2008-07-09 | 2010-01-13 | Sanofi Pasteur | Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués |
| EP2353609A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-10 | Sanofi Pasteur | Immunization compositions and methods |
| EP2877208B1 (en) | 2012-07-24 | 2021-05-12 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions for the prevention of dengue virus infection |
| JP2015524422A (ja) | 2012-07-24 | 2015-08-24 | サノフィ・パスツールＳａｎｏｆｉｐａｓｔｅｕｒ | ワクチン組成物 |
| CN104812410A (zh) | 2012-10-03 | 2015-07-29 | 赛诺菲巴斯德有限公司 | 针对日本脑炎、麻疹、腮肿以及风疹的疫苗接种 |
| WO2014083194A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Sanofi Pasteur | Methods for inducing antibodies |
| CN105451763B (zh) | 2013-03-15 | 2021-06-18 | 武田疫苗股份有限公司 | 用于疫苗中的登革热病毒嵌合式构建物的组合物及方法 |
| WO2014204892A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof |
| CN103352029A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用 |
| TW201620546A (zh) | 2014-09-02 | 2016-06-16 | 賽諾菲巴斯德公司 | 疫苗組合物 |
| EP3031923A1 (en) * | 2014-12-11 | 2016-06-15 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition |
| CN106999568A (zh) | 2014-12-22 | 2017-08-01 | 默沙东公司 | 登革病毒疫苗组合物及其使用方法 |
| BR112017028212A2 (pt) | 2015-07-03 | 2018-09-11 | Sanofi Pasteur | vacinação concomitante contra dengue e febre amarela |
| BE1024160B9 (fr) | 2015-12-22 | 2017-12-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Formulation immunogène |
| CN105400799B (zh) * | 2015-12-22 | 2018-12-28 | 成都生物制品研究所有限责任公司 | 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用 |
| SG11202002933TA (en) | 2017-10-05 | 2020-04-29 | Sanofi Pasteur | Compositions for booster vaccination against dengu |
| GB201716307D0 (en) * | 2017-10-05 | 2017-11-22 | Univ Leuven Kath | Chimeric yellow fever zika virus strain |
| KR20190127605A (ko) * | 2018-05-04 | 2019-11-13 | 에스케이바이오사이언스(주) | 키메라 지카바이러스 백신 |
| WO2020051328A1 (en) | 2018-09-05 | 2020-03-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Assay for determining antibody response to dengue virus |
| US11426461B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-08-30 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis A |
| CA3111332A1 (en) | 2018-09-05 | 2020-03-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| GB201814563D0 (en) * | 2018-09-07 | 2018-10-24 | Univ Leuven Kath | Chimeric flavivirus lyssavirus vaccines |
| BR112022001476A2 (pt) | 2019-08-16 | 2023-10-03 | Takeda Vaccines Inc | Uso de uma vacina contra hepatite a e uma composição de vacina contra dengue ou uma dose unitária de uma composição de vacina contra dengue, combinação de vacina e kit |
| WO2021174059A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for removing host cell dna from virus preparation |
| CN113215116B (zh) * | 2021-05-11 | 2022-07-19 | 中国科学院动物研究所 | 基于朝阳病毒载体的嵌合病毒、疫苗及其应用 |
| JPWO2022249757A1 (cs) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | ||
| WO2023147337A2 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Takeda Vaccines, Inc. | Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture |
| WO2023158989A1 (en) | 2022-02-15 | 2023-08-24 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine batch mixing process |
| WO2023215383A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Computer-based determination of flavivirus infectivity |
| WO2024108087A1 (en) | 2022-11-18 | 2024-05-23 | Takeda Vaccines, Inc. | A method for determining the proportion of a live, attenuated flavivirus having a nucleotide sequence comprising at least one attenuation locus in a formulation |
| WO2024118740A1 (en) | 2022-11-29 | 2024-06-06 | Takeda Vaccines, Inc. | Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990001946A1 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-08 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
| WO1993006214A1 (en) * | 1991-09-19 | 1993-04-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses |
-
1998
- 1998-03-02 AT AT98910103T patent/ATE297757T1/de active
- 1998-03-02 CN CNB988045567A patent/CN1187088C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 PT PT05012770T patent/PT1625852E/pt unknown
- 1998-03-02 CZ CZ0306499A patent/CZ300172B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 RU RU99120696/14A patent/RU2209082C2/ru active
- 1998-03-02 HU HU0002139A patent/HU228705B1/hu unknown
- 1998-03-02 CA CA2282790A patent/CA2282790C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 IL IL13160098A patent/IL131600A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 PT PT98910103T patent/PT977587E/pt unknown
- 1998-03-02 DE DE69841690T patent/DE69841690D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DE DE69830579T patent/DE69830579T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 BR BR9807873A patent/BR9807873A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-03-02 ES ES05012770T patent/ES2345614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 AT AT05012770T patent/ATE468858T1/de active
- 1998-03-02 EP EP05012770A patent/EP1625852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK05012770.3T patent/DK1625852T3/da active
- 1998-03-02 KR KR10-1999-7007904A patent/KR100517323B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 NZ NZ337522A patent/NZ337522A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 AU AU64431/98A patent/AU740961B2/en not_active Expired
- 1998-03-02 JP JP53790798A patent/JP4504464B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK98910103T patent/DK0977587T3/da active
- 1998-03-02 WO PCT/US1998/003894 patent/WO1998037911A1/en active Application Filing
- 1998-03-02 ES ES98910103T patent/ES2244050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 PL PL335481A patent/PL192957B1/pl unknown
- 1998-03-02 EP EP10005372A patent/EP2251036A1/en not_active Withdrawn
- 1998-03-02 EP EP98910103A patent/EP0977587B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-27 NO NO19994185A patent/NO329693B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-09 HK HK00104982A patent/HK1025743A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-31 IL IL193170A patent/IL193170A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-28 JP JP2009247641A patent/JP2010057496A/ja active Pending
-
2010
- 2010-08-10 IL IL207517A patent/IL207517A0/en unknown
- 2010-08-10 IL IL207516A patent/IL207516A0/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990001946A1 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-08 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
| WO1993006214A1 (en) * | 1991-09-19 | 1993-04-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BRAY Michael a kol., Construction of intertypic chimeric dengue viruses by substitution of structural protein genes, listopad 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, cislo 88, stranky 10342 a× 10346 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ300172B6 (cs) | Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující | |
| US6962708B1 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| WO1998037911A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| JP3531934B2 (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| JP5469336B2 (ja) | 組換えフラビウイルスワクチン | |
| Costa et al. | Protection against dengue type 2 virus induced in mice immunized with a DNA plasmid encoding the non-structural 1 (NS1) gene fused to the tissue plasminogen activator signal sequence | |
| US20060159704A1 (en) | Use of flavivirus for the expression of protein epitopes and development of new live attenuated vaccine virus to immunize against flavivirus and other infectious agents | |
| US7507415B2 (en) | West nile virus vaccine | |
| US20040052818A1 (en) | Attenuated live vaccine | |
| WO2001039802A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| US6676936B1 (en) | Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses | |
| EP2339011B1 (en) | West Nile virus and Dengue 4 virus chimeras for use in a live virus vaccine to prevent disease caused by west nile virus | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180302 |