NO329329B1 - Isolert eller rekombinant polynukleotid, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av et polypeptid, antistoff- eller antigenbindende fragment derav, fremgangsmate for anvendelse av antstoffet eller det antigenbindende fragment derav, sett, isolert polypeptid. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår isolert eller rekombinant polynukleotid, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, antistoff-ener antigenbindende fragment derav, fremgangsmåte for anvendelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment derav, sett, isolert polypeptid.

Oppfinnelsens bakgrunn

Rekombinant DNA-teknologi refererer generelt til teknikken med integrering av genetisk informasjon fra en donorkilde i vektorer for etterfølgende bearbeidelse, slik som gjennom innføring i en vert, hvorved den overførte genetiske informasjon kopieres og/eller uttrykkes i det nye miljø. Vanligvis eksisterer den genetiske informasjon i form av komplementært DNA (cDNA) avledet fra messenger-RNA (mRNA) som koder for et ønsket proteinprodukt. Bæreren er ofte et plasmid med kapasitet til å inkorporere cDNA for senere replikasjon i en vert, og i noen tilfeller i realiteten for å kontrollere ekspresjon av cDNA og derved direkte syntese av det kodete produkt i verten.

I noen tid har det vært kjent at immunresponsen hos pattedyr er basert på en serie av komplekse cellulære interaksjoner betegnet "immunnettverket". Nylig forskning har gitt ny innsikt i dette nettverkets indre arbeidsmåte. Selv om det fremdeles er klart at mye av responsene i realiteten kretser rundt de nettverkslignende interaksjoner mellom lymfocytter, makrofager, granulocytter og andre celler, er immunologer nå vanligvis av den oppfatning at oppløselige proteiner, kjent som lymfokiner, cytokiner eller monokiner, spiller en kritisk rolle ved kontrollering av disse cellulære interaksjoner. Det er således betydelig interesse for isolering, karakterisering -og virkningsmekanismer av cellemodulerende faktorer, og en forståelse av disse vil føre til betydelige fremskritt for diagnose og terapi av et stort antall medisinske abnormiteter, f.eks. immunsystemforstyrrelser. Noen av disse faktorer er hematopoetiske vekstfaktorer, f.eks. granulocyttkolonistimu-lerende faktor (G-CSF). Se f.eks. Thomson (1994; red.), The Cytokine Handbook (2. utg.), Academic Press, San Diego;

Metcalf og Nicola (1995), The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; og Aggarwal og Gutterman

(1991), Human Cytokines Blackwell Pub.

Lymfokiner formidler åpenbart cellulære aktiviteter på mange forskjellige måter. De er blitt vist å understøtte proliferasjon, vekst og differensiering av pluripotensielle hematopoetiske stamceller til enorme antall forløperceller som omfatter diverse cellelinjer som utgjør et komplekst immunsystem. Riktige og balanserte interaksjoner mellom de cellulære komponenter er nødvendig for en sunn immunrespons. De forskjellige cellelinjer reagerer ofte på forskjellig måte når lymfokiner administreres i forbindelse med andre midler.

Cellelinjer som er spesielt viktige for immunresponsen, inkluderer to klasser av lymfocytter: B-celler som kan produsere og utskille immunglobuliner (proteiner med evne til å gjenkjenne og bindes til fremmed materiale for å bevirke fjerning av materialet), og T-celler av forskjellige under-grupper som utskiller lymfokiner og induserer eller under-trykker B-cellene og forskjellige andre celler (inkludert andre T-celler) som utgjør immunnettverket. Disse lymfocytter reagerer med mange andre celletyper.

En annen viktig cellelinje er mastceller (som ikke er blitt positivt identifisert i alle pattedyrarter), som er granulinneholdende bindevevsceller lokalisert proksimalt for kapillarer gjennom hele kroppen. Disse celler er funnet i spesielt høye konsentrasjoner i lungene, huden og gastro-intestinal- og genitalurinkanalene. Mastceller spiller en sentral rolle ved allergirelaterte forstyrrelser, spesielt anafylakse, som følger: Når utvalgte antigener kryssbinder en klasse av immunglobuliner bundet til reseptorer på mastcelle-overflaten, degranuleres mastcellen og frigjør mediatorer, f.eks. histamin, serotonin, heparin og prostaglandiner, som forårsaker allergiske reaksjoner, f.eks. anafylakse.

Forskning for bedre å forstå og behandle forskjellige immunforstyrrelser er blitt hindret ved at det generelt ikke har vært mulig å opprettholde celler fra immunsystemet in vitro. Immunologer har oppdaget at dyrkning av disse celler kan oppnås ved anvendelse av T-celle- og andre cellesuper-natanter som inneholder forskjellige vekstfaktorer, inkludert mange av lymfokinene.

Fra det ovenstående fremgår det at oppdagelsen og utviklingen av nye lymfokiner, f.eks. beslektet med G-CSF og/eller IL-6, kunne bidra til nye terapier for et bredt område av degenerative eller unormale tilstander som direkte eller indirekte involverer immunsystemet og/eller hematopoetiske celler. Nærmere bestemt ville oppdagelsen og utviklingen av lymfokiner som forhøyer eller potensierer de fordel-aktige aktiviteter av kjente lymfokiner, være ytterst fordel-aktig. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye inter-leukinpreparater og beslektede forbindelser og metoder for anvendelse av disse.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert eller rekombinant polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for et modent polypeptid utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 4 og 5.

Også omfattet av oppfinnelsen er ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter ekspresjon av et rekombinant polynukleotid ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også antistoff- eller antigenbindende fragment derav, kjennetegnet ved at det spesifikt bindes til et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av den modne aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5.

Også omfattet av oppfinnelsen er fremgangsmåte for anvendelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment derav ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den omfatter at antistoffet eller det antigenbindende fragment derav bringes i kontakt med en biologisk prøve som omfatter et antigen, idet denne kontakt resulterer i dannelse av et antistoff:antigenkompleks eller et antigenbindende fragment:antigenkompleks.

Videre omfatter oppfinnelsen sett, kjennetegnet ved at det omfatter antistoffet eller det antigenbindende fragment derav ifølge oppfinnelsen, og

a) instruksjonsmateriale for anvendelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment

derav for nevnte påvisning; eller

b) et rom som tilveiebringer atskillelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment

derav.

Til slutt omfatter oppfinnelsen isolert polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter et modent polypeptid ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5.

Oppfinnelsen angår interleukin-B30 (IL-B30) fra pattedyr, f.eks. gnagere, hunder, katter, primater, og dets biologiske aktiviteter. Den inkluderer nukleinsyrer som koder for selve polypeptidene og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av disse. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er delvis karakterisert ved deres homologi med klonede komplementære DNA(cDNA)-sekvenser beskrevet heri, og/eller ved funksjonelle analyser for vekstfaktor- eller cytokinlignende aktiviteter, f.eks. G-CSF (se Nagata (1994) i Thomson, The Cytokine Handbook, 2. utg., Academic Press, San Diego), og/eller IL-6 (se Hirano (1994) i Thomson, The Cytokine Handbook, 2. utg., Academic Press, San Diego), anvendt på polypeptidene som typisk blir kodet for av disse nukleinsyrer. Metoder for modulering av eller intervenering i kontrollen av en vekstfaktoravhengig fysiologi eller en immunrespons er beskrevet.

Oppfinnelsen er delvis basert på oppdagelsen av en ny cytokinsekvens som oppviser betydelig sekvens- og strukturell likhet med G-CSF og IL-6. Oppfinnelsen tilveiebringer spesielt et primatgen, f.eks. et humant gen, som koder for et protein hvis modne størrelse er ca. 168 aminosyrer, og grise- og muse-sekvenser. Funksjonelle ekvivalenter som oppviser signifikant sekvenshomologi, vil være tilgjengelige fra andre pattedyrarter, f.eks. ku, hest og rotte, og ikke-pattedyrarter.

I forskjellige proteinutførelsesformer beskrives: et vesentlig rent eller rekombinant IL-B30-protein eller peptid som oppviser minst ca. 85 % sekvensidentitet i en lengde på ca. minst 12 aminosyrer med SEQ ID NO: 2; en naturlig sekvens IL-B30 av SEQ ID NO: 2; og et fusjonsprotein som omfatter IL-B30-sekvens. I visse utførelsesformer er homologien minst ca. 90 % identitet, og området er minst ca. 9 aminosyrer; homologien er minst ca. 80 % identitet, og området er minst ca. 17 aminosyrer; eller homologien er minst ca. 70 % identitet, og området er minst ca. 25 aminosyrer. I andre utførelsesformer omfatter IL-B30 en moden sekvens ifølge tabell 1; eller oppviser et posttranslasjonelt modifika-sjonsmønster forskjellig fra naturlig IL-B30; eller proteinet eller peptidet er fra et varmblodig dyr utvalgt fra et pattedyr, inkludert en primat; omfatter minst ett polypeptid-segment med SEQ ID NO: 2; oppviser mange forskjellige deler med identiteten; er en naturlig allel variant av IL-B30; har en lengde på minst ca. 30 aminosyrer; oppviser minst to ikke-overlappende epitoper som er spesifikke for et pattedyr-IL-B30; oppviser en sekvensidentitet på minst 90 % i en lengde på minst ca. 20 aminosyrer med pattedyr-ILB30; er glykosylert; har en molekylvekt på minst 10 kD med naturlig glykosylering; er et syntetisk polypeptid; er festet til et fast substrat; er konjugert til en annen kjemisk komponent; er substituert fem ganger eller mindre i forhold til en naturlig sekvens; eller er en delesjons- eller innføyelsesvariant av en naturlig sekvens. Foretrukne utførelsesformer inkluderer et preparat som omfatter: et sterilt IL-B30-protein eller peptid; eller IL-B30-proteinet eller peptidet og en bærer, der bæreren er: en vandig forbindelse, inkludert vann, fysiologisk saltvann og/eller buffer; og/eller formulert for oral, rektal, nasal, topisk eller parenteral administrering. I fusjonsprotein-utførelsesformer kan proteinet ha: en moden proteinsekvens ifølge tabell 1; en påvisnings- eller rensingsmarkør, inkludert en FLAG-, His6- eller Ig-sekvens; og/eller sekvensen til et annet cytokin eller kjemokin.

Utførelsesformer i form av sett inkluderer dem med IL-B30-protein eller polypeptid og: en beholder som inneholder proteinet eller polypeptidet; og/eller instruksjoner for anvendelse eller fjerning av reagenser i settet.

I bindingsforbindelsesutførelsesformer kan forbindelsen ha et antigenbindingssete fra et antistoff som spesifikt bindes til et naturlig IL-B30-protein, hvori: IL-B30 er et pattedyrprotein; bindingsforbindelsen er et Fv-, Fab- eller Fab2-fragment; bindingsforbindelsen er konjugert til en annen kjemisk komponent; eller antistoffet er dannet mot en peptid-sekvens av et modent polypeptid ifølge tabell 1; er dannet mot et modent IL-B30; er dannet mot et renset gnager-IL-B30; er immunutvalgt; er et polyklonalt antistoff; bindes til et de-naturert IL-B30; oppviser en kD på minst 30 uM; er festet til et fast substrat, inkludert en kule eller plastmembran; fore-ligger i et sterilt preparat; eller er påvisbart merket, inkludert en radioaktiv eller fluorescerende markør. Sett inneholdende bindingsforbindelser inkluderer dem med: en beholder som inneholder bindingsforbindelsen; og/eller instruksjoner for anvendelse eller fjerning av reagenser i settet. Settet er ofte i stand til å gjøre en kvalitativ eller kvantitativ analyse. Foretrukne preparater vil omfatte: en steril bindingsforbindelse; eller bindingsforbindelsen og en bærer, der bæreren er: en vandig forbindelse, inkludert vann, fysiologisk saltvann og/eller buffer; og/eller formulert for oral, rektal, nasal, topisk eller parenteral administrering.

Nukleinsyreutførelsesformer inkluderer en isolert eller rekombinant nukleinsyre som koder for et IL-B30-protein eller peptid eller fusjonsprotein, hvori: IL-B30 er fra et pattedyr; og/eller nukleinsyren: koder for en antigen peptid-sekvens ifølge tabell 1; koder for mange forskjellige antigen-peptidsekvenser ifølge tabell 1; oppviser minst ca. 80 % identitet med et naturlig cDNA som koder for segmentet; er en ekspresjonsvektor; omfatter ytterligere et replikasjonsstart-område; er fra en naturlig kilde; omfatter en påvisbar markør; omfatter en syntetisk nukleotidsekvens; er mindre enn 6 kb, fortrinnsvis mindre enn 3 kb; er fra et pattedyr, inkludert en primat; omfatter en naturlig, fullengdet kodingssekvens; er en hybridiseringsprobe for et gen som koder for IL-B30; eller er en PCR-primer, et PCR-produkt eller en mutageneseprimer. Oppfinnelsen tilveiebringer også en celle, et vev eller et organ som omfatter en slik rekombinant nukleinsyre, og fortrinnsvis vil cellen være: en prokaryot celle; en eukaryot celle; en bakteriecelle; en gjærcelle; en insektcelle; en pattedyrcelle; en musecelle; en primatcelle; eller en menneskecelle.

Utførelsesformer i form av sett inkluderer dem med en slik nukleinsyre og: en beholder som inneholder nukleinsyren; en beholder som ytterligere inneholder IL-B30-proteinet eller polypeptidet; og/eller instruksjoner for anvendelse eller fjerning av reagenser i settet. Settet er typisk i stand til å gjøre en kvalitativ eller kvantitativ analyse.

I visse utførelsesformer vil nukleinsyren: hybridisere under vaskebetingelser på 30 °C og mindre enn 2 M salt, eller 45 °C og/eller 500 mM salt, eller 55 °C og/eller 150 nM salt, med SEQ ID NO: 1; eller oppviser minst ca. 85 % identitet, og/eller strekningen er minst ca. 30 nukleotider, eller oppviser minst 90 % identitet, og/eller strekningen er minst 55 nukleotider, eller oppviser minst 95 % identitet, og/eller strekningen er minst 75 nukleotider, med et primat-IL-B30.

Oppfinnelsen omfatter en metode for modulering av fysiologi eller utvikling av en celle eller vevskulturceller, omfattende at cellene bringes i kontakt med en agonist eller antagonist av et pattedyr-IL-B30. Metoden kan gå ut på at: kontaktreaksjonen utføres i kombinasjon med en agonist eller antagonist av G-CSF og/eller IL-6; eller kontaktreaksjonen utføres med en agonist, inkludert et bindingspreparat som omfatter et antistoffbindingssete som spesifikt binder et IL-B30.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

I. Generelt

Det tilveiebringes aminosyresekvenser og DNA-sekvenser som koder for forskjellige pattedyrproteiner som er cytokiner, f.eks. som er utskilte molekyler som kan formidle et signal mellom immunceller og andre celler. Se f.eks. Paul

(1994), Fundamental Immunology (3. utg.), Raven Press, N.Y. De fullengdede cytokiner og fragmenter eller antagonister vil være anvendelige ved fysiologisk modulering av celler som uttrykker en reseptor. Det er sannsynlig at IL-B30 enten har stimulatoriske eller inhibitoriske effekter på hematopoetiske celler, inkludert f.eks. lymfoidceller, slik som T-celler, B-celler, naturlige dreper(NK)celler, makrofager, dendrittceller, hematopoetiske forløperceller etc. Proteinene vil også være anvendelige som antigener, f.eks. immunogener, for frembringelse av antistoffer mot forskjellige epitoper på proteinet, både lineære og konformasjonelle epitoper.

Et cDNA som koder for IL-B3 0, ble identifisert fra en human cellelinje. Molekylet ble betegnet huIL-B3 0. Et beslektet gen som tilsvarer en grisesekvens, ble også identifisert. En gnagersekvens, f.eks. fra mus, er også beskrevet.

Det humane gen koder for et lite, oppløselig, cytokinlignende protein på ca. 168 aminosyrer. Signalsekvensen er antakeligvis ca. 21 rester og vil løpe fra Met til ca. Ala. Se tabell 1 og SEQ ID NO: 1 og 2. IL-B30 oppviser strukturelle motiver som er karakteristiske for et medlem av de langkjedete cytokiner. Sammenlign f.eks. IL-B3 0, G-CSF og IL-6, sekvenser tilgjengelige fra GenBank. Se også tabell 2.

Tabell 1

Nukleinsyre (SEQ ID NO: 1) som koder for IL-B30 fra en primat, f.eks. et menneske. Translatert aminosyresekvens er SEQ ID NO: 2

ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA

48

Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr

-21 -20 -15 -10

GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG

96

Ala Gin Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gin

-5 15 10

TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT- GCA CAT

144

Cys Gin Gin Leu Ser Gin Lys Leu Tys Thr I,<p>ii Ala Trr Ala His

15 20 25

CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT

192

Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr

30 35 40

ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA

240

Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gir. Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gin

45 50 55

GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT

288

Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gir. Phe Cys Leu Gin Arg Ile His Gin Gly

60 65 70 75

Det beskrives også rekombinante proteiner, f.eks. heterologe fusjonsproteiner, ved anvendelse av segmenter fra disse proteiner. Et heterologt fusjonsprotein er en fusjon av proteiner eller segmenter som naturlig ikke normalt er fusjonert på samme måte. Et lignende konsept gjelder heterologe nukleinsyresekvenser.

Nye konstruksjoner kan dessuten dannes ved å kombi-nere lignende funksjonelle domener fra andre proteiner. Mål-bindingssegmenter eller andre segmenter kan f.eks. "utveksles" mellom forskjellige nye fusjonspolypeptider eller fragmenter. Se f.eks. Cunningham, et al. (1989), Science, 243:1330-1336; og 0'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15985-15992.

Fosforamidittmetoden beskrevet av Beaucage og Carruthers (1983), Tetra. Letts., 22(20):1859-1862, vil produsere egnede syntetiske DNA-fragmenter. Et dobbelttrådet fragment vil ofte oppnås, enten ved syntetisering av den komplementære tråd og annealing av tråden sammen under passende betingelser eller ved addisjon av den komplementære tråd ved anvendelse av DNA-polymerase med en passende primer-sekvens, f.eks. ved hjelp av PCR-teknikker.

Strukturell analyse kan utføres på dette gen for sammenligning med IL-6-familien av cytokiner. Familien inkluderer f.eks. IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF og Ob. Linjeoppstilling av de humane, grise- og muse-IL-B30-sekvenser med andre medlemmer av IL-6-familien burde tillate definisjon av strukturelle trekk. Nærmere bestemt kan (3-plate- og a-heliksrester bestemmes ved anvendelse av f.eks. RASMOL-program, se Bazan et al. (1996), Nature, 375:591; Lodi et al.

(1994), Science, 263:1762-1766; Sayle og Milner-White (1995), TIBS, 20:374-376; og Gronenberg et al. (1991), Protein Engineering, 4:263-269. Foretrukne rester for substitusjoner inkluderer de overflateeksponerte rester som ville forutsies å reagere med reseptor. Andre rester som burde konservere funksjon, vil være konservative substitusjoner, spesielt i en posisjon langt fra de overflateeksponerte rester.

IV. Funksjonelle varianter

Blokkering av fysiologiske responser på IL-B30 kan resultere fra den kompetitive inhibering av binding av liganden til dens reseptor.

In vi tro- analyser ifølge foreliggende oppfinnelse vil ofte anvende isolert protein, oppløselige fragmenter som omfatter reseptorbindingssegmenter av disse proteiner eller fragmenter festet til fastfasesubstrater. Disse analyser vil også tillate diagnostisk bestemmelse av effektene av enten bindingssegmentmutasjoner og modifikasjoner eller cytokin-mutasjoner og modifikasjoner, f.eks. IL-B30-analoger.

Det beskrives også anvendelse av kompetitive legemiddelscreeningsanalyser, f.eks. hvor nøytraliserende antistoffer mot cytokinet eller reseptorbindingsfragmenter konkurrerer med en testforbindelse.

"Derivater" av IL-B30-antigener inkluderer aminosyre-sekvensmutanter fra naturlig forekommende former, glykosyler-ingsvarianter og kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske komponenter. Kovalente derivater kan prepareres ved binding av funksjonaliteter til grupper som finnes i IL-B30-aminosyresidekjeder eller ved N- eller C-terminalene, f.eks. ved hjelp av standardmetoder. Se f.eks. Lundblad og Noyes

(1988), Chemical Reagents for Protein Modification, vol. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (red., 1989), Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; og Wong (1991), Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.

Spesielt er glykosyleringsendringer inkludert, f.eks. dannet ved modifikasjon av glykosyleringsmønstrene av et polypeptid under dets syntese og bearbeidelse, eller i ytterligere bearbeidelsestrinn. Se f.eks. Elbein (1987), Ann. Rev. Biochem., 56:497-534. Også omfattet er versjoner av peptidene med den samme primære aminosyresekvens som har andre mindre modifikasjoner, inkludert fosforylerte aminosyrerester, f.eks. fosfotyrosin, fosfoserin eller fosfotreonin.

Fusjonspolypeptider mellom IL-B30 og andre homologe eller heterologe proteiner tilveiebringes også. Mange cytokin-reseptorer eller andre overflateproteiner er multimere, f.eks. homodimere entiteter, og en gjentakelseskonstruksjon kan ha forskjellige fordeler, inkludert redusert mottakelighet for proteolytisk spalting. Typiske eksempler er fusjoner av et rapportørpolypeptid, f.eks. luciferase, med et segment eller domene av et protein, f.eks. et reseptorbindingssegment, slik at tilstedeværelsen eller beliggenheten av den fusjonerte ligand lett kan bestemmes. Se f.eks. Dull et al., US-patent nr. 4 859 609. Andre genfusjonspartnere inkluderer bakteriell (5-galaktosidase, trpE, protein A, (3-laktamase, alfa-amylase, alkoholdehydrogenase, gjær-alfa-paringsfaktor og deteksjons-eller rensingsmarkører, slik som en FLAG-sekvens av His6-sekvens. Se f.eks. Godowski et al. (1988), Science, 241:812-816.

Fusjonspeptider vil typisk fremstilles ved hjelp av enten rekombinante nukleinsyremetoder eller syntetiske poly-peptidmetoder. Teknikker for nukleinsyremanipulering og ekspresjon er generelt beskrevet av f.eks. Sambrook et al.

(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; og Ausubel et al. (red., 1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY. Teknikker for syntese av polypeptider er f.eks. beskrevet av Merrifield (1986), Science, 232:341-347; Atherton et al. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; og Grant (1992), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman, NY. Refoldingsmetoder kan anvendes på syntetiske proteiner.

Det beskrives også anvendelse av andre derivater av IL-B30-proteiner enn variasjoner i aminosyresekvens eller glykosylering. Slike derivater kan involvere kovalent eller aggregerende assosiasjon med kjemiske komponenter eller proteinbærere. Kovalente eller aggregerende derivater vil være anvendelige som immunogener, som reagenser i immunanalyser eller i rensingsmetoder, slik som for affinitetsrensing av bindingspartnere, f.eks. andre antigener. Et IL-B30 kan immobiliseres ved kovalent binding til et fast støtte-materiale, slik som cyanogenbromidaktivert Sepharose, ved hjelp av metoder som er vel kjent i teknikken, eller adsorberes på polyolefinoverflater, med eller uten glutar-aldehydkryssbinding, for anvendelse ved analyse eller rensing av anti-IL-B30-antistoffer eller en alternativ bindings-sammensetning. IL-B30-proteinene kan også merkes med en påvisbar gruppe, f.eks. for anvendelse i diagnostiske analyser. Rensing av IL-B30 kan utføres ved hjelp av et immobilisert antistoff eller en komplementær bindingspartner, f.eks. en bindingsdel av en reseptor.

Et oppløst IL-B30 eller et fragment kan anvendes som et immunogen for produksjon av antisera eller antistoffer spesifikke for binding. Renset antigen kan anvendes for å screene monoklonale antistoffer eller antigenbindingsfragmenter, omfattende antigenbindingsfragmenter av naturlige antistoffer, f.eks. Fab, Fab', F(ab)2 etc. Rensede IL-B30-antigener kan også anvendes som et reagens for å påvise antistoffer dannet som respons mot tilstedeværelsen av forhøyede nivåer av cytokinet, som kan være diagnostiske for en unormal eller spesifikk fysiologisk eller sykdomstilstand. Det beskrives antistoffer dannet mot aminosyresekvenser kodet for av nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 1 eller fragmenter av protein inneholdende denne. Nærmere bestemt omfatter oppfinnelsen antistoffer med bindingsaffinitet for, eller dannet mot, spesifikke domener, f.eks. helikser A, B, C eller

D.

Det beskrives isolering av ytterligere nært beslektede artsvarianter. Southern- og Northern-blot-analyse vil vise at lignende genetiske entiteter eksisterer i andre pattedyr. Det er sannsynlig at IL-B30 er alminnelig utbredt i artsvarianter, f.eks. gnagere, lagomorfer, carnivorer, artio-dactyla, perissodactyla og primater.

Det beskrives også midler for å isolere en gruppe av beslektede antigener som både utviser forskjeller og likheter i struktur, ekspresjon og funksjon. Belysning av mange av de fysiologiske effekter av molekylene vil bli sterkt akselerert ved isolering og karakterisering av ytterligere distinkte arter eller polymorfe varianter av disse. Det beskrives spesielt anvendelige prober for identifisering av ytterligere homologe genetiske entiteter i forskjellige arter.

De isolerte gener vil tillate transformasjon av celler som mangler ekspresjon av et IL-B30, f.eks. enten artstyper eller celler som mangler tilsvarende proteiner og oppviser negativ bakgrunnsaktivitet. Dette burde tillate analyse av funksjonen av IL-B30 som sammenligning med utransformerte kontrollceller.

Disseksjon av kritiske strukturelle elementer som be-virker de forskjellige fysiologiske funksjoner formidlet gjennom disse antigener, er mulig ved anvendelse av standard-teknikker i moderne molekylærbiologi, spesielt for sammenligning av medlemmer av den beslektede klasse. Se f.eks. homolog-skanningsmutageneseteknikken beskrevet av Cunningham, et al. (1989), Science, 243:1330-1336; og metoder anvendt av 0'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 26"3:15985-15992; og Lechleiter et al. (1990), EMBO J., 9:4381-4390.

Intracellulære funksjoner vil antakeligvis involvere reseptorsignalisering. Proteininternalisering kan imidlertid forekomme under visse omstendigheter, og interaksjon mellom intracellulære komponenter og cytokin kan forekomme. Spesifikke segmenter for interaksjon av IL-B30 med reagerende komponenter kan identifiseres ved mutagenese eller direkte biokjemiske metoder, f.eks. kryssbindings- eller affinitetsmetoder. Strukturanalyse ved hjelp av krystallografiske eller andre fysiske metoder vil også være anvendelig. Ytterligere undersøkelse av mekanismen for signaltransduksjon vil inkludere undersøkelse av assosierte komponenter som kan isoleres ved affinitetsmetoder eller ved hjelp av genetiske metoder, f.eks. komplementeringsanalyse av mutanter.

Ytterligere undersøkelser av ekspresjon og kontroll av IL-B30 vil fortsettes. Kontrolleringselementene assosiert med antigenene bør oppvise forskjellige fysiologiske, utvik-lingsmessige, vevsspesifikke eller andre ekspresjonsmønstre. Oppstrøms eller nedstrøms genetiske områder, f.eks. kontroll-elementer, er av interesse.

Strukturundersøkelser av IL-B30-antigenene vil føre til utforming av nye antigener, spesielt analoger som oppviser agonist- eller antagonistegenskaper på molekylet. Dette kan kombineres med tidligere beskrevne screeningsmetoder for å isolere antigener som oppviser ønskede aktivitetsspektra.

V. Antistoffer

Antistoffer kan dannes mot forskjellige epitoper av IL-B30-proteinene, inkludert arter, polymorfe eller allele varianter og fragmenter av disse, både i deres naturlig forekommende former og i deres rekombinante former. Antistoffer kan dessuten dannes mot IL-B30, enten i deres aktive former eller i deres inaktive former, inkludert native eller denatu-rerte versjoner. Antiidiotypiske antistoffer er også inkludert .

Antistoffer, inkludert bindingsfragmenter og enkelt-kjedeversjoner, mot forhåndsbestemte fragmenter av antigenene, kan dannes ved immunisering av dyr med konjugater av fragmen-tene med immunogene proteiner. Monoklonale antistoffer fremstilles fra celler som utskiller det ønskede antistoff. Disse antistoffer kan screenes for binding til normale eller defekte IL-B30, eller screenes for agonistisk eller antagonistisk aktivitet, f.eks. formidlet gjennom en reseptor. Antistoffer kan være agonistiske eller antagonistiske, f.eks. ved sterisk blokkeringsbinding til en reseptor. Disse monoklonale antistoffer vil vanligvis bindes med en KD på minst 1 mM, mer vanlig minst ca. 300 uM, typisk minst ca. 100 uM, mer typisk minst ca. 30 uM, fortrinnsvis minst ca. 10 uM, og mer foretrukket minst ca. 3 uM eller bedre.

Antistoffene som beskrevet heri kan også være anvendelige i diagnostikken. Som innfangelses- eller ikke-nøytraliserende antistoffer kan de screenes for evnen til å bindes til antigenene uten å inhibere binding til en reseptor. Som nøytraliserende antistoffer kan de være nyttige ved kompetitive bindingsanalyser. De vil også være nyttige for påvisning eller kvantifisering av IL-B30-protein eller dets reseptor. Se f.eks. Chan (red., 1987), Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price og Newman (red., 1991), Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; og Ngo (red., 1988), Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY. Kryssabsorpsjonstester eller andre tester vil identifisere antistoffer som oppviser forskjellige spektre av spesifisiteter, f.eks. unike eller delte artsspesifisiteter.

Antistoffene, inkludert antigenbindingsfragmenter, ifølge oppfinnelsen kan dessuten være potente antagonister som bindes til antigenet og inhiberer funksjonell binding, f.eks. til en reseptor som kan utløse en biologisk respons. De kan også være anvendelige som ikke-nøytraliserende antistoffer og kan koples til toksiner eller radionuklider, slik at når antistoffet bindes til antigen, blir en celle som uttrykker dette, f.eks. på overflaten, drept. Disse antistoffer kan dessuten konjugeres til legemidler eller andre terapeutiske midler, enten direkte eller indirekte, ved hjelp av en linker, og kan bevirke målretting av legemidler.

Antigenfragmenter kan bindes til andre materialer, spesielt polypeptider, i form av fusjonerte eller kovalent bundne polypeptider for anvendelse som immunogener. Et antigen og dets fragmenter kan være fusjonert eller kovalent bundet til forskjellige immunogener, slik som keyhole limpet-hemo-cyanin, bovint serumalbumin, tetanustoksoid etc. Se Micro-biology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962), Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams et al. (1967), Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, New York; og Harlow og Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY, for beskrivelser av metoder for fremstilling av polyklonale antisera.

I noen tilfeller er det ønskelig å fremstille monoklonale antistoffer fra forskjellige pattedyrverter, slik som mus, gnagere, primater, mennesker etc. Beskrivelse av teknikker for fremstilling av slike monoklonale antistoffer kan f.eks. finnes i Stites et al. (red.), Basic and Clinical Immunology (4. utg.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, og referanser anført deri; Harlow og Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986), Mono-clonal Antibodies: Principles and Practice (2. utg.), Academic Press, New York, NY; og spesielt i Kohler og Milstein (1975), Nature, 256": 497, som diskuterer én metode for dannelse av monoklonale antistoffer.

Andre egnede teknikker involverer in vitro-ekspo-nering av lymfocytter for de antigene polypeptider, eller alternativt for seleksjon av biblioteker av antistoffer i fag-vektorer eller lignende vektorer. Se Huse et al. (1989), "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immuno-globulin Repertoire in Phage Lambda", Science, 246:1275-1281; and Ward et al. (1989), Nature, 342:544-546. Polypeptidene og antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes med eller uten modifikasjon, inkludert kimære eller humaniserte antistoffer. Ofte vil polypeptidene og antistoffene være merket ved binding, enten kovalent eller ikke-kovalent, av et stoff som tilveiebringer et påvisbart signal. Mange forskjellige markører og konjugasjonsteknikker er kjent og er omfattende rapportert i både den vitenskapelige litteratur og patent-litteraturen. Egnede markører inkluderer radionuklider, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescerende komponenter, kjemiluminescerende komponenter, magnetiske partikler og lignende. Patenter som beskriver anvendelse av slike markører, inkluderer US-Patenter nr. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 og 4 366 241. Rekombinante immunglobuliner kan også produseres. Se Cabilly, US-patent nr. 4 816 567; Moore et al., US-patent nr. 4 642 334; og Queen et al. (1989), Proe. Nat<1>1 Acad. Sei. USA, 86:10029-1003.

Antistoffene ifølge oppfinnelse kan også anvendes for affinitetskromatografi ved isolering av proteinet. Kolonner kan prepareres hvor antistoffene er bundet til et fast støtte-materiale. Se f.eks. Wilchek et al. (1984), Meth. Enzymol., 104:3-55.

Antistoffer dannet mot hvert IL-B30 vil også være anvendelige for å danne antiidiotypiske antistoffer. Disse vil være nyttige ved påvisning eller diagnostisering av forskjellige immunologiske tilstander relatert til ekspresjon av de respektive antigener.

VI. Nukleinsyrer

De beskrevne peptidsekvenser og de relaterte reagenser er anvendelige for påvisning, isolering eller identifisering av en DNA-klon som koder for IL-B30, f.eks. fra en naturlig kilde. Den vil typisk være anvendelig for isolering av et gen fra pattedyr, og lignende prosedyrer vil anvendes for å isolere gener fra andre arter, f.eks. varmblodige dyr som fugler og pattedyr. Krysshybridisering vil tillate isolering av IL-B30 fra de samme, f.eks. polymorfe varianter eller andre arter. Et antall forskjellige metoder vil være tilgjengelige for vellykket å isolere en egnet nukleinsyreklon.

Det rensede protein eller definerte peptider er anvendelige for å danne antistoffer ved hjelp av standardmetoder, som beskrevet ovenfor. Syntetiske peptider eller renset protein kan presenteres for et immunsystem for å danne monoklonale eller polyklonale antistoffer. Se f.eks. Coligan

(1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; og Harlow og Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Det spesifikke bindingspreparat kan f.eks. anvendes for screening av et ekspresjonsbibliotek dannet fra en cellelinje som uttrykker et IL-B30. Screening av intracellulær ekspresjon kan utføres ved hjelp av forskjellige fargings-prosedyrer eller immunfluorescensprosedyrer. Bindingsprepa-rater kan anvendes for å affinitetsrense eller utsortere celler som uttrykker et overflatefusjonsprotein. Peptidsegmentene kan også anvendes for å forutsi egnede oligonukleotider for å screene et bibliotek. Den genetiske kode kan anvendes for å utvelge passende oligonukleotider anvendelige som prober for screening. Se f.eks. SEQ ID NO: 1. I kombinasjon med polymerasekjedereaksjons-(PCR)teknikker vil syntetiske oligonukleotider være anvendelige for utvelgelse av korrekte kloner fra et bibliotek. Komplementære sekvenser vil også anvendes som prober, primere eller antisensetråder. Forskjellige fragmenter kan være spesielt anvendelige, f.eks. koplet med forankret vektor-eller poly-A-komplementære PCR-teknikker eller med komplementært DNA for andre peptider. Det beskrives anvendelse av isolert DNA eller fragmenter for å kode for et biologisk aktivt, tilsvarende IL-B30-polypeptid, spesielt et som mangler delen som koder for den utranslaterte 5'-del av den beskrevne sekvens. Oppfinnelsen dekker dessuten isolert eller rekombinant DNA som koder for et biologisk aktivt protein eller polypeptid, og som er i stand til å hybridisere under passende betingelser med DNA-sekvensene beskrevet heri. Det biologisk aktive protein eller polypeptid kan være et intakt antigen eller et fragment, og har en aminosyresekvens beskrevet i f.eks. SEQ ID NO: 2, spesielt et modent, utskilt polypeptid. Oppfinnelsen dekker dessuten anvendelse av isolert eller rekombinant DNA, eller fragmenter av dette, som koder for proteiner som oppviser høy identitet med et utskilt IL-B30. Det isolerte DNA kan ha de respektive regulatoriske sekvenser i 5'- og 3'-flankene, f.eks. promotorer, enhancere, poly-A-addisjonssignaler og andre. Alternativt kan ekspresjon bevirkes ved operabel binding av et kodingssegment til en heterolog promotor, f.eks. ved innføyelse av en promotor oppstrøms fra et endogent gen. En "isolert" nukleinsyre er en nukleinsyre, f.eks. RNA, DNA eller en blandet polymer, som er hovedsakelig sepa-rert fra andre komponenter som naturlig medfølger en nativ sekvens, f.eks. ribosomer, polymeraser og/eller flankerende genomiske sekvenser fra den opprinnelige art. Betegnelsen omfatter en nukleinsyresekvens som er blitt fjernet fra sitt naturlig forekommende miljø, og inkluderer rekombinante eller klonede DNA-isolater og kjemisk syntetiserte analoger eller analoger syntetisert biologisk av heterologe systemer. Et vesentlig rent molekyl inkluderer isolerte former av molekylet. Vanligvis vil nukleinsyren befinne seg i en vektor eller et fragment mindre enn ca. 50 kb, vanligvis mindre enn ca. 30 kb, typisk mindre enn ca. 10 kb, og fortrinnsvis mindre enn ca. 6 kb. En isolert nukleinsyre vil generelt være en homogen sammensetning av molekyler, men vil i noen utførelsesformer inneholde en mindre andel heterogene deler. Denne heterogeni-tet finnes typisk ved polymerendene eller deler som ikke er kritiske for en ønsket biologisk funksjon eller aktivitet. En "rekombinant" nukleinsyre er enten definert ved dens produksjonsmetode eller dens struktur. Som referanse til dens produksjonsmetode, f.eks. et produkt fremstilt ved en prosess, er prosessen anvendelse av rekombinante nukleinsyre-teknikker og involverer f.eks. human intervensjon i nukleotidsekvensen, typisk seleksjon eller produksjon. Alternativt kan den være en nukleinsyre fremstilt ved dannelse av en sekvens som omfatter fusjon av to fragmenter som ikke naturlig er til-grensende hverandre, men er ment å ekskludere naturlige produkter, f.eks. naturlig forekommende mutanter. Produkter dannet ved transformasjon av celler med enhver ikke-naturlig forekommende vektor, er således f.eks. inkludert, og også nukleinsyrer som omfatter sekvenser avledet ved anvendelse av enhver syntetisk oligonukleotidprosess. En slik utføres ofte for å erstatte et kodon med et overflødig kodon som koder for den samme eller en konservativ aminosyre, mens det typisk introduseres eller fjernes et sekvensgjenkjennelsessete. Alternativt utføres prosessen for å binde sammen nukleinsyresegmenter med ønskede funksjoner for å danne en enkelt genetisk entitet som omfatter en ønsket kombinasjon av funksjoner som ikke finnes i de vanlig tilgjengelige, naturlige former. Restriksjonsenzymgjenkjennelsesseter er ofte målet for slike syntetiske manipulasjoner, men andre sete-spesifikke mål, f.eks. promotorer, DNA-replikasjonsseter, regulasjonssekvenser, kontrollsekvenser eller andre anvendelige trekk, kan inkorporeres ved utformingen. Et lignende konsept er ment for et rekombinant, f.eks. fusjons-, polypeptid. Spesielt inkludert er syntetiske nukleinsyrer som ved hjelp av overflødigheten av den genetiske kode koder for polypeptider som er lignende fragmenter av disse antigener, og fusjoner av sekvenser fra diverse forskjellige arter eller polymorfe varianter. Et signifikant "fragment" i en nukleinsyresammenheng er et sammenhengende segment på minst ca. 17 nukleotider, generelt minst ca. 22 nukleotider, vanligvis minst ca. 29 nukleotider, mer ofte minst ca. 35 nukleotider, typisk minst ca. 41 nukleotider, som regel minst ca. 55 nukleotider, og i spesielt foretrukne utførelsesformer minst ca. 60 eller flere nukleotider, f.eks. 67, 73, 81, 89, 95 etc. Et DNA som koder for et IL-B30-protein, vil være spesielt anvendelig for å identifisere gener, mRNA og cDNA som koder for beslektede eller lignende proteiner, så vel som DNA som koder for homologe proteiner fra forskjellige arter. Det vil være homologer i andre arter, inkludert primater, gnagere, hundedyr, kattedyr og fugler. Forskjellige IL-B30-proteiner bør være homologe og er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Selv proteiner som har et mer fjernt evolusjonsmessig slektskap med antigenet, kan imidlertid lett isoleres under passende betingelser ved anvendelse av disse sekvenser dersom de er tilstrekkelig homologe. Primat-IL-B30-proteiner er av spesiell interesse. Rekombinante kloner avledet fra de genomiske sekvenser, f.eks. inneholdende introner, vil være anvendelige for transgene undersøkelser, inkludert f.eks. transgene celler og organismer, og for genterapi. Se f.eks. Goodnow (1992), "Transgenic Animals", i Roitt (red.), Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, s. 1502-1504; Travis (1992), Science, 256": 1392-1394; Kunn et al. (1991), Science, 254:707-710; Capecchi (1989), Science, 244:1288; Robertson (1987)

(red.), Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; og Rosenberg (1992), J. Clinical Oncology, 10:180-199.

Vesentlig homologi, f.eks. identitet, i forbindelse med nukleinsyresekvenssammenligning betyr enten at segmentene eller deres komplementære tråder, når de sammenlignes, er identiske når de linjeoppstilles optimalt med passende nukleo-tidinnføyelser eller -delesjoner i minst ca. 50 % av nukleo-tidene, generelt minst ca. 58 %, vanligvis minst ca. 65 %, ofte minst ca. 71 %, typisk minst ca. 77 %, oftest minst ca. 85 %, fortrinnsvis minst ca. 95-98 % eller mer, og i spesielle utførelsesformer så høyt som ca. 99 % eller mer av nukleo-tidene. Alternativt eksisterer vesentlig homologi når segmentene vil hybridisere under selektive hybridiseringsbetingelser til en tråd eller dens komplement, typisk ved anvendelse av en sekvens av IL-B30, f.eks. i SEQ ID NO: 1. Selektiv hybridisering vil typisk forekomme når det er minst ca. 55 % identitet over en strekning på minst ca. 30 nukleotider, fortrinnsvis minst ca. 75 % over en strekning på ca. 25 nukleotider, og mest foretrukket minst ca. 90 % over ca. 20 nukleotider. Se Kanehisa (1984), Nuc. Acids Res., 12:203-213. Lengden for identitetssammenligning, som beskrevet, kan være over lengre strekninger og vil i visse utførelsesformer være over en strekning på minst ca. 17 nukleotider, vanligvis minst ca. 28 nukleotider, typisk minst ca. 40 nukleotider, og fortrinnsvis minst ca. 75-100 nukleotider eller flere.

Stringente betingelser, med referanse til homologi i en hybridiseringssammenheng, vil være stringent kombinerte betingelser for salt, temperatur, organiske løsningsmidler og andre parametere, typisk de som kontrolleres i hybridiserings-reaksjoner. Stringente temperaturbetingelser vil vanligvis inkludere temperaturer over ca. 30 °C, vanligvis over ca. 37 °C, typisk over ca. 55 °C, fortrinnsvis over ca. 70 °C. Stringente saltbetingelser vil vanligvis være mindre enn ca. 1000 mM, ofte mindre enn ca. 400 mM, typisk mindre enn ca.

250 mM, fortrinnsvis mindre enn ca. 150 mM, inkludert ca. 100, 50 eller 20 mM. Kombinasjonen av parametere er imidlertid mye viktig enn målingen av enhver enkel parameter. Se f.eks. Wetmur og Davidson (1968), J. Mol. Biol., 31:349-370. Hybridisering under stringente betingelser bør gi en bakgrunn på minst 2 ganger over bakgrunnen, fortrinnsvis minst 3-5 ganger eller mer.

For sekvenssammenligning virker typisk én sekvens som en referansesekvens som testsekvenser sammenlignes med. Ved anvendelse av en sekvenssammenligningsalgoritme er test- og referansesekvenser inn-data i en computer, subsekvenskoordi-nater utformes hvis nødvendig, og sekvensalgoritmeprogram-parametere utformes. Sekvenssammenligningsalgoritmen beregner deretter prosent sekvensidentitet for testsekvensen(e) i forhold til referansesekvensen, basert på de utformede program-parametere.

Optisk linjeoppstilling av sekvenser for sammenligning kan f.eks. utføres ved hjelp av den lokale homologi-algoritmen ifølge Smith og Waterman (1981), Adv. Appl. Math., 2:482, ved hjelp av homologilinjeoppstillingsalgoritmen ifølge Needleman og Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48:443, ved hjelp av søk for likhetsmetoden ifølge Pearson og Lipman (1988), Proe. Nat'l Acad. Sei. USA., 85:2444, ved hjelp av datoriserte gjennomføringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i the Wisconsin Genetics Software-sett, Genetics Computer Group, 575, Science Dr., Madison, WI) eller ved visuell inspeksjon (se generelt Ausubel et al., supra).

Ett eksempel på en anvendelig algoritme er PILEUP. PILEUP danner en multippel sekvenslinjeoppstilling fra en gruppe av beslektede sekvenser ved anvendelse av progressive, parvise linjeoppstillinger for å vise slektskap og prosent sekvensidentitet. Den plotter også et tre eller et dendrogram som viser grupperingsforholdene anvendt for å danne linjeoppstillingen. PILEUP benytter en forenkling av den progressive linjeoppstillingsmetoden ifølge Feng og Doolittle (1987), J. Mol. Evol., 35:351-360. Den anvendte metode er lignende metoden beskrevet av Higgins og Sharp (1989), CABIOS, 5:151-153. Programmet kan linjeoppstille opptil 300 sekvenser, hver med en maksimal lengde på 5000 nukleotider eller aminosyrer. Den multiple linjeoppstillingsprosedyre begynner med den parvise linjeoppstilling av de to mest lignende sekvenser, som gir en gruppe på to linjeoppstilte sekvenser. Denne gruppe linjeoppstilles deretter med den nest mest beslektede sekvens eller gruppe av linjeoppstilte sekvenser. To grupper av sekvenser linjeoppstilles ved en enkel forlengelse av den parvise linjeoppstilling av to individuelle sekvenser. Den endelige linjeoppstilling oppnås ved en serie progressive, parvise linjeoppstillinger. Programmet kjøres ved å utpeke spesifikke sekvenser og deres aminosyre- eller nukleotid-koordinater for områder for sekvenssammenligning, og ved angivelse av programparameterne. En referansesekvens kan f.eks. sammenlignes med andre testsekvenser for å bestemme prosent sekvensidentitetsforhold ved anvendelse de følgende parametere: "default gap weight" (3,00) "default gap length weight" (0,10) og "wieighted end gaps".

Et annet eksempel på en algoritme som er egnet for bestemmelse av prosent sekvensidentitet og sekvenslikhet, er BLAST-algoritmen, som er beskrevet av Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410. Programvare for utførelse av BLAST-analyser er offentlig tilgjengelig gjennom the National Center for Biotechnology Information

(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Denne algoritmen involverer først identifisering av høytskårende sekvenspar (HSP) ved identifisering av korte ord med lengde W i den søkte sekvens, som enten tilsvarer eller tilfredsstiller en positivt vurdert terskelverdi T når den linjeoppstilles med et ord med den samme lengde i en databasesekvens. T er referert til som naboord-poengtallterskelen (neighborhood word score threshold)

(Altschul et al., supra). Disse innledende naboord-"treff" virker som spirer for å initiere søk for å finne lengre HSP inneholdende disse. Ordtreffene utvides deretter i begge retninger langs hver sekvens så langt som det kumulative

linjeoppstillingstall kan økes. Utvidelse av ordtreffene i hver retning stopper når: det kumulative linjeoppstillings-poengtall minker med mengden X fra dets maksimalt oppnådde verdi; det kumulative poengtall når null eller lavere, på grunn av akkumuleringen av én eller flere negativt skårende restlinjeoppstillinger; eller enden av hver sekvens nås. BLAST-algoritmeparameterne W, T og X bestemmer sensitiviteten og hastigheten av linjeoppstillingen. BLAST-programmet anvender som normalverdier en ordlengde (W) på 11, BLOSUM62-skåringsmatrikslinjeoppstillinger (B) (se Henikoff og Henikoff

(1989), Proe. Nat'1 Acad. Sei. USA, 89:10915) på 50, forvent-ning (E) på 10, M = 5, N = 4, og en sammenligning av begge tråder. I tillegg til å beregne prosent sekvensidentitet ut-fører BLAST-algoritmen også en statistisk analyse av likheten mellom to sekvenser (se f.eks. Karlin og Altschul (1993), Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 90:5873-5787). Én måling for likhet tilveiebrakt ved BLAST-algoritmen er den minste sum-sannsynlighet (P(N)), som gir en indikasjon på sannsynligheten for at to nukleotidsekvenser eller aminosyresekvenser er like ville forekomme tilfeldig. En nukleinsyre betraktes f.eks. som lik en referansesekvens dersom den minste sum-sannsynlighet ved en sammenligning av testnukleinsyren med referansenuklein-syren er mindre enn ca. 0,1, mer foretrukket mindre enn ca. 0,01, og mest foretrukket mindre enn ca. 0,001. En ytterligere indikasjon på at to nukleinsyresekvenser av polypeptider er vesentlig identiske, er at polypeptidet kodet for av den første nukleinsyre er immunologisk kryss-reaktiv med polypeptidet kodet for av den andre nukleinsyre, som beskrevet nedenfor. Et polypeptid er således typisk vesentlig identisk med et andre polypeptid f.eks. når de to peptider kun atskiller seg ved konservative substitusjoner. En annen indikasjon på at to nukleinsyresekvenser er vesentlig identiske, er at de to molekyler hybridiserer med hverandre under stringente betingelser, som beskrevet nedenfor. IL-B30 fra andre pattedyrarter kan klones og isoleres ved hjelp av kryssartshybridisering av nært beslektede arter. Homologi kan være relativt lav mellom fjernt beslektede arter, og hybridisering av relativt nært beslektede arter er således tilrådelig. Alternativt kan fremstilling av et antistoff-preparat som oppviser mindre artsspesifisitet være anvendelig ved ekspresjonskloningsmetoder.

VII. Fremstilling av IL- B30; etterligninger

DNA som koder for IL-B30 eller fragmenter av dette, kan oppnås ved hjelp av kjemisk syntese, screening av cDNA-biblioteker eller screening av genomiske biblioteker preparert fra mange forskjellige cellelinjer eller vevsprøver. Se f.eks. Okayama og Berg (1982), Mol. Cell. Biol., 2:161-170; Gubler og Hoffman (1983), Gene, 25:263-269; og Glover (red., 1984), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternativt gir sekvensene beskrevet heri anvendelige PCR-primere eller tillater syntetisk eller annen fremstilling av egnede gener som koder for et IL-B30, inkludert naturlig forekommende utførelsesformer.

Dette DNA kan uttrykkes i mange forskjellige vertsceller for syntese av et fullengdet IL-B30 eller fragmenter, som i sin tur f.eks. kan anvendes for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer; for bindingsundersøkelser; for konstruksjon og ekspresjon av modifiserte molekyler; og for struktur-/funksjonsstudier.

Vektorer, som anvendt heri, omfatter plasmider, virus, bakteriofager, integrerbare DNA-fragmenter og andre vehikler som muliggjør integrering av DNA-fragmenter i vertens genom. Se f.eks. Pouwels et al. (1985 og supplementer), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; og Rodriguez et al. (1988) (red.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

For oppfinnelsens formål er DNA-sekvenser operabelt bundet når de er funksjonelt beslektet med hverandre. DNA for en presekvens eller sekretorisk leder er f.eks. operabelt bundet til et polypeptid hvis det blir uttrykt som et pre-protein eller deltar i dirigering av polypeptidet til celle-membranen, eller i sekresjon av polypeptidet. En promotor er operabelt bundet til en kodingssekvens hvis den kontrollerer transkripsjon av polypeptidet; et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodingssekvens hvis det er posisjonert til å tillate translasjon. Vanligvis betyr operabelt bundet sammenhengende og i leseramme, men visse genetiske elementer, slik som repressorgener, er imidlertid ikke bundet sammen sammenhengende, men bindes allikevel til operatorsekvenser som i sin tur kontrollerer ekspresjon. Se f.eks. Rodrigues et al., kapittel 10, s. 205-236; Balbas og Bolivar (1990), Methods in Enzymology, 185:14-37; og Ausubel et al. (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY.

Representative eksempler på egnede ekspresjons-vektorer inkluderer pCDNAl; pCD, se Okayama et al. (1985), Mol. Cell Biol., 5:1136-1142; pMClneo-poly-A, se Thomas et al.

(1987), Cell, 51:503-512, og en baculovirusvektor, slik som pAC373 eller pAC610. Se f.eks. Miller (1988), Ann. Rev. Microbiol., 42:177-199.

Det vil ofte være ønsket å uttrykke IL-B30-polypeptid i et system som tilveiebringer et spesifikt eller definert glykosyleringsmønster. Se f.eks. Luckow og Summers (1988), Bio/Technology, 6:47-55; og Kaufman (1990), Meth. Enzymol., 185:487-511. IL-B30, eller et fragment av dette, kan konstrueres til en fosfatidylinositol (PI) bundet til en cellemembran, men kan fjernes fra membranene ved behandling med et fosfatidyl-inositolspaltingsenzym, f.eks. fosfatidylinositolfosfolipase-C. Dette frigjør antigenet i en biologisk aktiv form og tillater rensing ved hjelp av standardprosedyrer for protein-kjemi. Se f.eks. Low (1989), Biochem. BioPhys. Acta, 988:427-454; Tse et al. (1985), Science, 230:1003-1008; Brunner et al.

(1991), J. Cell Biol., 114:1275-1283.

Nå som IL-B30 er blitt karakterisert, kan fragmenter eller derivater av dette fremstilles ved hjelp av konvensjonelle prosesser for syntetisering av peptider. Disse inkluderer slike prosesser som er beskrevet av Stewart og Young

(1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky og Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky

(1984), The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; og Villafranca (red., 1991), Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, CA.

VIII. Anvendelser

Det tilveiebringes reagenser som vil finne anvendelse i diagnostikken, som beskrevet annet sted heri, f.eks. ved IL-B30-formidlede tilstander, eller nedenfor under beskrivelsen av sett for diagnose. Genet kan være anvendelig i retts-vitenskapen, f.eks. for å skjelne gnagere fra mennesker, eller som en markør for å skjelne mellom forskjellige celler som oppviser forskjellige ekspresjons- eller modifikasjonsmønstre.

Det tilveiebringes også reagenser med betydelig kommersiell og/eller terapeutisk potensial. IL-B30 (naturlig forekommende eller rekombinant), fragmenter av dette og antistoffer mot dette, sammen med forbindelser identifisert som å ha bindingsaffinitet for IL-B30, bør være anvendelige som reagenser for undervisning i teknikker for molekylærbiologi, immunologi eller fysiologi. Passende sett kan prepareres med reagensene, f.eks. i praktiske laboratorieøvelser, i produksjon eller ved anvendelse av proteiner, antistoffer, kloningsmetoder, histologi etc.

Reagensene vil også være anvendelige ved behandling av tilstander forbundet med unormal fysiologi eller utvikling, inkludert inflammatoriske tilstander. De kan være anvendelige ved in vitro-tester for tilstedeværelse eller fravær av inter-aktive komponenter som kan samsvare med vellykkethet av spesielle behandlingsstrategier. Spesielt vil modulering av fysiologi av forskjellige celler, f.eks. hematopoetiske eller lymfoide celler, oppnås ved hjelp av egnede metoder for behandling ved anvendelse av preparatene tilveiebrakt heri. Se f.eks. Thomson (1994; red.), The Cytokine Handbook (2. utg.), Academic Press, San Diego; Metcalf og Nicola (1995), The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; og Aggarwal og Gutterman (1991), Human Cytokines, Blackwell Pub.

En sykdom eller en forstyrrelse assosiert med unormal ekspresjon eller unormal signalisering fra et IL-B30 burde f.eks. være et sannsynlig mål for en agonist eller antagonist. Det nye cytokin burde spille en rolle ved regulering eller utvikling av hematopoetiske celler, f.eks. lymfoidceller, som påvirker immunologiske responser, f.eks. inflammasjon og/eller autoimmunforstyrrelser. Alternativt kan det påvirke vaskulær fysiologi eller utvikling eller neuronale effekter.

Cytokinet burde spesielt formidle, i forskjellige sammenhenger, cytokinsyntese av cellene, proliferasjon etc. Antagonister av IL-B30, slik som muteinvarianter av en naturlig forekommende form av IL-B30, eller blokkerende antistoffer, kan tilveiebringe en selektiv og kraftig måte for å blokkere immunresponser, f.eks. ved situasjoner som inflammatoriske eller autoimmunresponser. Se også Samter et al.

(red.), Immunological Diseases, vol. 1 og 2, Little, Brown and Co.

Visse kombinasjonspreparater ville dessuten også være anvendelige, f.eks. med andre modulatorer av inflammasjon. Slike andre molekyler kan inkludere steroider, andre versjoner av IL-6 og/eller G-CSF, inkludert artsvarianter eller virus-homologer og deres respektive antagonister.

Forskjellige unormale tilstander er kjent i hver av celletypene vist å produsere IL-B30-mRNA ved hjelp av Northern blot-analyse. Se Berkow (red.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; Thorn et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; og Weatherall et al. (red.), Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Mange andre medisinske tilstander og sykdommer involverer aktivering av makrofager eller monocytter, og mange av disse vil reagere på behandling med en agonist eller antagonist tilveiebrakt heri. Se f.eks. Stites og Terr (red., 1991), Basic and Clinical Immunology, Appleton og Lange, Norwalk, Connecticut; og Samter et al. (red.), Immunological Diseases, Little, Brown and Co. Disse problemer burde være mottakelige for forebyggelse eller behandling ved anvendelse av preparater tilveiebrakt heri. Lokaliseringen i pankreatiske langerhanske celleøyer antyder en mulig relevans til diabetes. IL-B30, antagonister, antistoffer etc. kan renses og deretter administreres til en pasient, enten det er et dyr eller et menneske. Disse reagenser kan kombineres for terapeutisk anvendelse med ytterligere aktive eller inerte ingredienser, f.eks. i konvensjonelle, farmasøytisk akseptable bærere eller fortynningsmidler, f.eks. immunogene adjuvanser, sammen med fysiologisk uskadelige stabilisatorer, eksipienser eller konserveringsmidler. Disse kombinasjoner kan steril-filtreres og plasseres i doseringsformer, som ved lyofiliser-ing, i doseringsampuller, eller lages i stabiliserte vandige preparater. Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av antistoffer eller bindingsfragmenter av disse, inkludert former som ikke er komplementbinding.

Legemiddelscreening ved anvendelse av IL-B30 eller fragmenter derav kan utføres for å identifisere forbindelser med bindingsaffinitet til IL-B30, eller andre relevante biologiske effekter på IL-B30-funksjoner, inkludert isolering av assosierte komponenter. Etterfølgende biologiske analyser kan deretter benyttes til å bestemme hvorvidt forbindelsen har indre stimulerende aktivitet og derfor er en blokkerer eller antagonist ved at den blokkerer aktiviteten av cytokinet. Likeledes kan en forbindelse med indre stimulerende aktivitet aktivere signalreaksjonsveien og er således en agonist ved at den simulerer aktiviteten av IL-B30. Foreliggende oppfinnelse omfatter dessuten den terapeutiske anvendelse av blokkerings-antistoffer mot IL-B30 som antagonister, og av stimulerende antistoffer som agonister. Denne metoden burde være spesielt anvendelig med andre IL-B30-artsvarianter.

Mengden av reagenser nødvendig for effektiv terapi vil avhenge av mange forskjellige faktorer, inkludert admini-streringsmåter, målsete, pasientens fysiologiske tilstand og andre administrerte medikamenter. Behandlingsdoseringer bør således titreres for å optimalisere sikkerhet og effektivitet. Typisk kan doseringer anvendt in vitro tilveiebringe anvendelig rettledning om mengdene anvendelig for administrering

in situ av disse reagenser. Dyretesting av effektive doser for behandling av spesielle sykdommer vil gi ytterligere forhånds-indikasjon på dosering til mennesker. Forskjellige vurderinger er f.eks. beskrevet av Gilman et al. (red., 1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. utg.,

Pergamon Press; og Remington's Pharmaceutical Sciences,

17. utg. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA. Metoder for administrering er diskutert i disse og nedenfor, f.eks. for oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrering, transdermal diffusjon og andre. Farmasøytisk akseptable bærere vil inkludere vann, fysiologisk saltvann, buffere og andre forbindelser beskrevet f.eks. i Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Doseringsområder vil vanligvis for-ventes å være i konsentrasjonsmengder lavere enn 1 mM, typisk lavere enn ca. 10 uM, ofte lavere enn ca. 100 nM, fortrinnsvis lavere enn ca. 10 pM (pikomolar), og mest foretrukket lavere enn ca. 1 fM (femtomolar), med en passende bærer. Formuleringer med langsom frigivelse, eller en apparatur med langsom frigivelse, vil ofte benyttes for kontinuerlig eller langtids-administrering. Se f.eks. Langer (1990), Science, 249:1527-1533.

IL-B30, fragmenter av dette og antistoffer mot dette eller dets fragmenter, antagonister og agonister kan administreres direkte til verten som skal behandles, eller, avhengig av størrelsen av forbindelsene, det kan være ønskelig å konju-gere dem til bærerproteiner, slik som ovalbumin eller serumalbumin, før administrering. Terapeutiske formuleringer kan administreres i mange konvensjonelle doseformuleringer. Selv om det er mulig at den aktive ingrediens kan administreres alene, er det foretrukket å presentere den som en farmasøytisk formulering. Formuleringer omfatter typisk minst én aktiv ingrediens, som definert ovenfor, sammen med én eller flere akseptable bærere. Hver bærer bør være både farmasøytisk og fysiologisk akseptabel i den betydning at den er kompatibel med de andre ingredienser og ikke skadelig for pasienten. Formuleringer inkluderer dem som er egnet for oral, rektal, nasal, topisk eller parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) administrering. Formu-leringene kan passende presenteres i enhetsdoseform og kan prepareres ved hjelp av enhver metode vel kjent i farmasi-teknikken. Se f.eks. Gilman et al. (red.) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. utg.), Pergamon Press; og Remington's Pharmaceutical Sciences

(17. utg.) (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis et al. (red., 1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman et al. (red., 1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; og Lieberman et al. (red., 1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York. Terapien ifølge fore-

liggende oppfinnelse kan kombineres med eller anvendes i forbindelse med andre midler, f.eks. andre cytokiner, inkludert IL-6 eller G-CSF, eller deres respektive antagonister.

Både naturlig forekommende og rekombinante former av IL-B30 ifølge oppfinnelsen er spesielt anvendelige i sett og analysemetoder som er i stand til å screene forbindelser for bindingsaktivitet til proteinene. Flere metoder for automati-sering av analyser er blitt utviklet i de senere år for å tillate screening av titusener forbindelser på kort tid. Se f.eks. Fodor, et al. (1991), Science, 251:767-773, som beskriver metoder for testing av bindingsaffinitet ved hjelp av mangfoldige definerte polymerer syntetisert på et fast substrat. Utviklingen av egnede analyser kan lettes betydelig ved tilgjengeligheten av store mengder renset, oppløselig IL-B30, tilveiebrakt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse.

Andre metoder kan anvendes for å bestemme de kritiske rester i IL-B30-IL-B30-reseptorinteraksjoner. Mutasjonsanalyse kan utføres, se f.eks. Somoza et al. (1993), J. Exptl. Med., 2 78:549-558, for å bestemme spesifikke rester som er kritiske ved interaksjonen og/eller signaliseringen. PHD (Rost og Sander (1994), Proteins, 19:55-72) og DSC (King og Sternberg

(1996), Protein Sei., 5:2298-2310) kan tilveiebringe forut-sigelser om sekundær struktur av a-heliks (H) , (3-tråd (E)

eller kveil (L). Helikser A og D er mest viktige ved reseptor-interaksjon, og D-heliksen er det mest viktige området. Heliks A vil strekke seg i mennesket fra ca. pro(7) til his(27), mens heliks D vil strekke seg fra ca. trp(135) til gly(162). Overflateeksponerte rester vil påvirke reseptorbinding, mens inn-leirede rester vil påvirke den generelle struktur. Forutsagte rester med spesiell betydning vil sannsynligvis tilsvare arg(146), ser(147), gln(149), ala(150), ala(153), val(154), ala(156), arg(157), ala(160) og his(161).

Antagonister kan f.eks. vanligvis finnes når først antigenet er blitt strukturert definert, f.eks. ved hjelp av data for tertiærstruktur. Testing av potensielle reagerende analoger er nå mulig ved utviklingen av høyautomatiserte analysemetoder ved anvendelse av et renset IL-B30. Nye agonister og antagonister vil spesielt bli oppdaget ved anvendelse av screeningsteknikker beskrevet heri. Av spesiell betydning er forbindelser funnet å ha en kombinert bindingsaffinitet for et spektrum av IL-B30-molekyler, f.eks. forbindelser som kan tjene som antagonister for spesifikke varianter av IL-B30.

Én metode for legemiddelscreening benytter eukaryote eller prokaryote vertsceller som er stabilt transformert med rekombinante DNA-molekyler som uttrykker et IL-B30. Celler kan isoleres som uttrykker et IL-B30 isolert fra andre molekyler. Slike celler, enten levende eller i fiksert form, kan anvendes for standard bindingspartner-bindingsanalyser. Se også Parce et al. (1989), Science, 246": 243-247; og Owicki et al. (1990), Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 87:4007-4011, som beskriver sensi-tive metoder for å påvise cellulære responser.

En annen teknikk for legemiddelscreening involverer en metode som tilveiebringer høy gjennomløpsscreening for forbindelser med egnet bindingsaffinitet til et IL-B30, og er beskrevet i detalj av Geysen, europeisk patentsøknad 84/03564, publisert 13. september 1984. Først syntetiseres et stort antall forskjellige små peptidtestforbindelser på et fast substrat, f.eks. plastikkpinner eller en annen passende over-flate, se Fodor et al. (1991). Alle pinnene reageres deretter med oppløst, urenset eller oppløst, renset IL-B30 og vaskes. Det neste trinn involverer påvisning av bundet IL-B30.

Rasjonell legemiddelutforming kan også være basert på strukturelle undersøkelser av molekylformene av IL-B30 og andre effektorer eller analoger. Effektorer kan være andre proteiner som formidler andre funksjoner som respons på binding, eller andre proteiner som vanligvis reagerer med IL-B30, f.eks. en reseptor. Ett middel for å bestemme hvilke seter som reagerer med spesifikke andre proteiner, er en fysisk strukturbestemmelse, f.eks. røntgenkrystallografi eller todimensjonale NMR-teknikker. Disse vil gi veiledning om hvilke aminosyrerester som danner molekylære kontaktområder, som modellert f.eks. mot andre cytokinreseptormodeller. For en detaljert beskrivelse av proteinstrukturbestemmelse, se f.eks. Blundell og Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, New York.

IX. Sett

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av IL-B30-proteiner, fragmenter derav, peptider og deres fusjons-produkter i forskjellige diagnostiske sett, og metoder for påvisning av tilstedeværelse av et annet IL-B30 eller en bindingspartner. Typisk vil settet inneholde et rom som enten inneholder et definert IL-B30-peptid eller et gensegment eller et reagens som gjenkjenner det ene eller det andre, f.eks. IL-B30-fragmenter eller antistoffer.

Et sett for bestemmelse av bindingsaffiniteten av en testforbindelse til et IL-B30 vil typisk omfatte en testforbindelse; en merket forbindelse, f.eks. en bindingspartner eller et antistoff med kjent bindingsaffinitet for IL-B30; en kilde for IL-B30 (naturlig forekommende eller rekombinant); og et middel for separasjon av bundet fra fri, merket forbindelse, slik som en fast fase for immobilisering av molekylet. Når forbindelsene er screenet, kan de forbindelser som har egnet bindingsaffinitet til antigenet evalueres i passende biologiske analyser vel kjent i teknikken, for å bestemme hvorvidt de virker som agonister eller antagonister mot IL-B30-signali-seringsreaksjonsveien. Tilgjengeligheten av rekombinante IL-B30-polypeptider tilveiebringer også veldefinerte standarder for kalibrering av slike analyser.

Et foretrukket sett for bestemmelse av konsentrasjonen av f.eks. et IL-B30 i en prøve vil typisk omfatte en merket forbindelse, f.eks. bindingspartner eller antistoff, med kjent bindingsaffinitet for antigenet, en kilde for cytokin (naturlig forekommende eller rekombinant) og et middel for separasjon av den bundne fra den frie, merkede forbindelse, f.eks. en fast fase for immobilisering av IL-B30. Rom inneholdende reagenser og instruksjoner vil vanligvis tilveiebringes .

Antistoffer, inkludert antigenbindingsfragmenter, spesifikke for IL-B30 eller fragmenter er anvendelige i diagnostikken for å påvise tilstedeværelse av forhøyede nivåer av IL-B30 og/eller dets fragmenter. Slike diagnostiske analyser kan benytte lysater, levende celler, fikserte celler, immunfluorescens, cellekulturer, kroppsfluider, og kan videre involvere påvisning av antigener relatert til antigenet i serum, eller lignende. Diagnostiske analyser kan være homogene (uten et separasjonstrinn mellom fritt reagens og antigen-bindingspartnerkompleks) eller heterogene (med et separasjonstrinn) . Forskjellige kommersielle analyser eksisterer, slik som radioimmunanalyse (RIA), enzymbundet immunsorbentanalyse (ELISA), enzymimmunanalyse (EIA), enzym-multiplisert immun-analyseteknikk (EMIT), substratmerket fluorescensimmunanalyse (SLFIA) og lignende. Se f.eks. Van Vunakis et al. (1980), Meth. Enzymol., 70:1-525; Harlow og Lane (1980), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; og Coligan et al. (red., 1993) , Current Protocols in Immunology, Greene and Wiley, NY.

Antiidiotypiske antistoffer kan finne lignende anvendelse for å diagnostisere tilstedeværelse av antistoffer mot et IL-B30, fordi en slik tilstedeværelse kan være diagnostisk for forskjellige unormale tilstander. Overproduksjon av IL-B30 kan f.eks. resultere i produksjon av forskjellige immunologiske reaksjoner som kan være diagnostiske for unormale fysiologiske tilstander, spesielt ved proliferative celle-tilstander, slik som cancer, eller unormal aktivering eller differensiering. Det tilgjengelige fordelingsmønster tilveiebringer dessuten informasjon om at cytokinet blir uttrykt i pankreasøyceller, hvilket antyder muligheten for at cytokinet kan være involvert i funksjonen av dette organ, f.eks. i en diabetesrelevant medisinsk tilstand.

Ofte leveres reagensene for diagnostiske analyser i sett for å optimalisere sensitiviteten av analysen. For foreliggende oppfinnelse, avhengig av analysens beskaffenhet, protokollen og markøren, tilveiebringes enten merket eller umerket antistoff eller bindingspartner, eller merket IL-B30. Dette er vanligvis i forbindelse med andre additiver, slik som buffere, stabilisatorer, materialer nødvendig for signal-produksjon, slik som substrater for enzymer og lignende. Settet vil også fortrinnsvis inneholde instruksjoner for riktig bruk og fjerning av innholdet etter bruk. Typisk inneholder settet rom for hvert anvendelig reagens. Reagensene tilveiebringes ønskelig som et tørt, lyofilisert pulver, der reagensene kan rekonstitueres i et vandig medium som gir passende konsentrasjoner av reagenser for utførelse av analysen.

Mange av de ovennevnte bestanddeler av legemiddel-screeningen og de diagnostiske analyser kan benyttes uten modifikasjon eller de kan modifiseres på mange forskjellige måter. Merking kan f.eks. oppnås ved kovalent eller ikke-kovalent binding av en komponent som direkte eller indirekte gir et påvisbart signal. I enhver av disse analyser kan bindingspartneren, testforbindelsen, IL-B30 eller antistoffer mot dette merkes enten direkte eller indirekte. Muligheter for direkte merking inkluderer markørgrupper: radiomarkører, slik som <125>I, enzymer (US-patent nr. 3 645 090), slik som per-oksidase og alkalisk fosfatase, og fluorescerende markører (US-patent nr. 3 940 475), som kan overvåke endringen i fluor-escensintensitet, bølgelengdeskift eller fluorescenspolari-sering. Muligheter for indirekte merking inkluderer biotin-ylering av én bestanddel, etterfulgt av binding til avidin koplet til en av de ovennevnte markørgrupper.

Det finnes også et stort antall metoder for sepa-rering av bundet fra fritt IL-B30, eller alternativt bundet fra fri testforbindelse. IL-B30 kan immobiliseres på forskjellige matrikser, etterfulgt av vasking. Egnede matrikser inkluderer plast, slik som en ELISA-plate, filtre og kuler. Se f.eks. Coligan et al. (red., 1993), Current Protocols in Immunology, vol. 1, kapittel 2, Greene and Wiley, NY. Andre egnede separasjonsteknikker inkluderer, uten begrensning, fluorescein-antistoff-magnetiserbar partikkel-metoden, beskrevet av Rattle et al. (1984), Clin. Chem., 30:1457-1461, og den doble antistoff-magnetisk partikkelseparasjon, som beskrevet i US-patent nr. 4 659 678.

Metoder for binding av proteiner eller deres fragmenter til de forskjellige markører er blitt omfattende rapportert i litteraturen og fordrer ingen detaljert diskusjon her. Mange av teknikkene involverer anvendelse av aktiverte karboksylgrupper, enten ved anvendelse av karbodiimid eller aktive estere for å danne peptidbindinger, dannelse av tio-etere ved reaksjon av en merkaptogruppe med et aktivert halo-gen, slik som kloracetyl, eller et aktivert olefin, slik som maleimid, for binding eller lignende. Fusjonsproteiner vil også finne anvendelse i disse metoder.

Et annet diagnostisk aspekt involverer anvendelse av oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser tatt fra sekvensen til et IL-B30. Disse sekvenser kan anvendes som prober for påvisning av nivåer av IL-B30-budskapet i prøver fra pasienter mistenkt for å ha en unormal tilstand, f.eks. inflammatorisk eller autoimmun. Fordi cytokinet kan være en markør eller formidler for aktivering, kan det være anvendelig for å bestemme antallet aktiverte celler som skal bestemmes, f.eks. når ytterligere terapi kan være nødvendig, f.eks. på en forebyggende måte før effektene blir og utvikler seg til betydningsfulle. Fremstillingen av både RNA- og DNA-nukleotidsekvenser, merkingen av sekvensene og den foretrukne størrelse av sekvensene er blitt omfattende beskrevet og diskutert i litteraturen. Se f.eks. Langer-Safer et al. (1982), Proe. Nat'l. Acad. Sei., 79:4381-4385; Caskey (1987), Science, 236": 962-967; og Wilchek et al. (1988), Anal. Biochem. , 171:1-32.

Diagnostiske sett som også tester for den kvalitative eller kvantitative ekspresjon av andre molekyler er også inkludert. Diagnose eller prognose kan avhenge av kombinasjonen av mange indikasjoner anvendt som markører. Sett kan således teste for kombinasjoner av markører. Se f.eks. Viallet et al. (1989), Progress in Growth Factor Res., 1:89-97. Andre sett kan anvendes for å evaluere andre celleundersett.

X. Isolering av en IL- B30- reseptor

Når en ligand for en spesifikk ligand-reseptor-interaksjon er blitt isolert, eksisterer metoder for å isolere reseptoren. Se Gearing et al. (1989), EMBO J., 8:3667-3676. Metoder for å merke IL-B30-cytokinet uten å forstyrre bindingen til dets reseptor, kan f.eks. bestemmes. En affini-tetsmarkør kan f.eks. fusjoneres til enten amino- eller karboksylterminalen av liganden. En slik markør kan være en FLAG-epitopmarkør eller f.eks. et lg- eller Fc-domene. Et ekspresjonsbibliotek kan screenes for spesifikk binding av cytokinet, f.eks. ved cellesortering, eller annen screening for å påvise subpopulasjoner som uttrykker en slik bindings-komponent. Se f.eks. Ho et al. (1993), Proe. Nat'1 Acad. Sei. USA, 90:11267-11271; og Liu et al. (1994), J. Immunol., 252:1821-29. Alternativt kan en panoreringsmetode benyttes. Se f.eks. Seed og Aruffo (1987), Proe. Nat'1 Acad. Sei. USA, 84:3365-3369.

Proteinkryssbindingsteknikker med markør kan anvendes for å isolere bindingspartnere for IL-B30-cytokinet. Dette vil tillate identifisering av proteiner som spesifikt reagerer med cytokinet, f.eks. på en ligand-reseptorlignende måte.

Tidlige eksperimenter vil utføres for å bestemme hvorvidt de kjente IL-6- eller G-CSF-reseptorkomponenter er involvert i respons(er) på IL-B30. Det er også meget mulig at disse funksjonelle reseptorkomplekser kan dele mange, eller alle, komponenter med et IL-B30-reseptorkompleks, enten en spesifikk reseptorsubenhet eller en delaktig reseptorsubenhet.

Eksempler

I. Generelle metoder

Mange av standardmetodene nedenfor er beskrevet eller referert til i f.eks. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg.), vol. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Asso-ciates, Brooklyn, NY; eller Ausubel et al. (1987, og supplementer) , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley/Greene, NY; Innis et al. (red., 1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY. Metoder for proteinrensing inkluderer slike metoder som ammoniumsulfat-utfelling, kolonnekromatografi, elektroforese, sentrifugering, krystallisering og andre. Se f.eks. Ausubel et al. (1987, og periodiske supplementer); Deutscher (1990), "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology, vol. 182, og andre volumer i denne serien; Coligan et al. (1995 og supplementer), Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, New York, NY; P. Matsudaira (red., 1993), A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; og produsentens litteratur for anvendelse av proteinrensingsprodukter, f.eks. Pharmacia, Piscataway, NJ, eller Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinasjon med rekombinante teknikker tillater fusjon til passende segmenter (epitop-markører), f.eks. til en FLAG-sekvens eller en ekvivalent som f.eks. kan fusjoneres via en proteasefjernbar sekvens. Se f.eks. Hochuli (1989), Chemische Indusirie, 12:69-70; Hochuli

(1990) , "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent", i Setlow (red.), Genetic Engineering, Principle and Methods, 12:87-98, Plenum Press, NY; og Crowe et al. (1992), QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Standard immunologiske teknikker er f.eks. beskrevet av Hertzenberg et al. (red., 1996), Weir's Handbook of Experi-mental Immunology, vol. 1-4, Blackwell Science; Coligan

(1991) , Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; og Methods in Enzymology, vol. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 og 163. Cytokinanalyser er f.eks. beskrevet av Thomson (red., 1994), The Cytokine Handbook (2. utg.), Academic Press, San Diego; Metcalf og Nicola (1995), The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; og Aggarwal og Gutterman (1991), Human Cytokines, Blackwell Pub.

Analyser for vaskulære biologiske aktiviteter er vel kjent i teknikken. De vil dekke angiogene og angiostatiske aktiviteter i tumor eller andre vev, f.eks. proliferasjon av arteriell glattmuskel (se f.eks. Koyoma et al. (1996), Cell, 87:1069-1078), monocyttadhesjon til vaskulært epitel (se McEvoy et al. (1997), J. Exp. Med., 185:2069-2077), etc. Se også Ross (1993), Nature, 362:801-809; Rekhter og Gordon

(1995), Am. J. Pathol., 147:668-677; Thyberg et al. (1990), Atherosclerosis, 10:966-990; og Gumbiner (1996), Cell, 84:345-357.

Analyser for biologiske aktiviteter av nerveceller er f.eks. beskrevet av Wouterlood (red., 1995), Neuroscience Protocols modules, 10, Elsevier; Methods in Neurosciences, Academic Press; og Neuromethods, Humana Press, Totowa, NJ. Metodikk for utviklingssystemer er f.eks. beskrevet av Meisami (red.), Handbook of Human-Growth and Developmental Biology, CRC Press; og Chrispeels (red.), Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

FACS-analyser er beskrevet av Melamed et al. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York. NY; Shapiro (1988), Practical Flow Cytometry, Liss, New York, NY; og Robinson et al. (1993), Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, NY.

II. Kloning av humant IL- B30

Sekvensen av genet er vist i tabell 1. Sekvensen er avledet fra et cDNA-bibliotek dannet fra melanocytter, foster-hjerte og gravid livmor. Den er også funnet i en cDNA-biblio-teksekvens avledet fra pankreasøyceller. Disse sekvenser tillater fremstilling av PCR-primere eller prober for å bestemme cellulær fordeling av genet. Sekvensene tillater isolering av genomisk DNA som koder for budskapet.

Ved anvendelse av proben eller PCR-primerne blir forskjellige vev eller celletyper undersøkt for å bestemme cellulær fordeling. PCR-produkter klones ved anvendelse av f.eks. et TA-kloningssett (Invitrogen). De resulterende cDNA-plasmider sekvenseres fra begge terminaler på et automatisert sekvenseringsapparat (Applied Biosystems).

III. Cellulær ekspresjon av IL- B30

En passende probe eller primere spesifikke for cDNA som koder for primat-IL-B30, fremstilles. Proben blir typisk merket ved f.eks. vilkårlig priming. Ekspresjonen er antakeligvis i de beskrevne celletyper og kanskje også i pankreas-øyceller. Southern-analyse: DNA (5 ug) fra primært amplifisert cDNA-bibliotek ble spaltet med passende restriksjonsenzymer for å frigjøre innføyelsene, ble kjørt på en 1 % agarosegel og overført til en nylonmembran (Schleicher og Schuell, Keene,

NH) .

Prøver for isolering av humant mRNA inkluderer: perifere mononukleære blodceller (monocytter, T-celler, NK-celler, granulocytter, B-celler), hvilende (T100); perifere mononukleære blodceller aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 12 timer, sammenslått (T101); T-celle, THO-klon Mot 72, hvilende (T102); T-celle, THO-klon Mot 72, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer, sammenslått (T103); T-celle, THO-klon Mot 72, anergisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 7, 12 timer, sammenslått (T104); T-celle, THl-klon HY06, hvilende (T107); T-celle, THl-klon HY06, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i

3, 6, 12 timer, sammenslått (T108); T-celle, THl-klon HY06, anergsisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 6, 12 timer, sammenslått (T109); T-celle, TH2-klon #Y935, hvilende (T110); T-celle, TH2-klon HY935, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 2, 7, 12 timer, sammenslått (Till); T-celletumorlinjer Jurkat og Hut78, hvilende (T117); T-cellekloner, sammenslått AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, hvilende (T118); T-celler, vilkårlige y8-T-cellekloner, hvilende (T119); CD28-T-celleklon; splenocytter, hvilende (B100); splenocytter, aktivert med anti-CD40 og IL-4 (B101); B-celle-EBV-linjer, sammenslått WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, hvilende (B102); B-cellelinje JY, aktivert med PMA og ionomycin il, 6 timer, sammenslått (B103); NK 20-kloner, sammenslått, hvilende (K100); NK 20-kloner, sammenslått, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (K101); NKL-klon, avledet fra perifert blod fra LGL-leukemipasient, IL-2-behandlet (K106); hematopoetisk forløperlinje TF1, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (C100); U937-premonocyttisk linje, hvilende (M100); U937-premonocyttisk linje, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (M101); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10 i 1, 2, 6, 12, 24 timer, sammenslått (M102); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10 i 1, 2, 6, 12, 24 timer, sammenslått (M103); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10 i 4, 16 timer, sammenslått (M106); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10 i 4, 16 timer, sammenslått (M107); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS i 1 time (M108); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS i 6 timer (M109); DC 70 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, hvilende (D101); DC 70 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 1 time (D102); DC 70 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TN Fa, 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (D103); DC 95 % CDla<+> fra CD34<+->GM-

CSF, TNFa, 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (D104); DC 95 % CD14<+>, ex CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin, 1, 6 timer, sammenslått (D105); DC CDla<+-> CD86<+>, fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (D106); DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, hvilende (D107); DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, hvilende (D108); DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, aktivert med LPS 4, 16 timer, sammenslått (D109); DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, aktivert med TNFa, monocyttsupernatant, i 4, 16 timer, sammenslått (DUO); epitelceller, ustimulerte; epitelceller, IL-ip-aktiverte; lungefibroblastsarkomlinje MRC5, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (C101); nyreepitelkarsinomcellelinje CHA, aktivert med PMA og ionomycin il, 6 timer, sammenslått (C102). Ekspresjon av IL-B30-transkripsjon var meget høy i oppslemmede monocytter aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10, i 4, 16 timer, sammenslått (M106); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10, i 1, 2, 6, 12, 24 timer, sammenslått (M102); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS i 6 timer (M109); og oppslemmede monocytter, aktivert LPS i 1 time (M108). Ekspresjon var høy i DC 95 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (D104); og NK 20-kloner, sammenslått, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (K101). Lavere ekspresjon ble påvist i DC 70 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (D103); DC

70 % CDla<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 1 time (D102); T-celle, THl-klon HY06, anergisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 6, 12 timer, sammenslått (T109); perifere mononukleære blodceller, aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 12 timer, sammenslått (T101); T-celle, THO-klon Mot 72, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer, sammenslått (T103); splenocytter, aktivert med anti-CD40 og IL-4 (B101); T-celle, THO-klon Mot 72, anergisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 7, 12 timer, sammenslått (T104); splenocytter, hvilende (B100); T-celle, THl-klon HY06, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer, sammenslått (T108); epitelceller, IL-l|3-aktiverte; oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10 i 4, 16 timer, sammenslått (M107); og B-cellelinje JY, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (B103). Påvisbar ekspresjon ble observert i DC fra monocytter GM-CSF, IL-4, 5

dager, aktivert med LPS i 4, 16 timer, sammenslått (D109); T-celle, THO-klon Mot 72, hvilende (T102); perifere mononukleære blodceller (monocytter, T-celler, NK-celler, granulocytter, B-celler), hvilende (T100); T-celler, CD4<+->CD45RO~-T-celler polarisert i 27 dager i anti-CD28, IL-4 og anti-IFN-y, TH2-polariserte, aktivert med anti-CD3 og anti-CD28 i 4 timer (T116); T-cellekloner, sammenslått AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, hvilende (T118); U937-premonocyttisk linje, hvilende (M100); hematopoetisk forløperlinje TF1, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (C100); T-celle, TH2-klon HY935, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 2, 7, 12 timer, sammenslått (Till); DC-CDla<+->CD86<+> fra CD34<+->GM-CSF, TNFa, 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (D106); oppslemmede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10, i 1, 2, 6, 12, 24 timer, sammenslått (M103); DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, aktivert med TNFa, monocyttsupernatant, i 4, 16 timer, sammenslått (DUO) ; DC fra monocytter, GM-CSF, IL-4, 5 dager, hvilende (D108); U937-premonocyttisk linje, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer, sammenslått (M101); T-celler, vilkårlige y8-T-cellekloner, hvilende (T119); og T-celler, THl-klon HY06, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer, sammenslått (T108). Intet signal ble påvist i de andre prøvene.

Som oppsummering viser fordelingen at IL-B30-nivåene er forhøyet i aktiverte makrofager, hvilket antyder en rolle ved inflammasjon; aktiverte Thl-celler som antyder en regula-torisk eller effektorrolle i T-hjelperundersett, spesielt Thl-immunresponser; og aktiverte dendrittceller som antyder en rolle i antigenpresentasjon eller kimsenter-T- eller -B-celle-interaksjoner med DC.

Prøver for muse-mRNA-isolering inkluderer: hvilende musefibroblast-L-cellelinje (C200); Braf:ER (Braf-fusjon til østrogenreseptor) transfekterte celler, kontroll (C201); Mell4<+->naturilge T-celler fra milt, hvilende (T209); Mell4<+->naturlige T-celler fra milt, stimulert med IFNy, IL-12, og anti-IL-4, for å polarisere til THl-celler, eksponert for IFNy og IL-4 i 6, 12, 24 timer, sammenslått (T210); Mell4<+->naturlige T-celler fra milt, stimulert med IL-4 og anti-IFNy for å polarisere til Th2-celler, eksponert for IL-4 og anti-IFNy i 6, 13, 24 timer, sammenslått (T211); T-celler, THl-polariserte (Mell4 bright, CD4<+->celler fra milt, polarisert i 7 dager med IFN-y og anti-IL-4 (T200); T-celler, T2 polarisert (Mell4 bright, CD4<+->celler fra milt, polarisert i 7 dager med IL-4 og anti-IFN-y (T201); T-celler, THl-høypolarisert 3 x fra transgene Balb/C (se Openshaw et al. (1995), J. Exp. Med., 182: 1357-1367; aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått; T202); T-celler, TH2-høypolarisert 3 x fra transgene Balb/C (aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått (T203); T-celler, THl-høypolarisert 3 x fra transgene C57 bl/6 (aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått; T212); T-celler, TH2-høypolarisert 3 x fra transgene C57 bl/6 (aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått; T213); T-celler, THl-høypolarisert (naturlige CD4<+->T-celler fra transgene Balb/C, polarisert 3 x med IFNy, IL-12 og anti-IL-4; stimulert med IGIF, IL-12, og anti IL-4 i 6, 12, 24 timer, sammenslått); CD44"-CD25<+->pre-T-celler sortert fra thymus (T204); THl-T-celleklon Dl.l, hvilende i 3 uker etter siste stimulering med antigen (T205); THl-T-celleklon Dl.l, 10 ug/ml ConA-stimulert i 15 timer (T206); TH2- T-celleklon CDC35, hvilende i 3 uker etter siste stimulering med antigen (T207); TH2-T-celleklon CDC35, 10 ug/ml ConA- stimulert i 15 timer (T208); ustimulert B-cellelinje CH12 (B201); ustimulert moden B-celleleukemicellelinje A20 (B200); ustimulerte store B-celler fra milt (B202); B-celler fra total milt, LPS-aktiverte (B203); metrizamidanrikede dendrittceller fra milt, hvilende (D200); dendrittceller fra benmarg, hvilende (D201); ustimulerte benmargsavledete dendrittceller uttynnet med anti-B220, anti-CD3 og anti-klasse II, dyrket i GM-CSF og IL-4, (D202); benmargsavledete dendrittceller uttynnet med anti-B220, anti-CD3 og anti-klasse II, dyrket i GM-CSF og IL-4, stimulert med anti-CD40 i 1, 5 dager, sammenslått (D203); monocyttcellelinje RAW 264.7 aktivert med LPS i 4 timer (M200); benmargsmakrofager avledet med GM og M-CSF (M201); benmargsmakrofager avledet med GM-CSF, stimulert med LPS, IFNy og IL-10 i 24 timer (M205); benmargsmakrofager avledet med GM-CSF, stimulert med LPS, IFNy og anti-IL-10 i 24 timer (M206); peritoneale makrofager (M207); makrofagcellelinje J774, hvilende (M202); makro-

fagcellelinje J774 + LPS + anti-IL-10 ved 0,5, 1, 3, 6,

12 timer, sammenslått (M203); makrofagcellelinje J774 + LPS + IL-10 ved 0,5, 1, 3, 5, 12 timer, sammenslått (M204); ustimulerte mastcellelinjer MC-9 og MCP-12 (M208); immortalisert endotelcellelinje avledet fra mikrovaskulære hjerneendotelceller, ustimulerte (E200); immortalisert endotelcellelinje avledet fra mikrovaskulære hjerneendotelceller, stimulert over natten med TNFa (E201); immortalisert endotelcellelinje avledet fra mikrovaskulære hjerneendotelceller, stimulert over natten med TNFa (E202); immortalisert endotelcellelinje avledet fra mikrovaskulære hjerneendotelceller, stimulert over natten med TNFa og IL-10 (E203); total aorta fra wt C57 bl/e-mus; total aorta fra 5 måneder gamle ApoE KO-mus (X207); total aorta fra 12 måneder gamle APoE KO-mus (X207); wt-thymus

(0214); total thymus, rag-1 (O208); total nyre, rag-1 (O209); total nyre, NZ-B/W-mus; og totalt hjerte, rag-1 (O202). Høyt signal ble påvist i monocyttcellelinjen RAW 264.7 aktivert med LPS i 4 timer (M200); T-celler, THl-høypolarisert 3 x fra transgene C57 bl/6 (aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått; T212); og T-celler, THl-høypolarisert (naturlige CD4<+->T-celler fra transgene Balb/C, polarisert 3 x med IFNy, IL-12, og anti-IL-4; stimulert med IGIF, IL-12, og anti IL-4 i 6, 12, 24 timer, sammenslått). Påvisbare signaler ble påvist i T-celler, THl-høypolarisert 3 x fra transgene Balb/C (se Openshaw et al. (1995) J. Exp, Med., 182:1357-1367; aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 24 timer, sammenslått; T202); T-celler, TH2-polariserte (Mell4 bright, CD4<+->celler fra milt, polarisert i 7 dager med IL-4 og anti-IFN-y; T201); T-celler, TH1-polariserte (Mell4 bright, CD4<+->celler fra milt, polarisert i 7 dager med IFN-y og anti IL4; T200); makrofagcellelinje J774 + LPS + anti-IL-10 ved 0,5, 1, 3, 6, 12 timer, sammenslått (M203); makrofagcellelinje J774, hvilende (M202); makrofagcellelinje J774 + LPS + IL-10 ved 0,5, 1, 3, 5, 12 timer, sammenslått (M204); immortalisert endotelcellelinje avledet fra mikrovaskulære hjerneendotelceller, stimulert over natten med TNFa (E201); og benmargsmakrofager avledet med GM-CSF, stimulert med LPS, IFNy og anti IL-10 i 24 timer (M206). Andre prøver viste intet signal. Ekspresjonen i RAW 264.7-musemono-cyttcellelinjen antyder en naturlig kilde for protein.

IV. Kromosomkartlegging av IL- B30

Et isolert cDNA som koder for IL-B30 anvendes. Kromosomkartlegging er en standardteknikk. Se f.eks. BIOS Laboratories (New Haven, CT) og metoder for anvendelse av et somatisk musecellhybridpanel med PCR. Indirekte bevis antyder at muse-IL-B30-genet er kartlagt til kromosom 10.

V. Rensing av IL- B30- protein

Multiple, transfekterte cellelinjer screenes for en cellelinje som uttrykker cytokinet på høyt nivå sammenlignet med andre celler. Forskjellige cellelinjer screenes og ut-velges for deres gunstige egenskaper med hensyn til hånd-tering. Naturlig IL-B30 kan isoleres fra naturlige kilder, eller ved ekspresjon fra en transformert celle ved anvendelse av en passende ekspresjonsvektor. Rensing av det uttrykte protein oppnås ved hjelp av standardprosedyrer, eller kan kombineres med konstruerte anordninger for effektiv rensing med høy effektivitet fra cellelysater eller supernatanter. FLAG- eller His6~segmenter kan anvendes for slike rensings-trekk. Alternativt kan affinitetskromatografi benyttes med spesifikke antistoffer, se nedenfor.

Protein produseres i E. coli, insektceller eller pattedyrekspresjonssystemer etter ønske.

VI. Isolering av homologe IL- B30- gener

IL-B30-CDNA eller en annen artsmotstykkesekvens kan anvendes som en hybridiseringsprobe for å screene et bibliotek fra en ønsket kilde, f.eks. et primatcelle-cDNA-bibliotek. Mange forskjellige arter kan screenes, både for nødvendig stringens for lett hybridisering og for tilstedeværelse ved anvendelse av en probe. Egnede hybridiseringsbetingelser vil anvendes for å utvelge for kloner som oppviser spesifisitet for krysshybridisering.

Screening ved hybridisering ved anvendelse av degene-rerte prober basert på peptidsekvensene vil også tillate isolering av passende kloner. Alternativt vil anvendelse av passende primere for PCR-screening gi anrikning av egnede nukleinsyrekloner.

Lignende metoder kan anvendes for å isolere enten arter, polymorfe eller allele varianter. Artsvarianter isoleres ved anvendelse av artskrysningshybridiserings-teknikker basert på isolering av fullengdet isolat eller fragment fra én art som en probe.

Alternativt vil antistoffer dannet mot humant IL-B30 anvendes for å screene for celler som uttrykker kryssreaktive proteiner fra et egnet bibliotek, f.eks. cDNA-bibliotek. Det rensede protein eller definerte peptider er anvendelige for dannelse av antistoffer ved hjelp av standardmetoder, som beskrevet ovenfor. Syntetiske peptider eller renset protein presenteres for et immunsystem for å danne monoklonale eller polyklonale antistoffer. Se f.eks. Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; og Harlow og Lane

(1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. De resulterende antistoffer anvendes for screening, rensing eller diagnose, som beskrevet.

VII. Fremstilling av antistoffer spesifikke for IL- B30

Syntetiske peptider eller renset protein presenteres for et immunsystem for å danne monoklonale eller polyklonale antistoffer. Se f.eks. Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; og Harlow og Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Polyklonalt serum eller hybridomer kan fremstilles. I passende situasjoner er bindingsreagenset enten merket som beskrevet ovenfor, f.eks. med fluorescens eller på annen måte, eller immobilisert på et substrat for panoreringsmetoder. Immun-seleksjon og beslektede teknikker er tilgjengelige for å fremstille selektive reagenser etter ønske.

VIII. Evaluering av bredde av biologiske funksjoner

Biologiske aktiviteter av IL-B30 ble testet, basert på sekvens- og strukturhomologi mellom IL-B30 og IL-6 og G-CSF. Innledningsvis undersøkes analyser som hadde vist biologiske aktiviteter tilsvarende IL-6 eller G-CSF.

A. Effekter på proliferasjon av celler

Effekten på proliferasjon av forskjellige celletyper evalueres med forskjellige konsentrasjoner av cytokin. En dose-responsanalyse utføres i kombinasjoner med de beslektede IL-6, G-CSF etc.

B. Effekter på ekspresjon av celleoverflatemolekyler på humane monocytter

Monocytter renses ved negativ seleksjon fra mononukleære perifere blodceller fra normale, friske donorer. Kort beskrevet blir 3 x IO<8> ficoll-sammenknyttede mononukleære celler inkubert på is med en blanding av monoklonale antistoffer (Becton-Dickinson; Mountain View, CA) bestående av f.eks. 200 ul aCD2 (Leu-5A), 200 ul aCD3 (Leu-4), 100 ul aCD8 (Leu 2a), 100 ul aCD19 (Leu-12 ), 100 ul aCD20 (Leu-16),

100 ul aCD56 (Leu-19), 100 ul aCD67 (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME), og anti glykoforin-antistoff (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). Antistoffbundne celler vaskes og inkuberes deretter med saue-antimuse-IgG-koplede magnetiske kuler (Dynal, Oslo, Norge) ved et forhold mellom kuler og celler på 20:1. Antistoffbundne celler separeres fra monocytter ved påføring av et magnetisk felt. Deretter dyrkes humane monocytter i Yssels medium (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) inneholdende 1 % humant AB-serum i fravær eller nærvær av IL-B30, IL-6, G-CSF eller kombinasjoner av disse.

Analyser av ekspresjonen av celleoverflatemolekyler kan utføres ved direkte immunfluorescens. 2 x IO<5> rensede humane monocytter inkuberes f.eks. i fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1 % humant serum på is i 20 minutter. Cellene pelleteres ved 200 x g. Cellene resuspenderes i 20 ml PE- eller FITC-merket mAb. Etter ytterligere 20 minutters inkubasjon på is vaskes cellene i PBS inneholdende 1 % humant serum, etterfulgt av to vaskinger i PBS alene. Cellene fikseres i PBS inneholdende 1 % paraformaldehyd og analyseres på FACScan-strømningscytometer (Becton Dickinson; Mountain View, CA). Eksempelvise mAb benyttes, f.eks. CDllb (anti-macl), CDllc (gpl50/195), CD14 (Leu-M3), CD54 (Leu 54), CD80

(anti-BBl/B7), HLA-DR (L243) fra Becton-Dickinson, og CD86 (FUN 1; Pharmingen), CD64 (32.2; Medarex), CD40 (mAb89; Schering-Plough, Frankrike).

C. Effekter av IL- B30 på cytokinproduksjon av

humane monocytter

Humane monocytter isoleres som beskrevet og dyrkes i Yssels medium (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) inneholdende 1 % humant AB-serum, i fravær eller nærvær av IL-B30 (1/100-fortynning, baculovirusuttrykt materiale). Monocytter blir dessuten stimulert med LPS (£. coli 0127:B8 Difco) i fravær eller nærvær av IL-B30, og konsentrasjonen av cytokiner (IL-lp, IL-6, TNFa, GM-CSF og IL-10) i cellekultursupernatanten bestemmes ved hjelp av ELISA.

For intracytoplasmatisk farging for cytokiner blir monocytter dyrket (1 million/ml) i Yssels medium i fravær eller nærvær av IL-B30 og LPS ( E. coli 0127:B8 Difco) og 10 mg/ml Brefeldin A (Epicentre technologies, Madison, WI) i 12 timer. Cellene vaskes i PBS og inkuberes i 2 % form-aldehyd-/PBS-løsning i 20 minutter ved RT. Cellene blir deretter vasket, resuspendert i permeabiliseringsbuffer (0,5 % saponin (Sigma) i PBS/BSA (0,5 %)/azid (1 mM)) og inkuberes i 20 minutter ved RT. Celler (2 x IO<5>) sentrifugeres og resuspenderes i 20 ml direkte konjugerte anticytokin-mAb fortynnet 1:10 i permeabiliseringsbuffer i 20 minutter ved RT. De følgende antistoffer kan benyttes: IL-la-PE (364-3B3-14); IL-6-PE (MQ2-13A5); TNFa-PE (MAbll); GM-CSF-PE (BVD2-21C11); og IL-12-PE (Cll.5.14; Pharmingen, San Diego, CA). Cellene vaskes deretter to ganger i permeabiliseringsbuffer og én gang i PBS/BSA/azid og analyseres på FACScan-strømningscytometer (Becton Dickinson; Mountain View, CA).

D. Effekter av IL- B30 på proliferasjon av humane

perifere mononukleære blodceller ( PBMC)

Totale PBMC isoleres fra buffy coats fra normale, friske donorer ved sentrifugering gjennom ficoll-hypaque som beskrevet (Boyum et al.). PBMC dyrkes i 200 Dl Yssels medium (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) inneholdende 1 % humant AB-serum i 96-brønners plater (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) i fravær eller nærvær av IL-B30. Cellene dyrkes i medium alene eller i kombinasjon med 100 U/ml IL-2 (R&D Systems) i 120 timer. 3H-tymidin (0,1 mCi) tilsettes i de siste 6 timers dyrkning, og 3H-tymidininkorporering bestemmes ved hjelp av væskescintillasjonstelling.

De native, rekombinante og fusjonsproteiner vil testes for agonist- og antagonistaktivitet i mange andre biologiske analysesystemer, f.eks. på T-celler, B-celler, NK, makrofager, dendrittceller, hematopoetiske forløpere etc. På grunn av det strukturelle slektskap mellom IL-6 og G-CSF bør analyseresultater relatert til disse aktiviteter analyseres. IL-B30 evalueres for agonist- eller antagonistaktivitet på transfekterte celler som uttrykker IL-6- eller G-CSF-reseptor og kontroller. Se f.eks. Ho et al. (1993), Proe. Nat'1 Acad. Sei. USA, 90, 11267-11271; Ho et al. (1995), Mol. Cell. Biol., 25:5043-5053; og Liu et al. (1994), J. Immunol., 152:1821-1829. IL-B30 evalueres for effekt i makrofag/dendrittcelle-aktiverings- og antigenpresentasjonsanalyser, T-cellecytokin-produksjon og proliferasjon som respons på antigen eller allo-gen stimulering. Se f.eks. de Waal Malefyt et al. (1991), J. Exp. Med., 174:1209-1220; de Waal Malefyt et al. (1991), J. Exp. Med., 274:915-924; Fiorentino et al. (1991), J. Immunol., 147, 3815-3822; Fiorentino et al. (1991), J. Immunol., 246": 3444-3451; og Groux et al. (1996) J. Exp. Med., 184:19-29. IL-B30 vil også evalueres for effekter på NK-celle-stimulering. Analyser kan f.eks. være basert på Hsu et al.,

(1992), Internat. Immunol., 4:563-569; og Schwarz et al.

(1994), J. Immunother., 16:95-104.

B-cellevekst- og differensieringseffekter vil f.eks. analyseres ved hjelp av metodikken beskrevet av f.eks. Defrance et al. (1992), J. Exp. Med., 175:671-682; Rousset et al. (1992), Proe. NaflAcad. Sei. USA, 89:18 90-18 93, inkludert IgG2- og IgA2-skiftningsfaktoranalyser. Det skal anføres at i motsetning til COS7-supernatanter gir NIH3T3- og COP-supernatanter tilsynelatende ingen forstyrrelse av humane B-celleanalyser.

IX. Frembringelse og analyse av genetisk endrede dyr

Transgene mus kan frembringes ved hjelp av standardmetoder. Slike dyr er nyttige for å bestemme effektene av delesjon av genet, i spesifikke vev eller fullstendig gjennom hele organismen. Slike kan tilveiebringe interessant innsikt i utvikling av dyret eller spesielle vev i forskjellige stadier. Effekten på forskjellige responser på biologisk stress kan dessuten evalueres. Se f.eks. Hogan et al. (1995), Manipulat-ing the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2. utg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

En transgen mus er blitt frembrakt, og selv om dyret synes å overleve fødselen, trives det ikke og dør typisk innen noen få uker. Konstruksjonen er basert på en aktinpromotor med en CMV-enhancer som bør føre til bred og høy ekspresjon. Musene, slik som IL-6-transgene mus, er misdannede. De oppviser dessuten oppsvulmet buk, inflammasjon i magesekk og tarmer, infiltrasjon av celler i leveren og dør typisk før dag 50. Disse mus formerer seg ikke. Et andre undersett av de transgene mus har en mindre alvorlig fenotype, og forsøk på å formere dem finner nå sted.

Den genomiske struktur for musen IL-B30 er blitt bestemt. En strategi for produksjon av IL-B30-knock-out-mus er blitt utviklet, og konstruksjoner er blitt startet.

Claims (18)

1. Isolert eller rekombinant polynukleotid, karakterisert ved at det koder for et modent polypeptid utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 4 og 5.

2. Isolert eller rekombinant polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for et polypeptid utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 4 og 5.

3. Polynukleotid ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter den kodende delen av SEQ ID NO: 1 eller 3.

4. Polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter den modne, kodende delen av nukleotidsekvensen av SEQ ID NO: 1 eller 3.

5. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet ifølge krav 1.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder ekspresjonsvektoren ifølge krav 5.

7. Vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at den er en eukaryot celle.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, karakterisert ved at den omfatter ekspresjon av et rekombinant polynukleotid ifølge krav 1.

9. Antistoff- eller antigenbindende fragment derav, karakterisert ved at det spesifikt bindes til et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av den modne aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5.

10. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 9, karakterisert ved at antistoffet eller det antigenbindende fragment derav er et monoklonalt antistoff, Fab eller F(ab)2.

11. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 9, karakterisert ved at antistoffet eller det antigenbindende fragment derav er merket slik at det kan påvises.

12. Fremgangsmåte for anvendelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment derav ifølge krav 9, karakterisert ved at den omfatter at antistoffet eller det antigenbindende fragment derav bringes i kontakt med en biologisk prøve som omfatter et antigen, idet denne kontakt resulterer i dannelse av et antistoff:antigenkompleks eller et antigenbindende fragment: antigenkompleks.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den biologiske prøven er fra et menneske.

14. Sett, karakterisert ved at det omfatter antistoffet eller det antigenbindende fragment derav ifølge krav 9, og a) instruksjonsmateriale for anvendelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment derav for nevnte påvisning; eller b) et rom som tilveiebringer atskillelse av antistoffet eller det antigenbindende fragment derav.

15. Isolert polypeptid, karakterisert ved at det omfatter et modent polypeptid ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5.

16. Polypeptid ifølge krav 15, karakterisert ved at polypeptidet er påvisbart merket.

17. Isolert polypeptid ifølge krav 15, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5.

18. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 9, karakterisert ved at det spesifikt bindes til et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, 4 eller 5. SEQ ID NO: 1 is a primate IL-B30 natural nucleic acid sequence. SEQ ID NO: 2 is a primate IL-B3 0 nacural amino acid sequence. SEQ ID NO: 3 is a rodent IL-B30 natural nucleic acid sequence. SEQ ID NO: 4 is a rodent IL-B30 natural amino acid sequence. SEQ ID NO: 5 is a pig IL-B30. SEQ ID NO: 6 is bovine G-CSF. SEQ ID NO: 7 is feline G-CSF. SEQ ID NO: 8 is human G-CSF. SEQ ID NO: 9 is mouse G-CSF. SEQ ID NO: 10 is otter IL-6. SEQ ID NO: 11 is feline IL-6. SEQ ID NO: 12 is human IL-6. SEQ ID NO: 13 is sheep IL-6. SEQ ID NO: 14 is mouse IL-6. SEQ ID NO: 15 is chicken MGF. SEQ ID NO: 16 is KSHV, kaposi's sarcoma herpes virus, a viral IL-6. (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Schering Corporation (ii) TITLE OF INVENTION: MAMMALIAN CYTOKINE; RELATED REAGENTS (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 16 liv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Schering Corporation (B) STREET:2000 Galloping Hill Road (C) CITY: Ker.ilworth (D) STATE: New Jersey (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 07033-0530 <v! COMPUTER READABLE FORM: IA) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER-. Power Macintosh 7 600/120 (C) OPERATING SYSTEM: Windows <D> SOFTWARE: MS Word (vi) CURRENT APPLICATION' DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: July 24. 1998 (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/900,905 (B) FILING DATE: 25-JUL-1997 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Thampoe, Immac J. (Bl REGISTRATION NUMBER: 36,322 <C> REFERENCE/DOCKET NUMBER: DX07 58K1 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (908) 298-5061 (B> TELEFAX: (908) 298-5388