NO329155B1

NO329155B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et lyofilisert peptid/lipidprodukt

Info

Publication number: NO329155B1
Application number: NO20001683A
Authority: NO
Inventors: Jean-Louis Dasseux
Original assignee: Jean-Louis Dasseux
Priority date: 1997-10-02
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2010-08-30
Also published as: AU9671598A; US6455088B1; EP1019025B1; IL135322A; WO1999017740A9; KR100588241B1; US20030099714A1; US20070167351A1; DK1019025T3; EP1019025A4; WO1999017740A1; AU749344B2; EP1358874A1; CA2305704A1; PT1019025E; EP1019025A1; KR20010030892A; PL339654A1; NZ503721A; US7189411B2

Description

1. OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av et lyofilisert peptid/lipidprodukt, hvor en solubilisert løsning av et peptid eller en peptidanalog og et lipid lyofiliseres. Nevnte lyofiliserte produkt kan rehydreres for å danne et peptid/lipidkompleks.

2. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Liposomer er vesikler sammensatt av minst én lipidbilagsmembran som omslutter en vandig kjerne. Generelt omfatter fosfolipider lipidbilaget, men bilaget kan være sammensatt av andre lipider. Den vandige oppløsningen inne i liposomet blir referert til som "fanget volum".

Liposomer har blitt utviklet som vehikler for bla. å avlevere medikamenter, kosmetika, bioaktive forbindelser. Lipidbilaget innkapsler medikamentet, kosmetisk produkt, den bioaktive forbindelsen og dess like i det fangede volumet av liposomet og medikamentet blir frigitt fra liposomkjernen når lipidbilaget kommer i kontakt med en celleoverflatemembran. Liposomet frigir dets innhold til cellen ved lipidveksling, fu-sjon, endocytose eller adsorpsjon. Ostro et al., 1989, Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576. Alternativt kan medikamentet, det kosmetiske produkt, den bioaktive forbindelsen og dets like være assosiert med - eller satt inn i - lipidbilagets membran på vesikkelen.

I tillegg til vesikler, har lipidinneholdende komplekser blitt benyttet for å avlevere midler i partikkelform. For eksempel har mange forskere funnet det nyttig å fremstille rekonstituerte lipoproteinlignende partikler eller komplekser som har lik størrelse og tetthet som høytetthetslipoproteinpartikler (HDL). Disse rekonstituerte kompleksene består vanligvis av rensede apoproteiner (vanligvis apoprotein A-I) og fosfolipider slik som fosfatidylkolin. Noen ganger er uesterifisert kolesterol også inkludert. De meste vanlige metodene for å fremstille disse partiklene er 1) samsonikering av bestanddelene, enten ved badsonikering eller med en probesonikator, 2) spontan interaksjon av proteininnholdet med predannede lipidvesikler, 3) detergentmediert rekonstitusjon etterfulgt av fjerning av detergenten med dialyse. Jonas, 1986, Meth. in Enzymol. 128:553-582; Lins et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta, 1151:137-

142; Brouillette & Anantharamaiah, 1995, Biochimica et Biophysica Acta, 1256:103-129; Jonas, 1992, Structure & Function of Apoproteins, kapittel 8:217-250. Lignende komplekser har også blitt dannet ved å substituere amfipatiske heliksdannende peptider for apoproteinkomponentene. Uheldigvis representerer hver av disse metodene alvorlige problemer for dannelsen av store mengder av rene komplekser på en fornuftig kost-effektiv måte. Dessuten beskriver ingen av disse publikasjonene samlyofilisering av

peptider eller peptidanaloger som er istand til å innta en amfipatisk alfahelisk konformasjon og et lipid.

Mange forskjellige teknologier er kjent for å produsere lipidvesikler og komplekser. Vesikler, eller liposomer, har blitt produsert ved bruk av forskjellige protokoller ved å danne forskjellige typer av vesikler. De forskjellige typene av liposomer inkluderer: Multilamellære vesikler, små unilamellære vesikler og store unilamellære vesikler.

Hydrering av fosfolipider (eller andre lipider) ved vandig oppløsning, kan også resultere i dispersjon av lipider og spontan dannelse av multilamellære vesikler ("MLV"). En MLV er et liposom med multiple lipidbilag som omgir den sentrale vandige kjernen. Disse typer av liposomer er større enn små unilammelære vesikler (SUV) og kan være 350-400 nm i diameter. MLV er opprinnelig fremstilt ved oppløselige lipider i kloroform i en rundbunnet flaske, og evaporering av kloroformen inntil lipidet danner et tynt lag på veggen av flasken. Den vandige oppløsningen ble tilsatt, og lipidlaget fikk lov til å rehydrere. Vesikler ble dannet når flasken ble snurret eller vortex-sentrifugert. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (som siterer Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. 13:238). Johnson et al., rapporterte senere at denne metoden også dannet enkle lamellære vesikler. Johnson et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 233:820.

En liten unilamellær vesikkel (SUV) er et liposom med et enkelt lipidbilag som omslutter en vandig kjerne. Avhengig av metoden som blir anvendt for å danne SUV, kan de variere i størrelse fra 25-110 nm i diameter. De første SUV ble fremstilt ved å tørke en fosfolipidfremstilling i kloroform under nitrogen, tilsette det vandige laget for å produsere en lipidkonsentrasjon i det millimolære området og sonikere oppløsningen ved 45°C til klarhet. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. SUV fremstilt på denne måten ga liposomer i området på 25-50 nm i diameter.

En annen metode for å fremstille SUV er å raskt injisere en etanol/lipidoppløsning inn i den vandige oppløsningen som skal innkapsles. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (som siterer Batzri et al., 1973, Biochim. Biophys. Acta 298-1015). SUV produsert ved denne metoden varierer i størrelse fra 30-110 nm i diameter.

SUV kan også bli produsert ved å passere multilamellære vesikler gjennom en fransk presse fire ganger ved 20.000 psi. De produserte SUV vil variere i størrelse fra 30-50 nm i diameter. Deamer et al., 11983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (siterene Barenholz et al., 1979, FEBS Letters 99:210).

Multilamellære og unilamellære fosfolipidvesikler kan også bli dannet ved ekstrusjon av vandige fremstillinger av fosfolipider ved høyt trykk gjennom membraner med små porer (Hope et al., 1996, Chemistrv and Phvsics of Lipid. 40:89- 107V

En stor unilamellær vesikkel (LUV) er lik SUV ved at de er enkle lipidbilag rundt den sentrale vandige kjernen, men LUV er mye større enn SUV. Avhengig av deres bestand-deler og metoden brukt for å fremstille dem, kan LUV variere i størrelse fra 50-1000 nm i diameter. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. LUV blir vanligvis fremstilt ved å bruke én av tre metoder: Detergentfortynning, reversfase-evaporering eller infusjon.

I detergentfortynningsteknikken blir detergentoppløsninger slik som cholat, deoksy-cholat, oktylglykosid, heptylglykosid og Triton X-100 brukt for å danne miceller fra lipidfremstillingen. Oppløsningen blir deretter dialysert for å fjerne detergenten, og resulterer i dannelsen av liposomer. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. Denne metoden tar svært lang tid, og fjerning av detergenten blir generelt ufullstendig. Tilstedeværelse av detergent i den endelige fremstillingen, kan resultere i noe toksisitet av liposomfremstillingen og/eller modifisering av de fysisk-kjemiske egenskaper til liposomfremstillingen.

Reversfase-evaporeringsteknikken løser opp lipid i vandig ikke-polare oppløsninger som danner inverterte miceller. Ikke-polart oppløsningsmiddel blir evaporert og micellene aggregert for å danne LUV. Denne metoden krever generelt et stort antal lipider.

Infusjonsmetoden injiserer et lipid oppløst i en ikke-polar oppløsning inn i den vandige oppløsningen som skal innkapsles. Siden den ikke-polare oppløsningen fordamper, samles lipider på den gass/vandige overflaten. Lipidflakene danner LUV og oligolamellære liposomer når gassen bobler gjennom den vandige oppløsningen. Liposomene blir størrelsesbestemt ved filtrering. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (som siterer Deamer et al., 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:629 og Schieren et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 542-137). Infusjonsprosedyrene krever en ganske høy temperatur for infusjon og kan ha en relativt lav innkapslingseffektivitet. Deamer et al., 1983, i Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York).

Det er blitt et mål for hposomforskning å utvikle liposomfremstillinger som kan bli

lagret i lange perioder før anvendelse. For eksempel beskriver U.S.-patent nr.

4.229.360, Schneider et al., en metode for dehydrering av liposomer ved å tilsette en hydrofil forbindelse til en kolloidal dispersjon av liposomer i en vandig væske og dehydrering av oppløsningen, fortrinnsvis ved lyofilisering. Eksempler på hydrofile forbindelser er hydrofiliske polymerer med høy molekylvekt eller forbindelser med lav molekylvekt, slik som sukrose.

U.S.-patent nr. 4.411.894 til Shrank et al., beskriver anvendelse av høye konsentrasjoner av sukrose i sonikerte fremstillinger av liposomer. Liposomer inneholder fettoppløselige produkter i det fangede volumet, skjønt fremstillingene kunne bli lyofilisert kunne metoden ikke forhindre tapet av en signifikant mengde av det fangede innhold til tross for den høye konsentrasjonen av sukrose.

Crowe et al., U.S.-patent nr. 4.857.319, beskriver anvendelsen av disakkarider slik som sukrose, maltose, laktose og trehalse for å stabilisere liposomer når liposomer blir frysetørket. Mengden av disakkarid med hensyn til lipidinnholdet av komponenten (v/v) er innen 0,1:1 til 4:1. Crowe oppnådde større hell i konservering av liposomal integritet ved å bruke denne metoden enn det som ble oppnådd ved metoden beskrevet av Shrank iUS-patent nr. 4.441.894.

Janoff et al., U.S.-patent nr. 4.880.635, beskriver en metode for dehydrering av liposomer hvori liposomer ble lyofilisert ved tilstedeværelse av beskyttende sukkere slik som trehalose og sukrose, fortrinnsvis på både de indre og ytre "leaflets" av lipidbilaget. Tilstrekkelig vann blir bibeholdt i metoden til Janoff et al., slik at rehydrering av de tørkede liposomene gir liposomer med vesentlig strukturell integritet.

Lerch et al., U.S. patent nr. 5.652.339 vedrører en fremgangsmåte for å fremstille, i industriell skala, rekonstituert høy-tetthet-lipoproteiner fra apolipoproteiner og lipider. Imidlertid er det innen fagfeltet behov for en enkel og kostnadseffektiv metode for å danne lyofihserte peptid/lipidkomplekser som derved kan bli rehydrert.

Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse gir peptid/lipidblandinger i et stabilt, lyofilisert pulver som kan bli lagret, brukt som et pulver, eller brukt etter rehydrering for å danne peptid/lipidkomplekser.

3. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et lyofilisert peptid/lipidprodukt, kjennetegnet ved at den omfatter lyofilisering av en solubilsert løsning som omfatter et peptid eller en peptidanalog som er i stand til å innta en amfipatisk konformasjon og et lipid, hvor nevnte lipid er løst i nevnte løsning uten hjelp av en detergent og hvor nevnte lyofiliserte produkt kan rehydreres for å danne et peptid/lipidkompleks.

I én spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen er peptidet et protein, fortrinnsvis et lipidbindende protein. I en annen utførelsesform er blir peptidanaloger av ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III eller ApoE, utnyttet i stedet for - eller i kombinasjon med - peptidene. I en annen spesifikk utførelsesform blir metoden anvendt for å fremstille ApoAl-analog/(fosfo)lipidkomplekser som er lik HDL.

ApoAl/lipidkomplekser er nyttige i behandling av forstyrrelser assosiert med dyslipoproteinemi inklusivt - men ikke begrenset til - hyperkolesterolemi, hypertriglyseridemi, lavt HDL og apolipoprotein A-l-mangel, septisk sjokk, for in vifr-o-diagnostiske analyser som markører for HDL-populasjoner og for anvendelse med avbildingsteknologi.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør fremstillingen av peptid/lipidkomplekser egnet for parenteral administrering inklusive - men ikke begrenset til - intravenøse, intrapeirtoneale, subkutane, intramuskulære og bolusinjeksjoner til dyr eller mennesker. Videre kan peptid/lipidkompleksene også bli formulert for oral, rektal, muskøs (for eksempel munnhulen) eller topisk administrering til dyr eller mennesker, eller for in v#rø-eksperimentering.

Fremgangsmåten kan bli brukt til storskalaproduksjon av amfipatisk peptid/fosfolipid-komplekser, lipidbindende protein/fosfolipidkomplekser og/eller ApoAl-peptidanalog/- fosfolipidkomplekser. Det lyofiliserte materialet kan bli fremstilt for bulkfremstillinger eller - alternativt - kan den blandede peptid/lipidoppløsningen bli porsjonert i mindre beholdere (for eksempel enkle dose-enheter) forut for lyofilisering, og slike små enheter kan bli fremstilt som sterile enhetsdoseformer.

Det lyofiliserte pulveret fremstilt ved metoden fra oppfinnelsen kan bli rehydrert i en spesiell fri steril oppløsning umiddelbart før injeksjon, eller alternativt kan det lyofiliserte pulveret bli formulert til en egnet fastdoseform og administrert direkte.

Metoden kan også være egnet for lagring av forbindelser som på annen måte er ustabile eller uoppløselige ved fravær av lipider.

Metoden kan bli brukt for formulering av produkter for behandling eller forebygging av humane sykdommer, inklusive slike anvendelsesområder som sampresentasjon av antigener i vaksiner, behandling eller forebygging av dyslipoproteinemi inklusive - men ikke begrenset til - hyperkolesterolemi, hypertriglyseridemi, lav HDL og apolipoprotein A-I-mangel, kardiovaskulær sykdom slik som atherosclerose, septisk sjokk eller infeksjonssykdommer.

Metoden kan bli brukt for fremstilling av komplekser som kan brukes som bærere for medikamenter som vektorer (for å avlevere medikamenter, DNA, gener), for eksempel til leveren eller til ekstrahepatiske celler eller som oppsamlere for å fange toksin (for eksempel pesticider, LPS etc).

3. DEFINISJONER

Som brukt heri, refererer et "oppløsningsmiddelsystem" seg til ett eller flere oppløsningsmidler som er istand til å løse opp peptider og/eller lipider og - hvis det er mer enn ett - som er istand til å blandes med hverandre.

Som brukt heri refererer "peptid/lipidkomplekser" seg til en aggregering av lipid-deler og peptid-dannende partikler innen størrelsesområdet av høytetthets-lipoproteiner

(HDL).

Som brukt heri refererer "samlyofilisert" seg til lyofiliseringen, frysetørkingen eller va-kuumtørkingen av mer enn én forbindelse (for eksempel peptid, protein, lipid, fosfolipid) i oppløsningen i den samme beholder. For eksempel kan en lipidoppløsning bli kombinert med en peptidoppløsning i det samme kar, og den resulterende kombinasjonen av oppløsningen blir lyofilisert sammen, og derved blir peptidene og lipidene lyofilisert samtidig.

Som brukt hen betyr "amfipatisk peptid" eller "amfipatiske alfaheliske peptider" , peptider som er istand til å innta en amfipatisk eller amfipatisk helisk konformasjon,

respektivt. Den amfipatiske alfaheliksen er ofte et sekundært strukturelt motiv som man ofte treffer i biologisk aktive peptider og proteiner. Se Amphipathic helix motif: classes and properties av Jere P. Segrest, Hans de Loof, Jan G. Dohlman, Christie G. Brouillette og G.M. Anantharamaiah. PROTEINS: Structure Functions and Genetics 8:103-117

(1990). En amfipatisk alfaheliks er en alfaheliks som viser polare og ikke-polare faser orientert langs den langsgående aksen av heliksen. En spesifikk fordeling av ladede residier finnes langs den polare siden. Amfipatiske helikser som definert, er komplementære for polare/ikke-polare interfaser av hydrert bulk-fosfolipid; disse lipid-assosieringsdomenene har blitt postulert til å samhandle med fosfolipidet ved partielt å senke seg selv i interfasen mellom fettacylkjedene og de polare hovedgruppene. Jere P. Segrest. Febs letters 1976, 69 (1): 111-114.

Betegnelsen "peptid" og "protein" kan bli brukt omhverandre heri. Videre kan peptid-analogende fra oppfinnelsen være peptider, proteiner eller ikke-peptider, dvs. peptidoetterligninger. Alle analogene er imidlertid fortrinnsvis bioaktive molekyler.

Betegnelsen "lipid" som brukt heri inkluderer - men er ikke begrenset til - naturlige syntetiske fosfolipider. Videre kan betegnelsene "lipid" og "fosfolipid" bli brukt omhverandre heri.

4. KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: Superose 6-kromatografi av HDL fremstilt ved tetthetsultrasentrifugering fra 200 ul humant serum. Figur 2 (nederst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 1:1 (vekt:vekt). Figur 2 (øverst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 2:1 (vekt:vekt). Figur 3 (nederst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 3:1 (vekt:vekt). Figur 3 (øverst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 4:1 (vekt:vekt). Figur 4 (nederst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 5:1 (vekt:vekt). Figur 4 (øverst): Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 7,5:1 (v:v). Figur 5: Superose 6-kromatografi av (DPPC: peptid 1) komplekser fremstilt ved en ratio på 10:1 (vekt:vekt). Figur 6: Superose 6-kromatografi av <14>C-merket peptid 1-komplekser ved Ri = 3:1. Figur 7: Superose 6-kromatografi av <14>C-merket peptid 1-komplekser ved Ri = 4:1.

Figur 8: Superose 6-kromatografi av <14>C-merket peptid 1-komplekser ved Ri = 5:1.

5. DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKKEDE UTFØRELSESFORMER

De amfipatiske alfaheliske peptider eller proteiner, lipidbindende proteiner, ApoA-I-agonistpeptider, apoproteinanaloger og dets like, som er nyttige i den foreliggende oppfinnelse, kan bli syntetisert eller fremstilt ved å bruke enhver teknikk kjent innen fagfeltet. Stabile fremstillinger av peptider som har en lang holdbarhetstid, kan bli fremstilt ved lyofilisering av peptidene - enten for å fremstille bulk for reformulering, eller for å fremstille individuelle alikvoter eller dose-enheter som kan bli rekonstituert ved rehydrering med sterilt vann eller en egnet steril buffret oppløsning før administrering til et individ.

Av det oppfinneren kjenner til, er denne oppfinnelsen det første tilfelle av en metode for samlyofilisering av et amfipatisk alfahelisk peptid eller en peptidanalog med et lipid for å danne en blanding som kan bli rekonstituert i et sterilt peptid/lipidkompleks.

I visse utførelsesformer kan det være foretrukket å formulere og administrere ApoA-I-analog(er) inklusive - men ikke begrenset til - ApoA-I-agonister, i et peptid-lipidkompleks. Denne tilnærmingen har flere fordeler, ettersom komplekset skulle ha en økt halveringstid i sirkulasjonen, spesielt når komplekset har en lignende størrelse og tetthet til HDL-klassen av proteiner, spesielt pre-beta-HDL-populasjonene. HDL-klassen av lipoproteiner kan bli delt i et antall av subklasser basert på slike karakteristika som stør-relse, tetthet og elektroforetisk mobilitet. Noen eksempler, for å øke størrelse, er micelle-pre-beta HDL med diameter 50 til 60 Ångstrøm, discoidal HDK av intermediat størrelse, dvs. med en masse på 65 kDa (omtrent 70 Ångstrøm), sfærisk HDL3 eller HDL2 med diamter på 90 til 120 Ångstrøm. (J. Kane, 1996, i V. Fuster, R. Ross og E. Topol [red.] Atherosclerosis and Coronary Artery Disease, s. 99; A. Tall og J. Breslov, ibid., s. 106; Barrans et al., Biochemica et Biophysica Acta 1300, s. 73.85; og Fielding et al., 1995, J. Lipid Res 36, s. 211-228). Peptid/lipidkomplekser av mindre eller større størrelser enn HDL, kan imidlertid også bli dannet ved oppfinnelsen.

Peptid-lipidkompleksene fra foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt som stabile fremstillinger som har en lang holdbarhetstid, ved samlyofiliseringsprosedyren beskrevet nedenfor. Lyofiliserte peptid-lipidkomplekser kan bli brukt for å fremstille bulk-medikamentmateriale for farmasøytisk reformulering, eller for å fremstille individuelle ahkvoter eller dose-enheter som kan bli rekonstituert ved rehydrering med sterilt vann eller en egnet buffret oppløsning forut for administrering til et individ.

Søkerne har utviklet en enkel metode for fremstilling av peptid eller protein-(fosfo)-lipid-komplekser som har karakteristika lik HDL. Denne metoden kan bli brukt for å fremstille ApoA-I-peptid-lipidkomplekser, og har de følgende fordelene: 1) De fleste eller alle av de inkluderte ingrediensene er brukt for å danne de designede kompleksene og således unngå sløsing av utgangsmaterialet som er vanlig med de andre metodene. 2) Lyofiliserte forbindelser blir dannet som er svært stabile under lagring. De resulterende kompleksene kan bli rekonstituert umiddelbart før anvendelse. 3) De resulterende kompleksene krever vanligvis ikke ytterligere rensning etter dannelse eller før anvendelse. 4) Toksiske forbindelser, inklusive detergenter slik som cholat, er unnggått. Dessuten kan produksjonsmetoden lett bli skalert opp og er egnet for GMP-fremstilling (dvs. i et endotoksinfritt miljø).

I samsvar med den foretrukkede metoden, blir peptidet og lipidet kombinert i et oppløsningsmiddelsystem som samoppløser hver ingrediens. På denne måten må oppløsningsmiddelparene bli nøyaktig utvalgt for å sikre samoppløselighet av både det amfipatiske peptidet og det hydrofobe lipidet. I én utførelsesform kan proteinet(ene) eller peptidet(ene) som skal inkorporeres i partiklene, bli oppløst i et vandig eller organisk oppløsningsmiddel eller blanding av oppløsningsmidler (oppløsningsmiddel 1). (Fosfo)lipidkomponenten blir oppløst i et vandig eller organisk oppløsningsmiddel eller blanding av oppløsningsmidler (oppløsningsmiddel 2), som er blandbar med oppløsningsmiddel 1, og de to oppløsningene blir kombinert. Alternativt blir (fosfo)lipidkomponenten oppløst direkte i peptid (protein) oppløsningen. Alterntivt kan peptidet og lipidet bli inkorporert inn i et samoppløsningssystem, dvs. en blanding av blandbare oppløsningsmidler. Avhengig av de lipidbindende egenskapene til peptidet eller proteinet, vil de som kjenner fagfeltet erkjenne at forsterket - eller til og med fullstendig - oppløselighet (og/eller forøket blanding) kan være nødvendig forut for lyofilisering; derfor kan oppløsningsmidlene bli valgt tilsvarende.

En egnet proporsjon av peptid (protein) til lipider blir først bestemt empirisk, slik at de resulterende kompleksene utviser de egnede fysiske og kjemiske egenskapene. Vanligvis - men ikke alltid - betyr dette tilsvarende i størrelse som HDL2 eller HDL3. Lipid til protein/peptid molare forhold skulle være i området på fra omtrent 2 til omtrent 200, og fortrinnsvis 5 til 50, avhengig av den ønskede typen av komplekser. Eksempler på slike størrelsesklasser av peptd/lipid eller protein/lipidkomplekser inkluderer - men er ikke begrenset til - micellære eller discoidale partikler (vanligvis mindre enn HDL3 eller HDL2), sfæriske partikler av samme størrelse som HDL2 eller HDL3 og større komplekser som er større enn HDL2. HDL som blir brukt av oss som en standard under kromatografi (figur 1), er hovedsakelig sfæriske modne HDL2. Pre-^1 HDL er micellære komplekser av apolipoprotein og få molekyler av fosfolipider. Pre-^2 HDL er diskoidale komplekser av apolipoprotein og molekyler av fosfolipider. Jo flere lipider (triglyserider, kolesterol, fosfolipider) som blir inkorporert, jo større vil HDL bli og dets form bli modifisert. (Pre-^1 HDL (micellært kompleks) => Pre-^2 HDL (discoidalt kompleks) => HDL3 (sfærisk kompleks) => HDL2 (sfærisk kompleks).

Straks et oppløsningsmiddel er valgt og peptidet og lipidet har blitt inkorporert, blir den resulterende blandingen frosset og lyofilisert til tørrhet. Noen ganger blir et ytterligere oppløsningsmiddel tilsatt til blandingen for å lette lyofiliseringen. Dette lyofiliserte produktet kan bli lagret i lange perioder og vil forbli stabilt.

I arbeidseksemplene beskrevet infra, ble peptidet 1 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:l) og (fosfo)lipid oppløst separat i metanol, kombinert og deretter blandet med xylen før lyofilisering. Petidet og lipidet kan begge bli tilsatt til en blanding av de to oppløsningsmidlene. Alternativt kan en oppløsning av peptidet oppløst i metanol, bli blandet med en oppløsning av lipid oppløst i xylen. Det må utvises forsiktighet for å unngå utsalting av peptidet. Den resulterende oppløsningen som inneholder peptidet og lipidet samoppløst i metanol/xylen, blir lyofilisert for å danne et pulver.

Det lyofiliserte produktet kan bli rekonstituert for å erverve en oppløsning eller suspensjon av peptid-lipidkomplekset. Det lyofiliserte pulveret blir rehydrert med en vandig oppløsning til et egnet volum (ofte omtrent 5 mg peptid/ml som er passende for intravenøs injeksjon). I en foretrukket utførelsesform blir det lyofiliserte pulveret rehydrert med fosfatbuffret saltvann eller en fysiologisk saltvannsoppløsning. Blandingen må ristes eller vortexsentrifugeres for å lette rehydrering, og i de fleste tilfeller bør rekonstitusjonstrinnet bli utført ved en temperatur som er lik eller høyere fasetransisjonstemperaturen™ til lipidkomponenten til kompleksene. Innen minutter resulterer dette i en oppløsning av rekonstituerte lipid-proteinkomplekser (en klar oppløsning når kompleksene er små).

En ahkvot av den resulterende rekonstituerte fremstillingen kan bli karakterisert for å bekrefte at kompleksene i fremstillingen har den ønskede størrelsesdistribusjon, for eksempel størrelsesdistnbusjonen til HDL. Gelfiltreringskromatografi kan bli brukt til dette. I arbeidseksemplene beskrevet infra, ble et Pharmacia Superose 6 FPL-gelfil-trerings-kromatografisystem brukt. Eluanten som ble brukt inneholder 150 mM NaCl i deionisert vann. Et typisk prøvevolum er 20 til 200 mikroliter av komplekser som inneholder 5 mg peptid/ml. Kolonnestrømningsraten er 0,5 ml/min. En serie av proteiner av kjent molekylvekt og Stokes' diameter så vel som humant HDL, blir brukt som standarder for å kalibrere kolonnen. Proteinene og lipoproteinkompleksene ble målt ved absorbans eller spredning av lys med bølgelengde 254 eller 280 nm.

Oppløsningsmidlene som kan bli brukt ifølge metoden fra foreliggende oppfinnelse, inkluderer - men er ikke begrenset til - ikke-polare, polare, aprotiske og protiske organiske oppløsningsmidler og likså slike som etanol, metanol, cykloheksan, 1-butanol, isopropylalkohol, xylen, THF, eter, metylenkloridbenzen og kloroform. Oppfinnelsen inkluderer også anvendelsen av oppløsningsmiddelblandinger så vel som enkle oppløsningsmidler. Videre kan, før bruk i foreliggende metoder, de organiske oppløsningsmidlene bli tørket for å fjerne vann: hydrerte oppløsningsmidler eller vann kan imidlertid bli brukt med visse lipider, peptider eller proteiner. Med andre ord kan vann bli et egnet oppløsningsmiddel, eller hydrerte oppløsningsmidler eller organiske oppløsningsmidler/vannblandinger bli brukt. Hvis vann blir brukt, må det imidlertid bli detergentfntt. Som nevnt ovenfor er oppløsningsmidlene fortrinnsvis av den reneste kvalitet (for å unngå konsentrering av urenheter etter lyofilisering), og oppløsningsmidlene bør være saltfrie og fri for pertikler. Oppløsningsmidlene trenger imidlertid ikke å være sterile, da det resulterende produktet kan bli sterilisert før, under eller etter lyofilisering, i samsvar med kjente teknikker innen farmasi, slik som de beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. og 18. utgave, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980 og 1990) og i United States Pharmacopeia/National Formulary (USP/NF) XVII.

Lipidene som kan bli brukt i samsvar med metoden fra foreliggende sammensetning, inklusive - men ikke begrenset til - naturlige og syntetiserte (syntetiske) lipider og fosfolipider inklusive små alkylkjede-fosfolipider, eggfosfatidylkolin, soyabønnefosfati-dylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin, dimyristoylfosfatidylkolin, distearoylfosfatidylkolin-1 -myristoyl-2-palmitoylfosfatidylkolin, 1 -palmitoyl-2-myristoylfosfatidylkolin, 1 -palmitoyl-2-stearoylfosfatidylkolin, 1 -stearoyl-2-palmitoylfosfatidylkolin, dioloylfosfatidylkolin, dioleofosfatidyletanolamin, dilauroylfosfatidylglyserol, fosfatidylkolin, fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol, sfingomyelin, sfingolipider, fosfatidylglyserol, difosfatidylglyserol, dimyristoylfosfatidylglyserol, dipalmitoylfosfatidylglyserol, distearoyl fosfatidylglyserol, dioloylfosfatidylglyserol, dimyristoylfosfatidinsyre, dipalmitoylfosfatidinsyre, dimyristoylfosfatidyletanolamin, dipalmitoylfosfatidyletanolamin, dimyristoylfosfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserin, hjernefosfatidylserin, hjernesfingomyelin, dipalmitoylsifngomyelin, distearoylsfingomyelin, fosfatidinsyre, galaktocerebrosid, ganghosider, cerebrosider, dilaurylfosfatidylkolin, (l,3)-D-manno-syl-(l ,3)diglyserid, aminofenylglykosid, 3-kolesteryl-6'-(glykosyltio)heksyleterglyko-lipider og kolesterol og dets derivater.

Det er foretrukket, selv om det ikke er nødvendig i hvert tilfelle, at presipitatene bør bli løst opp eller fjernet forut for blanding eller omrøring av lipidet og peptidoppløsningene eller forut for lyofiliseringen.

Metoden kan bli brukt for produksjon i stor skala av peptid/lipidkomplekser, amfipatiske peptid/(fosfo)lipidkomplekser, lipidbindingsprotein/(fosfo)lipidkomplekser og/eller ApoA l-peptid-analog/(fosfo)lipidkomplekser. Det lyofiliserte materialet kan bli fremstilt for bulk-fremstillinger eller alternativt kan den blandede peptid/hpidoppløsningen bli porsjonert i mindre beholdere (for eksempel enkeldose-enheter) forut for lyofilisering, og slike mindre enheter kan blir fremstilt som sterile, enkle doseformer.

De vakuumtørkede sammensetningene fra foreliggende oppfinnelse kan bli tilveiebragt i enkle doser eller multiple dosebeholdere ved å aseptisk fylle egnede beholdere med den sterile pre-vakuumtørkede oppløsning til et fastsatt innhold; fremstilling av de ønskede vakuumtørkede sammensetningene; og deretter hermetisk forsegle den enkle eller multiple dosebeholderen. Det er hensikten at disse fylte beholderne vil tillate rask oppløsning av den tørkede sammensetningen ved rekonstituering med egnede sterile diluenter in situ for å gi en egnet steril oppløsning av ønsket konsentrasjon for administrering. Som brukt heri betyr betegnelsen "egnede beholdere" en beholder som er istand til opprettholde et sterilt miljø, slik som et rør, som er istand til å avlevere et vakuumtørket produkt hermetisk forseglet med en stopperinnretning. I tillegg innebærer egnede beholdere egnet størrelse, tatt i betraktning volumet av oppløsningen som følger av rekonstituering av den vakuumtørkede sammensetningen, og egnetheten av beholdermateriale, generelt Type I glass. Stopperinnretningen som anvendes, for eksempel sterile gummilukkere eller noe ekvivalent, skal forstås å være en som tilveiebringer den tidligere nevnte forsegling, men som også tillater inngang for å introdusere en diluent, for eksempel sterilt vann for injeksjon, USP, normalt saltvann, USP, eller 5% Dextrose i vann, USP, for rekonstitueringen av den ønskede oppløsningen. Disse og andre aspekter for egnethet av beholdere for farmasøytiske produkter, slik som de fra foreliggende oppfinnelse, er velkjente innen fagfeltet for de som praktiserer farmasi. I spesifikke utførelsesformer kan størrelser på produktenhetsdoser være i et område fra omtrent 10 mg til omtrent 2 g av peptidet, fortrinnsvis i området fra omtrent 100 mg til 1 g, og ved en konsentrasjon etter rekonstituering på omtrent 1 til 50 mg/ml, fortrinnsvis omtrent 2 til 25 mg/ml.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør fremstilling av protein eller peptid/lipidkomplekser for parenteral administrering inklusive intravensøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær og bolusinjeksjoner til dyr eller mennesker, eller for oral, rektal, muskøs (for eksempel munnhule) eller topisk administrering til dyr eller mennesker eller for in vi/ro-ekspeirmentering.

Det lyofiliserte pulveret fremstilt ved metoden ifølge oppfinnelsen, kan bli rehydrert umiddelbart før injeksjon, eller alternativt kan det lyofiliserte pulveret bli administrert direkte. Det lyofiliserte pulveret inkluderer - men er ikke begrenset til - lipid og peptider som er istand til å danne komplekser i form av vesikler, liposomer, partikler som inkluderer sfæriske eller discoidale partikler, miceller og dets like. For å rekonstituere eller rehydrere det lyofiliserte pulveret, blir en oppløsning valgt avhengig av den ønskede sluttbruken. For farmasøytisk anvendelse, kan enhver steril oppløsning bli brukt.

Dessuten blir bufrede oppløsninger foretrukket for visse anvendelser, og disse inkluderer - men er ikke begrenset til - fosfat, citrat, tris, barbital, acetat, glycin-HCl, suksinat, cacodylat, borinsyreboraks, ammediol og karbonat.

Metoden kan også være egnet for lagring av forbindelser som på annen måte er ustabile eller uoppløselige i fravær av lipider.

Metoden kan bli brukt for formuleringen av produkter for behandling eller forebygging av humane sykdommer, inklusive slike anvendelser som sam-presentering av antigener i vaksiner, behandling eller forebygging av dyslipoproteinemier inklusive - men ikke begrenst til - hyperkolesterolemi, hypertriglyceridemi, lav HDL og apolipoprotein A-l-svikt, kardiovaskulær sykdom slik som atherosklerose, septisk sjokk eller infeksjonsykdommer.

Fremgangsmåten kan bli brukt for fremstilling av komplekser som kan bli brukt som bærere for medikamenter, som vektorer (for å avlevere medikamenter, DNA, gener) for eksempel til leveren eller til ekstrahepatiske celler, eller som oppsamlere for å fange opp toksin (for eksempel pesticider, LPS etc). Alternativt kan metoden bli brukt for å fremstille komplekser for in vitro- analysesystemer eller for anvendelse i avbildingsteknologi.

I spesifikke utførelsesformer kan metoden bli brukt for fremstillingen av ApoA-I-analog (inklusive men ikke begrenset til agonister) komplekser som kan bli brukt i in vitro-diagnostiske analyser og som markører for HDL-populasjoner og subpopulasjoner. I andre spesifikke utførelsesformer kan ApoA-I-agonistkomplekser bli brukt for immun-analyser eller for avbildingsteknologi (for eksempel CAT-scanninger, MRI-scanninger).

6. EKSEMPEL: FREMSTILLING AV PEPTID-LIPIDKOMPLEKS VED SAM-LYOFILISERINGSTILNÆRMING

Følgende protokoll ble utnyttet for å fremstille peptid-lipidkomplekser.

Peptid 1 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO:l) (22,4 mg) ble oppløst i metanol ved en konsentrasjon på 3,5 mg/ml ved inkubering i flere minutter og blandet ved vortex-sentrifugering periodisk. Til denne oppløsningen ble det tilsatt dipalmitoylfosfatidylkolin (DPPC) i metanol (100 mg/ml utgangsoppløsning) slik at den finale ratio av DPPC/peptid var 2,5:1 (vekt/vekt). Denne oppløsningen ble blandet ved vortex-sentri fugering.

Xylen ble tilsatt til oppløsningen til en sluttkonsentrasjon på 36%. Alikvoter av den resulterende oppløsningen ble fjernet for senere analyse ved gelfiltreringskromatografi. Oppløsningene ble frosset i flytende nitrogen og lyofilisert til tørrhet ved vakuum. En alikvot inneholdende 20 mg peptid 1 (SEQ ID NO:l) og 50 mg DPPC ble rehydrert i steril saltvannsoppløsning (0,9% NaCl), blandet og varmet til 41 °C i flere minutter inntil en klar oppløsning av rekonstituert peptid/fosfolipidkomplekser var resultatet.

6.1. EKSEMPEL: GELFILTRERING OG FOSFOLIPIDUTNYTTELSE

6.1.1. MATERIALER OG METODER

Med formålet å teste betingelser for fremstilling av komplekser, er det ofte beleilig å fremstille små mengder av komplekser for karakterisering. Disse fremstillingene inneholdt 1 mg av peptid og ble fremstilt som følger: 1 mg av peptid 1 (SEQ ID NO: 1) ble oppløst i 250 ul HPLC grad metanol (Perkin Eimer) i et 1,0 ml klart glassrør med kork (Waters #WAT025054). Oppløsning av peptidet ble hjulpet ved vortex-sentrifugering, iblant over en periode på 10 minutter ved romtemperatur. Etter denne tiden kunne en liten mengde uoppløst partikkelmateriale fortsatt sees, men dette hadde ingen innvirkning på resultatene. Til denne blandingen ble en alikvot inneholdende enten 1, 2, 3,4, 5, 7,5, 10 eller 15 mg DPPC (Avanti Polar Lipids, 99% renhet, produkt #850355) fra en 100 mg/ml utgangsoppløsning i metanol tilsatt. Volumet av blandingen ble bragt til 400 ul ved tilsetting av metanol, og blandingen ble ytterligere vortex-sentrifugert periodisk i en periode på 10 minutter ved romtemperatur. På dette tidspunktet kunne svært lite uoppløst materiale sees i rørene. Til hvert rør ble det tilsatt 200 ul xylen (Sigma-Aldrich 99% ren, HPLC-grad) og rørene ble vortex-sentrifugert i 10 sekunder hver. To små hull ble stukket i toppene til hvert rør med en 20 gauge sprøytenål, rørene ble frosset i 15 sekunder hver i flytende nitrogen, og rørene ble lyofilisert overnatt under vakuum. Til hver tube ble 200 ml 0,9% NaCl-oppløsning tilsatt. Rørene ble vortexsentrifugert i 20 sekunder hver. Ved dette tidspunktet fikk oppløsningene i rørene et svært melkeaktig utseende. Rørene ble deretter inkubert i et vannbad i 30 minutter ved 41°C. Oppløsningene i alle rørene ble da helt klart (dvs. som vann) med unntak av røret som inneholdt 15 mg DPPC, som fortsatt var melkeaktig.

For å bestemme om alle fosfolipidene som ble brukt i kompleksfremstillingene faktisk var tilstede i kolonnefraksjonene korresponderende til kromatogram-absorbanstoppene, ble kolonne-eluatet fra rekonstituerte peptid/lipidkomplekser samlet i 1 eller 2 ml fraksjoner, og fraksjonene ble analysert enzymatisk for fosfolipidinnhold med BioMerieux Phospolipides Enzymatique PAP 150 kit (#61491) i samsvar med instruksjonene som fulgte med fra forhandleren.

Fremstillingene av komplekser kan også bli utført i større skala. Et eksempel på én slik fremstilling er rapportert ovenfor. Disse kompleksene ble brukt i in vivo-eksperimenter.

6.2. RESULTATER AV KOMPLEKSKARAKTERISERING

Figur 1: Superose 6-kroamtografi av modent HDL2 fremstilt ved tetthetsultrasentrifugering fra 200 ul humant serum. Kromatograf viser absorbans ved 254 nm. Elueringsvolum = 14,8 ml, korresponderende til en Stokes' diameter på 108 Ångstrøm (se tabell 1). Figur 2 (nederst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en ratio av inkubering (Ri, definert som ratioen av totalt fosfolipid til totalt peptid i utgangsblandingen) av 1:1 (vekt/vekt) som beskrevet ovenfor (småskalafremstilling). Elueringsvolumer av absorbanstopper = 16,2 ml og 18,1 ml korresponderende til partikler fra Stokes' diameter 74 og 82 Ångstrøm, som er mindre enn HDL. 87% av fosfolipididet påsatt kolonnen, ble gjenvunnet i fraksjonenene inneholdende absorbanstoppene (se tabell 1). Figur 2 (øverst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en Ri på 2:1 (vektvekt) som beskrevet ovenfor. Elueringsvolum av absorbanstoppen = 16,4 ml, (77 Ångstrøm), korresponderende til partikler mindre enn HDL. 70% av fosfolipidet som ble satt på kolonnen ble gjenvunnet i fraksjoner inneholdende absorbanstoppen (se tabell 1).

Firgur 3 (nederst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en Ri på 3:1 (vekt:vekt) som beskrevet ovenfor. Elusjonsvolum av absorbanstoppen = 16,0 ml (80 Ångstrøm) korresponderende til partikler som er mindre enn HDL. 79% av fosfolipidet som ble satt på kolonnen, ble gjenvunnet i fraksjonene inneholdende absorbanstoppen (se tabell 1). Figur 3 (øverst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en Ri av 4:1 (vekt:vekt) som beskrevet ovenfor. Elusjonsvolum av absorbanstoppen = 16.0 ml (80 Ångstrøm) korresponderende til partikler som er mindre enn HDL. 106% av fosfolipidet som ble satt på kolonnen, ble gjenvunnet i fraksjoner inneholdende absorbanstoppen (se tabell 1). Figur 4 (nederst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en Ri på 5:1 (vekt:vekt) som beskrevet ovenfor. Elusjonsvolumet av absorbanstoppen = 15.1 ml (104 Ångstrøm), korresponderende til partikler som er mindre enn HDL. 103% av fosfolipidet som ble satt på kolonnen, ble gjenvunnet i fraksjonene inneholdende absorbanstoppen (se tabell 1). Figur 4 (øverst): Superose 6 kromatografi av DPPC:peptid 1-komplekser fremstilt ved en Ri på 7,5:1 (vekt:vekt) som beskrevet ovenfor. Elueringsvolum av absorbanstoppen = 13,6 ml (134 Ångstrøm) korresponderende til partikler større enn HDL. 92% av fosfolipidet som ble satt på kolonnen ble gjenvunnet i fraksjonene inneholdene absorbanstoppene (se tabell 1). Figur 5: Superose 6 kromatografi av DPPC.petpid 1-komplekser fremstilt ved en ratio på 10:1 (vekt:vekt) som beskrevet ovenfor. Elueringsvolum av absorbanstoppen = 13,4 ml (138 Ångstrøm) var igjen korresponderende til partikler større enn HDL.

103% av fosfolipidet som var satt på kolonnen ble gjenvunnet i fraksjonene ved absorbanstoppene (se tabell 1).

Prøven inneholdende komplekser med 15:1 DPPC:peptid 1 (vekt:vekt) ble ikke utsatt for Superose 6-kromatografi fordi den var turbid, hvilket indikerer tilstedeværelse av store partikler.

For hver av de ovenfor nevnte eksperimentene ble ingen signifikant fosfolipid observert i noen fraksjon andre enn de som inneholder materiale som ble eluert med absorbanstoppene (se fig. 2.8). Dette indikerer at nesten alle fosfolipidene (innenfor eksperiment-elle feil av anaylsen) ble inkorporert i kompleksene. Eksperimentet viser at ved å variere den initielle ratio av fosfolipider til peptider, kan homoge komplekser av forskjellige størrelser (mindre eller større enn HDL) bli dannet.

6.3. KARAKTERISERING AV KOMPLEKSER SOM BRUKER

<14>C-MERKET PEPTID 1

Peptid-fosfolidkomplekser inneholdende <l4>C-merket peptid 1 (spesifikk aktivitet 159.000 DPM/mg peptid ved vekt, antatt 50% peptidinnhold) ble fremstilt ved kolyofilisering som beskrevet ovenfor. Fremstillingene inneholdt hver 1 mg peptid og 3, 4 eller 5 mg DPPC ved vekt. Etter rekonstituering ble kompleksene i 200 ul 0,9% NaCl,

20 ul (100 ug) av kompleksene satt på en Pharmacia Superose 6-kolonne ved å bruke 0,9% NaCl som den flytende fase ved en gjennomstrømningsrate på 0,5 ml/min. Etter en 5 ml forsinkelse (kolonne-vakuumvolum = 7,7 ml) ble 1 ml fraksjoner samlet opp. Alikvoter inneholdende 20 ul av fraksjonene ble analysert for fosfolipidinnhold ved å bruke BioMerieux enzymatisk analyse. Det gjenværende av hver fraksjon ble tellet i 3 minutter i en Wallach 1410 flytende scintillasjonsteller (Pharmacia) ved å bruke Easy Count-programmet. Resultatene av disse analysene er vist i fig. 6-8. Det kan sees at hovedmajoriteten av både fosfolipid og peptid blir gjenvunnet sammen i noen få fraksjoner med topper ved omtrent 16, 16 og 15 ml for komplekser fremstilt ved 3:1, 4:1 og 5:1 DPPC:peptidratioer, respektivt. UV-absorbansprofilene for disse prøvene indikerer at kompleksene som ble eluert fra kolonne ved volumer 15,1, 14,7 og 14,4 ml for komplekser fremstilt ved 3:1,4:1 og 5:1 DPPC:peptidratioer, respektivt (dødvolumet av røret mellom fraksjonsoppsamleren og UV-gjennomstrømningscellen er 1,3 ml, som forklarer en liten forskjell mellom elueringsvolumene som målt ved radioaktivitet/fosfolipid-analyse og UV-absorbans). Elusjonsvolumene korresponderer med Stoke's diameter på 106,114 og 120 Ångstrøm for 3:1,4:1 og 5:1 Ri-komplekser, respektivt.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et lyofilisert peptid/lipidprodukt, karakterisert ved at den omfatter lyofilisering av en solubilsert løsning som omfatter et peptid eller en peptidanalog som er i stand til å innta en amfipatisk konformasjon og et lipid, hvor nevnte lipid er løst i nevnte løsning uten hjelp av en detergent og hvor nevnte lyofiliserte produkt kan rehydreres for å danne et peptid/lipidkompleks.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptid er et protein.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptid er et lipidbindende protein.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptidanalog er en analog av ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III eller ApoE.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptid er en ApoA-I analog.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte lipid er et naturlig lipid, syntetisk lipid eller blandinger derav.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptid er et mettet peptid, umettet peptid eller blandinger derav.

8. Fremgangsmåte i følge krav 7, karakterisert ved at nevnte lipid er valgt fra gruppen bestående av eterfosfolipider, kortkjedet fosfolipider, kolesterol, kolesterolderivater, fosfatidylcholiner, fosfatidyletanolaminer, fosfatidylseriner, fosfatidylinositoler, sfingolipider, fosfatidylglyseroler, gangliosider og cerebrosider.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte lipid er selektert fra gruppen bestående av eggfosfatidylkolin, soyabønnefosfatidylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin, dimyristoylfosfatidylkolin, distearoylfosfatidylkolin, 1 -myristoyl-2-palmitoylfosfatidylkolin, 1 -palmitoyl-2-myristoylfosfatidylkolin, 1 -palmitoyl-2-stearoylfosfatidylkolin, 1 -stearoyl-2-palmitoylfosfatidylkolin, dioloylfosfatidylkolin, diolfosfatidyletanolamin, dilauroylfosfatidylglyserol, difosfatidylglyserol, dimyristoylfosfatidylglyserol, dipalmitoylfosfatidylglyserol, distearoylfosfatidylglyserol, dioloylfosfatidylglyserol, dimyristoylfosfatidinsyre, dipalmitoylfosfatidinsyre, dimyristoylfosfatidyletanolamin, dipalmitoylfosfatidyletanolamin, dimyristoylfosfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserin, sfingomyelin, dipalmitoylsfingomyelin, distearoylsfingomyelin, fosfatidinsyre, galaktocerebrosid, dilaurylfosfatidylkolin, (l,3)-D-mannosyl-(l,3)diglyserid, aminofenylglykosid og 3-kolesteryl-6'-(glykocyltio)heksyleterglykolipider, etherglykolipider og blandinger derav.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte lipid er et 3- kolesterlyl-6'-(glykosyltio)hexyl ether glykolipid.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at lipid:peptid molar ratio eller lipid:peptid analog molar ratio er 2:1 til 200:1.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at lipid:peptid molar ratio eller lipidrpeptid analog molar ratio er 2:1 til 50:1.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at lipid:peptid molar ratio eller lipid:peptid analog molar ratio er 5:1 til 50:1.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte løsning er fremstilt ved å anvende et organisk løsningsmiddel.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte lyofiliserte produkt er en farmasøytisk formulering.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at den ytterligere omfatter alikvotering av nevnte solubiliserte løsning til individuelle beholdere før lyofilisering, for å danne en farmasøytisk formulering som en enkel enhetsdoseform.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den ytterligere omfatter sterilisering av nevnte produkt forut for, under og etter lyofilisering.