NO327983B1 - Anvendelse av GABA analoger og et ikke-steroidalt anti-inflammatorisk legemiddel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og behandling av gastrointestinal skade - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en gamma-amino smørsyre (GABA) analog valgt fra gabapentin og pregabalin og et ikke-steroidalt anti-inflammatorisk legemiddel for fremstilling av et medikament for å forebygge viskeral og gastrointestinal skade, så som gastriske sår, for behandling av gastrointestinale lidelser så som inflammatoriske tarmlidelser (IBD), funksjonelle tarmlidelser (FBD), innbefattende dyspepsi og annen viskeral smerte.

Ikke-steroidale anti-inflammatoriske legemidler (NSAID) er de hyppigst foreskrevne legemidlene for behandling av smerte forbundet med osteoarteritt og mange andre muskel-skjelett- og inflammatoriske lidelser. I USA skrives det ca.

100 millioner resepter hvert år for å tilveiebringe effektiv lettelse fra smerte og for behandling av inflammatoriske sykdommer. Vanlige anvendte NSAID'er innbefatter sulindak, naproxen, idometacin, mefenaminsyre, diklofenak, fenoprofen og diflunisal.

Imidlertid foreligger det tydelige tegn på at NSAID'er har hyppige, alvorlige

og dyre toksiske bivirkninger i gastrointestinalkanalen. Disse omfatter mild dyspepsi, gastritt, peptisk sårsykdom, såvel som mer alvorlige gastrointestinale komplikasjoner, så som blødning og perforasjon, hvilket i noen tilfeller leder til signifikant morbiditet, og i mindre grad, mortalitet. Alvorlige Gl-komplikasjoner grunnet anvendelse av NSAID representerer den største livstrusselen for pasienter med bindevevssykdom, nest etter den primære sykdommen og dens komplikasjoner. Tilsvarende gastrointestinal skade forårsakes ved inntak av alkohol. I realiteten er en tilstand kjent som etanolabstinenssyndrom vanlig opptredende når langvarig etanolinntak termineres. I tillegg til gastrointestinal skade resulterer dette syn-dromet ofte i tremorer, angst, konvulsjoner, hallusinasjoner og forvirring.

Andre vanlige opptredende gastrointestinale lidelser omfatter inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) og funksjonelle tarmsykdommer (FBD), omfattende dyspepsi. Disse Gl-lidelsene omfatter en lang rekke sykdomstilstander som i dag bare kan kontrolleres i moderat grad, innbefattende Crohns sykdom, ileitt, isjemisk tarmsykdom, og ulserativ kollitt, så vel som IBD, irritabel tarmsyndrom, dyspepsi og gastro-isofagalrefluks for FBD, og andre former for viskeral smerte.

Gamma-aminosmørsyre er blitt vist å aktivere gastrisk-tilkommende nerver, som i sin tur er vist å delta i gastriske forsvarsmekanismer. Det er nå oppdaget at GABA analoger i dramatisk grad reduserer den gastrointestinale skaden forårsaket av legemidler og alkohol. GABA analogene behandler også tilstandene som skylles etanolabstinenssyndrom, og Gl lidelser kjennetegnet som IBD og IBS. Alt som er påkrevet for å forhindre gastrointestinal skade og å behandle IBD, IBS og alkoholisme ifølge foreliggende oppfinnelse er å administrere til et objekt som har behov for behandling en effektiv mengde av en GABA analog.

Flere GABA analoger er kjente. Gabapentin, en syklisk GABA analog, er nå kommersielt tilgjengelig og omfattende anvendt klinisk for behandling av epilepsi og neuropatisk smerte. Slike forbindelser er beskrevet i US patent 4 024 175. En annen serie av GABA analoger som er anti-krampe midler er beskrevet i US patent 5 563 175.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en GABA-analog valgt fra gabapentin og pregabalin og farmasøytiske akseptable salter derav og et ikke-steroidalt anti-inflammatorisk legemiddel, for fremstilling av et medikament for forebyggelse og behandling av gastrointestinal skade og lidelser.

En fremgangsmåte for forebyggelse og behandling av gastrointestinal skade og- sykdomstilstander vil innbefatte administrering til et objekt som har behov for behandling av en effektiv mengde av GABA analog. En syklisk aminosyre forbindelse av formel I

hvor R: er hydrogen eller lavere alkyl og N er et helt tall fra 4 til 6, og de farma-søytisk akseptable salter derav kan anvendes.

I foreliggende oppfinnelse anvendes en forbindelse av formel I hvor Ri er nitrogen og N er 5, hvilken forbindelse er 1-(aminometyl)-cykloheksaneddiksyre, generisk kjent som gabapentin. For andre GABA analoger ifølge formel I kan den sykliske ringen være substituert, for eksempel med alkyl, så som metyl eller etyl. Typiske forbindelser innbefatter (1-aminometyl-3-metylcykloheksyl)eddiksyre, (1-aminometyl-3-metylcyklopentyl)eddiksyre, og (l-aminometyl-3,4-dimetylcyklopentyl)eddiksyre.

En annen GABA analog har formel II

hvori

Ri er en rettkjedet eller forgrenet alkyl med fra ett til 6 karbonatomer, fenyl eller cykloalkyl på fra 3 til 6 karbonatomer;

R2 er hydrogen eller metyl; og

R3er hydrogen, metyl eller karboksyl.

I foreliggende oppfinnelse anvendes (S)-3-(aminometyl)-5-metyl-heksansyre, nå generisk kjent som pregabalin, så vel som CI-1008.

Som angitt ovenfor anvendes en GABA analog valgt fra gabapentin og pregabalin. En GABA analog er enhver forbindelse avledet fra, eller basert på, GAMA-amino smørsyre. Forbindelsene er lett tilgjengelige, enten kommersielt, eller ved syntetisk metodologi som er velkjent for fagfolk innen organisk kjemi. Sykliske aminosyrer av formel I er beskrevet i US patent 4 024 175. GABA analogene av formel II er beskrevet i US patent 5 563 175.

Alt som er påkrevet for å forebygge og behandle gastrointestinal skade og/lidelser ifølge foreliggende oppfinnelse er å anvende en GABA analog i en mengde som er effektiv for å forhindre eller behandle skadetilstanden, det vil si for å overvinne effektene av en NSAID eller alkohol, eller for å kontrollere IBD og IBS. Etanolabstinenssyndrom og generell alkoholisme kan behandles. Den effektive mengden av GABA analog som anvendes vil generelt være fra ca.1 til ca. 300mg per kilo kroppsvekt hos objektet. Typiske doser vil være fra ca. 10 til ca. 5000mg per dag for et voksent objekt av normal vekt.

Typiske "gastrointestinale skade"-tilstander forårsaket ved anvendelse av NSAID omfatter dyspepsi, gastritt, peptiske sår, så vel som gastrointestinal blød-ning og perforasjon. Ytterligere effekter av etanolabstinenssyndrom omfatter tremor, angst og konvulsjoner. Typiske IBD tilstander omfatter Neitt, ulcerativ kolitt og Crohns sykdom.

Farmasøytiske preparater av forbindelsen som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse eller dens salter fremstilles ved å formulere den aktive forbindelsen i enhetsdose form med en farmasøytisk bærer. Noen eksempler på enhetsdoseformer er tabletter, kapsler, piller, pulvere, vandige og ikke-vandige orale oppløsninger og suspensjoner, og parenterale oppløsninger pakket i beholdere inneholdende enten en eller et større antall doseringsenheter og som er i stand til å underoppdeles i individuelle doser. Noen eksempler på egnede farma-søytiske bærere, innbefattende farmasøytiske fortynningsmidler, er gelatinkapsler; sukker så som laktose og sukrose; stivelse så som maisstivelse og potetstivelse, cellulosederivater så som natrium karboksymetylcellulose, etylcellulose, og celluloseacetatftalat; gelatin; talk; stearinsyre; magnesiumstearat; vegetabilske oljer så som peanøttolje, bomullsfrøolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og olje av teobroma; propylenglykol, glyserol, sorbitol; polyetylenglykol; vann; agar; algin-syre; isotonisk saltvannsoppløsning, og fosfatbufferoppløsninger; så vel som andre kompatible stoffer som normalt anvendes i farmasøytiske preparater. Preparatene kan også inneholde andre komponenter så som fargemidler, smaks-midler og/eller konserveringsmidler. Disse materialene anvendes, om de er til stede, i relativt små mengder. Preparatene kan, om ønsket, også inneholde andre terapeutiske midler. For anvendelser ved bekjempelse av de gastrointestinale effektene av NSAID'er kan GABA analogene administreres alene i enhetsdoseform, eller i kombinasjon med NSAID som anvendes for den spesielle pasienten.

Prosentandelen av den aktive bestandelen i de ovenfor nevnte preparatene kan varieres innenfor vide grenser, men for praktiske formål er den fortrinnsvis til stede i en konsentrasjon på minst 10% i et fast preparat og minst 2% i et primært flytende preparat. De mest tilfredsstillende preparatene er de hvori en langt høyere andel av den aktive bestandelen er til stede, for eksempel fra 10 til 90 vekt%.

Administreringsmåter av den aktuelle forbindelsen eller dens salter er oralt eller parenteralt. For eksempel er en nyttig intravenøs dose mellom 5 og 50mg og en nyttig oraldose er mellom 20 og 800mg. Doseringen er innenfor doseringsom-rådet anvendt ved behandling av gastrointestinale sykdommer så som sår og IBS, eller som diktert av pasientens behov som vurdert av legen.

En enhetsdoseform av GABA-analogen som anvendes i foreliggende oppfinnelse kan også innbefatte andre forbindelser som er nyttige ved behandlingen av gastrointestinale lidelser.

Fordelene ved å anvende gabapentin og pregabalin, i foreliggende oppfinnelse, omfatter den relativt ikke-toksiske naturen av forbindelsen, den enkle fremstillingen, det faktum at forbindelsene er godt tålbare, og enkelheten ved IV og oraladministrering av legemidlene.

Videre metaboliseres legemidlene ikke i kroppen i omfattende grad. Objektene som her anvendes er pattedyr, innbefattende mennesker.

Preparatet som anvendes i oppfinnelsen omfatter et NSAID (ikke-stereoidalt anti-inflammatorisk legemiddel) sammen med en GABA analog valgt fra gabapentin og pregabalin. NSAID vil være til stede i en anti-inflammatorisk mengde, fortrinnsvis noe mindre enn den som normalt anvendes, og GABA analogen vil være til stede i en cytobeskyttende mengde, nemlig en mengde som vil være effektiv for forebyggelse eller reduksjon av den gastrointestinale skaden som ellers forårsakes av NSAID. Generelt vil NSAID være tilstede for doser på ca. 10 til ca. 500mg, og GABA analogen vil være til stede ved ca. 1 til ca. 1500mg. Hvilket som helst NSAID kan kombineres med hvilken som helst GABA analog ifølge foreliggende oppfinnelse. Foretrukne NSAID'erfor anvendelser i preparatene omfatter sulindak, naproksen, indometacin, mefenaminsyre, diklofenac, fenoprofen, diflunisal, etodolak, ibuprofen, piroksikam, acetylsalesylsyre, oksaprosin og bromfenak. De fleste av NSAID'ene som anvendes er kommersielt tilgjengelige, generelt som salter så som kalsium, natrium eller kalium, for eksempel fensprofen kalsium og bromfenak natrium. Spesielt foretrukne kombinasjoner omfatter pregabalin eller gabapentin, sammen med naproksen natrium eller ibuprofen. Preparatene kan inneholde vanlige farmasøytiske hjelpestoffer så som de som er beskrevet ovenfor. Evnen av GABA analoger til å behandle gastrointestinale lidelser ifølge foreliggende oppfinnelse er fastslått i dyremodeller for induserte gastriske lesjoner og alkoholisme. Figur 1 viser effekten av gabapentin på gastriske lesjoner forårsaket ved indometasin. Figur 2 viser effekten av gabapentin på behandlingsresponser etter abstinens ved kronisk alkoholbehandling. Figur 3 viser effekten av gabapentin på hukommelse og døsighet i dyr som mottar kronisk etanolbehandling. Figur 4 viser effekten av gabapentin, CI-1008 (pregabalin) og morfin på tarmalodynia. Figur 5 viser effekten av gabapentin og CI-1008 på tarmsmerteterskel i rotter.

EKSEMPEL 1

Gabapentin ble vurdert i dyr for å bestemme dets evne til å forebygge gastriske lesjoner som ellers forårsakes as indometacin.

Sprague-Dawley hannrotter med vekt 240 til 250g ble fastet i 24 timer og gitt fri tilgang til vann før forsøket. Alle forsøkslegemidler ble gitt intragastrisk. Rotter ble forbehandlet med forskjellige doser av gabapentin med doser på 40

til 60mg. 30 minutter senere ble indometacin (25mg/kg) administrert. En annen gruppe av rotter fikk 10mg gabapentin to ganger, med 3 timers mellomrom, etterfulgt av indometacin administrering. 3 timer etter indometacin behandling ble rottene avlivet og gastriske lesjoner ble bedømt. Graden av lesjonene ble bestemt ved å måle kvadratarealet (m<2>) av synlige lesjoner.

Resultat:

1. Indometacin forårsaket alvorlig gastrisk blødningsskade; skadearealene ble målt til 42,6 + 5.2mm2 (middelverdi + standard avvik). 2. Gabapentin forbehandling reduserte signifikant indometacin-indusert gastrisk skade. Den gastriske lesjonen med forskjellige doser av gabapentin forbehandling etter indometacin ble målt: 22,3 + 2,8mm2 med 40mg, 16,5 + 2,2mm<2 >med 60mg/kg, og 4,2 + 0,39mm<2> med 10mg to ganger. 3. Gabapentin forbehandling reduserte også gastrisk blødning i dramatisk grad.

Ovenstående data er presentert i figur 1, hvor den første søylen er kontroll (dyr behandlet med indometacin alene); søyle 2 er for dyr behandlet med en dose på 40mg gabapentin; søyle 3 er for dyr dosert en gang med 60mg gabapentin; og søyle 4 er for dyr dosert to ganger med 10mg gabapentin.

EKSEMPEL 2

For å bestemme effekten av gabapentin på etanolinduserte gastriske lesjoner ble rotter forbehandlet med 1ml 70% vandig etanol (volum/volum), etterfulgt av gabapentin ved en dose på henholdsvis 40 og 60mg. En annen gruppe rotter ble forbehandlet ved 20mg gabapentin tilført to ganger, med 3 timers mellomrom, etterfulgt av etanoladministrering. 30 minutter senere ble alle rottene avlivet og gastriske lesjoner ble bedømt.

Resultat:

1. 70% etanol induserte signifikant gastrisk skade. Skadearealet målte 41,9 + 3,3,7mm<2>. 2. Gabapentin forbehandling reduserte etanolindusert gastrisk skade. Med to doser på 20mg gabapentin forbehandling målte skadearealet 2,1 + 0,3mm<2>. Med 40 og 60mg gabapentin forbehandling målte skadearealet henholdsvis 24,4 + 3,5mm2 og 18,7 + 2,2mm<2>.

EKSEMPEL 3

Den følgende testen i rotter ble utført for ytterligere å fastslå evnen av gabapentin og pregabalin til å redusere gastrointestinal skade forårsaket av NSAID'er.

Dyr: CD-Sprague-Dawley hannrotter (132-202g) ble mottatt og huset i et rom med kontrollert temperatur, fuktighet og lys/mørkesyklus på 12 timer. Etter en akklimati-seringsperiode på 4 til 5 dager, og etter en 24 timers fasteperiode ble dyrene anvendt for undersøkelsen beskrevet nedenfor.

Administrering av GABA analoger og indometacin:

Gabapentin eller pregabalin (CI-1008) ble oppløst i vann og administrert oralt ved de følgende dosene: 1, 10,100 og 200mg/kg i volum på 1ml. Kontroll-dyrene ble dosert med et like stort volum av bærer (1ml vann). 60 minutter senere fikk alle dyrene 1ml av en oppløsning av indometacin oppløst i 5% vandig NaHC03 (80mg/kg). Kontrolldyr fikk 1ml 5% vandig NaHC03 oralt. Forsøksgrupper var som følger:

Vurdering av effekten:

Gastrisk skade forårsaket av indometacin korrelerer med inhibering av syklooksygenaseproduktet prostaglandin E2 (PGE2). Dyrene ble avlivet ved s dekapitering 4 timer etter indometacinadministrering. Magen ble fjernet og åpnet langs dens større kurvaturen og dens bilde ble digitalisert og lagret på en optisk disket ved anvendelse av en 486-basert PC utstyrt med CUE3 system billed-dannende analysesoftware (Olympus Corp., Marietta, Georgia, USA). To 6-mm biopsier ble tatt fra et konstantområde av mageslimhinnen lokalisert i hver side av 10 den glandulære delen av magen, og deres PGE2 innhold ble målt ved å anvende en kommersielt tilgjengelig ELISA kit (Assay Designs Inc., Ann Arbor, Michigan, USA). Nærværet av mageskade ble bestemt ved å anvende det gjenopprettede elektroniske bildet, og omfanget av skade ble målt ved å anvende CUE3 billed-dannende software. Data uttrykkes som en prosent av skadet mageareal og PGE2 15 innholdet (pg/mL). Data er presentert nedenfor i tabell 1.

Dunns test og sammenlignet med indometacin gruppe.

Både gabapentin og CI-1008 forårsaket en reduksjon av omfanget av mageskade indusert ved indometacin som i tilfelle CI-1008 nådde statistisk signifikans ved doser på 100 og 200mg/kg.

Som ventet var mageskaden forårsaket av indometacin forbundet med en signifikant inhibering av syklooksygenaseproduktet PGE2. Hverken gabapentin eller CI-1008 var, ved noen testet dose, i stand til signifikant å modifisere denne effekten. Dette resultatet antyder at den signifikante reduksjonen av indometacin-indusert gastrisk skade forårsaket av CI-1008 ikke er forbundet med en effekt av denne GABAanalogen på syklooksygenaseenzymet.

De foregående data fastslår at GABA analoger så som gabapentin og pregabalin er effektive ved forebyggelse av gastrointestinal skade, så som gastriske lesjoner, peptiske sår og sågar gastrointestinal blødning i nedre områder, som for øvrig forårsakes ved inntak av alkohol eller NSAID'er. GABAanalogene behandlet også effektene av alkoholabstinens, som er et syndrom kjennetegnet ved tremor, hallusinasjoner og forvirring, og generelle gastrointestinale sykdomstilstander så som IBD og IBS.

De følgende testene fastslår at GABA analogene er nyttige for behandling av etanolabstinenssyndrom.

EKSEMPEL 4:

Albino hannmus av utavl TO stammen (Bantin & Kingman, UK) ble anvendt i alle undersøkelser. Vekten varierte fra 25 til 35g, med ikke mer enn et 5g område i et hvilket som helst enkelt forsøk. Musene ble huset, 8 per bur, ved 21 °C + 1°C, med 55 + 10% relativ fuktighet, og en lys/mørke syklus på 12 timer med den lyse fasen mellom 09.00 til 21.00. Alle musene fikk fri tilgang til ledningsvann og standard laboratoriemat (RM-1, Special Diet Services, UK) inntil de ble anvendt i forsøk eller inntil dieten ble erstattet med en flytende diet.

Induksjon av fysisk avhengighet

Etanol ble administrert i et flytende diettopplegg. Alle musene fikk kontrolldiet i en innledende 2-dags periode. Etanolbehandlede mus fikk deretter en diet inneholdende 3,5% (volum/volum) etanol/vann i 2 dager, etterfulgt av en diet

inneholdende 7% etanol i ytterligere 5 dager. Det gjennomsnittlige inntaket var 22 til 30g/kg/dag. Kontrollgrupper ble parforet med en kontrolldiet, utbalansert isokal-orimetrisk for å stemme overens med den etanolholdige dietten. Det var ingen forskjeller i vekt på de etanolbehandlede og kontrollmusene ved avslutningen av behandlingsperioden. Når musene ble tatt av etanol (mellom 0700AM og 0900AM) ble de gitt ledningsvann inntil anvendelsen i forsøkene.

Legemiddelbehandling:

Gabapentin ble oppløst i saltvannsoppløsning, idet hver oppløsning ble nyfremstilt hver forsøksdag. Intraperitroniale (i.p.) injeksjoner av enten gabapentin, 10m l/kg, eller saltvannsoppløsning, ble gitt umiddelbart etter opphør av etanolbehandlingen i studier for hånderingsresponsene, og 2 timer før måling av audiogene kramper. I forsøkene ved anvendelse av standard forhøyede labyrinter ble gabapentin eller saltvannsoppløsning injisert i.p. 8 timer etter fjernelse av etanol-dieten, og musene ble plassert på pluslabyrinten 60 minutter etter injeksjonene.

I undersøkelsene vedrørende motorkoordinering (ataksi) og vedrørende lokomotoraktivitet ble gabapentin eller saltvannsoppløsning injisert i etanol-ukjente laboratoriematforede mus straks før testing. Målinger ble deretter utført i 60 minutter for ataksiundersøkelsen, og i 30 minutter i tilfeller med lokomotoraktiviteten.

Måling av håndterings- indusert oppførsel:

Etter fjernelse av etanolbehandlingen ved 0900AM ble vurderingen av håndteringsindusert oppførsel vurdert av den samme eksperimentatoren, på den samme musen, hver time i et tidsrom på 12 timer etter fjernelse fra etanol. Numeriske bedømmelser av definisjonen er vist i tabell 2.

Hver mus ble løftet forsiktig i halen og holdt i 3 sekunder, 30cm under "Anglepoise lampe" med en 60W pære. Dyrene ble forsiktig rotert og den etter-følgende oppførselen ble på en skala fra 1 til 5 i henhold til kriteriene i tabell 2. Grupper på 15 mus ble anvendt i hver av behandlingsgruppene, og data ble samlet som medianer med interkvartilområder. Data ble også uttrykt som arealet under kurven ved 4 og 12 timer fra fjernelsen av etanolbehandlingen. Resultatene er vist i figur 2.

Frembringelse av audiogene kramper:

Ved 8 og 12 timer etter etanolfjernelse ble mottakeligheten for lydinduserte konvulsjoner målt i separate grupper på 10 mus. Mus ble testet individuelt i en lydtett boks av perspeks 30 x 30 x 30cm inneholdende en elektrisk dørklokke. Klokken ble ringt i 2 minutter eller inntil de første tegnene på konvulsjoner. Antallet mus som viste respons ved vill løping og kroniske konvulsjoner ble talt. Musene ble avlivet på human måte så snart som en fullstendig konvulsjon ble observert.

Angstrelatert oppførsel:

Mus ble tatt av etanoldietten ved 0700AM og testet med hensyn til angstrelatert oppførsel 8 timer senere ved å anvende en murin forhøyet labyrint. Den var konstruert av perspeks med to motstående åpne armer (30 x 5 x 0.25cm) og to motstående lukkede armer (30 x 5 x 15cm) som strakte seg fra en sentral plattform (5 x 5). Gulvet var av matt, sort perspeks. Dyrene ble akklimatisert til forsøksrommet 1 time før forsøket. Forsøk ble gjennomført under svakt rødt lys, og hver 5-minutters sesjon ble videofilmet for senere analyse, av en observatør som ikke kjente til den forutgående behandlingen. Under denne analysen (Observer 3.0, Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands) ble målinger utført av tiden tilbragt på hver arm av labyrinten, antallet inntredener på hver arm og ryggende aktivitet. Målingene ble utført i henhold til definisjonene i tabell 3.

Måling av ataksiske aksjoner:

Mulige ataksiske effekter av gabapentin ble undersøkt i kontrolldyr (dvs.

ikke behandlet med etanol) ved rotorod fremgangsmåten. Mus ble plassert på en stav som roterte ved 4,5 omdreininger per minutt, og tiden de forble på staven ble målt automatisk. En 'cut-off tid på 180 sekunder ble anvendt i alle forsøk. Før de akutte legemiddelinjeksjonene ble alle mus testet på rotorod for å forsikre at de holdt seg på denne i 180 sekunder (et meget lite antall gjorde ikke dette og ble følgelig utelukket fra undersøkelsene). Målinger ble utført i 60 minutter, ved 10 minutters intervaller, etter den akutte administreringen av det undersøkte legemiddelet. 8 mus ble anvendt i hver behandlingsgruppe.

Lokomotor aktivitet:

Effektene av gabapentin in kontrolldyr ble også testet på lokomotoraktivitet for å bestemme selektiviteten av effektene i abstinensundersøkelsene. Mus ble injisert med gabapentinoppløsning eller saltvannsoppløsning og øyeblikkelig plassert i aktivitetsforsøksbur som var krysset av infrarøde stråler. Antallet infra-røde strålebrudd ble målt hvert 5 minutt i de neste 30 minuttene. Ryggende aktivitet ble målt ved en tilsvarende serie av infrarøde stråler anbrakt 4cm over bur gulvet.

Statistisk analyse:

Resultatene av håndteringsreponsbedømmelsene ble sammenlignet ved ikke-parametrisk toveis analyse av varians, utformet for gjentatte målinger på det samme dyret. Resultatene av beregningene av arealet under kurven ble sammenlignet ved Mann-Witney U-testen. Konvulsjonsinsidensen ble analysert ved hjelp av Fishers nøyaktighetssannsynlighetstest. Målingene fra den forhøyde labyrinten ble underkastet enveis analyse av varians, etterfulgt av en Bonuferroni multipel sammenlikningstest, under sammenlikning av alle grupper med kontrollgruppen som mottok saltvannsinjeksjoner, og også sammenligning av både etanolbehandlede grupper som mottok gabapentin med den etanolbehandlede gruppen som mottok saltvannsoppløsning. Ataksimålingene ble analysert ved Mann-Witney U-testen og lokomotoraktiviteten ved Students t-test.

RESULTATER:

Håndteringsrespons

Bedømmelse av oppførsel i respons på forsiktig håndtering viste den ventede økningen etter tilbaketrekning av etanolbehandlingen. Gabapentin (GP) ved 100mg/kg (figur 2a) reduserte signifikant denne økningen i bedømmelse når resultatene ble sammenliknet over forsøksperioden på 12 timer (p<0.001). Effekten av denne dosen av gabapentin viste en market reduksjon i håndteringsskåring i rundt 4 timer. Denne tidsperioden ble derfor anvendt i senere analyser for å undersøke arealet under håndteringskurven med hver dose av legemiddelet. Effektene av lavere doser av gabapentin var ikke signifikante over måleperioden på 12 timer, men når arealene under kurven ble beregnet for de første 4 timene av undersøkelsen (figur 2b) ble det observert signifikante effekter ved dosene 20-og 50-mg/kg (p <0.05), så vel som ved 100mg/kg dosen (p <0,01).

Audiogene kramper:

Ved 8 timers intervallet reduserte 50 og 100mg/kg gabapentin konvulsjonsinsidensen etter audiogen stimulering, i det 100mg/kg dosen nådde statistisk signifikans (p <0.05). Det var ingen effekt på de lavere dosene (tabell 4). Ingen effekt ble observert på noen av dosene testet ved 12 timer fra avsluttingen av etanolbehandlingen (data ikke vist).

Forhøyet labyrint:

Den mest fremtredende effekten av etanolabstinens i denne testen var en reduksjon i %delen tid tilbrakt på de åpne armene av labyrinten (figur 3a, F(4,50) = 5.12, p <0.002). Gabapentin reduserte denne effekten ved både 50 og 100mg/kg. P-verdiene var p <0,05 for 50mg/kg dosen og p <0,01 for 100mg/kg, for sammenlikning med saltvannsadministrering i begge tilfeller.

Mus som undergår etanolabstinens viste også en signifikant økning i hodesenkninger fra de lukkede armene (beskyttede hodesenkninger). Denne effekten ble signifikant redusert ved gabapentin ved 100mg/kg (p <0,01 sammenliknet med effektene av saltvann), som illustrert i figur 3b (F(4,50) = 6.53, p <0,001). I kontrolldyr var antallet beskyttede hodesenkninger signifikant redusert ved gabapentin ved 100mg/kg (p <0,05, sammenliknet med kontrollverdier etter saltvannsadministrering). Selv om den midlere tiden på de åpne armene var forøket i kontrolldyr etter denne dosen av gabapentin var dette ikke signifikant forskjellige fra kontroller med saltvannsoppløsning.

EKSEMPEL 5:

LPS- kolonhvpersensitivitetsanalyse

GABA analogene er også vurdert med henblikk til deres evne til å kontrollere og behandle gastrointestinale sykdomstilstander kjennetegnet som IBD og IBS. Analysen anvendt for å vurdere GABA analogene måler effektene av forbindelsen på lipopolysakkarinindusert forsinket rektalallodymi i rotter. Intraperitoniale (IP) injeksjoner av indotoksiner lipopolysakkarid (LPS) er kjent for å indusere langvarig hyperalgesi i somatiske smertemodeller. Den følgende LPS-kolonhypersensitivitetsanalyse ble utformet for å vurdere effekten av IP injeksjoner av LPS på smerte viskeral terskel i en forsøksmodell med rektal utvidelse.

Dvrepreparering:

Wistar hannrotter med vekt 250 til 350g ble kirurgisk preparert for elektro-myografi, i henhold til en standard teknikk. Rotter ble bedøvet ved i.p. injeksjon av acepromazine og ketamin (Imalgene 1000, Rhone-Mérieux, Lyon, Frankrike) ved doser på henholdsvis 0,6 og 120mg/kg. To grupper på 4 elektroder av nikromtråd (60cm lengde og 8|im diameter) ble implantert bilateralt i den abdominale eksterne oblike muskulaturen like over inguinarligamentet. Elektroder ble plassert eksternt på baksiden av nakken og beskyttet ved hjelp av et glassrør festet til huden. Dyrene ble huset individuelt i polypropylenbur og holdt i et temperaturkontrollert rom ((21 °C). De ble gitt fri tilgang til vann og mat (UAR pellets, Epinay, Frankrike).

Elektromvoarafiske opptak:

Elektromyografiske registreringer begynte 5 dager etter kirurgi. Den elektriske aktiviteten av abdominal strierte muskler ble registrert med en elektro-encefalografmaskin (Mini VIII, Alvar, Paris, Frankrike) med anvendelse av en tids-konstant (0.03sek) for å fjerne lavfrekvens signaler ((<3Hz) og ved en papir hastighet på 3,6cm/minutt.

Ballongutvidelsesfremgangsmåte:

Rotter ble plassert i plasttunneler (diameter 6cm; lengde 25cm) hvor de ikke kunne bevege seg, unnslippe eller snu seg, for å forhindre skade på ballongen. De ble tilvendt til denne prosedyren i 3 eller 4 dager før rektal utvidelse (RD) for å minimalisere stress reaksjon under forsøk. Dyrene ble bestemt å være tilvendt til plasttunnelen ved å anvende to kriterier: (i) en oppførselsmessig komponent: når dyrene forsøkte å unnslippe eller snu seg ikke mer enn en gang per 5 minutter; (ii) abdominal basal aktiviteten: når de abdominale strierte musklene viser mindre enn 5 abdominale kontraksjoner per 5 minutter ifra hver utvidelse. Ballongen anvendt for utvidelse var et arterielt embolektomi kateter (Fogarty, Edwards Labora-tories, Inc., Santa Ana, USA). Rektal utvidelse (RD) ble utført ved innføring av ballongen (2mm diameter; 2cm lang) i rektum, ved 1cm av anus, i det kateteret ble fiksert til halen. Den ble oppblåst trinnvis ved trinn på 0,4mL, fra 0 til 1,6mL, hvor hvert oppblåsningstrinn varte i 5 minutter. For å detektere mulig lekkasje ble volumet av vann innført i ballongen sjekket ved fullstendig fjernelse med en sprøyte ved slutten av utvidelsesperioden.

Forsøksfremgangsmåte:

I en første serieforsøk ble en gruppe på 8 rotter underkastet gradvis rektal utvidelse. Dyrene var på forhånd (30 minutter) behandlet med gabapentin ved doser på 30 og 100mg/kg IP eller dens bærer (NaCI 9% vandig).

I en andre serieforsøk fikk den samme gruppen på 8 rotter IP lipopolysakkarid (E Coli, serotype 0111:B4) eller dens bærer, med en dose på 1 mg/kg IP, en time etter en kontroll rektal utvidelse. Deretter ble RD utført 12 timer etter LPS injeksjon og ble forutgått (30minutter) ved IP administrering av gabapentin (30mg/kg) eller dens bærer (0,3ml_/rotte).

Legemidler:

LPS ble oppløst i saltvannsoppløsning (NaCI 9%). Intraperitoneal injeksjon av bærer ble gitt i et volum på 0,3ml. LPS var innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Quentin Fallavier, Frankrike).

Statistisk analyse:

Statistisk analyse av antallet av abdominale kontraksjoner som finner sted i løpet av en 5 minutters periode under RD ble utført ved enveis ANOVA etterfulgt av Students parede t-test. Verdier ble uttrykt som middelverdier + SEM, og forskjeller ble betraktet som signifikante for p<0,05.

Resultatene er angitt i tabeller 5 og 6, og fastslår at gabapentin er effektivt ved reduksjon av lidelser i det nedre gastrointestinale området, så som IBS.

Det foregående forsøket ble utført med GABA analogen pregabalin. Pregabalin reduserte, ved 30mg/kg, antallet kramper ved begge utvidelsesvolumer på 0,4 og 0,8mL Når den ble injisert 120 minutter før rektal utvidelse hadde pregabalin ved både 10 og 30mg/kg en tilsvarende effekt ved alle utvidelsesvolum. LPS

øket antallet abdominale kontraksjoner ved volumet på 0,4mL (9.7 + 1.0 vs. 3.7 + 1.0) 12 timer etter dets administrering. Denne effekten ble undertrykket når dyrene fikk pregabalin (1.8 + 0.9 vs. (9.7 + 1.0) ved 30mg/kg 30 minutter før rektal utvid-

else. Disse resultatene fastslår at pregabalin er effektiv ved reduksjon av basale rektale sensitivitet og ved blokkering av LPS-indusert rektal allodyni i rotter.

EKSEMPEL 6

TNBS- indusert allodvni:

GABA analoger ble vurdert i rotter som lider av kronisk viskeral allodyni indusert ved trinitrobenzensulfonsyre (TNBS). Injeksjoner at TNBS i kolon av dyr er funnet å indusere kronisk kolitt. I mennesker er fordøyelseslidelser ofte forbundet med viskeral smerte. I disse patologiske tilstandene er den viskerale smerteterskelen redusert, hvilket indikerer en viskeral hypersensitivitet. Følgelig ble den følgende undersøkelsen utformet for å vurdere effekten av injeksjon av TNBS i kolon på viskeral smerteterskel i forsøksmodell for kolonutvidelse.

Sprague-Dawley hannrotter med vekt 340 til 400g ble anvendt i undersøk-elsen. Dyrene ble huset 3 per bur i et regulert miljø (20 + 1°C, 50 + 5% fuktighet, med lys 0800AM til 0800PM). Under bedøvelse (ketamine 80mg/kg i.p.; acepro-mazin 12mg/kg i.p.) ble TNBS (50mg/kg), eller saltvannsoppløsning (1.5mL/kg) injisert i den proksimale kolon (1cm fra sekum). Etter kirurgi ble dyrene individuelt huset i det regulerte miljøet.

Et ballongkateter (5-6cm lengde) ble innført gjennom anus i kolon og holdt i posisjon (top av ballong 5cm fra anus) ved å tape kateteret til haleroten. Ballongen ble progressivt oppblåst ved trinn på 5mm Hg, fra 0 til 75mm Hg, i det hvert oppblåsningstrinn varte i 30 sekunder. Hver syklus av kolonutvidelse ble kontrollert ved hjelp av en standard barostat. Terskelen tilsvarer trykket som produserte den første abdominale kontraksjonen, med hvilken tid syklusen med utvidelser ble avbrutt. For å bestemme kolonterskelen ble fire utvidelsessykler utført på det samme dyret.

I en første serie forsøk ble en gruppe på 8 rotter behandlet med saltvanns-oppløsning underkastet en kolonutvidelsessesjon.

I en andre serie ble en gruppe på 8 rotter behandlet med TNBS underkastet en kolonutvidelsessesjon.

I en tredje serie mottok en gruppe på 8 rotter behandlet med TNBS en subkutan (sc) injeksjon av gabapentin eller CI-1008 30 minutter før initiering av kolon-utvidelsessyklusen.

Alle forsøksforbindelser ble oppløst i saltvannsoppløsning bortsett fra TNBS. TNBS ble oppløst i EtOH 30% (vekt/volum). Subkutan injeksjon av bærer ble gitt i et volum på 2mg/kg.

Statistisk signifikans mellom hver gruppe ble bestemt ved anvendelse av en enveis ANOVA etterfulgt av Students uparede t-test. Forskjeller ble betraktet som statistisk signifikant ved p< 0,05.

Smerteterskel (trykk av utvidelser som induserer den første abdominale kontraksjonen) etter distal kolonutvidelse ble bestemt ved dag 7 i to grupper av våkne rotter: kontrolldyr og TNBS-behandlede dyr. En signifikant reduksjon i smerteterskel ble observert i TNBS-behandlede dyr. Inflammatoriske parametere

(kolon/vekt, område av hyperemi og nekrose og kolonmyeloperoksidase innhold)

ble målt i den proksimale kolon ved dag 7 etter TNBS-behandling. Alle parametrene var signifikant forøket, bortsett fra område av nekrose.

Gabapentin (100, 300 og 500mg/kg sc) og CI-1008 (30, 60 100 og 200mg/kg sc) ble administrert 30 minutter før kolonutvidelse og måling av de inflammatoriske parametrene. Gabapentin inhiberte på en doserelatert måte TNBS-indusert kolonallodyni. Ved 500mg/kg sc blokkerte gabapentin fullstendig effekten av TNBS på kolonsmerte. CI-1008 visste også en doserelatert inhibering av reduksjonen i smerteterskel. Ved 100mg/kg undertrykket CI-1008 fullstendig allodynien indusert ved TNBS. Morfin (0.1 mg/kg sc) undertrykket fullstendig den TNBS-induserte reduksjonen i smerteterskel etter kolonutvidelse (figur 4). Derimot inhiberte hverken gabapentin eller CI-1008 den koloninflammatoriske effekten av TNBS under disse forsøksbetingelsene.

I normale betingelser (kontrolldyr) øket morfin (0.3mg/kg sc) signifikant kolonsmerteterskelen mens, under de samme betingelsene, hverken gabapentin (500mg/kg sc) eller CI-1008 (200mg/kg sc) modifiserte kolonsmerteterskelen (figur 5). Resultatene er videre vist i tabeller 7 og 8.

De foregående data fastslår at GABA analoger, så som gabapentin og Cl-1008, undertrykker TNBS-indusert kolonallodyni, og er derfor effektive ved abdominal kolonhypersensitivitet som gjenspeiler den kroniske smerten i IBS.

EKSEMPEL 7:

Formalinindusert inflammatorisk smerte i kolon:

GABA analogene ble vurdert i en annen modell for å bestemme deres effekt på inflammatorisk viskeral smerte, innbefattende pankreatitt og intestinal cystitt.

Administrering av formalin i veggen av rottekolon forårsaker akutt inflammasjon og viskeral smerte. Formålet med foreliggende undersøkelse var å bedømme den antinosiseptive aktiviteten av gabapentin og CI-1008 i viskeral smerte indusert ved kolonintrapariental injeksjon av formalin.

Voksne Sprague-Dawley hunnrotter med vekt 240 til 260g ble anvendt i undersøkelsen. Dyrene ble huset 3 per bur i et regulert miljø (20 + 1°C, 50 + 5% fuktighet, med lys 0800AM til 0800PM) før anvendelse i testen.

Hvert forsøksdyr ble plassert i et transparent plastbur (27 x 43 x 28cm) med et lag av trespon på gulvet. Drikkevann var tilgjengelig. Bur ble plassert på en slik måte at visuell interaksjon mellom dyrene ble unngått. Et speil var plassert bak hvert bur for å forbedre registreringen av oppførsel. Hvert dyr ble innledningsvis gitt 20 minutter til å tilvende seg omgivelsene. Anestesi ble deretter oppnådd ved å anvende isofuran (utgangspunkt 4%, deretter 1,5% i en blanding av 2 : 3 nitrous-oksyd og 1 : 3 oksygen). Dyret ble opphengt i halen, rektum ble forsiktig tømt med en pinne med bomullstupp, og et koloskop ble innført gjennom anus. Dette utform-ede endoskopet har en lateral spalte som muliggjør punktur av tarmveggen under visuell kontroll, ved anvendelse av en 51 mm lang nål (26 ga) ved ca. 35mm fra den anale randen. Injisert oppløsninger var enten 50|aL 5% vandig formalin (volum/volum), eller det samme volumet av isotonisk saltvannsoppløsning. Dyr ble tillatt å komme seg etter anestesi så snart som injeksjonen var fullført (ca. 1 minutt), og observasjonsperioden ble startet og fortsatt i 2 timer. 30 minutter etter avslutningen av observasjonstesten ble det administrert en IV injeksjon av Evans Blue (1%) og 30 minutter senere ble dyret avlivet. Abdomen ble åpnet. Injeksjonsstedet og sonen for diffusjon av Evans Blue ble registrert ved billedanalysesoftware. Data fra rotter hvor spredning av fargestoffet ikke var begrenset til den sigmoide veggen ble utelatt.

Som angitt i økende rekkefølge av smerteintensitet var disse oppførslene:

(i) abdominal slikking og napping (L), (ii) kroppsstrekking, dvs. bakoverstrekking av bakbenene (B), (iii) kontraksjon av flankene, i noen tilfeller utviklende til en strekk-ende stilling (C) og (iv) kontraksjon av hele kroppen, rotten står med ryggen kurvet, i noen tilfeller ytterligere gradert i henhold til varigheten av den gitte episoden: Wi for mindre enn 30 sekunder, W2 mellom 30 sekunder og 1 minutt, W3 for mer enn 1 minutt. Oppførsler ble registrert for hvert dyr gjennom 2-timers testen på individuelle kart. En smerteskåring ble deretter beregnet for hver av de suksessive 15-minutters periodene, ved å anvende følgende formel:

hvorved smerteskåringene var proporsjonal med (i) antallet episoder av hver valgt oppførsel, og (ii) koeffisienten, fra 1 til 6, tilskrevet den gitte oppførselen.

Alle forbindelser ble oppløst i saltvannsoppløsning. Subkutan injeksjon av bærer ble gitt i et volum på 2,5mg/kg. Formalin ble innkjøpt fra Prolabo.

Statistisk signifikans mellom hver gruppe ble bestemt ved å anvende en enveis ANOVA etterfulgt av Students uparede t-test. Forskjeller ble betraktet som statistisk signifikante ved p <0,05.

Hyperalgesi induseres ved intramural injeksjon av formalin (5%, 50^L/rotte) i kolonveggen i ikke-fastede Sprague-Dawley hunnrotter. Gabapentin og CI-1008 ble testet ved henholdsvis 100, 300, 500 og 100, 200mg/kg sc. Gabapentin og CI-1008 reduserer signifikant og doseavhengig smerteskåringen ved intrakolonisk formalin. Den maksimale inhibitoriske effekten ble observert etter 50mg/kg gabapentin og 200mg/kg CI-1008. Resultatene er angitt i tabell 9.

Denne undersøkelsen etablerer at GABA analoger viser en antinosiseptiv effekt på intrakolon formalinindusert smerte, og er følgelig effektive ved behandling av IBD og IBS, og viskeral smerte, innbefattende pankreatitt og intestinal cystitt.

NS = ikke signifikant vs. Kontroll

De følgende eksemplene illustrerer ytterligere preparatet tilveiebragt ifølge oppfinnelsen som inneholder en GABA analog i kombinasjon med en NSAID.

EKSEMPEL 8:

Bestandelene blandes til uniformitet og presses til en tablett. Tablettene administreres fra 1 til 3 ganger per dag for behandling av inflammatoriske tilstander så som reumatoid artritt, ankyloserende spondulitt, osteoartritt, bursitis, tendinitis og akutt podagristisk artritt.

EKSEMPEL 9

Kapsel formulering:

Bestandelene blandes til uniformitet og plasseres i en gelatinkapsel. Kapslene administreres fra 1 til 4 ganger per dag for behandling av reumatoid artritt og osteoartritt.

Kombinasjonene tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse innbefatter en NSAID (for eksempel naproksen eller meklofenaminsyre) og en GABA analog valgt fra pregabalin eller gabapentin. Slike kombinasjoner er vist å være synergistiske i deres evne til å behandle smerte. For eksempel blir gabapentin og naproksennatrium kombinert i synergistiske mengder og vurdert i en standard rottekare-genant fotpute/termisk hyperalgesi analyse. Denne analysen anvender et ekstrakt av tang (karragenan) som, når det injiseres i fotputen på forsøksdyr, forårsaker en steril inflammasjon og nedsetter derved smerteterskelen. Analgesiske midler, innbefattende GABA analoger så som gabapentin, hever smerteterskelen tilbake til normal verdi og gjør derved mulig for dyret å tolerere en ytre smertekilde i et lengere tidsrom relativt til ubehandlede kontrolldyr. Flere fikserte kombinasjoner av gabapentin og naproksennatrium, varierende i konsentrasjoner fra ca. 50 vektdeler GABA analog til 1 vektdel NSAID, til 1 : 1 kombinasjoner, ble vurdert i den foregående analysen. Resultatene er vist i figur 6 (for fikserte 1 :1 kombinasjoner ved forskjellige doser) og i figur 7 (for fikserte 50 : 1 kombinasjoner ved forskjellige doser. Data fastslår at kombinasjonene av en GABA analog og en NSAID er synergistiske i deres evne til å lette akutt og kronisk smerte og å indusere analgesi.

Claims (6)

1. Anvendelse av en GABA-analog valgt fra gabapentin og pregabalin og farmasøytiske akseptable salter derav og et ikke-steroidalt anti-inflammatorisk legemiddel, for fremstilling av et medikament for forebyggelse og behandling av gastrointestinal skade og lidelser.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor GABA-analogen er gabapentin.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor GABA-analogen er pregabalin

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor den gastrointestinale skaden er i et objekt som mottar eller vil motta NSAID behandling eller alkohol.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor den gastrointestinale skaden er kjennetegnet som inflammatorisk tarmlidelse eller irritabel tarmsyndrom.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor betingelsen som skal behandles med det oppnådde medikamentet velges fra Crohns sykdom, ileitt, iskjemisk tarmsykdom, dyspepsi og ulserativ kolitt.