NO326858B1 - Mutanter av gram-negative mukose bakterier som er i stand til a danne OMP og mangler LPS, og anvendelse derav i vaksiner - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en gram-negativ mutant av en mukøs bakterie, en vaksine og en yttermembranvesikkelvaksine mot en gram-negativ mukøs bakterie, samt fremgangsmåter til fremstilling av en LPS-fri vaksine samt LPS-frie OMP.

Oppsummering av oppfinnelsen.

Det er i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse funnet at i motsetning til tidligere funn med E. coli er det mulig å inaktivere det tidlige stadium av Lipid A syntese av mukøse gram-negative bakterier uten å bringe cellelevedyktighet i fare. Spesielt ble IpxA-genet i Neisseria meningitidis mutert uten at cellelevedyktigheten ble brakt i fare. De resulterende lpxA-knockout mutanter viste seg å være fullstendig uten LP. Hovedyttermembranproteinene (OMPer) ble påvist i normale mengder. En yttermembran kunne også iakttas i elektronmikrofotografier av ultratynne snitt. Dette var så vidt bekjent første gang med en levedyktig, gram-negativ, bakteriell mutant fullstendig uten LPS.

Iakttagelsen gir viktige implikasjoner for forståelsen av yttermembranens struktur og biogenese. På et praktisk plan åpner tilgjengeligheten av LPS-manglende mutanter av patogene mukøse bakterier, såsom N. meningitidis, opp for nye veier til utvikling av vaksiner. Den muliggjør lettvint isolasjon av endotoksinfrie, rensede proteiner, yttermembraner eller sogar helcellepreparater for anvendelse i immunisering.

Bakgrunnsinformasj on.

Lipopolysakkarid (LPS) utgjør det ytre monolag av yttermembranen av gram-negative bakterier. Som sådant danner det en viktig komponent i yttermembranen og har vært betraktet som relevant for vaksineformål (Verheul et al., 1993) . Den membranforankrende Lipid A del er ansvarlig for molekylets velkjente endotoksinaktivitet (Zåhringer et al., 1994) .

Slik endotoksinaktivitet er uønsket i vaksiner. For tiden er noen preparater for anvendelse i vaksiner gjen-stand for rigorøse, tidkrevende og kostbare renseprosesser for å fjerne denne endotoksinaktivitet før de er egnet for anvendelse som en vaksine. Dette muliggjør høyere doser som følge av minsket toksisitet. Men drastiske rensemetoder kan lett føre til denaturering av proteinantigener som behøver å bibeholde sin naturlige struktur for å bevirke en passende immunrespons. Til dags dato er det tilgjengelig polysakkaridvaksiner av gruppe A og gruppe C, som er blitt gjort stort sett frie for lipopolysakkarid ved hjelp av rensing. Til dags dato er det imidlertid ikke blitt fremstilt helcellevaksiner som er stort sett frie for LPS eller OMP stort sett uten LPS. I de følgende publikasjoner gis det detaljer for fremgangsmåter som har vært benyttet til dags dato for å unngå LPS i farmasøytiske produkter: Akers

(1985), Gabler (1987) og European Pharmacopoeia, 2. utgave, "test for ikke-pyrogenisitet". Spesielt befatter WHO Tech. Rep., Ser 594:50, 1976, seg med krav til en meningokokk-polysakkaridvaksine.

Mutanter med defekter i LPS-biosyntese er blitt beskrevet for mange bakteriearter, men ingen av disse har vært betraktet som kandidater til en vaksine som er fri for det endotoksiske Lipid A. Alle levedyktige mutanter bibe-holder en minimal Lipid A - KDO-struktur, som er den første del som må fremstilles (Raetz, 1990) i LPS-syntese. Således kunne de ikke være egnet for å overvinne det ovennevnte problem som vaksineprodusenter støter på. Fremfor alt er bare betinget dødelige mutasjoner blitt rapportert for gener involvert i tidlige stadier av biosyntese av Lipid A i Escherichia coli (Raetz, 1990) . Disse mutanter har en mutasjon i gener som er involvert i tidlige stadier av biosyntese av Lipid A. Denne iakttagelse antydet at denne del av LPS-molekylet faktisk er vesentlig for bakterievekst. Som sådan vil denne iakttagelse av fagfolk på området fremstilling av en vaksine av muterende gener forbundet med dette bli betraktet som uegnet på grunn av at den resulterende mutant ikke vil vokse.

Inhibitorer av biosyntese av Lipid A har også vist seg å føre til hurtig tap av cellelevedyktighet i E. coli og atskillige andre bakterier (Onishi et al, 1996) og under-støtter derved den ovenfor beskrevne hypotese vedrørende den essensielle natur ved biosyntese av Lipid A.

I tillegg er det foreslått modeller for biogenese av OMPer, hvor deres korrekte folding og målretting er av-hengig av LPS (Sen og Nikaido, 1991; Reid et al., 1990; Laird et al., 1994; de Cock og Tommassen, 1996).

I WO 97/25061 beskrives mutanter av gram-negative bakterier som har en form for LPS-mangel på nivå med myristinsyreenhet, hvor IpxF-genet er inhibert.

I WO 97/19688 beskrives mutanter av gram-negative bakterier som produserer mindre toksisk LPS som et resultat av en mutasjon i htrB-genet.

IpxA-genet fra Neisseria meningitidis, som koder for enzymet UDP-GlcNac acyltransferase som er nødvendig for første stadium i biosyntesen av Lipid A, er tidligere blitt klonet (Steeghs et al., 1997). Under forsøk på å forandre fettacylspesifisiteten til dette enzym ved å konstruere et hybrid-IpxA-gen av E. coli- N. meningitidis, ble det gjort en uventet iakttagelse som danner basis for den foreliggende oppfinnelse.

Således kjennetegnes den gram-negativ mutanten av en mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved en mutasjon slik at den er levedyktig, er i stand til å danne OMP og mangler endotoksisk lipopolysakkarid (LPS), og at mutanten er fri for LPS. Fortrinnsvis omfatter mutanten en mutasjon i minst ett gen valgt blant lpxA, lpxD og lpxB, fortrinnsvis i det minste i genet lpxA. Fortrinnsvis er bakterien valgt blant diplokokker. f.eks. N. gonorrhoeae, N. meningitidisr eller Bordetella, f.eks. Bordetella pertussis. Fortrinnsvis er mutasjonen slik at mutanten er fri for Lipid A, og omfatter fortrinnsvis en mutasjon i minst ett gen forbundet med biosyntese av Lipid A, fortrinnsvis en mutasjon i minst ett gen forbundet med det tidlige stadium og biosyntesen av Lipid A hvor det tidlige stadium er før dannelsen av følgende struktur:

Videre kjennetegnes vaksinen mot en gram-negativ mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter en mutant som beskrevet ovenfor som en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer. Vaksinen er fortrinnsvis en svekket, levende vaksine eller en helcellevaksine, og er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.

Videre kjennetegnes yttermembranvesikkelvaksinen mot en gram-negativ mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter yttermembranvesikler avledet fra en mutant som beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer og ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven. Fortrinnsvis omfatter yttermembranvesikkelen en OMP, og inneholder dessuten en adjuvans.

Videre kjennetegnes fremgangsmåten til fremstilling av LPS-fri vaksine i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter trinnene

a) dyrking av en mutant som beskrevet ovenfor, og

b) blanding av mutanten eller yttermembranvesikler avledet

fra mutanten med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Yttermembranvesiklene omfatter fortrinnsvis en OMP.

Videre kjennetegnes fremgangsmåten til fremstilling av LPS-frie OMP i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter trinnene

a) dyrking av en mutant som beskrevet ovenfor, og

b) isolering OMP fra nevnte kulturen.

Beskrivelse av figurene.

Fig. 1. Konstruksjon av H44/76[pHBK30]. To-trinns PCR-mutagenese som fører til hybrid IpxA-genet med E. coli-spesifikke primere Eprl (ACTGACGCGTGTGATTGATAAATCCGC) sekv. id. nr. 1 og Epr2 (GTAGGGCGGCACGTCCTGCGCCACACCGGA) sekv. id. nr. 2 og N. meningitidis- speslfikke primere Nprl (TCCGGTGTGGCGCAGGACGTGCCGCCCTAC) seq. id. no. 3 og Npr2 (CGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCA) seq. id. no. 4. Fig. 2. Konstruksjon av H44/76[pHBK30]. Erstatning av den kromosomale IpxD-fajbZ-IpxA-locus med insertet pHBK30 som i tillegg til E. coli- N. meningitidis hybrid IpxA-genet bærer en kanR seleksjonsmarkør istedenfor regionen med 99 basepar mellom Mlul-setet i fabZ og startkodonet til lpxA. Fig. 3. SDS-PAGE-analyse av H44/76[pHBK30]. Sølvfarget tricin-SDS-PAGE LPS-gel av proteinase-K-behandlete hel-cellelysater av H44/7 6 (spor 1 og 8) og 6 uavhengige kana-mycinresistente transformanter med pHBK30 (spor 2-7). Fig. 4. SDS-PAGE av OMC-proteiner fra H44/76[pHBK30]

(spor 2) og H44/76 vildtype (spor 3). Spor 1 inneholder en molekylvektmarkør på 94, 67, 43, 30, 20,1 og 14,4 kDa.

Fig. 5. Elektronmikrofotografi av et tynt snitt av H44/76[pHBK30], som viser nærværet av en yttermembran i fravær av LPS.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Isoleringen av N. meningitidis IpxA- genet som er involvert i biosyntesen av Lipid A er nylig blitt rapportert (Steeghs et al., 1997). Den deduserte aminosyresekvens for IpxA-proteinet viste homologi med E. coli acyltransfe-rasen som er ansvarlig for binding av den O-bundne 3-OH-myristoylkjede til UDP-N-acetylglukosamin, som er det første stadium i den biosyntetiske bane for fremstilling av Lipid A (Anderson og Raetz, 1987; Coleman og Raetz, 1988) . Basert på denne homologi og en sammenligning av E. coli og N. meningitidis Lipid A strukturene forventes det at meningokokk IpxA-genet koder for en acyltransferase med 3-OH-lauroylspesifisitet (Kulshin et al., 1992). Basisen for den forskjellige fettsyrespesifisitet kan kanskje opp-fattes til å være lokalisert i det karakteristiske heksa-peptidrepeatmotiv hos disse acyltransferaser, som det er blitt påvist å spille en avgjørende rolle i foldingen av E. coli proteinet (Vuorio et al., 1994; Raetz og Roderick, 1995). I et forsøk på å verifisere denne hypotese ble det konstruert et hybrid IpxA-gen hvor meningokokk-N-terminal-fi-helixdomenet som inneholdt heksapeptidrepeatmotivet ble erstattet med den tilsvarende del av E. coli lpxA, etterfulgt av transformasjon og allelisk erstatning av dette konstruksjon til N. meningitidis H44/76. Forsøksdataene for dette er gitt i eksemplene (spesielt i eksempel 1).

Resultatene viste at stamme H44/76[pHBK30] er en levedyktig LPS-manglende mutant. Den mest sannsynlige for-klaring på denne overraskende iakttagelse synes å være at hybrid IpxA-genet var blitt inaktivt, enten på grunn av avbrutt transkripsjon/translasjon i konstruktet eller på grunn av hybridproteinet som uttrykt hadde tapt sin enzy-matiske aktivitet. For å avgjøre dette ble det konstruert en lpxA-knockout-mutant. Resultatene viste en gang til at blokkering av Lipid A biosyntesebanen i N. meningitidis stamme H44/76 fører til levedyktige LPS-manglende mutanter.

Dette er den første rapport om en levedyktig, gram-negativ bakteriemutant fullstendig uten LPS. Det har følgende implikasjoner: (1) Overraskende (i lys av det ovennevnte syn på den essensielle natur av Lipid A biosyntesen for cellelevedyktighet) er det mulig for noen gram-negative bakterier å danne en yttermembran som er uten noe som helst LPS, men som likevel blir værende levedyktig. Selv om resultatene ikke utelukker involvering av LPS i den OMP-dannende prosess, viser de at den klart ikke kan være essensiell. Det bør være meget interessant å undersøke strukturen til yttermembranen i IpxA-mutanten mer i detalj. (2) I E. coli er alle de mutasjoner som påvirker de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A som er blitt beskrevet dødelige når de uttrykkes. Det faktum at dette ikke er tilfellet i meningokokker åpnet for det spørsmål om hvilken organisme som er typisk i denne forbindelse og hva som forårsaker denne forskjell. Muligens er den forbundet med en annen LPS-OMP-interaksjon, som også antydes ved den iakttagelse at mens dyprøde LPS-mutanter av E. coli og Salmonella typhimurium viser en minsket ekspresjon av de viktigste OMPer (Koplow og Goldfine, 1974; Ames et al., 1974), viste en sammenlignbar heptosemanglende rfaC-mutant av E. coli og N. meningitidis å ha normal uttrykking av porinene av klasse 1 og 3 (Hamstra og van der Ley, upublisert).

Det postuleres i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse at mukøse gram-negative bakterier på analog måte kan muteres og derved bli frie for endotoksisk LPS. Mulig-gjør deretter utvikling av LPS-frie helcelle- eller acellulære vaksiner, såsom OMP-vaksiner. Grunnlaget for dette postulat finnes i den kunnskap som er tilgjengelig hos fagfolk vedrørende biosyntesen av Lipid A i mukøse, gram-negative bakterier. Fig. 6, f.eks. som avledet fra Raetz 1990, viser et diagram av de tidlige stadier i biosyntesen av Lipid A. Den viser behovet for lpxA og lpxB som enzymer som er nødvendige for den tidlige biosyntese. Enzymet lpxD er også kjent for å være involvert (Steeghs et al., 1997). Kjennskap til nukleinsyresekvensene som koder for disse gener er tilgjengelig for fagfolk (Steeghs et al., 1997). Etterfølgende mutasjon av ett eller flere av genene som koder for enzymene som er involvert i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A er mulig. Fig. 6 viser de tidlige stadier. Fortrinnsvis vil mutasjonen fremstå slik at ikke noe stadium fører forbi IpxB-stadiet når disse produkter allerede nært ligner strukturen til Lipid A. Fortrinnsvis vil mutasjonen oppstå så tidlig som mulig i biosyntesebanen. I de fleste tilfeller er genene som koder for lpxA, lpxB og lpxD i klaseform. Steeghs et al gir referanser som beskriver slike detaljer for Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia entereocolitica, Haemophilus influenzae og Rickettsia rickettsii. Kjennskap til disse mikroorganismers sekvenser er således tilgjengelig for fagfolk på området, og homologe sekvenser i andre organismer kan finnes. Både lpxA og lpxD inneholder en karakteristisk heksapeptidlipidstruktur [(I,V,L)GXXXX]n. IpxB-genet er vanligvis kotranskribert med lpxA og kan som sådant lett finnes. Klasen inneholder også fabZ- qenet, som også kan anvendes for å forvisse seg om lokaliseringen til genklasen som er involvert i biosyntesen av Lipid A (Steeghs et al., 1997). Steeghs et al gir genbanknummeret hvor N. meningitidis sekvensdataene vedrørende Lipid A biosyntesegenklasen er tilgjengelig, nemlig U79481. Det henvises også til de øvrige referanser som er nevnt der og som dekker sekvenser for andre organismer.

Der er to muligheter til å mutere ett eller flere gener som er forbundet med biosyntesen av Lipid A. Slik mutasjon kan enten være slik at enzym dannes i en inaktiv form eller slik at genet muteres slik at det ikke uttrykkes, dvs. at det derved dannes en såkalt knockout-mutant. Måtene dette mål kan nås på er tallrike og vil være lett tilgjengelig for en fagmann på området genteknologi. Det er klart at som eksempel på en slik måte kan en analog prosess til den som benyttes i eksemplene anvendes for forskjellige mikroorganismer og/eller forskjellige enzymer som er kjent for å være involvert i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A. Det prinsipielle ved fremstilling av knockout-mutanter generelt er velkjent og kan benyttes for enhver av de gener som koder for enzymer som er aktive i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A.

Oppfinnelsesgjenstanden omfatter mutantene som er beskrevet ovenfor. I tillegg omfatter den nye vaksiner fremstilt fra slike organismer eller komponentdeler av disse. Slike nye vaksiner er frie for Lipid A. Faktisk kan slike vaksiner være helt frie for enten aktivt eller inaktivt Lipid A. Som en konsekvens er vaksinene frie for LPS. Limulus-testen kan benyttes slik som beskrevet for å sikre at et preparat faktisk er fritt for LPS.

Derved faller en vaksine mot en gram-negativ, mukøs bakterie, hvor vaksinen er stort sett fri for LPS, hvor stort sett fri kan bestemmes ved Limulus-testen og vaksinen omfatter en mikroorganisme ifølge oppfinnelsen slik som beskrevet her som aktiv bestanddel innenfor rammen av oppfinnelsen. Dette er en såkalt helcellevaksine. I tillegg er en vaksine mot en gram-negativ, mukøs bakterie som omfatter én eller flere komponenter av den ovennevnte mikroorganisme, som også er stort sett fri for LPS slik som definert ovenfor, dekket av oppfinnelsen. Særlig er en OMP-holdig vaksine som er stort sett fri for LPS slik som beskrevet ovenfor dekket av oppfinnelsen.

En fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot gram-negative, mukøse bakterier ved anvendelse av en mikroorganisme ifølge oppfinnelsen og/eller deler avledet derav som aktiv bestanddel på en måte som er i og for seg kjent til fremstilling av helcelle- eller acellulære vaksiner er dekket av oppfinnelsen, slik også produktene fra fremgangsmåten er. Vaksinene ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis være kjennetegnet av nærvær av en adjuvans for å øke dens immunogeniske aktivitet. Det er kjent et antall adjuvanser som vanlig anvendes i vaksiner. Enhver av disse kan hen-siktsmessig benyttes. Enhver doseringsform og ytterligere bestanddeler som vanlig anvendes for vaksiner, særlig meningokokkvaksiner, er egnet for oppfinnelsen.

Særlig egnete mål-mikroorgansimer er diplokokker og Bordetella pertussis. Diplokokkene omfatter meningokokker og gonokokker. Eksempler på hver kategori er N. meningitidis og N. gonorrhoeae. Tallrike andre organismer av denne kategori er kjent fra Bergeys Handbook of Determinative Bacteriology. Disse diplokokker er struk-turelt nær beslektet og oppviser samme genstruktur. Begge er interessante mikroorganismer fra et vaksinasjonssyns-punkt, slik også et antall andre mikroorganismer, såsom Haemophilus influenzae og Moraxella catarrhalis er.

Det er klart at konstruksjonen av lpxA-knockout-mutanter kan forsøkes i andre bakteriearter som det er kjent at har Lipid A i deres lipopolysakkarid. (3) Tilgjengeligheten av LPS-manglende mutanter vil muliggjøre nye tilnærminger til vaksineutvikling mot N. meningitidis og det nærbeslektede patogen N. gonorrhoeae samt andre bakterier som er nevnt ovenfor og som slike mutanter kan fremstilles og isoleres fra. For det første vil det bli mye enklere å rense OMPer eller andre celle-overflatebestanddeler uten forurensende endotoksin. For det andre kan rollen til LPS i meningokokk-yttermembran-vesikkelvaksiner, f.eks. som adjuvans eller i stabili-serende OMP-konformasjon (Verheul et al., 1993; Nakano og Matsuura, 1995; Poolman, 1995), nå bestemmes utvetydig og eventuelt overtas av en mindre toksisk forbindelse. For det tredje kan anvendelsen av inaktiverte helcellevaksiner undersøkes under anvendelse av endotoksinfrie mutanter ifølge oppfinnelsen, såsom IpxA-mutantene. Endelig oppstår nå muligheten til å anvende LPS-manglende stammer som levende, svekkede vaksiner.

Oppfinnelsens nøyaktige natur vil bli ytterligere belyst ved de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1: Konstruksjon av et inaktivt lpxA - qen i N . meningitidis .

I to separate PCR-reaksjoner ble E. coli- og N. meningitidis- delen av hybridgenet mangfoldiggjort med henholdsvis primeren Eprl/Epr2 og primeren Nprl/Npr2 (fig. 1). Innsideprimerne Epr2 og Nprl var utformet slik at endene av produktene inneholder komplementære sekvenser. Disse produkter ble blandet, denaturert og gjenavherdet i en andre PCR hvor det fusjonerte konstrukt ble mangfoldiggjort ved hjelp av utsideprimerne Eprl og Npr2, som har henholdsvis et Mlul- og Spel-sete (fig. 1). Det resulterende PCR-produkt ble klonet og dets sekvens verifisert.

For å teste aktiviteten til hybrid-lpxA ble dette gen anvendt for å erstatte det originale lpxA i meningokokk-kromosomet (fig. 2). For dette formål ble 1,0 kb Mlul/ Spel-fragmentet som bærer vildtype IpxA-genet i plasmid pLA19

(et pUC18-derivat med et 1,9 kb IpxD-fajbZ-lpxA-insert)

erstattet med det tilsvarende kuttede hybrid-lpxA-gen. Deretter ble en kanamycin-resistenskassett ligert inn i Mlul-setet som er lokalisert direkte oppstrøms for lpxA med plasmidet pHBK30 som resultat.

Transformasjon av N. meningitidis H44/76 med lineari-sert pHBK30 frembrakte kanamycin-resistente kolonier etter 24 timers inkubasjon. Disse mutanter døde når de ble over-ført til friske gelkromatografiplater med kanamycin (100 ug/ml).

Ved å senke kanamycinkonsentrasjonen og screene de resulterende kolonier ved PCR-mangfoldiggjøring av lpxA-hybridspesifikke fragmenter lykkes det til slutt å isolere levedyktige kanR- H44/76[pHBK30] transformanter hvor det kromosomale IpxA-gen var blitt erstattet av hybridkonstruktet slik som vist i fig. 2.

LPS hos mutanten H44/76[pHBK30] og vildtypestammen ble sammenlignet ved Tricine-SDS-PAGE etterfulgt av en sølv-flekk for karbohydrater (fig. 3). Overraskende kunne ikke noe LPS påvises i hybridderivatet ved denne metode, selv når større mengder cellelysater ble lastet på gelen.

For å få mer innsikt i strukturen til yttermembranen til H44/76[pHBK30] ble et panel av LPS- og OMP-spesifikke mantistoffer testet i en helcelle ELISA (tabell 1). Mutantstammen bandt ikke noen av de LPS-spesifikke mantistoffer, mens de OMP-spesifikke mantistoffer viste lignende bind-ingsmønstre for mutant og vildtype. Denne tilsynelatende OMP-likhet ble bekreftet når OMCer av H44/76[pHBK30] og H44/76 ble isolert og analysert ved SDS-PAGE (fig. 3). Begge stammer viser like mengder av OMP av klasse 1, 3 og 4. I motsetning til vildtypen uttrykker mutanten tilsynelatende også en OMP av klasse 5.

Som følge av at LPS i H44/76[pHBK30] ikke kunne påvises med noen av de metoder som er beskrevet ovenfor ble det stilt spørsmål om den var nærværende i det hele tatt. Derfor ble mutant- og vildtypestammen testet i en kromogen Limulus-prøve (LAL) med meningokokkmedium som en negativ kontroll. Denne prøve avhenger av aktivering av den klump-dannende enzymkaskade i amøbocyttlysat fremstilt av heste-skokrabbe og er i stand til å påvise endotoksin i mengder på pikogram. Resultatene av LAL-prøve på cellesuspensjoner viste ingen betydelig endotoksinaktivitet for H44/76-[pHBK30] i forhold til meningokokkmedium (henholdsvis 0,3 og 1,7 EU/ml) i motsetning til 21,7 x IO<4> EU/ml for vildtypen.

Sammen viser disse resultater at det innledende forsøk med å erstatte vildtype IpxA-genet med hybridkonstruktet resulterte i isolering av det som tilsynelatende var en LPS-manglende mutant. Dette ble ytterligere bekreftet ved analyse ved gasskromatografi/massespektrometri (GS-MS) av fettsyrer i OMC-preparater, noe som viste at det Lipid A-spesifikke 3-OH C12 bare var tilstede i spormengder i mutanten. Idet denne fettsyre tilsettes i det første trinn av biosyntesen av Lipid A viser dens fravær at mutanten virkelig er LPS-manglende og ikke bare danner et ufull-stendig forstadiumsmolekyl uten antistoffbinding eller LAL-prøveaktivitet.

Selv om H44/76[pHBK30] er helt levedyktig var en redusert veksthastighet sammenlignet med vildtypestammen tydelig. Ved vekst natten over på gelkromatografi-agar-plater produserte mutantstammen mye mindre kolonier. I væskemedium var doblingstiden under eksponentiell vekst ca. 50% høyere enn i vildtypestammen H44/76.

Morfologien til H44/76[pHBK30] og dens morstamme ble undersøkt ved elektronmikroskopi på ultratynne snitt. I

motsetning til vildtypen var cellene til H44/76[pHBK30] mer heterogene i størrelse, og en betydelig fraksjon viste tegn på lysis. Men yttermembranen kunne klart sjeines i den LPS-manglende mutant (fig. 5). I motsetning til det noe

"posete" utseende i vildtypen viste mutantens yttermembran en "trangere pasning", noe som eventuelt indikerer en senket fremstillingshastighet.

Eksempel 2: Konstruksjon av en lpxA - knockout- mutant.

En lpxA-knockout-mutant av N. meningitidis ble konstruert ved insertering av en kanamycin-resistent kassett i BstEII-setet lokalisert i posisjon 293 i IpxA-genet av plasmid pLA21 (et pUC18-derivat med et 2,1 kb lpxD- fabZ-IpxA-insert). Det resulterende plasmid pLAK33 ble kuttet med Xbal/ SacI og transformert til stamme H44/76 med selek-sjon for kanamycinresistens. Som ventet viste de resulterende kolonier samme vekstegenskaper som mutanten H44/76[pHBK30], noe som indikerer mangel på LPS. Dette ble bekreftet ved hjelp av en helcelle-ELISA hvor lpxA-knockout-mutanten ikke bandt noen av de LPS-spesifikke mantikropper. Disse resultater viste nok en gang at Lipid A biosyntesebanen i stamme H44/76 av N. meningitidis fører til levedyktige, LPS-manglende mutanter.

Detaljert beskrivelse av metoder og stammer anvendt i eksemplene.

Når ingen spesifikke detaljer er gitt er det benyttet standard teknologi. Når det er angitt referanser henvises det til innholdet i disse.

Bakteriestammer og - plasmider.

E. coli-stammene NM522 og INVaF<1> ble dyrket på LB-medium ved 37°C. N. meningitidis- stamme H4 4/76 og dens derivater ble dyrket ved 37°C på gelkromatografimediumbase (Difco) supplert med IsoVitaleX (Becton Dickinson) i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO2, eller i væskemedium slik som beskrevet (Van der Ley et al., 1993). For valg av meningokokktransformanter (Van der Ley et al., 1996) ble kanamycin anvendt i en konsentrasjon på 75-100 ug/ml. Ved E. coli ble antibiotika anvendt i følgende konsentrasjoner: ampicillin, 100 ug/ml; kanamycin, 100 ug/ml. For kloning av PCR-fragmenter ble TA-kloningskittet med vektoren pCRII (Invitrogen) anvendt. En annen vektor som ble anvendt var pUC18.

Rekombinante DNA- teknikker.

De fleste rekombinante DNA-teknikker var slik som beskrevet i Sambrook et al., (1989). Plasmid-DNA ble isolert under anvendelse av pLASmix-kittet (Talent). Polymerase-kjedereaksjonen (PCR) ble utført i et Perkin Eimer GeneAmp PCR-system 9600 med Taq-polymerase. Sekvensanalyse ble ut-ført med et automatisk sekvenseringsapparat fra Applied Biosystems på dobbelt-kjedete plasmid-DNA-templater (isolert med Qiagen-kolonner) og med en syklus-sekvenserings-protokoll.

LPS- analyse.

Tricin-natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese ble ut-ført i 4% stablende og 16% separerende geler slik som beskrevet av Lesse et al., (1990). Proteinase K-behandlete, koke bakterieceller ble anvendt som prøver. Gelene ble kjørt i 17 timer ved en konstant strømstyrke på 20 mA og sølvfarget ved metoden til Tsai og Frasch (1982). Den kromogene LAL-prøve for endotoksinaktivitet ble utført under anvendelse av kittet QCL-1000 fra BioWhittaker Inc.

(Walkersville, MD, USA) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Kulturer natten over ble tynnet i meningo-

kokkmedium til en optisk tetthet ved 620 nm på 0,1, og seriefortynninger av disse stabler ble anvendt som prøver i LAL-prøven. For fettsyreanalyse ved GC-MS ble OMC-prøver acetylert i 3 timer ved 90°C i pyridin og eddiksyreanhydrid for å oppløse LPS fullstendig. Prøvene ble deretter opp-varmet i 3 timer ved 65°C i tetrahydrofuran i nærvær av LiAlH4 for å redusere de 0-bundne fettsyrer til de frie alkoholer. Disse ble derivatisert til TMS-etere i 1 time ved 60°C med BSTFA + 1% TMCS i pyridin og analysert ved GC-MS i et Autospec-apparat (Micromass, Manchester, UK) ved elektronstøtmetoden. Mengden 3-OH C12 i prøvene ble bestemt kvantitativt ved anvendelse av 2-OH C12 som intern standard.

Karakterisering av OMP- sammensetning.

Binding av mantistoffer som er spesifikke for OMPer av klasse 1, 3 og 4 og for oligosakkaridgelen av LPS av immunotype L3 ble testet i en helcelle ELISA (Van der Ley et al., 1995, 1996). Isolering av OMCer ved sarkosyl-ekstraksjon og analyse av dem ved SDS-PAGE ble utført slik som beskrevet ovenfor (Van der Ley et al., 1993).

Referanser.

M.J. Akers, Parenteral Quality Control. Kapittel 2: "Pyrogen Testing". Marcel Dekker Inc. New York og Basel, 1985, p 79-142.

G. F.-L Ames, E.N. Spudich og H. Nikaido: "Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimurium: effect of lipopolysacharide mutations", J. Bacteriol, Vol 117, 1974, p 406-416. M.S. Anderson og C.R.H. Raetz: "Biosynthesis of lipid A precursors in Escherichia coli. A cytoplasmic acyltransferase that converts UDP-N-acetylglucosamine to UDP-3-0-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine", J. Biol. Chem., Vol 262, 1987, p 5159-5169.

H. de Cock og J. Tomassen: "Lipopolysaccharides and divalent cations are involved in the formation of an assembly-competent intermediate of outer-membrane protein PhoE of E. coli", EMBO J., Vol 15, 1996, p 5567-5573.

J. Coleman og C.R.H. Raetz: "First committed step of lipid A biosynthesis in Escherichia coli: Sequence of the lpxA gene", J. Bacteriol., Vol 170, 1988, p 1268-1274.

F.R. Gabler: "Pyrogens, and the depyrogenation of solutions with ultrafiltration membranes", p 919-939 i: T.H. Meltzer, "Filtration in the pharmaceutical industry", Marcel Dekker, Inc., New York og Basel, 1987, M.J. Karnovsky: "Use of ferrocyanide-reduced osmium tetraoxide in electron microscopy", Proe. 11. Ann. Meeting Soc. Cell Bil., Vol 51, 1971, p 146.

J. Koplow og H. Goldfine: "Alterations in the outer membrane of the cell envelope of heptose-deficient mutants of Eschericihia coli", J. Bacteriol, Vol 117, 1974, p 527-543. V.A. Kulshin, U. Zåhringer, B. Lindner, CE. Frasch, C. Tsai, A. Dimitriev og E.T. Rietschel: "Structural characterization of the lipid A component of phatogenic Neisseria meningitidis", J. Bacteriol, Vol 174, 1992, p 1793-1800. M.W. Laird, A.W. Kloser, og R. Misra: "Assembly of LamB and OmpF in deep rough lipopolysaccharide mutants of Escherichia coli K-12", J. Bacteriol, Vol 176, 1994, p 2259-2264.

A.J. Lesse, A.A. Campagnari, E.W. Bittner og M.A. Apicella: "Incrased resolution of lipopolysaccharides and lipooligosaccharides utilising tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis", J. Immunol. Meth., Vol 126, 1990, p 109-117.

P. Van der Ley, J. Van der Biezen, P. Hohenstein, C. Peeters og J.T. Poolman: "Use of transf ormation to construct antigenic hybrids of the class 1 outer membrane protein in Neisseria meningitidis", Infect Immun., Vol 61, 1993, p 4217-4224.

P. Van der Ley, J. Van der Biezen og J.T. Poolman: "Construction of Neisseria meningitidis strains carrying multiple chromosomal copies of the porA gene for use in the production of a multivalent outer membrane vesicle vaccine", Vaccine, Vol 13, 1995, p 401-407.

P. Van der Ley, M. Kramer, L. Steeghs, B. Kuipers, S.R. Andersen, M.P. Jennings, E.R. Moxon og J.T. Poolman: "Identification of a locus involved in meningococcal lipopolysaccharide biosynthesis by deletion mutagenesis", Mol. Microbiol., Vol 19, 1996, p 1117-1125. M. Nakano og M. Matsuura: "Lipid A", p 315-335, i: Stewart-Tull, D.E.S. (Ed.), "The Theory and Practical Application of Adjuvants", John Wiley & Sons, 1995,.

H.R. Onishi, B.A. Pelak, L.S. Gerckens et al.: "Antibacterial agents that inhibit lipid A biosynthesis", Science 274, 1996, p 980-982.

J.T. Poolman: "Development of a meningococcal vaccine", Infect. Agents Dis., Vol 4, 1995, p 13-38. C.R.H. Raetz: "Biochemistry of endotoxins", Annu. Rev. Biochem., Vol 59, 1990, p 129-170. C.R.H. Raetz og S.L. Roderick: "A left-handed parallell 15 helix in the structure of UDP-N-Acetylglucosamine acyltransferase", Science 270, 1995, p 997-1000.

G. Reid, I. Hindennach og U. Henning: "Role of lipopolysaccharide in assembly of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA, OmpC and OmpF", J. Bacteriol., Vol 172, 1990, p 6048-6053.

J. Sambrook, E.F. Fritsch og T. Maniatis: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, New York, 1989.

K. Sen og H. Nikaido: "Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin", J. Bacteriol., Vol 173, 1991, p 926-928. L. Steeghs, M.P. Jennings, J.T. Poolman og P. Van der Ley: "Isolation and characterization of the Neisseria meningitidis IpxD- fabZ- lpxA gene cluster involved in lipid A biosynthesis", Gene, Vol 190, 1997, p 263-270. CM. Tsai og G.E. Frasch: "A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels", Anal. Biochem., Vol 119, 1982, p 115-119.

A.F.M. Verheul, H. Snippe og J.T. Poolman: "Meningo-cocal lipopolysaccharides: Virulence factor and potential vaccine component", Microbiol. Rev., Vol 57, 1993, p 34-49.

R. Vuorio, T. Hårkonen, M. Tolvanen og M. Vaara: "The novel hexapeptide motif found in the acyltransferase LpxA and LpxD of lipid A biosynthesis is conserved in various bacteria", FEBS Lett., Vol 337, 1994, p 289-292.

U. Zåhringer, B. Lindner og E.Th. Rietschel: "Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides", p 211-276 i: D. Horton (Ed.), "Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry", Vol 50, Academic Press Inc., San Diego, 1994,.

Claims (19)

1. Gram-negativ mutant av en mukøs bakterie, karakterisert ved en mutasjon slik at den er levedyktig, er i stand til å danne OMP og mangler endotoksisk lipopolysakkarid (LPS), og at mutanten er fri for LPS.

2. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1, karakterisert ved en mutasjon slik at den er fri for Lipid A.

3. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at bakterien er valgt blant diplokokker.

4. Gram-negativ mutant i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at bakterien er valgt blant gonokokker, f.eks. N. gonorrhoeae.

5. Gram-negativ mutant i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at bakterien er valgt blant meningokokker, f.eks. N. meningitidis.

6. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at bakterien er valgt fra gruppen som omfatter Bordetella, f.eks. Bordetella pertussis.

7. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter en mutasjon i minst ett gen forbundet med biosyntese av Lipid A.

8. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i minst ett gen forbundet med det tidlige stadium og biosyntesen av Lipid A hvor det tidlige stadium er før dannelsen av følgende struktur:

9. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i minst ett gen valgt blant lpxA, lpxD og lpxB.

10. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i det minste i genet lpxA.

11. Vaksine mot en gram-negativ mukøs bakterie, karakterisert ved at vaksinen omfatter en mutant ifølge et av kravene 1-10 som en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

12. Vaksine i samsvar med krav 11, karakterisert ved at vaksinen er en svekket, levende vaksine eller en helcellevaksine.

13. Vaksine ifølge et av kravene 11-12, karakterisert ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.

14. Yttermembranvesikkelvaksine mot en gram-negative mukøs bakterie, karakterisert ved at vaksinen omfatter yttermembranvesikler avledet fra en mutant ifølge et av kravene 1-10 , og en farmasøytisk akseptabel bærer og ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.

15. Vaksine i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte yttermembranvesikkelen omfatter en OMP.

16. Vaksine i samsvar med et av kravene 11-15, karakterisert ved at den dessuten inneholder en adjuvans.

17. Fremgangsmåte til fremstilling av LPS-fri vaksine, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene a) dyrking av en mutant ifølge et av kravene 1-10, og b) blanding av mutanten eller yttermembranvesikler avledet fra mutanten med en farmasøytisk akseptabel bærer.

18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 17, karakterisert ved at yttermembranvesiklene omfatter en OMP.

19. Fremgangsmåte til fremstilling av LPS-frie OMP, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene a) dyrking av en mutant ifølge et av kravene 1-10, og b) isolering OMP fra nevnte kulturen.