NO326858B1 - Mutanter av gram-negative mukose bakterier som er i stand til a danne OMP og mangler LPS, og anvendelse derav i vaksiner - Google Patents
Mutanter av gram-negative mukose bakterier som er i stand til a danne OMP og mangler LPS, og anvendelse derav i vaksiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO326858B1 NO326858B1 NO20000774A NO20000774A NO326858B1 NO 326858 B1 NO326858 B1 NO 326858B1 NO 20000774 A NO20000774 A NO 20000774A NO 20000774 A NO20000774 A NO 20000774A NO 326858 B1 NO326858 B1 NO 326858B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- mutant
- lps
- vaccine
- gram
- accordance
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 29
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 60
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 25
- 101150041203 lpxA gene Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 241000239218 Limulus Species 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 101150093674 lpxD gene Proteins 0.000 claims description 5
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 101150103033 lpxB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 3
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 12
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 abstract 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 230000007893 endotoxin activity Effects 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 101150087392 pilQ gene Proteins 0.000 description 5
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 4
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000897304 Neisseria meningitidis H44/76 Species 0.000 description 3
- 101150002068 Npr2 gene Proteins 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150084167 fabZ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000258241 Mantis Species 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 229910010084 LiAlH4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 1
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 1
- 101150060710 NPR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 TMS ethers Chemical class 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 101150062294 htrB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 101150092659 rfaC gene Proteins 0.000 description 1
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en gram-negativ mutant av en mukøs bakterie, en vaksine og en yttermembranvesikkelvaksine mot en gram-negativ mukøs bakterie, samt fremgangsmåter til fremstilling av en LPS-fri vaksine samt LPS-frie OMP.
Oppsummering av oppfinnelsen.
Det er i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse funnet at i motsetning til tidligere funn med E. coli er det mulig å inaktivere det tidlige stadium av Lipid A syntese av mukøse gram-negative bakterier uten å bringe cellelevedyktighet i fare. Spesielt ble IpxA-genet i Neisseria meningitidis mutert uten at cellelevedyktigheten ble brakt i fare. De resulterende lpxA-knockout mutanter viste seg å være fullstendig uten LP. Hovedyttermembranproteinene (OMPer) ble påvist i normale mengder. En yttermembran kunne også iakttas i elektronmikrofotografier av ultratynne snitt. Dette var så vidt bekjent første gang med en levedyktig, gram-negativ, bakteriell mutant fullstendig uten LPS.
Iakttagelsen gir viktige implikasjoner for forståelsen av yttermembranens struktur og biogenese. På et praktisk plan åpner tilgjengeligheten av LPS-manglende mutanter av patogene mukøse bakterier, såsom N. meningitidis, opp for nye veier til utvikling av vaksiner. Den muliggjør lettvint isolasjon av endotoksinfrie, rensede proteiner, yttermembraner eller sogar helcellepreparater for anvendelse i immunisering.
Bakgrunnsinformasj on.
Lipopolysakkarid (LPS) utgjør det ytre monolag av yttermembranen av gram-negative bakterier. Som sådant danner det en viktig komponent i yttermembranen og har vært betraktet som relevant for vaksineformål (Verheul et al., 1993) . Den membranforankrende Lipid A del er ansvarlig for molekylets velkjente endotoksinaktivitet (Zåhringer et al., 1994) .
Slik endotoksinaktivitet er uønsket i vaksiner. For tiden er noen preparater for anvendelse i vaksiner gjen-stand for rigorøse, tidkrevende og kostbare renseprosesser for å fjerne denne endotoksinaktivitet før de er egnet for anvendelse som en vaksine. Dette muliggjør høyere doser som følge av minsket toksisitet. Men drastiske rensemetoder kan lett føre til denaturering av proteinantigener som behøver å bibeholde sin naturlige struktur for å bevirke en passende immunrespons. Til dags dato er det tilgjengelig polysakkaridvaksiner av gruppe A og gruppe C, som er blitt gjort stort sett frie for lipopolysakkarid ved hjelp av rensing. Til dags dato er det imidlertid ikke blitt fremstilt helcellevaksiner som er stort sett frie for LPS eller OMP stort sett uten LPS. I de følgende publikasjoner gis det detaljer for fremgangsmåter som har vært benyttet til dags dato for å unngå LPS i farmasøytiske produkter: Akers
(1985), Gabler (1987) og European Pharmacopoeia, 2. utgave, "test for ikke-pyrogenisitet". Spesielt befatter WHO Tech. Rep., Ser 594:50, 1976, seg med krav til en meningokokk-polysakkaridvaksine.
Mutanter med defekter i LPS-biosyntese er blitt beskrevet for mange bakteriearter, men ingen av disse har vært betraktet som kandidater til en vaksine som er fri for det endotoksiske Lipid A. Alle levedyktige mutanter bibe-holder en minimal Lipid A - KDO-struktur, som er den første del som må fremstilles (Raetz, 1990) i LPS-syntese. Således kunne de ikke være egnet for å overvinne det ovennevnte problem som vaksineprodusenter støter på. Fremfor alt er bare betinget dødelige mutasjoner blitt rapportert for gener involvert i tidlige stadier av biosyntese av Lipid A i Escherichia coli (Raetz, 1990) . Disse mutanter har en mutasjon i gener som er involvert i tidlige stadier av biosyntese av Lipid A. Denne iakttagelse antydet at denne del av LPS-molekylet faktisk er vesentlig for bakterievekst. Som sådan vil denne iakttagelse av fagfolk på området fremstilling av en vaksine av muterende gener forbundet med dette bli betraktet som uegnet på grunn av at den resulterende mutant ikke vil vokse.
Inhibitorer av biosyntese av Lipid A har også vist seg å føre til hurtig tap av cellelevedyktighet i E. coli og atskillige andre bakterier (Onishi et al, 1996) og under-støtter derved den ovenfor beskrevne hypotese vedrørende den essensielle natur ved biosyntese av Lipid A.
I tillegg er det foreslått modeller for biogenese av OMPer, hvor deres korrekte folding og målretting er av-hengig av LPS (Sen og Nikaido, 1991; Reid et al., 1990; Laird et al., 1994; de Cock og Tommassen, 1996).
I WO 97/25061 beskrives mutanter av gram-negative bakterier som har en form for LPS-mangel på nivå med myristinsyreenhet, hvor IpxF-genet er inhibert.
I WO 97/19688 beskrives mutanter av gram-negative bakterier som produserer mindre toksisk LPS som et resultat av en mutasjon i htrB-genet.
IpxA-genet fra Neisseria meningitidis, som koder for enzymet UDP-GlcNac acyltransferase som er nødvendig for første stadium i biosyntesen av Lipid A, er tidligere blitt klonet (Steeghs et al., 1997). Under forsøk på å forandre fettacylspesifisiteten til dette enzym ved å konstruere et hybrid-IpxA-gen av E. coli- N. meningitidis, ble det gjort en uventet iakttagelse som danner basis for den foreliggende oppfinnelse.
Således kjennetegnes den gram-negativ mutanten av en mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved en mutasjon slik at den er levedyktig, er i stand til å danne OMP og mangler endotoksisk lipopolysakkarid (LPS), og at mutanten er fri for LPS. Fortrinnsvis omfatter mutanten en mutasjon i minst ett gen valgt blant lpxA, lpxD og lpxB, fortrinnsvis i det minste i genet lpxA. Fortrinnsvis er bakterien valgt blant diplokokker. f.eks. N. gonorrhoeae, N. meningitidisr eller Bordetella, f.eks. Bordetella pertussis. Fortrinnsvis er mutasjonen slik at mutanten er fri for Lipid A, og omfatter fortrinnsvis en mutasjon i minst ett gen forbundet med biosyntese av Lipid A, fortrinnsvis en mutasjon i minst ett gen forbundet med det tidlige stadium og biosyntesen av Lipid A hvor det tidlige stadium er før dannelsen av følgende struktur:
Videre kjennetegnes vaksinen mot en gram-negativ mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter en mutant som beskrevet ovenfor som en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer. Vaksinen er fortrinnsvis en svekket, levende vaksine eller en helcellevaksine, og er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.
Videre kjennetegnes yttermembranvesikkelvaksinen mot en gram-negativ mukøs bakterie i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter yttermembranvesikler avledet fra en mutant som beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer og ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven. Fortrinnsvis omfatter yttermembranvesikkelen en OMP, og inneholder dessuten en adjuvans.
Videre kjennetegnes fremgangsmåten til fremstilling av LPS-fri vaksine i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter trinnene
a) dyrking av en mutant som beskrevet ovenfor, og
b) blanding av mutanten eller yttermembranvesikler avledet
fra mutanten med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Yttermembranvesiklene omfatter fortrinnsvis en OMP.
Videre kjennetegnes fremgangsmåten til fremstilling av LPS-frie OMP i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den omfatter trinnene
a) dyrking av en mutant som beskrevet ovenfor, og
b) isolering OMP fra nevnte kulturen.
Beskrivelse av figurene.
Fig. 1. Konstruksjon av H44/76[pHBK30]. To-trinns PCR-mutagenese som fører til hybrid IpxA-genet med E. coli-spesifikke primere Eprl (ACTGACGCGTGTGATTGATAAATCCGC) sekv. id. nr. 1 og Epr2 (GTAGGGCGGCACGTCCTGCGCCACACCGGA) sekv. id. nr. 2 og N. meningitidis- speslfikke primere Nprl (TCCGGTGTGGCGCAGGACGTGCCGCCCTAC) seq. id. no. 3 og Npr2 (CGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCA) seq. id. no. 4. Fig. 2. Konstruksjon av H44/76[pHBK30]. Erstatning av den kromosomale IpxD-fajbZ-IpxA-locus med insertet pHBK30 som i tillegg til E. coli- N. meningitidis hybrid IpxA-genet bærer en kanR seleksjonsmarkør istedenfor regionen med 99 basepar mellom Mlul-setet i fabZ og startkodonet til lpxA. Fig. 3. SDS-PAGE-analyse av H44/76[pHBK30]. Sølvfarget tricin-SDS-PAGE LPS-gel av proteinase-K-behandlete hel-cellelysater av H44/7 6 (spor 1 og 8) og 6 uavhengige kana-mycinresistente transformanter med pHBK30 (spor 2-7). Fig. 4. SDS-PAGE av OMC-proteiner fra H44/76[pHBK30]
(spor 2) og H44/76 vildtype (spor 3). Spor 1 inneholder en molekylvektmarkør på 94, 67, 43, 30, 20,1 og 14,4 kDa.
Fig. 5. Elektronmikrofotografi av et tynt snitt av H44/76[pHBK30], som viser nærværet av en yttermembran i fravær av LPS.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.
Isoleringen av N. meningitidis IpxA- genet som er involvert i biosyntesen av Lipid A er nylig blitt rapportert (Steeghs et al., 1997). Den deduserte aminosyresekvens for IpxA-proteinet viste homologi med E. coli acyltransfe-rasen som er ansvarlig for binding av den O-bundne 3-OH-myristoylkjede til UDP-N-acetylglukosamin, som er det første stadium i den biosyntetiske bane for fremstilling av Lipid A (Anderson og Raetz, 1987; Coleman og Raetz, 1988) . Basert på denne homologi og en sammenligning av E. coli og N. meningitidis Lipid A strukturene forventes det at meningokokk IpxA-genet koder for en acyltransferase med 3-OH-lauroylspesifisitet (Kulshin et al., 1992). Basisen for den forskjellige fettsyrespesifisitet kan kanskje opp-fattes til å være lokalisert i det karakteristiske heksa-peptidrepeatmotiv hos disse acyltransferaser, som det er blitt påvist å spille en avgjørende rolle i foldingen av E. coli proteinet (Vuorio et al., 1994; Raetz og Roderick, 1995). I et forsøk på å verifisere denne hypotese ble det konstruert et hybrid IpxA-gen hvor meningokokk-N-terminal-fi-helixdomenet som inneholdt heksapeptidrepeatmotivet ble erstattet med den tilsvarende del av E. coli lpxA, etterfulgt av transformasjon og allelisk erstatning av dette konstruksjon til N. meningitidis H44/76. Forsøksdataene for dette er gitt i eksemplene (spesielt i eksempel 1).
Resultatene viste at stamme H44/76[pHBK30] er en levedyktig LPS-manglende mutant. Den mest sannsynlige for-klaring på denne overraskende iakttagelse synes å være at hybrid IpxA-genet var blitt inaktivt, enten på grunn av avbrutt transkripsjon/translasjon i konstruktet eller på grunn av hybridproteinet som uttrykt hadde tapt sin enzy-matiske aktivitet. For å avgjøre dette ble det konstruert en lpxA-knockout-mutant. Resultatene viste en gang til at blokkering av Lipid A biosyntesebanen i N. meningitidis stamme H44/76 fører til levedyktige LPS-manglende mutanter.
Dette er den første rapport om en levedyktig, gram-negativ bakteriemutant fullstendig uten LPS. Det har følgende implikasjoner: (1) Overraskende (i lys av det ovennevnte syn på den essensielle natur av Lipid A biosyntesen for cellelevedyktighet) er det mulig for noen gram-negative bakterier å danne en yttermembran som er uten noe som helst LPS, men som likevel blir værende levedyktig. Selv om resultatene ikke utelukker involvering av LPS i den OMP-dannende prosess, viser de at den klart ikke kan være essensiell. Det bør være meget interessant å undersøke strukturen til yttermembranen i IpxA-mutanten mer i detalj. (2) I E. coli er alle de mutasjoner som påvirker de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A som er blitt beskrevet dødelige når de uttrykkes. Det faktum at dette ikke er tilfellet i meningokokker åpnet for det spørsmål om hvilken organisme som er typisk i denne forbindelse og hva som forårsaker denne forskjell. Muligens er den forbundet med en annen LPS-OMP-interaksjon, som også antydes ved den iakttagelse at mens dyprøde LPS-mutanter av E. coli og Salmonella typhimurium viser en minsket ekspresjon av de viktigste OMPer (Koplow og Goldfine, 1974; Ames et al., 1974), viste en sammenlignbar heptosemanglende rfaC-mutant av E. coli og N. meningitidis å ha normal uttrykking av porinene av klasse 1 og 3 (Hamstra og van der Ley, upublisert).
Det postuleres i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse at mukøse gram-negative bakterier på analog måte kan muteres og derved bli frie for endotoksisk LPS. Mulig-gjør deretter utvikling av LPS-frie helcelle- eller acellulære vaksiner, såsom OMP-vaksiner. Grunnlaget for dette postulat finnes i den kunnskap som er tilgjengelig hos fagfolk vedrørende biosyntesen av Lipid A i mukøse, gram-negative bakterier. Fig. 6, f.eks. som avledet fra Raetz 1990, viser et diagram av de tidlige stadier i biosyntesen av Lipid A. Den viser behovet for lpxA og lpxB som enzymer som er nødvendige for den tidlige biosyntese. Enzymet lpxD er også kjent for å være involvert (Steeghs et al., 1997). Kjennskap til nukleinsyresekvensene som koder for disse gener er tilgjengelig for fagfolk (Steeghs et al., 1997). Etterfølgende mutasjon av ett eller flere av genene som koder for enzymene som er involvert i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A er mulig. Fig. 6 viser de tidlige stadier. Fortrinnsvis vil mutasjonen fremstå slik at ikke noe stadium fører forbi IpxB-stadiet når disse produkter allerede nært ligner strukturen til Lipid A. Fortrinnsvis vil mutasjonen oppstå så tidlig som mulig i biosyntesebanen. I de fleste tilfeller er genene som koder for lpxA, lpxB og lpxD i klaseform. Steeghs et al gir referanser som beskriver slike detaljer for Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia entereocolitica, Haemophilus influenzae og Rickettsia rickettsii. Kjennskap til disse mikroorganismers sekvenser er således tilgjengelig for fagfolk på området, og homologe sekvenser i andre organismer kan finnes. Både lpxA og lpxD inneholder en karakteristisk heksapeptidlipidstruktur [(I,V,L)GXXXX]n. IpxB-genet er vanligvis kotranskribert med lpxA og kan som sådant lett finnes. Klasen inneholder også fabZ- qenet, som også kan anvendes for å forvisse seg om lokaliseringen til genklasen som er involvert i biosyntesen av Lipid A (Steeghs et al., 1997). Steeghs et al gir genbanknummeret hvor N. meningitidis sekvensdataene vedrørende Lipid A biosyntesegenklasen er tilgjengelig, nemlig U79481. Det henvises også til de øvrige referanser som er nevnt der og som dekker sekvenser for andre organismer.
Der er to muligheter til å mutere ett eller flere gener som er forbundet med biosyntesen av Lipid A. Slik mutasjon kan enten være slik at enzym dannes i en inaktiv form eller slik at genet muteres slik at det ikke uttrykkes, dvs. at det derved dannes en såkalt knockout-mutant. Måtene dette mål kan nås på er tallrike og vil være lett tilgjengelig for en fagmann på området genteknologi. Det er klart at som eksempel på en slik måte kan en analog prosess til den som benyttes i eksemplene anvendes for forskjellige mikroorganismer og/eller forskjellige enzymer som er kjent for å være involvert i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A. Det prinsipielle ved fremstilling av knockout-mutanter generelt er velkjent og kan benyttes for enhver av de gener som koder for enzymer som er aktive i de tidlige stadier av biosyntesen av Lipid A.
Oppfinnelsesgjenstanden omfatter mutantene som er beskrevet ovenfor. I tillegg omfatter den nye vaksiner fremstilt fra slike organismer eller komponentdeler av disse. Slike nye vaksiner er frie for Lipid A. Faktisk kan slike vaksiner være helt frie for enten aktivt eller inaktivt Lipid A. Som en konsekvens er vaksinene frie for LPS. Limulus-testen kan benyttes slik som beskrevet for å sikre at et preparat faktisk er fritt for LPS.
Derved faller en vaksine mot en gram-negativ, mukøs bakterie, hvor vaksinen er stort sett fri for LPS, hvor stort sett fri kan bestemmes ved Limulus-testen og vaksinen omfatter en mikroorganisme ifølge oppfinnelsen slik som beskrevet her som aktiv bestanddel innenfor rammen av oppfinnelsen. Dette er en såkalt helcellevaksine. I tillegg er en vaksine mot en gram-negativ, mukøs bakterie som omfatter én eller flere komponenter av den ovennevnte mikroorganisme, som også er stort sett fri for LPS slik som definert ovenfor, dekket av oppfinnelsen. Særlig er en OMP-holdig vaksine som er stort sett fri for LPS slik som beskrevet ovenfor dekket av oppfinnelsen.
En fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot gram-negative, mukøse bakterier ved anvendelse av en mikroorganisme ifølge oppfinnelsen og/eller deler avledet derav som aktiv bestanddel på en måte som er i og for seg kjent til fremstilling av helcelle- eller acellulære vaksiner er dekket av oppfinnelsen, slik også produktene fra fremgangsmåten er. Vaksinene ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis være kjennetegnet av nærvær av en adjuvans for å øke dens immunogeniske aktivitet. Det er kjent et antall adjuvanser som vanlig anvendes i vaksiner. Enhver av disse kan hen-siktsmessig benyttes. Enhver doseringsform og ytterligere bestanddeler som vanlig anvendes for vaksiner, særlig meningokokkvaksiner, er egnet for oppfinnelsen.
Særlig egnete mål-mikroorgansimer er diplokokker og Bordetella pertussis. Diplokokkene omfatter meningokokker og gonokokker. Eksempler på hver kategori er N. meningitidis og N. gonorrhoeae. Tallrike andre organismer av denne kategori er kjent fra Bergeys Handbook of Determinative Bacteriology. Disse diplokokker er struk-turelt nær beslektet og oppviser samme genstruktur. Begge er interessante mikroorganismer fra et vaksinasjonssyns-punkt, slik også et antall andre mikroorganismer, såsom Haemophilus influenzae og Moraxella catarrhalis er.
Det er klart at konstruksjonen av lpxA-knockout-mutanter kan forsøkes i andre bakteriearter som det er kjent at har Lipid A i deres lipopolysakkarid. (3) Tilgjengeligheten av LPS-manglende mutanter vil muliggjøre nye tilnærminger til vaksineutvikling mot N. meningitidis og det nærbeslektede patogen N. gonorrhoeae samt andre bakterier som er nevnt ovenfor og som slike mutanter kan fremstilles og isoleres fra. For det første vil det bli mye enklere å rense OMPer eller andre celle-overflatebestanddeler uten forurensende endotoksin. For det andre kan rollen til LPS i meningokokk-yttermembran-vesikkelvaksiner, f.eks. som adjuvans eller i stabili-serende OMP-konformasjon (Verheul et al., 1993; Nakano og Matsuura, 1995; Poolman, 1995), nå bestemmes utvetydig og eventuelt overtas av en mindre toksisk forbindelse. For det tredje kan anvendelsen av inaktiverte helcellevaksiner undersøkes under anvendelse av endotoksinfrie mutanter ifølge oppfinnelsen, såsom IpxA-mutantene. Endelig oppstår nå muligheten til å anvende LPS-manglende stammer som levende, svekkede vaksiner.
Oppfinnelsens nøyaktige natur vil bli ytterligere belyst ved de etterfølgende eksempler.
Eksempel 1: Konstruksjon av et inaktivt lpxA - qen i N . meningitidis .
I to separate PCR-reaksjoner ble E. coli- og N. meningitidis- delen av hybridgenet mangfoldiggjort med henholdsvis primeren Eprl/Epr2 og primeren Nprl/Npr2 (fig. 1). Innsideprimerne Epr2 og Nprl var utformet slik at endene av produktene inneholder komplementære sekvenser. Disse produkter ble blandet, denaturert og gjenavherdet i en andre PCR hvor det fusjonerte konstrukt ble mangfoldiggjort ved hjelp av utsideprimerne Eprl og Npr2, som har henholdsvis et Mlul- og Spel-sete (fig. 1). Det resulterende PCR-produkt ble klonet og dets sekvens verifisert.
For å teste aktiviteten til hybrid-lpxA ble dette gen anvendt for å erstatte det originale lpxA i meningokokk-kromosomet (fig. 2). For dette formål ble 1,0 kb Mlul/ Spel-fragmentet som bærer vildtype IpxA-genet i plasmid pLA19
(et pUC18-derivat med et 1,9 kb IpxD-fajbZ-lpxA-insert)
erstattet med det tilsvarende kuttede hybrid-lpxA-gen. Deretter ble en kanamycin-resistenskassett ligert inn i Mlul-setet som er lokalisert direkte oppstrøms for lpxA med plasmidet pHBK30 som resultat.
Transformasjon av N. meningitidis H44/76 med lineari-sert pHBK30 frembrakte kanamycin-resistente kolonier etter 24 timers inkubasjon. Disse mutanter døde når de ble over-ført til friske gelkromatografiplater med kanamycin (100 ug/ml).
Ved å senke kanamycinkonsentrasjonen og screene de resulterende kolonier ved PCR-mangfoldiggjøring av lpxA-hybridspesifikke fragmenter lykkes det til slutt å isolere levedyktige kanR- H44/76[pHBK30] transformanter hvor det kromosomale IpxA-gen var blitt erstattet av hybridkonstruktet slik som vist i fig. 2.
LPS hos mutanten H44/76[pHBK30] og vildtypestammen ble sammenlignet ved Tricine-SDS-PAGE etterfulgt av en sølv-flekk for karbohydrater (fig. 3). Overraskende kunne ikke noe LPS påvises i hybridderivatet ved denne metode, selv når større mengder cellelysater ble lastet på gelen.
For å få mer innsikt i strukturen til yttermembranen til H44/76[pHBK30] ble et panel av LPS- og OMP-spesifikke mantistoffer testet i en helcelle ELISA (tabell 1). Mutantstammen bandt ikke noen av de LPS-spesifikke mantistoffer, mens de OMP-spesifikke mantistoffer viste lignende bind-ingsmønstre for mutant og vildtype. Denne tilsynelatende OMP-likhet ble bekreftet når OMCer av H44/76[pHBK30] og H44/76 ble isolert og analysert ved SDS-PAGE (fig. 3). Begge stammer viser like mengder av OMP av klasse 1, 3 og 4. I motsetning til vildtypen uttrykker mutanten tilsynelatende også en OMP av klasse 5.
Som følge av at LPS i H44/76[pHBK30] ikke kunne påvises med noen av de metoder som er beskrevet ovenfor ble det stilt spørsmål om den var nærværende i det hele tatt. Derfor ble mutant- og vildtypestammen testet i en kromogen Limulus-prøve (LAL) med meningokokkmedium som en negativ kontroll. Denne prøve avhenger av aktivering av den klump-dannende enzymkaskade i amøbocyttlysat fremstilt av heste-skokrabbe og er i stand til å påvise endotoksin i mengder på pikogram. Resultatene av LAL-prøve på cellesuspensjoner viste ingen betydelig endotoksinaktivitet for H44/76-[pHBK30] i forhold til meningokokkmedium (henholdsvis 0,3 og 1,7 EU/ml) i motsetning til 21,7 x IO<4> EU/ml for vildtypen.
Sammen viser disse resultater at det innledende forsøk med å erstatte vildtype IpxA-genet med hybridkonstruktet resulterte i isolering av det som tilsynelatende var en LPS-manglende mutant. Dette ble ytterligere bekreftet ved analyse ved gasskromatografi/massespektrometri (GS-MS) av fettsyrer i OMC-preparater, noe som viste at det Lipid A-spesifikke 3-OH C12 bare var tilstede i spormengder i mutanten. Idet denne fettsyre tilsettes i det første trinn av biosyntesen av Lipid A viser dens fravær at mutanten virkelig er LPS-manglende og ikke bare danner et ufull-stendig forstadiumsmolekyl uten antistoffbinding eller LAL-prøveaktivitet.
Selv om H44/76[pHBK30] er helt levedyktig var en redusert veksthastighet sammenlignet med vildtypestammen tydelig. Ved vekst natten over på gelkromatografi-agar-plater produserte mutantstammen mye mindre kolonier. I væskemedium var doblingstiden under eksponentiell vekst ca. 50% høyere enn i vildtypestammen H44/76.
Morfologien til H44/76[pHBK30] og dens morstamme ble undersøkt ved elektronmikroskopi på ultratynne snitt. I
motsetning til vildtypen var cellene til H44/76[pHBK30] mer heterogene i størrelse, og en betydelig fraksjon viste tegn på lysis. Men yttermembranen kunne klart sjeines i den LPS-manglende mutant (fig. 5). I motsetning til det noe
"posete" utseende i vildtypen viste mutantens yttermembran en "trangere pasning", noe som eventuelt indikerer en senket fremstillingshastighet.
Eksempel 2: Konstruksjon av en lpxA - knockout- mutant.
En lpxA-knockout-mutant av N. meningitidis ble konstruert ved insertering av en kanamycin-resistent kassett i BstEII-setet lokalisert i posisjon 293 i IpxA-genet av plasmid pLA21 (et pUC18-derivat med et 2,1 kb lpxD- fabZ-IpxA-insert). Det resulterende plasmid pLAK33 ble kuttet med Xbal/ SacI og transformert til stamme H44/76 med selek-sjon for kanamycinresistens. Som ventet viste de resulterende kolonier samme vekstegenskaper som mutanten H44/76[pHBK30], noe som indikerer mangel på LPS. Dette ble bekreftet ved hjelp av en helcelle-ELISA hvor lpxA-knockout-mutanten ikke bandt noen av de LPS-spesifikke mantikropper. Disse resultater viste nok en gang at Lipid A biosyntesebanen i stamme H44/76 av N. meningitidis fører til levedyktige, LPS-manglende mutanter.
Detaljert beskrivelse av metoder og stammer anvendt i eksemplene.
Når ingen spesifikke detaljer er gitt er det benyttet standard teknologi. Når det er angitt referanser henvises det til innholdet i disse.
Bakteriestammer og - plasmider.
E. coli-stammene NM522 og INVaF<1> ble dyrket på LB-medium ved 37°C. N. meningitidis- stamme H4 4/76 og dens derivater ble dyrket ved 37°C på gelkromatografimediumbase (Difco) supplert med IsoVitaleX (Becton Dickinson) i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO2, eller i væskemedium slik som beskrevet (Van der Ley et al., 1993). For valg av meningokokktransformanter (Van der Ley et al., 1996) ble kanamycin anvendt i en konsentrasjon på 75-100 ug/ml. Ved E. coli ble antibiotika anvendt i følgende konsentrasjoner: ampicillin, 100 ug/ml; kanamycin, 100 ug/ml. For kloning av PCR-fragmenter ble TA-kloningskittet med vektoren pCRII (Invitrogen) anvendt. En annen vektor som ble anvendt var pUC18.
Rekombinante DNA- teknikker.
De fleste rekombinante DNA-teknikker var slik som beskrevet i Sambrook et al., (1989). Plasmid-DNA ble isolert under anvendelse av pLASmix-kittet (Talent). Polymerase-kjedereaksjonen (PCR) ble utført i et Perkin Eimer GeneAmp PCR-system 9600 med Taq-polymerase. Sekvensanalyse ble ut-ført med et automatisk sekvenseringsapparat fra Applied Biosystems på dobbelt-kjedete plasmid-DNA-templater (isolert med Qiagen-kolonner) og med en syklus-sekvenserings-protokoll.
LPS- analyse.
Tricin-natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese ble ut-ført i 4% stablende og 16% separerende geler slik som beskrevet av Lesse et al., (1990). Proteinase K-behandlete, koke bakterieceller ble anvendt som prøver. Gelene ble kjørt i 17 timer ved en konstant strømstyrke på 20 mA og sølvfarget ved metoden til Tsai og Frasch (1982). Den kromogene LAL-prøve for endotoksinaktivitet ble utført under anvendelse av kittet QCL-1000 fra BioWhittaker Inc.
(Walkersville, MD, USA) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Kulturer natten over ble tynnet i meningo-
kokkmedium til en optisk tetthet ved 620 nm på 0,1, og seriefortynninger av disse stabler ble anvendt som prøver i LAL-prøven. For fettsyreanalyse ved GC-MS ble OMC-prøver acetylert i 3 timer ved 90°C i pyridin og eddiksyreanhydrid for å oppløse LPS fullstendig. Prøvene ble deretter opp-varmet i 3 timer ved 65°C i tetrahydrofuran i nærvær av LiAlH4 for å redusere de 0-bundne fettsyrer til de frie alkoholer. Disse ble derivatisert til TMS-etere i 1 time ved 60°C med BSTFA + 1% TMCS i pyridin og analysert ved GC-MS i et Autospec-apparat (Micromass, Manchester, UK) ved elektronstøtmetoden. Mengden 3-OH C12 i prøvene ble bestemt kvantitativt ved anvendelse av 2-OH C12 som intern standard.
Karakterisering av OMP- sammensetning.
Binding av mantistoffer som er spesifikke for OMPer av klasse 1, 3 og 4 og for oligosakkaridgelen av LPS av immunotype L3 ble testet i en helcelle ELISA (Van der Ley et al., 1995, 1996). Isolering av OMCer ved sarkosyl-ekstraksjon og analyse av dem ved SDS-PAGE ble utført slik som beskrevet ovenfor (Van der Ley et al., 1993).
Referanser.
M.J. Akers, Parenteral Quality Control. Kapittel 2: "Pyrogen Testing". Marcel Dekker Inc. New York og Basel, 1985, p 79-142.
G. F.-L Ames, E.N. Spudich og H. Nikaido: "Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimurium: effect of lipopolysacharide mutations", J. Bacteriol, Vol 117, 1974, p 406-416. M.S. Anderson og C.R.H. Raetz: "Biosynthesis of lipid A precursors in Escherichia coli. A cytoplasmic acyltransferase that converts UDP-N-acetylglucosamine to UDP-3-0-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine", J. Biol. Chem., Vol 262, 1987, p 5159-5169.
H. de Cock og J. Tomassen: "Lipopolysaccharides and divalent cations are involved in the formation of an assembly-competent intermediate of outer-membrane protein PhoE of E. coli", EMBO J., Vol 15, 1996, p 5567-5573.
J. Coleman og C.R.H. Raetz: "First committed step of lipid A biosynthesis in Escherichia coli: Sequence of the lpxA gene", J. Bacteriol., Vol 170, 1988, p 1268-1274.
F.R. Gabler: "Pyrogens, and the depyrogenation of solutions with ultrafiltration membranes", p 919-939 i: T.H. Meltzer, "Filtration in the pharmaceutical industry", Marcel Dekker, Inc., New York og Basel, 1987, M.J. Karnovsky: "Use of ferrocyanide-reduced osmium tetraoxide in electron microscopy", Proe. 11. Ann. Meeting Soc. Cell Bil., Vol 51, 1971, p 146.
J. Koplow og H. Goldfine: "Alterations in the outer membrane of the cell envelope of heptose-deficient mutants of Eschericihia coli", J. Bacteriol, Vol 117, 1974, p 527-543. V.A. Kulshin, U. Zåhringer, B. Lindner, CE. Frasch, C. Tsai, A. Dimitriev og E.T. Rietschel: "Structural characterization of the lipid A component of phatogenic Neisseria meningitidis", J. Bacteriol, Vol 174, 1992, p 1793-1800. M.W. Laird, A.W. Kloser, og R. Misra: "Assembly of LamB and OmpF in deep rough lipopolysaccharide mutants of Escherichia coli K-12", J. Bacteriol, Vol 176, 1994, p 2259-2264.
A.J. Lesse, A.A. Campagnari, E.W. Bittner og M.A. Apicella: "Incrased resolution of lipopolysaccharides and lipooligosaccharides utilising tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis", J. Immunol. Meth., Vol 126, 1990, p 109-117.
P. Van der Ley, J. Van der Biezen, P. Hohenstein, C. Peeters og J.T. Poolman: "Use of transf ormation to construct antigenic hybrids of the class 1 outer membrane protein in Neisseria meningitidis", Infect Immun., Vol 61, 1993, p 4217-4224.
P. Van der Ley, J. Van der Biezen og J.T. Poolman: "Construction of Neisseria meningitidis strains carrying multiple chromosomal copies of the porA gene for use in the production of a multivalent outer membrane vesicle vaccine", Vaccine, Vol 13, 1995, p 401-407.
P. Van der Ley, M. Kramer, L. Steeghs, B. Kuipers, S.R. Andersen, M.P. Jennings, E.R. Moxon og J.T. Poolman: "Identification of a locus involved in meningococcal lipopolysaccharide biosynthesis by deletion mutagenesis", Mol. Microbiol., Vol 19, 1996, p 1117-1125. M. Nakano og M. Matsuura: "Lipid A", p 315-335, i: Stewart-Tull, D.E.S. (Ed.), "The Theory and Practical Application of Adjuvants", John Wiley & Sons, 1995,.
H.R. Onishi, B.A. Pelak, L.S. Gerckens et al.: "Antibacterial agents that inhibit lipid A biosynthesis", Science 274, 1996, p 980-982.
J.T. Poolman: "Development of a meningococcal vaccine", Infect. Agents Dis., Vol 4, 1995, p 13-38. C.R.H. Raetz: "Biochemistry of endotoxins", Annu. Rev. Biochem., Vol 59, 1990, p 129-170. C.R.H. Raetz og S.L. Roderick: "A left-handed parallell 15 helix in the structure of UDP-N-Acetylglucosamine acyltransferase", Science 270, 1995, p 997-1000.
G. Reid, I. Hindennach og U. Henning: "Role of lipopolysaccharide in assembly of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA, OmpC and OmpF", J. Bacteriol., Vol 172, 1990, p 6048-6053.
J. Sambrook, E.F. Fritsch og T. Maniatis: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, New York, 1989.
K. Sen og H. Nikaido: "Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin", J. Bacteriol., Vol 173, 1991, p 926-928. L. Steeghs, M.P. Jennings, J.T. Poolman og P. Van der Ley: "Isolation and characterization of the Neisseria meningitidis IpxD- fabZ- lpxA gene cluster involved in lipid A biosynthesis", Gene, Vol 190, 1997, p 263-270. CM. Tsai og G.E. Frasch: "A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels", Anal. Biochem., Vol 119, 1982, p 115-119.
A.F.M. Verheul, H. Snippe og J.T. Poolman: "Meningo-cocal lipopolysaccharides: Virulence factor and potential vaccine component", Microbiol. Rev., Vol 57, 1993, p 34-49.
R. Vuorio, T. Hårkonen, M. Tolvanen og M. Vaara: "The novel hexapeptide motif found in the acyltransferase LpxA and LpxD of lipid A biosynthesis is conserved in various bacteria", FEBS Lett., Vol 337, 1994, p 289-292.
U. Zåhringer, B. Lindner og E.Th. Rietschel: "Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides", p 211-276 i: D. Horton (Ed.), "Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry", Vol 50, Academic Press Inc., San Diego, 1994,.
Claims (19)
1. Gram-negativ mutant av en mukøs bakterie, karakterisert ved en mutasjon slik at den er levedyktig, er i stand til å danne OMP og mangler endotoksisk lipopolysakkarid (LPS), og at mutanten er fri for LPS.
2. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1, karakterisert ved en mutasjon slik at den er fri for Lipid A.
3. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at bakterien er valgt blant diplokokker.
4. Gram-negativ mutant i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at bakterien er valgt blant gonokokker, f.eks. N. gonorrhoeae.
5. Gram-negativ mutant i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at bakterien er valgt blant meningokokker, f.eks. N. meningitidis.
6. Gram-negativ mutant i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at bakterien er valgt fra gruppen som omfatter Bordetella, f.eks. Bordetella pertussis.
7. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter en mutasjon i minst ett gen forbundet med biosyntese av Lipid A.
8. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i minst ett gen forbundet med det tidlige stadium og biosyntesen av Lipid A hvor det tidlige stadium er før dannelsen av følgende struktur:
9. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i minst ett gen valgt blant lpxA, lpxD og lpxB.
10. Gram-negativ mutant i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at mutanten omfatter en mutasjon i det minste i genet lpxA.
11. Vaksine mot en gram-negativ mukøs bakterie, karakterisert ved at vaksinen omfatter en mutant ifølge et av kravene 1-10 som en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer.
12. Vaksine i samsvar med krav 11, karakterisert ved at vaksinen er en svekket, levende vaksine eller en helcellevaksine.
13. Vaksine ifølge et av kravene 11-12, karakterisert ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.
14. Yttermembranvesikkelvaksine mot en gram-negative mukøs bakterie, karakterisert ved at vaksinen omfatter yttermembranvesikler avledet fra en mutant ifølge et av kravene 1-10 , og en farmasøytisk akseptabel bærer og ved at vaksinen er stort sett fri for endotoksisk LPS, hvor stort sett fri defineres som LPS-fri ifølge Limulus-prøven.
15. Vaksine i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte yttermembranvesikkelen omfatter en OMP.
16. Vaksine i samsvar med et av kravene 11-15, karakterisert ved at den dessuten inneholder en adjuvans.
17. Fremgangsmåte til fremstilling av LPS-fri vaksine, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene a) dyrking av en mutant ifølge et av kravene 1-10, og b) blanding av mutanten eller yttermembranvesikler avledet fra mutanten med en farmasøytisk akseptabel bærer.
18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 17, karakterisert ved at yttermembranvesiklene omfatter en OMP.
19. Fremgangsmåte til fremstilling av LPS-frie OMP, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene a) dyrking av en mutant ifølge et av kravene 1-10, og b) isolering OMP fra nevnte kulturen.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/NL1997/000474 WO1999010497A1 (en) | 1997-08-21 | 1997-08-21 | Novel mutants of gram negative mucosal bacteria and application thereof in vaccines |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20000774D0 NO20000774D0 (no) | 2000-02-17 |
NO20000774L NO20000774L (no) | 2000-04-14 |
NO326858B1 true NO326858B1 (no) | 2009-03-02 |
Family
ID=19866207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20000774A NO326858B1 (no) | 1997-08-21 | 2000-02-17 | Mutanter av gram-negative mukose bakterier som er i stand til a danne OMP og mangler LPS, og anvendelse derav i vaksiner |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7011836B1 (no) |
EP (1) | EP0991761B1 (no) |
JP (1) | JP2001514001A (no) |
AT (1) | ATE384130T1 (no) |
AU (1) | AU755462B2 (no) |
CA (1) | CA2300854C (no) |
DE (1) | DE69738472T2 (no) |
DK (1) | DK0991761T3 (no) |
ES (1) | ES2301181T3 (no) |
NO (1) | NO326858B1 (no) |
PT (1) | PT991761E (no) |
WO (1) | WO1999010497A1 (no) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9918319D0 (en) * | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
ATE394490T1 (de) * | 2000-03-02 | 2008-05-15 | Cp Kelco Us Inc | Mutante bakteriestämme vom genus sphingonomas die defizient in der herstellung von polyhydroxybutyrate sind, und verfahren zur klärung von sphinganen |
GB0220194D0 (en) | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Improved vesicles |
EP1654364A4 (en) * | 2003-08-13 | 2008-02-13 | Novartis Vaccines & Diagnostic | CURRENT HOST CELL RELEASE COMPRISING POLYNUCLEOTIDES ENCODING IMMUNOGENS |
CA2550927A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | A gram negative bacterium with reduced lps level in the outer membrane and use thereof for treating gram negative bacterial infection |
WO2006085910A2 (en) * | 2004-06-04 | 2006-08-17 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Endotoxin-free moraxella catarrhalis |
GB0424092D0 (en) | 2004-10-29 | 2004-12-01 | Chiron Srl | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins |
AU2007207519B2 (en) * | 2006-01-19 | 2010-05-20 | Research Corporation Technologies, Inc. | Viable non-toxic gram negative bacteria |
GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
BRPI0818545A2 (pt) | 2007-10-19 | 2017-07-04 | Novartis Ag | formulações de vacinais meningocócicas |
EP2886551A3 (en) | 2008-02-21 | 2015-09-23 | Novartis AG | Meningococcal fhbp polypeptides |
SI2268618T1 (sl) | 2008-03-03 | 2015-09-30 | Novartis Ag | Spojine in sestavki kot modulatorji aktivnosti TLR |
CN102300585A (zh) | 2008-12-17 | 2011-12-28 | 诺华有限公司 | 包含血红蛋白受体的脑膜炎球菌疫苗 |
CN102762226A (zh) | 2009-06-10 | 2012-10-31 | 诺华有限公司 | 含苯并萘啶的疫苗 |
NZ598458A (en) | 2009-08-27 | 2014-03-28 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
EP2470205A1 (en) | 2009-08-27 | 2012-07-04 | Novartis AG | Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation |
JO3257B1 (ar) | 2009-09-02 | 2018-09-16 | Novartis Ag | مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr |
NZ598654A (en) | 2009-09-02 | 2014-05-30 | Novartis Ag | Immunogenic compositions including tlr activity modulators |
US20130022639A1 (en) | 2009-09-30 | 2013-01-24 | Novartis Ag | Expression of meningococcal fhbp polypeptides |
CN102917730A (zh) | 2009-10-27 | 2013-02-06 | 诺华有限公司 | 修饰的脑膜炎球菌fHBP多肽 |
WO2011057148A1 (en) | 2009-11-05 | 2011-05-12 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators |
WO2011084549A1 (en) | 2009-12-15 | 2011-07-14 | Novartis Ag | Homogeneous suspension of immunopotentiating compounds and uses thereof |
DK2545162T3 (en) * | 2010-03-12 | 2017-02-06 | Res Corp Tech | Viable Gram Negative Bacteria Lacking Outer MEMBRANE AGONISTS FOR TLR4 / MD-2 |
JP2013522287A (ja) | 2010-03-18 | 2013-06-13 | ノバルティス アーゲー | 血清群b髄膜炎菌のためのアジュバント添加ワクチン |
WO2011119759A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | Irm Llc | Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc. |
US9259462B2 (en) | 2010-09-10 | 2016-02-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Developments in meningococcal outer membrane vesicles |
WO2012153302A1 (en) | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Novartis Ag | Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines |
BR112014019166A2 (pt) | 2012-02-02 | 2017-07-04 | Novartis Ag | promotores para expressão aumentada de proteína em meningococos |
CA2882619A1 (en) | 2012-09-06 | 2014-03-13 | Novartis Ag | Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p |
LT3110442T (lt) | 2014-02-28 | 2020-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modifikuoti meningokokinio fhbp polipeptidai |
BR112020015639A2 (pt) | 2018-02-06 | 2021-03-30 | Evelo Biosciences, Inc. | Composições e métodos para o tratamento de câncer e distúrbios imunológicos usando bactérias veillonella |
WO2019169181A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using lactobacillus salivarius |
WO2019169168A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using agathobaculum |
EP3799884A1 (en) * | 2019-10-01 | 2021-04-07 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic compositions |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8912330D0 (en) * | 1989-05-30 | 1989-07-12 | Wellcome Found | Live vaccines |
ES2145072T3 (es) | 1993-05-13 | 2000-07-01 | American Cyanamid Co | Preparacion y usos de proteinas de membranas externas carentes de los de cocos gramnegativos. |
US6887483B2 (en) * | 1995-12-01 | 2005-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria |
WO1997025061A1 (en) | 1996-01-09 | 1997-07-17 | Bristol-Myers Squibb Company | De-myristolated lipopolysaccharide of gram-negative bacteria |
-
1997
- 1997-08-21 CA CA2300854A patent/CA2300854C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-21 AU AU39540/97A patent/AU755462B2/en not_active Ceased
- 1997-08-21 DK DK97936881T patent/DK0991761T3/da active
- 1997-08-21 JP JP2000507805A patent/JP2001514001A/ja active Pending
- 1997-08-21 US US09/486,073 patent/US7011836B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-21 WO PCT/NL1997/000474 patent/WO1999010497A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-21 AT AT97936881T patent/ATE384130T1/de active
- 1997-08-21 ES ES97936881T patent/ES2301181T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-21 DE DE69738472T patent/DE69738472T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-21 PT PT97936881T patent/PT991761E/pt unknown
- 1997-08-21 EP EP97936881A patent/EP0991761B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-17 NO NO20000774A patent/NO326858B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69738472T2 (de) | 2009-01-02 |
WO1999010497A1 (en) | 1999-03-04 |
ATE384130T1 (de) | 2008-02-15 |
US7011836B1 (en) | 2006-03-14 |
CA2300854A1 (en) | 1999-03-04 |
NO20000774D0 (no) | 2000-02-17 |
PT991761E (pt) | 2008-04-28 |
CA2300854C (en) | 2011-04-05 |
AU755462B2 (en) | 2002-12-12 |
JP2001514001A (ja) | 2001-09-11 |
AU3954097A (en) | 1999-03-16 |
NO20000774L (no) | 2000-04-14 |
EP0991761B1 (en) | 2008-01-16 |
DE69738472D1 (de) | 2008-03-06 |
EP0991761A1 (en) | 2000-04-12 |
ES2301181T3 (es) | 2008-06-16 |
DK0991761T3 (da) | 2008-05-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO326858B1 (no) | Mutanter av gram-negative mukose bakterier som er i stand til a danne OMP og mangler LPS, og anvendelse derav i vaksiner | |
Koster et al. | The outer membrane component, YscC, of the Yop secretion machinery of Yersinia enterocolitica forms a ring‐shaped multimeric complex | |
Allen et al. | The identification, cloning and mutagenesis of a genetic locus required for lipopolysaccharide biosynthesis in Bordetella pertussis | |
Tønjum et al. | The pilus colonization factor of pathogenic neisserial species: organelle biogenesis and structure/function relationships–a review | |
Drake et al. | PilP, a pilus biogenesis lipoprotein in Neisseria gonorrhoeae, affects expression of PilQ as a high‐molecular‐mass multimer | |
Mattick et al. | The molecular genetics of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa-a review | |
CA2452836C (en) | Meningococcus adhesins nada, app and orf 40 | |
KR20160062169A (ko) | 숙주 세포 변형 방법 | |
KR20150068998A (ko) | 숙주 세포 변형 방법 | |
US9402889B2 (en) | Live, oral vaccine for protection against Shigella dysenteriae serotype 1 | |
US20240148848A1 (en) | Immunogenic compositions | |
KR20150048771A (ko) | 신규의 약독화된 시겔라 생백신 | |
Zhang et al. | A σE-mediated temperature gauge orchestrates type VI secretion system, biofilm formation and cell invasion in pathogen Pseudomonas plecoglossicida | |
Van Der Ley et al. | Identification of a locus involved in meningococcal lipopolysaccharide biosynthesis by deletion mutagenesis | |
Kamal | Functions of the Neisseria meningitidis TolC protein | |
Bishop | Dissecting protein-protein interactions facilitating secretion of the virulence factor EspC by enteropathogenic Escherichia coli | |
Rowley | Characterisation of the S. Typhimurium σE regulon | |
Runyen-Janecky et al. | Complete Genome Sequence and |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |