NO324857B1 - Enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, naeringsmiddelprodukt, varmebehandlet naeringsmiddelprodukt, fremgangsmate for hydrolysering av fytat, samt fremgangsmate for forbedring av naeringsmiddel- eller fôr-fordoyelsen ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjodsel. - Google Patents

Enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, naeringsmiddelprodukt, varmebehandlet naeringsmiddelprodukt, fremgangsmate for hydrolysering av fytat, samt fremgangsmate for forbedring av naeringsmiddel- eller fôr-fordoyelsen ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjodsel. Download PDF

Info

Publication number
NO324857B1
NO324857B1 NO19941183A NO941183A NO324857B1 NO 324857 B1 NO324857 B1 NO 324857B1 NO 19941183 A NO19941183 A NO 19941183A NO 941183 A NO941183 A NO 941183A NO 324857 B1 NO324857 B1 NO 324857B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
phytase
acid phosphatase
phytate
activity
enzyme preparation
Prior art date
Application number
NO19941183A
Other languages
English (en)
Other versions
NO941183L (no
NO941183D0 (no
Inventor
Eric Eugene Maurice Vanderbeke
Marnix De Schrijver
Annie Maria Magdalena Vermeire
Original Assignee
Aveve Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8213746&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO324857(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aveve Nv filed Critical Aveve Nv
Publication of NO941183D0 publication Critical patent/NO941183D0/no
Publication of NO941183L publication Critical patent/NO941183L/no
Publication of NO324857B1 publication Critical patent/NO324857B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/12—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from cereals, wheat, bran, or molasses
    • A23J1/125—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from cereals, wheat, bran, or molasses by treatment involving enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • A23J1/148—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds by treatment involving enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/30—Removing undesirable substances, e.g. bitter substances
    • A23L11/33—Removing undesirable substances, e.g. bitter substances using enzymes; Enzymatic transformation of pulses or legumes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/06—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
    • A23L7/107—Addition or treatment with enzymes not combined with fermentation with microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, næringsmiddelprodukt, varmebehandlet næringsmiddelprodukt, fremgangsmåte for hydrolysering av fytat, samt fremgangsmåte for forbedring av næringsmiddel- eller f6r-fordøyelsen ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjødsel.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Det er fastslått at tilstedeværelse av essensielle mineraler spiller en viktig rolle ved foring av dyr. Tilgjenge-ligheten og fordøyelsen av disse f6r-bestanddelene reflekteres i dyrets ytelse og utskilling i avføringen. På grunn av økning av intensiv husdyrproduksjon, forårsaker produksjon av gjødsel problemer for omgivelsene, delvis på grunn av dens fosfater. Videre medfører lovgivning angående gjødsels-pro-blematikken, særlig fosfor-innhold i gjødselen, utgifter, noe som gjør det nødvendig å redusere fosfor-utskillelse til omgivelsene .
Fosfor tilsettes til foret ved forskjellige plante-råstoffer, animalske biprodukter og uorganisk fosfor.
EP 321004 beskriver en fremgangsmåte for bløtlegging av kornkjerner i nærvær av fytatdegraderende enzymer avledet fra Aspergillus.
EP 449375 beskriver ekspresjon av fytase i planter.
Zyla, K. and Korelski J., J. Sei. Food Agric. 61:1-6,
1993 og Zyla K., World J. Microbiol. Biotechnol. 9:117-119,
1994 beskriver begge tilsetning av sur fosfatase til fystase for forbedring av fytatdegraderingen. Den synergistiske effekten i de undersøkte blandingene ble derimot ikke
beskrevet.
Fytinsyre eller fytat er heksa-fosfor-esteren av inositol (myo-inositol-heksakisfosfat), som finnes i mange frø og korn.
Den virker som den primære lagringsform for både fosfor og inositol, og svarer for mer enn 50% av det totale fosfor-
innhold (LOLAS et al., 1976; SAUVEUR, 1989). Oljefrø kan inneholde opptil 5,2% fytin (REDDY et al., 1982).
Fytin-fosfor fra planteråstoffer fordøyes imidlertid dårlig hos én-mavede dyr så som fjærfe, svin og mennesker, på grunn av deres enkle tarmkanal: de mangler eller har bare lav intestinal fytase-aktivitet til å katalysere hydrolyse av disse fytater i tarmen, og fytin-fosfor frigjøres i kolon og utskilles til omgivelsene. Planteråstoffer er således dårlige fosforkilder for dyrefor, og ytterligere fosfor må tilsettes til kosten som animalske biprodukter eller uorganiske fosfater .
Fytin betraktes videre som en anti-ernærings-faktor på grunn av dens chelaterings-egenskaper: den binder mange fler-verdige kationer så som Ca<2+>, Fe<3+>, Mg<2+> og Zn<2+> ved å danne uoppløselige komplekser med dem og reduserer således biotilgjengeligheten og absorpsjonen av disse essensielle minera-lene i føden. Dessuten hindrer kompleksering av proteiner med fytin (COSGROVE, 1966), enzymatisk protein-fordøyelse.
De negative virkningene til fytin på fosfor- og mineral-metabolisme, sammen med høy fosfor-utskillelse til omgivelsene og den eksisterende lovgivning angående fosfor-utskillelse, gjør det nødvendig å gjøre fytin-fosfor biotilgjengelig.
Fytin eller fytater kan hydrolyseres enzymatisk av fytaser som enten er tilstede i planteråstoffene eller produseres av mikroorganismer.
Enzymet fytase (myo-inositol heksafosfat-fosfohydrolase E.C. 3.1.3.8.) hydrolyserer, under passende betingelser, fytinsyre eller fytat til uorganisk fosfat, inositol og inositol-mono- til penta-fosfater.
Fytase er utbredt i planter og mikroorganismer, særlig sopp, men finnes bare i ubetydelige mengder i tarmkanalen til én-mavede dyr.
Plante-fytaser blir, på grunn av deres lave pH-stabilitet og smale pH-aktivitets-område (SUTARDI & BUCKLE, 1986, LOLAS & MARKAKIS, 1977), raskt inaktivert i fordøyelseskanalen til én-mavede dyr, og deres in vivo effektivitet er liten (EECKHOUT & DE PAEPE, 1991) . De er derfor av mindre betydning ved frem-stilling av dyrefor.
I motsetning til dette har noen mikrobielle fytaser bred pH-stabilitet og pH-aktivitetsområde, hvorved fytin mer effektivt kan hydrolyseres i fordøyelseskanalen til dyret. Av denne grunn er det blitt utviklet mikrobiell fytase-produksjonsprosesser for å øke fytin-fosfor i dyrefor, ved anvendelse av fytase som kan tåle de sure betingelsene i maven. Varmestabiliteten til fytase er allikevel for dårlig til å tåle de høye temperaturer (70-80°C) som anvendes ved for-fremstillingsprosessen. Det kan således være nødvendig å anvende en overdose på 30%.
Det er allerede demonstrert in vivo at tilsetning av sopp-fytase kan forbedre opptagelse av fytin-fosfor og mineraler, hvorved fosfor-omdannelses-koeffisienten øker og fosfor-mengden i for og gjødsel reduseres.
Mikrobiell fytase-aktivitet er godt dokumentert. Ved siden av bakterielle (GREAVES et al., 1967; IRVING & COSGROVE, 1971; POWAR & JAGANNATHAN, 1982) og gjær-fytaser (NAYINI & MARKAKIS, 1984), finnes fytaser hovedsakelig i mugg, spesielt Aspergillus-stammer (SHIEH & WARE, 1968; YAMAMOTO et al., 1972; YOUSSEF et al., 1987). Mesteparten av disse stammene, og andre mikroorganismer, produserer også sure fosfataser. Selv om noen fosfataser er blitt kalt fytaser, er de heller uspesifikke, og deres hydrolytiske virkning på fytin er lav sammenlignet med andre organiske fosfater.
Avhengig av fermenterings-betingelsene, produserer
Aspergillus ficuum NRRL 3135 vill-type, en blanding av ekstra-cellulære fosfataser og fytase(r). Fytase- og sur fosfatase-syntese kan reguleres ved fosforkonsentrasjonen, i henhold til metoder kjent på området (SHIEH et al., 1969; ULLAH and CUMMINS, 1987). Nylig publiserte patentsøknader beskriver anvendelse av genetisk konstruerte Aspergillus ficuum NRRL 3135 og Aspergillus niger stammer, for å oppnå høyt produksjonsnivå av fytase (EP 0 420 358 Al). Kloning av sur fosfatase er også nevnt i dette dokument.
Rensning av rå A. ficuum NRRL 3135 fytase dyrkningsvæske (ULLAH & GIBSON, 1987) gir en fytase med to distinkte pH-optima: høyest aktivitet er funnet ved pH 5,0-5,5, mens den andre aktivitetstopp (60% av pH 5,0 aktiviteten) forekommer ved pH 2,2.
ULLAH & CUMMINS (1987) renset en Aspergillus ficuum NRRL 3135 sur fosfatase (ortofosforsyre-monoester-fosfohydrolase E.
C. 3.1.3.2.) med et pH-optimum på 2,5. Den sure fosfatasen er 65% mindre aktiv ved pH 4,5 og er på det nærmeste inaktiv ved pH 6,0. En annen sur fosfatase ble renset av ULLAH & CUMMINS
(1988) med et pH-optimum på 6,0.
Begge de sure fosfatasene var ute av stand til å anvende fytat som substrat, selv om de oppviser bred substrat-selekti-vitet på forskjellige organiske fosfomonoestere (ULLAH & CUMMINS, 1988). IRVING & COSGROVE (1974) nevnte derimot en bi-aktivitet (16%) av A. ficuum sur fosfatase med pH-optimum 2,2 på fytat.
Nyere publikasjoner av ZYLA (1993) beskriver virkning av sur fosfatase i nærvær av fytase fra Aspergillus niger på f6r-råstoff og for ved forskjellige pH-verdier.
A. ficuum NRRL 3135 fytase og sure fosfataser er ikke bare forskjellige når det gjelder substrat-spesifisitet og pH-optima, men også når det gjelder temperatur-optima. Fytase utvikler høyest aktivitet ved 58°C, og mister all aktivitet ved 68°C. Sur fosfatase med pH optimum 2,5 har et temperatur-optimum på 63°C og opprettholder 88% av sin katalytiske aktivitet ved 70°C.
Temperatur-optimum for sur fosfatase med pH-optimum 6,0 er også 63°C, men enzymet mister 92% av aktiviteten ved 70°C. Av dette kan det trekkes den konklusjon at den sure fosfatase med pH-optimum 2,5 er aktiv ved høyere temperaturer enn fytase og sur fosfatase med pH-optimum 6,0.
En ikke-renset intracellulær sur fosfatase fra mycelium-avfall fra Aspergillus niger, har et pH-optimum på fra 1,8 til 2,6 og et temperatur-optimum på 60°C. Resterende sur fosfatase aktivitet ved pH 4,5 var enda 85% av det maksimale (ZYLA et al., 1989).
Aspergillus ficuum fytase-aktivitet tilføres til grisefor og broiler-for for å oppnå den ønskede fytin- og fekal fosfor-reduksjon, kombinert med god ytelse hos dyret, innbefattet vekst og foromdannelse. En fytase-aktivitet på 500 til 1000 Enheter (pH 5)/kg for er angitt for grisefor og broiler-for (SIMONS et al., 1990), hvor en aktivitet på 500 Enheter/kg tilsvarer 0,8 g fosfor/kg i grisefor og 1,0 g fosfor/kg i kylling-for (BORRGREVE, 1991, VAHL, 1991). Anbefalt tilsetning av fytase til grisefor er begrenset til 600 Enheter/kg, på grunn av redusert effekt med ytterligere enheter (Natuphos manual, Gist-Brocades).
In vitro hydrolyse av fytin i planteråstoffet hvetekli og soyabønner med urenset intracellulær Aspergillus niger sur fosfatase er fullført etter 2 timer med doser på henholdsvis 12000 og 30000 enheter/kg, 40°C og pH 4,5, mens fytin-hydrolyse i broiler-for er fullført etter 4 timers reaksjonstid under samme betingelser. Dette reflekterer ineffektiviteten til sur fosfatase når det gjelder fytin-nedbrytning (ZYLA et al., 1989) .
ZYLA & KORELESKI (1993) angir at in vitro virkningen til sur fosfatase i tillegg til fytase fra Aspergillus niger på rapsfrø og soyabønner influeres av pH ved inkuberingen. Inkuberingen ble utført med relativt høyt sur fosfatase/fytase forhold (3,5/1 til 62/1, uttrykt som fytat-hydrolyserende aktivitet).
ZYLA (1993) angir at defosforylerings-virkningen til Aspergillus niger sur fosfatase på fytin er forskjellig fra virkningen til Aspergillus niger fytase, noe som resulterer i en additiv virkning for begge enzymene (og en kortere ned-brytningstid) . Den totale fosfor-frigjøring fra fytat er angitt å være langsommere med det mer rensede fytase-preparatet (dvs. lavere sur fosfatase/fytase forhold). Det mest rensede preparatet hadde allikevel et høyt sur fosfatase/- fytase forhold (3,5/1).
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelse av en synergistisk vekselvirkning av fungale sure fosfataser og fytaser, blandet i lavt sur fosfatase/fytase-forhold, ved in vitro og in vivo hydrolyse av fytin i planteråstoffer og for.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig et enzym-preparat med fytat-hydrolyserende aktivitet som omfatter en fytase med fytat-hydrolyserende aktivitet ved en pH-verdi i området fra 2,5 til 5,0 og en sur fosfatase med fytat-hydrolyserende aktivitet ved en pH-verdi på 2,5, i et forhold (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p) på fytat på fra 0,8/1,0 til 3/1, som har en synergistisk virkning på fytat.
Enzympreparatet ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved
at forholdet (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5
(p) på fytat er på fra 1/1 til 2,5/1.
Enzympreparat ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at forholdet (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p)
på fytat er på fra 1,5/1 til 2/1. Mest hensiktsmessig velges den fungale fytase fra gruppen som består av Aspergillus ficuum fytase, Aspergillus niger fytase og Aspergillus terreus fytase.
Enzympreparatet ifølge oppfinnelsen er videre
kjennetegnet ved at fytasen er en fungal fytase, mer foretrukket er den fungale fytasen Aspergillus fytase. Fortrinnsvis er den sure fosfatase en fungal sur fosfatase.
Spesielt angår oppfinnelsen et enzympreparat kjennetegnet ved at den sure fosfatasen er en varmestabil sur fosfatase som beholder aktivitet ved 70°C.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et mat-, næringsmiddel- eller for-produkt, eller en bestanddel derav,
som inneholder et enzympreparat som angitt ovenfor. Det er videre beskrevet et varmebehandlet mat-, næringsmiddel- eller for-produkt, eller en komponent derav, kjennetegnet ved at det inneholder et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en fremgangsmåte for å hydrolysere fytat kjennetegnet ved at den omfatter behandling av et råmateriale som inneholder fytat,
med et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12, idet behandlingen utføres under hydrolyserende betingelser
ved en pH på fra omtrent 2 til omtrent 6, hvor fytase og sur fosfatase i enzympreparatet har hydrolyserende aktivitet.
Behandlingen utføres fortrinnsvis ved en pH på fra ca. 2 til ca. 6, mer foretrukket ved en pH på ca. 2,5.
Ved ovennevnte fremgangsmåte er det fytat-holdige råmateriale fortrinnsvis et vegetabilsk (plante) råstoff, så som spesielt soyabønne- eller hvete-råstoff.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for forbedring av næringsmiddel- eller for-fordøyelse ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjødsel, kjennetegnet ved at husdyrene fores med et næringsmiddel eller for som inneholder et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en forbedret, enzymatisk nedbrytning av plante-fytin med en passende sur fosfatase/- fytase blanding, ved synergistisk vekselvirkning mellom begge enzymene.
I naturen virker fytin som den primære lagringsform for både fosfor og inositol i mange plantefrø og korn. Under spiring frigjøres fosfor fra fytin ved virkningen av fytase, som er tilstede i disse frø og korn.
Når disse plante-råstoffene anvendes innen næringsmiddel-og f6r-industrien, er fytin en potensiell fosfor-kilde for mennesker og dyr. Biotilgjengeligheten av dette fytin er imidlertid begrenset for én-mavede dyr: plante-fytaser inaktiveres i mave-tarm-kanalen på grunn av mavesyre, hvilket gjør deres in vivo effektivitet lav. Fremgangsmåter kan derfor utvikles for å forbedre biotilgjengeligheten av fytin-fosfor og således biotilgjengeligheten og absorpsjonen av essensielle mineraler i kosten.
a. enzymatisk forbehandling av plante-råstoff for å øke fordøyelig fosfor;
b. enzymatisk forbehandling av for eller mat;
c. in vivo fytase-virkning.
Mens plante-fytaser kan spille en viktig rolle ved forbehandling av plante-råstoffer, for og næringsmidler (nøytral pH), er de av mindre betydning for in vivo virkning (pH i maven (2)).
In vivo fytin-hydrolyse kan bedre oppnås mikrobielt, nærmere bestemt med fungale fytaser, som kan utvikle høy aktivitet ved mavesyrens pH, og har høy pH-stabilitet. Fytin-hydrolyserende enzymer produseres av sopp av slektene Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Botrytis. Disse soppene produserer en blanding av sure fosfataser (E.C.3.1.3.2) og fytaser (E.C.3.1.3.8), som begge hydrolyserer fytin, men med forskjellig spesifisitet overfor fytat og fosfat-monoestere. Mesteparten av disse organismene har imidlertid lavt enzym-produksjons-nivå. Ettersom produksjonsnivået av disse enzymene er av avgjørende betydning for å gjøre prosessen økonomisk, ble Aspergillus ficuum NRRL 3135 valgt som en meget produktiv stamme. Alternative sopper er Aspergillus niger og Aspergillus terreus, med et lavere produksjonsnivå.
Selv om både fungale sure fosfataser og fungale fytaser kan hydrolysere oppløst, renset fytin, oppviser sure fosfataser liten aktivitet på fytin i planteråstoff, for eller mat, både in vitro og in vivo. De ble derfor, inntil nylig, ignorert som fytin-hydrolyserende enzymer. Til tross for den lave fytin-hydrolyserende aktiviteten til de sure fosfatasene når de anvendes som eneste enzym-kilde, kan imidlertid fytase-virkningen på fytin forbedres ved supplering med sure fosfataser, på grunn av den synergistiske vekselvirkning mellom enzymene, anvendt i bestemte forhold av sur fosfatase/fytase-aktivitet. Den synergistiske virkningen er til stede ved en passende sammensetning og lavt forhold av begge enzymer.
Ved siden av pH-stabilitet, er varmestabiliteten til de fytin-hydrolyserende enzymer en viktig faktor med hensyn til næringsmiddel- og f6r-fremstillingsprosesser. Ettersom vanli-ge f6r-fremstillingsprosesser ofte benytter pelletert for, må enzymer som settes til foret før pelletering tåle de høye temperaturene som det blir i for-møllen (75-80°C) for å sikre en forutsigbar fytin-hydrolyse. A. ficuum fytase blir delvis denaturalisert ved disse temperaturer, og en overdose på 30% er derfor nødvendig. A. ficuum sur fosfatase er derimot mer stabil, og denaturaliseres mindre, og en sur fosfatase/fytase-blanding er mer stabil ved f6r-pelleterings-prosessen enn fytase selv.
Ved å anvende en blanding av sur fosfatase og fytase istedenfor fytase som eneste enzym, forbedres således plante-fytin-hydrolyse, ikke bare som et resultat av den høyere varmestabiliteten til denne enzym-blandingen, men hovedsakelig som et resultat av en forbedret synergistisk vekselvirkning mellom begge enzymene, ettersom forholdet pH 2,5/5,0 fytat-hydrolyserende aktivitet øker ved forskjellig varme-nedbrytning av begge enzymene.
Fungal A. ficuum eller A. niger sur fosfatase (E.C.3.1.3.2) og A. ficuum fytase (E.C.3.1.3.8) kan begge hydrolysere dodekanatriumfytat i væske, men deres hovedaktivitet er forskjellig: fytase har hovedaktivitet på fytat (1) og bi-aktivitet på monofosfat-estere (2); sur fosfatase har hovedaktivitet på mono-fosfatestere og bi-aktivitet på fytat (eksempel I). Forholdet (l)/(2) for Aspergillus ficuum fytase aktivitet på fytat og dinatrium-S-glycerofosfat er 6,6, mens for A. ficuum sur fosfatase er forholdet (l)/(2) 0,13, hvilket viser den høye spesifisitet til fytase for fytat. For Aspergillus niger sur fosfatase er forholdet (l)/(2) 0,17. Slik det anvendes i den videre beskrivelse, refererer sur fosfatase-aktivitet alltid til fytat-hydrolyse. Den sure fosfatase har optimal aktivitet ved pH 2,3, mens fytase har optimal aktivitet ved pH 5,0, med en andre aktivitetstopp ved 2,5. Enzym-blandinger av fytase og fosfatase karakteriseres i det følgende ved forholdet (a/p) av aktiviteten ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p) på fytat. Ren fytase a/p-forhold er funnet å være ca. 0,6/1, og ren sur fosfatase a/p forhold er funnet å være 1/0.
A. ficuum NRRL 3135- og A. niger fytase- og sur fosfatase-oppløsninger ble oppnådd ved metoder velkjent på området.
En in vitro fytase-test ble satt opp for standard grise-for, lavt fuktighetsnivå (70%), pH 2,5 og 40°C, 3 timers inkubering, for å bestemme den aktive komponent i fytase-preparatene (figurene).
A. ficuum NRRL 3135 fytase-preparater med forskjellige a/p forhold ble satt til grise-for, enten basert på pH 2,5 aktivitet (Ua) eller basert på pH 5 aktivitet (Up) på fytat.
Det eksisterte ingen direkte korrelasjon mellom fytase pH 2,5 aktivitet og fytinhydrolyse, selv om nedbrytningen fant sted ved pH 2,5 og den sure fosfatase kunne hydrolysere opp-løst natriumfytat i væske (figur 1). På den annen side kunne fytin-hydrolyse korrelateres til fytase pH 5,0 aktivitet, særlig når fytase-preparatene ble skilt i preparater med a/p forhold < 1,5/1 og preparater med a/p forhold mellom 1,5/1 og 3/1 (figur 2).
Det kan av dette trekkes den konklusjon at fosfatase-aktiviteten på for-fytin ikke var dominerende. Det ble imidlertid enda funnet variasjon mellom de forskjellige fytase-preparatene, dosert med samme pH 5,0 aktivitet. Disse varia-sjonene ble funnet å henge sammen med forskjellig sur fosfatase-aktivitet i fytase-preparatene (eksempel II): når a/p-forholdet øket fra 0,6/1 til 3/1, og følgelig mengden av sur fosfatase øket, ble fytin-hydrolyse i grise-for favori-sert, og effektiviteten (mengde av fytin-fosfor frigjort med fytase-preparatet (pH 5,0 aktivitet) - (g PP/500 Up) for fytase-blandingen øket (figur 3).
Betydningen av A. ficuum sur fosfatase 1/0 i et fytase-preparat med a/p > 0,6/1 ble demonstrert ved in vitro hydrolyse av grise-f6r-fytin med fytase-preparater 0,6/1 og 1/1, med og uten tilsetning av sur fosfatase 1/0 til a/p-forhold = 2/1 (eksempel III). En synergistisk virkning mellom fytase og sur fosfatase ble funnet. Ved tilsetning av den samme fytase 0,6/1 aktivitet (Up) til grise-foret, supplert med sur fosfatase til et a/p forhold på 2/1, økte fytase-effektiviteten fra 0,55 til 1,25 g PP/500 Up, med en synergistisk virkning på 0,49 g PP/500 Up. Den synergistiske virkningen mellom A. ficuum fytase og sur fosfatase på grise-for var maksimal ved et a/p-forhold på 1,5-2/1, og viste en avtagende virkning når a/p øket til 3/1. Over dette forhold, ble det ikke påvist noen synergistisk virkning (figur 3).
For skiller seg fra hverandre ved for-sammensetning, og kan således påvirke fytase-virkningen, så vel som den synergistiske vekselvirkning mellom fytase- og sur fosfatase-preparater. Forskjellige grise- og fjærkre-for, så som for for smågriser, purker, griser, broilere og verpehøner, ble inkubert in vitro med fytase-preparater a/p 1,6/1, 0,6/1 og en blanding av fytase (0,6/1 og sur fosfatase 1/0 til a/p 2/1.
All fytase- og sur fosfatase-aktivitet varierte sterkt for de forskjellige for (f.eks. fytase 0,6/1: 0,25 -> 1,5 g PP/500 Up; sur fosfatase: 0,025 0,15 g PP/500 Ua), noe som indikerer at forekomsten av fytin i de forskjellige plante-rå-stof f ene er forskjellig, og innvirker på den enzymatiske hydrolyse.
Den synergistiske virkningen av A. ficuum sur fosfatase, påvist i standard grise-for, var overførbar til annet for, men avvek sterkt for de forskjellige forene (0,25 -> 0,94 g PP/500 Up) .
Virkningen av fytin-opprinnelsen på den synergistiske virkningen mellom fytase og sur fosfatase, som antatt ovenfor, ble undersøkt ved in vitro fytin-nedbrytning i forskjellige plante-råstoffer som ofte finnes i dyre-for: erter, hvetekli, soyabønner og riskli (eksempel V). A. ficuum fytase 0,6/1 ble supplert med A. ficuum sur fosfatase 1/0 til et a/p forhold = 2/1.
Effektiviteten til A. ficuum fytase (0,6/1 og 2/1), så vel som til sur fosfatase (1/0) var sterkt varierende. Selv om sur fosfatase hadde liten virkning i standard grise-for (0,15 g PP/500 Ua), kunne noe plantefytin, så som riskli-fytin lett hydrolyseres med sur fosfatase (0,8 g PP/500 Ua). Annet plante-fytin, så som hvetekli- og soyabønnemel-fytin, ble omtrent ikke hydrolysert med A. ficuum sur fosfatase (0,2 g PP/500 Ua).
Den synergistiske virkningen mellom A. ficuum fytase og sur fosfatase, som ble registrert i for, ble bare funnet for de plante-råstoffer hvor sur fosfatase alene hadde liten virkning (0,2 g PP/500 Ua): synergi i soyabønnemel: 0,57 g PP/500 Up; synergi i hvetekli: 0,47 g PP/500 Up.
Den synergistiske virkningen mellom fytase og sur fosfatase var liten når fytin allerede var hydrolysert av sur fosfatase: synergi i riskli: 0,13 g PP/500 Up). Fytin i erter ble lite hydrolysert av begge enzymene, og noen synergistisk vekselvirkning kunne ikke påvises.
Vekselvirkningen mellom A. ficuum sur fosfatase 1/0 og fytase 0,6/1 i for, kan følgelig forklares som et resultat av den normale additive virkning supplert med forskjellige synergistiske virkninger på de forskjellige plante-råstoffer som utgjør foret.
I tillegg til A. ficuum NRRL 3135, produseres fytase og sur fosfatase også av Aspergillus niger stammer. Som A. ficuum, produserer også A. niger en blanding av ekstracellulær fytase og sur fosfatase. A. niger sur fosfatase 1/0 har samme pH aktivitets-profil som A. ficuum sur fosfatase, med et pH-optimum på 2,3. De følgende eksperimenter viste den synergistiske virkningen mellom fytaser og sure fosfataser av forskjellig fungal opprinnelse.
In vitro fytin-hydrolyse i standard grise-for med flytende A. niger fytase-preparater, var identisk med hydrolysen med A. ficuum NRRL 3135 fytase-preparater (eksempel VI). A. niger fytase-effektiviteten øket fra 0,75 til 1,15 g PP/500 Up ettersom a/p-forholdet i fytase-preparatet øket fra 0,9/1 til 1,6/1.
Tilsetning av sur fosfatase, enten fra A. niger eller A. ficuum NRRL 3135, til et A. niger fytase-preparat a/p 1,15/1 for å øke a/p-forholdet til henholdsvis 1,9/1 og 1,6/1, viste den synergistiske vekselvirkningen til disse enzymene (eksempel VII) .
Effektiviteten til begge de sure fosfatasene var lik. Når sur fosfatase ble satt til A. niger fytase 1,15/1, var gjenværende fytin-fosfor i foret null, hvorved enzym-effektivitet og synergisme ikke kunne beregnes riktig, på grunn av utpining av fytat-substratet.
Synergistisk vekselvirkning ble også observert mellom A. niger sur fosfatase og A. ficuum NRRL 3135 fytase: effektiviteten ble fordoblet (0,85 -> 1,8 g PP/500 Up) når A. ficuum fytase 0,6/1 ble supplert med A. niger sur fosfatase 1/0 til a/p 1,9/1, med en synergistisk effekt på 0,62 g PP/500 Up (eksempel VIII).
A. ficuum NRRL 3135 sur fosfatase 1/0 har fordelen av øket varmestabilitet under flytende betingelser og under for-pelletering, hvorved den synergistiske virkningen av fytase 0,6/1 og sur fosfatase 1/0 i pelletert for fremmes.
Denaturering av en flytende fytase 0,6/1-oppløsning var 60%, både for pH 2,5 og pH 5 aktivitet, etter 1 min. ved 80°C og pH 5 (0,5M acetat-buffer), mens en sur fosfatase 1/0 opp-løsning bare mistet 10% av sin aktivitet under identiske inkuberings-betingelser.
Varmestabiliteten under for-mølle betingelsene ble simu-lert. Flasker ble fylt med standard grise-for, tilsatt flytende fytase 0,6/1 eller sur fosfatase 1/0 preparater. Fuktigheten i blandingen var 12,2%. Flaskene ble lukket og oppvarmet ved forskjellige temperaturer (60-90°C) ved at de ble senket i vannbad (eksempel IX).
A. ficuum sur fosfatase 1/0 aktivitet (pH 2,5) var fort-satt 100% etter 10 minutters oppvarmning ved 70°C, mens A. ficuum fytase 0,6/1 allerede hadde tapt 40% av sin aktivitet (pH 2,5). Ved 80°C var sur fosfatase aktivitet redusert til 65% og fytase-aktiviteten til 35%.
Den høyere varmestabiliteten til A. ficuum sur fosfatase 1/0, som allerede var påvist i væske og for, ble videre påvist i forsøksmøller og industrielle møller.
Grisefor, tilsatt A. ficuum fytase 0,6/1 eller sur fosfatase 1/0 væske (3000 Ua/kg for), ble pelletert i forsøks-skala (eksempel X). Temperaturen i pelleten ble kontrollert ved damp-tilsetning i melkondisjoneringsanlegget.
Fytase 0,6/1 mistet gjennomsnittlig 55% av sin aktivitet ved en pelleteringstemperatur i området 68,6-72,l°C, mens sur fosfatase 1/0 bare mistet gjennomsnittlig 25% av sin aktivitet ved 71,6-73,1°C (pH 2,5 aktivitet).
Et industrielt pelleterings-forsøk ble satt opp med tørkede fytase-preparater. Fytase 0,6/1 og fytase-blanding 1,25/1 ble blandet i standard grisefor (900 Up/kg for) og ført gjennom en industriell for-mølle (eksempel XI). Effektiviteten til fytase-blandingen 1,25/1 i melet, før pelletering var 160% av fytase 0,6/1 effektiviteten: 0,95 <-> 0,6 g PP/500 Up.
Etter pelletering, ved ca. 75°C (pellet-temperatur) , var effektiviteten til fytase 1,25/1 190% av fytase 0,6/1: 0,75 <-> 0,4 g PP/500 Up. Denne økningen kan tilskrives en kombinasjon av den høyere varmestabilitet til den sure fosfatase 1/0 som er tilstede i fytase 1,25/1-preparatet, og den synergistiske effekten mellom begge enzymene: aktivitets-tapet (33%) til fytase 0,6/1-komponenten i fytase 1,25/1 preparatet ble kompensert ved økningen i a/p-forholdet til 1,25-0,66 = 1,9/1 i det pelleterte foret.
Den synergistiske virkningen mellom A. ficuum NRRL 3135 fytase 0,6/1 og sur fosfatase 1/0, som ble registrert ved in vitro fytin-hydrolyse, og den høyere varmestabiliteten til sur fosfatase, kan hjelpe in vivo fytin-hydrolyse i pelletert for.
In vivo fordøyelses-forsøk med griser (eksempel XII og
XIII) ble satt opp for å bestemme virkningen av A. ficuum sur fosfatase 1/0, satt til A. ficuum fytase 0,6/1. Fytase- eller sur fosfatase-virkning in vivo ble målt ved fekal fordøyet fosfor (dP) på grunn av enzymatisk fytin-hydrolyse. In vivo fekal dP beregnes som følger: totalt fosfor-inntak - toal fosfor-utskillelse. En økning i dP beregnes ved forskjellen av in vivo dP og dP beregnet under for-formuleringen.
I grise-forsøk I (eksempel XII) øket dP med 0,78 g/kg for ved tilsetning av fytase 0,6/1 med 750 Up/kg for; tilsetning av fytase med sur fosfatase 1/0 med 1050 Ua/kg for for å øke a/p-forholdet til 2/1, øket dP til 0,89 g/kg for, med en synergistisk virkning på 0,055 g dP/500 Up. Sur fosfatase, tilsatt alene til foret (1050 Ua/kg for), hadde ingen virkning i det hele tatt på dP-nivået i foret: dP forble uendret etter prøve-perioden.
Effektiviteten til fytase i dette forsøket var lav (0,52 g dP/500 Up), på grunn av den høye dosen.
Ved tilsetning av sur fosfatase til fytase, øket den totale effektiviteten med 13% relativt, fra 0,52 til 0,59 g dP/500 Up.
Den in vivo synergistiske virkningen på dP for både fytase og fytase/sur fosfatase-blanding betydde også redusert fosforutskillelse: tilsetning av fytase (750 Up/kg for) reduserte fosforutskillelse med 37%, mens fytase/sur fosfatase-blanding reduserte fosfor-utskillelsen med 41%, sammenlignet med kontroll-for. Denne ytterligere reduksjon i utskillelse (11% relativt) kan resultere i lavere kostnader sett på bakgrunn av fosforutslipps-lovgivningen.
I grise-forsøk II (eksempel XIII), ble fytase 0,6/1 satt til grisefor i en anbefalt mengde på 400 Up/kg. dP øket med 0,58 g/kg for ved tilsetning av fytase, og med 0,62 g/kg for ved å supplere fytasen med sur fosfatase 1/0 (580 Ua/kg) til et a/p-forhold = 2/1.
Ved nedsettelse av fytase-nivået, øket effektiviteten til 0,725 g dP/500 Up.
Ved tilsetning av sur fosfatase, øket den totale effektiviteten med 24% (relativt), til 0,9 g dP/500 Up, med en synergistisk virkning på 0,125 g dP/500 Up.
Både fra forsøk I og II kan det konkluderes med at den in vivo synergistiske virkningen av A. ficuum fytase og sur fosfatase er mer uttalt ved lavt fytase og sur fosfatase nivå
(eksempel XIV). Når dosen av fytase + sur fosfatase-blandingen ble satt ned fra 750 Up + 1050 Ua/kg til 400 Up + 580 Ua/kg, øket effektiviteten fra 0,59 til 0,9 dP/500 Up.
Kort beskrivelse av tegningene
Plante-fytin ble hydrolysert in vitro i standard grisefor med 0,33% fytin-fosfor med forskjellige Aspergillu ficuum fytase-preparater med a/p-forhold varierende mellom 1/0 og 16/1. Hovedkomponentene i griseforet var tapioka, erter, mais-gluten-for, hvete-gluten-for og soyabønne-ekstrakter.
Fytase-preparatene ble tilsatt i forskjellige doser:
1. 0-2,5 Ua (pH 2,5 aktivitet)/g for (figur 1)
2. 0-2,8 Up (pH 5 aktivitet)/g for (figur 2).
Totalt fytin-fosfor i foret ble målt i henhold til ELLIS and MORRIS (1983 og 1986). Et passende fortynnet fytase-preparat ble satt til 2 g av foret, fuktigheten i blandingen ble regulert til 70% ved tilsetning av 0,2M pH 2,5 Sorensen-HCl-buffer, og blandingen ble inkubert ved 40°C i 3 timer. Etter inkubering ble foret ekstrahert med 40 ml 2,4% HCl (3 timer), og gjenværende fytin-fosfor i ekstrakten ble målt etter ionebytter-kromatografi og fytin-nedbrytning.
Én fytase-enhet på fytat ved pH 5 forkortes her som 1 Up, mens én sur fosfatase- eller fytase-enhet på fytat ved pH 2,5 forkortes som 1 Ua.
Figur 1 viser prosent gjenværende fytin-fosfor etter fytase-virkning som funksjon av den doserte pH 2,5 aktivitet:
ved dosering av samme fytase pH 2,5 aktivitet til foret (f.e. 0,5-1 Ua/g), viste gjenværende fytin-fosfor (95-10%) ingen korrelasjon med enzym-dosen, noe som indikerte at det ikke var noen korrelasjon mellom fytase pH 2,5 aktivitet og in vitro fytin-hydrolyse i grisefor. Figur 2 viser prosent gjenværende fytin-fosfor etter fytase-virkning som funksjon av dosert pH 5 aktivitet: ved dosering av den samme fytase pH 5 aktivitet til foret (f.e. 0,4-0,5 Up/g), viste gjenværende fytin-fosfor korrelasjon med enzym-dosen. Videre, hvis fytase-preparater med a/p mellom 1,5/1 og 3/1, og a/p < 1,5/1 ble separert, ble forskjellen i gjenværende fytin-fosfor etter fytase-virkning ved samme pH 5 dose, mindre: fytase-preparater med a/p < 1,5 hydrolyserte fytin-fosfor mindre effektivt enn fytase-preparater med a/p mellom 1,5/1 og 3/1. Figur 3 viser in vitro fytinhydrolyse beregnet som den mengde fytin-fosfor som frigjøres ved tilsetning av 500 U fytase (Up) til 1 kg for ved 40°C i 3 timer (g PP/500 Up). Effektiviteten av de forskjellige fytase-preparatene ble sammenlignet med effektiviteten beregnet som en additiv effekt mellom de to enzymene som utgjør fytase-preparatet, fytase 0,6/1 og sur fosfatase 1/0, som i eksempel III. Den synergistiske virkningen for begge enzymene ble beregnet som differansen mellom testresultatet og den beregnede additiv-effekt. En økende synergistisk virkning kan sees med et maksimum rundt a/p 2/1. Over dette forhold, ble det ikke iakttatt noen synergistisk virkning.
Eksempel I
Fytase og sur fosfatase pH 2,5 aktivitet ble undersøkt ved å måle fosfor-frigjøring. 0,5 ml av et passende fortynnet enzym-preparat ble satt til 2 ml av en 1/1 blanding av 0,2M pH 2,5 Sorensenbuf f er og 12,5 mM dodekanatriumfytat eller 25 inM dinatrium-S-glycerofosfat-oppløsning. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 10 min. ved 40°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 2,5 ml av en 10% trikloreddiksyre-oppløsning. Frigjort fosfor ble målt spektrofotometrisk ved tilsetning av 5 ml av et vanadat/molybdat-reagens i henhold til den offisi-elle EEC-metode.
pH 5 fytase-aktivitet på dodekanatrium-fytat ble målt på lignende måte, ved å erstatte pH 2,5 SSrensenbuffer med IM
pH 5 acetat-buffer.
Én fytase eller sur fosfatase aktivitet-enhet ble definert som den mengde enzym som frigjør 1 umol fosfor/min. ved 40°C og henholdsvis pH 5 eller pH 2,5.
Forholdet (l)/(2) mellom enzymaktiviteten ved pH 2,5 på fytat (1) og dinatrium-6-glycerofosfat (2) bestemmer spesifisiteten til begge enzymene: fytase 0,6/1 utvikler høyest aktivitet på fytat, mens sur fosfatase utvikler høyest aktivitet på dinatrium-S-glycerofosfat.
Eksempel II
Fytin ble hydrolysert in vitro i standard grisefor med 0,33% fytin-fosfor med forskjellige A. ficuum fytase-preparater. Komponentene i griseforet var erter, tapioka, maisgluten-for, hvetegluten-for og soyabønne-ekstrakter. Totalt fytin-fosfor i foret ble målt i henhold til Ellis and Morris (1983, 1986). 1,4 enheter (Up) flytende fytase-preparat ble satt til 2 g for, fuktigheten i blandingen ble avpas-set til 70% ved tilsetning av 0,2M pH 2,5 Sorensen-HCl-buffer, og blandingen ble inkubert ved 40°C i 3 timer. Etter inkuberingen ble foret ekstrahert med 40 ml 2,4% HC1 (3 timer) , og fytin-fosfor i ekstrakten ble målt etter ionebytter-kromatografi og fytin-nedbrytning. Fytin-hydrolyse ble beregnet som forskjellen i fytin-innhold i foret før og etter behandlingen med fytase. In vitro fytase-effektiviteten ble - beregnet som den mengde fytin-fosfor (g PP) som ble frigjort med 500 enheter fytase (Up) pr. kg for ved 40°C i 3 timer.
Ettersom a/p-forholdet i fytase-preparatene ved lavt a/p-forhold (0,6/1 -> 2/1) øket, oppviste effektiviteten til preparatene en lineær økning: ren fytase 0,6/1 viste en effektivitet på 0,55 g PP/500 Up, mens effektiviteten til et fytase-preparat med a/p-forhold =2/1 var 1,75 g PP/500 Up. Tilsetning av 500 enheter (Up) fytase-aktivitet til 1 kg grisefor, resulterer således i frigjøring av en mengde fytin-fosfor som varierer mellom 0,55 og 1,75 g, avhengig av a/p-forholdet av fytasen. Ved høyere a/p-forhold, utflates effektivitets-økningen (synergismen).
Eksempel III
Fytin ble hydrolysert in vitro i standard grisefor (eksempel II) med A. ficuum fytase-preparater, tilsatt A. ficuum sur fosfatase 1/0 for å vise betydningen av sur fosfatase i en sur fosfatase/fytase blanding. Fytase 0,6/1 ble tilsatt sur fosfatase til a/p = 2/1 og 3/1 ved tilsetning av henholdsvis 2 og 3,4 Ua sur fosfatase til 1,4 Up fytase 0,6/1; fytase 1/1 (1,4 Up) ble tilsatt henholdsvis 1,4 og 2,8 Ua sur fosfatase til a/p-forhold 2/1 og 3/1.
1,4 Up flytende fytase-preparat (a/p 0,6/1, 1/1, 2/1 og 3/1) ble satt til 2 g for, fuktigheten i blandingen ble bragt til 70% eller 80% ved tilsetning av 0,2M pH 2,5 Sorensen-HCl-buffer, og blandingen ble inkubert ved 40°C i 3 timer.
Effektiviteten til sur fosfatase alene ble bestemt ved tilsetning av 2 Ua til 2 g grisefor, og inkubering av blandingen som angitt ovenfor.
Fytin-hydrolyse ble beregnet som i eksempel II.
Blanding av fytase- og sur fosfatase-preparater til et a/p forhold 2/1 og 3/1 før tilsetning til foret, øket effektiviteten av enzym-blandingen med både additiv og synergistisk virkning av begge enzymene.
Tilsetning av 500 Up fytase 0,6/1 til grisefor frigjør f.eks. 0,95 g fytin-fosfor, mens tilsetning av 500 Ua sur fosfatase 1/0 frigjør 0,25 g fytin-fosfor. Ettersom 500 Up fytase 0,6/1 har 300 Ua pH 2,5 aktivitet, er 700 Ua sur fosfatase 1/0 nødvendig for å oppnå en sur fosfatase/fytase-blanding med a/p-forhold = 2/1. Hvis begge enzymene hadde en enkel additiv virkning, ville effektiviteten kunne beregnes som følger: (500 Up fytase <*> 0,95 g PP/500 Up) + (700 Ua sur fosfatase <*> 0,25 g PP/500 Ua) = 1,3 g PP (/500 Up fytase).
Effektiviteten registrert i forsøket er ikke 1,3, men 2,1 g PP/500 Up, hvilket innebærer en synergistisk effekt på 0,8 g PP/500 Up.
Eksempel IV
Fytin ble hydrolysert in vitro i forskjellig standard for (for gris, smågris, purke, broiler og verpehøne) med forskjellige A. ficuum fytase-preparater, for å undersøke den synergistiske vekselvirkning mellom fytase og sur fosfatase på for generelt.
Hoved-bestanddelene i forene var:
Smågris:bygg, hvete, soyabønneekstrakt, hvetekli, myse-pulver
og fiskemel
purke:tapioka, erter, solsikkefrø-ekstrakt, riskli og kokos-kake
gris 1:tapioka, erter, soyabønneekstrakt og hvete gluten-for gris 2:tapioka, erter, soyabønneekstrakt, hvete gluten-for og
mais gluten for
broiler:durra, soyabønne-ekstrakt, erter og kjøttmei verpe-
høns: mais, soyabønner, solsikkefrø-ekstrakt og kalksten.
Fytase 0,6/1 ble tilsatt med 0,7 Up/g og sur fosfatase 1/0 med 1 Ua/g. Fytase 0,6/1 ble tilsatt sur fosfatase 1/0 til a/p 2/1, ved tilsetning av 1 Ua sur fosfatase til 0,7 Up fytase. Inkuberingsbetingelsene var tilsvarende som i eksempel III (80% fuktighet). Den synergistiske effekten ble beregnet som i eksempel III.
Både fytase- og sur fosfatase-effektiviteten varierte sterkt for de forskjellige forene. Synergistisk virkning mellom begge enzymene ble funnet for alle forene, men varierte for de forskjellige forene.
Fytase a/p 1,6/1 ble tilsatt i en dose på 0,7 Up/g til forskjellige for. Effektiviteten til denne fytase bekreftet effekten av sur fosfatase 1/0 i sur fosfatase/fytase-blandingen.
Eksempel V
Ettersom enzym-fytin-hydrolyse varierte sterkt for de forskjellige forene (eksempel IV), kunne det forventes at fytin-hydrolyse avhenger av planteråstoffet som foret var sammensatt av.
Hydrolyse av plante-fytin av forskjellig opprinnelse, og effektiviteten til A. ficuum fytase 0,6/1 og sur fosfatase 1/0, tilsatt alene eller i kombinasjon, på forskjellig planteråstoff ble undersøkt in vitro.
Fytase 0,6/1 ble tilsatt i en dose på 0,35-0,7 Up/g og sur fosfatase 1/0 i en dose på 1 Ua/g forstoff. Fytase 0,6/1 ble tilsatt sur fosfatase 1/0 til a/p 2/1 ved tilsetning av henholdsvis 0,5 og 1 Ua sur fosfatase/g. Inkuberingsbetingelsene var tilsvarende de i eksempel II (80% fuktighet). Fytin-hydrolyse ble analysert og fytase-effektiviteten beregnet som i eksempel II, og den synergistiske effekten ble beregnet som i eksempel III.
Fytase-aktiviteten på erter var meget lav (0,15 g PP/500 Up), og det var ingen synergistisk virkning med sur fosfatase.
Størst synergi ble funnet for de planteråstoffer hvor fytin ble hydrolysert med fytase og omtrent ikke hydrolysert med sur fosfatase, f.eks. soyabønner og hvetekli.
Lav synergi ble funnet når sur fosfatase i seg selv hydrolyserte plantefytin mer effektivt, f.eks. riskli.
Eksempel VI
In vitro fytin-hydrolyse i standard grisefor (eksempel II) med Aspergillus niger fytase-preparater med forskjellig a/p-forhold. Fytase ble tilsatt i en dose på 0,7 eller 1 Up/g for. Inkuberingsbetingelsene var tilsvarende eksempel II (70% fuktighet) .
Fytin-hydrolyse ble analysert og fytase-effektivitet beregnet som i eksempel II.
Ettersom a/p-forholdet av A. niger fytase-preparatene øket (ved lavt forhold), øket effektiviteten til preparatene: fytase-ef fektiviteten varierer mellom 0,75 og 1,15 g PP/500 Up, avhengig av a/p-forholdet av fytase.
Eksempel VII
In vitro fytin-hydrolyse i standard grisefor (eksempel II) med Aspergillus niger fytase-preparat a/p 1,15/1, tilsatt sur fosfatase fra Aspergillus niger (An) eller Aspergillus ficuum NRRL (Af), for å øke a/p-forholdet til henholdsvis 1,9/1 og 1,6/1.
A. niger fytase 1,15/1 ble tilsatt i en dose på 0,7 Up/g for; 0,5 Ua A. niger eller 0,3 Ua A. ficuum sur fosfatase/g ble tilsatt til A. niger fytase for å øke a/p-forholdet til henholdsvis 1,9/1 (An) og 1,6/1 (Af). Sure fosfataser ble satt til foret alene i doser på 0,5 Ua A. niger eller 0,3 Ua A. ficuum/g.
Inkuberingsbetingelsene var tilsvarende eksempel II (80% fuktighet). Fytinhydrolyse ble analysert og fytase-effektivitet beregnet som i eksempel II.
Den synergistiske effekten mellom A. niger fytase a/p 1,15/1 og sur fosfatase 1/0, enten fra A. niger eller A. ficuum, ble beregnet som i eksempel III.
Eksempel VIII
In vitro fytin-hydrolyse med A. ficuum fytase (Af) supplert med A. niger sur fosfatase (An) i standard grisefor. Fytase 0,6/1 ble tilsatt i en dose på 0,7 Up/g; fytasen ble supplert med 0,85-0,9 Ua/g sur fosfatase 1/0 for å oppnå fytase-preparater med a/p-forhold på henholdsvis 1,8/1 og 1,9/1.
Sur fosfatase 1/0 ble tilsatt i en dose på 1 Ua/g.
Inkuberingsbetingelsene var tilsvarende de i eksempel II (80% fuktighet).
Fytin-hydrolyse ble analysert og fytase-effektiviteten beregnet som i eksempel II. Den synergistiske virkningen mellom A. ficuum fytase 0,6/1 og A. niger sur fosfatase 1/0 ble beregnet som i eksempel III.
Eksempel IX
In vitro varmestabilitet av A. ficuum fytase 0,6/1 og sur fosfatase 1/0 ble undersøkt i standard grisefor (eksempel II) i lukkede flasker, nedsenket i vannbad, for å simulere formølle-betingelser.
20 g grisefor inneholdende 1750 Ua fytase eller sur fosfatase ble blandet med 480 g grisefor, hvilket resulterte i et for med 3500 Ua/kg. Flaskene ble fylt med 7 g av det enzym-tilsatte for, inneholdende 10,5 Ua fytase eller sur fosfatase. Fuktigheten i f6ret var 12,2%. Flaskene ble lukket og nedsenket i et vannbad ved forskjellige temperaturer (70-90°C) i 10 minutter. Gjenvaerendt sur fosfatase- og fytase-aktivitet ved pH 2,5 ble målt etter enzym-ekstråksjon: 3 g av det varmebehandlede for ble ekstrahert med 50 ml 0,1M pH 2,5 Sorensenbuffer i 30 minutter, og fytase-eller sur fosfatase-aktivitet i f6r-ekstrakten ble bestemt ved pH
2,5 på dodekanatriumfytat i henhold til eksempel I. Aktiviteten, målt i ikke-behandlet for, ble satt til 100%, og all aktivitet ble beregnet som prosentdel gjenværende aktivitet.
Eksempel X
Grisefor ble pelletert i forsøksskala etter tilsetning av flytende A. ficuum fytase 0,6/1 eller sur fosfatase 1/0. Begge enzymer ble tilsatt som 165000 Ua/550 g forblanding, som deretter ble satt til 55 kg grisefor før pelletering.
Hovedbestanddelene i griseforet var: erter, rapsfrøekstrakt, mais gluten for og tapioka.
Temperaturen i pelleten når den forlot mølleplaten, ble regulert til mellom 69 og 74°C ved tilsetning av damp.
Fytase- og sur fosfatase pH 2,5 aktivitet i melet og pelleten ble målt etter for-ekstråksjon: 5 g av foret ble ekstrahert med 50 ml 0,1M pH 2,5 Sorensen buffer i 30 minutter, og fytase- eller sur fosfatase-aktivitet ble målt ved pH 2,5 på dodekanatriumfytat i henhold til eksempel I. Aktiviteten i for-melet (3 Ua/g) ble satt til 100%.
% fuktighet i fytase- og sur fosfatase-foret ble redusert med fra henholdsvis 11,6 og 11,9 i melkondisjonøren til 10,6 og 10,8 i den avkjølte pellet.
Eksempel XI
A. ficuum fytase 0,6/1- og fytase 1,25/1-preparater ble satt til grisefor med 900 Up/kg for, fulgt av f6r-pelletering i industriell skala. Hovedbestanddelene i foret var: erter, mais gluten for, soyabønne-ekstrakt og tapioka. Fytin-fosfor-konsentrasjonen var 0,37%, målt i henhold til eksempel II. Temperaturen i pelleten når den forlot møllen var sammenlignbar (74,5°C). Fytase-overlevelse ble målt ved in vitro fytin-hydrolyse i det pelleterte for: 2 g fytase-for ble inkubert som i eksempel II (80% fuktighet). Fytin-hydrolyse ble analysert og fytase-effektiviteten beregnet som i eksempel II. Fytase-effektiviteten i for-mel før pelletering var satt til 100%. Fytase 1,25/1 effektiviteten i det pelleterte for er 190% (0,75) av fytase 0,6/1-effektiviteten (0,4), mens dens effektivitet i formel er bare 160% (0,95) av fytase 0,6/1-effektiviteten (0,6).
Eksempel XII
Fosfor-fordøyelsesforsøk I (12 griser, 3 griser/for).
Kontroll grisefor ble formulert til 2 g/kg fordøyelig fosfor (dP) (For I) og et totalt fosforinnhold på 5,8 g/kg. For I inneholdt hovedsakelig erter, tapioka, mais gluten for, hvete gluten for og soyabønneekstrakt.
Fytase-holdig grisefor ble formulert til et totalt fosforinnhold på 4,4 g/kg og 1,17 g/kg fordøyelig fosfor, idet det inneholdt de samme hovedkomponenter som for I. De ble tilsatt forskjellige A. ficuum fytase-preparater: 750 Up fytase (0,6/1)/kg (For II), 1050 Ua sur fosfatase (1/0)/kg (For IV) og en blanding av 750 Up fytase + 1050 Ua sur fosfatase/kg (For III) for å oppnå et a/p-forhold = 2/1. Konsentrerte enzym-oppløsninger ble satt til formelet. Tolv (12) griser ble holdt i individuelle binger, og ble gitt foret i 17 dager (7 dager preliminært og 10 dager test) (3 griser/for), med et daglig for-inntak på 1800 g og et totalt inntak på 18 kg i løpet av test-perioden. Avføringen ble oppsamlet for hver gris i disse 10 dagene, og total fosfor-utskillelse ble bestemt på den oppsamlede avføringen i henhold til EEC-metoden. Fosfor-fordøyelseskoeffisienten (DC-P (%)) ble beregnet som forskjellen mellom totalt fosfor-inntak og total fosfor-utskillelse .
f.e. For I:
totalt fosforinntak (tot-P inn): 104,4 g = 100%
total fosforutskillelse (tot-P ut): 70,9 g = 67,9%
DC-P (%) = 100 - 67,9 (%) = 32,1.
Fordøyelig fosfor (g dP/kg) beregnes deretter som:
total fosfor-konsentrasjon i foret <*> DC-P
f.e. For I: g dp/kg = 5,8 g P/kg <*> 0,321 = 1,86.
Eksempel XIII
Fosfor-fordøyelses-forsøk II (24 griser, 8 griser/for).
Kontroll-grisefor ble formulert med 2 g/kg fordøyelig fosfor og 6,1 g/kg totalt fosfor (For I). For I inneholdt hovedsakelig erter, tapioka, hvete gluten for og soyabønneekstrakt; fosfor ble delvis tilsatt som monokalsiumfosfat. Fytase-holdig for ble formulert med 5,2 g/kg totalt fosforinnhold og 1,4 g/kg fordøyelig fosfor, inneholdende samme hovedbestanddeler som for I, men med utelatelse av monokalsiumfosfat.
De ble tilsatt enten fytase 0,6/1 i et anbefalt nivå på 400 Up/kg (For II), eller en blanding av 580 Ua sur fosfatase 1/0 + 400 Up fytase 0,6/1/kg, for å oppnå et a/p-forhold = 2/1 (For III). Fytase-oppløsninger ble satt til for-melet. Tjuefire (24) griser ble holdt i individuelle binger og ble gitt foret i 17 dager (7 dager preliminært og 10 dager forsøk) (8 griser/for), med et daglig inntak på 1800 g, og et totalt inntak på 18 kg i løpet av test-perioden. Avføringen ble oppsamlet pr. gris i disse 10 dagene, og den totale fosfor-utskillelse ble målt i den oppsamlede avføring i henhold til EEC-metoden. Fordøyelig fosfor (DC-P % og g dP/kg) ble beregnet som i eksempel XII.
Eksempel XIV
In vivo fytase-effektivitet (g dP/500 Up) av flytende A. ficuum fytase og sur fosfatase, satt i forskjellige mengder til grisefor (mel) (eksempel XII og XIII).
In vivo fytase-effektiviteten ble definert som den mengde fosfor som ble frigjort under fordøyelsen med 500 Enheter (Up) fytase (0,6/1 eller 2/1) satt til foret (g dP/500 Up).
Mengden av fosfor frigjort av enzymene, er beregnet som differansen mellom det formulerte fordøyelige fosfor i foret, og fordøyelig fosfor beregnet fra dyreforsøk som i eksempel XII. f.e.:
fordøyelig fosfor formulert i foret: 1,17 g/kg
fordøyelig fosfor fra dyreforsøk: 2,06 g/kg
fytase-innhold i foret: 750 Up fytase + 1050 Ua sur fosfatase/kg fytase-effektivitet (g dP/500 Up): (2,06 - 1,17) <*> 500/750 = 0,59
Ettersom in vivo effektiviteten av sur fosfatase er 0, beregnes den synergistiske virkningen som differansen mellom effektiviteten av 2/1 sur fosfatase/fytase-blanding, og fytase 0,6/1.
Referanser
E.P. 0 321 004 Bl (1988). A process for steeping cereals with a new enzyme preparation.
E.P. 0 420 358 Al (1990). Cloning and expression of microbial phytase.
BORGGREVE, G. (1991). Effectiviteit van microbieel fytase in varkensvoeders. Lezing CLO-studiedag, Utrecht.
COSGROVE, D. (1966). The chemistry and biochemistry of inositol polyphosphates. Rev. Pure Appl. Chem. 16, 209-224.
EECKHOUT, W. & DE PAEPE, M. (1991). The quantitative effeets of an industrial microbial phytase and wheat phytase on the apparent phosphorus absorbability of a mixed feed by piglets. Med. Fac. Landbouww. Rijksuniversiteit Gent 56 (4a), 1643-1647.
ELLIS, R. & MORRIS, E. (1983). Improved ion-exchange phytate method. Cereal Chemistry 60, 121-124.
ELLIS, R. & MORRIS, E. (1986). Appropriate resin selection for rapid phytate analysis by ion-exchange chromatography. Cereal Chemistry 63, 58-59.
GREAVES, M., ANDERSON, G. & WEBLEY, D. (1967). The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim. Biophys. Acta 132, 412-418.
IRVING, G. & COSGROVE, D. (1971). Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of a partially purified bacterial (Pseudomonas sp.) phytase. Aust. J. Biol. Sei. 24, 547-557.
IRVING, G. & COSGROVE, D. (1974). Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of the partially purified phosphatases of Aspergillus ficuum NRRL 3135. Aust. J. Biol. Sei. 27, 361-368.
LOLAS, G. & MARKAKIS, P. (1977). The phytase of navy beans (Phaseolus vulgaris). J. Food Sei. 42(4), 1094-1097, 1106.
LOLAS, G., PALAMIDIS, N. & MARKAKIS, P. (1976). The phytic acid-total phosphorus relationship in barley, oats, soybeans, and wheat. Cereal Chemistry 53(6), 867-871.
NAYINI, N . & MARKAKIS, P. (1984) . The yeast of phytase. Lebensm.-Wiss. u. -Technol. 17, 24-26.
NATUPHOS MANUAL, Gist-Brocades.
POWAR, V. & JAGANNATHAN, V. (1982) . Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis,
J. Bacteriol. 151 (3), 1102-1108.
REDDY, N., SATHE, S. & SALUNKHE, D. (1982) . Phytates in
legumes and cereals. Adv. Food Res. 28, 1-92.
SAUVEUR, B. ( 1989) . Phosphore phytique et phytases dans 1'alimentation des volailles. INRA 2 (5), 343-351.
SHIEH, T. & WARE, J. (1968) . Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase. Appl. Microbiol. 16 (9), 1348-1351.
SHIEH, T., WODZINSKI, R. & WARE, J. (1969) . Regulation of the formation of acid phosphatases by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum. J. Bacteriol. 100 (3), 1161-1165.
SIMONS, P., VERSTEEGH, H., JONGBLOED, A. & KEMME, P. (1990).
Improvement of phosphorus availability by microbial phytase in broilers and pigs. Brit. J. Nutr. 64, 525-540.
SUTARDI & BUCKLE, K. (1986) . The characteristics of soybean phytase. J. Food Biochem. 10, 197-216.
ULLAH, A. & CUMMINS, B. (1987) . Purification, N-terminal amino acid sequence and characterization of pH 2.5 optimum acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2) from Aspergillus ficuum. Prep. Biochem. 17 (4), 397-422.
ULLAH, A. & CUMMINS, B. (1988) . Aspergillus ficuum
extracellular pH 6.0 optimum acid phosphatase: purification, N-terminal amino acid sequence, and biochemical
characterization. Prep. Biochem. 18 (1), 37-65.
ULLAH, A. & GIBSON, D. (1987) . Extracellular phytase (E.C. 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep. Biochem. 17 (1), 63-91. VAHL, H. (1991). Effectiviteit van microbieel fytase in slachtkuikenvoeders. Lezing CLO-studiedag, Utrecht.
YAMAMOTO, S., MINODA, Y. & YAMADA, K. (1972) . Chemical and physicochemical properties of phytase from Aspergillus terreus. Agr. Biol. Chem. 36 (12), 2097-2103.
YOUSSEF, K., GHAREIB, M. & NOUR EL DEIN, M. (1987) .
Purification and general properties of extracellular phytase from Aspergillus flavipes. Zentralbl. Mikrobiol. 142, 397-402.
ZYLA, K. (1993) . The role of acid phosphatase activity during enzymic dephosphorylation of phytates by Aspergillus niger phytase. World J. Microbiol. Biotechnol. 9, 117-119.
ZYLA, K. & KORELESKI, J. (1993) . In vitro and in vivo dephosphorylation of rapeseed meal by means of phytate degrading enzymes derived from Aspergillus niger. J. Sei. Food Agric. 61, 1-6.
ZYLA, K., KORELESKI, J. & KUJAWSKI, M. (1989).
Dephosphorylation of phytate compounds by means of acid phosphatase from Aspergillus niger. J. Sei. Food Agric. 49, 315-324.

Claims (19)

1. Enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, karakterisert ved at det omfatter en fytase med fytat-hydrolyserende aktivitet ved en pH-verdi i området fra 2,5 til 5,0 og en sur fosfatase med fytat-hydrolyserende aktivitet ved en pH-verdi på 2,5, i et forhold (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p) på fytat på fra 0,8/1,0 til 3/1, som har en synergistisk virkning på fytat.
2. Enzympreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at forholdet (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p) på fytat er på fra 1/1 til 2,5/1.
3. Enzympreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at forholdet (a/p) på deres aktivitet ved pH 2,5 (a) og pH 5 (p) på fytat er på fra 1,5/1 til 2/1.
4. Enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at fytasen er en fungal fytase.
5. Enzympreparat ifølge krav 4, karakterisert ved at den fungale fytasen er en Aspergillus fytase.
6. Enzympreparat ifølge krav 4, karakterisert ved at den fungale fytasen er valgt fra gruppen bestående av Aspergillus ficuum fytase, Aspergillus niger fytase og Aspergillus terreus fytase.
7. Enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den sure fosfatasen er en fungal sur fosfatase.
8. Enzympreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at den fungale sure fosfatasen er en Aspergillus sur fosfatase.
9. Enzympreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at den sure fosfatasen er valgt fra gruppen bestående av Aspergillus ficuum sur fosfatase, Aspergillus niger sur fosfatase og Aspergillus terreus sur fosfatase.
10. Enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9, karakterisert ved at den sure fosfatasen er en varmestabil sur fosfatase som beholder aktivitet ved 70°C.
11. Enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9, karakterisert ved at den sure fosfatasen er mer varmestabil enn fytasen.
12. Enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det oppviser et forbedret forhold (a/p) på fra 1,5/1 til 2/1 ved varmebehandling.
13. Mat-, næringsmiddel- eller for-produkt, eller en bestanddel derav, karakterisert ved at det inneholder et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.
14. Varmebehandlet mat-, næringsmiddel- eller for-produkt, eller en komponent derav, karakterisert ved at det inneholder et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.
15. Fremgangsmåte for hydrolysering av fytat, karakterisert ved at den omfatter behandling av et råmateriale som inneholder fytat, med et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12, idet behandlingen utføres under hydrolyserende betingelser ved en pH på fra omtrent 2 til omtrent 6, hvor fytase og sur fosfatase i enzympreparatet har hydrolyserende aktivitet.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at behandlingen utføres ved en pH på ca. 2,5.
17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at det fytat-holdige råmateriale er et vegetabilsk (plante) råstoff.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at planteråstoffet er et soyabønne- eller hvete-råstoff.
19. Fremgangsmåte for forbedring av næringsmiddel- eller f6r-fordøyelse ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjødsel, karakterisert ved at husdyrene fores med et næringsmiddel eller for som inneholder et enzympreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.
NO19941183A 1993-04-05 1994-03-30 Enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, naeringsmiddelprodukt, varmebehandlet naeringsmiddelprodukt, fremgangsmate for hydrolysering av fytat, samt fremgangsmate for forbedring av naeringsmiddel- eller fôr-fordoyelsen ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjodsel. NO324857B1 (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93200989A EP0619369B2 (en) 1993-04-05 1993-04-05 Phytate hydrolysis and enzyme composition for hydrolyzing phytate

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO941183D0 NO941183D0 (no) 1994-03-30
NO941183L NO941183L (no) 1994-10-06
NO324857B1 true NO324857B1 (no) 2007-12-17

Family

ID=8213746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19941183A NO324857B1 (no) 1993-04-05 1994-03-30 Enzympreparat med fytat-hydrolyserende aktivitet, naeringsmiddelprodukt, varmebehandlet naeringsmiddelprodukt, fremgangsmate for hydrolysering av fytat, samt fremgangsmate for forbedring av naeringsmiddel- eller fôr-fordoyelsen ved husdyrproduksjon og reduksjon av fosforutskillelse i husdyrgjodsel.

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5443979A (no)
EP (1) EP0619369B2 (no)
JP (1) JP3587876B2 (no)
AT (1) ATE244302T1 (no)
CA (1) CA2120265C (no)
DE (1) DE69333071T2 (no)
DK (1) DK0619369T3 (no)
ES (1) ES2202305T3 (no)
FI (1) FI941545A (no)
NO (1) NO324857B1 (no)
PT (1) PT619369E (no)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780292A (en) * 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
DK0655890T3 (da) * 1992-07-31 2005-06-06 Ab Enzymes Gmbh Rekombinante celler, DNA-konstruktioner, vektorer og fremgangsmåder til ekspression af phytatnedbrydende enzymer i önskede forhold
DK0619369T3 (da) * 1993-04-05 2003-10-06 Aveve Nv Phytathydrolyse og enzymsammensætning til hydrolyse af phytat
JP2696057B2 (ja) * 1993-05-11 1998-01-14 ニチモウ株式会社 穀類を原料とした生成物の製造方法
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
US6699704B1 (en) 1994-04-25 2004-03-02 Roche Vitamins Inc. Heat tolerant phytases
US6358722B1 (en) 1994-04-25 2002-03-19 Roche Vitamins, Inc. Heat tolerant phytases
US6291221B1 (en) 1994-04-25 2001-09-18 Roche Vitamins Inc. Heat tolerant phytases
NL9401495A (nl) * 1994-09-15 1996-04-01 Ceres Milieu Holding Bv Werkwijze en inrichting voor het defosfateren van varkensmest.
JP3592782B2 (ja) * 1995-01-24 2004-11-24 株式会社Ｅｍ研究機構 イノシトールの製造方法
JP2001057852A (ja) * 1995-06-14 2001-03-06 Showa Denko Kk 耐熱酵素含有飼料用組成物
NZ299401A (en) * 1995-09-20 1997-09-22 Hayashibara Biochem Lab Fermented animal-feed made from soybean and wheat splinter and subjected to lactic acid fermentation to decompose phytin
SE507355C2 (sv) * 1996-09-18 1998-05-18 Semper Ab Förfarande för reducering av halten fytat i korn av spannmål
WO1998030681A1 (en) * 1997-01-09 1998-07-16 Novo Nordisk A/S Phytase combinations
CA2231948C (en) 1997-03-25 2010-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified phytases
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
US6156563A (en) * 1998-01-29 2000-12-05 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for clarifying cane sugar juice
CN1293542A (zh) * 1998-03-23 2001-05-02 诺维信公司 饲料制剂中的热稳定性植酸酶及植物表达
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
GB2340727B (en) * 1998-08-19 2002-05-22 Univ Saskatchewan Process for converting phytate into inorganic phosphate
US6284502B1 (en) 1998-08-21 2001-09-04 University Of Saskatchewan Process for converting phytate into inorganic phosphate
ES2248067T3 (es) * 1999-03-31 2006-03-16 Cornell Research Foundation, Inc. Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada.
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
DE10013061C2 (de) * 2000-03-19 2003-10-30 Univ Hannover Querfeld-Erwärmungsanlage
JP3813055B2 (ja) * 2000-07-26 2006-08-23 ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー 高純度植物タンパク材料の製造方法
DE60023491T2 (de) * 2000-08-22 2006-07-20 Solae, Llc Verfahren zur Herstellung eines hochgereinigten pflanzlichen Proteins mit niedriger Ribonukleinsäure- Konzentration
CA2465202C (en) * 2001-10-31 2014-01-21 Phytex, Llc Phytase-containing animal food and method
DE60335497D1 (de) 2002-09-13 2011-02-03 Cornell Res Foundation Inc Ergillus-phytasen
CA2413240A1 (en) * 2002-11-29 2004-05-29 Mcn Bioproducts Inc. Purification of inositol from plant materials
MXPA05008485A (es) * 2003-02-11 2005-10-18 Dsm Ip Assets Bv Preparado y producto alimenticio que comprende una fitasa activa.
US7521481B2 (en) * 2003-02-27 2009-04-21 Mclaurin Joanne Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation
US7713562B2 (en) 2003-09-04 2010-05-11 Rose Acre Farms, Inc. Animal feed and methods for reducing ammonia and phosphorus levels in manure
US20080044548A1 (en) * 2003-09-04 2008-02-21 Hale Edward C Iii Animal feed and methods for reducing ammonia and phosphorus levels in manure
US20050163823A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Charles Cobb Method and composition for reducing ruminant phosphorus excretion
WO2006053428A1 (en) * 2004-11-17 2006-05-26 Joanne Mclaurin Compositions comprising scyllo-inositol derivatives and methods to treat disorders of protein aggregation
WO2006063588A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Novozymes A/S Polypeptides having acid phosphatase activity and polynucleotides encoding same
US7587376B2 (en) * 2005-05-26 2009-09-08 International Business Machines Corporation Reformulation of constraint satisfaction problems for stochastic search
FR2888249B1 (fr) * 2005-07-08 2007-08-17 Adisseo France Sas Soc Par Act Effet synergique de l'association de phytases sur l'hydrolyse de l'acide phytique
US20070111970A1 (en) * 2005-10-13 2007-05-17 Antonio Cruz Inositol compounds and uses of same in the treatment of diseases characterized by abnormal protein folding or aggregation or amyloid formation, desposition, accumulation or persistence
US20070197452A1 (en) * 2006-02-17 2007-08-23 Mclaurin Joanne Treatment of amyloid-related diseases
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
WO2007101353A1 (en) * 2006-03-09 2007-09-13 Waratah Pharmaceuticals Inc. A cyclohexane polyalcohol formulation for treatment of disorders of protein aggregation
US20110028719A1 (en) * 2006-05-19 2011-02-03 Jacek Slon-Usakiewicz Screening methods for amyloid beta modulators
US8540984B2 (en) * 2006-08-03 2013-09-24 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
PT2617823E (pt) 2006-09-21 2015-11-23 Basf Enzymes Llc Fitases, ácidos nucleicos que as codificam e métodos para as preparar e utilizar
WO2008034244A1 (en) * 2006-09-21 2008-03-27 Waratah Pharmaceuticals Inc. The combination of a cyclohexanehexol and a nsaid for the treatment of neurodegenerative diseases
US20100292157A1 (en) * 2006-11-24 2010-11-18 Antonio Cruz Combination Treatments for Alzheimer's Disease and Similar Diseases
WO2008124931A1 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 Joanne Mclaurin Use of cyclohexanehexol derivatives in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US20110105626A1 (en) * 2007-04-12 2011-05-05 Mclaurin Joanne Use of cyclohexanehexol derivatives for the treatment of polyglutamine diseases
WO2008124929A1 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 Joanne Mclaurin USE OF CYCLOHEXANEHEXOL DERIVATIVES IN THE TREATMENT OF α-SYNUCLEINOPATHIES
EP2148667B1 (en) * 2007-04-12 2013-05-22 Waratah Pharmaceuticals, Inc. Use of cyclohexanehexol derivatives in the treatment of ocular diseases
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
AU2009301603A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Waratah Pharmaceuticals Inc. Use of scyllo-inositols for the treatment of macular degeneration-related disorders
VN30065A1 (en) 2009-05-21 2012-06-25 Verenium Corp Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
PL2811844T3 (pl) 2012-02-07 2020-08-24 Danisco Us Inc. Sposób poprawy stabilności fitazy kwasem fitynowym i kompozycje zawierające fitazę i kwas fitynowy
CN105925548A (zh) * 2012-02-16 2016-09-07 伊莱利利公司 用于减少动物废物的环境影响的方法和组合物
WO2021086138A1 (ko) * 2019-10-30 2021-05-06 씨제이제일제당 (주) 피틴산이 저감된 대두단백 농축물 제조용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT951490B (it) * 1971-11-29 1973-06-30 Owens Corning Fiberglass Corp Composizione apprettante e fibre di vetro con essa apprettate
US4952396A (en) * 1986-11-19 1990-08-28 Linus Pauling Institute Of Science & Medicine Method of using phytic acid for inhibiting tumor growth
US4758430A (en) * 1987-01-21 1988-07-19 Robert Sabin Method of treatment of Alzheimer's disease using phytic acid
NL8702735A (nl) * 1987-11-17 1989-06-16 Dorr Oliver Inc Werkwijze voor het weken van granen met een nieuw enzympreparaat.
US5316770A (en) * 1989-02-16 1994-05-31 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vitamin D derivative feed compositions and methods of use
KR100225087B1 (ko) * 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
US5217959A (en) * 1990-09-06 1993-06-08 Robert Sabin Method of treating multiple sclerosis with phytic acid
US5206226A (en) * 1990-10-24 1993-04-27 Robert Sabin Method of treatment of Parkinsons's disease using phytic acid
DK0619369T3 (da) * 1993-04-05 2003-10-06 Aveve Nv Phytathydrolyse og enzymsammensætning til hydrolyse af phytat

Also Published As

Publication number Publication date
CA2120265C (en) 2007-05-29
EP0619369B1 (en) 2003-07-02
DE69333071T2 (de) 2004-05-06
CA2120265A1 (en) 1994-10-06
NO941183L (no) 1994-10-06
JP3587876B2 (ja) 2004-11-10
JPH06319539A (ja) 1994-11-22
US5443979A (en) 1995-08-22
EP0619369B2 (en) 2009-09-30
ES2202305T3 (es) 2004-04-01
DK0619369T3 (da) 2003-10-06
US5554399A (en) 1996-09-10
DE69333071D1 (de) 2003-08-07
FI941545A0 (fi) 1994-04-05
NO941183D0 (no) 1994-03-30
FI941545A (fi) 1994-10-06
ATE244302T1 (de) 2003-07-15
EP0619369A1 (en) 1994-10-12
PT619369E (pt) 2003-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5443979A (en) Composition containing phytase and acid phosphatase for hydrolyzing phytate
Humer et al. Phytate in pig and poultry nutrition
Singh et al. Developments in biochemical aspects and biotechnological applications of microbial phytases
Vashishth et al. Cereal phytases and their importance in improvement of micronutrients bioavailability
Haefner et al. Biotechnological production and applications of phytases
Maga Phytate: its chemistry, occurrence, food interactions, nutritional significance, and methods of analysis
Maenz Enzymatic characteristics of phytases as they relate to their use in animal feeds.
Kumar et al. Phytate and phytase in fish nutrition
Konietzny et al. Molecular and catalytic properties of phytate‐degrading enzymes (phytases)
Selle et al. Phytate and phytase: consequences for protein utilisation
Vohra et al. Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications
Woyengo et al. Supplementation of phytase and carbohydrases to diets for poultry
Greiner et al. Phytase for food application.
GREINER et al. Purification and properties of a phytase from rye
Feil Phytic acid
Gessler et al. Phytases and the prospects for their application
Kumar et al. General aspects of phytases
Frias et al. Inositol phosphate degradation by the action of phytase enzyme in legume seeds
Nair et al. Production of phytase by Aspergillus ficuum and reduction of phytic acid content in canola meal
NO339291B1 (no) Preparat, som kombinerer minst to fytaser for hydrolysen av fytinsyre, anvendelse derav for fremstillingen av et ernæringstilskudd for dyr eller et dyrefor, sett eller sammensetning til foring av dyr samt en fremgangsmåte for hydrolyse av fytinsyre.
Żyta Mould phytases and their application in the food industry
Sandberg In vitro and in vivo degradation of phytate
Singh et al. Phytase: The feed enzyme, an overview
Mittal et al. Phytase: a boom in food industry
Hussain et al. Unrevealing the sources and catalytic functions of phytase with multipurpose characteristics

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees