NO322425B1

NO322425B1 - Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasoytisk middel for behandling og/eller hindring av patologisk hoye nivaer av tracylglyceroler, hyperkolesterolemia, hyperhomocysteinemia, eller patologisk lave nivaer av beta-oksidasjon i et dyr eller menneske.

Info

Publication number: NO322425B1
Application number: NO20033078A
Authority: NO
Inventors: Rolf Kristian Berge
Original assignee: Berge Biomed As
Priority date: 2003-07-04
Filing date: 2003-07-04
Publication date: 2006-10-02
Also published as: US20070142274A1; AU2004253441B2; PE20050400A1; NO20033078L; KR101182023B1; EP1653981A1; KR20060111897A; EP1653981B1; CA2542396C; NO20033078D0; CA2542396A1; JP2007527384A; RU2360693C2; US8206739B2; WO2005002605A1; CL2004001642A1; NZ545120A; CN1845748B; CN1845748A; RU2006104108A

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale (FPH). FPH-materialet senker konsentrasjonen'av kolesterol i plasma, og triglyserider i lever. FPH induseres også en gunstig forand-ring i fettsyremønster, og senker konsentrasjon av homocystein i plasma. En foretrukket utførelse av oppfinnelsen vedrører anvendelse av FPH som et antiaterogenisk og kardio-beskyttende middel.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Fiskeoppdrettsindustrien har vokst enormt både i Norge og ellers i verden i løpet av de siste år, spesielt med hensyn til oppdrett av laks. Mye av fisken selges til forbrukeren som sløyd, hel fisk, men betydelige mengder selges som filéter. Kun 50-70 % av laksen er filéter, mens resten selges som lawerdi-produkter som fiskemel og fiskeensilasje.

Gjennom enzymatisk behandling kan fiskekjøttet og også fiskeskjellettet sepa-reres til en vandig fraksjon som er rik på proteiner og som benevnes hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale (FPH). Den enzymatiske hydrolyseprosess er sterkt kontrollerbar, og produktene er reproduserbare og godt definerte.

Overraskende har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse vist at et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale i samsvar med oppfinnelsen har flere nyttige biologiske effekter, og at et slikt materiale kan anvendes som et farmasøytisk middel.

Vi har vist at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale senker konsentrasjonen av plasma kolesterol og homocystein, og også senker konsentrasjonen av hepatiske triacylglyseroler. Basert på disse funn vurderes det at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale vil ha en preventiv og/eller terapeutisk effekt på stenose, aterosklerose, koronar hjertesykdom, trombose, myokardisk infarkt, slag og fettlever. Behandling med et fiskeproteinmateriale representerer en ny måte å behandle disse sykdommer på.

Hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale er spesielt nyttig som et funksjonelt protein i næringsprodukter, spesielt idet det anvendes som et substitutt for naturlig plasma i dyrefor og i for til kjæledyr. Idet det anvendes i kjæledyrfor kan ytterligere ingredienser tilsettes til produktet så som fett, sukker, salt, smakstil-setninger, mineraler, etc. Produktet kan deretter formes til klumper som ligner naturlige kjøttklumper i utseende og tekstur. Produktet har ytterligere fordeler i at det er enkelt å formulere til å inneholde nødvendige næringsstoffer, det fordøyes enkelt av dyrene og er velsmakende for dyrene.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling og/eller hindring av patologisk høye nivåer av triacylglyceroler, hyperkolesterolemia, hyperhomocysteinemia, eller patologisk lave nivåer av p-oksidasjon i et dyr eller menneske.

Ytterligere utførelser av oppfinnelsen er fremlagt i underkravene 2 og 6-10.

De eksperimentelle data viser klart at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale i samsvar med foreliggende oppfinnelse senker konsentrasjonen av homocystein i plasma. Homocystein er en risikofaktor i sykdommer så som aterosklerose, koronar hjertesykdom, stenose, trombose, myokardisk infarkt og slag, og det vurderes således at FPH-materialet ifølge oppfinnelsen vil være effektiv i å hindre og behandle disse sykdommer.

Dataene viser også at nivåer triacylglyseroler i lever reduseres ved administrering av FPH, og det vurderes av FPH-materialet kan anvendes for behandling og hindring av fettlever.

En ytterligere utførelse av foreliggende oppfinnelse vedrører et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk preparat eller næringsmateriale for behandling og/eller prevensjon av hyperkolesterolemia,

idet vi har vist at nevnte materiale er i stand til å senke plasmakonsentrasjonen av kolesterol.

En ytterligere utførelse vedrører anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk preparat eller næringsmateriale for å senke konsentrasjonen av homocystein i plasma. Et hyperhomocystein-nivå kan etableres før den ovenfor indikerte sykdom manifesteres. Administreringen av FPH-materialet har en generell homocysteinsenkende effekt, og materialet ifølge foreliggende oppfinnelse er således spesielt egnet for å hindre starten av, og senke risikoen for den ovenfor indikerte sykdommer.

Resultatene indikerer ytterligere at FPH-materialet har generell kardio- og arteriebeskyttende egenskaper, og vi vurderer at materialet kan gis for å redusere risikoen for arterie- og kardio-relaterte sykdommer.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å administrere materiale enten som et profylaktisk eller farmasøytisk medikament, eller som et funksjonelt for i næringsstoffer. Materialet kan gis til mennesker og ikke-humane dyr.

En foretrukket utførelse av oppfinnelsen vedrører et formateriale omfattende hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale. Materialet kan anvendes for å fore landbruksdyr, så som hønsefugler, bovine, ovine, caprine eller porcine pattedyr, husdyr eller kjæledyr, så som hund og katt, og fisk og skalldyr, så som laks, torsk, Tilapia, muslinger, østers, hummer eller krabber.

En foretrukket utførelse av oppfinnelsen anvender FPH-materialet produsert av en enzymatisk behandling av fiskekjøtt eller - skjellett. Fortrinnsvis anvendes enzymsammensetningen Protamex™, og fisken er fortrinnsvis laks.

FIGURER

Figur 1 viser at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale (FPH) reduserer konsentrasjon av kolesterol i plasma. Figur 2 viser at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale (FPH) reduserer konsentrasjonen av kolesterol i lever. Figur 3 viser at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale inhiberer ACAT-enzymet. Figur 4 viser at hydrolysatet av proteinholdig fiskemateriale øker den mitokondriene (3-oksidasjon.

DEFINISJONER ANVENDT I SØKNADEN

Dyr

I denne sammenheng angir termen "dyr" pattedyr så som mennesker og landbruksdyr, spesielt dyr med økonomisk viktighet så som hønsefugler, bovine, ovine, kaprine og porsine dyr, spesielt de som produserer produkter egnet for menneskelig forbruk, så som kjøtt, egg og melk. Videre er termen tiltenkt å inkludere fisk og skalldyr, så som laks, torsk, tilapia, musling og østers. Termen inkluderer også husdyr så som hunder og katter.

Behandling

I forbindelse med farmasøytiske applikasjoner av foreliggende oppfinnelse angir termen "behandling" en reduksjon av alvorligheten av sykdommen.

Hindring

Termen "hindring" angir å hindre en gitt sykdom, dvs. forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse administreres før start av tilstand. Dette betyr at forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som et profylaktisk middel eller som ingredienser i funksjonelle for eller næringsstoffer for å hindre risiko for start av en gitt sykdom.

Hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale

Hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale er et enzym-behandlet fiskemateriale. FPH-mateiralet inneholder høye andeler av proteiner.

ADMINISTRERING AV FORBINDELSENE IFØLGE FORELIGGENDE OPPFINNELSE

Som et farmasøytisk medikament kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres direkte til dyret med enhver egnet teknikk, inkluderende parenteral, intranasal, oral eller ved absorpsjon gjennom huden. De kan administreres lokalt eller systemisk. Den spesifikke administrasjonsvei for hvert middel vil avhenge av for eksempel den medisinske historie for dyret.

Eksempler på parenteral administrering inkluderer subkutanøs, intra-muskulær, intravenøs, intraarteriell og intraperitoneal administrering.

Dersom de gis kontinuerlig administreres typisk forbindelsene ifølge oppfinnelsen med 1-4 injeksjoner per dag eller ved kontinuerlig sub-kutanøs infusjon, for eksempel ved anvendelse av en minipumpe. En intravenøs poseløsning kan også benyttes. Nøkkelfaktoren ved seleksjon av egnet dosering er resultatet som oppnås, som målt ved en nedgang i den totale kroppsvekt eller forholdet mellom fett og mager masse, eller ved andre kriterier for å måle regulering eller hindring av obesitet eller prevensjon av obesitet-beslektede tilstander, slik det anses som hensiktsmessig av praktiserende lege.

For parental administrering formuleres forbindelsene ifølge oppfinnelsen, i en utførelse, generelt ved å blande hver med den ønskete grad av renhet, i en enhetsdosering injiserbar form (løsning, suspensjon eller emulsjon) med en farmasøytisk akseptabel bærer, dvs. en som ikke er toksisk for mottakerne av doseringene og konsentrasjonene som anvendes, og som er kompatible med andre ingredienser i formuleringen.

Generelt fremstilles formuleringene ved å sette forbindelsene ifølge oppfinnelsen i uniform og intim forbindelse med væskebærere eller finfordelt faststoffbærere, eller begge deler. Deretter, dersom nødvendig, formes produktet til den ønskede formulering. Fortrinnsvis er bæreren en parenteral bærer, mer foretrukket en løsning som er isotonisk med mottakerens blod. Eksempler på slike vehikler inkluderer vann, saltløsning, Ringers løsning og dekstroseløsning. Ikke-vandige vehikler så som fikserte oljer og etyloleat kan også benyttes, og likeledes liposomer.

Bæreren kan hensiktsmessig inneholde mindre mengder av tilsetnings-stoffer så som substanser som forbedrer isotonisitet og kjemisk stabilitet. Slike materialer er ikke-toksiske for mottakerne i de doseringer og konsentrasjoner som benyttes, og omfatter buffere så som fosfat, citrat, sukkinat, eddiksyre, og andre organiske syrer og deres salter; anti-oksidanter så som askorbinsyre; immunoglobuliner; hydrofiliske poly-merer så som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer så som glycin, glutamin-syre, asparaginsyre eller arginin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkluderende cellulose eller dets derivater, glukose, mann-ose eller dekstriner; kelaterende midler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol; motion så som natrium; og/eller ikke-ioniske surfaktanter så som polysorbat, poloxamerer eller PEG.

For orale farmakologiske sammenblandinger kan bærematerialer så som vann, gelatin, gummi, laktose, stivelse, magnesium stearat, talk, oljer, polyalken glykol, petroleumgele og lignende anvendes. Slike farmasøytiske preparater kan være i enhetsdoseringsform og kan ytterligere inneholde andre terapeutisk nyttige substanser eller konvensjonelle farmasøytiske adjuvanser så som konserveringsmidler, stabiliserende midler, emulsifiserende midler, buffere og lignende. De farmasøytiske preparater kan være i konvensjonelle væskeformer så som tabletter, kapsler, dragéer, ampuller og lignende, i konvensjonelle doseringsformer så som tørrampuller, og som stikkpiller og lignende.

I tillegg kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hensiktsmessig administreres i kombinasjon med andre behandlinger for å lindre eller hindre en spesifikk sykdom.

Oppfinnelsen vil mer tydelig forklares med henvisning til de medfølgende eksempler. De skal imidlertid ikke ansees som begrensende for oppfinnelsens ramme.

Som et næringsmateriale kan FPH formuleres på enhver konvensjonell måte som et for eller næringsprodukt.

EKSPERIMENTELL DEL

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Kjemikalier

[1-<14>C] palmitoyl-L-karnitin (54 Ci/mmol) ble innkjøpt fra Amersham. Kjemi-kalene anvendt for sanntids RT-PCR var fra Applied Biosystems. Alle andre kjemikalier ble innkjøpt fra kjente kommersielle kilder og var av gradering reagensgrad.

Hydrol<y>sat av proteinholdig fiskemateriale ( FPH)

FPH ble produsert fra fiskekjøttrester fra laksebenskjelett etter filetering som tidligere beskrevet (23)(24). Supro 530 EX soyaprotein var fra duPont Protein Technologies (St. Louis, MO, USA), og bovint kasein natriumsalt, C-8654, var fra Sigma-Aldrich.

Dyr og behandlinger

4-5 ukers gamle hannkjønn obese Zucker rotter (Crl:(ZUC)/faBR) fra Charles River, Tyskland, i gjennomsnitt 120 + 3 g ved starten av eksperimentet, ble oppbevart i et rom opprettholdt ved 12 timers lys-mørke-sykluser, ved en temperatur av 20+ 3 °C, og med en relativ fuktighet av 65 + 15 %. Den dagen rottene ankom ble de randomisert og plassert separat i metabolske bur, og oppdelt i tre eksperimentelle grupper, hver av seks dyr. Rottene ble tilpasset de eksperimentelle betingelser og eksperimentelle dietter i fire dager, hvoretter faeses ble innsamlet i 7 dager. De semirensete dietter (tabell 1) inneholdt 20 % råprotein (N x 6,25) i form av FPH eller kasein (kontroll).

<1>Fettsyresammensetning av soyabønneoljen (g/100g fett): 18:2n-6 (54,1 + 0,5), 18:1n-9 (21,8 + 0,2), 16:0 (11,2 + 0,1), 18:3n-3 (6,1 + 0,2), 18:0 (3,7 + 0,1), 18:1n-7 (1,5 + 0,1), 20:0 (0,5 + 0,1), 22:0(0,5 + 0,1).

Vitaminer (mg/kg diett): 8 mg vit. A (4000 I.U.), 2 mg vit. D3 (1000 I.U.), 60 mg vit. E (30 I.U.), 0,1 mg vit. K (0,05 I.U.), 1000 mg kolinhydrogentartrat, 4 mg tiamin, 3 mg riboflavin, 6 mg pyridoksin,'20 mg niasin, 8 mg Ca-pantotenat, 1 mg folin, 5 mg vitamin B12 (0,05 I.U.). <3>Mineraler (g/kg diett): 8,5g CaC03, 6,2 g CaHP04x2H20,12,3 g KH2P04,1,4 g MgC03, 0,4 NaC03, 0,8 g NaCI, 0,02 g CuS04x5H20, 0,002 g NaF, 0,0002 g Kl, 0,2 g FeSO^HzO, 0,05 g ZnS04xH20.

Dyrene ble daglig tilbudt like næringsrasjoner, som ble justert for å møte kravet for de voksende dyr. Dyrene hadde fri tilgang til springvann. Rottene ble foret i 22 eller 23 dager etter akklimatisering (tre rotter fra hver gruppe ble avlivet ved dag 22 og resten ved dag 23), og kroppsvekt ble målt ukentlig. Ved slutten av foringsperioden ble dyrene anestetisert subkutanøst med 1:1 Hypnorm<®>/- Dormicum<®> (Fentanyl/fluanison-Midazolam), 0,2 ml/100 g kroppsvekt. Kardiapunktering ble utført for å samle blodprøver (i heparin), og lever ble dissekert. Deler av leveren ble umiddelbart frosset i væskeformig N2, mens resten av leveren ble avkjølt på is for homogenisering. Protokollen var godkjent av "Norwegian State Board of Biological Experiments with Living Animals".

Fremstilling av subcellulære fraksjoner

Lever fra rottene ble homogenisert individuelt i iskald sukroseløsning (0,25 mol/L sukrose i 10 mmol/L HEPES buffer pH 7,4 og 1 mmol/L EDTA) ved anvendelse av Potter-Elvehjem-homogeniserer. De subcellulære fraksjoner ble isolert som beskrevet i Berge, R. K. et al (Berge, R. K., Flatmark, T. & Osmundsen, H. (1984), Enhancement of long-chain acyl-CoA hydrolase activity in peroxisomes and mitochondria of rat liver by peroxisomal proliferators. Eur J Biochem 141: 637-644. Hurtig forklart, homogenatet ble sentrifugert ved 1000 x g i 10 minutter for å separere postnukleær fra nukleær fraksjon. En mitokondrisk anriket fraksjon ble fremstilt fra den postnukleære fraksjon ved 10.000 x g i 10 min. En peroksisom-anriket fraksjon ble fremstilt ved sentrifugering av den post-mitokondrielle fraksjon ved 23.500 x g i 30 min. En mikrosomal-anriket fraksjon ble isolert fra den post-peroksimale fraksjon ved 100.000 x g i 75 min. Den resterende supernatant ble samlet som cytosollisk fraksjon. Prosedyren ble utført ved 0-4 °C, og fraksjonene ble lagret ved -80 °C. Protein ble analysert ved anvendelse av BioRad proteinanalysekitt (BioRad, Heraules, CA) og bovin serum albumin som standard.

Enzvmanalvse

Karnitin palmitoyltransferase I (CPT-I) aktivitet ble målt i hovedsak som beskrevet i Bremer (Bremer, J. (1981) The effect of fasting on the activity of liver carnitine palmitoyltransferase and its inhibition by malonyl-CoA. Biochim Biophys Acta 665: 628-631. Analysen for CPT-I inneholdt 20 mmol/L HEPES pH 7,5, 70 mmol/L KCI, 5 mmol/L KCN, 100 umol/L palmitoyl CoA, 10 mg BSA/ml og 0,6 mg vevprotein/ml. Reaksjonen startet med 200 umol/L [metyl-<14>C] L karnitin (200 cpm/nmol). Analysebetingelser for CPT-II var identisk med unntak av at BSA ble utelatt og at 0,01 % Triton X-100 ble inkludert. Vevs-proteinkonsentrasjonen var 2,5 ug/ml. Acylkoenzym A kolesterol acyltransferase (ACAT) ble målt ved anvendelse av 130 mg protein og <14>C-oleyl-CoA som substrat. Produktet ble separert på TLC-plater ved anvendelse av heksan/dietyleter/eddiksyre (80:20:1) som den mobile fase, og talt i en scintillasjonsteller (Win Spectral 1414 væske scintillasjonsteller, Wallac). 3-hyroksy-3-metylglutaryl (HMG) CoA-reduktase ble målt ved anvendelse av 80 mg protein og <14>C-HMG-CoA som et substrat. Produktet ble separert ved anvendelse av 80 mg protein og <14>C-HMG-CoA som et substrat. Produktet ble separert på TLC-plater ved anvendelse av aceton:benzen (1:1) som den mobile fase, og talt i en scintillasjonsteller. Fettsyresyntase ble målt som beskrevet av Roncari (Roncari, D. A. (1981) Fatty acid synthase from human liver. Methods Enzymol 71 Pt C: 73-79), modifisert i samsvar med Skorve et al. (Skorve, J., al-Shurbaji, A., Asiedu, D., Bjorkhem, I., Berglund, L. & Berge, R. K. (1993). On the mechanism of the hypolipidemic effect of sulfur-substituted hexadecanedioic acid (3-thiadicarboxylic acid) in normolipidemic rats. J Lipid res 34:1177-1185), og acetyl CoA karboksylase ble bestemt ved å måle mengden NaH<14>C03 inkorporert i malonyl-CoA.

Lipidanalyse

Lipider i hel lever og heparanisert plasma ble målt i en Tecnicon Axon system (Miles, Tarrytown, NY), med Bayer-triglyserid og kolesterol enzymatisk kit (Bayer, Terrytown, NY) og PAP 150 fosfolipid enzymatik kit (bioMérieux, Lyon, France). Leverlipider ble først ekstrahert i samsvar med Bilgh and Dyer (Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37: 911-91).

Faekale steroler

Fekale totale gallesyrer ble tilberedt i samsvar med Suckling et al. (Suckling, K. E., Benson, G. M.( Bond, B., Gee, A., Haynes, C. & Jackson, B. (1991), Cholesterol lowering and bile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment, Atherosclerosis 89: 183-190) med noen modifiseringer. To ml NaBH i etanol (mg/ml) ble tilsatt til 0,1 g tørrfaeses i pulverform. Blandingen fikk reagere i 1 time ved omgivelsestemperatur, hvoretter 50 pl 2 mol/L HGI ble tilsatt for å fjerne ethvert overskudd av NaBH. Nøytrale steroler ble ekstrahert fra prøvene med n-heksan (to påfølgende vasketrinn) før prøvene ble hydrolysert natten over med 200 pl 10 mol/L NaOH ved 110 °C. 240 pl av hydrolysatet sammen med 2,8 ml vann ble applisert til Bond Elut C<18> kolonner (Varian, 200 mg, 3 ml), som tidligere var blitt aktivert med 3 ml metanol og 3 ml vann. Gallesyrer ble tilbakeholdt i kolonnene, som ble vasket to ganger med 3 ml 20 % metanol i vann, før gallesyrene ble eluert med 3 ml metanol. Gallesyrene ble lufttørket ved 45 °C og oppløst i 1 ml isopropanol. Totale gallesyrer ble bestemt enzymatisk ved anvendelse av totalt gallesyrediagnostisk kit (Sigma 450A) på Tecnicon Axon system.

Aminosyrer

Aminosyrene i diettene ble bestemt etter hydrolyse i 6 M HCI ved 110 + 2 °C i 22 timer og prederivatisering med fenylisotiocyanat i samsvar med metoden til Cohen og Strydom (34). Total cystein i forproduktene ble bestemt etter oksi-dering av cystein og cystin med 9:1 performisk syre (88 %): H2O2 (30 %)

(vol/vol) for å gi cysteinsyre. Prøvene ble deretter hydrolysert i 6 M HCI ved 110 + 2 °C i 22 timer og ytterligere behandlet som aminosyreanalyser beskrevet ovenfor. Aminosyrene i lever og plasma ble bestemt i en biokrom 20 pluss aminosyreanalysator (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) utstyrt med en

litiumkolonne med postkolonne ninhydrin-derivatisering som tidligere beskrevet (24). Før analyse ble leverprøvene ekstrahert og deproteinert ved tilsetning av 2 volum 5 % sulfosalisylisk syre, holdt på is i 30 minutter og sentrifugert ved 5000 x g i 15 min. Supernatantene ble blandet 4:1 (vol/vol) med intern standard (2,5 mmol/L norleusin i 0,1 mol/l HCI). Plasmaprøver ble blandet 1.1 med intern standard (1 mmol/L norleusin i 0,1 mol/L HCI), sentrifugert ved 10.000 x g i 5 min. før supernatanten ble sentrifugert i et filterrør (grenseverdi 10 kDa, Biomax PB polyetersulfonmembran, Milipore Corp., USA) ved 10.000 x g i 30 min.

Fettsvresammensetninq

Fettsyrer ble ekstrahert fra prøvene med 2:1 kloroform: metanol (vol/vol) (35). Prøvene ble filtrert, forsåpet og esterifisert i 12 % BF3 i metanol (vol/vol). Fettsyresammensetning av totale lipider fra lever og plasma ble analysert ved anvendelse av metoder beskrevet av Lie and Lambertsen (Lie, O. & Lambertsen, G. (1991) Fatty acid composition of glycerophospholipids in seven tissues og cod (Gadus morhua), determinded by combined high-performance liquid chromatography and gas chromatography. J Chromatogr 565:119-129). Fettsyremetylestere ble separert ved anvendelse av Carlo Erba gasskroma-tografi (kald på kolonne-injisering, 69 °C i 20 sek., økning med 25 °C/min. til 160 °C og ble holdt ved 160 °C i 28 min., økning til 25 °C/min. til 190 °C og holdt ved 190 °C i 17 min. økning med 25 °C/min. til 220 °C og holdt ved 220 °C i 9 min.) utstyrt med en 50 m CP-sil 88 (Chrompack, Middleburg, the Netherlands) fusjonert silika kapillar kolonne (i.d. 0,32 mm). Fettsyrene ble identifisert med retensjonstid ved anvendelse av standardblandinger av metylestere (Nu-Chek-Prep, Elyian, MN, USA). Fettsyresammensetningen (vektprosentandel) ble beregnet ved anvendelse av en integrator (Turbochrom Navigator, Version 4,0) koblet til GLCen.

Lipider ble ekstrahert fra plasmatriasylglyserol-rik lipoprotein fraksjon ved anvendelse av en blanding av kloroform og metanol, og separert med tynnsjikt kromatografi på silikagelplate (0,25 mm silikagel 60, Merck) utviklet i heksandietyletereddiksyre (80:20:1, vol/vol) og visualisert ved anvendelse av rodamin 6G (0,05 % i metanol, Sigma) og UV-lys. Flekkene ble skrapt av og overført til rør inneholdende heneikosanoisk syre (21:0) som indre standard. BF3-metanol ble tilsatt prøvene for transesterifisering. For å fjerne nøytrale steroler og ikke-forsåpet materiale ble ekstrakter av fettacylmetylestere oppvarmet i 0,5 mol/L KOH i etanol-vann løsning (9:1). Gjenvunnete fettsyrer ble deretter reesterifisert ved anvendelse av BF3-metanol. Metylestere ble analysert på en GC8000 toppgasskromatograf (Carlo Erba instrument), utstyrt med en flammeioni-seringsdetektor (FID), programmerbar temperatur for vaporiseringsinjektor, AS 800 autosampler (Carlo Erba instrument) og en kapillar kolonne (60 m x 0,25 mm) inneholdende en høyt polar SP 2340 fase med filmtykkelse 0,20 pm (Supelco). Den innledende temperatur var 130 °C, oppvarming 1,4 °C/min til final temperatur 214 °C. Injektortemperaturen var 235 °C. Detektortemperaturen var 235 °C ved anvendelse av hydrogen (25 ml/min), luft (350 ml/min) og nitrogen som gass (30 ml/min). Prøvene ble kjørt med konstant gjennom-strømning ved anvendelse av hydrogen som bærergass (1,6 ml/min). Splitt-forhold var 20:1. Metylesterene ble positivt identifisert med sammenligning til kjente standarder (Larodan Fine Chemicals, Malmo, Sweden) og verifisert med massespektrometry. Kvantifisering av fettsyrene ble utført med Chrom-Card A/D 1,0 kromatografistasjon (Carlo Erba instrument) basert på heneikosanoisk syre som en indre standard.

Acvl- CoA- estere

Acyl-CoA estere i lever ble målt ved revers fase høyytelses væskekromatografi. 100 mg frossen lever ble homogenisert i iskald 1,4 mol/L HCI04 og 2 mmol/L D-ditiotreitol for å oppnå 10 % (vekt/vol) homogenat, og sentrifugert ved 12.000 x g i 1 min. 122 pl iskald 3 mol/L K2C03 med 0,5 mol/L trietanolamin ble tilsatt til 500 pl supernatant. Etter 10 minutter på is ble løsningen sentrifugert ved 12.000 x g i 1 minutt ved 4 °C. 40 pl av supernatanten ble injisert på høyytelses væske-kromatografikolonne, og acyl-CoA estere ble målt i samsvar med Demoz et al (39), med de følgende modifiseringer: elueringsbuffer A ble justert til pH 5,0, profilen av gradientelueringen var som følger: 0 min, 83,5 % A; 10 min, 55 % A;

17 min, 10 % A, og gjennomstrømningsrate var 1,0 ml/min.

Isolering av plasma triacvlglycerol- rik lipoprotein fraksjon

Plasma triacylglycerol-rik lipoprotein fraksjon ble fremstil med ultrasentrifugering av 3 ml plasma med en tetthet påp 1,063 g/ml i 19 timer ved 105000 x g ved 15 °C. Rørene ble oppkuttet, og den flytende fraksjon på toppen av hvert rør ble høstet. Fraksjonen ble deretter dialysert mot 150 mmol/l natriumklorid, 16 mmol/l natriumfosfat og 4 mm/l kaliumfosfat, pH 7,4, mettet med nitrogen.

Sanntids kvantitativ RT- PCR

Total RNA ble renset ved anvendelse av trizol (Gibco BRL), og 1 pg total RNA ble revers transkribert i et totalt volum av 100 pl med anvendelse av revers transkriptase kitt (Applied Biosystems). Reaksjoner hvor RNA ble utelatt fungerte som negativ kontroll, og reaksjoner hvor RNA var fortynnet fungerte som standard kurver.

Primere og Taqman probe for rotte A<9>, A<6> og A<5> desaturaser, peroksisom proliferatoraktivert reseptor (PPAR)a og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble konstruert ved anvendelse av Primer Express (Applied Biosystems). GAPDH og 18S rRNA ble anvendt som endogene kontroller. Primere og Taqman probe for 18S rRNA ble innkjøpt fra Applied Biosystems. Sanntids PCR ble utført i triplikat for hver prøve på en ABI 7900 sekvens-deteksjonssystem (Applied Biosystems). For A<9>, A<1> og A<5> desaturaser, PPARa og GAPDH inneholdt hver 20 pl reaksjon 3 pl første-tråd cDNA, 1x Universal Master Mix (Applied Biosystems), 300 nmol/L av hver fremover- og revers-primer, og 250 nmol/L Taqman-probe. For 18S rRNA inneholdt reaksjonen 3 pl første-tråd cDNA, 1x Universal Master Mix (Applied Biosystems), og 1x 18S probe/primer-reaksjonsmiks. Alle reaksjoner ble utført ved anvendelse av følgende syklusparametere; 50 °C i 2 min. og 95 °C i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser av 95 °C i 15 sek. og 60 °C i 1 min, som generelt anbefalt av Applied Biosystems. Ct-avlesninger (terskelsyklus nummer) for hver av de ukjente prøver ble anvendt for å beregne mengden av desaturaser, PPARa og GAPDH of 18S rRNA. For hver prøve ble resultatene normalisert til GAPDH og 18S rRNA.

Resultatene er rapportert som gjennomsnitt + SEM fra 6 dyr i hver eksperiment-gruppe. Statistisk analyse var enveis Anova Dunetts test (Prism, GraphPad).

Eksempel 1

Fremstilling av hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale

FPH ble produsert fra fiskekjøttrester av laksebenskjellett etter filetering. Skjellettene, uten hoder, av ferske filéter av Atlantisk laks (Salmon salar, L.) ble hentet direkte fra produksjonslinjen og frosset ved -20+2°C. Innen en uke ble de frosne skjelletter benyttet i den enzymatiske hydroliseringsprosessen.

Den enzymatiske hydrolyse ble utført med Protamex™ ved en pH på ca. 6,5 og ved en temperatur av 55+2°C. Protamex™ (E.C. 3.4.21.62/3.4.24.28) er et Bacillus protease kompleks fra Novozymes AS (Bagsvaerd, Danmark) og til-fredsstiller renhetskravene for næringsgraderte enzymer. Forholdet mellom lakseskjellett og vann var 1,14. Et enzym til substratforhold av 11,1 AU/kg råprotein ble anvendt i hydrolysen. Etter 60 minutters enzymatisk behandling ble temperaturen forhøyet til 98°C, som ble nådd etter 105 minutter. Store ben ble tilbakeholdt i hydrolysetanken, mens små ben ble behandlet ved å filtrere hydrolysatet gjennom en sikt. Deretter ble den uløselige fraksjon fjernet i en tofaseseparator (Westfalia, Tyskland, SC.35-26-177,15 kW, 7200 rpm), før den resterende blanding ble separert i en trefaseseparator (Westfalia, Tyskland, SB-7-36-+76, 4 kW, 8520 rpm) til lakseolje, emulsjonsfraksjon og vandig fraksjon. Den vandige fraksjon ble konsentrert (Nitro Atomicer, Danmark, Falling Film Evaporator), Ff 100), filtrert gjennom en ultramembran med nominell mole-kylvektgrense av 100 000 (PCI membransystemer.UK, PF100,2,65m<2>) og til slutt ble den ultramembranfiltrerte fraksjon (UF-fraksjon) spraytørket (Niro Atomicer, Danmark, P-63 tower, Tin=200<o>C=84<o>C).

UF-fraksjonen benevnes hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale (FPH) og ble anvendt i eksperimentene indikert nedenfor. FPH-materialet inneholder ca 83% protein, 10% aske og ca 2% lipider, basert på tørrvekt. Aminosammensetningen er gitt i tabell 2.

Eksempel 2

FPH induserer en plasmakolesterol- senkende effekt

Obese Zucker rotter ble tilbudt en diett inneholdende 20% FPH som den eneste kilde av protein. FPH er et fettsyrefritt hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale (FPH), produsert som beskrevet ovenfor.

Plasmakolesterolnivået ble redusert med 49% i Zucker rotter foret med FPH sammenlignet med rotter foret kasein som næringsprotein. Resultatene er vist i fig. 1. Resultatet viser klart at FPH reduserer nivået av kolesterol i plasma og kan anvendes som et kolesterolsenkende middel.

Eksempel 3

FPH reduserer konsentrasjonen av triacvlglyseroler i leveren

Figur 2 viser at FPH induserer en senking av konsentrasjonen av triacylglyseroler (TG) i lever med ca. 50%. Dette indikerer at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som et lipidsenkende middel, og for behandling og hindring av fettlever.

Eksempel 4

FPH inhiberer aktiviteten av Acyl- CoA: kolesterol acvltransferase

Acyl-CoA:kolesterol acyltransferase (ACAT) katalyserer reaksjonen hvor fett acyl-CoA esterifiseres til kolesterol. Kolesterolester kan deretter lagres i cyto-plasma som lipiddråper eller utskilles som del av VLDL sammen med fritt kolesterol. Således spiller ACAT en viktig rolle i VLDL-sekresjon og påfølgende kolesterylesterakkumulering og risiko for kardiovaskulær sykdom. I de foreliggende Zucker rotteeksperimenter forandret FPH-proteinet sammensetningen av lipidklassene i triacylglyserol-rik lipoprotein fraksjon, dvs. kolesterylester og fosfolipidinnholdet ble lavere, mens triacylglyserolinnholdet var høyere enn i rotter foret med kasein.

Videre viser figur 3 at ACAT aktiviteten ble redusert i rotter foret med FPH-protein sammenlignet med de som ble foret med kasein. Idet det er sterkt bevis på at øket ACAT aktivitet spiller en viktig rolle i progresjon av atherosclerose (46-49) så indikerer disse funn at FPH og soyaprotein er kardiobeskyttende. Figur 3 viser at ACAT-aktivitet ble redusert ca 30% i rotter foret med FPH sammenlignet med Zucker rotter foret med kasein.

Eksempel 5

FPH øker den mitokondriene B- oksidasion

Figur 4 viser at FPH øker den mitokondriene p-oksidasjon. Øket fettsyre-oksidasjon er en viktig faktor bak den lipidsenkende effekt av FPH. Den økede fettsyrekatabolisme vil redusere mengden av fettsyrer tilgjengelig for esteri-fisering, og dermed redusere produksjonen og sekresjonen av VLDL av leveren. Fra figur 4 fremgår det at FPH signifikant øker oksidasjonen av palmitoyl-Coenzym A sammenlignet med kontroll.

Eksempel 6

FPH påvirker lipid homeostase

De foreliggende data indikerer at fettfritt FPH-materiale påvirker lipidhomeo-stase, og kan fremme akkumulering av endogene ligander. Til tross for en uforandret hepatisk mRNA nivå av PPARa (data ikke vist), ble fettsyresammensetningen i lever, plasma og triacylglyserol-rik lipoproteinfraksjon forandret i rotter foret FPH sammenlignet med de som ble foret kasein, og forandringene var ikke parallelle i lever og plasma (tabeller 3-5). Leverkonsentrasjonene (tabell 3) av mettet 14:0 og 16:0 fettsyrer ble redusert, mens 18:0 ble øket i rotter foret FPH, spesielt i dyr foret med soyaprotein, sammenlignet med de som ble foret kasein. Leverkonsentrasjonen av monomettede fettsyrer, inkluderende 18:1n-9, ble redusert i rotter foret FPH. Som et resultat ble 18:1n/- 9/18:0-forholdet redusert med 54 i rotter foret med FPH. De hepatiske mRNA nivå av A9 desaturase, ble imidlertid ikke påvirket av dietarisk protein (data ikke vist). I motsetning til lever ble en motsatt effekt funnet i plasma på mettet og monoumettede fettsyrer (tabell 4). I plasma økte de mettede fettsyrer 14:0 og 16:0 med FPH-foring. De monoumettede fettsyrer 18:1n-9 og 16:1n-7 økte 1,3-1,5 ganger i rotter foret FPH, og forholdet av 18:1 n-9 til 18:0 økte. I den triacylglyserol-rike lipoprotein fraksjon (tabell 5) var det kun mindre forandringer i mettede og monoumettede fettsyrer, dvs. 16:1 n-7 i fosfolilipider ble redusert i rotter foret med FPH og soyaprotein. 18:1n-9/18:0-forholdet var generelt ikke forandret i den triacylglyserol-rike lipoproteinfraksjonen. Av n-6 fettsyrene var 18:3n-6 uforandret i lever,, 18:2n-6 økte mindre enn to ganger, mens 20:3n-6 og 20:4n-6 økte flere ganger med FPH. Dette resulterte i en nedgang med 18:3n-6/18:2n-6-forholdet, noe som indikerer en redusert A<6> desaturering. Den hepatiske A<6>desaturase mRNA ekspresjon ble faktisk redusert (data ikke vist). Videre ble 20:4n-6/20:3n-6-forholdet redusert, noe som indikerer en redusert A<5 >desaturering, i samsvar med en redusert hepatisk A<5> desaturase mRNA nivå

(data ikke vist). En to gangers økning i 20:4n-6/18:2n-6-forholdet og en 3 til 5 gangers økning i 20:4n-6/18:3n-6-forholdet fremkom i dyr foret med FPH. Det vurderes derfor at deres hepatiske elongase ble øket. Dyr foret med FPH viste økte plasmakonsentrasjoner av 18:2n6, mens de viste reduserte plasmakonsentrasjoner av 20:4n-6. Som et resultat ble deres 20:4n-6/18:2n-6-forhold i plasma redusert med 54. Videre ble 20:4n-6/20:3n-6-forholdet redusert med 60% i FPH-forete rotter i forhold til de som ble foret kasein. I tillegg var det en tendens til en reduksjon i 18:3n-6/18:2n-6 og 20:4n-6/18:3n-6-forholdene i dyr foret med FPH, selv om denne ikke var signifikant. I den triacylglycerolrike lipoproteinfraksjonen lignet fettsyresammensetningen plasmaprofilen, dvs. 18:2n-6 økte og 20:4n-6 ble redusert, noe som resulterte i redusert 20:4n-6/18:2n-6 (ved 49-68%), 20:4n-6/18:3n-6 (ved 53-65%) og 20:4n-6/20:3n-6 (ved 35-37%) forhold i rotter foret FPH. Alle av n-3 fettsyrene målt i lever økte i begge FPH-forete rotter. 18:3n-3 økte i 1,8 i plasma ved FPH-foring. 20:5n-3 ble signifikant øket i FPH-forete rotter (44% økning), mens DHA ble redusert ved FPH-foring (27% reduksjon). I den triacylglycerolrike lipoproteinfraksjonen ble sammensetningen av n-3 fettsyremønstre forandret kun i fosfolilipider, mens 20:5n-3 og 22:5n-3 økte i rotter foret FPH. Dette ligner funnene i plasma.

<1> Verdier er gjennomsnitt + SEM, n=6.

<*> Forskjellig fra kasein, P<0,05. n.d. = ikke detektert. ;;Verdier er gjennomsnitt + SEM, n=3 (totalt seks rotter, men plasma fra to rotter ble samlet). ;<*>forskjellig fra kasein, P<0,05; n.d., = ikke detektert; soya = soyaprotein.

Eksempel 7.

FPH senker konsentrasjonen av homocystein i plasma

Økte nivåer av homocystein, dvs. hyperhomocysteinemia har blitt foreslått å være assosiert med artielle sykdommer, og vi har således målt nivåer av homocystein av plasmaprøver fra rotter.

Total plasma homocystein ble målt med en fullautomatisert fluoressens analyse. 30 jai plasma ble redusert av 30 pl NaBH4/DMSO-løsning (6mol/L). Etter 1,5 min ble 20 pl av fluoressensreagenset monobromobiman (25 mmol/L) i acetonitril tilsatt og dette fikk reagere i 3 min. 20 pl av prøven ble deretter umiddelbart analysert med HPLC med injisering på en sterk kationutbytte-kolonne, og deretter med kolonneutbytting til en kykloheksyl silikakollonne. SCX kolonnen ble eludert isokratisk og CH-kolonnen ble eludert med en lineær metanol gradient (17-35% i 5 min) i 20 mmol/L format buffer. Homocysteinet ble eluder med en retasjonstid av 4,5 min. Resultatet er gitt i tabell 5.

Claims

1. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling og/eller hindring av patologisk høye nivåer av triacylglyceroler i et dyr eller menneske.

2. Anvendelse i samsvar med krav 1, for behandling og/eller hindring av fettlever i et dyr eller menneske.

3. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling og/eller hindring av hyperkolesterolemia i et dyr eller menneske.

4. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling og/eller hindring av hyperhomocysteinemia i et dyr eller menneske.

5. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling og/eller hindring av patologisk lave nivåer av B-oksidasjon i et dyr eller menneske.

6. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale i samsvar med ét av de foregående krav, hvor nevnte dyr er et landbruksdyr, så som hønsefugler, bovine, ovine, kaprine eller porsine pattedyr.

7. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte dyr er et husdyr eller kjæledyr, så som hund eller katt.

8. Anvendelse av et hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte dyr er fisk eller skalldyr, så som laks, torsk, tilapia, muslinger, østers, hummer og krabbe.

9. Anvendelse i samsvar med ett av de foregående kravene, hvor nevnte hydrolysat av proteinholdig fiskemateriale er produsert med enzymatisk hydrolyse av et fiskemateriale.

10. Anvendelse i samsvar med krav 9, hvor nevnte fiskemateriale er fiskekjøttavskjær fra benskjelleter av laks.

11. Anvendelse i samsvar med et av de kravene 1-10, hvor middelet er et næringsgradert produkt eller tilsetningsstoff, for eksempel et for, eller et for til kjæledyr.