NO20100369A1

NO20100369A1 - Peptidmateriale, fôrsammensetning og preparater og anvendelser derav.

Info

Publication number: NO20100369A1
Application number: NO20100369A
Authority: NO
Inventors: Anders Aksnes; Rolf Kristian Berge; Kjartan Sandnes
Original assignee: Marine Bioproducts As
Priority date: 2010-03-08
Filing date: 2010-03-08
Publication date: 2011-09-09
Also published as: WO2011112101A1

Description

Peptidmateriale, forsammensetning og preparater og anvendelser derav.

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et peptid preparat, forsammensetninger, en fremgangsmåte for fremstilling av et peptidpreparat, og anvendelser derav.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN.

Fiskeoppdrettsindustrien har vokst enormt både i Norge og resten av verden i løpet av de siste år, spesielt oppdrett av laks. Det meste av fisken selges til forbrukeren som slaktet hel fisk, men betydelige mengder selges som fileter. Kun 50-70 % av laksen er fileter, mens resten selges som lawerdiprodukter så som fiskemel og fiske ensilasje.

Gjennom enzymatisk behandling av fiskekjøttet og også fiskeskjelettet kan det separeres til en vandig fraksjon som er rik på proteiner, benevnt fiskeproteinhydrolysat (FPH). Den enzymatiske hydrolyseprosess kan kontrolleres, og produktene er reproduserbare og godt definerte.

Et slikt proteinmateriale, det vil si fiskeproteinhydrolysat (FPH) har fere nyttige biologiske effekter, og et slikt materiale kan anvendes som et farmasøytisk materiale og som et emæringsmateriale. Søkers egen patentsøknad PCT/NO04/00202 beskriver av anvendelse av et slikt FPH-materiale senker konsentrasjon av plasmakolesterol og homocystein, og også senker konsentrasjon av hepatiske triacylglyseroler.

Vi har nå overraskende funnet at vi kan behandle et enzymbehandlet proteinmateriale videre, det vil si behandle det enzymbehandlete proteinmateriale i en sekundær andre behandling og at vi kan oppnå et nytt peptidmateriale som er forskjellig med hensyn til størrelsesfordeling av peptidfragmentene.

Vi har fremstilt flere nye peptidmaterialer og vi har overraskende påvist at de biologiske aktiviteter forandres blant de forskjelllige peptidmaterialer, og også at de nye peptidmaterialer har effekter som er avvikende fra proteinmaterialet som kun har blitt behandlet en gang med ett enzym. Disse nye materialer kan anvendes for bedre å skreddersy materialene for spesifikke ernæringseffekter, medisinske indikasjoner eller sykdommer.

Det spesifikke peptidmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse, benevnt som E3, representerer en forbedring av det kjente fiskeproteinhydrolysat (FPH) som har blitt behandlet med kun en primær enzymbehandling. Vi antar at også enzymbehandlete ikke-fiskeproteinmaterialer kan anvendes som en basis for en andre enzymatisk behandling, og foreliggende oppfinnelse er således ikke begrenset til fiskeproteinmaterialer.

Uten å være bundet av teori antar vi at virkningsmekanismen er relatert til størrelses-fordeling av peptidblandingen, og ikke til opprinnelsen av proteinprøven.

Peptidmaterialet i samsvar med foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttig som et funksjonelt protein i ernæringsprodukter, spesielt idet det anvendes som et substitutt for naturlig plasma i dyrefor og i for for kjæledyr. Dersom det anvendes i for eller for for kjæledyr, kan ytterligere ingredienser tilsettes produktet så som fett, sukker, salt, smaksmidler, mineraler, etc. Produktet kan deretter formes til klumper som ligner naturlige kjøttklumper i utseende og tekstur. Produktet ifølge oppfinnelsen har de ytterligere fordeler at det enkelt kan formuleres til å inneholde nødvendige ernæringsmidler, at det er enkelt å fordøye av dyrene og velsmakende for dyrene.

Peptidmaterialet i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for fremstilling av et nutrasøytisk eller farmasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av forskjellige sykdommer, som angitt i kravseksjonen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN.

I en foretrukket utførelse er nevnte proteinmateriale etfiskeproteinmateriale, mer fortrinnsvis et proteinmateriale fra laks.

Fortrinnsvis, peptidpreparatet er fremstilt med enzymatisk behandling med en protease.

Mer foretrukket, nevnte protease er Proleather FG-F.

Fortrinnsvis, nevnte enzymatiske behandling involverer også en enzymatisk behandling med et Bacillus proteasekompleks, fortrinnsvis før behandlingen med en sur protease.

I en foretrukket utførelse har minst 50%, fortrinnsvis 60% og mer foretrukket 70% av peptidene en størrelse på 1000 Dalton eller mindre.

Fortrinnsvis, minst 35% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, mer foretrukket at minst 40% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og mer foretrukket at minst 45% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton.

Fortrinnsvis, minst 20% av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton, mer foretrukket at minst 25% av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton.

Mer fortrinnsvis,

- minst 35% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 40% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og mer foretrukket at minst 45% av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og - minst 20% av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 25% av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton.

Fortrinnsvis, en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 1200 til 200 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3. Fortrinnsvis, en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 200 til 100 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3.

Mer foretrukket,

- en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 100 til 200 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3, og - en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 200 til 100 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3.

I en foretrukket utførelse er den relative mengde av aminosyren arginin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 200 til 100 Dalton minst 5%, mer foretrukket 6%, og mer fortrinnsvis minst 7% lavere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet, eller den relative mengde av aminosyren arginin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 1200 til 200 Dalton er minst 30%, mer fortrinnsvis 40%, og mer fortrinnsvis minst 50% lavere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

I en foretrukket utførelse er den relative mengde av aminosyren tyrosin minst 50%, mer fortrinnsvis 71% høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

I en foretrukket utførelse er den relative mengde av aminosyren tyrosin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 1200 til 200 Dalton minst 50%, mer fortrinnsvis 60%, og mer fortrinnsvis minst 70% høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

I en foretrukket utførelse er den relative mengde av aminosyren tyrosin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 200 til 100 Dalton minst 100%, mer foretrukket 125%, og mer fortrinnsvis minst 150% høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

Et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et peptidpreparat, hvor fremgangsmåten omfatter et trinn hvor et protein eller peptidmateriale behandles med en protease for å redusere størrelsen av peptidfragmentene.

Fortrinnsvis, nevnte protease er Proleather FG-F.

Fortrinnsvis, fremgangsmåten inkluderer en ytterligere enzymatisk behandling av materialet, fortrinnsvis før behandlingen med en sur protease, og fortrinnsvis er nevnte enzymatiske behandling med en Bacillus proteasekompleks.

Fortrinnsvis, nevnte behandling med nevnte protease utføres ved en pH på ca. 8 til ca. 12, fortrinnsvis ved en pH ved ca. 9 til 11, eller mer foretrukket ved en pH av ca. 10.

En tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et peptidpreparat som beskrevet over for fremstilling av et farmasøytisk eller nutrasøytisk preparat for hindring og/eller behandling av hyperkolesterolemia, kardiovaskulære sykdommer, periferal vaskulære sykdommer, xantoma, xantelasma palpabrum, arcus senilis, aterosklerose, overvekt eller obesitet.

DEFINISJONER AV TERMER ANVENDT I SØKNADEN.

Dyr

I denne konteksten inkluderer termen "dyr" pattedyr så som mennesker og husdyr (landbruksdyr), spesielt dyr av økonomisk viktighet så som hønsefugler, bovine, ovine, caprine og porcine dyr, spesielt de som produserer produkter egnet for humant forbruk, så som kjøtt, egg og melk. Videre, termen er tiltenkt å inkludere fisk og skalldyr, så som laks, torsk, Tilapia, skjell og østers. Termen inkluderer også husdyr så som hunder og katter.

Behandling

I relasjon til de farmasøytiske applikasjoner ifølge oppfinnelsen angir termen "behandling" en reduksjon av alvorligheten av sykdommen.

Hindring

Termen "hindring" refererer til å hindre en gitt sykdom, det vil si en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse administreres før start av tilstand. Dette betyr at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som profylaktiske midler eller som ingredienser i funksjonelle matvarer eller for for å hindre risiko for start av en gitt sykdom.

FPH - Enzymbehandlet fiskeproteinhydrol<y>sat

FPH-materialet er et proteinhydrolysat resulterende fra en primær enzymatisk behandling av et fiskemateriale med enzymet Protamex™. FPH-materialet inneholder høye andeler av proteiner og peptider og anvendes som en kontroll i den eksperimentelle seksjon. Peptidmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse er forskjellig fra dette FPH-materialet med hensyn til størrelsesfordeling av peptidene og biologisk aktivitet.

Peptidmateriale i samsvar med oppfinnelsen

Peptidmaterialet i samsvar med foreliggende oppfinnelse er basert på en primær enzymatisk behandlet proteinmateriale, og deretter en sekundær enzymatisk behandling har blitt utført for å redusere størrelsene av peptidfragmentene.

Protease

En protease, (også benevnt peptidase eller proteinase) bryter ned proteinene. En protease er et enzym som utfører proteolyse, det vil si, starter proteinkarabolisme ved å hydrolysere peptidbindinger som forbinder aminosyrer sammen i polypeptid-kjeden som danner proteinet.

Proleather FG- F.

Proleather FG-F er en proteinase tilgjengelig fra Amano Enzyme Inc., som er fermentert med en unik fermenteringsprosess av en utvalgt stamme av Bacillus subtilis.

ADMINISTRERING AV FORBINDELSENE IFØLGE FORELIGGENDE OPPFINNELSE.

Som et farmasøytisk medikament kan materialene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres direkte til dyret med enhver egnet teknikk, inkluderende parenteralt, intranasalt, oralt, eller ved absorpsjon gjennom huden. Det kan administreres lokalt eller systemisk. Den spesifikke administrasjonsrute for hvert middel vil avhenge for eksempel av den medisinske historie til dyret. Den foretrukne administrasjonsrute er oralt.

Eksempler på parenteral administrering inkluderer subkutanøs, intramuskulær, intravenøs, intraarteriell og intraperitoneal administrering.

Dersom de gis kontinuerlig administreres forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse typisk med 1-4 injeksjoner per dag eller med kontinuerlig subkutanøse infu-sjoner, for eksempel ved anvendelse av en minipumpe. En intravenøs poseløsning kan også benyttes. Nøkkelfaktoren for å velge en egnet dosering er resultatet som skal oppnås, som målt med reduksjon i totalt kroppsfett eller forholdet av fett til mager masse, eller med andre kriterier for å måle kontroll eller hindring av obesitet eller for å hindre obesitets relaterte tilstander, slik det er hensiktsmessig av den praktiserende.

For parenteral administrering, i en utførelse, formuleres forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse generelt ved å blande hver i en ønsket grad av enhet, i en enhetsdoserings injiserbar form (løsning, suspensjon eller emulsjon), med en farma-søytisk akseptabel bærer, det vil si en som er ikke-toksisk til mottakeren i de doseringer og konsentrasjoner som benyttes og som er kompatibel med de andre ingredienser i formuleringen.

Generelt, formuleringene fremstilles ved å sette forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hver uniformt og intimt i kontakt med væskebærere eller finfordelte faststoffbærere, eller begge deler. Deretter, dersom nødvendig, formes produktene til den ønskete formulering. Fortrinnsvis er bæreren en parenteral bærer, mer fortrinnsvis en løsning som er isoton med blodet til mottakeren. Eksempler på slike bærervehikler inkluderer vann, saltløsning, Ringers løsning og dekstrose løsning. Ikke-vandige vehikler så som faste oljer og etyl oleat er også nyttige heri og likeledes liposomer.

Bæreren kan hensiktsmessig inneholde mindre mengder av tilsetningsstoffer så som substanser som forsterker isotonisitet og kjemisk stabilitet. Slike materialer er ikke-toksiske til mottakerne i de doseringer og konsentrasjoner som benyttes, og inkluderer buffere så som fosfat, sitrat, sukinat, eddiksyre, og andre organiske syrer eller deres salter; antioksidanter så som askorbinsyre, immunglobuliner; hydrofile poly-merer så som polyvinyl polidon; aminosyrer, så som glysin, glutamisk syre, aspara-ginsyre eller arginin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkluderende cellulose eller dets derivater, glukose, mannose eller dekstriner, kela-terende midler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol; motion så som natrium; og/eller ikke-ioniske surfaktanter så som polysorbater, poloks-amerer eller PEG.

For orale farmakologiske sammensetninger kan slike bærer materialer være for eksempel vann, gelatin, gummi, laktose, stivelser, magnesium stearat, talg, oljer, polyalkenglykol, petroleum jelly og lignende benyttes. Slike farmasøytiske preparater kan være i enhets doseringsform og kan ytterligere inneholde andre terapeutiske verdifulle substanser eller konvensjonelle farmasøytiske adjuvanter så som konser-verende midler, stabiliserende midler, emulsifiserende midler, buffere og lignende. De farmasøytiske preparater kan være i konvensjonelle væskeformer så som tablet-ter, kapsler, drageer, ampuller og lignende, i konvensjonelle doseringsformer så som tørrampuller, og som stikkpiller og lignende.

I tillegg, forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse administreres hensiktsmessig i kombinasjon med andre behandlinger for å bekjempe eller hindre spesifikk sykdom.

Oppfinnelsen vil forstås bedre med referanse til de påfølgende eksempler. Disse skal imidlertid ikke vurderes som begrensende for rammen av oppfinnelsen.

En foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse vedrører en ernæringssammen-setning omfattende peptidmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse formulert på enhver konvensjonell måte til et for eller matprodukt.

FIGURER

Figur 1 viser kontroll (FPH) og forskjellige filtreringsfunksjoner etter behandling med enzympreparatet Proleather FG-F som beskrevet i eksempel 2. X-aksen viser log MW for peptidene. Figur 2 viser effekten av peptidpreparatet E3 på vektøkning relativt til kontroll. Figur 3 viser effekten av peptidpreparatet E3 for spesifikk vekstrate relativt til kontroll. Figur 4 viser effekten av peptidpreparatet E3 for konsentrasjon av plasmanivået av kolesterol.

EKSPERIMENTELL SEKSJON

Eksempel 1

Primær enzymatisk behandling, fremstilling av hvdrolvsat materialet anvendt som kontroll i eksempel 2.

Kontrollmaterialet er et enzymbehandlet fiskeproteinhydrolysat (FPH) og har flere nyttige biologiske effekter.

FPH ble produsert fra fiskekjøttrester av laksebenskjeletter etter filetering. Skjelet-tene uten hoder fra fersk filetert Atlantisk laks { Salmo salar, L.) ble tatt direkte fra produksjonslinjen og frosset ved -20 ± 2 °C: Innen en uke ble de frosne kroppene anvendt i den enzymatiske hydrolyseprosess.

Den enzymatiske hydrolyse ble utført med Protamex™ ved en pH på ca. 6,5 og ved en temperatur på 55 ± 2 °C. Protamex™ (E.C. 3.4.21.62/3.4.24.28) er et Bacillus protease kompleks fra Novozymes AS (Bagsvaerd, Denmark) og tilfredsstiller ren- hetskravene for ernæringsgraderte enzymer. Forholdet av laksekropper til vann var 1,14. Et enzym til substratforhold på 11,1 AU/kg ubearbeidet protein ble anvendt i hydrolysene. Etter 60 minutters enzymatisk behandling ble temperaturen økt til 98 °C, som ble nådd etter 105 minutter.

Store ben ble tilbakeholdt i hydrolysetanken, mens små ben ble fjernet med filtrering av hydrolysatet gjennom et gitter. Deretter ble de uløselige fraksjoner fjernet i en tofase separator (Westfalia, Germany, SC.35-26-177, 15 kW, 7200 rpm), før den resulterende blanding ble separert i en trefase separator (Westfalia, Germany, SB-7-36-+76, 4 kW, 8520 rpm) til lakseolje, emulsjonsfraksjon og en vandig fraksjon. Den vandige fraksjon ble konsentrert i en 4-trinns fallende film evaporator (APV Anhydro) til en pasta med ca. 60 % tørrstoff.

Det evaporerte hydrolysat benevnes som fiskeproteinhydrolysat (FPH), det vil si kontrollprøvene i eksempel 2, og inneholder ca. 83 % protein, 10 % aske og ca. 2 % lipider, basert på tørrvekt. Aminosyresammensetningen er gitt i tabell 1.

Eksempel 2

Sekundær enzymatisk behandling - Enzymatisk behandling av FPH ( kontroll) med Proleather FG- F ved pH 10

Substratprøven (FPH) (pasta) ble oppløst i preoppvarmet springvann (50 °C) til 10% tørrsubstans. Løsningen ble justert til pH 10 ved tilsetning av 23,5 liter av en 10 %

(vekt/vol) løsning av NaOH. Temperaturen under hydrolysen var 50 - 60 °C, men falt til 38 °C over natten. Enzymreaksjonen i karet fikk kjøre i 18,5 timer.

FPH-løsningen ble behandlet med Proleather FG-F som er et proteolytisk enzympreparat fremstilt med en unik fermenteringsprosess med en utvalgt stamme av Bacillus subtilis, og er tilgjengelig fra Amano Enzyme Inc.

Ingen spesifikk inaktivering av enzymene ble utført etter inkubering. Inaktivering av enzymene ble utført under de første filtreringstrinn og under evaporeringen av de aktuelle fraksjoner. I disse prosesseringstrinn overstiger temperaturen flere ganger inaktiveringstemperaturen av enzymene som er inkludert i studien.

Figur 1 viser peptidfordelingen av kontrollprøven (FPH) og filtreringsfraksjoner etter behandling med Proleather FG-F. Peptidfordelingen ble bestemt som beskrevet i Rubin-rapporten nr. 4617/115, 2004.

Fraksjonering med filtrering

Den enzymbehandlete løsning E3 ble foredlet med mikrofiltrering og ultrafiltrering i løsning med ca. 10 % tørrstoff ved 50-60 °C. Filtreringene ble utført i filtreringsenhet (Membralox SD 3-A modules M-3P1940, Pall.USA) med keramiske membraner med 100 nm og 20 nm porestørrelse (Membralox EP1940, Pall, USA). Kun permeatene ble samlet for evaluering av bioaktive peptider, selv om små prøver av retentatene ble samlet for analytiske formål for å gi informasjon om utbytte og utførelse under de spesifikke filtreringstrinn.

Detaljert informasjon om utførelse under mikro- og ultrafiltrering er gitt i tabell 2, nedenfor.

Permeatet etter ultrafiltreringstrinnet ble anvendt for de biologiske eksperimenter beskrevet i eksempel 3, nedenfor.

Peptidstørrelsesfordeling

Ca. 2 ml av den primære og sekundære enzymatisk behandlete løsning E1 eller en kontrollprøve (nullprøve) av FPH ble tilsatt 20 ml buffer, blandet, sentrifugert og filtrert før applisering til HPLC for separasjon med størrelseseksklusjonskromatografi (Rubin-rapporten 4617/115, 204; http://www.rubin.no/files/documents/4617-115_peptidstorrelse_hydrolysat2.pdf).

Samling av peptidfraksjoner av spesifikk lengde og analyser av disse for å karakterisere den generelle aminosyreprofil av den spesifiserte peptidfraksjon oppnådd etter enzymbehandling med de forskjellige protolytiske enzymer ble evaluert. Følgende fraksjoner ble samlet etter størrelseseksklusjonskromatografi med fremgangsmåten beskrevet i Rubin-rapporten 4617/115, 204). Eluert væske ble samlet ved spesifikke elueringstider for å karakterisere peptidene som foreligger i det opp-finneriske produkt. Under gis elueringstidene for prøver samlet for å analyseres for aminosyreprofil: Fraksjon 1: 18-22 min (korresponderende til peptider av ca. 8500 - 1200 Dalton<*>) Fraksjon 2: 22-26 min (korresponderende til peptider av ca. 1200 - 200 Dalton<*>) Fraksjon 3: 26-30 min (korresponderende til peptider av ca. 200 - 100 Dalton<*>) Fraksjon 4: 30-34 min (korresponderende til peptider av ca. <100 Dalton<*>)

Fraksjon 5: 34-40 min

Størrelsen av peptidene beregnes i samsvar med korrelasjonen mellom elueringstid og logMW beskrevet i Rubin-rapporten 4617/115, 2004.

Utbytter

Utbyttene i permeatet etter ultrafiltrering ble analysert med forskjellen mellom innledende tørrstoff og retentatet etter mikro- og ultrafiltrering: Utbytte = 100 - ((tørrstoff ved start hydrolysat - (mikrofiltrat retentat tørrstoff + ultrafiltrerings retentat tørrstoff))/ (tørrstoff ved start hydrolysat)<*>100)).

Et utbytte på 76 % ble oppnådd på E3-materialet i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Peptidstørrelsesfordeling:

Fig 1 viser peptidfordelingen oppnådd i forskjellige filtreringsfraksjoner etter enzymatisk behandling med enzymet Umamizyme.

Som det fremgår av resultatene over, har den enzymatiske behandling signifikant redusert mengden av de største peptider og i varierende grad forandret forholdet av de andre peptidfraksjoner. Det skal bemerkes at foreliggende enzymstudier er preliminære i den betydning av enzymbetingelsene og utbyttet ikke er optimalisert.

Aminosyreanalyse av samlete fraksjoner etter størrelseseksklusionskromatografi. De sekundære enzymbehandlete preparater (eksempel 2) det vil si E3-materialet i samsvar med foreliggende oppfinnelse, og det primære enzymbehandlete preparat (eksempel 1) det vil si FPH (kontroll), ble samlet og analysert for totalt innhold av aminosyrer. Kun fraksjon 1, 2 og 3 ble analysert.

Fraksjon 1: 18-22 min (korresponderende til ca. 8500 - 1200 Dalton<*>

Fraksjon 2: 22-26 min (korresponderende til ca. 1200 - 200 Dalton<*>

Fraksjon 3: 26-30 min (korresponderende til ca. 200 - 100 Dalton<*>

Tabell 3 viser den relative mengde av totale aminosyrer detektert i de forskjellige fraksjoner. Generelt, hovedpeptidene forekom i fraksjoner 2 og fraksjoner 3 for enzymene som viser det høyeste utbyttet i enzymhydrolysene.

Tabell 3 viser at hydrolysatet som er behandlet med et andre enzym (Proleather FG-F) inneholder et høyere nivå av aminosyrer foreliggende i mindre peptider (fraksjon 2 og fraksjon 3) sammenlignet med kontroll (FPH).

Tabell 4, nedenfor, viser mengden av de forskjellige aminosyrer i fraksjon 2 og 3.

Aminosyreanalyse ble analysert etter hydrolyse i 6 M i 221 ved 110 °C med HPLC ved anvendelse av en fluoressens teknikk for deteksjon (Cohen and Michaud, Anal. Biochem. 1993, 211, 279-287).

Eksempel 3

Biologisk aktivitet av enzympreparatene

Dyr og dyrehold

80 hannkjønn Wistar rotter (Mollegaard og Blomholtgaard, Danmark) 12 uker gamle, ble huset individuelt i bur av typen Makrolon III i et åpent system. De ble holdt under standard laboratoriebetingelser med temperatur 22±1 °C, mørke/lys-sykluser av 12/121, relativ fuktighet 55±5 % og 20 luftforandringer per time.

Rottene har fri aksess til intervensjonsdiettene på dager 1-29. Alle rotter ble drept på dag 30. På dag 30 ble alle rottene anestetisert ved inhalering av Sevoflurane 2 % i et anestesikammer. Torakotomi, hjertepunktuering og blodtømming ble utført.

Prøvesamling og analyser av biokjemiske parametere under foringsperioden.

Kroppsvekt og forinntak. (dag 0-7-14-21, 23-29)

Blodprøver (fra lår, plasma) ble opptatt i en heparininneholdende Vacutainer, plas-sert på is i 10 minutter, og sentrifugert ved 2000 rpm i 10 min ved 4 °C. (Dag 0-22-30 og plasma ble lagret ved -80 °C).

Urinprøver for målinger av protein, isoprostaner, natrium og kreatinin (dag 0-22-30), urin ble lagret ved -80 °C.

Avføringsprøver ble samlet på dag 29 og holdt under 20 °C inntil analyse for GMP. Kort forklart, 1 g av det føkale materiale fortynnes i 4 ml ekstraheringsbuffer og homogeniseres grundig ved anvendelse av en Ultra Turrax (20,000 rpm) før sentrifugering ved 45,000g i 20 minutter. De øvre halvdeler av supernatanten høstes forsiktig og kjøres på en standard 1 -trinns enzymkoplet immunosorbentanalyse (ELISA) som beskrevet tidligere (10).

Helblod ble spunnet, plasma tatt ut, og prøven ble lagret midlertidig på is, og overført til -80 °C fryser.

Fettsyrer i plasma og i rektale prøver ble analysert som tidligere beskrevet. Den samme metode ble anvendt for analyse av fettsyreprofil i plasma og homogeniserte biopsiprøver tatt fra rektal mukosa. Plasma lipid/fettsyrer, triglyserider, kolesterol, LDL kolesterol, HDL kolesterol, EPA, DHA, docosapentanoisk syre (DPA, C22:5n-3), AA, total n-3 og total n-6 PUFAer ble analysert.

Fremstilling av subcellulære fraksjoner.

Lever fra rottene ble homogenisert individuelt i iskald sukroseløsning (0,25 mol/l sukrose i 10 mmol/l HEPES-buffer pH 7,4 og 1 mmol/l EDTA) ved anvendelse av en Potter-Elvehjem homogeniserer. De subcellulære fraksjoner ble isolert som beskrevet i Berge, R. K. et al (Berge, R. K., Flatmark, T. & Osmundsen, H. (1984), Enhancement of long-chain acyl-CoA hydrolase activity in peroxisomes and mitochondria of rat liver by peroxisomal proliferators. Eur J Biochem 141: 637-644). Kort forklart, homogenatet ble sentrifugert ved 1000 x g i 10 min for å separere post-nukleære fra nukleær fraksjon. En mitokondriell-anriket fraksjon ble fremstilt fra den post nukleære fraksjon ved 10000 x g i 10 min. En peroksisom anriket fraksjon ble fremstilt med sentrifugering av den post-mikrokondrielle fraksjon ved 23500 x g i 30 min. En mikrosomal anriket fraksjon ble isolert fra den post-peroksisomal fraksjon ved 100000 x g i 75 min. Den resulterende supernatant ble samlet som den cytosoliske fraksjon. Prosedyren ble utført ved 0-4 °C, og fraksjonene ble lagret ved - 80 °C. Protein ble analysert ved anvendelse av BioRad protein analyse kit (BioRad, Heraules, CA) og bovin serum albumin som standard.

Lipid analyser

Lipider i hellever og heparinisert plasma ble målt i Tecnicon Axon system (Miles, Tarrytown, NY), med Bayer triglyserid og kolesterol enzymatiske kit (Bayer, Terrytown, NY) og PAP 150 fosfolipid enzymatisk kit (bioMérieux, Lyon, France). Leverlipider ble først ekstrahert i samsvar med Bligh and Dyer (Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37: 911-91.

Fettsyresammensetning

Fettsyrer ble ekstrahert fra prøvene med 2:1 kloroform: metanol (v/v) (35). Prøvene ble filtrert, forsåpet og esterifisert i 12 % BF3i metanol (v/v). Fettsyresammensetningen total lipider fra lever og plasma ble analysert ved anvendelse av metodene beskrevet av Lie og Lambertsen (Lie, O. & Lambertsen, G. (1991) Fatty acid composition of glycerophospholipids in seven tissues of cod (Gadus morhua), determined by combined high-performance liquid chromatography and gas chromatography. J Chromatogr 565: 119-129). Fettsyre metylestere ble separert ved anvendelse av en Carlo Erba gasskromatograf ("kald på kolonne" -injeksjon, 69 °C i 20 s, øker med 25 °C min"<1>til 160 °C og holdes ved 160 °C i 28 min, øker med 25 °C min"<1>til 190 °C og holdes ved 190 °C i 17 min, øker ved 25 °C min"<1>til 220 °C og holdes ved 220 °C i 9 min) utstyrt med en 50 m CP-sil 88 (Chrompack, Middelburg, The Netherlands) brent silica kappilærkolonne (i.d. 0,32 mm). Fettsyrene ble identifisert med retensjonstid ved anvendelse av standard blandinger av metylestere (Nu-Chek-Prep, Elyian, MN, USA). Fettsyresammensetningen (vekt prosentandel) ble beregnet ved anvendelse av en integrator (Turbochrom Navigator, Version 4,0) koplet til GLC.

Lipider ble ekstrahert fra plasma triacylglyserol-anriket lipoproteinfraksjon ved anvendelse av en blanding av kloroform og metanol, og separert med tynnsjikt-kromatografi på silicagelplater (0.25mm Silica gel 60, Merck) utviklet i heksan-dietyleter-eddiksyre (80:20:1, v/v/v) og visualisert ved anvendelse av Rhodamine 6G (0,05 % i metanol, Sigma) og UV-lys. Flekkene ble skrapet av, og overført til rør inneholdende heneicosanoisk syre (21:0) som indre standard. BF3-metanol ble tilsatt til prøvene for transesterifisering. For å fjerne nøytrale steroler og ikke-forsåpet materiale, ble ekstrakter av fettacylmetylestere oppvarmet i 0,5mol/l KOH i etanol-vann-løsning (9:1). Gjenvunnet fettsyrer ble deretter reesterifisert ved anvendelse av BF3-metanol. Metylesterene ble analysert på en GC8000Top gasskromatograf (Carlo Erba Instrument), utstyrt med en flammeioniserings detektor (FID), programmerbar temperatur av dampinjektor, AS 800 autosampler (Carlo Erba Instrument) og en kappelær kolonne (60m x 0,25mm) inneholdende en sterkt polar SP 2340 fase med filmtykkelse 0,20^m (Supelco). Innledende temperatur var 130 °C, oppvarming 1,4 "C/min til final temperatur 214 °C. Injektortemperaturen var 235 °C. Detektor-temperatur var 235 °C, ved anvendelse av hydrogen (25ml/min), luft (350 ml/min) og nitrogen som make-up gass (30 ml/min). Prøvene ble kjørt med konstant strømning ved anvendelse av hydrogen som bærergass (1,6 ml/min). Splittingsforholdet var 20:1. Metylesterene ble positivt identifisert med sammenligning til kjente standard (Larodan Fine Chemicals, Malmo, Sweden) og verifisert med massespektrometri. Kvantifisering av fettsyrene ble utført med Chrom-Card A/D 1,0 kromatografistasjon (Carlo Erba Instruments) basert på heneicosanoisk syre som en indre standard.

Isolering av plasma triacylglvserol- rik lipoproteinfraksion

Plasma triacylglyserol-rik lipoproteinfraksjon ble fremstilt med ultrasentrifugering av 3 ml plasma med en tetthet på 1,063 g/ml i 19 t ved 105000 x g ved 15 °C. Rørene ble fordelt, og den flytende fraksjon i topp 1 ml av hvert rør ble høstet. Fraksjonen ble deretter dialysert mot 150 mmol/l natriumklorid, 16 mmol/l natriumfosfat og 4 mmol/l kaliumfosfat, pH 7,5, mettet med nitrogen.

Resultater av biologisk aktivitet.

De biologiske eksperimentelle data for enzympreparat E3 er vist i tabell 5 nedenfor og gitt i figurer 2 til 6.

Tabell 5

Sammendrag av biologiske aktiviteter for E3-materialet, det vil si materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse hvor kontrollmaterialet er blitt behandlet med sur Proleather FG-F.

Sammenlignet med kontrollmaterialet reduserer E3-materiale ifølge foreliggende oppfinnelse vektøkningen med ca. 35 %. Også den spesifikke vekstrate er signifikant redusert.

Det vurderes således at E3-materialet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som et vektreduserende middel, for eksempel for å hindre eller behandle overvekt eller obesitet.

Vi har også vist at peptidmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse reduserer nivået av kolesterol i plasma, og det vurderes således at foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling og/eller hindring av hyperkolesterolemi, dvs. situasjoner med høye nivåer av kolesterol (høyere nivåer enn normalt).

Hyperkolesterolemi (høyt nivå av blodkolesterol) er forekomsten av høye nivåer av kolesterol i blodet. Det er ikke en sykdom men et metabolsk dearrangement som kan bidra til mange former for sykdommer, særskilt kardiovaskulær sykdom. Noen typer hyperkolesterolemia fører til spesifikke fysiologiske funn: xantoma (avleiring av kolesterol i områder på huden eller sener), xantelasma palpabrum (gulaktige flekker rundt øyelokk) og arcus senilis (hvit misfarging av perifer hornhinne).

Langvarige forhøyete hyperkolesterolemi fører til akselerert aterosklerose; og dette kan uttrykke seg selv som en rekke kardiovaskulære sykdommer: koronart arteriesykdom (angina pektoris, hjerteanfall), slag og korte slaglignende episoder og perifer vaskulær sykdom.

Claims

1. Peptidpreparat fremstilt med enzymatisk behandling av et proteinmateriale hvor proteinene kuttes til mindre peptidfragmenter,karakterisert vedat størrelsen av peptidfragmentene er fra 0 til 10 000 Dalton, mer fortrinnsvis fra 0 til 10.000 Dalton, og mer fortrinnsvis fra 0 til 1000 Dalton, og mer fortrinnsvis fra 0 til 100 Dalton.

2. Peptidpreparat i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte proteinmateriale er et fiskeproteinmateriale.

3. Peptidpreparat i samsvar med krav 2,karakterisert vedat nevnte fiskeproteinmateriale er et proteinmateriale fra laks.

4. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat peptidpreparatet fremstilles med enzymatisk behandling med en protease.

5. Peptidpreparat i samsvar med krav 4,karakterisert vedat nevnte proteasen er Proleather FG-F.

6. Peptidpreparat i samsvar med krav 4 eller 5,karakterisert vedat nevnte enzymatiske behandling også involverer en enzymatisk behandling med et Bacillus protease kompleks, fortrinnsvis før behandlingen med en sur protease.

7. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat minst 50%, fortrinnsvis 60% og mer fortrinnsvis 70% av peptidene har en størrelse på 1000 Dalton eller mindre.

8. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat minst 35 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 70 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og mer foretrukket at minst 45 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton.

9. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat minst 20 % av peptidene har e størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 25 % av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton.

10. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat - minst 35 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 40 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og mer foretrukket at minst 45 % av peptidene har en størrelse på ca. 100-1000 Dalton, og - minst 20 % av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton, mer fortrinnsvis at minst 25 % av peptidene har en størrelse på mindre enn ca. 100 Dalton.

11. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptid-størrelser av ca. 1200 til 200 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3.

12. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptid-størrelse av ca. 200 til 100 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3.

13. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat : - en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelse av ca. 1200 til 200 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3, og - en fraksjon av peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelse av ca. 200 til 100 Dalton har en aminosyresammensetning som angitt i tabell 3.

14. Peptidpreparat i samsvar med krav 14,karakterisert vedat den relative mengde av aminosyren arginin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser av ca. 200 til 100 Dalton er minst 5 %, mer fortrinnsvis 6%, og mer fortrinnsvis minst 7% lavere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet, eller den relative mengde av aminosyren arginin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelse av ca. 1200 til 200 Dalton er minst 30%, mer fortrinnsvis 40 %, mer fortrinnsvis minst 50 % lavere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

15. Peptidpreparat i samsvar med et av de foregående krav,karakterisertved at den relative mengde av aminosyren tyrosin er minst 50%, mer fortrinnsvis 71 % høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

16. Peptidpreparat i samsvar med krav 17,karakterisert vedat den relative mengde av aminosyren tyrosin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser på ca. 1200 til 200 Dalton er minst 50%, mer foretrukket 60%, og mer foretrukket minst 70% høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

17. Peptidpreparat i samsvar med krav 17,karakterisert vedat den relative mengde av aminosyren tyrosin i peptidpreparatet korresponderende til peptidstørrelser på ca. 200 til 100 Dalton er minst 100%, mer foretrukket 125%, og mer fortrinnsvis minst 150% høyere enn sammenlignet med fiskeproteinhydrolysatet.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidpreparat,karakterisertved at fremgangsmåten omfatter et trinn hvor et protein eller peptidmateriale behandles med en protease for å redusere størrelsene av peptidfragmentene.

19. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16,karakterisert vedat nevnte protease er Proleather FG-F.

20. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 18-19,karakterisertved at fremgangsmåten inkluderer en ytterligere enzymatisk behandling av materialet, fortrinnsvis før behandlingen med en sur protease.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 20,karakterisert vedat nevnte ytterligere enzymatiske behandling er med en Bacillus proteasekompleks.

22. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 18-21,karakterisertved at nevnte behandling med nevnte protease utføres ved en pH av ca. 8 til ca.

12, fortrinnsvis ved en pH av ca. 9 til ca. 11, og mer fortrinnsvis med en pH av ca.

10.

23. Anvendelse av et peptidpreparat i samsvar med krav 1, for fremstilling av et farmasøytisk eller nutrasøytisk preparat for å hindre og/eller behandle hyperkolesterolemi, kardiovaskulære sykdommer, perifere vaskulære sykdommer, xantoma, xantelasma, palpabrum, arcus senilis, aterosklerose, overvekt eller obesitet.